WO2000008147A1 - Genes impliques dans les voies moleculaires de la suppression tumorale et/ou la resistance aux virus - Google Patents

Genes impliques dans les voies moleculaires de la suppression tumorale et/ou la resistance aux virus Download PDF

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Adam Telerman
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Definitions

  • the present invention relates to the detection of genes involved in the molecular pathways of tumor suppression and / or resistance to viruses.
  • the present invention was made possible by the isolation of cDNA corresponding to messenger RNAs expressed or repressed during tumor suppression and / or during the process of apoptosis induced by the p53 suppressor gene.
  • mice nullizygous for p53 were much more sensitive to the formation of tumors. It has also been demonstrated that, in cancers, the p53 gene is very often altered and leads to the production of proteins incapable of conveying the message of apoptosis. It is this feature which has been implemented in the context of the present invention.
  • the present invention is based on the observation that it is not possible, or at least that it seems very difficult, to set up a direct substitution therapy during a dysfunction of the p53 gene. Indeed, the mutated p53 as it is in cancer will cancel the physiological effect of normal p53. It was therefore necessary to give up, at least initially, a substitution therapy acting directly at the level of p53.
  • the present invention has therefore endeavored to study the genes located upstream and downstream of p53 in order to “bypass” the difficulty mentioned above.
  • a global raking of gene expression was carried out in a malignant line (K562) and a derived cell (KS) with a suppression of the phenotype.
  • malignant more particularly in a cell expressing normal p53 (KS) in its function and in a cell not expressing p53 (K562).
  • the comparison of the expressed genes made it possible to highlight genes expressed differently, that is to say expressed in one of the cells whereas they are not it in the other (genes can be turned on or off).
  • sequences are sequences whose function is known and which are involved in the process of suppressing the malignant phenotype and / or of apoptosis induced by the suppressor gene p53 and / or in the resistance to viruses.
  • the present invention relates to new sequences and the genes comprising them as well as the use of these sequences, both at the diagnostic level and at the therapy level, as well as for the production of models intended for testing anti products. -cancerous and anti-viral.
  • the present invention firstly relates to a nucleotide sequence corresponding to a gene comprising:
  • sequences 1 to 15 constitute only part of the genes in question, but that the present invention covers both the nucleotide sequence corresponding to the entire gene as fragments of this gene, in particular when they code for an equivalent protein as will be described below.
  • the nucleotide sequences can be either DNA or RNA OR sequences in which some of the nucleotides are unnatural, either to improve their pharmacological properties or to allow their identification.
  • sequences mentioned in (b) are essentially the total or partial complementary sequences (in particular for the cases mentioned above).
  • the invention also relates to the nucleotide sequences of the genes having a strong homology with the genes mentioned above, preferably a homology greater than 80% on the essential parts of said genes, ie in general at least 50% of the sequence, preferably the homology on these parts will be greater than 90%.
  • the present invention also relates to the sequences coding for the same protein, taking into account the degeneration of the genetic code, but also for equivalent proteins, that is to say producing the same effects. , in particular proteins deleted and / or having undergone point mutations.
  • sequences according to the present invention are more particularly the sequences which are induced or inhibited during cellular apoptosis, in particular those induced by p53 and / or p21 and / or TSAP3 (HUMSIAH) and / or antisense-TSIP2 (antisens-PSl) .
  • these sequences correspond to genes whose cellular expression is activated by at least one of the transfectants chosen from the group comprising the p21 transfectants, the TSAP3 transfectants and the TSIP2 antisense transfectants.
  • Said genes are grouped in TSAP or "Tumor Suppressor Activated Pathway ", and named TSAP 9 to TSAP 22 corresponding to IND.SEQ 1 to 14, and TSIP or" Tumor Suppressor Inhibited Pathvay ", and called TSIP 3, corresponding to IND.SEQ 15.
  • nucleotide sequences corresponding to the TSAP genes are sequences expressed during the apoptosis process while when they are not expressed the oncogenesis process continues. It is therefore interesting:
  • Replacement therapy may be carried out by gene therapy, that is to say by introducing the TSAP gene with the elements which allow its expression in vivo.
  • gene therapy is to say by introducing the TSAP gene with the elements which allow its expression in vivo.
  • vectors viral or non-viral, for example adenovirus, retrovirus, herpes virus or poxvirus. Most of the time, these vectors are used in defective forms which will serve as vehicles for the expression of TSAP with or without integration.
  • the vectors can also be synthetic, that is to say mimic viral sequences, or else consist of DNA or naked RNA according to the technique developed in particular by the company VICAL. In most cases, it will be necessary to provide targeting elements ensuring expression of specific tissues or organs, in fact, it is not possible to envisage activating an uncontrolled apoptosis phenomenon.
  • the present invention therefore relates to all of the vectors described above.
  • the present invention also relates to cells transformed with an expression vector as described above as well as the protein obtainable by culturing transformed cells.
  • Expression systems for producing proteins can be either eukaryotic systems such as the foregoing vectors or prokaryotic systems in bacteria cells.
  • One of the advantages of the present invention is that it has demonstrated the involvement of several genes in apoptosis; thus, the overexpression of one of the genes by gene therapy may, for some of them, lead to apoptosis only the cells in which other deregulated genes are already expressed, that is to say malignant cells.
  • the present invention also relates, as a medicament, to a compound ensuring the cellular expression of at least one of the preceding nucleotide sequences when it is induced during apoptosis and / or tumor suppression, in particular TSAP 9 genes to TSAP 22, or on the contrary ensuring the inhibition of cellular expression of at least one cell sequence as described above when it is inhibited during apoptosis and / or tumor suppression, in particular TSIP 3. It may for example be an activated nucleotide ensuring the blocking of the nucleotide sequence or else a monoclonal antibody raised against the protein (s) encoded by the nucleotide sequence.
  • nucleotide sequences in sense or antisense strategy that is to say which can block the expression of TSIP or, on the contrary, acting by upstream, promoting the expression of TSAP.
  • the present invention relates in particular to the use of the above drugs as an anti-cancer agent.
  • the product of the TSAP 9 to 22 and TSLP 3 genes is also useful as an antiviral agent, as will appear on reading the example.
  • the present invention therefore also relates to the use of the above drugs as an antiviral agent.
  • the present invention relates, as a diagnostic agent for determining the predisposition to cancer, all or part of the sequences according to the invention to be used as a nucleotide probe or as an amplification primer, but also as a diagnostic agent for determining the predisposition to cancer an antigen corresponding to all or part of the proteins encoded by the sequence according to the invention or the corresponding antibodies, optionally after culture.
  • the diagnostic methods are known, they can be, for example, techniques of microsequencing of the variable parts after isolation and possible amplification, or detection methods of the RFLP type, or simple amplification in particular. Differential techniques can, in particular, make it possible to highlight the difference between normal and abnormal TSAP (or TS P).
  • the invention also relates to models implementing the above sequences.
  • TSAP 9 with a mouse chaperonin containing the TCP-1 gene (9), the inventors have found a strong homology which TSAP 13 has with the p40.5 subunit of the human proteasome
  • Chaperonins are involved in the folding process and the assembly of proteins in the eukaryotic cytosol. They are suspected of slowing down this folding by trapping intermediaries who would otherwise aggregate.
  • actin tubulin
  • the proteasome like the ubiquitin, is the main component of the major proteolytic system responsible for the breakdown of many intracellular proteins, including aberrant proteins resulting from mutations or environmental stress.
  • the p40.5 subunit of the human proteasome 26S has recently been demonstrated, as well as its counterpart in the yeast Nas7p.
  • the mRNA corresponding to the above subunit is more particularly expressed in the pancreas, the placenta, the testes, the heart and the skeletal muscle. It also appears that yeast cells deficient in Nas7p are particularly sensitive to heat stress. This helps to suggest that the function of the 26S proteasome is degraded during heat stress.
  • SNARE proteins Soluble N-ethylmaleimide-sensitiye factor-attachment protein receptor
  • proteins are proteins whose differential expression and associations are involved in the organization of the membrane compartments of cells. These proteins are specifically localized in the region of the Golgi apparatus, endosomes and lysosomes, which suggests that they play a role in regulating membrane exchanges from these organelles. More particularly, syntaxin 11 would be localized in the post-Golgi region.
  • Figure 1 shows the extended TSAP 13 sequence (SEQ ED No. 5).
  • the underlined part corresponds to the sequence as originally updated by the inventors.
  • the bold characters correspond to the sequence showing 100% homology with the p40.5 subunit of the human 26S proteasome.
  • Figure 2 shows the extended TSAP 21 sequence (SEQ ID No. 13).
  • the underlined part corresponds to the sequence as originally updated by the inventors.
  • Bold characters correspond to the sequence showing 100% homology with syntaxin 11 of the SNARE protein group
  • the K562 line is a tumor line, derived from a chronic erythromyeloid type leukemia. It is characterized in particular by a Philadelphia chromosome which contains the translocation (9,22), where there is a rearrangement of the bcr gene with the proto-oncogene abl. This line also has an abnormal karyotype and overexpresses the oncogenes myc and pim-1. These lines are described in reference A. Telerman et al. : A model for tumor suppression using H-1 parvovirus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90, pp. 8702-8706, September 1993. In summary, a K562 monoclone was infected with the parvovirus H-1.
  • the inventors derived from a population of malignant cells U937 the lines US3 and US4 which are resistant to parvovirus H-1 and which exhibit a suppression of the malignant phenotype. These lines are described in reference (7).
  • Ml myeloid leukemia cells and Ml cells were stably transfected with a temperature-sensitive mutant val 135 p53
  • Line U937 transfected with p21 WAF1 the complete coding part of the cDNA of the p21 WAF1 gene was cloned into the vector pBK-RSV (Stratagene, La JoUa, California). 3.5 million U937 cells were transfected with 20 micrograms of DNA / 30 micrograms Lipofectin (Life Technologies).
  • the stable transfectants were selected using 1.5 mg / ml of
  • Line U937 transfected with TSIP2 (PSI) in the antisense position the complete coding part of the cDNA of the TSIP2 gene (PSI) was cloned in the antisense position in the vector pBK-RSV (Stratagene, La Jolla, California). 3 million cells
  • G418 (Sigma). The characteristics of this line, describing in particular a slowdown in growth, activation of apoptosis and suppression of the malignant phenotype, have been described in reference (8).
  • Line U937 transfected with TSAP3 ( ⁇ UMSIAH): the complete coding part of the cDNA of the TSAP3 gene has been cloned into the vector pBK-RSV
  • PolyA + mRNA is still used twice purified on an oligodT column using Fast Track (Invitrogen, San Diego CA). After reverse transcription (M-MLV Reverse Transcriptase, Gibco BRL) on 0.05 ⁇ g of polyA + using 20 ⁇ M of each of the dNTPs (Boehringer-Mannheim), no added dNTPs are added to the final PCR mixture. A “hot start” at 94 ° C for 5 minutes is carried out before the PCR (GeneAmp PCR System 9600 Perkin Elmer Cetus). The samples are quickly cooled on ice water.
  • a touch down (2) of 10 cycles of 50 ° C to 40 ° C is carried out (94 ° C 30 seconds - 50 ° C 1 minute - 72 ° C 30 seconds), followed by 35 cycles (94 ° C 30 seconds - 40 ° C 1 minute - 72 ° C 30 seconds) and a final extension of 5 minutes at 72 ° C.
  • PCR products are separated on 6% non-denaturing polyacrylamide gels (4). The gels are exposed without drying. Each differential presentation is performed by comparing M1S6 and LTR6 at 37 ° C and after 4 hours of incubation of the two cell lines at 32 ° C.
  • differential presentation procedure is repeated in 3 different experiments to confirm perfect reproducibility.
  • the differentially expressed bands are cut from the gel, eluted and re-amplified (1).
  • PCR products are subcloned using the TA-cloning system (Invitrogen, San Diego CA) following the directions provided.
  • RNA extraction analyzes and Northern blots probes
  • Total RNA is extracted with Trizol (Life Technologies).
  • the polyl + RNAs are prepared using the OligotexdT kit (Qjagen, CA). 30 ⁇ g of total RNA or 2 ⁇ g of polyA + RNA are separated on 1% agarose 1 x MOPS / 2% formaldehyde gel, transferred to nylon membrane (Hybond N +, Applig necessarily, France) as described above ( 5).
  • the Northern blots are hybridized with probes labeled with P 32 on the TSAP and TSEP inserts and washed as described previously (5).
  • the Northern blots are hybridized with a cyclin G probe (6).
  • the bots are hybridized with a " GAPDH probe.
  • Different Northern blots (Clontech CA) are used under identical conditions and hybridized for control with a ⁇ -actin probe. The Northern blots are exposed for 10 days to - 80 ° C.
  • Example 1 The aim sought is to characterize the molecular pathways which lead to the suppression of cancer.
  • the KS, KS2 and KS3 cells have a reduction in their tumorigenicity by 90%, while cultivated in "soft agar", these same KS lines have a reduction in their tumorigenicity in vivo when injected into Scid immunosuppressed mice - Scid.
  • this suppression of the malignant phenotype went hand in hand with a re-expression of the suppressor gene p53.
  • TSAP 9 is homologous to chaperonins.
  • Table 1 brings together the characterized molecules, showing the primers as well as the sizes of the mRNAs detected by Northern blot. Of these 15 molecules, all are induced in KS cells, except TSIP 3, the expression of which is inhibited during the suppression of the malignant phenotype.
  • the 15 molecules that we isolated therefore encode genes whose overexpression (TSAP 9 - TSAP 22) or inhibition (TSIP 3) is associated not only with the suppression of cancer but also with resistance to the parvovirus H-1. These genes therefore code for molecules that are part of the molecular pathways for cancer suppression and are potential suppressor genes.
  • U937 are transfected with the TSIP2 gene (PSI) in the antisense position.
  • Table 1 reports the results of differential expressions analyzed by Northern blot of the various probes (TSAP9-
  • TSAP22, TSEP3 of the K562 / KS model as well as of the other U937 / US3-US4 models, that is to say in a tumor suppression model in which the p21 gene is activated by the independent p53 pathway.
  • These cDNAs are therefore activated in two different cellular systems for tumor suppression (the erythroleukemia model K562 / KS and the myelomonocytic model U937 / US).
  • the p21 transfectants or TSAP3 transfectants or antisense-TSIP2 transfectants are capable of activating the molecular machinery for tumor suppression common to the U937 / US and K562 / KS systems.
  • Table 3 summarizes the differential expression characteristics of the cDNA clones by Northern blot.

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Abstract

L'invention concerne des gènes impliqués dans les voies moléculaires de la suppression tumorale et/ou la résistance aux virus, et dont l'expression cellulaire est notamment induite ou inhibée lors de l'apoptose et/ou la suppression tumorale.

Description

GENES IMPLIQUES DANS LES VOIES MOLECULAIRES DE LA SUPPRESSION TUMORALE ET/OU LA RESISTANCE AUX VIRUS
La présente invention concerne la mise en évidence de gènes impliqués dans les voies moléculaires de la suppression tumorale et/ou de la résistance aux virus.
La présente invention a été rendue possible par l'isolement d'ADNc correspondant à des ARN messagers exprimés ou réprimés lors de la suppression tumorale et/ou lors du processus d'apoptose induit par le gène suppresseur p53.
L'un des gènes suppresseurs les plus importants impliqués dans l'apoptose est le gène p53. Dans sa fonction normale, ce gène contrôle la croissance cellulaire et le processus d'apoptose ; en particulier, c'est ce gène qui bloque la croissance cellulaire et qui doit induire le processus apoptotique afin d'éviter le développement d'un cancer. On a ainsi mis en évidence que des souris nullizygotes pour le p53 étaient beaucoup plus sensibles à la formation de tumeurs. On a également mis en évidence le fait que, dans les cancers, le gène p53 était très souvent altéré et conduisait à la production de protéines incapables de véhiculer le message d'apoptose. C'est cette particularité qui a été mise en œuvre dans le cadre de la présente invention.
En effet, la présente invention repose sur la constatation qu'il n'est pas possible, ou du moins qu'il paraît très difficile, de mettre en place une thérapie de substitution directe lors d'un dysfonctionnement du gène p53. En effet, le p53 muté comme il l'est dans le cancer va annuler l'effet physiologique du p53 normal. Il a donc fallu renoncer, du moins dans un premier temps, à une thérapie de substitution agissant directement au niveau de p53.
La présente invention s'est donc attachée à étudier les gènes situés en amont et en aval de p53 afin de « bipasser » la difficulté évoquée précédemment. Afin d'isoler les gènes activés ou inhibés par le p53 normal (wild-type p53) on a effectué un ratissage global de l'expression des gènes dans une lignée maligne (K562) et une cellule dérivée (KS) avec une suppression du phénotype malin, plus particulièrement dans une cellule exprimant le p53 normal (KS) dans sa fonction et dans une cellule n'exprimant pas de p53 (K562). La comparaison des gènes exprimés (ARN messagers exprimés dans les deux types de cellule) a permis de mettre en évidence des gènes exprimés différentiellement, c'est-à-dire exprimés dans l'une des cellules alors qu'ils ne le sont pas dans l'autre (les gènes peuvent être activés ou inhibés).
On en déduit aisément que ces gènes sont impliqués dans le processus de cancérisation, dans un cas par leur absence, et, dans l'autre cas, par leur présence.
Pour cette étude différentielle, la méthode utilisée est la méthode décrite en 1992 par Liang et Pardee (Differential display o eucaryotic mRNA by mean of a polymerase chaine reaction).
L'approche du problème selon la présente invention a permis d'isoler des séquences directement reliées à une fonction. Dès lors, au contraire du séquençage aléatoire des EST, les séquences sont des séquences dont la fonction est connue et qui sont impliquées dans le processus de suppression du phénotype malin et/ou d'apoptose induit par le gène suppresseur p53 et/ou dans la résistance aux virus.
Ainsi, la présente invention concerne de nouvelles séquences et les gènes les comportant ainsi que l'utilisation de ces séquences, tant au niveau du diagnostic qu'au niveau de la thérapie, de même que pour la réalisation de modèles destinés à tester des produits anti-cancéreux et anti-viraux.
La présente invention concerne tout d'abord une séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant :
(a) une séquence selon l'une des IND.SEQ 1 à 15 ou un gène équivalent qui comporte: (b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a),
(c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec (a) ou (b), ou
(d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon (a), (b) ou (c) ou pour une protéine équivalente, et leur application notamment dans la suppression du cancer et/ou la résistance aux virus ainsi que dans le suivi thérapeutique.
Il convient de rappeler que les séquences 1 à 15 ne constituent qu'une partie des gènes en cause mais que la présente invention couvre aussi bien la séquence nucléotidique correspondant au gène entier que des fragments de ce gène, notamment lorsqu'ils codent pour une protéine équivalente comme cela sera décrit ci-après.
Les séquences nucléotidiques peuvent être aussi bien de l'ADN que de TARN OU des séquences dans lesquelles certains des nucléotides sont non naturels, soit pour améliorer leurs propriétés pharmacologiques, soit pour permettre leur identification.
Les séquences mentionnées en (b) sont essentiellement les séquences complémentaires totales ou partielles (notamment pour les cas évoqués précédemment).
Ainsi, l'invention concerne également les séquences nucléotidiques des gènes présentant une forte homologie avec les gènes mentionnés précédemment, de préférence une homologie supérieure à 80 % sur les parties essentielles desdits gènes, soit en général au moins 50 % de la séquence, de préférence l'homologie sera sur ces parties supérieure à 90 %.
Enfin, lorsque lesdits gènes codent pour une protéine, la présente invention concerne également les séquences codant pour la même protéine, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, mais également pour les protéines équivalentes, c'est-à-dire produisant les mêmes effets, notamment les protéines délétées et/ou ayant subi des mutations ponctuelles.
Les séquences selon la présente invention sont plus particulièrement les séquences qui sont induites ou inhibées lors de l'apoptose cellulaire, notamment celles induites par p53 et/ou p21 et/ou TSAP3 (HUMSIAH) et/ou antisens-TSIP2 (antisens-PSl). En d'autres termes, ces séquences correspondent à des gènes dont l'expression cellulaire est activée par l'un au moins des transfectants choisi dans le groupe comprenant les transfectants p21, les transfectants TSAP3 et les transfectants anti-sens TSIP2.
Lesdits gènes sont regroupés en TSAP ou "Tumor Suppressor Activated Pathway", et dénommés de TSAP 9 à TSAP 22 correspondant aux IND.SEQ 1 à 14, et en TSIP ou "Tumor Suppressor Inhibited Pathvay", et dénommé TSIP 3, correspondant à IND.SEQ 15.
Les caractéristiques des séquences sont rassemblées dans les tableaux ci- annexés.
Les séquences nucléotidiques correspondant aux gènes TSAP sont des séquences exprimées lors du processus d'apoptose alors que lorsqu'ils ne sont pas exprimés le processus d'oncogénèse se poursuit. Il est donc intéressant:
- de détecter toute anomalie dans le gène correspondant, laquelle peut conduire à une plus grande susceptibilité à l'oncogénèse, et
- de pouvoir prévoir une thérapie de remplacement.
Il faut d'ailleurs rappeler que ces gènes peuvent intervenir dans d'autres processus que les processus de suppression tumorale ; en effet, p53 est en quelque sorte le gardien de l'intégrité du génome, dans ces conditions les gènes TSAP ou TSIP sont sans doute également impliqués dans cette fonction de contrôle, c'est donc l'ensemble des altérations possibles du génome qui peuvent être redevables de la détection et de la thérapie précédente. Au contraire, les gènes TSIP sont exprimés lors de l'oncogénèse et cette expression est diminuée voire inhibée lors de l'apoptose et de la suppression tumorale, il est donc là aussi intéressant de détecter l'éventuelle anomalie des TSIP et également de prévoir une thérapie d'inhibition/blocage.
La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à-dire en introduisant le gène TSAP avec les éléments qui permettent son expression in vivo. Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs particuliers, viraux ou non viraux, par exemple des adénovirus, rétrovirus, virus herpès ou poxvirus. La plupart du temps ces vecteurs sont utilisés sous forme défectifs qui serviront de véhicules d'expression de TSAP avec ou sans intégration. Les vecteurs peuvent être également synthétiques, c'est-à- dire mimer des séquences virales, ou bien être constitués par de l'ADN ou de l'ARN nu selon la technique développée notamment par la société VICAL. Dans la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression tissus ou organes spécifiques, en effet, il n'est pas possible d'envisager d'activer un phénomène d'apoptose incontrôlé.
La présente invention concerne donc l'ensemble des vecteurs décrits précédemment.
La présente invention concerne également les cellules transformées par un vecteur d'expression tel que décrit précédemment ainsi que la protéine pouvant être obtenue par culture de cellules transformées.
Les systèmes d'expression pour produire des protéines peuvent être aussi bien des systèmes eucaryotes tels que les vecteurs précédents que des systèmes procaryotes dans des cellules de bactéries.
L'un des intérêts de la présente invention est qu'elle a mis en évidence l'implication de plusieurs gènes dans l'apoptose ; ainsi, la surexpression de l'un des gènes par thérapie génique peut, pour certains d'entre eux, ne conduire à l'apoptose que les cellules dans lesquelles s'expriment déjà d'autres gènes déréglés, c'est-à-dire des cellules malignes.
La présente invention concerne également, à titre de médicament, un composé assurant l'expression cellulaire d'au moins une des séquences nucléotidiques précédentes lorsqu'elle est induite lors de l'apoptose et/ou de la suppression tumorale, notamment des gènes TSAP 9 à TSAP 22, ou au contraire assurant l'inhibition de l'expression cellulaire d'au moins une séquence cellulaire telle que décrite précédemment lorsqu'elle est inhibée lors de l'apoptose et/ou de la suppression tumorale, notamment TSIP 3. Il peut s'agir par exemple d'un nucléotide activé assurant le blocage de la séquence nucléotidique ou encore d'un anticorps monoclonal dressé contre la ou les protéine(s) codée(s) par la séquence nucléotidique.
Par ailleurs, il est possible de prévoir d'autres approches que la thérapie génique, notamment l'utilisation de séquences nucléotidiques en stratégie sens ou antisens, c'est-à-dire pouvant bloquer l'expression de TSIP ou au contraire, agissant en amont, favorisant l'expression de TSAP.
On peut également prévoir une stratégie de remplacement directe par apport de protéines correspondant à TSAP ou d'anticorps inhibiteurs correspondant à TSIP.
Enfin, il est possible de prévoir l'utilisation de molécules non protéiques dont l'activité sera d'activer TSAP ou de mimer l'action de son produit d'expression ou bien d'inhiber TSIP ou bien de bloquer l'action de son produit d'expression.
Ces produits peuvent être aisément testés sur les cellules modifiées qui sont décrites dans les exemples en introduisant les produits à tester dans la culture cellulaire et en détectant l'apparition du phénomène apoptotique. Dans les stratégies à ADN, ARN ou protéique les produits sont bien entendu élaborés en fonction des séquences qui sont décrites.
La présente invention concerne en particulier l'utilisation des médicaments précédents en tant qu'agent anti-cancéreux.
Mais le produit des gènes TSAP 9 à 22 et TSLP 3 est également utile comme agent antiviral, comme cela apparaîtra à la lecture de l'exemple. La présente invention concerne donc également l'utilisation des médicaments précédents comme agent antiviral.
De plus, la présente invention concerne à titre d'agent de diagnostic pour la détermination de la prédisposition au cancer, tout ou partie des séquences selon l'invention à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification, mais également à titre d'agent de diagnostic pour la détermination de la prédisposition au cancer un antigène correspondant à tout ou partie des protéines codées par la séquence selon l'invention ou les anticorps correspondants, éventuellement après culture.
Les méthodes de diagnostic sont connues, il peut s'agir, par exemple, de techniques de microsequençage des parties variables après isolement et amplification éventuelle, ou des méthodes de détection type RFLP, ou d'amplification simple notamment. Les techniques différentielles peuvent, en particulier, permettre de mettre en évidence l'écart entre le TSAP (ou TS P) normal et anormal. L'invention concerne également des modèles mettant en oeuvre les séquences précédentes.
Par ailleurs, il convient de souligner que les inventeurs, ont mis en évidence, par extension des séquences conformes à l'invention initialement mises en évidence, des homologies présentées par lesdites séquences étendues avec des séquences correspondant à des protéines connues.
Plus particulièrement, outre l' homologie de TSAP 9 avec une chaperonine de souris contenant le gène TCP-1 (9), les inventeurs ont mis à jour une forte homologie que présente TSAP 13 avec la sous-unité p40.5 du protéasome humain
(10, 11) et une forte homologie que présente TSAP 21 avec la syntaxine 11 appartenant au groupe des protéines SNARE (12).
Les chaperonines interviennent dans le processus de repliement et l'assemblage des protéines dans le cytosol eucaryote. Elles sont soupçonnées de ralentir ce repliement en piégeant des intermédiaires qui s'agrégeraient sans cela. Parmi les protéines sur lesquelles agirait la chaperonine contenant le gène TCP-1 homologue de TSAP 9, on peut citer l'actine, la tubuline et la protéine de capside du virus de l'hépatite B. Le protéasome, au même titre que l'ubiquitine, est le principal composant du système protéolytique majeur responsable de la dégradation de nombreuses protéines intracellulaires, y compris de protéines aberrantes résultant de mutations ou de stress environnementaux. La sous-unité p40.5 du protéasome 26S humain a récemment été mise en évidence, ainsi que son homologue chez la levure Nas7p. Chez l'homme, le mRNA correspondant à la susdite sous-unité est plus particulièrement exprimé dans le pancréas, le placenta, les testicules, le cœur et le muscle squelettique. Il semble par ailleurs que les cellules de levures déficientes pour Nas7p soient particulièrement sensibles au stress dû à la chaleur. Ceci contribue à suggérer que la fonction du protéasome 26S est dégradée lors d'un stress dû à la chaleur.
Les protéines SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitiye factor- attachment protein receptor) sont des protéines dont l'expression différentielle et les associations sont impliquées dans l'organisation des compartiments membranaires des cellules. Ces protéines sont spécifiquement localisées dans la région de l'appareil de Golgi, des endosomes et des lysosomes, ce qui suggère qu'elles jouent un rôle dans la régulation des échanges membranaires à partir de ces organelles. Plus particulièrement, la syntaxine 11 serait localisée dans la région post-Golgi.
Il serait intéressant de pouvoir déterminer si les voies moléculaires dans lesquelles sont impliquées les séquences conformes à l'invention présentent des points communs avec les voies moléculaires dans lesquelles sont impliquées les susdites protéines, ce qui permettrait d'envisager de nouveaux modes d'action sur les susdites séquences à des fins par exemple thérapeutiques ou diagnostiques.
La Figure 1 représente la séquence de TSAP 13 étendue (SEQ ED N° 5). La partie soulignée correspond à la séquence telle que mise à jour à l'origine par les inventeurs. Les caractères gras correspondent à la séquence présentant 100 % d' homologie avec la sous-unité p40.5 du protéasome 26S humain.
La Figure 2 représente la séquence de TSAP 21 étendue (SEQ ID N° 13). La partie soulignée correspond à la séquence telle que mise à jour à l'origine par les inventeurs. Les caractères gras correspondent à la séquence présentant 100 % d'homologie avec la syntaxine 11 du groupe des protéines SNARE
D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de l'exemple ci-après.
MATERIELS ET METHODES Cultures cellulaires
Les cellules K562, KS. KS2 et KS3 ont été utilisées comme modèles. La lignée K562 est une lignée tumorale, dérivée d'une leucémie chronique de type érythromyéloïde. Elle est caractérisée notamment par un chromosome de Philadelphie qui contient la translocation (9,22), où il y a un réarrangement du gène bcr avec le proto-oncogène abl. Cette lignée a par ailleurs un caryotype anormal et surexprime les oncogènes myc et pim-1. Ces lignées sont décrites dans la référence A. Telerman et al. : A model for tumor suppression using H-l parvovirus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90, pp. 8702-8706, September 1993. En résumé, un monoclone de K562 a été infecté par le parvovirus H-l.
Cette infection a causé une mort massive de la culture cellulaire. Après un maintien de cette culture pendant une période de deux mois, le clone KS a été isolé. La même expérience effectuée une seconde fois a fourni, après trois mois d'incubation, les clones KS2 et KS3.
En employant la même approche, les inventeurs ont dérivé d'une population de cellules malignes U937 les lignées US3 et US4 qui sont résistantes au parvovirus H-l et qui présentent une suppression du phénotype malin. Ces lignées sont décrites dans la référence (7).
Des cellules de leucémie myéloïde Ml et des cellules Ml ont été transfectées de façon stable avec un mutant sensible à la température val 135 p53
(LTR6). Ces cellules sont cultivées sur milieu RPMI 1640 avec 10 % FCS à 5 % de
CO2 à 37°C (3). Pour la modification de la température, les cultures sont placées dans un second incubateur à 32°C.
Lignée U937 transfectée par p21WAF1 : la partie codante complète du cDNA du gène p21WAF1 a été clonée dans le vecteur pBK-RSV (Stratagene, La JoUa, Californie). 3,5 millions de cellules U937 ont été transfectées avec 20 microgrammes d'ADN/30 microgrammes Lipofectin (Life Technologies).
Les transfectants stables ont été sélectionnés à l'aide de 1,5 mg/ml de
G418 (Sigma). Les caractéristiques de cette lignée décrivent notamment une suppression du phénotype malin. Lignée U937 transfectée par TSIP2 (PSI) en position antisens : la partie codante complète du cDNA du gène TSIP2 (PSI) a été clonée en position antisens dans le vecteur pBK-RSV (Stratagene, La Jolla, Californie). 3 millions de cellules
U937 ont été transfectées avec 20 microgrammes d'ADN/30 microgrammes
Lipofectin (Life Technologies). Les transfectants stables ont été sélectionnés à l'aide de 1,5 mg/ml de
G418 (Sigma). Les caractéristiques de cette lignée, décrivant notamment un ralentissement de la croissance, une activation de l'apoptose et une suppression du phénotype malin, ont été décrites dans la référence (8).
Lignée U937 transfectée par TSAP3 (ΗUMSIAH) : la partie codante complète du cDNA du gène TSAP3 a été clonée dans le vecteur pBK-RSV
(Stratagene, La Jolla, Californie). 3 millions de cellules U937 ont été transfectées avec 20 microgrammes d'ADN/30 microgrammes Lipofectin (Life Technologies). Les transfectants stables ont été sélectionnés à l'aide de 1,5 mg/ml de G418 (Sigma). Les caractéristiques de cette lignée, comportent notamment une activation de l'apoptose et une suppression du phénotype malin.
Etude des ADNc différentiels
Pour effectuer les tests dans des conditions expérimentales standards et pour obtenir une reproductivité totale des résultats, les modifications suivantes au protocole d'origine (1) ont été effectuées :
On utilise toujours des ARNm polyA+ purifiés deux fois sur colonne d'oligodT utilisant Fast Track (Invitrogen, San Diego CA). Après transcription réverse (M-MLV Reverse Transcriptase, Gibco BRL) sur 0,05 μg de polyA+ utilisant 20 μM de chacun des dNTP (Boehringer-Mannheim), aucun dNTP additionné n'est ajouté au mélange de PCR final. Un « hot start » à 94°C pendant 5 minutes est effectué avant la PCR (GeneAmp PCR System 9600 Perkin Elmer Cetus). Les échantillons sont refroidis rapidement sur de l'eau glacée. Un « touch down » (2) de 10 cycles de 50°C à 40°C est effectué (94°C 30 secondes - 50°C 1 minute - 72°C 30 secondes), suivi par 35 cycles (94°C 30 secondes - 40°C 1 minute - 72°C 30 secondes) et une extension finale de 5 minutes à 72°C. Les produits de la PCR sont séparés sur gels de polyacrylamide à 6 % non dénaturant (4). Les gels sont exposés sans séchage. Chaque présentation différentielle est effectuée en comparant M1S6 et LTR6 à 37°C et après 4 heures d'incubation des deux lignées cellulaires à 32°C.
La procédure de présentation différentielle est répétée dans 3 expériences différentes pour confirmer une parfaite reproductibilité. Les bandes exprimées différentiellement sont découpées à partir du gel, éluées et réamplifiées (1). Les produits de PCR sont sous-clonés en utilisant le système TA-cloning (Invitrogen, San Diego CA) en suivant les indications fournies.
Pour chaque réaction de ligation, 10 clones recombinants sont séquences en utilisant le système automatique ABI.
Extraction des ARN, analyses et sondes Northern blots L'ARN total est extrait avec du Trizol (Life Technologies). Les ARN polyl+ sont préparés en utilisant le kit OligotexdT (Qjagen, CA). 30 μg de l'ARN total ou 2 μg d'ARN polyA+ sont séparés sur agarose 1 % 1 x MOPS/2 % gel de formaldéhyde, transférés sur membrane de nylon (Hybond N+, Appligène, France) comme cela a été décrit précédemment (5). Les Northern blots sont hybrides avec des sondes marqués au P32 sur les inserts TSAP et TSEP et lavés comme décrit précédemment (5). Pour vérifier l'induction de la fonction du p53 sauvage, les Northern blots sont hybrides avec une sonde cycline G (6). A titre de contrôle pour la quantité d'ARNm chargée, les bots sont hybrides avec une sonde "GAPDH. Différents Northern blots (Clontech CA) sont utilisés dans des conditions identiques et hybrides pour contrôle avec une sonde β-actine. Les Northern blots sont exposés pendant 10 jours à - 80°C.
Exemple 1 Le but recherché est de caractériser les voies moléculaires qui mènent à la suppression du cancer.
De façon à élaborer un modèle, on a fait l'hypothèse suivante : s'il était possible de sélectionner, à partir d'une tumeur qui soit sensible à l'effet cytopathique du parvovirus H-l, les cellules qui étaient résistantes, cette résistance pourrait être due à un changement de leur phénotype malin. Ceci a pu être démontré pour les cellules KS sélectionnées à partir des cellules érythro- leucémiques K562. Contrairement à la lignée parentale K562, les clones KS, KS2 et KS3 sont résistants à l'effet cytopathique du parvovirus H-l. En outre, les cellules KS, KS2 et KS3 ont une réduction de leur tumorigénicité de 90 %, alors que cultivées dans du "soft agar", ces mêmes lignées KS ont une réduction de leur tumorigénicité in vivo lorsqu'injectées dans des souris immunodéprimées Scid- Scid. Au niveau moléculaire, on a pu remarquer que cette suppression du phénotype malin allait de pair avec une réexpression du gène suppresseur p53.
15 ADNc exprimés de manière différentielle entre les cellules K562 et KS ont été isolés. TSAP 9 est homologue aux chaperonines.
Le Tableau 1 rassemble les molécules caractérisées, en reprenant les amorces ainsi que les tailles des mRNAs détectés par Northern blot. De ces 15 molécules, toutes sont induites dans les cellules KS, hormis TSIP 3, dont l'expression est inhibée durant la suppression du phénotype malin.
Dans des expériences de transfection, on a également pu démontrer que la résistance à l'effet cytopathique du parvovirus H-l allait de pair avec une fonction intacte du gène p53 et que des cellules transfectées avec des mutants p53 devenaient sensibles à l'effet cytopathique du parvovirus H-l.
Les 15 molécules que nous avons isolées codent donc des gènes dont la surexpression ( TSAP 9 - TSAP 22) ou l'inhibition ( TSIP 3) est associée non seulement à la suppression du cancer mais également à la résistance au parvovirus H-l . Ces gènes codent par conséquent pour des molécules faisant partie des voies moléculaires de la suppression du cancer et sont de potentiels gènes suppresseurs.
Afin de mieux cerner les voies d'activation p53/p21, les inventeurs ont étudié :
- l'activation de ces TSAP / inhibition des TSIP dans le modèle p53 thermosensible développé dans Moshe Oren,
- l'activation de ces TSAP / inhibition des TSIP dans le modèle où les cellules U937 sont transfectées par le gène p21,
- l'activation des nouveaux TSAP / inhibition des TSIP dans le modèle où les cellules U937 sont transfectées par le gène TSAP3, et - l'activation de ces nouveaux TSAP TSIP dans le modèle où les cellules
U937 sont transfectées par le gène TSIP2 (PSI) en position antisens.
Le Tableau 1 ci-après rend compte de résultats d'expressions différentielles analysées par Northern blot des différentes sondes (TSAP9-
TSAP22, TSEP3) du modèle K562/KS ainsi que des autres modèles U937/US3- US4, c'est-à-dire dans un modèle de suppression tumorale dans lequel le gène p21 est activé par la voie p53 indépendante. Ces ADNc sont donc activés dans deux systèmes cellulaires différents de suppression tumorale (le modèle d'érythroleucémie K562/KS et le modèle myélomonocytaire U937/US).
D'après ce tableau, on constate que dans la majeure partie des cas, les gènes exprimés différentiellement dans le modèle K562/KS sont également exprimés différentiellement dans le modèle U937 US3-US4. Il existe donc une machinerie moléculaire de la suppression tumorale commune à différents types de cancer. Cette conclusion est également valable pour le modèle Ml LTR-6. Il faut noter dans ce dernier cas que l'absence de signaux dans certains TSAP-TSIP est probablement due au fait que les expérimentations ont été réalisées dans deux systèmes hétérologues (des sondes humaines sur de l'ARN de souris).
TABLEAU 1
Figure imgf000016_0001
* les chiffres et les séquences des amorces en 5' correspondent à ceux rapportés par Bauer et al.
0 HUMKGIDD ARNm humain pour l'ORF (équivalent humain de la chaperonine de souris contenant le gène TCP-1 (t-complexe polypeptide).
0 Sous unité p40.5 du Protéasome (Nas7p)
Δ Syntaxine 11 SNARE TABLEAU 1 (suite)
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
EXP DEFF. = Expression différentielle
NO EXPR. DEFF. = Pas d'expression différentielle Le Tableau 2 ci-après résume l'expression différentielle de certains clones TSAP et TSIP dans différentes lignées de transfectants.
Il se dégage de ce tableau que, dans la majeure partie des cas, les transfectants p21 ou transfectants TSAP3 ou transfectants antisens-TSIP2 sont capables d'activer la machinerie moléculaire de la suppression tumorale commune aux systèmes U937/US et K562/KS.
TABLEAU 2
Figure imgf000018_0001
Le Tableau 3 ci-après récapitule les caractéristiques d'expression différentielle des clones d'ADNc par Northern blot.
TABLEAU 3
Figure imgf000019_0001
D : Expression différentielle N : Pas d'expression différentielle
0 : Chaperonine contenant le gène TCP1 ° : Sous unité p40.5 du protéasome (Nas 7p) Δ : Syntaxine 11 SNARE REFERENCES
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(2) Don R.H., Cox P.T., Wainwright B.J., Baker K. & Mattick J.S. (1991) Nucl. . Acids Res., 19, 4008
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(6) Okamoto K. & Beach D. (1994) EMBO J., 13, 4816-4822
(7) NemaniM., Linares-Cruz G., Bruzzoni-Giovanelli H., Roperch J.-P., Tuynder M., Bougueleret L., Cherif D., Medhioub M., Pasturaud P., Alvaro V., Der Sarkissan H., Cazes L., Le Paslier D., Le Gall L, Israeli D., Dausset
J., Sigaux F., Chumakov L, Oren M., Calvo F., Amson R. B., Cohen D. and Telerman A., Activation of the human homologue of the Drosophila sina gène in apoptosis and tumor suppression, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1996) 93, 9039-9057 (8) Roperch J.-P., Alvaro V., Prieur S., Tuynder M., Nemani M., Lethrosne F., Piouffre L., Gendron M-G., Israeli D., Dausset J., Oren M., Amson R., and Telerman A., Inhibition of presenilin 1 expression is promoted by p53 and p21 WAF-1 and results in apoptosis and tumor suppression, Nature Medicine (1998) 4, 835-838. (9) Kubota et al., 1995, Eur. J. Biochem. 230, 3-16,
(10) Hori et al., 1998, Gène, 216, 113-122,
(11) Baumeister et al., 1998, Cell, Vol. 92, 367-380,
(12) Advani et al., 1998, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, N° 17, 10317-10324.

Claims

REVENDICATIONS
1) Séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant: (a) une séquence selon l'une des IND.SEQ 1 à 15 ou un gène équivalent qui comporte:
(b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a),
(c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec (a) ou (b), ou (d) une séquence caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est induite ou inhibée lors de l'apoptose et/ou suppression tumorale.
2) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'apoptose et ou la suppression tumorale est(sont) induite(s) par p53 et ou p21.
3) Séquence selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi TSAP 9 à TSAP 22 ou un gène équivalent. 4) Séquence selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'apoptose et/ou la suppression tumorale est(sont) induite(s) par p53 et/ou p21.
5) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle correspond au gène TSIP 3 ou un gène équivalent.
6) Séquence selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est inhibée lors de l'apoptose et/ou la suppression tumorale.
7) Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est activée par l'un au moins des transfectants choisi dans le groupe comprenant les transfectants p21, les transfectants TSAP3 et les transfectants antisens TSLP2.
8) Vecteur d'expression cellulaire d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 7.
9) Vecteur d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral. 10) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus herpès ou d'un poxvirus.
1 1 ) Vecteur selon la revendication S, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur à acide nucléique nu.
12) Vecteur selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence assurant le ciblage et/ou l'expression tissu spécifique.
13) Cellule transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 8 à 12.
14) Protéine pouvant être obtenue par culture de cellule transformée selon la revendication 13 et codée par la séquence selon l'une des revendications 1 à 7.
15) A titre de médicament, un vecteur selon l'une des revendications 8 à 12 ou une protéine selon la revendication 14.
16) A titre de médicament, un composé assurant l'expression cellulaire d'au moins une des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 3 ou de leurs produits.
17) A titre de médicament selon la revendication 15, un vecteur nucléotidique assurant l'expression cellulaire de ladite séquence.
18) A titre de médicament, un composé assurant l'inhibition de l'expression cellulaire d'au moins un gène cellulaire selon l'une des revendications 1, 5 à 7 ou de leurs produits.
19) A titre de médicament selon la revendication 18, un nucléotide activé assurant la blocage de la séquence nucléotidique.
20) A titre de médicament selon la revendication 18, un anticorps monoclonal dressé contre la ou les protéines codées par la séquence nucléotidique.
21) A titre de médicament destiné au traitement du cancer, un médicament selon l'une des revendications 15 à 20. 22) A titre d'agent antiviral, un médicament selon l'une des revendications 15 à 20.
23) A titre d'agent de diagnostic, notamment pour la détermination de la prédisposition et le suivi des cancers, tout ou partie des séquences selon l'une des revendications 1 à 7 à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification.
24) A titre d'agent de diagnostic, notamment pour la détermination de la prédisposition et le suivant des cancers, un antigène correspondant à tout ou partie des protéines codées par la séquence selon l'une des revendications 1 à 7 ou les anticorps correspondants.
25) Modèle pour la mise en évidence de médicament anti-cancéreux, et/ou antiviral des cellules selon la revendication 13.
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