FR2742766A1 - Sequences nucleotidiques, proteines, medicaments et agents diagnostics utiles dans le traitement du cancer - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant: (a) une séquence selon l'une des IND.SEQ1 à 10 ou un gène équivalent qui comporte: (b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a), (c) une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec (a) ou (b), ou (d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon (a), (b) ou (c) ou pour une protéine équivalente, et leur application notamment dans la suppression du cancer ainsi que dans le suivi thérapeutique.

Description

La présente invention concerne la mise en évidence de gènes impliqués dans les voies moléculaires de la suppression tumorale et l'utilisation des gènes ainsi mis en évidence pour le traitement de certains dysfonctionnements géniques, notamment les cancers.

La présente invention a été rendue possible par l'isolement d'ADNc correspondant a des ARN messagers exprimés ou réprimés lors du processus d'apoptose induit par le gène suppresseur p53.

Une synthèse rapide des événements moléculaires intervenant au cours du cycle cellulaire lors du développement et de l'apoptose cellulaire est nécessaire pour mieux comprendre l'importance du gène p53 dans le processus de suppression tumorale ou, au contraire, de cancérisation.

La transformation d'une cellule normale en cellule tumorale est un processus qui se déroule en plusieurs étapes et qui nécessite une suite d'événements moléculaires. Au niveau physiologique, ces événements se traduiront par une indépendance de la cellule tumorale vis à vis des signaux extérieurs ainsi que par une dérégulation interne menant à une croissance incontrôlée.

Deux groupes de gène sont responsables de cette transformation dite "maligne", d'une part, les oncogènes, de l'autre, les gènes suppresseurs ou anti-oncogènes. Les oncogènes, en raison de leur dérégulation dans le cancer (résultant le plus souvent d'une mutation ou d'une translocalisation) induiront un signal positif qui favorisera la croissance néoplasique. Au contraire, les gènes suppresseurs, du fait de leur délétion, de l'absence de leur expression par mutation du promoteur, par exemple, ou encore de mutations qui modifieront la structure et la fonction de la protéine, seront incapables dans le cancer de fournir le signal qui lui, normalement, devrait freiner cette croissance anormale. En conséquence, le dysfonctionnement des gènes suppresseurs contribue à la transformation néoplasique.

L'objet de la présente invention est l'isolement de gènes ayant normalement une action dans la suppression tumorale et dont il sera alors possible de surveiller et de traiter les éventuels dysfonctionnements.

En particulier, l'isolement de ces gènes permet d'avoir recours à une thérapie génique de remplacement ou bien à la synthèse d'agents pharmacologiques, protéiques ou non protéiques, qui, directement ou indirectement, par leur action sur les promoteurs, induiront l'activation et l'expression de ces gènes, ou encore la synthèse d'agents pharmacologiques qui permettront de mimer l'effet physiologique de ces gènes suppresseurs.

L'objectif final est, soit d'inhiber la croissance tumorale, ou mieux, d'induire le processus apoptotique de ces cellules tumorales, c'est-àdire de conduire les cellules tumorales à se "suicider".

La présente invention concerne la mise en évidence de gènes qui sont impliqués dans cette apoptose. En effet, chaque cellule possède en elle un programme de mort physiologique. I1 s'agit également d'un processus physiologique qui est impliqué dans le développement afin de maintenir l'homéostasie du corps et de ne pas voir des proliférations cellulaires anormales s'établir, même si, au demeurant, elles n'ont pas de caractère malin.

L'un des gènes suppresseurs les plus importants impliqués dans l'apoptose est le gène p53. Dans sa fonction normale, ce gène contrôle la croissance cellulaire et le processus d'apoptose ; en particulier, c'est ce gène qui bloque la croissance cellulaire et qui doit induire le processus apoptotique afin d'éviter le développement d'un cancer. On a ainsi mis en évidence que des souris nullizygotes pour le p53 étaient beaucoup plus sensibles à la formation de tumeurs. On a également mis en évidence le fait que, dans les cancers, le gène p53 était très souvent altéré et conduisait à la production de protéines incapables de véhiculer le message d'apoptose.

C'est cette particularité qui a été mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention.

En effet, la présente invention repose sur la constatation qu'il n'est pas possible, ou du moins qu'il paraît très difficile, de mettre en place une thérapie de substitution directe lors d'un dysfonctionnement du gène p53. En effet, le p53 muté comme il l'est dans le cancer va annuler l'effet physiologique du p53 normal.

I1 a donc fallu renoncer, du moins dans un premier temps, à une thérapie de substitution agissant directement au niveau de p53.

La présente invention s'est donc attachée à étudier les gènes situés en aval de p53 afin de "bipasser" la difficulté évoquée précédemment.

Afin d'isoler les gènes activés ou inhibés par le p53 normal (wild-type p53) on a effectué un ratissage global de l'expression des gènes dans une cellule induite en apoptose et dans la même cellule maligne, plus particulièrement dans une cellule exprimant le p53 normal dans sa fonction et dans une cellule exprimant le p53 muté dont la fonction est oncogénique.

La comparaison des gènes exprimés (ARN messagers exprimés dans les deux types de cellule) a permis de mettre en évidence des gènes exprimés différentiellement, c'est-à-dire exprimés dans l'une des cellules alors qu'ils ne le sont pas dans l'autre (les gènes peuvent être activés ou inhibés).

On en déduit aisément que ces gènes sont impliqués dans le processus de cancérisation, dans un cas par leur absence, et, dans l'autre cas, par leur présence.

Pour cette étude différentielle, la méthode utilisée est la méthode décrite en 1992 par Liang et Pardee (Differential display of eucaryotic mRNA by mean of a polymerase chaine reaction).

Jusqu'à présent, l'isolement des gènes impliqués dans la suppression était effectué soit par clonage positionnel, soit par l'emploi des doubles hybrides. La première méthode permettait, par un calcul statistique, de calculer la plus haute probabilité où pouvait se localiser, au niveau chromosomique, un gène suppresseur candidat pour un type bien particulier de cancer, surtout ceux d'origines familiales. Le système de doubles hybrides permet d'isoler une à une les protéines qui interagissent avec un gène donné.

L'approche du problème selon la présente invention a permis d'isoler des séquences directement reliées à une fonction. Dès lors, au contraire du séquençage aléatoire des EST, les séquences sont des séquences dont la fonction est connue et qui sont impliquées dans le processus d'apoptose induit par le gène suppresseur p53.

De façon plus précise, cette méthode a été utilisée sur un modèle cellulaire décrit par Moshe Oren, il s'agit de cellules myeloïdes tumorales de souris qui ont été transfectées par un mutant stable du gène p53. En fait, l'expression de ce gène est thermosensible, c'est-à-dire que dans des conditions de culture cellulaire à 37"C la protéine produite est une protéine mutée, c'est-à-dire qu'elle ne peut jouer le rôle de suppresseur de tumeur et donc que la lignée cellulaire correspondante se développe sous forme de cellule maligne, alors qu'à la température de 32"C la protéine p53 exprimée, comme la protéine naturelle, est capable de jouer le rôle de suppresseur et empêche la lignée cellulaire correspondante de devenir maligne.

Cette étude systématique a permis de mettre en évidence les gènes impliqués dans la cascade de suppression induite par p53.

C'est pourquoi la présente invention concerne ces nouvelles séquences et les gènes les comportant ainsi que l'utilisation de ces séquences, tant au niveau du diagnostic qu'au niveau de la thérapie, de même que pour la réalisation de modèles destinés à tester des produits anticancéreux.

La présente invention concerne tout d'abord une séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant (a) une séquence selon l'une des IND.SEQ1 à 10 ou
un gène équivalent qui comporte (b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a), (c) une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec (a) ou (b), ou (d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon (a),
(b) ou (c) ou pour une protéine équivalente, et leur application notamment dans la suppression du cancer ainsi que dans le suivi thérapeutique.

I1 convient de rappeler que les séquences 1 à 10 ne constituent qu'une partie des gènes en cause mais que la présente invention couvre aussi bien la séquence nucléotidique correspondant au gène entier que des fragments de ce gène, notamment lorsqu'ils codent pour une protéine équivalente comme cela sera décrit ci-après.

Les séquences nucléotidiques peuvent être aussi bien de 1'ADN que de 1'ARN ou des séquences dans lesquelles certains des nucléotides sont non naturels, soit pour améliorer leurs propriété pharmacologiques, soit pour permettre leur identification.

Les séquences mentionnées en (b) sont essentiellement les séquences complémentaires totales ou partielles (notamment pour les cas évoqués précédemment).

Les séquences (a) et (b) permettent non seulement l'accès au gène murin dont elles sont issues, mais également aux gènes humains correspondant par homologie.

Ainsi, l'invention concerne également les séquences nucléotidiques des gènes présentant une forte homologie avec les gènes mentionnés précédemment, de préférence une homologie supérieure à 80% sur les parties essentielles desdits gènes, soit en général au moins 50% de la séquence, de préférence l'homologie sera sur ces parties supérieure à 90%.

Enfin, lorsque lesdits gènes codent pour une protéine, la présente invention concerne également les séquences codant pour la même protéine, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, mais également pour les protéines équivalentes, c'est-à-dire produisant les mêmes effets, notamment les protéines délétées et/ou ayant subi des mutations ponctuelles.

Les séquences selon la présente invention sont plus particulièrement les séquences qui sont induites ou inhibées lors de l'apoptose cellulaire, notamment celles induites par p53.

Lesdits gènes sont regroupés en TSAP ou "Tumor Suppressor
Activated Pathway" et dénommés de TSAP 1 à TSAP 8, correspondant aux
IND.SEQ 1 à 8, et en TSIP ou "Tumor Suppressor Inhibited Pathway" et dénommés TSIP 1 et TSIP 2, correspondant aux IND.SEQ9 et 10.

Les caractéristiques des séquences sont rassemblées dans le tableau ci-annexe.

Les séquences nucléotidiques correspondant aux gènes TSAP sont des séquences exprimées lors du processus d'apoptose alors que lorsqu'ils ne sont pas exprimés le processus d'oncogénèse se poursuit. Il est donc intéressant - de détecter toute anomalie dans le gène correspondant, laquelle peut
conduire à une plus grande susceptibilité à l'oncogénèse, et - de pouvoir prévoir une thérapie de remplacement.

Il faut d'ailleurs rappeler que ces gènes peuvent intervenir dans d'autres processus que les processus oncogènes ; en effet, p53 est en quelque sorte le gardien de l'intégrité du génome, dans ces conditions les gènes TSAP ou TSIP sont sans doute également impliqués dans cette fonction de contrôle, c'est donc l'ensemble des altérations possibles du génome qui peuvent être redevables de la détection et de la thérapie précédente. Au contraire, les gènes TSIP sont exprimés lors de l'oncogénèse et non lors de l'apoptose, il est donc là aussi intéressant de détecter l'éventuelle anomalie des TSIP et également de prévoir une thérapie d'inhibition/blocage.

La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à-dire en introduisant le gène TSAP avec les éléments qui permettent son expression in vivo. Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs particuliers, viraux ou non viraux, par exemple des adénovirus, rétrovirus, virus herpès ou poxvirus. La plupart du temps ces vecteurs sont utilisés sous forme défectifs qui serviront de véhicules d'expression de TSAP avec ou sans intégration.Les vecteurs peuvent être également synthétiques, c'est-à-dire mimer des séquences virales, ou bien être constitués par de l'ADN ou de l'ARN nu selon la technique développée notamment par la société VICAL
Dans la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression spécifique des tissus ou organes, en effet, il n'est pas possible d'envisager d'activer un phénomène d'apoptose incontrôlé.

La présente invention concerne donc l'ensemble des vecteurs décrits précédemment.

La présente invention concerne également les cellules transformées par un vecteur d'expression tel que décrit précédemment ainsi que la protéine pouvant être obtenue par culture de cellules transformées.

Les systèmes d'expression pour produire des protéines peuvent être aussi bien des systèmes eucaryotes tels que les vecteurs précédents que des systèmes procaryotes dans des cellules de bactéries.

L'un des intérêts de la présente invention est qu'elle a mis en évidence l'implication de plusieurs gènes dans l'apoptose ; ainsi la surexpression de l'un des gènes par thérapie génique peut, pour certains d'entre eux, ne conduire à l'apoptose que les cellules dans lesquelles s'expriment déjà d'autres gènes déréglés, c'est-à-dire des cellules malignes.

La présente invention concerne également, à titre de médicament, un composé assurant l'expression cellulaire d'au moins une des séquences nucléotidiques précédentes lorsqu'elle est induite lors de l'apoptose cellulaire, notamment des gènes TSAP 1 à TSAP 8, ou au contraire assurant l'inhibition de l'expression cellulaire d'au moins une séquence cellulaire telle que décrite précédemment lorsqu'elle est inhibée lors de l'apoptose cellulaire, notamment TSIP 1 et TSIP 2.

Il est, par exemple, possible de prévoir d'autres approches que la thérapie génique, notamment l'utilisation de séquences nucléotidiques en stratégie sens ou antisens, c'est-à-dire pouvant bloquer l'expression de TSIP ou au contraire, agissant en amont, favorisant l'expression de TSAP.

On peut également prévoir une stratégie de remplacement directe par apport de protéines correspondant à TSAP ou d'anticorps inhibiteurs correspondant à TSlP.

Enfin, il est possible de prévoir l'utilisation de molécules non protéiques dont l'activité sera d'activer TSAP ou de mimer l'action de son produit d'expression ou bien d'inhiber TSIP ou bien de bloquer l'action de son produit d'expression.

Ces produits peuvent être aisément testés sur les cellules modifiées qui sont décrites dans les exemples en introduisant les produits à tester dans la culture cellulaire et en détectant l'apparition du phénomène apoptotique. Dans les stratégies à ADN, ARN ou protéique les produits sont bien entendu élaborés en fonction des séquences qui sont décrites.

La présente invention concerne en particulier l'utilisation des médicaments précédents en tant qu'agent anti-cancéreux.

La présente invention concerne également à titre d'agent de diagnostic pour la détermination de la prédisposition au cancer, tout ou partie des séquences selon l'invention à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification mais également à titre d'agent de diagnostic pour la détermination de la prédisposition au cancer un antigène correspondant à tout ou partie des protéines codées par la séquence selon l'invention ou les anticorps, notamment les anticorps monoclonaux, correspondants, éventuellement après culture.

Les méthodes de diagnostic sont connues, il peut s'agir, par exemple, de techniques de microséquençage des parties variables après isolement et amplification éventuelle ou des méthodes de détection type RFLP ou d'amplification simple notamment. Les techniques différentielles peuvent, en particulier, permettre de mettre en évidence l'écart entre le
TSAP ou TSIP normal et anormal.

L'invention concerne également des modèles mettant en oeuvre les séquences précédentes.

Enfin, l'invention concerne un perfectionnement à la méthode de Liang et Pardee (1) caractérisé en ce que dans l'amplification par PCR on effectue une diminution en palier ( touch down") tel que décrit dans Don et al. (2).

D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après faite notamment en se référant aux figures suivantes - Figure 1 - Quantification de l'expression différentielle des ARNm
utilisant l'imageur 1200 ss. Hybridation aux ARNm dérivés des cellules
LTR6 à 37"C et des cellules LTR6 après 4 heures à 32"C. Les nombres en
ordonnées de 0 à 500 correspondent au comptage détecté par 0,15 mm et
sont proportionnels au signal d'hybridation.

C1 : ARNm exprimé également en utilisant un clone sans expression différentielle
C2 : contrôle positif utilisant la Cycline G et montrant l'induction des
ARNm correspondant à 32 C ;
MER-LTR : montre l'induction de cette séquence à 32 C.

TSAP 1 à TSAP 8 : expression différentielle des 8 ARNm activés dans les 4 premières heures suivant l'induction de l'apoptose ;
TSIP 1 et TSIP 2 : expression différentielle des 2 ARNm inhibés dans les 4 premières heures suivant l'induction de l'apoptose.

Figure 2 - Analyse Northern blot.

A: hybridation avec la sonde TSAP 3
B: hybridation avec la sonde siah lb de souris; lignes 1 et 2 : ARNm polyA+ de cellules leucémiques myéloïdes M1 (clone S6) cultivées à 37 C et 32 C respectivement lignes 3 et 4 : ARNm polyA+ de cellules LTR6 cultivées à 37 C et 32"C respectivement; la flèche indique l'expression différentielle du transcrit 1 ,9 kb de
TSAP 3 - siah lb de souris; panneaux inférieurs :GAPDH;
C : distribution tissulaire utilisant TSAP 3 comme sonde; 1 : coeur, 2 : cerveau, 3 : rate, 4 : poumon, 5 : foie, 6 : muscle du squelette, 7 : rein, 8 : testicule les flèches indiquent les transcrits de 1,9 et 2,4 kb panneau inférieur : ss-actine.

Figure 3 - Analyse de l'hybridation in situ avec la sonde TSAP 3
A: cellules Nil incubées pendant 4 heures à 32 C et hybridées avec une sonde antisens TSAP 3
B : cellules LTR6 incubées pendant 4 heures à 32 C et hybridées avec une sonde sens TSAP 3;
C: cellules LTR6 incubées à 37 C et hybridées avec une sonde antisens
TSAP 3;
D à F : cellules LTR6 cultivées à 32 C pendant respectivement 1, 2 et 4 heures et hybridées à une sonde antisens TSAP 3 la barre dans le panneau A: 10 tim; les flèches indiquent l'accumulation des ARNm TSAP 3 dans le cytoplasme.

MATERIELS ET METHODES
Cultures cellulaires
Cellules de leucémie myéloïde Ml (clone S6) et cellules M1 transfectées de façon stable avec un mutant sensible à la température val 135 p53 (LTR6).

Ces cellules sont cultivées sur milieu RPMI 1640 avec 10% FCS à 5% de CO2 à 37"C (3). Pour la modification de la température, les cultures sont placées dans un second incubateur à 32 C. Pour tous les essais effectués dans cette étude, les cellules sont testées après 12 et 24 heures pour la présence d'apoptose.

Etude des ADNc différentiels
Pour effectuer les tests dans des conditions expérimentales standards et pour obtenir une reproductivité totale des résultats, les modifications suivantes au protocole d'origine (1) ont été effectuées
On utilise toujours des ARNm polyA+ purifiés deux fois sur colonne d'oligodT utilisant Fast Track (Invitrogen, San Diega CA). Après transcription réverse (M-MLV Reverse Transcriptase, Gibco BRL) sur 0,05 g de polyA+ utilisant 20 yM de chacun des dNTP (Boehringer
Mannheim), aucun dNTP additionné n'est ajouté au mélange de PCR final.

Un "hot start" à 94 C pendant 5 minutes est effectué avant la PCR (GeneAmp
PCR system 9600 Perkin Elmer Cetus). Les échantillons sont refroidis rapidement sur de l'eau glacée. Un "touch down" (2) de 10 cycles de 50"C à 40"C est effectué (94 C 30 secondes - 50"C 1 minute - 72"C 30 secondes), suivi par 35 cycles (94 C 30 secondes - 40"C 1 minute - 72"C 30 secondes) et une extension finale de 5 minutes à 72 C. Les produits de la PCR sont séparés sur gels de polyacrylamide à 6% non dénaturant (4). Les gels sont exposés sans séchage. Chaque présentation différentielle est effectuée en comparant M1S6 et LTR6 à 37"C et après 4 heures d'incubation des deux lignées cellulaires à 32 C.

La procédure de présentation différentielle est répétée dans 3 expériences différentes pour confirmer une parfaite reproductibilité.

Les bandes exprimées différentiellement sont découpées à partir du gel, éluées et réamplifiées (1). Les produits de PCR sont sous-clonés en utilisant le système TA-cloning (Invitrogen, San Diego CA) en suivant les indications fournies.

Pour chaque réaction de ligation, 10 clones recombinants sont séquencés en utilisant le système automatique ABI.

Extraction des ARN. analyses et sondes Northern blots
L'ARN total est extrait avec du Trizol (Life Technologies). Les
ARN polyA+ sont préparés en utilisant le kit OligotexdT (Qiagen, CA). 30 Fg de l'ARN total ou 2 pg d'ARN polyA+ sont séparés sur agarose 1%/1 x MOPS/2% gel de formaldéhyde, transférés sur membrane de nylon (Hybond N+,
Appligène, France) comme cela a été décrit précédemment (5). Les Northern blots sont hybridés avec des sondes marqués au p32 sur les inserts TSAP et
TSIP et lavés comme décrit précédemment (5). Pour vérifier l'induction de la fonction du p53 sauvage, les Northern blots sont hybridés avec une sonde cycline G (6). A titre de contrôle pour la quantité d'ARNm chargée, les blots sont hybridés avec une sonde GAPDH.Différents Northern blots (Clontech
CA) sont utilisés dans des conditions identiques et hybridés pour le contrôle avec une sonde B-actine. Les produits de RT-PCR pour LTR6 sont amplifiés en utilisant les amorces siah lb suivantes : 5'CAGTAAACCACTGAAAAACC3' et 5'CAAACCAAACCAAAACCAC3'. Le produit de PCR sous-cloné est utilisé comme sonde contrôle de siah lb. Les Northern blots sont exposés pendant 10 jours à -80 C.

Slot blots
La reproductubilité des résultats obtenus par les analyse
Northern blot. Les blots sont préparés (Bio-Rad, Hercules CA) en plaçant les produits de PCR (200 ng de Zeta-Probe Blotting Membranes, Bio-Rad, suivant les instructions du fabricant) de clones TSAP et hybridés avec une sonde
ADNc marquée au P32 (Superscript II Gibco-BRL, Life Technologies) correspondant à l'ARN des cellules LTR6 incubées à 37oC et ensuite 4 heures à 32"C. Le produit de PCR du clone contenant la cycline G est également déposé sur les membranes et utilisé comme contrôle positif. Les Slot Blots sont exposés une nuit à -80"C.

Analyse quantitative des images
Celle-ci est effectuée en utilisant un imageur 1200 B (Biospace
Instruments, Paris France) sur les deux Northern blots (pour TSIP1 et TSIP2) et sur les Slot Blots pour tous les contrôles ADNsc et TSAP1 à 8. Pour l'analyse quantitative représentée dans les graphiques de la figure 1 on soustrait un nombre constant de chaque pic. Cette constante est calculée en mesurant la valeur moyenne du bruit de fond dans les slots qui ne contiennent pas d'ADNc. Les résultats du ss imageur ont été obtenus en comptant les slot blots une nuit et en les confirmant par autoradiographie avec des temps variables d'exposition.Ces autoradiogrammes montrent les mêmes variations qualitatives relatives entre les activités à 32"C et à 37"C que les mesures effectuées avec le ss imageur.

Hybridation in situ (7, 8)
Les cellules sont lavées 3 fois dans un tampon phosphate salin (PBS) "cytospinned" et fixées par du paraformaldéhyde à 4% dans PBS pendant 10 minutes puis conservées dans l'éthanol à 70%. Des transcrits d'ARN marqués à la digo,xigénine-ll-urédine-5'-triphosphate (DIG) et à la biotine-l l-UTP de TSAP3 sont utilisés dans les analyses suivant la procédure décrite précédemment (Boehringer-Mannheim). Pour la détection des souches marquées à la digoxigénine hybridée les tranches sont incubées dans SA > 10 (10 nm d'anticorps anti-DIG de mouton marqués à l'or à 1/1000 de dilution, Biocell UK). L'analyse est effectuée en utilisant de la microscopie à laser confocal.

EXEMPLE 1
L'étude différentielle des ADNc par la méthode de Liang et
Pardee permet de disposer d'un outil très puissant et efficace pour détecter les variations dans l'expression des gènes. Néanmoins, il a fallu modifier le protocole original comme cela a été indiqué précédemment afin d'écarter certains problèmes de reproductibilité observés lorsque l'on applique la méthode telle qu'elle est décrite à l'origine.

On a pu mettre en évidence une reproductibilité totale lorsque dans la méthode PCR on introduit un "hot start" suivi par un "touch down".

Les bandes exprimées différentiellement après isolement et réamplification sont néanmoins souvent contaminées par des bandes provenant des ARN qui migrent dans les régions voisines de l'ADNc, si l'on utilise directement ces sondes sur des Northern blots ceci conduit à des erreurs. On a donc sous-cloné les produits de seconde PCR et fait effectuer les analyses des Northern blots utilisés à défaut de recombinant à sonde simple. Le séquençage systématique d'au moins 10 sous-clones recombinants pour chaque bande sélectionnée a montré qu'il était très efficace pour sélectionner les clones d'intérêt.

Le gène p53 est, dans l'état actuel de nos connaissances, le suppresseur tumoral qui est muté dans le plus grand nombre de cancers d'origines très diverses et l'utilisation du mutant sensible à la température val-135 p53 s'est déjà montrée précédemment fournir des informations très importantes concernant le fonctionnement du p53 sauvage en induisant, soit l'arrêt de la croissance cellulaire en phase G-1, soit l'initiation du programme de mort cellulaire.

Jusqu'à maintenant, les voies moléculaires en amont et en aval de p53 et qui conduisent à la suppression tumorale étaient encore peu claires.

Jusqu'à maintenant un certain nombre de gènes en aval de p53 ont été identifiés, il s'agit notamment de gadd 45, mdm 2, mck, "Mouse endogenous retrovirus" LTR, p21-waf et Cycline G.

La présente invention a permis de mettre en évidence l'existence de 10 gènes qui sont exprimés différentiellement dans les cellules exprimant le p53 sous sa forme suppresseur actif ou bien dans des cellules tumorales exprimant le gène p53 non actif.

La figure 1 montre la quantification des signaux d'hybridation correspondant à l'expression différentielle de 8 de ces gènes qui sont activés à 32"C, c'est-à-dire dans lesquels la fonction de p53 sauvage est activée et conduit donc à l'apoptose des cellules, ces gènes qui sont activés seront dénommés ci-après TSAP (pour Tumor Suppressor Activated
Pathway), par contre on constate que dans deux expériences 2 gènes exprimés à 37"C sont en partie inhibés à 32"C, ce qui impliquerait qu'ils sont inhibés durant la mort cellulaire programmée, ces gènes ont été dénommés
TSIP (pour Tumor Suppressor Inhibited Pathway).

L'analyse des homologies des différentes séquences activées de
TSAP1 à TSAP3 a montré qu'il s'agissait là de gènes déjà connus. Par contre, les autres ADNc TSAP4 à TSAP8 ne montrent aucune homologie significative avec des gènes connus.

Pour les deux ADNc TSIP1 et TSIP2 qui sont inhibés dans leur expression pendant l'apoptose, ils ne montrent aucune homologie avec des gènes connus.

L'hypothèse que l'on peut faire sur ces gènes inhibés dans leur expression par le p53 sauvage est qu'ils peuvent coder pour des séquences oncogéniques qui seraient régulées en aval du processus de suppression tumorale ou encore qu'il s'agit de protéines de structure ou du cytosquelette pour lesquelles la régulation en aval de l'expression est concomitante de la mort cellulaire par apoptose.

TSAP1 est homologue à la phospholipase C béta 4 de rat. La séquence de TSAP1 présente 100% d'identité avec la PLC entre les nucléotides 3967 et 3985 ; 82% entre les nucléotides 3986 et 4116 et 85% entre les nucléotides 4070 et 4220. La PLC est connue pour être impliquée dans la voie de signalisation des récepteurs de la tyrosine-kinase et pour catalyser l'hydrolyse du phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate en diacylglycérol et inositol-l,4,5-triphosphate. Toutefois, la présente étude suggère que la PLC est une cible en aval dans l'apoptose à médiation p53.

TSAP2 montre des séquences conservées (92% d'identité entre les nucléotides 259 et 299 ; 100 d'identité entre les nucléotides 418 et 458 et 92% d'identité entre les nucléotides 645 et 685) avec la protéine digitée au zinc (ZFM 1) qui est localisée dans le locus Multiple Endocrine Neoplasia (MEN 1). MEN 1 est un désordre dominant autosomal associé avec le développement de tumeurs affectant le lobe antérieur des glandes pituitaires et parathyroïdes et les cellules des ilots pancréatiques. Il est particulièrement inéressant d'avoir mis en évidence qu'à la fois ZFM et une isoenzyme de PLC sont colocalisés dans la même région chromosomique 11ql3 contenant le gène de susceptibilité à MEN 1. Chez la souris, les régions homologues sont localisées sur le chromosome 19B.Le fait de trouver que
TSAP 1 et TSAP 2 sont activés en réponse à p53 peut suggérer que ces gènes appartiennent à une voie de suppression des tumeurs plus globale et que p53 peut coopérer avec MEN 1.

TSAP 3 est identique à Siah lb. Ce gène est l'homologue chez les vertébrés du gène Drosophila seven in absentia (sina). Le clone décrit présente 94% d'identité avec l'homologue murin ( nucléotides 1496 à 1634).

Par analyse Northern blot en utilisant une sonde TSAP 3, on a pu détecter une expression différentielle d'un messager de 1,9 kb de ce gène (figure 2A). Ceci est confirmé en utilisant une seconde sonde correspondant à la même région de la séquence siah lb décrite (figure 2B). La figure 2C montre la distribution tissulaire de ce gène en utilisant une sonde TSAP 3 qui détecte à la fois l'ARNm de 1,9 et de 2,4 kb correspondant aux résultats mentionnés précédemment lorsqu'une sonde siah est utilisée. L'hybridation in situ montre que l'ARNm de TSAP 3 est induit rapidement 1 heure après l'induction de l'apoptose (figure 3D). Son expression augmente après 2 et 4 heures (figures 3E et 3F). Dans les cellules qui sont entrées en mitose aucun signal n'est détecté.

Carthew et Rubin ont montré que seven in absentia est nécessaire pour le développement de l'oeil de la drosophile. D'autre part, des mutants de ce gène dans la drosophile montrent un rôle beaucoup plus général dans le développement. L'homologue murin est subdivisé en deux groupes siah 1 et siah 2 et ces protéines montrent un degré de conservation tout à fait inhabituel par rapport à drosophila seven in absentia.

Nos résultats ont montré que TSAP 3 / siah lb est activé dans le programme de mort cellulaire dans les cellules Nil induites par le gène suppresseur de tumeur p53. Comme ce gène code pour une protéine digitée au zinc nucléaire, il pourrait être un facteur de transcription régulateur qui est en aval du signal de p53. Les résultats montrent également un lien direct entre les gènes concernant le développement chez la drosophile et une voie majeure de suppression tumorale.

TABLEAU
CARACTERISTIQUES DES CLONES

<tb> Clone <SEP> à <SEP> expression <SEP> Amorces <SEP> Taille <SEP> de <SEP> l'ARNm <SEP> Homologie
<tb> <SEP> différentielle <SEP> 3' <SEP> et <SEP> 5' <SEP> * <SEP> en <SEP> kb
<tb> <SEP> TSAP1 <SEP> T11GC-16 <SEP> 2,0 <SEP> et <SEP> 4,5 <SEP> PLC <SEP> &num;;
<tb> <SEP> TSAP2 <SEP> T11GC-5 <SEP> 5,9 <SEP> MEN1 <SEP>
<tb> <SEP> TSAP3 <SEP> T11CG-4 <SEP> 1,9 <SEP> siah <SEP> 1b <SEP> #
<tb> <SEP> TSAP4 <SEP> T11GC-6 <SEP> 5,0 <SEP> Non
<tb> <SEP> TSAP5 <SEP> T1 <SEP> 1CG-5 <SEP> i <SEP> 1,2 <SEP> Non
<tb> <SEP> TSAP6 <SEP> T11AG-1 <SEP> 2,8 <SEP> Non
<tb> <SEP> TSAP7 <SEP> T11GC-16 <SEP> > <SEP> 8,0 <SEP> Non
<tb> <SEP> TSAP8 <SEP> T11GC-6 <SEP> > <SEP> 10,0 <SEP> Non
<tb> <SEP> TSIP1 <SEP> T11CG-8 <SEP> 3,0 <SEP> Non
<tb> <SEP> TSIP2 <SEP> T11AA-5 <SEP> 3,1 <SEP> Non
<tb> * Les chiffres et les séquences des amorces en 5' correspondent à ceux
rapportés par Bauer et al. (4) &num; Rat phospholipase C-béta 4 ARNm (RATPHOSCB) ≈ARNm humains (HUMMEN1C; HUMZFM1C; HUMZFM1A;HUMMEN1A) # siah-1B ARNm (MMSIAH1B)
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N : 1 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: TSAP 1
(B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 1:
TSAP1
10.TGATCACGTAC
ratPLC CTTCTTCTACTTAACAATTTGACTATTGAATTTCTTTGGCCAACCAAAAGTAGCTATGTAC
3970 3980 3990 4000 4010 4020
20 30 40 50 60 70
TSAP1 ACACACACACACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAT
ra PLC ACACACACACACACACACACACACACA------------CACACACACACACACGAAAT
4030 4040 4050 4060
80 90 100 110 120 130
TSAP1 CCCCTATTCCTGACAGGCAGAGTTGAATCATGATATATGGCTTAAACATGTTTGCTATGA
rat PLC CCCCTATTCCTGACAGGCAGAGTTGAACCATAATCCACAACTTAAACATGTTGGCTAGGG
4070 4080 4090 4100 4110 4120
140 150 160 170 180 190
TSAP 1 GACAGCATCACAAGCCAGTGGGCTTGGTGATAACAACTCTGCTTTGTGGTGCATTAGGAC
ratPLC GACAGCATCACAAGCCAGTGGGCTTGGTGATAACAACTCTGCTTTGTGGTGCATTAGGAC
4130 4140 4150 4160 4170 4180
200 210 220 230
TSAP 1 ATTTTTGAGCTGCTGCTGCTGCAAA-AAAAATAAGAGCCG ratPLC ATGTTCGAGCTGCTGCTG--GAAAAGGAAAATTAGTGCATTAGTACTTTAATGGCAAGCG
4190 4200 4210 4220 4230 42:0
INFORMATIONS POUR A SEQ ID N :2 (i)' CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: TSAP 2
(B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 2: TSAP 2
10 20 30 40 50 60
TSAP2 GCTTGGAACCAATCTACAACAGCGAGGGGAAGCGGCTTAACACTCGAGAGTTCCGTACCC
humzfmlc.seq CCCCTGAGCCCATCTACAATAGCGAGGGGAAGCGGCTTAACACCCGAGACTTCCCCACCC
250 260 270 280 290 300
70 80 90 100 110 120
TSAP2 GCAAAAAAAAAAATCTCTTGTGTTTTCCTAAGCTTTTCCCTGTGCTAGGGAAAGATCAGT
humzfmlc.seq GCAAAAAGCTGGAAGAGGGCGGCACAACCTCATCACAGAGATGGTTGCACTCAATCCGG
310 320 330 340 350 360
130 140
TSAP2 AAGTCCGTGGTTATAGATTGGTT
humzfmlc.seq ATTTCAAGCCACCTGCAGATTACAAACCTCCAGCAACACGTGTGAGTGAT
370 380 390 400 410
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N :3 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE:TSAP 3
(B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 3:
TSAP3
10
TSAP3 TTTTTTTTTTTG
mmsiahlb.seq TTGTAAAATATTTCTGAACTTTGTATTTGTTGTAGATTGATTGTATTGTTGACAATTTTT
1450 1460 1470 1480 1490 1500
20 30 40 50 60 70
TSAP 3 CGGGGTGGGGGTGTGCCTCCACACATGCGTGCACGTCTGTGCTTGGTTTTCCTTTAACAA
mmsiahlb.seq CGGGGTGGGGGTGTGCCTGCACACATGCGTGCACGTGTGTGCTTGGTTTTCCTTTAACAA
1510 1520 1530 1540 1550 1560
80 90 100 110 120 130
TSAP 3 GcCATCTAcCTCTCATAGCcCACTCTTTTCCCCTTCTGACTCAACACATACTCCTCCTCT
mmsiahlb.seq GCCATCTACGTGTCATAGCCCACTGTTTTCCCCTTGTGAGTCAACACATAGTGCTGCTGT
1570 1580 1590 1600 1610 1620
140
TSAP 3 GGTTTGGGTTTGGT
mmsiahlb.seq GGTTTTGGTTTGGTTTGCTTTTGGTTTTTGATGTGTGTGTATTTGATAATTTTTATTCTA
1630 1640 1650 1660 1670 1680
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N : 4 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: TSAP 4
(B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 4:
TSAP4
AACTCCGTCG TGGGTGTGGG GACCTAATTC CTTATATTTT TACAACAAGC ACTGTACAAA 60
CTGTGCCTTT CCCTAATGCA GTTATACTAT TTCCATTAAG ATGGGTAACC TTAGTTAAGG 120
CTTTATATTC ACTGCCATGG GTAGGAATGC TCACGGTGAA TGGGCCAACT TGTCATGGAA 180
GAAGCCCTCA TTTTCAGTTG GC 202
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N : 5 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: TSAP 5
(B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID N 5: TSAPS
TCTTTATTTG AGCTTTCCAT GATTGCACAG ATCTAAGTAA ACAAGGATAT TCAGGTTCGG 60 GASTGGST 68
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N :6 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc (ix) CARACTERISRIQUE:
(A) NOM/CLE: TSAP 6
(B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID N 6:
TSAP6
TTACAACGAG GTGATGATAT ATGCGTGGGT GGCTGAGATC CTAATTCCTG GGGTGCAGGT 60
GTAAACTGAC ATACTGAGAA TGACACCCCA TACATGTGAT ATGTACTCAC ATATATTTCA 120
CATATAATAA GATTTGCTAT TATNCTTACT TAOCT 155
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N : 7 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: sinple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: TSAP 7
(B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID N 7:
TSAP7
GCCCATCCAG TCATTCTTTA TTTCAGTGTG TGAAAGCCTC CTACGCATTT TCCCCCAAAT 60
TAATTTTTAA TCCATTTTCA AACCAGCCTT TACTGTGGCC TTTTCTGCTA TTTTTGATAT 120
ATGTTAGCAC GTGTGCATAG 140
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N": 8 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: TSAP 8
(B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID N 8:
TSAP8
CACGTNAAAG TACCACATCC NCCCCCATTG GTAGATATTG ANAGAGTATA TANATAGGNC 60
GAAGCACAAT CTCTTCCCTT CCTNTGTACA CCTCANACCC AGTGACTTCC NACCNAAGCN 120
CNTGANTGTN TTTGTNGATA TGAGTGTCTG NGTGTGTGNA TNTGCGTCTC ACATGTATGG 180
GACGACCNAC CCCACCCCCA GCGGCCTTCA NGCACAATNG AGGACGCCTA TNGTGGATAC 240
GNGCATCGGT AAANAGC 257
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N": 9 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: TSIP 1
(B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID N C 9:
TSIP1
GGAGGGGGTC TAGCTTTCTC TTTAGTTATC ACTCTGAGGT GCTCAGGTCA CAGAGAAGGC 60
ACTTAATTGG GAAGGTCATC TGATTCCGGC CATCTTCTCT CCCTTTACCA A 111
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N :10 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: TSIP 2
(B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 10:
TSIP2
TGGAACCAAT CAGTGCTGCT AACGGGCTUG CATAGCTCCT TCGATGGCAA ATAGGATGTG 60
TCCCCAAAGA ATTAAAGCGA TGAGTGCCTC CTC 93
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES (1) Liang P. & Pardee A.B. (1992) Science, 257, 967-971 (2) Don RH., Cox P.T., Wainwright B.J., Baker K. & Mattick J.S. (1991) Nucl.

Acids Res., 19, 4008 (3) Yonish-Rouach E, Resnitzky D., Lotem J., Sachs L, Kimchi A. & Oren M.

(1991) Nature 352, 345-347 (4) Bauer D., Muller H., Reich J., Riedel H., Ahrenkiel V., Warthoe P. & BR<
Strauss M. (1993) Nucl. Acids Res. 21, 4272-4280 (5) Sambrook J., Fritsch EF. & Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a
laboratory manual (6) Okamoto K. & Beach D. (1994) EMBO. J., 13, 4816-4822 (7) Angerer L & Angerer R.C. (1991) Methods in cell biology: functional
organization of the nucleus, 35, 37-71 (8) Linares-Cruz G., Rigaut J.P., Vassy J., De Oliveira T.C., De Cremoux P.,
Olofsson B. & Calvo F. (1994) J. Microsc., 173, 27-38

Claims (25)

1. (b) ou (c) ou pour une protéine équivalente.

   ou (d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon (a),

   un gène équivalent qui comporte: (b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a), (c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec (a) ou (b),

   1) Séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant: (a) une séquence selon l'une des IND.SEQ1 à 10 ou

   REVENDICATIONS
2. 2) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est induite lors de l'apoptose cellulaire.
3. 3) Séquence selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'apoptose cellulaire est induite par p53.
4. 4) Séquence selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi TSAP 1 à TSAP 8 ou un gène équivalent.
5. 5) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est inhibée lors de l'apoptose cellulaire.
6. 6) Séquence selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'apoptose cellulaire est induite par p53.
7. 7) Séquence selon l'une des revendications 1 et 5 et 6, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi TSIP 1 et TSIP 2 ou un gène équivalent.
8. 8) Vecteur d'expression cellulaire d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 7.
9. 9) Vecteur d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
10. 10) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus herpès ou d'un poxvirus.
11. 11) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur à acide nucléique nu.
12. 12) Vecteur selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence assurant le ciblage et/ou l'expression spécifique des tissus ou organes.
13. 13) Cellule transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 8 à 12.
14. 14) Protéine pouvant être obtenue par culture de cellule transformée selon la revendication 13 et codée par la séquence selon l'une des revendications 1 à 7.
15. 15) A titre de médicament, un vecteur selon l'une des revendications 8 à 12 ou une protéine selon la revendication 14.
16. 16) A titre de médicament, un composé assurant l'expression cellulaire d'au moins une des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 4 ou de leurs produits.
17. 17) A titre de médicament selon la revendication 16, un vecteur nucléotidique assurant l'expression cellulaire de ladite séquence.
18. 18) A titre de médicament, un composé assurant l'inhibition de l'expression cellulaire d'au moins un gène cellulaire selon l'une des revendications 1, 5 à 7 ou de leurs produits.
19. 19) A titre de médicament selon la revendication 18, un nucléotide activé assurant le blocage de la séquence nucléotidique.
20. 20) A titre de médicament selon la revendication 18, un anticorps monoclonal dressé contre la ou les protéines codées par la séquence nucléotidique.
21. 21) A titre de médicament destiné au traitement du cancer, un médicament selon l'une des revendications 15 à 20.
22. 22) A titre d'agent de diagnostic notamment pour la détermination de la prédisposition et le suivi des cancers, tout ou partie des séquences selon l'une des revendications 1 à 7 à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification.
23. 23) A titre d'agent de diagnostic notamment pour la détermination de la prédisposition et le suivi des cancers un antigène correspondant à tout ou partie des protéines codées par la séquence selon l'une des revendications 1 à 7 ou les anticorps correspondants.
24. 24) Modèle pour la mise en évidence de médicament anticancéreux, des cellules selon la revendication 13.
25. 25) A titre de perfectionnement de la méthode de Liang et

    Pardee le fait d'utiliser une diminution en palier lors de l'amplification PCR