CA2275454A1 - Polypeptides de la famille "basic helix-loop-helix" bhlh, sequences d'acides nucleiques correspondantes - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à une nouvelle protéine de type bHLH et à la séquence nucléique codante correspondante. Elle vise également des vecteurs d'expression intégrant ladite séquence et l'utilisation de cette séquence ou protéine à des fins thérapeutiques.
Description
WO 98!27206 PCTIFR97102368 POLYPEPTIDES DE LA FAMILLE "BASIC HÉLIX-LOOP-HÉLIX" BHLH) SÉQUENCES D'ACIDES
CORRESPONDANTES
La présente invention se rapporte à une nouvelle protéine de type bHLH et à la séquence nucléique codante correspondante. Elle vise également des vecteurs d'expression intégrant ladite séquence et l'utilisation de cette séquence ou protéine à
des fans thérapeutiques.
Le tube neuronal embryonnaire est à l'origine composé d'un neuroépithélium non différencié sur toute sa longueur. Les cellules se dit~érencient ensuite, selon leurs positions sur les axes antérieur/postérieur, dorsal/ventral et médium/latéral générant alors des structures neuronales différentes. Cette différenciation est en partie contrôlée par des facteurs génétiques qui sous-divisent le tube neuronal en plusieurs régions histogéniques. On sait aujourd'hui que de nombreux facteurs transcriptionnels et plus particulièrement des produits codés par des gènes dits bHLH " Basic Helix Loop Helix" (Caudy et al., 1988, Cell, 55, 1061-67) sont impliqués dans ce phénomène de I S différenciation. Les protéines de cette famille présentent des motifs d'acides aminés très conservés et plus particulièrement un domaine basique suivi des Hélice 1 et Hélice
CORRESPONDANTES
La présente invention se rapporte à une nouvelle protéine de type bHLH et à la séquence nucléique codante correspondante. Elle vise également des vecteurs d'expression intégrant ladite séquence et l'utilisation de cette séquence ou protéine à
des fans thérapeutiques.
Le tube neuronal embryonnaire est à l'origine composé d'un neuroépithélium non différencié sur toute sa longueur. Les cellules se dit~érencient ensuite, selon leurs positions sur les axes antérieur/postérieur, dorsal/ventral et médium/latéral générant alors des structures neuronales différentes. Cette différenciation est en partie contrôlée par des facteurs génétiques qui sous-divisent le tube neuronal en plusieurs régions histogéniques. On sait aujourd'hui que de nombreux facteurs transcriptionnels et plus particulièrement des produits codés par des gènes dits bHLH " Basic Helix Loop Helix" (Caudy et al., 1988, Cell, 55, 1061-67) sont impliqués dans ce phénomène de I S différenciation. Les protéines de cette famille présentent des motifs d'acides aminés très conservés et plus particulièrement un domaine basique suivi des Hélice 1 et Hélice
2. Ces deux derniers motifs sont séparés par une boucle de taille variable.
Chez les vertébrés, certains produits de ces gènes bHLH participent aux différentes étapes de neurogénèse au cours de la détermination et différenciation neuronales. A
titre représentatif de ces protéines, on peut notamment citer les protéines Math-1 (Akazawa et al., 1995, J. Bol. Chem., 279,8730-38) Mash-1 (Johnson et al., 1990, 346, 858-61) et NeuroD (Lee et al., 1995, Sciences, 268, 836-44). A l'évidence, d'autres protéines comportant ce domaine bHLH interviennent dans le développement neuronal au niveau d'autres sites et à des temps variables. L'identification de nouvelles protéines de FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) WO 98!27206 PCT/FR97/02368 type bHLH serait particulièrement précieuse pour améliorer notre compréhension de la neurogénèse et donc avantageuse sur le plan thérapeutique.
La présente invention a précisément pour objet !'isolément, le séquençage et la caractérisation d'un ADNc codant pour un polypeptide appartenant à une nouvelle famille de protéines de type bHLH. Elle décrit aussi des ADN recombinants incorporant cette séquence, des vecteurs la contenant et leur utilisation pour activer l'expression de protéines recombinantes.
La demanderesse a ainsi mis en évidence un polypeptide possédant une homologie importante avec les protéines bHLH déjà identifiée, homologie limitée au niveau du domaine bHLH. En effet, de manière inattendue, les régions bordant ce domaine bHLH ne partagent aucune identité de séquence avec celles des autres protéines de type bHLH.
En conséquence, la présente invention a pour premier objet un polypeptide de type bHLH doté d'une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il partage une homologie de séquence avec les protéines de type bHLH uniquement au niveau de son domaine bHLH.
Plus précisément la présente invention se rapporte à un polypeptide possédant une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il est représenté en tout ou partie par la SEQ ID N° 1 ou l'un de ses dérivés.
Par dérivé, on entend au sens de la présente invention les produits comportant par exemple des modifications au niveau de la structure primaire, telles que des délétions d'un ou plusieurs résidus) des substitutions d'un ou plusieurs résidus, et/ou des modifications au niveau d'un ou plusieurs résidus. Le nombre de résidus affectés par les modifcations peut ëtre par exemple de I. 2, ou de 3 à J 0. 20 ou 30 résidus. Le
Chez les vertébrés, certains produits de ces gènes bHLH participent aux différentes étapes de neurogénèse au cours de la détermination et différenciation neuronales. A
titre représentatif de ces protéines, on peut notamment citer les protéines Math-1 (Akazawa et al., 1995, J. Bol. Chem., 279,8730-38) Mash-1 (Johnson et al., 1990, 346, 858-61) et NeuroD (Lee et al., 1995, Sciences, 268, 836-44). A l'évidence, d'autres protéines comportant ce domaine bHLH interviennent dans le développement neuronal au niveau d'autres sites et à des temps variables. L'identification de nouvelles protéines de FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) WO 98!27206 PCT/FR97/02368 type bHLH serait particulièrement précieuse pour améliorer notre compréhension de la neurogénèse et donc avantageuse sur le plan thérapeutique.
La présente invention a précisément pour objet !'isolément, le séquençage et la caractérisation d'un ADNc codant pour un polypeptide appartenant à une nouvelle famille de protéines de type bHLH. Elle décrit aussi des ADN recombinants incorporant cette séquence, des vecteurs la contenant et leur utilisation pour activer l'expression de protéines recombinantes.
La demanderesse a ainsi mis en évidence un polypeptide possédant une homologie importante avec les protéines bHLH déjà identifiée, homologie limitée au niveau du domaine bHLH. En effet, de manière inattendue, les régions bordant ce domaine bHLH ne partagent aucune identité de séquence avec celles des autres protéines de type bHLH.
En conséquence, la présente invention a pour premier objet un polypeptide de type bHLH doté d'une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il partage une homologie de séquence avec les protéines de type bHLH uniquement au niveau de son domaine bHLH.
Plus précisément la présente invention se rapporte à un polypeptide possédant une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il est représenté en tout ou partie par la SEQ ID N° 1 ou l'un de ses dérivés.
Par dérivé, on entend au sens de la présente invention les produits comportant par exemple des modifications au niveau de la structure primaire, telles que des délétions d'un ou plusieurs résidus) des substitutions d'un ou plusieurs résidus, et/ou des modifications au niveau d'un ou plusieurs résidus. Le nombre de résidus affectés par les modifcations peut ëtre par exemple de I. 2, ou de 3 à J 0. 20 ou 30 résidus. Le
3 terme dérivé comprend également les molécules comportant des parties supplémentaires internes ou terminales, de nature peptidique ou non. Il peut s'agir notamment de parties actives, de marqueurs, d'acides aminés, tels qu'une méthionine en position -1. Le terme dérivé comprend également les molécules comportant des modifications au niveau de la structure tertiaire (extrémité N-terminale, etc).
Ces dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'a~nité du peptide pour son ou ses sites d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Préférentiellement, les dérivés partagent au moins une homologie structurale avec la protéine revendiquée et plus préférentiellement au moins au niveau des régions bordant le domaine bHLH, et conservent sa propriété biologique d'activateur transcriptionnel. Les dérivés peuvent également apporter de nouvelles propriétés aux polypeptides revendiqués (marquage,... ) ou améliorer leurs propriétés (stabilité, activité biologique etc).
De préférence, il s'agit d'un polypeptide de type bHLH possédant la séquence représentée en SEQ ID N° 1. II s'agit plus préférentiellement d'une protéine comprenant un cadre de lecture ouvert, de 214 acides aminés dont l'expression de l'ARNm correspondant est détectée chez l'embryon de rat sous forme de bandes longitudinales. Cette protéine est désignée ci-après sous la dénommination Relax pour "Rat Embryonic Longitudinal Axis" et constitute un des objets revendiqués selon la presente invention.
La comparaison de la séquence d'acides aminés de Relax avec celles de protéines déjà disponibles a permis d'établir une corrélation de séquence
Ces dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'a~nité du peptide pour son ou ses sites d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Préférentiellement, les dérivés partagent au moins une homologie structurale avec la protéine revendiquée et plus préférentiellement au moins au niveau des régions bordant le domaine bHLH, et conservent sa propriété biologique d'activateur transcriptionnel. Les dérivés peuvent également apporter de nouvelles propriétés aux polypeptides revendiqués (marquage,... ) ou améliorer leurs propriétés (stabilité, activité biologique etc).
De préférence, il s'agit d'un polypeptide de type bHLH possédant la séquence représentée en SEQ ID N° 1. II s'agit plus préférentiellement d'une protéine comprenant un cadre de lecture ouvert, de 214 acides aminés dont l'expression de l'ARNm correspondant est détectée chez l'embryon de rat sous forme de bandes longitudinales. Cette protéine est désignée ci-après sous la dénommination Relax pour "Rat Embryonic Longitudinal Axis" et constitute un des objets revendiqués selon la presente invention.
La comparaison de la séquence d'acides aminés de Relax avec celles de protéines déjà disponibles a permis d'établir une corrélation de séquence
4 essentiellement avec les protéines de type bHLH. Par ailleurs, cette homologie a été
localisée uniquement au niveau du domaine bHLH. Le domaine bHLH de Relax partage ainsi respectivement 68%, 57% et 40% d'homologie avec les domaines bHLH
des protéines NeuroD, Math-1 et Mash-1.
Des tests d'activité réalisés avec la protéine Relax et plus précisément discutés dans les exemples ci-après, il ressort que cette protéine est capable de se lier spécifiquement à une séquence de boîte E et que dans des essais de cotransfection, elle se comporte comme un activateur transcriptionnel et que cette activité est strictement dépendante de !a présence d'une boîte E intacte. L'ensemble de c.es observations démontre l'appartenance de la protéine Relax ò evendiquée à une nouvelle famille de protéines bHLH.
La présente invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique susceptible d'exprimer un polypeptide de type bHLH tel que défini précédemment.
Plus précisément, la présente invention vise une séquence d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle est représentée en tout ou partie par la SEQ ID
N° 1, son brin complémentaire ou son dérivé.
Les acides nucléiques revendiqués peuvent être des fragments d'ADN
complémentaire (ADNc), d'ADN génomique (ADNg) ou des fragments d'ARN. II
s'agit plus préférentiellement d' ADNc ou d'ADNg Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique.
ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et dont le produit possède l'activité indiquée WO 98!27206 PCT/FR97/02368 Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus.
De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'améliorer ses niveaux de productioncelui d'augmenter et/ou de modifier son activité, S ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les séquences nucléiques chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à
une extrêmité, de type par exemple constructions hybrides consistant en un ADNc auquel serait associé un ou plusieurs introns.
De même au sens de !'invention, les acides nucléiques revendiqués peuvent comprendre des séquences promotrices, d'activation, de régulation. etc Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type ou de type I 5 substanciellement similaire. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent ëtre réalisées à
partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions de stringence conventionnelles (Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire), ou, de préférence, dans des conditions de stringence élevées.
Plus .préférentiellement il s'agit de la séquence d'acide nucléique représentée en SEQ ID N°i ou de son brin complémentaire.
La présente invention entend également couvrir les séquences antisens correspondantes dont l'expression permet de contrôler la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie de la séquence nucléique considérée, transcrite dans l'orientation inverse Elles sont WO 98/2720b PCTIFR97/02368 complémentaires ou significativement complémentaires à la séquence d'acide nucléique en tout ou partie.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des polypeptides revendiqués pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes. Ces activateurs transcriptionnels peuvent être tout particulièrement avantageux pour cibler l'expression d'une protéine au niveau du système nerveux central.
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessus, incorporée ou non dans un ADN recombinant, en utilisant les techniques connues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques.
Préférentiellement, les séquences nucléiques selon l'invention font partie d'un vecteur utile pour induire in vivo, ex vivo et/ou in vitro l'expression des polypeptides revendiqués. Le vecteur utilisé peut être d'origines diverses, dès lors qu'il est capable de transformer Les cellules animales, de préférence les cellules nerveuses humaines.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut dériver des adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés (AAV), du virus de l'herpès, du cytomégalovirus (CMV)) du virus de la vaccine, etc. Des vecteurs dérivés des adénovirus, des rétrovirus, ou des AAV incorporant des séquences d'acides nucléiques hétérologues ont été décrits dans la littérature [Akli et al., Nature Genetics 3 ( 1993 ) 224 ; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy I ( 1990) 241 ; EP
185 573, Levrero et al., Gene 1 O 1 ( 1991 ) 195 ; Le Gal la Salle et al., Science 259 ( 1993 ) 988 : Roemer et Friedmann. Eur. 3 Biochem. 208 ( 1992) 21 1 ; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353 ; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739 : Miyanohara et al., New Biol 4 (1992) 238 : W0911i8088J.
La présente invention concerne donc également tout virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, une séquence nucléique telle que définie avant.
Avantageusement, le virus recombinant selon l'invention est un virus défectif.
Le terme "virus défectif' désigne un virus incapable de se répliquer dans la cellule cible. Généralement) le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par l'acide nucléique de l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à
l'encapsidation des particules virales II est particulièrement avantageux d'utiliser les séquences nucléiques de l'invention sous forme incorporée à un adénovirus, un AAV ou un rétrovirus recombinant défectif. Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus.
I S II existe différents sérotypes d'adénovirus. dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi fes adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 ( 1990) 81 ). ovine. porcine. aviaire ou encore simienne (exemple : SAV).
De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin) plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800 ) par exemple] . De préférence. on utilise dans le cadre de l'invention des WO 98!27206 PCT/FR97/02368 adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, dans ie génome des adériovirus de l'invention, Ia région E 1 au moins est non fonctionnelle.
Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de (homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou S addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment ia région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et LS
(W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus comprend une délétion dans les régions E 1 et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il I 0 comprend une délétion dans la région E I au niveau de lacuelle sont insérés la région E4 et la séquence codant. Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région E I
s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus AdS. Selon un autre mode de réalisation préféré, la séquence d'acide nucléique exogène est insérée au niveau de la délétion dans la région E I .
Les virus recombinants défectifs de l'invention peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un virus défectif et un plasmide portant entre autre la séquence nucléotidique telle que définie ci-avant (Levrero et al., Gene 101 ( 1991 ) 195;
Graham, EMBO J. 3( 12) ( 1984) 2917). La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits virus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments) et (ü), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome du virus défectif. de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation d'adénovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire immain 293 (Graham et al.. J Gen. Virol. 36 ( 1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 ( I 2 %). A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation de rétrovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 ( I988) 6460). Ensuite) les virus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
Le vecteur, l'acide nucléique ou le polypeptide de l'invention peut être sous une forme isolée ou purifiée.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une séquence nucléotidique, un vecteur ou un polypeptide selon l'invention.
Elle se rapporte également à toute utilisation d'une séquence ou d'un vecteur tels que revendiqués pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies affectant le système nerveux.
Enfin l'invention s'étend en outre à toute utilisation des poiypeptides 1 S revendiqués pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes.
Les exemples et figures présentés ci-après à titre illustratif et non limitatif mettent en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
FIGURES
Figure l: Séquence nucléotidique de l'ADNc CIG235. Sur cette séquence sont indiqués les différents oligonucléotides utilisés pour isoler l'ADNc complet.
Les flèches indiquent l'orientation 5' vers 3' de ces oligonucléotides.
W~ 98/27206 PCT/FR97/02368 Figure 2 : Comparaison des séquences en acides aminés du domaine bHLH de Relax avec d'autres protéines de la famille. En noir sont notés les acides aminés homologues, en gris les acides aminés de structure proche.
S EXEMPLE I
Amplification directe par PCR des séquences comprises entre les domaines basique et l'Hélice II à l'aide d'oligonucléotides dégénérés.
L'isolement de l'ADNc codant de nouveaux facteurs de transcription de la famille bHLH est effectué à partir de GCS de rat ( Rat Superior Cervical Ganglia) .
Les 10 protéines de cette familie présentant des motifs d'acides am~nés très conservés, en particulier un domaine basique suivi des Hélice I et Hélice 2, il est choisi des oligonucléotides dégénérés codant ces diverses régions conservées. Ils ont donc été
sélectionnés de manière à conserver les régions basiques et le domaine Hélice II du complexe Drosophilia ac~haete-.rc~~te et des gènes mammifères bHLH tels que Mash-1, I S Mash-2 et M-Twist. De tels oligonucléotides ont été utilisés respectivement comme amorce sens et antisens d'une part, pour réaliser un criblage direct d'une banque de GCS construite par PCR, et d'autre part pour effectuer des PCR sur des ADNc-sb de GCS.
L'oligonucléotide sens a été choisi dans le domaine basique de ces protéines bHLH, il s'agit plus précisément de l'oligonucléotide correspondant au fragment polypeptidique suivant: S'-AATKHGMGIGAGCGCIDKCGCRYG-3' (SEQ ID N°2) L'oligonucléotide antisens a quant à lui été déterminé à partir du domaine Hélice II des mêmes protéines bHLH. Il s'agit de l'oligonucléatide correspondant au fragment polypeptidique suivant : 5'-GGCSRDTYTCAGGGTSYBGAYCTT-3' (SEQ ID N°3 ) L'ADNc monobrin (ss-ADNc) est préparé à partir de SOOng d'ARNpoIyA' dénaturé issu du GCS de rats, agés de deux jours.
L'amplification par PCR est effectuée sur un mélange comprenant outre le tampon PCR (IOmM Tris, pH 8,3, SOmM Kcl, 2,SmM MgCl2), 200p.M dNTP, 12, 5 uM de chaque oligonucléotide et environ 20ng de ss-ADNc. La PCR est effectué
en réalisant successivement 3 minutes de dénaturation à 94°C; 2 cycles ( 94°C pendant 3 0 sec. ; 50°C pendant 45 sec. ; 72°c pendant 1, 5 mi n. ) suivi s de 3 8 cycles ( 94C
pendant 30 sec.; 62°C pendant 45 sec.; 72)C pendant 1,5 min.). Les produits de PCR
sont clonés au site SmaI de pUC I 9 et les 1500 clones ainsi obtenus, analysés par séquençage. Nous avons recherché Ia présence d'un motif Hélice I dans la séquence en acides aminés déduite de la séquence nucléotidique de ces différents ADNc. Une large proportion de ces ADNc (670) contiennent un tel motif, et parmi eux, un seul correspond à un nouveau membre possible de la famille bHLH. Les autres ADNc isolés correspondent à des protéines bHLH connues.
Le nouvel ADNc isolé, appelé C1G235 et représenté en figure 1, correspond à un fragment de 76 nucléotides (en excluant les séquences correspondant aux oligonucléotides introduits par la PCR). Les alignements de séquences en acides aminés ont été effectués en n'autorisant ni les insertions ni les délétions.
Ces alignements montrent que ce fragment code un motif homologue au motif Hélice I
des protéines bHLH . L'isolement de l'ADNc complet a ensuite été entrepris.
Isolement de l'ADNc complet correspondant à CIG235.
L'isolement de l'ADNc complet correspondant à CIG23 5 a été extrêmement dif~'~cile, car l'ARNm correspondant à CIG235 est très peu exprimé dans le GCS. Il semble même que son niveau d'expression soit proche de celui de la transcription illégitime. La technique retenue consiste d'une part à isoler l'extrémité 3' de l'ADNc correspondant à CIG23 5 par PCR ancrée et d'autre part à isoler l'extrémité 5' de cet ADNc à partir de moelle épinière d'embryons de rat au stade E12,5.
l.l:xle».sio» c~e l'ADNc~ ('IG?3J e» 3' pca~ l'C,R arrcwéc~.
Pour cela, des ADNc-sb de GCS sont préparés avec l'amorce RA3' NV (amorce de transcription inverse aléatoire portant l'ancre 3' NV) selon la méthode Dumas Milne Edwards et al ( 1995, A Pratical Approach Ed McPherson et al.) pp89-1 18, IRL
Press Oxford U. K. ). Deux amorces emboitées spécifiques sont choisies dans le clone positif bEiLH de 76 nucléotides:CIGS' 1 5'-AACCTTAACTCCGCGCTGGATGCGC-3' (SEQ ID N°4) et CIGS'-2 : 5'-CGCGGTGTCCTGCCCACC-3' (SEQ ID N°5).
Nous avons ensuite amplifié l'extrémité 3' de CIG235 par deux PCR emboîtées avec les couples d'oligonucléotides CIGS' I et A3'-1 puis CIGS'2 et A3' 2. Le mélange PCR identifié en exemple l, est utilisé avec seulement 0,8~M de chacun des oligonucléotides et une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 sec.
suivi d'une étape d'élongation à 72°C pendant 1,5 min. L"'annealing" est effectué pendant 45 sec. avec des variations de température Lors des dix premiers cycles cette température est réduite de 1 °C tous les deux cycles de 70°C à 65°C puis maintenue à 65°C au cours de cycles. Les produits résultant sont clonés dans pUC 19 et séquencés. Nous avons ainsi obtenu un ADNc de 717 nucléotides. appelé CIG3', dont la partie 5' correspond à
25 l'extrémité 3' du clone CIG23 ~. L'analyse des phases ouvertes de lectures montre que WO 98lZ7206 PCTIFR97102368 la totalité de la séquence codant l'extrémité carboxy-terminale de la protéine a été
isolée avec 321 nucléotides de région 3' non codante.
2.Isolement de l'extrémité 5' correspondant à CIG3' à parür de moelle épinière d'emhiyorrs de rat au stade E12.5.
Nous avons recherché par hybridation in .sitzr le patron d'expression de l'ARNm correspondant à CIG3'. Son expression est estimée à différents stades du développement embryonnaire. La méthode choisie est celle de l'hybridation in .situ sur coupes épaisses d'embryons de rat avec une sonde marquée à la digoxygénine.
Cette méthode est en fait une adaptation de celle décrite pour l'hybridation in toto ( 1994, A
Pratical Approach, Ed Wilkinson et al., pp75-83, IRL Press Oxford U.K. ), et permet de cribler rapidement des embryons entiers à de nombreux stades différents.
Une forte expression de cet ARNm a été détectée dans la moelle épinière, au jour embryonnaire I 2. 5 (E 12. 5 ). Nous avons donc préparé des ARNm à partir de moelle épinière à ce stade de développement, et effectué l'isolement de l'extrémité 5' par la méthode SLIC. Un produit de PCR de 893 nucléotides est isolé et appelé
CIGS' L'ADNc CIG3' et CIGS' se recouvrent sur une région de 120 nucléotides et forment un ADNc total dont la taille est de 1491 nucléotides.
Cependant, CIG3' et CIGS' n'ayant pas été isolés à partir du méme tissu, il était nécessaire de montrer que le contigue généré par l'alignement de ces deux clones correspondait bien à un ARNm existant et non pas à une chimère jénérée par PCR.
Nous avons donc vérifié par PCR, après transcription inverse, que l'AIL'V'm total est présent dans la moelle épinière à E 12.5. Dans ce tissu, une seule amplification par PCR
permet de visualiser cet .ARNm dans son intégralité. De plus. l'analyse des ARNm par Northern blot montre que les sondes CIG3', CIGS' et l'ADNc total permettent toutes WO 98!27206 PCTIFR97/02368 trois de détecter un seul ARNm de 3.1 kb. Enfin, en hybridation in situ, le patron d'expression spatio-temporel obtenu avec CIG3' ou avec l'ADNc total est absolument identique. Ces trois résultats nous permettent d'affirmer que CIG3' et CIGS' correspondent bien à deux fragments d'un même ARNm.
Afin de s'affranchir des mutations ponctuelles introduites par la Taq polymérise, nous avons effectué, sur des ADNc-sb de moelle à EI2.5) quatre amplifications indépendantes de la totalité de l'ADNc. Nous avons ainsi pu déterminer de manière fiable la séquence de cet ADNc qui est représenté en SEQ ID N° 1.
L'analyse de la séquence de l'ADNc montre que nous avons isolé la totalité de la région codante, la région 5' non codante ainsi qu'une partie de la région 3' non traduite.
De plus, l'expression de l'ARNm correspondant est détectée, chez !'embryon, sous forme de bandes longitudinales. Cette caractéristique a conduit à désigner cet ADNc Relax, pour Rat embryonic longitudinal axis.
Comparaison de séquences en acides aminés du domaine bHLH de Relax avec d'autres protéines de la famille BHLH.
L'analyse de la séquence en acides aminés déduite dg l'ADNc Relax indique clairement que cette protéine fait partie de la famille des bHLH. Le domaine bHLH de Relax partage une identité de 68% avec le motif bHLH de la protéine NeuroD
(Lee et col!., 1995). De plus, il apparaît que Refax partage plus d'identités de séquences avec les protéines homologues de ato (Math-1, Akazawa et col!., 1995 ) qu'avec celles homologues d' AS-C (Mash-1, Johnson et col!., 1990) (Figure 2). Cependant, l'absence totale d'identité de séquence, en dehors du domaine bHLH, avec les autres membres de la famille révèle que Relax n'est pas le paralo~ue d'une protéine déjà
identifiée. Pour cette raison, Relax correspond vraisemblablement au premier membre d'une nouvelle sous-famille de protéines bHLH.
localisée uniquement au niveau du domaine bHLH. Le domaine bHLH de Relax partage ainsi respectivement 68%, 57% et 40% d'homologie avec les domaines bHLH
des protéines NeuroD, Math-1 et Mash-1.
Des tests d'activité réalisés avec la protéine Relax et plus précisément discutés dans les exemples ci-après, il ressort que cette protéine est capable de se lier spécifiquement à une séquence de boîte E et que dans des essais de cotransfection, elle se comporte comme un activateur transcriptionnel et que cette activité est strictement dépendante de !a présence d'une boîte E intacte. L'ensemble de c.es observations démontre l'appartenance de la protéine Relax ò evendiquée à une nouvelle famille de protéines bHLH.
La présente invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique susceptible d'exprimer un polypeptide de type bHLH tel que défini précédemment.
Plus précisément, la présente invention vise une séquence d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle est représentée en tout ou partie par la SEQ ID
N° 1, son brin complémentaire ou son dérivé.
Les acides nucléiques revendiqués peuvent être des fragments d'ADN
complémentaire (ADNc), d'ADN génomique (ADNg) ou des fragments d'ARN. II
s'agit plus préférentiellement d' ADNc ou d'ADNg Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique.
ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et dont le produit possède l'activité indiquée WO 98!27206 PCT/FR97/02368 Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus.
De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'améliorer ses niveaux de productioncelui d'augmenter et/ou de modifier son activité, S ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les séquences nucléiques chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à
une extrêmité, de type par exemple constructions hybrides consistant en un ADNc auquel serait associé un ou plusieurs introns.
De même au sens de !'invention, les acides nucléiques revendiqués peuvent comprendre des séquences promotrices, d'activation, de régulation. etc Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type ou de type I 5 substanciellement similaire. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent ëtre réalisées à
partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions de stringence conventionnelles (Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire), ou, de préférence, dans des conditions de stringence élevées.
Plus .préférentiellement il s'agit de la séquence d'acide nucléique représentée en SEQ ID N°i ou de son brin complémentaire.
La présente invention entend également couvrir les séquences antisens correspondantes dont l'expression permet de contrôler la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie de la séquence nucléique considérée, transcrite dans l'orientation inverse Elles sont WO 98/2720b PCTIFR97/02368 complémentaires ou significativement complémentaires à la séquence d'acide nucléique en tout ou partie.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des polypeptides revendiqués pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes. Ces activateurs transcriptionnels peuvent être tout particulièrement avantageux pour cibler l'expression d'une protéine au niveau du système nerveux central.
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessus, incorporée ou non dans un ADN recombinant, en utilisant les techniques connues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques.
Préférentiellement, les séquences nucléiques selon l'invention font partie d'un vecteur utile pour induire in vivo, ex vivo et/ou in vitro l'expression des polypeptides revendiqués. Le vecteur utilisé peut être d'origines diverses, dès lors qu'il est capable de transformer Les cellules animales, de préférence les cellules nerveuses humaines.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut dériver des adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés (AAV), du virus de l'herpès, du cytomégalovirus (CMV)) du virus de la vaccine, etc. Des vecteurs dérivés des adénovirus, des rétrovirus, ou des AAV incorporant des séquences d'acides nucléiques hétérologues ont été décrits dans la littérature [Akli et al., Nature Genetics 3 ( 1993 ) 224 ; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy I ( 1990) 241 ; EP
185 573, Levrero et al., Gene 1 O 1 ( 1991 ) 195 ; Le Gal la Salle et al., Science 259 ( 1993 ) 988 : Roemer et Friedmann. Eur. 3 Biochem. 208 ( 1992) 21 1 ; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353 ; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739 : Miyanohara et al., New Biol 4 (1992) 238 : W0911i8088J.
La présente invention concerne donc également tout virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, une séquence nucléique telle que définie avant.
Avantageusement, le virus recombinant selon l'invention est un virus défectif.
Le terme "virus défectif' désigne un virus incapable de se répliquer dans la cellule cible. Généralement) le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par l'acide nucléique de l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à
l'encapsidation des particules virales II est particulièrement avantageux d'utiliser les séquences nucléiques de l'invention sous forme incorporée à un adénovirus, un AAV ou un rétrovirus recombinant défectif. Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus.
I S II existe différents sérotypes d'adénovirus. dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi fes adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 ( 1990) 81 ). ovine. porcine. aviaire ou encore simienne (exemple : SAV).
De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin) plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800 ) par exemple] . De préférence. on utilise dans le cadre de l'invention des WO 98!27206 PCT/FR97/02368 adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, dans ie génome des adériovirus de l'invention, Ia région E 1 au moins est non fonctionnelle.
Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de (homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou S addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment ia région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et LS
(W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus comprend une délétion dans les régions E 1 et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il I 0 comprend une délétion dans la région E I au niveau de lacuelle sont insérés la région E4 et la séquence codant. Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région E I
s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus AdS. Selon un autre mode de réalisation préféré, la séquence d'acide nucléique exogène est insérée au niveau de la délétion dans la région E I .
Les virus recombinants défectifs de l'invention peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un virus défectif et un plasmide portant entre autre la séquence nucléotidique telle que définie ci-avant (Levrero et al., Gene 101 ( 1991 ) 195;
Graham, EMBO J. 3( 12) ( 1984) 2917). La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits virus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments) et (ü), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome du virus défectif. de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation d'adénovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire immain 293 (Graham et al.. J Gen. Virol. 36 ( 1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 ( I 2 %). A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation de rétrovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 ( I988) 6460). Ensuite) les virus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
Le vecteur, l'acide nucléique ou le polypeptide de l'invention peut être sous une forme isolée ou purifiée.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une séquence nucléotidique, un vecteur ou un polypeptide selon l'invention.
Elle se rapporte également à toute utilisation d'une séquence ou d'un vecteur tels que revendiqués pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies affectant le système nerveux.
Enfin l'invention s'étend en outre à toute utilisation des poiypeptides 1 S revendiqués pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes.
Les exemples et figures présentés ci-après à titre illustratif et non limitatif mettent en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
FIGURES
Figure l: Séquence nucléotidique de l'ADNc CIG235. Sur cette séquence sont indiqués les différents oligonucléotides utilisés pour isoler l'ADNc complet.
Les flèches indiquent l'orientation 5' vers 3' de ces oligonucléotides.
W~ 98/27206 PCT/FR97/02368 Figure 2 : Comparaison des séquences en acides aminés du domaine bHLH de Relax avec d'autres protéines de la famille. En noir sont notés les acides aminés homologues, en gris les acides aminés de structure proche.
S EXEMPLE I
Amplification directe par PCR des séquences comprises entre les domaines basique et l'Hélice II à l'aide d'oligonucléotides dégénérés.
L'isolement de l'ADNc codant de nouveaux facteurs de transcription de la famille bHLH est effectué à partir de GCS de rat ( Rat Superior Cervical Ganglia) .
Les 10 protéines de cette familie présentant des motifs d'acides am~nés très conservés, en particulier un domaine basique suivi des Hélice I et Hélice 2, il est choisi des oligonucléotides dégénérés codant ces diverses régions conservées. Ils ont donc été
sélectionnés de manière à conserver les régions basiques et le domaine Hélice II du complexe Drosophilia ac~haete-.rc~~te et des gènes mammifères bHLH tels que Mash-1, I S Mash-2 et M-Twist. De tels oligonucléotides ont été utilisés respectivement comme amorce sens et antisens d'une part, pour réaliser un criblage direct d'une banque de GCS construite par PCR, et d'autre part pour effectuer des PCR sur des ADNc-sb de GCS.
L'oligonucléotide sens a été choisi dans le domaine basique de ces protéines bHLH, il s'agit plus précisément de l'oligonucléotide correspondant au fragment polypeptidique suivant: S'-AATKHGMGIGAGCGCIDKCGCRYG-3' (SEQ ID N°2) L'oligonucléotide antisens a quant à lui été déterminé à partir du domaine Hélice II des mêmes protéines bHLH. Il s'agit de l'oligonucléatide correspondant au fragment polypeptidique suivant : 5'-GGCSRDTYTCAGGGTSYBGAYCTT-3' (SEQ ID N°3 ) L'ADNc monobrin (ss-ADNc) est préparé à partir de SOOng d'ARNpoIyA' dénaturé issu du GCS de rats, agés de deux jours.
L'amplification par PCR est effectuée sur un mélange comprenant outre le tampon PCR (IOmM Tris, pH 8,3, SOmM Kcl, 2,SmM MgCl2), 200p.M dNTP, 12, 5 uM de chaque oligonucléotide et environ 20ng de ss-ADNc. La PCR est effectué
en réalisant successivement 3 minutes de dénaturation à 94°C; 2 cycles ( 94°C pendant 3 0 sec. ; 50°C pendant 45 sec. ; 72°c pendant 1, 5 mi n. ) suivi s de 3 8 cycles ( 94C
pendant 30 sec.; 62°C pendant 45 sec.; 72)C pendant 1,5 min.). Les produits de PCR
sont clonés au site SmaI de pUC I 9 et les 1500 clones ainsi obtenus, analysés par séquençage. Nous avons recherché Ia présence d'un motif Hélice I dans la séquence en acides aminés déduite de la séquence nucléotidique de ces différents ADNc. Une large proportion de ces ADNc (670) contiennent un tel motif, et parmi eux, un seul correspond à un nouveau membre possible de la famille bHLH. Les autres ADNc isolés correspondent à des protéines bHLH connues.
Le nouvel ADNc isolé, appelé C1G235 et représenté en figure 1, correspond à un fragment de 76 nucléotides (en excluant les séquences correspondant aux oligonucléotides introduits par la PCR). Les alignements de séquences en acides aminés ont été effectués en n'autorisant ni les insertions ni les délétions.
Ces alignements montrent que ce fragment code un motif homologue au motif Hélice I
des protéines bHLH . L'isolement de l'ADNc complet a ensuite été entrepris.
Isolement de l'ADNc complet correspondant à CIG235.
L'isolement de l'ADNc complet correspondant à CIG23 5 a été extrêmement dif~'~cile, car l'ARNm correspondant à CIG235 est très peu exprimé dans le GCS. Il semble même que son niveau d'expression soit proche de celui de la transcription illégitime. La technique retenue consiste d'une part à isoler l'extrémité 3' de l'ADNc correspondant à CIG23 5 par PCR ancrée et d'autre part à isoler l'extrémité 5' de cet ADNc à partir de moelle épinière d'embryons de rat au stade E12,5.
l.l:xle».sio» c~e l'ADNc~ ('IG?3J e» 3' pca~ l'C,R arrcwéc~.
Pour cela, des ADNc-sb de GCS sont préparés avec l'amorce RA3' NV (amorce de transcription inverse aléatoire portant l'ancre 3' NV) selon la méthode Dumas Milne Edwards et al ( 1995, A Pratical Approach Ed McPherson et al.) pp89-1 18, IRL
Press Oxford U. K. ). Deux amorces emboitées spécifiques sont choisies dans le clone positif bEiLH de 76 nucléotides:CIGS' 1 5'-AACCTTAACTCCGCGCTGGATGCGC-3' (SEQ ID N°4) et CIGS'-2 : 5'-CGCGGTGTCCTGCCCACC-3' (SEQ ID N°5).
Nous avons ensuite amplifié l'extrémité 3' de CIG235 par deux PCR emboîtées avec les couples d'oligonucléotides CIGS' I et A3'-1 puis CIGS'2 et A3' 2. Le mélange PCR identifié en exemple l, est utilisé avec seulement 0,8~M de chacun des oligonucléotides et une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 sec.
suivi d'une étape d'élongation à 72°C pendant 1,5 min. L"'annealing" est effectué pendant 45 sec. avec des variations de température Lors des dix premiers cycles cette température est réduite de 1 °C tous les deux cycles de 70°C à 65°C puis maintenue à 65°C au cours de cycles. Les produits résultant sont clonés dans pUC 19 et séquencés. Nous avons ainsi obtenu un ADNc de 717 nucléotides. appelé CIG3', dont la partie 5' correspond à
25 l'extrémité 3' du clone CIG23 ~. L'analyse des phases ouvertes de lectures montre que WO 98lZ7206 PCTIFR97102368 la totalité de la séquence codant l'extrémité carboxy-terminale de la protéine a été
isolée avec 321 nucléotides de région 3' non codante.
2.Isolement de l'extrémité 5' correspondant à CIG3' à parür de moelle épinière d'emhiyorrs de rat au stade E12.5.
Nous avons recherché par hybridation in .sitzr le patron d'expression de l'ARNm correspondant à CIG3'. Son expression est estimée à différents stades du développement embryonnaire. La méthode choisie est celle de l'hybridation in .situ sur coupes épaisses d'embryons de rat avec une sonde marquée à la digoxygénine.
Cette méthode est en fait une adaptation de celle décrite pour l'hybridation in toto ( 1994, A
Pratical Approach, Ed Wilkinson et al., pp75-83, IRL Press Oxford U.K. ), et permet de cribler rapidement des embryons entiers à de nombreux stades différents.
Une forte expression de cet ARNm a été détectée dans la moelle épinière, au jour embryonnaire I 2. 5 (E 12. 5 ). Nous avons donc préparé des ARNm à partir de moelle épinière à ce stade de développement, et effectué l'isolement de l'extrémité 5' par la méthode SLIC. Un produit de PCR de 893 nucléotides est isolé et appelé
CIGS' L'ADNc CIG3' et CIGS' se recouvrent sur une région de 120 nucléotides et forment un ADNc total dont la taille est de 1491 nucléotides.
Cependant, CIG3' et CIGS' n'ayant pas été isolés à partir du méme tissu, il était nécessaire de montrer que le contigue généré par l'alignement de ces deux clones correspondait bien à un ARNm existant et non pas à une chimère jénérée par PCR.
Nous avons donc vérifié par PCR, après transcription inverse, que l'AIL'V'm total est présent dans la moelle épinière à E 12.5. Dans ce tissu, une seule amplification par PCR
permet de visualiser cet .ARNm dans son intégralité. De plus. l'analyse des ARNm par Northern blot montre que les sondes CIG3', CIGS' et l'ADNc total permettent toutes WO 98!27206 PCTIFR97/02368 trois de détecter un seul ARNm de 3.1 kb. Enfin, en hybridation in situ, le patron d'expression spatio-temporel obtenu avec CIG3' ou avec l'ADNc total est absolument identique. Ces trois résultats nous permettent d'affirmer que CIG3' et CIGS' correspondent bien à deux fragments d'un même ARNm.
Afin de s'affranchir des mutations ponctuelles introduites par la Taq polymérise, nous avons effectué, sur des ADNc-sb de moelle à EI2.5) quatre amplifications indépendantes de la totalité de l'ADNc. Nous avons ainsi pu déterminer de manière fiable la séquence de cet ADNc qui est représenté en SEQ ID N° 1.
L'analyse de la séquence de l'ADNc montre que nous avons isolé la totalité de la région codante, la région 5' non codante ainsi qu'une partie de la région 3' non traduite.
De plus, l'expression de l'ARNm correspondant est détectée, chez !'embryon, sous forme de bandes longitudinales. Cette caractéristique a conduit à désigner cet ADNc Relax, pour Rat embryonic longitudinal axis.
Comparaison de séquences en acides aminés du domaine bHLH de Relax avec d'autres protéines de la famille BHLH.
L'analyse de la séquence en acides aminés déduite dg l'ADNc Relax indique clairement que cette protéine fait partie de la famille des bHLH. Le domaine bHLH de Relax partage une identité de 68% avec le motif bHLH de la protéine NeuroD
(Lee et col!., 1995). De plus, il apparaît que Refax partage plus d'identités de séquences avec les protéines homologues de ato (Math-1, Akazawa et col!., 1995 ) qu'avec celles homologues d' AS-C (Mash-1, Johnson et col!., 1990) (Figure 2). Cependant, l'absence totale d'identité de séquence, en dehors du domaine bHLH, avec les autres membres de la famille révèle que Relax n'est pas le paralo~ue d'une protéine déjà
identifiée. Pour cette raison, Relax correspond vraisemblablement au premier membre d'une nouvelle sous-famille de protéines bHLH.
5 Caractérisation de !'activité transcriptionnelle de la protéine Relax Les analyses de séquences en acides aminés indiquent que Relax partage une communauté de structure avec les protéines de la famille des bHLH. Ces protéines sont des facteurs de transcription. 11 est donc important de démontrer que l'ADNc Relax code une protéine dont les caractéristiques sont celles d'un facteur de 10 transcription, c'est à dire que Relax est capable de se fixer à l'ADN sur les sites cibles de facteurs bHLH, et qu'il peut réguler la transcription.
1. Les protéines de ia famille bHLH forment des homo ou hétérodimères et se fixent spécifiquement à l'ADN (Murre et coil., 1989, Cell, 558, 537-44). La caractérisation io nnr~~~ des sites de liaison à l'ADN a permis l'identification d'une 15 séquence hexanucléotidique consensus, CANNTG dénommée boîte E (Murre et coll., 1989). Nous avons montré, par des expériences de retard de migration sur gel, que la protéine Relax recombinante purifiée est capable de se lier spécifiquement à
une séquence contenant une boîte E. Pour se faire, l'ADN codant pour la protéine Relax est inséré entre les sites NdeI et KpnI dans un vecteur pFLAG-CTC. Après expression de la protéine dans E.coli, la protéine de fusion Relax-Flag est purifiée sur colonne d'afFmité puis utilisée dans une réaction de binding en présence d'un oligonucléotide contenant une boîte E
WO 98!27206 PCTIFR97102368 2. L'activité transcriptionnelle de la protéine Relax a pour sa part été
testée par des expériences de cotransfection dans la lignée cellulaire PC 12, dérivée de phéochromocytomes de rat.
Pour cela, nous avons utilisé un gène rapporteur luciférase placé sous te contrôle, d'une part, d'un promoteur contenant une boîte E (Skb du promoteur de la TH) et, d'autre part, d'un même promoteur contenant une boîte E mutée.
Parallèlement nous avons préparé un vecteur d'expression de la protéine Relax comme suit:
L'ADNc codant pour la protéine Relax ( de ia position 389 à 1235) est inséré
entre les sites EcoRI et XhoI dans le vecteur d'expression pcDNA3 en aval du promoteur CMV. Le promoteur TH du rat portant une boîte E CAGGTG (SEQ ID
N°
1. Les protéines de ia famille bHLH forment des homo ou hétérodimères et se fixent spécifiquement à l'ADN (Murre et coil., 1989, Cell, 558, 537-44). La caractérisation io nnr~~~ des sites de liaison à l'ADN a permis l'identification d'une 15 séquence hexanucléotidique consensus, CANNTG dénommée boîte E (Murre et coll., 1989). Nous avons montré, par des expériences de retard de migration sur gel, que la protéine Relax recombinante purifiée est capable de se lier spécifiquement à
une séquence contenant une boîte E. Pour se faire, l'ADN codant pour la protéine Relax est inséré entre les sites NdeI et KpnI dans un vecteur pFLAG-CTC. Après expression de la protéine dans E.coli, la protéine de fusion Relax-Flag est purifiée sur colonne d'afFmité puis utilisée dans une réaction de binding en présence d'un oligonucléotide contenant une boîte E
WO 98!27206 PCTIFR97102368 2. L'activité transcriptionnelle de la protéine Relax a pour sa part été
testée par des expériences de cotransfection dans la lignée cellulaire PC 12, dérivée de phéochromocytomes de rat.
Pour cela, nous avons utilisé un gène rapporteur luciférase placé sous te contrôle, d'une part, d'un promoteur contenant une boîte E (Skb du promoteur de la TH) et, d'autre part, d'un même promoteur contenant une boîte E mutée.
Parallèlement nous avons préparé un vecteur d'expression de la protéine Relax comme suit:
L'ADNc codant pour la protéine Relax ( de ia position 389 à 1235) est inséré
entre les sites EcoRI et XhoI dans le vecteur d'expression pcDNA3 en aval du promoteur CMV. Le promoteur TH du rat portant une boîte E CAGGTG (SEQ ID
N°
6) en position 197 sur un fragment de Skbp est inséré au site HindIII rendu à
extrémité
franche dans le plasmide pKSLuc qui devient SkbTH-Luc. Le site est muté en TCCGTG( SEQ ID N°7) et le plasmide résultant désigné SkbTH(Delta E)-Luc.
1 S Le plasmide pcDNA3-Relax est cotransfecté à différentes quantités variant de 0 à 5pmole, et ramené à Spmole avec du vecteur pcDNA3 vide, dans des cellules PC
( 10~ celluleslplaque) en mélange à 1 pmole de plamide SkbTH-Luc, Skb-TH(deltaE)-Luc ou pKSLuc.. Pour évaluer l'efficacité de transfection, 0,2pmo1 d'un vecteur d'expression du gène codant pour la protéine CAT (acétyltransférase chloramphénicol) sous contrôle du promoteur RSV sont également cotransfectés.
La mesure de l'activité luciférase) après cotransfection de ces vecteurs avec des quantités croissantes d'un vecteur d'expression de la protéine Relax, démontre que Relax active la transcription du gène rapporteur d'une manière dépendante de la quantité de vecteur d'expression utilisée et que cette activation nécessite strictement la présence d'une boîte E intacte.
Caractérisation des sites d'expression de l'ARNm Reiax au cours du développement embryonnaire Nous avons analysé de manière systématique, par hybridation ire sizo, la distribution de l'ARNm Relax chez le rat au cours du développement embryonnaire.
Pour se faire, des hybridations ire .siur chez l'embryon de rats sont efîectués selon la méthode de Wilkinson avec des ribosondes antisens soit in toto soit sur des sections de 250pm. Les ribosondes sont préparées en présence de 1 pg de plamide linéarisé et en présence de 3,5 nmol. de Digoxygenin-11-UTP en utilisant le kit Ribosonde de Promega. ette analyse détaillée montre que l'expression de l'ARNm Relax est transitoire et spatialement restreinte.
Cet ARNm n'est présent que chez l'embryon, entre les jours 11.5 et 18.5 de développement. Son expression est restreinte au système nerveux central. En effet, aucune expression n'a été détectée, ni dans le système nerveux périphérique, ni en dehors du système nerveux. A l'intérieur du SNC, l'ARNm Relax est exprimé
uniquement dans la moelle épiniére, le cerveau postérieur et le cerveau antérieur Plus précisément, l'ARNm Relax est exprimé dans des compartiments longitudinaux dans la moelle épinière et le cerveau postérieur.
Sa distribution dans la moelle épinière y est restreinte à deux bandes continues de symétrie bilatérale, organisées longitudinalement et restreintes, sur l'axe D/V, à la lame basale, l'une à son extrémité ventrale, l'autre à son extrémité dorsale.
WO 98127206 PCTlFR97l02368 Dans le cerveau antérieur, les ARNm Relax sont localisés dans deux groupes de cellules situées de part et d'autre du recessus optique, dans la région ventrale de l'hypothalamus et dans l'aire préoptique. Le groupe majoritaire des cellules exprimant Relax est situé dans la partie basale. Seules les quelques cellules de l'aire préoptique sont situées dans la région alaire. La situation dans Ie cerveau antérieur est semblable à
celle dans la moelle épinière et le cerveau postérieur. En effet, les cellules exprimant Relax sont, dans tous les cas, strictement localisées dans la zone ventriculaire.
Caractérisation des moments d'expression de l'ARNm Relax au cours du développement embryonnaire Tous les sites d'expression de Relax apparaissent simultanément à E I 1. 5.
Ils disparaissent progressivement dans la moelle épinière entre E 16. 5 et E I 8.
S, suivant un gradient ventro-dorsal qui suit la réduction progressive de la zone ventriculaire. Dans le cerveau postérieur, l'expression de Relax s'éteint, en même temps que celle de 1a bande médiane dans la moelle épinière. Enfin, dans le cerveau antérieur, l'expression de Relax disparaît après E 18.5. Il est important de souligner que l'expression de Relax est confinée à la zone ventriculaire et que la fenêtre temporelle d'expression coïncide avec celle de la production des neurones dans ces différentes structures.
LISTE DE SÉQUENCES
1) INFORMATION GENER.ALE:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
( E ) PAYS : FRANCE
{F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION:Polypeptides de la famille bHLH, séqunces d'acides nucléiques correspondantes (iii) NOMBRE DE SEQUENCES:7 (i--) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1491 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (Dj CONFIGTJRATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iiij HYPOTHÉTIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: rat (ii DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ iD NO: 1:
gcaggtagcgagaggagcagtccctgggeccccgttgctgattggcccgtggcacaggcagcagcceggcag ?2 gcaegetcctggtccgggcagagcaga*aaagcgtgccaggggacacacgattagcagcteagaagtcaete 114 tgggtctcaccactgeacagaggccgaggaceecctccgagcttctttgetgectcaagacgcaatttaetc 21b caggegagggcgectgoogetcageaaaaettegaagcgagcagaggggtteagetaxecaecgetgettga 288 etetgaecaeccgcagetetetgttettttgagcccggagtaaetaggtaacatttaggaaceteeaaaggg 360 tagaagaggggagtgggtgggcgtactctagtcccgcgtggagtgacctctaagtcagagactgtcacaccc ~i32 cecttecattttttccetraccteagg ATG GCG GCT GRT CCC TTG GAT GGG CCC AGC RTG 491 0 ~ 3 Q E T Q Q P F F G A 3 D H E ~l 29 CRR GTG TGG GRR GRG RCG CRG GRR GGG TTT CCG GGR GCC TCG C~iC CRC GRR GTG 545 L 3 3 N 3 T F F S F T L ~ F R D C S 47 CTG AGT TCC RRT '!GC AGG CCA CGT AGC CCG RCT CTC GTA GCG AGG GAC TGC TCG 599 E A E A G D G R G T 8 R K L R A R R b5 G G R H p. P K S E L H L 3 K Q R R ~' 83 GGR GGG GGG RAC AGG GGG AAG RGC GAG TTG GCA CTG AGC RRG CAG CGR GGR RGC ?0?
R R K K R N D R E R fa R M Ef M L H S 101 CGG GGC RAG ARG GGG AAG GRC GGG GAG GGG AAC GGG ATG CRG ARG CTT AAC TGG ?b1 T K I E T L fi f A Ef H Y 1 W R L T 0, 13?
RGA AAG ATG GAG ACC CTr GGG TTG GGG GAG RAG TAC ATT TGG GCR CTG RGT CAG 869 T L R I R L EI 3 F Y G P ï F F Y F G 155 AGG GTG GGC RTA GCG GRG GAC AGG T'tY' TAC GGG GGG GAG CGG GGT GTG CGG TGT 923 G E L G 3 P G G G S ~ G D W G 3 I Y 173 GGG GRG CTG GGA AGG GGG GGA GGG GGC TCG RGC GGC GAG TGG GGC TGT ATC TAC 9??
TGC GCA GTT TGC GRA GGT GGT AGC GTG AGG CGG ACA GCC TGA Tl'G GAG GAG TTG 1031 F G L Q 9 F 3 3 F 3 C L L F G T L 5~ 209 TTG TGA GRC TTC TI~ tgaagggcccaaacaggecetgggcggtgggegctggeagaaagggaggga 1151 gteagagctgtctgaaatggaaggtagtggaggeactegagcatctcgeeeettetggcttteattagtcag 1223 gtccctgatttaaccaggattcgcacagttcettgctgetgtgcgtgcacaaaggacmttgeaggctgatct 1295 catettaaecctcctcagtgtggecaectcaaactcccgetceaageagaggagagxgtagcaetaaatag l3bF
ttgggagaeteccatacttcctggtgaetcegecctcttteaaatctgcgggcctccmaeeaccgctttete 1439 cagagtgacctaatceagtgttgcgtcttacctcactggctcttgttccata 1991 INEORMATIGN PGUR LA 5E~ ID NG: 2:
S , CARACTERiSTI',2UE5 UE LA SEQrJENCE:
!A. LONGLTErJF : 2? c~av_res àe bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii) HYPOTHÉTIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
(9) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii) HYPOTHÉTIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(x.i) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 3:
(5) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i} CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (i:i) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii' HYPOTHÉTIQUE: NGN
;iii ANTI-SENS: NON
(xi~; DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NC: 4:
F~CCTTAACT CCGC.GC.TGG%. TGCGC 2~
(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0: 5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR:18 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii) HYPOTHÉTIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 5:
(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0: 6:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii) HYPOTHÉTIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 6:
(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (iii TYPE DE MOLÉCULE: ADN
,'iii' HYPOTHÉTIQUE: NON
;iii'> ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQCIENCE: SEQ ID N0: ?:
TCCGTG _
extrémité
franche dans le plasmide pKSLuc qui devient SkbTH-Luc. Le site est muté en TCCGTG( SEQ ID N°7) et le plasmide résultant désigné SkbTH(Delta E)-Luc.
1 S Le plasmide pcDNA3-Relax est cotransfecté à différentes quantités variant de 0 à 5pmole, et ramené à Spmole avec du vecteur pcDNA3 vide, dans des cellules PC
( 10~ celluleslplaque) en mélange à 1 pmole de plamide SkbTH-Luc, Skb-TH(deltaE)-Luc ou pKSLuc.. Pour évaluer l'efficacité de transfection, 0,2pmo1 d'un vecteur d'expression du gène codant pour la protéine CAT (acétyltransférase chloramphénicol) sous contrôle du promoteur RSV sont également cotransfectés.
La mesure de l'activité luciférase) après cotransfection de ces vecteurs avec des quantités croissantes d'un vecteur d'expression de la protéine Relax, démontre que Relax active la transcription du gène rapporteur d'une manière dépendante de la quantité de vecteur d'expression utilisée et que cette activation nécessite strictement la présence d'une boîte E intacte.
Caractérisation des sites d'expression de l'ARNm Reiax au cours du développement embryonnaire Nous avons analysé de manière systématique, par hybridation ire sizo, la distribution de l'ARNm Relax chez le rat au cours du développement embryonnaire.
Pour se faire, des hybridations ire .siur chez l'embryon de rats sont efîectués selon la méthode de Wilkinson avec des ribosondes antisens soit in toto soit sur des sections de 250pm. Les ribosondes sont préparées en présence de 1 pg de plamide linéarisé et en présence de 3,5 nmol. de Digoxygenin-11-UTP en utilisant le kit Ribosonde de Promega. ette analyse détaillée montre que l'expression de l'ARNm Relax est transitoire et spatialement restreinte.
Cet ARNm n'est présent que chez l'embryon, entre les jours 11.5 et 18.5 de développement. Son expression est restreinte au système nerveux central. En effet, aucune expression n'a été détectée, ni dans le système nerveux périphérique, ni en dehors du système nerveux. A l'intérieur du SNC, l'ARNm Relax est exprimé
uniquement dans la moelle épiniére, le cerveau postérieur et le cerveau antérieur Plus précisément, l'ARNm Relax est exprimé dans des compartiments longitudinaux dans la moelle épinière et le cerveau postérieur.
Sa distribution dans la moelle épinière y est restreinte à deux bandes continues de symétrie bilatérale, organisées longitudinalement et restreintes, sur l'axe D/V, à la lame basale, l'une à son extrémité ventrale, l'autre à son extrémité dorsale.
WO 98127206 PCTlFR97l02368 Dans le cerveau antérieur, les ARNm Relax sont localisés dans deux groupes de cellules situées de part et d'autre du recessus optique, dans la région ventrale de l'hypothalamus et dans l'aire préoptique. Le groupe majoritaire des cellules exprimant Relax est situé dans la partie basale. Seules les quelques cellules de l'aire préoptique sont situées dans la région alaire. La situation dans Ie cerveau antérieur est semblable à
celle dans la moelle épinière et le cerveau postérieur. En effet, les cellules exprimant Relax sont, dans tous les cas, strictement localisées dans la zone ventriculaire.
Caractérisation des moments d'expression de l'ARNm Relax au cours du développement embryonnaire Tous les sites d'expression de Relax apparaissent simultanément à E I 1. 5.
Ils disparaissent progressivement dans la moelle épinière entre E 16. 5 et E I 8.
S, suivant un gradient ventro-dorsal qui suit la réduction progressive de la zone ventriculaire. Dans le cerveau postérieur, l'expression de Relax s'éteint, en même temps que celle de 1a bande médiane dans la moelle épinière. Enfin, dans le cerveau antérieur, l'expression de Relax disparaît après E 18.5. Il est important de souligner que l'expression de Relax est confinée à la zone ventriculaire et que la fenêtre temporelle d'expression coïncide avec celle de la production des neurones dans ces différentes structures.
LISTE DE SÉQUENCES
1) INFORMATION GENER.ALE:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
( E ) PAYS : FRANCE
{F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION:Polypeptides de la famille bHLH, séqunces d'acides nucléiques correspondantes (iii) NOMBRE DE SEQUENCES:7 (i--) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1491 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (Dj CONFIGTJRATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iiij HYPOTHÉTIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: rat (ii DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ iD NO: 1:
gcaggtagcgagaggagcagtccctgggeccccgttgctgattggcccgtggcacaggcagcagcceggcag ?2 gcaegetcctggtccgggcagagcaga*aaagcgtgccaggggacacacgattagcagcteagaagtcaete 114 tgggtctcaccactgeacagaggccgaggaceecctccgagcttctttgetgectcaagacgcaatttaetc 21b caggegagggcgectgoogetcageaaaaettegaagcgagcagaggggtteagetaxecaecgetgettga 288 etetgaecaeccgcagetetetgttettttgagcccggagtaaetaggtaacatttaggaaceteeaaaggg 360 tagaagaggggagtgggtgggcgtactctagtcccgcgtggagtgacctctaagtcagagactgtcacaccc ~i32 cecttecattttttccetraccteagg ATG GCG GCT GRT CCC TTG GAT GGG CCC AGC RTG 491 0 ~ 3 Q E T Q Q P F F G A 3 D H E ~l 29 CRR GTG TGG GRR GRG RCG CRG GRR GGG TTT CCG GGR GCC TCG C~iC CRC GRR GTG 545 L 3 3 N 3 T F F S F T L ~ F R D C S 47 CTG AGT TCC RRT '!GC AGG CCA CGT AGC CCG RCT CTC GTA GCG AGG GAC TGC TCG 599 E A E A G D G R G T 8 R K L R A R R b5 G G R H p. P K S E L H L 3 K Q R R ~' 83 GGR GGG GGG RAC AGG GGG AAG RGC GAG TTG GCA CTG AGC RRG CAG CGR GGR RGC ?0?
R R K K R N D R E R fa R M Ef M L H S 101 CGG GGC RAG ARG GGG AAG GRC GGG GAG GGG AAC GGG ATG CRG ARG CTT AAC TGG ?b1 T K I E T L fi f A Ef H Y 1 W R L T 0, 13?
RGA AAG ATG GAG ACC CTr GGG TTG GGG GAG RAG TAC ATT TGG GCR CTG RGT CAG 869 T L R I R L EI 3 F Y G P ï F F Y F G 155 AGG GTG GGC RTA GCG GRG GAC AGG T'tY' TAC GGG GGG GAG CGG GGT GTG CGG TGT 923 G E L G 3 P G G G S ~ G D W G 3 I Y 173 GGG GRG CTG GGA AGG GGG GGA GGG GGC TCG RGC GGC GAG TGG GGC TGT ATC TAC 9??
TGC GCA GTT TGC GRA GGT GGT AGC GTG AGG CGG ACA GCC TGA Tl'G GAG GAG TTG 1031 F G L Q 9 F 3 3 F 3 C L L F G T L 5~ 209 TTG TGA GRC TTC TI~ tgaagggcccaaacaggecetgggcggtgggegctggeagaaagggaggga 1151 gteagagctgtctgaaatggaaggtagtggaggeactegagcatctcgeeeettetggcttteattagtcag 1223 gtccctgatttaaccaggattcgcacagttcettgctgetgtgcgtgcacaaaggacmttgeaggctgatct 1295 catettaaecctcctcagtgtggecaectcaaactcccgetceaageagaggagagxgtagcaetaaatag l3bF
ttgggagaeteccatacttcctggtgaetcegecctcttteaaatctgcgggcctccmaeeaccgctttete 1439 cagagtgacctaatceagtgttgcgtcttacctcactggctcttgttccata 1991 INEORMATIGN PGUR LA 5E~ ID NG: 2:
S , CARACTERiSTI',2UE5 UE LA SEQrJENCE:
!A. LONGLTErJF : 2? c~av_res àe bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii) HYPOTHÉTIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
(9) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii) HYPOTHÉTIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(x.i) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 3:
(5) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i} CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (i:i) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii' HYPOTHÉTIQUE: NGN
;iii ANTI-SENS: NON
(xi~; DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NC: 4:
F~CCTTAACT CCGC.GC.TGG%. TGCGC 2~
(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0: 5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR:18 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii) HYPOTHÉTIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 5:
(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0: 6:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii) HYPOTHÉTIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 6:
(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (iii TYPE DE MOLÉCULE: ADN
,'iii' HYPOTHÉTIQUE: NON
;iii'> ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQCIENCE: SEQ ID N0: ?:
TCCGTG _
Claims (15)
1. Polypeptide de type bHLH doté d'une activité transcriptionnelle caractérisé
en ce qu'il partage une homologie de séquence avec les protéines de type bHLH
uniquement au niveau de son domaine bHLH.
en ce qu'il partage une homologie de séquence avec les protéines de type bHLH
uniquement au niveau de son domaine bHLH.
2. Polypeptide possédant une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il est représenté en tout ou partie par la SEQ ID N°1 ou l'un de ses dérivés.
3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il posséde la séquence représentée en SEQ ID N°1.
4. Polypeptide selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit de la protéine Relax.
5. Séquence d'acides nucléiques codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4.
6. Séquence d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle est représentée en tout ou partie par la SEQ ID N°1, son brin complémentaire ou son dérivé.
7. Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est représentée par la SEQ ID N°1 ou son brin complémentaire.
8. Vecteur comprenant une séquence nucléique selon l'une des revendications 5 à 7.
9. Vecteur selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
10. Vecteur selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur dérivé des adénovirus, des rétrovirus, des AAV, du virus HSV, CMV ou du virus de la vaccine.
11. Vecteur selon les revendications 9 ou 10 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus défectif pour la réplication.
12. Utilisation des polypeptides selon l'une des revendications 1 à 4 pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes.
13. Composition pharmaceutique comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 5 à 7 un ou plusieurs vecteurs selon l'une des revendications 8 à 11.
14. Composition pharmaceutique comprenant au moins un polypeptide selon la revendication 1 à 4.
15. Utilisation d'une séquence selon l'une des revendications 5 à 7 ou d'un vecteur contenant ladite séquence pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de pathologies affectant le système nerveux.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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