KR20000057698A

KR20000057698A - 기본-나선-루프-나선 비에이치엘에이치 패밀리의 폴리펩티드 및상응하는 핵산서열

Info

Publication number: KR20000057698A
Application number: KR1019990705560A
Authority: KR
Inventors: 이카르-리이프칼른스크리스틴; 말레쟈크; 라바사르드필립
Original assignee: 자끄 사비나; 아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2000-09-25
Also published as: CZ219499A3; FR2757524A1; JP2001510464A; HU224305B1; AU5667398A; HUP0001184A2; WO1998027206A2; FR2757524B1; WO1998027206A3; ZA9711401B; NO993029L; SK81899A3; IL130302A0; HUP0001184A3; US6998474B1; EP0946724A2; CA2275454A1; NO993029D0; BR9713968A; AU732438B2

Abstract

본 발명은 신규한 bHLH 단백질과 상응하는 암호화 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열을 통합하는 발현 벡터 및 치료 목적상 이러한 서열 또는 단백질의 용도에 관한 것이다.

Description

기본-나선-루프-나선 비에이치엘에이치 패밀리의 폴리펩티드 및 상응하는 핵산 서열 {POLYPEPTIDES OF THE BASIC-HELIX-LOOP-HELIX bHLH FAMILY, CORRESPONDING NUCLEIC ACID SEQUENCES}

배 신경관은 초기에 이의 전 길이에 걸쳐서 비분화된 신경상피세포로 이루어진다. 이어서 세포는 위치에 따라 전/후, 등/복 및 중/측 축에서 분화한다. 이러한 분화는 신경관을 여러 조직원 영역으로 세분하는 유전 인자에 의해서 부분적으로 조절된다. 최근에 다수의 전사 인자, 좀더 상세하게는, 소위 bHLH "기본 나선 루프 나선" 유전자 [참조문헌: Caudy et al., 1988, Cell, 55, 1061-67]에 의해서 암호화되는 산물이 이러한 분화 현상에 수반됨이 알려졌다. 이러한 패밀리의 단백질은 고도로 보존된 아미노산 단위, 특히 나선 1과 나선 2가 이어지는 기본 영역을 갖는다. 나선 1과 나선 2의 두 단위는 다양한 크기의 루프에 의해서 분리된다. 척추동물에서, 이러한 bHLH 유전자의 특정 산물은 신경 결정 및 분화 동안 신경형성의 다양한 단계에 참여한다. 이러한 단백질의 예로서, 특히 Math-1 [참조문헌: Akazawa et al., 1995, J. Bol. Chem., 279, 8730-38], Mash-1 [참조문헌: Johnson et al., 1990, 346, 858-61] 및 NeuroD [참조문헌: Lee et al., 1995, Sciences, 268, 836-44] 단백질을 언급할 수 있다. 분명히, 이러한 bHLH 도메인을 포함하는 기타 단백질은 기타 부위의 수준에서 및 가변적인 횟수로 신경 발생에 수반된다. 신규 bHLH형 단백질의 동정은 신경형성에 대한 우리의 이해를 높이는 데에 특히 가치가 있고, 이에 따라 치료 관점에서 유리할 수 있다.

본 발명은 신규한 bHLH형 단백질과 상응하는 암호화 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열을 통합하는 발현 벡터 및 치료 목적상 이러한 서열 또는 단백질의 용도에 관한 것이다.

도 1: cDNA CIG235의 뉴클레오티드 서열. 완전 cDNA를 분리하는데 사용되는 각종 올리고뉴클레오티드가 이 서열상에 표시되어 있다. 화살표는 이들 올리고뉴클레오티드의 5' → 3' 배향을 나타낸다.

도 2: 릴랙스 패밀리의 기타 단백질과 릴랙스의 bHLH 도메인의 아미노산 서열 비교. 상동 아미노산은 검게 표시되고, 유사한 구조의 아미노산은 회색으로 표시된다.

본 발명의 주제는 정확히 bHLH형 단백질의 신규 패밀리에 속하는 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA의 분리, 서열화 및 특징 규명이다. 본 발명은 또한 이러한 서열을 포함하는 재조합 DNA, 이를 함유하는 벡터 및 재조합 단백질 발현의 활성화를 위한 이의 용도를 기재한다.

본 출원인은 본 발명에 이르러 이미 동정된 bHLH 단백질과의 높은 상동성 (bHLH 도메인에 제한됨)을 지닌 폴리펩티드를 동정했다. 사실상, 예상치않게도, 이러한 bHLH 도메인에 인접한 영역은 기타 bHLH형 단백질의 서열과 어떠한 서열 상동성도 공유하지 않는다.

따라서, 본 발명의 제 1 주제는 bHLH 도메인의 수준에서만 bHLH형 단백질과의 서열 상동성을 공유함을 특징으로 하는, 전사 활성이 부여된 bHLH형 폴리펩티드이다.

좀더 정확히, 본 발명은 서열번호 1 또는 이의 유도체에 의해서 완전히 또는 부분적으로 표현됨을 특징으로 하는, 전사 활성을 지니는 폴리펩티드에 관한 것이다.

유도체는 본 발명의 목적상 예를 들면, 하나 이상의 잔기의 결실, 하나 이상의 잔기의 치환, 및/또는 하나 이상의 잔기의 수준에서의 변형과 같은 주요 구조의 수준에서의 변형을 포함하는 산물을 의미하는 것으로 이해된다. 변형에 의해서 영향받는 잔기의 수는 예를 들면, 1, 2 또는 3 내지 10, 20 또는 30 개일 수 있다. 유도체라는 용어는 또한 추가의 펩티드 성질이거나 아닌 내부 또는 말단부를 포함하는 분자를 포함한다. 이들은 특히 활성부, 마커, 아미노산, 예를 들면, -1 위치의 메티오닌일 수 있다. 유도체라는 용어는 또한 3차 구조 (N-말단 등)의 수준에 변형을 포함하는 분자를 포함한다.

이러한 유도체는 다양한 목적, 예를 들면, 특히 상호작용의 부위에 대한 펩티드의 친화력을 증가시키려는 목적, 이의 생성 수준을 증진시키려는 목적, 신규한 약력학 및/또는 생물학적 성질을 부여하려는 목적으로 생성될 수 있다.

바람직하게, 유도체는 청구된 단백질 및 좀더 바람직하게는 적어도 bHLH 도메인에 인접한 영역의 수준에서 적어도 하나의 구조적 상동성을 공유하고 전사 활성화제의 생물학적 성질을 보존한다. 유도체는 또한 청구된 폴리펩티드에 신규한 성질 (라벨링 등)을 제공하거나 이의 성질 (안정성, 생물학적 활성 등)을 증진시킬 수 있다.

바람직하게, 유도체는 서열번호 1에 표현된 서열을 지니는 bHLH형 폴리펩티드이다. 이것은 또한 좀더 바람직하게는 상응하는 mRNA의 발현이 래트의 배에서 세로 밴드의 형태로 검출되는 214 개의 아미노산을 개방 판독 프레임에 포함하는 단백질이다. 이러한 단백질은 이후 본원에서 "래트 배 종축"에 대해 릴랙스 (Relax)라는 명칭으로 표시되고 본 발명에 따라 청구되는 주제 중의 하나를 구성한다.

릴랙스와 이미 입수가능한 단백질의 아미노산 서열의 비교는 본질적으로 bHLH형 단백질과 서열 상관 관계를 성립시킴을 가능하게 한다. 또한, 이러한 상동성은 bHLH 도메인의 수준에서만 존재했다. 따라서, 릴랙스의 bHLH 도메인은 NeuroD, Math-1 및 Mash-1 단백질의 bHLH 도메인과 각각 68 %, 57 %, 40 %의 상동성을 공유한다.

릴랙스 단백질로 수행되고, 좀더 정확히 하기 실시예에 기재된 활성의 시험으로부터, 이러한 단백질이 E 박스 서열에 특이적으로 결합할 수 있고 형질감염 시도시, 전사 활성화제처럼 작동하며 이러한 활성이 원상태의 E 박스의 존재에 완전히 의존적임이 명백해진다. 이러한 모든 관찰은 bHLH 단백질의 신규 패밀리의 청구된 릴랙스 단백질의 지위를 증명한다.

본 발명의 주제는 또한 상기에 정의된 bHLH형 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 핵산 서열이다.

좀더 정확히, 본 발명은 서열번호 1에 의해 완전히 또는 부분적으로 표현됨을 특징으로 하는 핵산 서열, 이의 상보적 본쇄 또는 이의 유도체에 관한 것이다.

청구된 핵산은 상보적 DNA (cDNA), 게놈 DNA (gDNA) 또는 RNA 단편일 수 있다. 이는 좀더 상세하게 cDNA 또는 gDNA일 수 있다.

본 발명의 목적상, 유도체라는 용어는 유전적 및/또는 화학적 성질의 하나 이상의 변형에 의해서 수득되는, 유전자 코드의 퇴화의 결과로서 여겨지는 서열과는 다른 서열 및 이들 서열 또는 이의 단편과 하이브리드화하고 이의 산물이 표시된 활성을 지니는 서열을 나타낸다.

유전적 및/또는 화학적 성질의 변형은 하나 이상의 잔기의 돌연변이, 치환, 결실, 첨가 및/또는 변형을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 유도체는 다양한 목적, 예를 들면, 특히 이의 생성 수준을 증진시키려는 목적, 활성을 증가시키고/시키거나 변형시킬 목적, 또는 신규한 약력학 및/또는 생물학적 성질을 부여하려는 목적으로 생성될 수 있다. 첨가로부터 생성된 유도체 중에서, 예를 들면, 하나 이상의 인트론이 수반되는 cDNA로 이루어진 하이브리드 작제물 유형의 한 말단에 연결된 추가의 이종 부분을 포함하는 키메릭 핵산을 언급할 수 있다.

또한, 본 발명의 목적상, 청구된 핵산은 프로모터, 활성화 또는 조절 서열 등을 포함할 수 있다.

유도체라는 용어는 또한 다른 세포원, 특히 인간 기원의 세포, 또는 기타 기관으로부터 유도되고, 동일한 형태 또는 실질적으로 유사한 형태의 활성을 지니는 것으로 여겨지는 서열에 상동성인 서열을 포함한다. 이러한 상동성 서열은 하이브리드화 실험에 의해서 수득될 수 있다. 하이브리드화는 통상적인 엄격한 조건 (Maniatis et al., cf. general molecular biology techniques) 또는 바람직하게는 고엄격 조건 하에서 핵산 라이브러리를 기초로 하여 탐침으로서 원 서열 또는 이의 단편을 사용하여 수행될 수 있다.

좀더 바람직하게, 이것은 서열번호 1에 표현된 핵산 서열 또는 이의 상보적 본쇄이다.

본 발명은 또한 발현이 세포 mRNA의 전사 조절을 가능하게 하는 상응하는 안티-센스 서열을 포함시키고자 한다. 이러한 서열은 역 배향으로 전사되는 고려된 핵산 서열의 전체 또는 일부로 이루어질 수 있다. 이것은 전체적으로 또는 부분적으로 상보적이거나 상당히 상보적이다.

본 발명의 주제는 또한 유전자 발현을 조절하고/하거나 이에 참여하는 청구된 폴리펩티드의 용도이다. 이러한 전사 활성화제는 중추 신경계 수준에서의 단백질 발현의 표적화에 가장 특히 유리할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 세포 숙주에서 재조합 DNA에 포함되거나 되지 않은 상기의 뉴클레오티드 서열을 당해분야의 기술자들에게 공지된 기술을 사용하여 또는 이들 기술의 조합에 의해서 발현시킴으로써 수득될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 핵산 서열은 청구된 폴리펩티드의 생체내, 생체외 및/또는 시험관내 발현을 유도하기에 유용한 벡터의 일부를 형성한다. 사용된 벡터는 다양한 기원일 수 있고, 단, 동물 세포, 바람직하게는 인간 신경 세포를 형질전환시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-수반 바이러스 (AAV), 허프스바이러스, 시토메갈로바이러스 (CMV), 박시니아 바이러스 등으로부터 유도될 수 있는 바이러스 벡터가 사용된다. 이종 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 AAV로부터 유도된 벡터가 문헌 [참조: Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988; Roemer and Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO91/18088]에 기재되어 있다.

그러므로, 본 발명은 또한 게놈에 삽입된 상기의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스에 관한 것이다.

유리하게, 본 발명에 따른 재조합 바이러스는 결손 바이러스이다. "결손 바이러스"라는 용어는 표적 세포에서 복제할 수 없는 바이러스를 나타낸다. 따라서, 일반적으로, 본 발명에 사용된 결손 바이러스의 게놈은 감염된 세포에서의 바이러스 복제에 필수적인 최소한의 서열이 부족하다. 이러한 영역은 제거되거나 (완전히 또는 부분적으로) 비기능성으로 되거나 다른 서열, 특히 본 발명의 핵산에 의해서 치환될 수 있다. 바람직하게, 그럼에도 불구하고 결손 바이러스는 바이러스 입자의 캡시드화에 필수적인 게놈의 서열을 보존한다.

본 발명의 핵산 서열을 결손인 아데노바이러스, AAV 또는 재조합 레트로바이러스에 포함된 형태로 사용함이 특히 유리하다. 바람직한 양태에 있어서, 이것은 아데노바이러스이다.

구조와 성질이 다소 다른 다양한 아데노바이러스 항원형이 존재한다. 이들 항원형 중에서, 유형 2 또는 5 인간 아데노바이러스 (Ad 2 또는 Ad 5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스 (출원 WO94/26914 참조)의 용도가 본 발명에서 바람직하다. 본 발명에 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스 중에서, 개, 소, 마우스 (예를 들면, Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류, 유인원 (예를 들면, SAV) 기원을 언급할 수 있다. 바람직하게, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 좀더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스 [예를 들면, 맨하탄주 또는 A26/61 (ATCC VR-800)]이다. 바람직하게, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 본 발명에 사용된다. 바람직하게, 본 발명의 아데노바이러스의 게놈에서, 최소한의 E1 영역이 비기능성이다. 고려되는 바이러스 유전자는 당해분야 기술자들에게 공지된 기술에 의해서, 특히 전체 억제에 의해서, 치환 또는 부분 결실에 의해서, 또는 고려되는 유전자내 하나 이상의 염기의 첨가에 의해서 비기능성으로 제조될 수 있다. 기타 영역, 특히 E3 (WO95/02697), E2(WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) 및 L5 (WO95/02697) 영역이 또한 변형될 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 아데노바이러스는 E1 및 E4 영역에 결실을 포함한다. 다른 바람직한 양태에 있어서, 아데노바이러스는 E4 영역과 암호화 서열이 삽입되는 수준으로 E1 영역에 결실을 포함한다. 본 발명의 바이러스에서, E1 영역내 결실은 바람직하게 Ad5 아데노바이러스 서열 상의 뉴클레오티드 455에서 3329까지 걸쳐 있다. 다른 바람직한 양태에 있어서, 외생 핵산 서열이 E1 영역내 결실의 수준으로 삽입된다.

본 발명의 결손 재조합 바이러스는 결손 바이러스와 특히 상기의 뉴클레오티드 서열을 운반하는 플라스미드 사이의 상동성 재조합에 의해서 제조될 수 있다 [참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917]. 상동성 재조합은 적합한 세포주로의 바이러스와 플라스미드의 공-형질감염 후 일어난다. 사용된 세포주는 바람직하게 (i) 상기 요소에 의해서 형질전환될 수 있어야 하고 (ii) 재조합의 위험을 피하기 위해서 결손 바이러스 게놈을, 바람직하게는 통합된 형태로 상보할 수 있는 서열을 포함해야 한다. 결손 재조합 아데노바이러스의 제조에 사용될 수 있는 세포주의 예로서, 특히 게놈에 통합된 Ad5 아데노바이러스 (12 %)의 게놈의 좌측부를 함유하는 배 신장 세포주 293 [참조문헌: Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59]을 언급할 수 있다. 결손 레트로바이러스의 제조에 사용될 수 있는 세포주의 예로서, CRIP 세포주 [참조문헌: Danos and Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460]를 언급할 수 있다. 이어서, 증식된 바이러스를 회수하고 통상의 분자 생물학 기술에 따라 정제한다.

본 발명의 벡터, 핵산 또는 폴리펩티드는 분리되거나 정제된 형태일 수 있다.

본 발명의 주제는 또한 적어도 하나의 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열, 벡터 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명은 신경계에 영향을 미치는 병리의 치료용 약학 조성물의 제조를 위해 청구된 서열 또는 벡터의 용도에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 또한 유전자 발현을 조절하고/하거나 이에 참여하는 청구된 폴리펩티드의 용도에까지 확대된다.

하기에서 제시된 설명적이고 비제한적으로 암시된 실시예 및 도면이 본 발명의 기타 이점 및 특성을 입증한다.

실시예 1

퇴화된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 기본 도메인과 Helix II 사이 서열의 PCR에 의한 직접적인 증폭

bHLH 패밀리의 신규 전사 인자를 암호화하는 cDNA의 분리는 래트 SCG(Rat Superior Cervical Ganglia)를 이용하여 수행된다. 이러한 패밀리의 단백질이 고도로 보존된 아미노산 단위, 특히 기본 도메인에 이은 Helix I과 Helix 2를 가지는 경우, 이들 각종 보존된 영역을 암호화하는 퇴화된 올리고뉴클레오티드가 선택된다. 따라서 이들은 기본 영역 및 복합 초파리 achaete-scute 및 Mash-1, Mash-2 및 M-Twist와 같은 bHLH 포유류 유전자의 Helix II 도메인을 보존하기 위해 선택된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 한편으로는 PCR에 의해 작제된 SCG 라이브러리의 직접 선별을 수행하기 위해서이고, 다른 한편으로는 SCG ss-cDNA상에서 PCR을 수행하기 위해, 각각 센스 및 안티-센스 프라이머로 사용되어왔다.

센스 올레고뉴클레오티드는 이들 bHLH 단백질의 기본 도메인으로부터 선택되고; 이는 좀더 정확하게는 하기 폴리펩티드 단편에 상응하는 올리고뉴클레오티드이다:

5'-AATKHGMGIGAGCGCIDKCGCRYG-3' (서열 번호 2).

안티-센스 올리고뉴클레오티드는, 부분적으로는, 동일한 bHLH 단백질의 Helix II 도메인으로부터 결정된다. 이는 하기 폴리펩티드 단편에 상응하는 올리고뉴클레오티드이다:

5'-GGCSRDTYTCAGGGTSYBGAYCTT-3' (서열 번호 3).

일본쇄 cDNA(ss-cDNA)는 2일간 자란 래트의 SCG로부터 유도된 변성된 폴리A⁺RNA 500 ng으로부터 제조된다.

PCR 증폭은 PCR 완충액(10 mM Tris, pH 8.3, 50 mM Kcl, 2.5 mM MgCl₂) 이외에, 200 μM의 dNTP, 12.5 μM의 각 올리고뉴클레오티드 및 약 20 ng의 ss-cDNA를 포함하는 혼합물상에서 수행된다. PCR은 94℃에서 연속 3분간 변성; 2 회(94℃에서 30초; 50℃에서 45초; 72℃에서 1.5분)에 이어 38 회(94℃에서 30초; 62℃에서 45초; 72℃에서 1.5분)을 수행하여 달성된다. PCR 산물은 pUC19의 SmaI 부위에서 클로닝되고 이렇게 얻어진 1500 클론은 서열 분석에 의해 분석된다. 본 출원인은 이들 각종 cDNA의 뉴클레오티드 서열에서 유래된 아미노산 서열에서 Helix I 단위의 존재를 찾았다. 이들 cDNA의 큰 부분(670)은 이러한 단위를 함유하고, 이들 중, 단지 하나는 bHLH 패밀리의 신규 가능한 멤버에 상응한다. 분리된 기타 cDNA는 알려진 bHLH 단백질에 상응한다.

CIG235로 불리고 도 1에 나타내어진 새로이 분리된 cDNA는 76 뉴클레오티드의 단편(PCR에 의해 도입된 올리고뉴클레오티드에 상응하는 서열 제외)에 상응한다. 아미노산 서열의 정렬은 삽입이나 결실없이 수행된다. 이들 정렬은 이 단편이 bHLH 단백질의 Helix I 단위에 상동인 단위를 암호화함을 보여준다. 완전 cDNA의 분리가 착수된다.

실시예 2

CIG235에 상응하는 완전 cDNA의 분리

CIG235에 상응하는 완전 cDNA의 분리는 CIG235에 상응하는 mRNA가 SCG에서 거의 발현되지 않기 때문에 극도로 어렵다. 심지어는 발현 수준이 변칙적인 전사 수준에 가까운 것으로 보인다. 선택된 기술은 한편으로는, 고정된 PCR에 의해 CIG235에 상응하는 cDNA의 3' 말단을 분리하는데 있고, 다른 한편으로는, E12.5 단계에서 래트 배의 척수로부터 이 cDNA의 5' 말단을 분리하는데 있다.

1. 고정된 PCR에 의한 3'에서 cDNA CIG235의 확장

이를 위해, SCG ss-cDNA는 Dumas Milne Edwards 등의 방법[참조 문헌: 1995, A Practical Approach, Ed McPherson et al., pp89-118, IRL Press Oxford U.K.]에 따라 RA3' NV 프라이머(3' NV 앵커를 운반하는 랜덤 역 전사 프라이머)로 제조된다. 두 특정 네스팅 프라이머는 76 뉴클레오티드의 bHLH 양성 클론에서 선택된다:

CIG5'-1: 5'-AACCTTAACTCCGCGCTGGATGCGC-3'(서열 번호 4)

및 CIG5'-2: 5'-CGCGGTGTCCTGCCCACC-3'(서열 번호 5)

본 출원인은 올리고뉴클레오티드 CIG5'1와 A3'-1 및 CIG5'2와 A3'-2의 쌍을 이용하여 두개의 네스팅 PCR에 의해 CIG235의 3' 말단을 증폭시켰다. 실시예 1에서 확인된 PCR 혼합물은 단지 0.8 μM의 각 올리고뉴클레오티드 및 94℃에서 30초간의 변성 단계에 이은 72℃에서 1.5분간의 확장 단계가 사용된다. "어닐링"은 온도를 다양하게 하여 45초간 수행된다. 처음 10회 동안, 이 온도는 매 2회 1℃씩 70℃에서 65℃까지 감소된 다음 30회 동안 65℃로 유지된다. 생성된 산물은 pUC19 중으로 클로닝되고 서열 분석된다. 이렇게 하여 본 출원인은 CIG3'(이의 5' 부분은 클론 CIG235의 3' 말단에 상응함)로 불리는 717 뉴클레오티드의 cDNA를 얻는다. 개방 판독 프레임의 분석은 단백질의 카복시-종결 말단을 암호화하는 전체 서열이 비암호화 3' 영역의 321 뉴클레오티드로 분리됨을 보여준다.

2. E12.5 단계에서 래트 배의 척수로부터 CIG3'에 상응하는 5' 말단의 분리

본 출원인은 CIG3'에 상응하는 mRNA의 발현 패턴을 제자리 하이브리드화에 의해 찾아 내었다. 이의 발현은 배 발생의 다양한 단계에서 평가된다. 선택된 방법은 디그옥시게닌-라벨된 탐침을 이용한 두꺼운 래트 배 절편상에 제자리 하이브리드화이다. 이 방법은 실제로 전체적인 하이브리드화를 위해 기술된 것에 적합하고[참조문헌: 1994, A Practical Approach, Ed Wilkinson et al., pp75083, IRL Press Oxford U.K.], 다수의 상이한 단계에서 전체 배를 빠르게 선별할 수 있게한다.

이 mRNA의 높은 발현은 배 발생 12.5일째(E12.5)에, 척수에서 검출된다. 따라서 본 출원인은 이 발생 단계에서 척수로부터 mRNA를 제조하고, SLIC법에 의해 5' 말단의 분리를 수행한다. 893 뉴클레오티드의 PCR 산물이 분리되고 이는 CIG5'로 불린다.

CIG3' 및 CIG5'의 cDNA는 120 뉴클레오티드 영역에서 중복되고 크기가 1491 뉴클레오티드인 전체 cDNA를 형성한다.

그러나, CIG3' 및 CIG5'가 동일한 조직에서 분리된 것이 아닌 경우, 이들 두 클론의 정열에 의해 생긴 콘티그(contig)가 기존 mRNA에 상응하고 PCR에 의해 생긴 키메라가 아님을 보여줄 필요가 있다. 따라서 본 출원인은 역 전사후, 총 mRNA가 E12.5에서 척수에 존재함을 PCR에 의해 입증했다. 이 조직에서, 단일 PCR 증폭은 이러한 mRNA를 전체적으로 볼 수 있게끔 할 수 있다. 추가로, 노던 블랏에 의한 mRNA의 분석은 세가지 탐침 CIG3', CIG5' 및 전체 cDNA 모두가 3.1 kb의 단일 mRNA를 검출할 수 있음을 보여준다. 결국, 제자리 하이브리드화에서, CIG3' 또는 전체 cDNA를 이용하여 얻어진 시간 공간적 발현 패턴은 절대적으로 동일하다. 이들 세가지 결과로부터 본 출원인은 CIG3' 및 CIG5'가 실제로 동일한 mRNA의 두 단편에 상응함을 확신할 수 있다.

Taq 폴리머라제에 의해 도입된 점 돌연변이가 일어나지 않도록, 본 출원인은 E12.5에서 척수의 ss-cDNA상에, 전체 cDNA의 4가지 독립적인 증폭을 수행한다. 본 출원인은 서열 번호 1에서 표현된 이 cDNA의 서열을 정확히 결정할 수 있다.

cDNA 서열 분석은 본 출원인이 전체 암호화 영역, 비암호화 5' 영역 및 비전사된 3' 영역의 일부를 분리함을 보여준다. 추가로, 상응하는 mRNA의 발현은 세로 밴드 형태로 배에서 검출된다. 이러한 특성은 래트 배 종축의 경우, 릴랙스로 불리는 cDNA를 야기한다.

실시예 3

BHLH 패밀리의 기타 단백질과 릴랙스의 bHLH 도메인의 아미노산 서열의 비교

릴랙스 cDNA에서 유도된 아미노산 서열의 분석은 이 단백질이 bHLH 패밀리의 일부임을 나타낸다. 릴랙스의 bHLH 도메인은 단백질 NeuroD의 bHLH 단위와 68%의 동일성을 공유한다(Lee et al., 1995). 추가로, 이는 릴랙스가 AS-C(Mash-1, Johnson et al., 1990)에 상동이기 보다 ato(Math-1, Akazawa et al., 1995)에 상동인 단백질과 좀더 서열 동일성을 공유함을 보인다(도 2). 그러나, 패밀리의 기타 멤버와의 bHLH 도메인 외부의, 총 서열 동일성의 부재는 릴랙스가 이미 확인된 단백질의 허위가 아님을 나타낸다. 이러한 이유로 인해, 릴랙스는 아마도 bHLH 단백질의 신규 서브패밀리의 제 1 멤버에 상응한다.

실시예 4

릴랙스 단백질의 전사 활성의 특징화

아미노산 서열 분석은 릴랙스가 bHLH 패밀리의 단백질과 일반 구조를 공유하고 있음을 나타낸다. 이들 단백질은 전사 인자이다. 따라서 릴랙스 cDNA가 특징이 전사 인자의 특징인, 즉 릴랙스가 bHLH 인자의 표적 부위상의 DNA에 결합할 수 있고, 전사를 조절할 수 있는, 단백질을 암호화함을 입증하는데 중요하다.

1. bHLH 패밀리의 단백질은 호모- 또는 헤테로다이머를 형성하고 DNA에 특징적으로 결합한다[참조문헌: Murre et al., 1989, Cell, 558, 537-44]. 시험관 내에서 DNA 결합 부위의 특징화는 컨센서스 헥사뉴클레오티드 서열, E 박스로 불리는 CANNTG의 동정을 허용한다(Murre et al., 1989). 본 출원인은 겔 이동 지연 실험에 의해, 정제된 재조합 릴랙스 단백질이 E 박스를 함유하는 서열에 특징적으로 결합할 수 있음을 보여준다. 이를 위해, 릴랙스 단백질을 암호화하는 DNA는 벡터 pFLAG-CTC 중의 NdeI과 KpnI 부위 사이에 삽입된다. 이. 콜라이에서 단백질의 발현 후, 융합 단백질 릴랙스-Flag는 친화성 컬럼상에 정제된 다음 E 박스를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 존재하에 결합 반응에 사용된다.

2. 릴랙스 단백질의 전사 활성은 부분적으로, 래트 갈색세포종에서 유도된 세포주 PC12에서 공형질감염 실험에 의해 시험된다.

이 경우, 본 출원인은 한 편으로는, E 박스를 함유하는 프로모터(TH 프로모터 5 kb), 및 다른 한편으로는, 돌연 변이된 E 박스를 함유하는 동일한 프로모터의 통제하에 놓인 루시퍼라제 리포터 유전자를 사용한다.

병행하여, 본 출원인은 하기와 같은 릴랙스 단백질을 발현시키는 벡터를 제조한다:

릴랙스 단백질을 암호화 하는 cDNA(위치 389에서 1235까지)는 CMV 프로모터의 다운스트림의 발현 벡터 pcDNA3 중의 EcoRI과 XhoI 부위 사이에 삽입된다. 5 kbp 단편상의 위치 197에서 E 박스 CAGGTG(서열 번호 6)를 운반하는 래트 TH 프로모터는 5kbTH-Luc로 되는 플라스미드 pKSLuc의 블런트 말단 HindIII 부위 중으로 삽입된다. 이 부위는 TCCGTG(서열 번호 7)로 돌연변이가 일어나고 생성된 플라스미드는 5kbTH(델타 E)-Luc로 불린다.

플라스미드 pcDNA3-릴랙스는 0 내지 5 pmol 범위의 다양한 양으로 공형질감염되고, 1 pmol 플라스미드 5 kbTH-Luc, 5 kb-TH(델타E)-Luc 또는 pKSLuc로 혼합된 PC12 세포(10⁶세포/플레이트)에서, 빈 벡터 pcDNA3와 함께 5 pmol에 이른다. 형질감염 효율을 평가하기 위해, RSV 프로모터의 통제하에 CAT(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제) 프로텐스를 암호화 하는 유전자를 발현시키기 위한 0.2 pmol 벡터도 공형질감염된다.

루시퍼라제 활성의 측정은, 릴랙스 단백질을 발현시키는 벡터의 양을 증가시키면서 이들 벡터를 공형질감염시킨 후, 릴랙스가 사용된 발현 벡터의 양에 좌우되는 리포터 유전자의 전사를 촉진하고 이 활성이 온전한 E 박스의 존재를 절대적으로 필요로 함을 입증한다.

실시예 5

배 발생동안 릴랙스 mRNA의 발현 부위의 특징화

본 출원인은 제자리 하이브리드화에 의해, 배 발생 동안 래트에서 릴랙스 mRNA의 분포를 조직적으로 분석했다. 이를 위해, 제자리 하이브리드화는 래트 배에서 안티-센스 리보탐침 전체 또는 250 ㎛ 절편을 이용하여 Wilkinson법에 따라 수행된다. 리보탐침은 Promega 리보탐침 키트를 사용하여 1 ㎍의 선형 플라스미드 및 3.5 nmol의 디그옥시게닌-11-UTP의 존재하에 제조된다. 이러한 상세한 분석은 릴랙스 mRNA의 발현이 일시적이고 공간적으로 제한됨을 보여준다.

이 mRNA는 11.5 및 18.5의 발생일에서, 단지 배에 존재한다. 이의 발현은 중추 신경계에 한정된다. 실제로, 말초 신경계, 또는 신경계 외부에서는 어떠한 발현도 검출되지 않는다. DNS의 내부에, 릴랙스 mRNA는 척수, 후뇌 및 전뇌에서만 발현된다.

좀더 정확하게는, 릴랙스 mRNA는 척수 및 후뇌의 종 구획에서 발현된다.

척수에서의 이의 분포는 좌우 대칭인 두개의 연속 밴드에 한정되고, 세로방향으로 조직화되며 D/V 축상에서, 기저 라미나, 배 말단에 하나, 등 말단에 하나에 한정된다.

전뇌에서, 릴랙스 mRNA는 시속교차 함요(視束交叉陷凹)의 일측에 위치된 두개의 세포 그룹, 시상하부의 배 영역 및 전이대체 영역에 위치된다. 릴랙스를 발현시키는 대부분의 세포 그룹은 기저부에 위치한다. 전이대체 영역의 소수의 세포만이 윙 영역(wing region)에 위치한다. 전뇌에서의 위치는 척수 및 후뇌에서의 것과 유사하다. 실제로, 릴랙스 발현 세포는 모든 경우에, 뇌실 지대에 정확히 위치한다.

실시예 6

배 발생 동안 릴랙스 mRNA의 발현 순간의 특징화

모든 릴랙스 발현 부위는 동시에 E11.5에 속한다. 이들은 복측배측 구배에 이은 뇌실 지대의 점진적인 감소에 따라, E16.5과 E18.5 사이의 척수에서 점차적으로 사라진다. 후뇌에서, 릴랙스의 발현은 척수의 중앙 밴드의 것과 동일한 시간대에 중단된다. 결국, 전뇌에서, 릴랙스의 발현은 E18.5 후에 사라진다. 릴랙스의 발현이 뇌실 지대에 한정되고 발현용 측두 창은 이들 상이한 구조에서 뉴런 생성의 경우와 일치함을 강조함에 있어 중요하다.

서열 목록

(1) 유전 정보:

(A) 성명: 로오느-푸우랜크 로레르 소시에테 아노님

(B) 거리: 아부뉴 레이몽 아롱 20

(C) 시: 앙또니

(E) 국가: 프랑스공화국

(F) 우편번호: 92165

(ii) 발명의 명칭: bHLH 패밀리의 폴리펩티드, 및 상응하는 핵산 서열

(iii) 서열 번호:7

(iv) 컴퓨터 판독형태:

(A) 매체형:테이프

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환 기종

(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25(EPO)

(2) 서열 번호: 1의 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 1491 염기쌍

(B) 타입: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자형: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iii) 안티센스: 없음

(vi) 기원:

(A) 유기체: 래트

(xi) 서열 배열: 서열 번호: 1

(3) 서열 번호:2의 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 24 염기쌍

(B) 타입: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자형: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iii) 안티센스: 없음

(xi) 서열 배열: 서열 번호: 2

(4) 서열 번호:3의 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 24 염기쌍

(B) 타입: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자형: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iii) 안티센스: 없음

(xi) 서열 배열: 서열 번호: 3:

(5) 서열 번호: 4의 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 25 염기쌍

(B) 타입: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자형: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iii) 안티센스: 없음

(xi) 서열 배열: 서열 번호: 4

(6) 서열 번호: 5의 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 18 염기쌍

(B) 타입: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자형: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iii) 안티센스: 없음

(xi) 서열 배열: 서열 번호: 5:

(6) 서열 번호:6의 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 6 염기쌍

(B) 타입: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자형: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iii) 안티센스: 없음

(xi) 서열 배열: 서열 번호: 6:

6) 서열 번호:7의 정보

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 6 염기쌍

(B) 타입: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자형: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iii) 안티센스: 없음

(xi) 서열 배열: 서열 번호: 7:

Claims

bHLH 도메인의 수준에서만 bHLH형 단백질과의 서열 상동성을 공유함을 특징으로 하는, 전사 활성이 부여된 bHLH형 폴리펩티드.
서열번호 1에 의해서 완전히 또는 부분적으로 표현됨을 특징으로 하는, 전사 활성을 지니는 폴리펩티드 또는 이의 유도체.
제 1 항 또는 2 항에 있어서, 서열번호 1에 표현된 서열을 지님을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 릴랙스 단백질임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열.
서열번호 1에 의해서 완전히 또는 부분적으로 표현됨을 특징으로 하는 핵산 서열, 이의 상보적 본쇄 또는 이의 유도체.
제 6 항에 있어서, 서열번호 1에 의해서 표현됨을 특징으로 하는 핵산 서열 또는 이의 상보적 본쇄.
제 5 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
제 8 항에 있어서, 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
제 9 항에 있어서, 아데노바이러스, 레트로바이러스, AAV, HSV 바이러스, CMV 바이러스 또는 박시니아 바이러스로부터 유도된 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
제 9 항 또는 10 항에 있어서, 복제에 결함이 있는 바이러스임을 특징으로 하는 벡터.
유전자 발현을 조절하고/하거나 이에 참여하기 위한, 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
제 5 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 핵산 서열과 제 8 항 내지 11 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 벡터를 포함하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
신경계에 영향을 미치는 병리 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 제 5 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 따른 서열 또는 이러한 서열을 함유하는 벡터의 용도.