JP2004519216A - 進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ１３）およびその使用 - Google Patents
進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ１３）およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、進行によって抑制される遺伝子（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ） １３ （ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクター、単離されたＰＳＧｅｎ １３タンパク質、ならびに癌細胞および／または新しい血管の増殖を阻止するために、ひいては癌患者を治療するために、そのような分子を用いる方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的には、ラットおよびヒトＰＳＧｅｎ １３をコードする完全なｃＤＮＡの特徴づけに基づき、また、ＰＳＧｅｎ １３の発現レベルの上昇はトランスフォームされた表現型を抑制し、かつ癌進行および血管新生に関連するプロモーター要素の活性を抑制することができるという発見に基づいている。各種の実施形態において、本発明は、癌細胞の増殖を抑制する方法であって、癌細胞を、該細胞の増殖を抑制するように十分量のＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質またはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター化合物と接触させることを含む該方法を提供する。本発明はまた被験者の癌を治療する方法であって、被験者の細胞を、該細胞にＰＳＧｅｎ １３タンパク質を発現させるように、十分量のＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸と接触させ、それによって被験者の癌を治療することを含む該方法を提供する。
Description
【０００１】
本明細書に開示する発明は、米国保健福祉省からの国立衛生研究所補助金第ＣＡ３５６７５号のもとで政府の援助を得てなされた。したがって、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本出願は、米国特許出願第０９／６４８，３１０号（この内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）の一部継続出願である。
【０００３】
１．序論
本発明は、細胞が悪性表現型に向かって進行する時に該細胞中により低レベルで発現され、そのため進行によって抑制される遺伝子１３ （Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ １３： ＰＳＧｅｎ １３）と呼ばれる遺伝子に関する。本発明は、少なくとも部分的には、この新規遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質の発見、ならびに悪性腫瘍細胞へのＰＳＧｅｎ １３の導入は癌細胞増殖を抑制し、かつ悪性腫瘍および血管形成に関連する遺伝子の発現制御要素を抑制する、という発見に基づいている。
【０００４】
２．発明の背景
遺伝子発現の変化は、細胞周期の調節、分化および発生を含む正常な細胞生理学の重要な決定因子であり、そしてそれらの変化は発生異常、分化の異常なプログラム、および癌を含む異常な細胞生理学に直接寄与する（ＷａｔｓｏｎおよびＭａｒｇｕｌｉｅｓ， １９９３， Ｄｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５：７７−８６； Ｗｉｎｋｌｅｓ， １９９８， Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５８： ４１−７８； Ｆｉｓｈｅｒ （編）， １９９０， Ｍｏｄｅｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， Ｖｏｌ． １； Ｆｉｓｈｅｒ （編）， １９９０， Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， Ｖｏｌ． ２）。これらの前後関係において、示差的に発現された遺伝子の同定、クローン化および特徴づけは、増殖、発生、老化、分化および癌、等のプロセスの分子的決定因子に関する適切で重要な洞察を提供するに相違ない。
【０００５】
示差的に発現された遺伝子を同定し、そしてクローン化するためには、いくつかの方法を用いることができる。これらの方法には、サブトラクティブハイブリダイゼーション法（ＪｉａｎｇおよびＦｉｓｈｅｒ， １９９３， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｄｉｆｆｅｒ． １： ２８５−２９９； ＳｕおよびＦｉｓｈｅｒ， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ９１２５−９１３０； Ｓａｇｅｒｓｔｒｏｍら， １９９７， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６： ７５１−７８３； Ｊｉａｎｇら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０： １８５５−１８６４； Ｊｉａｎｇら， １９９５， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１： ２４７７−２４８６； Ｊｉａｎｇら， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３： ９１６０−９１６５）、ディファレンシャルＲＮＡディスプレイ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）（ ＷａｔｓｏｎおよびＭａｒｇｕｌｉｅｓ， １９９３， Ｄｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５：７７−８６； Ｗｉｎｋｌｅｓ， １９９８， Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５８： ４１−７８； ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６７−９７１； Ｓｈｅｎら， １９９５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２； ６７７８−６７８２）、恣意的にプライミングしたＰＣＲ（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）によるＲＮＡフィンガープリンティング（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら， １９９５， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ， １１： ２４２−２４６； Ｒａｌｐｈら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： １０７１０−１０７１４）、再現的差異分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＨｕｂａｎｄおよびＳｃｈａｔｚ， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ５６４０−５６４８）、遺伝子発現の連続分析（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０： ４８４−４８７； Ｚｈａｎｇら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： １２６８−１２７２）、電子工学的サブトラクション法（Ｗａｎら， １９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １４： １６８５−１６９１； Ａｄａｍｓら， １９９３， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ４： ２５６−２６７）およびコンビナトリアル遺伝子マトリックス分析（Ｓｃｈｅｎａら， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０： ４６７−４７０）が含まれる。
【０００６】
ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ （１９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６７−９７１）によって開発されたＤＤＲＴ−ＰＣＲアプローチは、示差的に発現された遺伝子を分析し、クローン化するうえで広い人気を獲得した。ＤＤＲＴ−ＰＣＲは、少量のＲＮＡ（約５μｇ）を用いて膨大な数（重複が起こらなければ＞２０，０００）のｍＲＮＡ種を分析することができる強力な方法である（同文献）。ＤＤＲＴ−ＰＣＲは、組織生検等のようなＲＮＡ供給源が限定されている場合は、しばしば優れた方法である。ＤＤＲＴ−ＰＣＲの直接的利点は、示差的に発現された遺伝子を、アップレギュレーションされたものもダウンレギュレーションされたものも両方とも、同一の反応で同定し、単離する能力である。さらに、ＤＤＲＴ−ＰＣＲ技法は、同一ゲル中で多数のサンプルのディスプレイを可能とする。これは、ＲＮＡ種中で特異的な診断上の変化を明確にするうえで、および遺伝子発現の変化を時間的に分析するために有用である。
【０００７】
しかし、ＤＤＲＴ−ＰＣＲ技法に問題がないわけではない（Ｄｅｂｏｕｃｋ， １９９５， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６： ５９７−５９９）。標準的ＤＤＲＴ−ＰＣＲを用いる際に遭遇する困難には、偽陽性および重複した遺伝子同定の高い発生率、貧弱な再現性、バイアスがかかった遺伝子ディスプレイ、およびクローン化されたｃＤＮＡに関する機能情報の欠如が含まれる。さらに、貧弱な分離は、示差的に発現された量の少ない遺伝子を、高発現された遺伝子が発生する強いシグナルの下に隠してしまう場合がある。偽陽性および重複の発生は非常に問題となりうる。そして、適切な示差的発現および単離されたｃＤＮＡの独自性を確認するために資源の過度の消費をもたらす。ｃＤＮＡは、ゲルから純粋な形で単離され（多重配列によるバンドの汚染はクローン同定を複雑にする）、再度増幅され、適切なクローニングベクター中に挿入され、真正な示差的発現について分析され、そして最後に配列決定される必要がある。標準的ＤＤＲＴ−ＰＣＲアプローチの有するこれらの制限は、示差的に発現された遺伝子をより効率的かつ選択的に同定するためにこの方法を改善する必要性をきわだたせる。
【０００８】
サブトラクティブハイブリダイゼーション（テスターとドライバーの間でハイブリダイゼーションを行い、次に共通の遺伝子産物を選択的に除去する）は、テスターｃＤＮＡ集団中の独自の遺伝子産物を富化し、そして豊富な共通のｃＤＮＡを減少させる（Ｓａｇｅｒｓｔｒｏｍら， １９９７， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６： ７５１−７８３）。サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーを分析して、ランダムにコロニーをピッキングすることによって、またはディファレンシャルスクリーニングによって、示差的に発現された遺伝子を同定し、クローン化することが可能である（Ｒａｎｇｎｅｋａｒら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ６２４０−６２４８； Ｗｏｎｇら， １９９７， Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９： ７−１６； ＭａｓｅｒおよびＣａｌｖｅｔ， １９９５， Ｓｅｍｉｎ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １５： ２９−４２）。サブトラクティブハイブリダイゼーションをうまく用いて多数の示差的に発現された遺伝子がクローン化されてきたが（ＪｉａｎｇおよびＦｉｓｈｅｒ， １９９３， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｄｉｆｆｅｒ． １： ２８５−２９９； Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ９１２５−９１３０； Ｊｉａｎｇら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０： １８５５−１８６４； Ｊｉａｎｇら， １９９５， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１： ２４７７−２４８６）、このアプローチは多大な労力を要し、そして変化した発現を示す遺伝子の全ての単離をもたらすものではない（Ｓａｇｅｒｓｔｒｏｍら， １９９７， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６： ７５１−７８３； Ｗａｎら， １９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４： １６８５−１６９１）。
【０００９】
原則として、サブトラクトしたＲＮＡまたはｃＤＮＡサンプルを用いて実施したＤＤＲＴ−ＰＣＲは、アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた遺伝子産物をクローン化するための強力な戦略を提供するに相違ない。このアプローチは、両方の技法の有利な点を組合わせるもので、独自配列の富化および共通配列の減少または消去をもたらすに相違ない。また、この方法はディスプレイゲル上のバンドの複雑性を一貫して減少させ、それによってｃＤＮＡのより明確な分離を可能とし、その結果、偽陽性反応をより少なくするに相違ない。さらに、より少ない数のプライマーセットを用いて逆転写およびＰＣＲ反応を行って、示差的に発現される遺伝子の全範囲を分析することが可能であるに相違ない。遺伝子同定および単離にとって特に重要なのは、強い共通遺伝子産物によって隠されている稀な遺伝子産物が、ＤＤＲＴ−ＰＣＲと組合わせてサブトラクティブハイブリダイゼーションを用いることによってディスプレイされるということである。さらに、サブトラクティブライブラリーを用いたＤＤＲＴ−ＰＣＲアプローチは、示差的に発現された遺伝子のサブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーを効率的にスクリーニングするためにも貴重であることを実証できるであろう。しかし、サブトラクティブハイブリダイゼーションとＤＤＲＴ−ＰＣＲの組合わせが上記の理由によって魅力的に思われようと、このアプローチを使おうとした以前の試みは、生成されるシグナルの複雑さを一貫して減少させることにおいて，標準的ＤＤＲＴ−ＰＣＲ法と比較して、最低限の成功をもたらしたにすぎないことを実証した（Ｈａｋｖｏｏｒｔら， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ８７８−８７９）。
【００１０】
Ｋａｎｇら（１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １３７８８−１３７９３）は、ＤＤＲＴ−ＰＣＲの複雑さを効率的に、かつ一貫して減少させ、そして予想された示差的発現を示す遺伝子の同定およびクローン化をもたらす、相互サブトラクションディファレンシャルＲＮＡディスプレイ（ＲＳＤＤ）アプローチを用いた。ＲＳＤＤのために用いられたモデルは、アデノウイルスによって形質転換されたラット胚細胞系Ｅ１１であった。この細胞は、無胸腺症ヌードマウスに注入し、細胞培養物中で再確立すると（Ｅ１１−ＮＭＴ）、攻撃的な発癌進行表現型を獲得する（Ｓｕ ＆ Ｆｉｓｈｅｒ， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ９１２５−９１３０； Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（編）Ａｄｏｌｐｈ， Ｋ．Ｗ． （Ａｃａｄｅｍｉｃ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ）， Ｖｏｌ． １， ｐｐ． ６８−１０２に掲載のＲｅｄｄｙら， １９９３；Ｂａｂｉｓｓら， １９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８： １０９９−１１０１）。ヌードマウスへのＥ１１細胞の注入は、腫瘍潜伏時間約３５−４０日で１００％の動物に腫瘍をもたらし、他方、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞は腫瘍潜伏時間約１５−２０日で１００％のヌードマウス中に腫瘍を形成する（同文献）。さらに、Ｅ１１細胞は寒天中で約３％の効率でコロニーを形成し、他方、Ｅ１１−ＮＭＴは＞３０％の寒天クローニング効率を示す（同文献）。増大した腫瘍形成性および増強された足場非依存的表現型が、Ｅ１１／Ｅ１１−ＮＭＴモデル系における腫瘍進行の重要なインジケーターである（同文献）。
【００１１】
前出のＫａｎｇらは、ＲＳＤＤは進行したラット腫瘍細胞中で発現の上昇を示す遺伝子［すなわち、進行によって促進される遺伝子（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｅｌｅｖａｔｅｄ ｇｅｎｅ： ＰＥＧｅｎ遺伝子）］および進行した腫瘍細胞中で発現の抑制を示す遺伝子［すなわち、進行によって抑制される遺伝子（ＰＳＧｅｎ遺伝子）］の同定をもたらしたと報告している。Ｋａｎｇらによって同定されたラット遺伝子の１つは、（ラット）ＰＳＧｅｎ １３（発明者Ｆｉｓｈｅｒらによる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０４３２３も参照されたい）であるが、全長ｃＤＮＡは単離されておらず、したがってその配列も、それによってコードされるタンパク質の配列も報告されていなかった。本発明は、完全なラットおよびヒトＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡのクローニングおよび特徴づけに関するものであり、それらの核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を提供し、そしてさらにＰＳＧｅｎ １３のレベルの上昇が悪性表現型に対して有する抑制効果を実証するものである。
【００１２】
３．発明の概要
本発明は、進行によって抑制される遺伝子１３ （ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクター、単離されたＰＳＧｅｎ１３タンパク質、ならびに癌細胞および／または新血管形成を阻止するため、そして結果的に癌患者を治療するためにこれらの分子を使用する方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的には、ラットおよびヒトＰＳＧｅｎ １３をコードする完全なｃＤＮＡのクローニングおよび特徴づけ、ならびにＰＳＧｅｎ １３の発現レベルの上昇はトランスフォームされた表現型を抑制することができ、かつ癌進行および血管新生に関連するプロモーター要素を抑制することができる、という発見に基づいている。本発明はさらに、ヒトＰＳＧｅｎ １３の染色体上の位置は、その観察された腫瘍抑制活性と一致して、種々の癌を患う患者において欠失を含むことが観察された領域であるという発見に基づいている。
【００１３】
種々の実施形態において、本発明は癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。この方法は、該癌細胞を、該癌細胞の増殖を阻止するように、十分な量のＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質またはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター化合物と接触させることを含む。本発明はまた、被験者における癌を治療する方法を提供する。この方法は、被験者の細胞を、該細胞にＰＳＧｅｎ １３タンパク質を発現させるように、十分な量のＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸と接触させ、それによって該被験者の癌を治療することを含む。
【００１４】
３．１． 定義
ＤＮＡ「コード配列」または特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれた時に、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列をいう。コード配列の境界は、５’−（アミノ）末端の開始コドンおよび３’−（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、限定するものではないが、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）供給源由来のゲノムＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ、および合成核酸配列をも含むことができる。転写終止配列は、通常コード配列の３’末端側に位置する。
【００１５】
ＤＮＡ「制御配列」という用語は、宿主中のコード配列の転写および翻訳を集合的に提供するプロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、エンハンサー等、ならびに５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）の総称である。
【００１６】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合してコード配列をｍＲＮＡに転写する時、細胞中でコード配列の「転写を指令する」。次に、ｍＲＮＡはコード配列によってコードされたポリペプチドに翻訳される。
【００１７】
本明細書に用いる「エンハンサー要素」という用語は、関心のある治療遺伝子の転写速度を増大させるが、プロモーター活性をもたないヌクレオチド配列をいう。
【００１８】
本明細書に用いる「遺伝子」という用語は、産物を直接的または間接的にコードする核酸をいう。例えば、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードするｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（ＰＳＧｅｎ １３をコードするｍＲＮＡがそこから転写されうる）が遺伝子と見なされると同じように、「ＰＳＧｅｎ １３遺伝子」と見なされるであろう。
【００１９】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域とは、天然においては他方の分子と会合して見出されることはない別のＤＮＡ分子の内部の、またはそれに連結された、識別可能なＤＮＡのセグメントである。異種コード配列の１例は、コード配列自体（例：ＰＳＧｅｎ １３突然変異体をコードする配列またはＰＳＧｅｎ １３をコードする核酸の断片）が天然に見いだされない構築物である（例：天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、異種構造遺伝子およびＰＳＧｅｎ １３をコードする遺伝子またはそのような遺伝子の一部を含み、組織特異的プロモーターに連結されているキメラ配列は、同一の遺伝子に由来しようと異なる遺伝子に由来しようと、異種と考えられるであろう。なぜなら、そのようなキメラ構築物は通常天然には見いだされないからである。対立遺伝子変異または天然に存在する突然変異現象は、本明細書に用いる意味でのＤＮＡの異種領域を生じさせない。
【００２０】
本明細書に用いる「核酸分子」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み、そして別途特定されていない場合は、２本鎖および１本鎖核酸の両方を含む。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド等のハイブリッドもまた含まれる。核酸配列への言及は、改変が該核酸によるリガンド（タンパク質等）の結合またはワトソン−クリック型塩基対合を重大な程度に妨げない限り（そのような妨げが意図されたものであるか、または望ましいものである場合を除いて）、改変された塩基も含みうる。
【００２１】
「機能しうる形で連結された」という表現は、上述の構成要素がそれらの通常の機能を達成するように配列されたヌクレオチド配列要素の配置をいう。このようにして、コード配列に機能しうる形で連結された制御配列は、コード配列の発現を果たすことができる。制御配列は、コード配列の発現を導くように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される配列がプロモーター配列とコード配列の間に介在することが可能であり、そしてこのような場合も該プロモーター配列はコード領域に「機能しうる形で連結されている」と考えることができる。
【００２２】
２つのＤＮＡまたはポリペプチド配列は、分子のある規定された長さにわたってヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％（好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％）が一致する場合、「実質的に相同」である。本明細書に用いる「実質的に相同」という用語はまた、特定されたＤＮＡまたはポリペプチド配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す配列をもいう。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系について規定されるストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なストリンジェント条件を規定することは、当技術分野における技術の範囲内である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００２３】
本明細書に用いる「治療遺伝子」という用語は、癌細胞に対して治療（例：増殖を抑制する、分化させる、および／またはアポトーシスを誘導する）効果を発揮することができる、または細胞内である機能の発現に対して調節効果を有する機能性タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを意味する。
【００２４】
細胞は、細胞膜内または、細菌の場合は、細胞壁内に外因性ＤＮＡが導入され場合、外因性ＤＮＡによって「形質転換」または「トランスフォーム」されている。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを作っている染色体ＤＮＡに組み込まれていても（すなわち、共有結合していても）、組み込まれていなくてもよい。例えば、原核生物および酵母においては、外因性ＤＮＡはプラスミド等のエピソーム性要素上に保持されうる。真核細胞においては、安定に形質転換された細胞とは、一般に、染色体複製を介して娘細胞によって外因性ＤＮＡが受け継がれるように外因性ＤＮＡが染色体内に組み込まれている細胞、または安定に保持された染色体外プラスミドを含む細胞である。この安定性は、細胞系または該外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなるクローンを樹立する真核細胞の能力によって示される。
【００２５】
４．図面の説明
（図面の簡単な説明については下記参照）
５．発明の開示
本発明の限定を目的とするものではないが、開示を明確にするために、発明の詳細な説明を以下の分節に分ける：
（ｉ） ＰＳＧｅｎ １３核酸；
（ｉｉ） ＰＳＧｅｎ １３タンパク質；
（ｉｉｉ） ＰＳＧｅｎ １３タンパク質に対する抗体；および
（ｉｖ） ＰＳＧｅｎ １３の使用。
【００２６】
５．１ ＰＳＧｅｎ １３ 核酸
本発明は、ＰＳＧｅｎ遺伝子および関連分子を含めて、ＰＳＧｅｎ １３核酸を提供する。「ＰＳＧｅｎ １３」という用語は、種に関わりなく、ＰＳＧｅｎ １３分子をいう。
【００２７】
特定の非限定的実施形態において、本発明は、図１および配列番号１または配列番号５に示す配列を有し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ； １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９に所在する機関）に寄託され、受託番号 ＰＴＡ−２４１４を付与されたラットＰＳＧｅｎ １３（ｒＰＳＧｅｎ １３）遺伝子、およびそれと実質的に相同な分子を提供する。この寄託物は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドベクターのＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ Ｉクローニング部位に挿入されたｒＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡインサートである。このインサートは、長さが約０．８ ｋｂである。上記プラスミドのセンス鎖プロモーターは、Ｔ７である。このプラスミドは、アンピシリンおよびネオマイシン耐性遺伝子を担持している。上記インサートの起源は、ＥＳＴクローンＡＴＣＣ ＃２００５７７７（下記参照）である。該ｃＤＮＡを単離するのに用いたラット組織は、副腎組織であった。
【００２８】
他の特定の非限定的実施形態において、本発明は、図２および配列番号３または配列番号６に示す配列を有し、そしてＡＴＣＣに寄託され、受託番号 ＰＴＡ−２４１３を付与されたヒトＰＳＧｅｎ １３（ＨｕＰＳＧｅｎ １３）遺伝子、およびそれと実質的に相同な分子を提供する。この寄託物は、プラスミドベクターｐＴ７Ｔ３−Ｐａｃ内に挿入されたインサートである。このインサートはＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔ Ｉクローニング部位内に挿入されている。このインサートは、長さが約０．８３ ｋｂである。上記プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を担持している。上記インサートの起源は、ＥＳＴクローンＡＴＣＣ ＃２５２５２６２（下記参照）である。該ＤＮＡを単離するのに用いたヒト組織は、ヒト腎組織であった。
【００２９】
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子および／またはＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子とハイブリダイズするであろう核酸を提供する。ストリンジェントな条件下とは、例えば、０．５ Ｍ ＮａＨＰＯ４， ７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）， １ ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中で６５℃でハイブリダイゼーション、および０．１ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で６８℃で洗浄、等である（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ． ２．１０．３）。したがって、本発明は、非ヒト霊長類動物、マウス、またはウシのＰＳＧｅｎ １３遺伝子を含む、他の生物種のＰＳＧｅｎ １３遺伝子、ならびに核酸プローブおよびアンチセンス分子（これらは、例えば、トランスフォームされた表現型を確認するために用いることができるであろう）を包含する。
【００３０】
本発明はまた、図１および２ならびに配列番号２および４に示すｒＰＳＧｅｎ １３およびＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸をも提供する。また、このようなＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【００３１】
図１および２に示す核酸配列は、標準的技法を用いた増幅によってＰＳＧｅｎ １３遺伝子を得るために使用可能なプライマー分子を同定するのに用いることができる。
【００３２】
本発明は、ｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子またはＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子等のＰＳＧｅｎ １３遺伝子を発現可能な形で提供する。「発現可能な形」とは、転写および／または翻訳にとって必要な要素および制御配列を含む形である。例えば、ＰＳＧｅｎ １３遺伝子は、適切なプロモーター要素（これはＰＳＧｅｎ １３プロモーターまたは異種プロモーターであってよい）に機能しうる形で連結されていて、そしてエンハンサー要素、転写開始および終止部位、核局在化配列をコードする核酸、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、ｍＲＮＡ安定化配列、等を含むことができる。
【００３３】
原核生物における発現を除外するわけではないが、好ましい実施形態において、本発明はｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子またはＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子等のＰＳＧｅｎ １３遺伝子を真核細胞中で発現可能な形で提供する。したがって、ＰＳＧｅｎ １３遺伝子は、例えば真核細胞中で活性なプロモーター要素と機能しうる形で連結されているとよい。適切なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、ヒト延長因子１αプロモーター、ヒトユビキチンｃプロモーター、等が含まれる。本発明の特定の実施形態においては、誘導性プロモーターを使用することが望ましい場合がある。誘導性プロモーターの非限定的例としては、マウス乳癌ウイルスプロモーター（デキサメタゾンで誘導可能）；市販のテトラサイクリン応答性またはエクダイソン誘導性プロモーター、等が含まれる。本発明の特定の非限定的実施形態において、プロモーターは、前立腺特異的抗原遺伝子プロモーター（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら， ２００， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ４５： １４９−１５７）、カリクレイン２遺伝子プロモーター（Ｘｉｅら， ２００１， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２： ５４９−５６１）、ヒトα−フェトプロテイン遺伝子プロモーター（Ｉｄｏら， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： ３１０５−３１０９）、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子プロモーター（Ｔａｋａｋｕｗａら， １９９７， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８８： １６６−１７５）、ヒト癌胎児性抗原遺伝子プロモーター（Ｌａｎら， １９９６， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． １１１： １２４１−１２５１）、ガストリン放出ペプチド遺伝子プロモーター（Ｉｎａｓｅら， ２０００， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８５： ７１６−７１９）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子プロモーター（ＰａｎおよびＫｏｅｎｍａｎ， １９９９， Ｍｅｄ． Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ ５３： １３０−１３５）、ヘキソキナーゼＩＩ遺伝子プロモーター（Ｋａｔａｂｉら， １９９９， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １０： １５５−１６４）、Ｌ−プラスチン遺伝子プロモーター（Ｐｅｎｇら， ２００１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１： ４４０５−４４１３）、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター（Ｔａｎａｋａら， ２００１， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２１： ２９１−２９４）、ミドカイン遺伝子プロモーター（Ａｄａｃｈｉら， ２０００， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０： ４３０５−４３１０）、ヒトムチン遺伝子ＭＵＣ１プロモーター（Ｓｔａｃｋｈｏｕｓｅら， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６： ２０９−２１９）、および膵臓癌細胞中で特に活性である（Ｐｅｒｒａｉｓら， ２００１； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． によって２００１年６月１９日に”ＪＢＣ Ｐａｐｅｒｓ ｉｎ Ｐｒｅｓｓ”に原稿Ｍ１０４２０４２００として刊行された）ヒトムチン遺伝子ＭＵＣ４プロモーター（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＡＦ２４１５３５）、等のように癌細胞中で選択的に活性であってよい。
【００３４】
ｒＰＳＧｅｎ １３およびＨｕＰＳＧｅｎ １３アミノ酸配列をコードする配列を（最初の寄託者が気付かないままに）含むエクスプレスド・シーケンス・タグ（ＥＳＴ）クローンが、米国特許出願第０９／６４８，３１０号の出願日前にＡＴＣＣに寄託され、それぞれ２００５７７７および２５２５２６２という受託番号を付与されていたことに注意しなければならない。これらのクローンは、本発明において完全なｒＰＳＧｅｎ １３およびＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子を特徴づけ、クローン化するのに使用された（下記の分節６参照）。しかし、上記ＥＳＴが寄託された時、これらの完全な遺伝子は公知ではなく、また上記ＥＳＴによってコードされるタンパク質の正体または機能はいずれも公知ではなかった。
【００３５】
真核細胞中で機能するプロモーター要素に機能しうる形で連結されたｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子またはＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子等のＰＳＧｅｎ １３核酸は、例えば、他の発現関連要素、抗生物質耐性に関連する遺伝子、等と共にベクター分子中に包含されていてよい。適切なベクター分子の例としては、限定するものではないが、ウイルスに基づくベクターおよびウイルスに基づかないＤＮＡまたはＲＮＡデリバリー系が含まれる。ウイルスに基づく遺伝子導入ベクターの適切な例としては、限定するものではないが、レトロウイルス由来のもの、例えばＬＸ、ＬＮＳＸ、ＬＮＣＸまたはＬＸＳＮなどのモロニーマウス白血病ウイルスに基づくベクター（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ， １９８９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７： ９８０−９８９）； レンチウイルス由来のもの、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づくベクター（Ｃａｓｅら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６： ２２９８８−２９９３； Ｃｕｒｒａｎら， ２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒ． １： ３１−３８； Ｏｌｓｅｎ， １９９８， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： １４８１−１４８７； 米国特許第６，２５５，０７１号および第 ６，０２５，１９２号）；アデノウイルス由来のもの（Ｚｈａｎｇ， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６（２）： １１３−１３８； Ｃｏｎｎｅｌｌｙ， １９９９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １（５）： ５６５−５７２； Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， １９９０， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １： ２４１−２５６； Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： ４３１−４３４； Ｗａｎｇら， １９９１， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３０９： ６１−６６； Ｊａｆｆｅら， １９９２， Ｎａｔ． Ｇｅｎ． １： ３７２−３７８； Ｑｕａｎｔｉｎら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９： ２５８１−２５８４； Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら， １９９２， Ｃｅｌｌ ６８： １４３−１５５； Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら， １９９３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９１： ２２５−２３４； Ｒａｇｏｔら， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３６１： ６４７−６５０； Ｈａｙａｓｋｉら， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ２３８７２−２３８７５； Ｂｅｔｔら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１： ８８０２−８８０６）、例えばＡｄ５／ＣＭＶに基づくＥ１欠失ベクター（Ｌｉら， １９９３， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４： ４０３−４０９）；アデノ随伴ウイルス由来のもの、例えばｐＳｕｂ２０１に基づくＡＡＶ２由来ベクター（Ｗａｌｓｈら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９： ７２５７−７２６１）；単純ヘルペスウイルス由来のもの、例えばＨＳＶ−１に基づくベクター（ＧｅｌｌｅｒおよびＦｒｅｅｓｅ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７： １１４９−１１５３）； バキュロウイルス由来のもの、例えば、ＡｃＭＮＰＶに基づくベクター（ＢｏｙｃｅおよびＢｕｃｈｅｒ， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９３： ２３４８−２３５２）； ＳＶ４０由来のもの、例えばＳＶｌｕｃ （ＳｔｒａｙｅｒおよびＭｉｌａｎｏ， １９９６， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３： ５８１−５８７）； エプスタイン−バーウイルス由来のもの、例えばＥＢＶに基づくレプリコンベクター（Ｈａｍｂｏｒら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８５： ４０１０−４０１４）； アルファウイルス由来のもの、例えばセムリキ森林熱ウイルスまたはシンドビスウイルスに基づくベクター（Ｐｏｌｏら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９６： ４５９８−４６０３）； ワクシニアウイルス由来のもの、例えば改変ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）に基づくベクター（ＳｕｔｔｅｒおよびＭｏｓｓ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９： １０８４７−１０８５１）、またはヒト腫瘍細胞に効率的に形質導入することができ、かつ治療上の効果に必要とされる核酸配列を収容することができる、任意の他のクラスのウイルスに由来するベクターが含まれる。特定の実施形態にとっては、シャトルベクターを用いることが望ましいであろう。
【００３６】
本発明は、適切なキャリアー中に上記ＰＳＧｅｎ １３核酸を含む組成物を提供する。治療用途のために、本発明は、例えば発現可能な形でベクター中に包含され、適切な医薬キャリアーに担持された、治療的量のＰＳＧｅｎ １３核酸を提供する。
【００３７】
本発明はまた、例えばベクター中に包含された、上記のＰＳＧｅｎ １３核酸を含む原核または真核宿主細胞を提供する。宿主細胞は、限定するものではないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞を含む、原核細胞または真核細胞であってよい。宿主細胞は悪性細胞であっても非悪性細胞であってもよい。本発明の特定の非限定的実施形態においては、宿主細胞は、例えば鼻咽頭腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、中枢神経系腫瘍細胞（例：神経芽腫、星状細胞腫、または多形性神経膠芽腫細胞）、黒色腫細胞、上皮腫瘍細胞、非上皮腫瘍細胞、血液腫瘍細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、神経芽腫細胞、子宮頸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、泌尿性器癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、骨肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、胃癌細胞または膵臓癌細胞を含むヒト腫瘍細胞であってよい。
【００３８】
５．２ ＰＳＧｅｎ １３ タンパク質
本発明は、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明は、図１に示すｒＰＳＧｅｎ １３タンパク質であって、配列番号２に示す配列を有する該タンパク質、およびそれと実質的に相同なタンパク質を提供する。別の特定の実施形態において、本発明は、図２に示すＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質であって、配列番号４に示す配列を有する該タンパク質、およびそれと実質的に相同なタンパク質を提供する。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明は、上記ＰＳＧｅｎ １３核酸によってコードされる、および／または以下に記述するｒＰＳＧｅｎ １３タンパク質および／またはＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質に対する抗体と交差反応するＰＳＧｅｎ １３タンパク質を提供する。したがって、ヒトおよびラットのＰＳＧｅｎ １３タンパク質に加えて、本発明はウシタンパク質、マウスタンパク質、および非ヒト霊長類動物ＰＳＧｅｎ １３タンパク質を提供する。
【００４０】
ＰＳＧｅｎ １３タンパク質は、天然の供給源から調製することも、化学的に合成することも、または遺伝子組換え技法によって生産することも可能である。例えば、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質は、適切な発現ベクターに含まれるＰＳＧｅｎ １３遺伝子を発現させることによって生産することができる。ＰＳＧｅｎ １３タンパク質は、標準的技法を用いて真核または原核細胞発現系中に発現させることができる。真核細胞発現系を用いる場合は、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸（好ましくは、ベクター中に発現可能な形で含まれる）を任意の標準的技法（トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、等を含む）を用いて真核細胞中に導入することができる。
【００４１】
本発明は、適切なキャリアー中に上記ＰＳＧｅｎ １３タンパク質を含む組成物を提供する。治療上の使用のためには、本発明は適切な医薬キャリアーに担持させた治療的量のＰＳＧｅｎ １３タンパク質を提供する。
【００４２】
５．３ ＰＳＧｅｎ １３ タンパク質に対する抗体
本発明は、本明細書に記述するＰＳＧｅｎ １３タンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。特定の実施形態において、該抗体は、図１および配列番号２に示す配列を有するｒＰＳＧｅｎ １３タンパク質と特異的に結合する。別の特定に実施形態において、該抗体は、図２および配列番号４に示す配列を有するＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質と特異的に結合する。そのような抗体は、ある場合には、異なる生物種に由来する数種のＰＳＧｅｎ １３タンパク質と交差反応する。
【００４３】
上記抗体は、限定するものではないが、例えばヒト抗体、マウス抗体、非ヒト霊長類動物抗体、ウシ抗体、ヒツジ抗体、ヤギ抗体、またはラット抗体であってよい。特定の非限定的実施形態において、抗体はマウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化霊長類動物モノクローナル抗体、またはヒト化ラットモノクローナル抗体であってよい。
【００４４】
本発明によれば、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質、その断片または他の誘導体（例えばヒスチジンタグを付けたタンパク質）またはその類似体を、抗体を作製するための免疫原として用いることができる。そのような抗体は、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーを含む。特定の実施形態においては、ｒＰＳＧｅｎ １３またはＨｕＰＳＧｅｎ １３を認識する抗体が作製される。
【００４５】
ＰＳＧｅｎ １３タンパク質と特異的に結合するポリクローナル抗体の作製には、当技術分野で公知の種々の技法を用いることができる。抗体を作製するためには、天然のＰＳＧｅｎ １３タンパク質、もしくはその合成タンパク質、またはその誘導体（例えばフラグメント）を注射することによって種々の宿主動物（限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、等を含む）を免疫することができる。宿主の種によって種々のアジュバントを用いて免疫応答を増大させることができる。これらのアジュバントには、限定するものではないが、フロインド（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、等の界面活性物質、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等の潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。
【００４６】
ＰＳＧｅｎ １３タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製するためには、培養下の連続した細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いることができる。そのような技法の例としては、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｒｉｎ （１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７）によって最初に開発されたハイブリドーマ技法、ならびにトリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６ に掲載のＣｏｌｅら， １９８５）が含まれる。本発明のさらなる実施形態においては、近年の技術（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５）を用いて、無菌動物中にモノクローナル抗体を産生させることができる。本発明によれば、ヒト抗体を用いることができ、かつヒトハイブリドーマを用いることによって（Ｃｏｌｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０： ２０２６−２０３０）、またはＥＢＶウイルスを用いてヒトＢ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで形質転換することによって（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６ に掲載のＣｏｌｅら， １９８５）ヒト抗体を得ることができる。さらに、本発明によれば、「キメラ抗体」の作製のために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１： ６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ４５２−４５４）を用いて、ＰＳＧｅｎ １３に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子とスプライシングすることによって抗体を作製することができる；そのような抗体は本発明の範囲内にある。
【００４７】
本発明によれば、１本鎖抗体の作製のために記述された技法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適合させてＰＳＧｅｎ １３特異的１本鎖抗体を作製することができる。本発明のさらなる実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために記述された技法（Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｎｅｃｅ ２４６： １２７５−１２８１）を用いて、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質誘導体または類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定を可能とする。
【００４８】
分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントを公知の技法によって作製することができる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作製することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製できるＦａｂ’フラグメント；抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製できるＦａｂフラグメントが含まれる。
【００４９】
本発明は、本明細書に記述する抗体およびキャリアーを含む組成物を提供する。本発明の特定の実施形態において、この組成物は医薬組成物である。
【００５０】
本発明による抗体は、例えばＰＳＧｅｎ １３タンパク質の精製に、または存在するＰＳＧｅｎ １３タンパク質の量を検出または測定する診断方法（細胞中のＰＳＧｅｎ １３タンパク質の量は、細胞がトランスフォームされた表現型に向かって進行するにつれて減少するであろう）に用いることができる。
【００５１】
５．４ ＰＳＧｅｎ １３ の使用
本発明は、悪性細胞のトランスフォームされた表現型を抑制するためのＰＳＧｅｎ １３の使用に関する。トランスフォームされた表現型の指標としては、限定するものではないが、細胞増殖、形態、接触阻止の欠如、形質転換関連遺伝子の発現の増大、分化特異的遺伝子の発現の減少、足場非依存的増殖能、老化またはアポトーシスの開始の欠如、腫瘍を形成し転移する傾向、等が含まれる。ＰＳＧｅｎ １３の効果は、ＰＳＧｅｎ １３核酸を発現可能な形で悪性細胞中に導入することによって、および／またはＰＳＧｅｎ １３タンパク質もしくはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター物質（下記参照）を導入することによって伝達されうる。
【００５２】
したがって本発明は、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質またはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター物質に癌細胞を接触させることを含む、癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。ＰＳＧｅｎ １３アクチベーター物質とは、細胞中に存在するＰＳＧｅｎ １３のレベルを上昇させるものである。例えば、プロモーターの活性化によってＰＳＧｅｎ １３遺伝子の転写を誘導する物質、またはＰＳＧｅｎ １３タンパク質もしくはｍＲＮＡの半減期を増大させる物質である。特定の実施形態においては、癌細胞はヒト癌細胞である。特定の非限定的実施形態において、本発明は、ヒト癌細胞を有効量のｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎ １３核酸（発現可能な形の）、またはｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎタンパク質に暴露することを含む、ヒト癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。例えば、限定するものではないが、ヒト癌細胞は鼻咽頭腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、中枢神経系腫瘍細胞（例：神経芽腫、星状細胞腫、または多形性神経膠芽腫細胞）、黒色腫細胞、上皮腫瘍細胞、非上皮腫瘍細胞、血液腫瘍細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、神経芽腫細胞、子宮頸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、泌尿性器癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、骨肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、胃癌細胞または膵臓癌細胞であることができる。
【００５３】
関連する実施形態において、本発明は、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質またはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター物質の治療上有効量を癌を患う被験者に投与することを含む、被験者を治療する方法を提供する。特定の非限定的実施形態において、被験者はヒトである。特定の非限定的実施形態において、本発明は、ｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎ １３核酸（発現可能な形の）またはｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質の治療上有効量を、癌を患うヒト被験者に投与することを含む、ヒト被験者の治療方法を提供する。例えば、治療されるべき癌は、鼻咽頭腫瘍、甲状腺腫瘍、中枢神経系腫瘍（例：神経芽腫、星状細胞腫、または多形性神経膠芽腫）、黒色腫、脈管癌、血管癌（例：血管腫、血管肉腫）上皮腫瘍、非上皮腫瘍、血液腫瘍、白血病、リンパ腫、神経芽腫、子宮頸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、肝癌、泌尿性器癌、卵巣癌、精巣癌、骨肉腫、軟骨肉腫、胃癌または膵臓癌であることができる。
【００５４】
ＰＳＧｅｎ １３核酸は、限定するものではないが、例えばベクター介在エントリー（例：感染）、リポソーム（例：ＤＣ−コレステロールリポソーム、カチオン性リポソーム、センダイウイルス外被タンパク質を含有するリポソーム）、イミダゾリウム脂質（例えば、２００１年６月１２日に発行されたＷａｎｇらによる米国特許第６，２４５，５２０号参照）、カチオン性脂質（例えば、２００１年５月２２日に発行されたＷａｎｇらによる米国特許第６，２３５，３１０号参照）、リポフェクション、アシアロ糖タンパク質ポリ（Ｌ）リシン複合体、および微小泡（例えば、２００１年６月１２日に発行されたＰｏｒｔｅｒらによる米国特許第６，２４５，７４７号参照）を用いる、当技術分野で公知の任意の方法によって導入することができる。ＰＳＧｅｎ １３タンパク質は、リポソーム、微小球体、または飲作用または食作用を容易にするビヒクル等の処方物を用いる方法を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって細胞に導入することができる。
【００５５】
被験者は、任意の適切な経路（腫瘍内点滴注入、静脈内、動脈内、鞘内、筋肉内、皮内、皮下、等を含む）によって治療上有効量のＰＳＧｅｎ １３遺伝子またはタンパク質を投与され得る。治療上有効量のこれらの作用物質は、下記の成果のうち１つ以上をもたらす：すなわち、腫瘍塊の減少、癌細胞数の減少、血清腫瘍マーカーの減少、腫瘍転移の減少、血管新生の減少、灌流の減少、腫瘍増殖速度の低下、臨床症状の改善、および／または患者の生存率の増大である。適切な場合は、最初に癌を外科的に処置して腫瘍塊を取り除いてもよい。
【００５６】
５．４．１ 潜在的標的細胞の同定
特定の癌が本発明の方法にとって適切な標的であるかどうかを評価することが望ましいであろう。そのような評価は、例えば、ＰＳＧｅｎ １３遺伝子（発現可能な形の）またはタンパク質を被験癌細胞に導入し、そして該細胞のトランスフォームされた表現型が抑制されるかどうかを、例えば、該細胞の増殖能および／または軟寒天中にコロニーを形成する該細胞の能力を試験することによって確認することにより行うことができる。
【００５７】
下記の分節６に、ＰＳＧｅｎ １３が進行関連遺伝子ＰＥＧ３に関連するプロモーターであるＰＥＧ３プロモーター［例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７１９９、公開番号ＷＯ ９９／４９８９８（１９９９年１０月７日に英語で公開；参照によりここに組み入れる）に記載されているＰＥＧ３プロモーター、およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３５１１３０参照］の活性を抑制することを示すデータを提示する。該プロモーターの活性は、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を用いてモニターされた。この発見に基づいて、本発明は、癌細胞がＰＥＧ３レベルの上昇を示すかどうかを確認することによって、ＰＳＧｅｎ １３の推定される治療標的を同定する方法を提供する。本発明の方法は、ＰＳＧｅｎ １３がＰＥＧ３発現を低下させうるかどうかを、例えばそのプロモーター活性を抑制することによって、確認することをさらに含むことができる。特定の実施形態において、そのような活性は、限定するものではないが、本明細書に例示するＰＥＧ３プロモーター／ルシフェラーゼ遺伝子リポーター系等のＰＥＧ３プロモーター／リポーター遺伝子構築物を用いてモニターすることができる。
【００５８】
下記の分節６に、ＰＳＧｅｎ １３が、血管内皮増殖因子の発現および新たな血管形成（血管新生）に関連するプロモーターであるＶＥＧＦプロモーターの活性を抑制することを示すさらなるデータを提示する。該プロモーターの活性は、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を用いてモニターされた。この発見に基づいて、本発明は、癌細胞がＶＥＧＦレベルの上昇を示すかどうかを確認することによって、ＰＳＧｅｎ １３の推定される治療標的を同定する方法を提供する。本発明の方法は、ＰＳＧｅｎ １３がＶＥＧＦ発現を低下させうるかどうかを、例えばそのプロモーター活性を抑制することによって、確認することをさらに含むことができる。特定の実施形態において、そのような活性は、限定するものではないが、本明細書に例示するＶＥＧＦプロモーター／ルシフェラーゼ遺伝子リポーター系等のＶＥＧＦプロモーター／リポーター遺伝子構築物を用いてモニターすることができる。または、血管新生に特に関連する腫瘍（例えば、黒色腫または血管腫等の血管腫瘍等）は、ＰＳＧｅｎ １３介在治療の適切な標的でありうる。
【００５９】
下記の分節８に示すように、ＨｕＰＳＧｅｎ １３は染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３にマップされた。この領域に欠失を有する癌細胞は、ＨｕＰＳＧｅｎ １３の形質転換抑制効果に対して特に感受性でありうる。したがって、本発明は、染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３に欠失を検出することを含む、ＨｕＰＳＧｅｎ １３による治療のヒト癌細胞標的を同定する方法を提供する。
【００６０】
５．４．２ 血管新生の抑制
本発明は、被験者における癌増殖に関連した血管新生を抑制するように、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質またはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター化合物の十分量を含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、被験者における癌増殖に関連した血管新生を抑制する方法を提供する。特定の非限定的実施形態において、該被験者はヒトであり、そして該治療方法は治療上有効量の発現可能な形のｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎ １３核酸、または治療上有効量のｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質を投与することを含む。非限定的実施形態においては、ＰＳＧｅｎ １３核酸またはタンパク質を、アンギオスタチンまたはサリドマイド等の抗血管新生活性を有する別の分子と共に投与することが望ましいかもしれない。
【００６１】
５．４．３ 診断方法
本発明は、ＨｕＰＳＧｅｎ １３の染色体上の位置、すなわち６ｑ２３．２−６ｑ２３．３を利用する診断方法をさらに提供する。
【００６２】
１組の実施形態において、本発明は、個体の染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３における欠失を検出することを含む、癌を発症する危険が増大した個体を同定する方法を提供する。特定の非限定的実施形態において、増大した危険とは、膵臓癌、腹膜の乳頭状漿液性癌、肝細胞癌、大Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、乳癌、胃癌、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含むリストより選択された癌の発症をいう。
【００６３】
別の１組の実施形態において、本発明は、個体の染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３における欠失を検出することを含む、被験者における癌の進行（すなわち、より悪性な表現型の発生）を検出する方法を提供する。特定の非限定的実施形態において、上記進行は、膵臓癌、腹膜の乳頭状漿液性癌、肝細胞癌、大Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、乳癌、胃癌、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含むリストより選択された癌に起こる。
【００６４】
欠失は、制限断片長多型の分析を含むが、それだけに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって検出することができる。
【００６５】
６．実施例： 進行によって抑制される遺伝子 １３ （ＰＳＧｅｎ １３） は、齧歯動物およびヒトの癌細胞におけるトランスフォームされた状態を抑制する
要約： 全長齧歯動物ＰＳＧｅｎ １３遺伝子を作製し、発現ベクターに導入し、そして進行した、齧歯動物のトランスフォームされた細胞系であるＥ１１−ＮＭＴおよびＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞系中に安定にトランスフェクトした。一連のランダムな単一細胞クローンを単離し、そして文献に記述されているトランスフォームされた状態の発現について、足場非依存的に増殖するそれらの能力によって評価した。ラットＰＳＧｅｎ １３遺伝子を欠く対照発現ベクターではなく、ラットＰＳＧｅｎ １３発現ベクターを用いてトランスフェクトした特定のＥ１１−ＮＭＴおよびＤＵ−１４５クローンは、足場非依存的に増殖するそれらの能力が抑制された。ラットＰＳＧｅｎ １３でトランスフェクトされたＥ１１−ＮＭＴ形質転換体の場合、特定の進行によって促進される遺伝子（ＰＥＧ−３）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の転写が抑制された。ラットＰＳＧｅｎ １３配列を用いて、ラットＰＳＧｅｎ １３配列にかなりのＤＮＡおよびタンパク質相同性を有する（それぞれ７５および９４％）ヒトＰＳＧｅｎ １３（ＨｕＰＳＧｅｎ １３）遺伝子が同定された。以下に記述する試験は、ＰＳＧｅｎ １３が癌表現型の抑制物質であること、および抑制は癌進行誘導遺伝子および血管新生刺激遺伝子の発現に変化をもたらすことを示す。
【００６６】
６．１ 材料および方法
細胞培養および寒天増殖アッセイ： Ｅ１１は、Ｈ５ｔｓ１２５で形質転換されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ二次ＲＥ細胞の単一細胞クローンである（Ｆｉｓｈｅｒら， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．７５： ２３１１−２３１４）。Ｅ１１−ＮＭＴは、Ｅ１１細胞系によって誘導されたヌードマウス腫瘍に由来するＥ１１細胞のサブクローンである（Ｂａｂｉｓｓら， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８： １０９９−１１０１）。Ｒ１２は、Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換されたＥ１１クローンである（Ｄｕｉｇｏｕら， １９８９， ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ５６７ ：３０２−３０６）。Ｆ１およびＦ２は、Ｅ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞の間に形成された、平坦な形態を有する、抑制された体細胞ハイブリッドである（Ｄｕｉｇｏｕら， １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０： ２０２７−２０３４）。Ｒ１およびＲ２は、Ｅ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞を融合させて作製した、丸い形態を有する、進行した体細胞ハイブリッドである（同文献）。Ｅ１１−ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７は、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６／Ｅ７遺伝子領域で形質転換したＥ１１細胞のクローンである（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９４： ９１２５−９１３０）。Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６および３ｂは、Ｅ１１細胞とＥ１１−ＮＭＴ細胞の間に形成された、進行表現型を示さない独立した体細胞ハイブリッドクローンである（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａｄｏｌｐｈ（編）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｐ． ６８−１０２に掲載のＲｅｄｄｙら， １９９３）。進行表現型を示さないＥ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ細胞（同文献）。Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６ＴＤは、Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６体細胞ハイブリッドによってヌードマウス中に誘導された腫瘍を単離することによって形成された、進行した体細胞ハイブリッドである（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９４： ９１２５−９１３０； Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａｄｏｌｐｈ（編）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｐ． ６８−１０２に掲載のＲｅｄｄｙら， １９９３）。Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ ＩＩａは、Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴの間に形成された、進行表現型を示す体細胞ハイブリッドクローンである（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａｄｏｌｐｈ（編）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｐ． ６８−１０２に掲載のＲｅｄｄｙら， １９９３）。Ｅ１１−ＮＭＴ ＡｚａＢ１およびＡｚａ Ｃ１は、５−アザシチジンで処理したＥ１１−ＮＭＴ細胞の独立したクローンであり、進行表現型の抑制を示す（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９４： ９１２５−９１３０； Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａｄｏｌｐｈ（編）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｐ． ６８−１０２に掲載のＲｅｄｄｙら， １９９３）。ＣＲＥＦは、Ｆｉｓｃｈｅｒラット胚繊維芽細胞の特定の不死の非形質転換および非腫瘍形成性クローンである（Ｆｉｓｈｅｒら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７９： ３５２７−３５３１）。ＤＵ−１４５は、ホルモン屈折性（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ）ヒト前立腺癌細胞系である（Ｊｉａｎｇら， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３： ９１６０−９１６５）。全ての培養物は、５％ ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃にて、湿潤化５％ ＣＯ２／９５％空気インキュベーター中で増殖させた。足場非依存的増殖アッセイは、以前に記述されたように、０．８％ ｎｏｂｌｅ ａｇａｒ含有培地である基層上の０．４％ ｎｏｂｌｅ ａｇａｒ含有培地中に異なる数の細胞を播くことによって実施した（Ｋａｎｇら，１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １３７８８−１３７９３； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３９： ３０５１−３０５７； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２８１： ５９１−５９４； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃｅｌｌ １８： ６９５−７０５； Ｂａｂｉｓｓら， １９８５， Ｓｃｉｎｅｃｅ ２２８： １０９９−１１０１； Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ２１９５−９１３０； Ｓｕら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６： １５１１５−１５１２０； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７５： ２３１１−２３１４）。
【００６７】
ＰＳＧｅｎ １３ 発現 Ｅ１１−ＮＭＴ クローンの構築： Ｅ１１−ＮＭＴおよびＤＵ−１４５細胞を、以前に記述されているように（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ２１９５−９１３０）、完全なｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子を欠く、または有するｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（ネオマイシン耐性遺伝子を含む）を用いてトランスフェクトした。すなわち、１ ｘ １０５個の細胞を１０ ｃｍの組織培養プレートに播き、６時間後に１０ ｇの精製ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターまたはラットＰＳＧｅｎ １３／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）構築物を３０ μｌのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と共にインキュベートし、この混合物を８時間細胞に加えた。翌日、培地を５００ μｇ／ｍｌのＧ４１８を加えたものと交換し、そして培地は週に２回、３週間にわたって交換した。クローニング・シリンダーを用いてＧ４１８耐性コロニーを単離し、ＮＭＴ−ＰＳＧ１３クローン（ｃｌ ３、５、６、７、８、９、１０、１１および１２）およびＤＵ−ＰＳＧ１３クローン（ｃｌ １１、１２、１３、１４、１５および１７）と称する独立した細胞系として、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する完全培地で維持した。さらに、ＮＭＴ−ベクターおよびＤＵ−１４５−Ｖｅｃクローンを単離し、独立した細胞系として１０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する完全培地で維持した。
【００６８】
ノーザンブロッティングアッセイ： グアニジニウム／フェノール抽出法により全細胞ＲＮＡを単離した（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ２１９５−９１３０）。１５μｇのＲＮＡを変性させ、３％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲル中で電気泳動し、ナイロン膜に転写し、そして３２Ｐ標識化ｒＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡプローブと順次ハイブリダイズさせた。ブロットを剥がし、そして以前に記述されているように（同文献） ３２Ｐ標識化ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡプローブで再度釣り上げた。ハイブリダイゼーション後、フィルターを洗浄し、オートラジオグラフィーのために感光させた。
【００６９】
プロモーター分析： 全長ラットＰＥＧ３プロモーター（ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ）およびＶＥＧＦ−プロモーター構築物の活性を評価するため、細胞（Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＮＭＴ−ＰＳＧｅｎ １３）クローンを３５ ｍｍの組織培養プレート１枚あたり２ ｘ １０５個の割合で播き、約２４時間後に、５μｇのＰＥＧ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼまたはＶＥＧＦ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ構築物、および２００μｌの無血清培地中で１０μｌのリポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ）と混合した１μｇのＳＶ４０−β−ｇａｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてトランスフェクトした。２０分後、室温で、８００μｌの無血清培地を添加し、最終容量を１ ｍｌとした。このトランスフェクション混合物を１４時間後に除去し、細胞を無血清培地で３回洗浄し、そして完全増殖培地中３７℃でさらに４８時間インキュベートした。細胞を回収し、溶解して、β−ｇａｌおよびルシフェラーゼリポーターアッセイに用いる抽出物を調製した（Ｇｏｐａｌｋｒｉｓｈａｎら， １９９９， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：４７７５−４７８２）。ルシフェラーゼおよびβ−ｇａｌ活性の発光測定は、市販のキット（それぞれＰｒｏｍｅｇａおよびＴｒｏｐｉｘ）を用いて実施した。ルシフェラーゼアッセイのためには、１０μｌの細胞溶解物を４０μｌのルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。β−ｇａｌアッセイのためには、１０μｌの細胞溶解物を１００μｌの希釈Ｇａｌｅｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓおよび１５０μｌのＡｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ （Ｔｒｏｐｉｘ）と混合した。プロモーター分析のデータは、各実験ポイントについて３個１組のサンプルを用いて最低３回集めた。そして、データはβ−ｇａｌデータによって標準化した。
【００７０】
全長ラット ＰＳＧｅｎ １３ および ＨｕＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡ のクローニング： ＲＳＤＤおよび逆ノーザンハイブリダイゼーションを用いて、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞と比較してＥ１１細胞中で発現上昇を示す遺伝子として、もとのラットＰＳＧｅｎ １３ ＥＳＴが同定された（Ｋａｎｇら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１３７８８−１３７９３）。ラットＰＳＧｅｎ １３の全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、上記ＥＳＴ配列に基づく遺伝子特異的プライマーおよび電子データマイニングと共に完全オープンリーディングフレーム（Ｃ−ＯＲＦ）アプローチを用いてクローン化した。Ｃ−ＯＲＦに用いたプライマーは、ＰＳＧｅｎ１３−Ｒ２ （ＴＣＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＣＧ ＧＡＧ ＴＧＴ ＣＡＡ Ｇ）（配列番号７）およびＰＳＧｅｎ１３−Ｒ２ネステッド（ＴＧＴ ＣＡＡ ＧＴＧ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＧＡ ＣＴＡ ＡＧＡ ＡＴＧ Ｇ）（配列番号８）であった。さらに、ラットＰＳＧｅｎ １３ ＥＳＴ配列をＧｅｎＢａｎｋの配列とＢＬＡＳＴによって比較することにより、全長ｒＰＳＧｅｎ １３およびＨｕＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡクローンを同定した。選択したクローン（ラットＰＳＧｅｎ １３由来のＡＴＣＣ＃２００５７７７およびＨｕＰＳＧｅｎ １３由来のＡＴＣＣ＃２５２５２６２）を取得し（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、配列を決定した。
【００７１】
６．２ 実験結果
ＰＳＧｅｎ １３ の配列インフォーマティクス： クローン化した全長ラットＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）テイルを除いて、７８０ ｂｐからなる。ポリ（Ａ）シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）は７６３位に位置する（図１；配列番号１）。インフレーム終止コドンが８６ ｂｐに存在し（ＨｕＰＳＧｅｎ １３には存在しない）、そしてＯＲＦは１７０ ｂｐの最初のＡＴＧから始まり、４１５ ｂｐまで延びている。ｒＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡは、計算分子量が９ ｋＤａで、等電点（ｐＩ）が５．５２である、予想される８１個のアミノ酸（図１；配列番号２）を有するタンパク質をコードする。タンパク質配列分析は、膜にかかる領域のための疎水性パッチ、または分泌タンパク質に特徴的なシグナルペプチド配列を示さなかった。モチーフおよびパターン分析もまた、以前に報告された遺伝子との配列相同性（これはラットＰＳＧｅｎ １３の生物学的機能および／または作用機序への可能な洞察を提供するのに有用な情報である）を同定できなかった。この考察に基づくならば、ｒＰＳＧｅｎ １３は新規なクラスのタンパク質をコードしているように思われる。
【００７２】
ｒＰＳＧｅｎ １３のヒト相同体であるＨｕＰＳＧｅｎ １３を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに報告されている配列を分析することにより電子的にクローン化した（図２；配列番号３）。ＨｕＰＳＧｅｎ １３はヌクレオチドレベルではｒＰＳＧｅｎ １３と７５％同一であるが、タンパク質レベルではｒＰＳＧｅｎ １３と９４％同一である（７９／８１残基）（図３および４）。ＨｕＰＳＧｅｎ １３において独特な５個の残基のうち、３個（４位のＤ、３８位のＫおよび７７位のＩ）はｒＰＳＧｅｎ １３（４位のＥ、３８位のＲおよび７７位のＶ）の保存された置換であり、これは機能性における強い保存を示唆している。さらに、ＨｕＰＳＧｅｎ １３とｒＰＳＧｅｎ １３のタンパク質コード配列の配列同一性は、ヌクレオチドレベルで８７％である。５’および３’末端非翻訳領域は、それぞれ６８．７％および６８．３％の同一性を示す。これらの領域はｒＰＳＧｅｎ １３とＨｕＰＳＧｅｎ １３の間でＯＲＦ部分よりも多様であるが、これは種間相同体の間では珍しいことではない。ＯＲＦにおける保存の程度およびその結果としてのタンパク質配列を考えるならば、ＨｕＰＳＧｅｎ １３はｒＰＳＧｅｎ １３のオーソログである。クローン化したＨｕＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）テイルを除いて８３５ ｂｐからなり、そして標準的なポリ（Ａ）シグナルが８１４ ｂｐに観察される。インフレーム終止コドンは存在しなかったが、ＨｕＰＳＧｅｎ １３のＯＲＦは最初のＡＴＧ （１９７ ｂｐ）から始まり、４４２ ｂｐまで延びている。ＨｕＰＳＧｅｎ １３は計算された分子量が９ ｋＤａで、等電点が５．８６である、８１個のアミノ酸をコードしている。ｒＰＳＧｅｎ １３におけるように、コンピュータによるタンパク質配列分析は公知の機能モチーフを何らもたらさなかった。
【００７３】
ｒＰＳＧｅｎ １３ は Ｅ１１−ＮＭＴ および ＤＵ−１４５ 細胞における足場非依存的増殖を抑制する：
ｒＰＳＧｅｎ １３は、ＲＳＤＤを用いて、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞と比較してＥ１１細胞中で発現上昇を示す遺伝子として同定された（Ｋａｎｇら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１３７８８−１３７９３）。進行した表現型（＋）（これは寒天中における増殖の増大および短い腫瘍潜伏時間によって示される）、または進行しない表現型（−）（これは寒天中における増殖の減少および腫瘍潜伏時間の延長によって示される）を示す１群の齧歯動物細胞系を用いて、ｒＰＳＧｅｎ １３発現の減少と進行表現型との間に直接的な相関関係が見出された（図５、Ｋａｎｇら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１３７８８−１３７９３より）。ｒＰＳＧｅｎ １３のレベルは、進行表現型を示さないＥ１１、ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｆ１およびＦ２、Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６、およびＥ１１−ＮＭＴ ＡＺＡ Ｂ１細胞において上昇した。対照的に、進行したＥ１１−ＮＭＴ、ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｒ１およびＲ２、Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６ＴＤ、Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ ＩＩａ、Ｅ１１−Ｒａｓ Ｒ１２およびＥ１１−ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７細胞においては、ｒＰＳＧｅｎ １３の発現はより低かった。これらの知見は、進行表現型の発現とラットＰＳＧｅｎ １３発現の間に潜在的な逆の関係を実証する。これらの知見はまた、ＰＳＧｅｎ １３が進行プロセスにおいて機能的な役割をはたすかもしれないという可能性を提起した。
【００７４】
ｒＰＳＧｅｎ １３は発現ベクター中にクローン化され、そしてＥ１１−ＮＭＴおよびＤＵ−１４５細胞中に安定にトランスフェクトされた。ランダムクローンを単離し、そして半固体寒天中に播いた時に肉眼で見えるクローンを形成する能力について評価した（Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３９： ３０５１−３０５７； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２８１： ５９１−５９４； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃｅｌｌ １８： ６９５−７０５）。Ｅ１１細胞は寒天中では低い効率で増殖するが、他方、進行したＥ１１−ＮＭＴ細胞は寒天中で増大した増殖を示し、Ｅ１１細胞におけるよりも多数の、より大きいコロニーを形成する（図６）（同文献）。ランダムＮＭＴ−ＰＳＧｅｎ １３クローン（「ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ番号」で表わす）の分析は、足場非依存性の顕著な減少を何ら示さない特定のクローン（すなわちＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３および５）、ならびにＥ１１細胞に類似した寒天クローニング効率の低下を示すクローン（すなわちＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７および１２）を示した。さらに、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞に較べて足場非依存性の顕著な減少を示すが、ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７および１２よりも少ない増殖抑制を示すいくつかのクローンが同定された。これらは、ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ６、８、９、１０および１１を含む。
【００７５】
足場非依存性の抑制はｒＰＳＧｅｎ １３の発現増大と関連していることを確認するため、全ＲＮＡをＥ１１、Ｅ１１−ＮＭＴならびにＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３、５、７および１２から単離して、ノーザンブロッティングによって評価した（図７）。この実験は、Ｅ１１ならびにＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７および１２におけるＰＳＧｅｎ １３の発現を証明したが、Ｅ１１−ＮＭＴまたはＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３および５における発現は証明しなかった。これらの結果は、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞におけるｒＰＳＧｅｎ １３の強制発現が、このトランスフォーメーションモデル系における進行表現型のマーカーである足場非依存的増殖の抑制をもたらしたことを示している。
【００７６】
ｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子がヒト癌細胞におけるトランスフォームされた表現型に効果を及ぼしうるかどうかを決定するため、全長ｒＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡをＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞中にトランスフェクトし、ランダムクローンを単離した。次に、これらのクローンを足場非依存的増殖について評価した（図８）。ＤＵ−１４５細胞と比較して足場非依存的増殖に顕著な減少を示す数個のクローン（ＤＵ−ＰＥＧ１３ ｃｌ １１、１２および１４を含む）が同定された。ベクターでトランスフェクトされたクローンならびにＤＵ−ＰＥＧ１３ ｃｌ １３、１５および１７を含むさらなるクローンは、寒天中でトランスフェクトされていないＤＵ−１４５細胞と類似のクローニング効率を示した。これらの結果は、ラットＰＳＧｅｎ １３がヒト癌細胞におけるトランスフォームされた表現型をも抑制することができることを示し、それによってこの遺伝子産物の腫瘍細胞におけるより一般的な抑制能力を示している。
【００７７】
ラット ＰＳＧｅｎ １３ は Ｅ１１−ＮＭＴ 細胞における転写活性を抑制する： 以前の研究は、Ｅ１１細胞と比較してＥ１１−ＮＭＴ細胞がＰＥＧ−３およびＶＥＧＦ遺伝子の転写の増大を示すことを明らかにした（Ｓｕら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６： １５１１５−１５１２０）。遺伝子発現におけるこれらの変化は、Ｅ１１細胞と較べてＥ１１−ＮＭＴ細胞の攻撃的で進行した癌表現型の重要な決定因子であると思われる（同文献）。ｒＰＳＧｅｎ １３発現がこれらの重要な進行関連遺伝子に効果を及ぼすことができるかどうかを決定するため、ルシフェラーゼリポーター遺伝子に連結したＰＥＧ３プロモーター（ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ）およびルシフェラーゼリポーター遺伝子に連結したＶＥＧＦプロモーター（ＶＥＧＦ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ）構築物の転写活性を、Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよび異なるＮＭＴ−ＰＳＧ１３クローンにおいて評価した（図９および１０）。以前に報告されているように（同文献）、ＰＥＧ−ＰｒｏｍおよびＶＥＧＦ−ＰｒｏｍはＥ１１細胞におけるよりもＥ１１−ＮＭＴ細胞においてより活性である。ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７および１２の両者は、Ｅ１１細胞のそれと類似したＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の減少を示した（図９）。対照的に、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞と比較した場合、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ活性のレベルはＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３および５において変化しておらず、これらは増大したｒＰＳＧｅｎ １３ ｍＲＮＡを発現しない（図７）。ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７および１２において観察されたよりも小規模ではあるが、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性レベルの低下がＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ６（最小低下）、８、９、１０および１１においても明らかであった。ＶＥＧＦ−Ｐｒｏｍの場合、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞と比較してＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３および５においてはプロモーター活性の変化は全く見られなかった（図１０）。しかし、ＶＥＧＦ−Ｐｒｏｍ活性における類似の低下（Ｅ１１細胞に観察されたものに近い）がＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７、８、９、１０、１１および１２において明らかであった。これらの結果は、ＰＳＧｅｎ １３の発現がＰＥＧ−３およびＶＥＧＦの両方の発現を調節できることを示唆している。これら２つの遺伝
子のどちらについても、転写活性のこの調節が直接的または間接的作用機構によって起こるのかどうかは、現在のところ分かっていない。
【００７８】
６．３ 結論
ＲＳＤＤアプローチは、齧歯動物およびヒトの両方の腫瘍細胞における癌の進行を機能的に調節することができる新規な遺伝子、すなわちｒＰＳＧｅｎ １３をうまく同定した。攻撃的な癌表現型を示す齧歯動物腫瘍細胞（Ｅ１１−ＮＭＴ）におけるｒＰＳＧｅｎ １３の強制発現は、足場非依存的増殖の減少によってモニターされる癌表現型の抑制をもたらすという証拠が提示される。同様に、ヒト前立腺癌細胞系（ＤＵ−１４５）中で過剰発現させた場合も、ｒＰＳＧｅｎ １３は足場非依存性の抑制を誘導した。ＰＳＧｅｎ １３がその癌増殖抑制特性を誘導する作用機構は知られていない。しかし、Ｅ１１−ＮＭＴモデルにおいては、ｒＰＳＧｅｎ １３の強制発現は、２つの重要な癌進行調節遺伝子であるＰＥＧ−３およびＶＥＧＦの転写活性の抑制と直接相関していた。
【００７９】
配列相同性に基づいて、ヒトＰＳＧｅｎ １３遺伝子、すなわちＨｕＰＳＧｅｎ １３が単離された。この遺伝子はラットＰＳＧｅｎ １３遺伝子に高度に相同である。ヌクレオチドおよびタンパク質レベルでそれぞれ７５％および９４％同一である。以下の分節に示すように、ＨｕＰＳＧｅｎ １３もまたトランスフォームされた表現型を抑制することが示された。
【００８０】
７．実施例： ヒト ＰＳＧｅｎ １３ はトランスフォームされた表現型を抑制する
ＨｕＰＳＧｅｎ １３ は形質転換されたラット胚細胞のトランスフォームされた表現型を抑制した： ＣＲＥＦ細胞およびＨａ−ｒａｓによって形質転換したＣＲＥＦ細胞（「ＣＲＥＦ−ｒａｓ」細胞）を、空のベクターまたはＨｕＰＳＧｅｎ １３を含むベクターによってトランスフェクトした。このベクターはハイグロマイシン耐性遺伝子も含んでいた。ハイグロマイシン耐性によってトランスフェクタントを選択し、単層培養におけるコロニー形成を評価した。結果を図１１に示す。この図は、３枚反復プレートの結果±Ｓ．Ｄ．を示している。このデータは、ＨｕＰＳＧｅｎ １３がＣＲＥＦ−ｒａｓ形質転換ラット胚繊維芽細胞におけるコロニー形成に対して選択的抑制効果を発揮することを示している。さらに、トランスフェクトされたＨａ−ｒａｓ形質転換細胞におけるコロニー形成効率は、形質転換されていない、トランスフェクトされたＣＲＥＦ細胞に観察されたレベルに戻ることが見いだされた。
【００８１】
ＨｕＰＳＧｅｎ １３ はヒト乳癌細胞のトランスフォームされた表現型を抑制した； ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７の細胞を、ハイグロマイシン耐性遺伝子をも含むベクターに組み込んだＨｕＰＳＧｅｎ １３によってトランスフェクトした。次に、ハイグロマイシンの存在下でトランスフェクタントを選択し、単離したクローンを寒天中における足場非依存的増殖について評価した。図１２に示すように、ＨｕＰＳＧｅｎ １３でトランスフェクトしたいくつかの細胞系はトランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞と類似したクローニング効率を示したが（クローン４および５）、クローニング効率はヒトＰＳＧｅｎ １３でトランスフェクトしたＭＣＦ−７クローン６、７、１２、１３および１５において実質的に低下した。
【００８２】
８．実施例： ＨｕＰＳＧｅｎ １３ の染色体上の位置
ＨｕＰＳＧｅｎ １３の染色体上の位置は、染色体遺伝子座６ｑ２３．２−６ｑ２３．３にマップされた。膵臓癌、腹膜の乳頭状漿液性癌、肝細胞癌、大Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、乳癌、胃癌、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含む種々の癌において、この領域における欠失が注目されている。
【００８３】
本出願には本文内に種々の刊行物が著者名および日付によって言及されている。米国特許出願第０９／６４８，３１０号を含む、本明細書に引用したすべての特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ配列および刊行物は、本明細書に記載し、請求している発明のなされた日において当業者に公知の技術水準をより十分に記述するため、参照により本出願に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ラットＰＳＧｅｎ １３遺伝子（ｒＰＳＧｅｎ １３と称する）のヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列、それぞれ配列番号１および２。オープンリーディングフレームの開始ＡＴＧおよび終止コドンを丸で囲み、またポリ（Ａ）シグナルに下線を付している。
【図２】
ヒトＰＳＧｅｎ １３遺伝子（ＨｕＰＳＧｅｎ １３と称する）のヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列、それぞれ配列番号３および４。オープンリーディングフレームの開始ＡＴＧおよび終止コドンを丸で囲み、またポリ（Ａ）シグナルに下線を付している。
【図３】
ラット（ＰＳＧｅｎ １３；配列番号１）およびヒト（ＨｕＰＳＧｅｎ １３；配列番号３）ｃＤＮＡ間のヌクレオチド配列比較。ラットＰＳＧｅｎ １３およびヒトＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子の開始および終止コドンを太字で示す。
【図４】
ラットＰＳＧｅｎ １３およびヒトＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質（それぞれ配列番号２および４）のアミノ酸配列比較。
【図５】
ＲＳＤＤおよび逆ノーザンブロッティングによって同定されたｒＰＳＧｅｎ １３の、トランスフォーメーション進行に差を示す１群の齧歯動物細胞における示差的発現。種々の段階のトランスフォーメーション進行を示す細胞のノーザンブロットを、３２Ｐで放射性標識したｒＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡ（ＲＳＤＤおよび逆ノーザンブロッティングによって最初に同定された）で釣り上げた（Ｋａｎｇら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １３７８８−１３７９３）。ノーザンブロットのレーンに左から右にかけて以下の通り表示する細胞型からＲＮＡを得た：未進行Ｅ１１細胞（Ｅ１１ （−））；進行したＥ１１−ＮＭＴ（＋）細胞； ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｆ１（−）未進行細胞（ここで「細胞型Ａ ｘ 細胞型Ｂ」はＡ型細胞とＢ型細胞の間の体細胞ハイブリッドを示す）； ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｆ２（−）未進行細胞；ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｒ１（＋）進行細胞；ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｒ２（＋）進行細胞；ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６（−）未進行細胞；ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６ＴＤ（＋）ヌードマウス腫瘍由来進行細胞；Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ ３ｂ（−）未進行細胞；Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ ＩＩａ（＋）進行細胞；Ｅ１１−ＮＭＴ ＡＺＡ Ｂ１ （−）未進行５−アザシチジン処理Ｅ１１−ＮＭＴクローン；Ｅ１１−ＮＭＴ ＡＺＡ Ｃ１（−）未進行５−アザシチジン処理Ｅ１１−ＮＭＴクローン；Ｅ１１−Ｒａｓ Ｒ１２進行細胞；およびＥ１１−ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７（ＨＰＶ−１８のＥ６およびＥ７領域によって形質転換されたＥ１１クローン）。臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色によって、ＲＮＡの等しいローディングが示されている。このデータは、Ｋａｎｇら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １３７８８−１３７９３からのものである。
【図６】
ｒＰＳＧｅｎ １３は、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞における足場非依存的増殖を抑制する。図に示す細胞型の寒天クローニング効率を、以前に記述されているように測定した（Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３９： ３０５１−３０５７； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２８１： ５９１−５９４； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃｅｌｌ １８： ６９５−７０５）。細胞型は、Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴ、およびＰＳＧｅｎ １３でトランスフェクトしたＥ１１−ＮＭＴクローン（ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３、５、６、７、８、９、１０、１１および１２と称する）を含む。３個１組のサンプルは変動が＜１０％で、レプリケートアッセイは変動が＜１５％であった。
【図７】
Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＭＮＴ−ＰＳＧ１３クローンにおけるラットＰＳＧｅｎ １３およびＧＡＰＤＨ発現のノーザンブロッティング分析。図に示す細胞型から単離された１５μｇの細胞ＲＮＡを電気泳動し、ナイロン膜に転写し、ラットＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、次に以前に記述されているようにそれを剥がしてＧＡＰＤＨで釣り上げた（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ９１２５−９１３０； Ｓｕら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６： １５１１５−１５１２０）。
【図８】
ラットＰＳＧｅｎ １３は、ＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞における足場非依存的増殖を抑制する。図に示す細胞型の寒天クローニング効率は、以前に記述されているように測定した（Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３９： ３０５１−３０５７； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２８１： ５９１−５９４； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃｅｌｌ １８： ６９５−７０５）。細胞型は、ＤＵ−１４５、ＤＵ−１４５のベクターで形質転換したクローン（ＤＵ−１４５／Ｖｅｃ）、およびラットＰＳＧｅｎ １３でトランスフェクトしたＤＵ−１４５クローン（ＤＵ−ＰＳＧ１３ ｃｌ １１、１２、１３、１４、１５および１７と称する）を含む。３個１組のサンプルは変動が＜１０％で、レプリケートアッセイは変動が＜１２％であった。
【図９】
Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＭＮＴ−ＰＳＧ１３クローンにおける全長ＰＥＧ−３プロモーター−ルシフェラーゼ活性。異なる細胞型を、５μｇの全長ＰＥＧ−Ｐｒｏｍおよび１μｇのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドを用いて共トランスフェクトし、そして４８時間後にルシフェラーゼ活性を「材料および方法」に記述したように測定した。結果はβ−ガラクトシダーゼ活性によって標準化されており、そして変動が＜１５％であった３つの独立した実験の平均を表わす。
【図１０】
Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＭＮＴ−ＰＳＧ１３クローンにおけるＶＥＧＦプロモーター−ルシフェラーゼ活性。異なる細胞型を、５μｇのＶＥＧＦ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ（Ｓｕら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６： １５１１５−１５１２０）および１μｇのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドを用いて共トランスフェクトし、そして４８時間後にルシフェラーゼ活性を「材料および方法」に記述したように測定した。結果はβ−ガラクトシダーゼ活性によって標準化されており、そして変動が＜１５％であった３つの独立した実験の平均を表わす。
【図１１】
ＨｕＰＳＧｅｎ １３は、Ｈａ−ｒａｓにより形質転換されたラット胚繊維芽細胞における単層コロニー形成を選択的に抑制した。
【図１２】
ＨｕＰＳＧｅｎ １３は、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞のトランスフォームされた表現型を、寒天中のクローニング効率の低下によって示されるように、抑制した。
本明細書に開示する発明は、米国保健福祉省からの国立衛生研究所補助金第ＣＡ３５６７５号のもとで政府の援助を得てなされた。したがって、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本出願は、米国特許出願第０９／６４８，３１０号（この内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）の一部継続出願である。
【０００３】
１．序論
本発明は、細胞が悪性表現型に向かって進行する時に該細胞中により低レベルで発現され、そのため進行によって抑制される遺伝子１３ （Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ １３： ＰＳＧｅｎ １３）と呼ばれる遺伝子に関する。本発明は、少なくとも部分的には、この新規遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質の発見、ならびに悪性腫瘍細胞へのＰＳＧｅｎ １３の導入は癌細胞増殖を抑制し、かつ悪性腫瘍および血管形成に関連する遺伝子の発現制御要素を抑制する、という発見に基づいている。
【０００４】
２．発明の背景
遺伝子発現の変化は、細胞周期の調節、分化および発生を含む正常な細胞生理学の重要な決定因子であり、そしてそれらの変化は発生異常、分化の異常なプログラム、および癌を含む異常な細胞生理学に直接寄与する（ＷａｔｓｏｎおよびＭａｒｇｕｌｉｅｓ， １９９３， Ｄｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５：７７−８６； Ｗｉｎｋｌｅｓ， １９９８， Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５８： ４１−７８； Ｆｉｓｈｅｒ （編）， １９９０， Ｍｏｄｅｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， Ｖｏｌ． １； Ｆｉｓｈｅｒ （編）， １９９０， Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， Ｖｏｌ． ２）。これらの前後関係において、示差的に発現された遺伝子の同定、クローン化および特徴づけは、増殖、発生、老化、分化および癌、等のプロセスの分子的決定因子に関する適切で重要な洞察を提供するに相違ない。
【０００５】
示差的に発現された遺伝子を同定し、そしてクローン化するためには、いくつかの方法を用いることができる。これらの方法には、サブトラクティブハイブリダイゼーション法（ＪｉａｎｇおよびＦｉｓｈｅｒ， １９９３， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｄｉｆｆｅｒ． １： ２８５−２９９； ＳｕおよびＦｉｓｈｅｒ， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ９１２５−９１３０； Ｓａｇｅｒｓｔｒｏｍら， １９９７， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６： ７５１−７８３； Ｊｉａｎｇら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０： １８５５−１８６４； Ｊｉａｎｇら， １９９５， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１： ２４７７−２４８６； Ｊｉａｎｇら， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３： ９１６０−９１６５）、ディファレンシャルＲＮＡディスプレイ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）（ ＷａｔｓｏｎおよびＭａｒｇｕｌｉｅｓ， １９９３， Ｄｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５：７７−８６； Ｗｉｎｋｌｅｓ， １９９８， Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５８： ４１−７８； ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６７−９７１； Ｓｈｅｎら， １９９５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２； ６７７８−６７８２）、恣意的にプライミングしたＰＣＲ（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）によるＲＮＡフィンガープリンティング（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら， １９９５， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ， １１： ２４２−２４６； Ｒａｌｐｈら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： １０７１０−１０７１４）、再現的差異分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＨｕｂａｎｄおよびＳｃｈａｔｚ， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ５６４０−５６４８）、遺伝子発現の連続分析（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０： ４８４−４８７； Ｚｈａｎｇら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： １２６８−１２７２）、電子工学的サブトラクション法（Ｗａｎら， １９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １４： １６８５−１６９１； Ａｄａｍｓら， １９９３， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ４： ２５６−２６７）およびコンビナトリアル遺伝子マトリックス分析（Ｓｃｈｅｎａら， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０： ４６７−４７０）が含まれる。
【０００６】
ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ （１９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６７−９７１）によって開発されたＤＤＲＴ−ＰＣＲアプローチは、示差的に発現された遺伝子を分析し、クローン化するうえで広い人気を獲得した。ＤＤＲＴ−ＰＣＲは、少量のＲＮＡ（約５μｇ）を用いて膨大な数（重複が起こらなければ＞２０，０００）のｍＲＮＡ種を分析することができる強力な方法である（同文献）。ＤＤＲＴ−ＰＣＲは、組織生検等のようなＲＮＡ供給源が限定されている場合は、しばしば優れた方法である。ＤＤＲＴ−ＰＣＲの直接的利点は、示差的に発現された遺伝子を、アップレギュレーションされたものもダウンレギュレーションされたものも両方とも、同一の反応で同定し、単離する能力である。さらに、ＤＤＲＴ−ＰＣＲ技法は、同一ゲル中で多数のサンプルのディスプレイを可能とする。これは、ＲＮＡ種中で特異的な診断上の変化を明確にするうえで、および遺伝子発現の変化を時間的に分析するために有用である。
【０００７】
しかし、ＤＤＲＴ−ＰＣＲ技法に問題がないわけではない（Ｄｅｂｏｕｃｋ， １９９５， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６： ５９７−５９９）。標準的ＤＤＲＴ−ＰＣＲを用いる際に遭遇する困難には、偽陽性および重複した遺伝子同定の高い発生率、貧弱な再現性、バイアスがかかった遺伝子ディスプレイ、およびクローン化されたｃＤＮＡに関する機能情報の欠如が含まれる。さらに、貧弱な分離は、示差的に発現された量の少ない遺伝子を、高発現された遺伝子が発生する強いシグナルの下に隠してしまう場合がある。偽陽性および重複の発生は非常に問題となりうる。そして、適切な示差的発現および単離されたｃＤＮＡの独自性を確認するために資源の過度の消費をもたらす。ｃＤＮＡは、ゲルから純粋な形で単離され（多重配列によるバンドの汚染はクローン同定を複雑にする）、再度増幅され、適切なクローニングベクター中に挿入され、真正な示差的発現について分析され、そして最後に配列決定される必要がある。標準的ＤＤＲＴ−ＰＣＲアプローチの有するこれらの制限は、示差的に発現された遺伝子をより効率的かつ選択的に同定するためにこの方法を改善する必要性をきわだたせる。
【０００８】
サブトラクティブハイブリダイゼーション（テスターとドライバーの間でハイブリダイゼーションを行い、次に共通の遺伝子産物を選択的に除去する）は、テスターｃＤＮＡ集団中の独自の遺伝子産物を富化し、そして豊富な共通のｃＤＮＡを減少させる（Ｓａｇｅｒｓｔｒｏｍら， １９９７， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６： ７５１−７８３）。サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーを分析して、ランダムにコロニーをピッキングすることによって、またはディファレンシャルスクリーニングによって、示差的に発現された遺伝子を同定し、クローン化することが可能である（Ｒａｎｇｎｅｋａｒら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ６２４０−６２４８； Ｗｏｎｇら， １９９７， Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９： ７−１６； ＭａｓｅｒおよびＣａｌｖｅｔ， １９９５， Ｓｅｍｉｎ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １５： ２９−４２）。サブトラクティブハイブリダイゼーションをうまく用いて多数の示差的に発現された遺伝子がクローン化されてきたが（ＪｉａｎｇおよびＦｉｓｈｅｒ， １９９３， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｄｉｆｆｅｒ． １： ２８５−２９９； Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ９１２５−９１３０； Ｊｉａｎｇら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０： １８５５−１８６４； Ｊｉａｎｇら， １９９５， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１： ２４７７−２４８６）、このアプローチは多大な労力を要し、そして変化した発現を示す遺伝子の全ての単離をもたらすものではない（Ｓａｇｅｒｓｔｒｏｍら， １９９７， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６： ７５１−７８３； Ｗａｎら， １９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４： １６８５−１６９１）。
【０００９】
原則として、サブトラクトしたＲＮＡまたはｃＤＮＡサンプルを用いて実施したＤＤＲＴ−ＰＣＲは、アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた遺伝子産物をクローン化するための強力な戦略を提供するに相違ない。このアプローチは、両方の技法の有利な点を組合わせるもので、独自配列の富化および共通配列の減少または消去をもたらすに相違ない。また、この方法はディスプレイゲル上のバンドの複雑性を一貫して減少させ、それによってｃＤＮＡのより明確な分離を可能とし、その結果、偽陽性反応をより少なくするに相違ない。さらに、より少ない数のプライマーセットを用いて逆転写およびＰＣＲ反応を行って、示差的に発現される遺伝子の全範囲を分析することが可能であるに相違ない。遺伝子同定および単離にとって特に重要なのは、強い共通遺伝子産物によって隠されている稀な遺伝子産物が、ＤＤＲＴ−ＰＣＲと組合わせてサブトラクティブハイブリダイゼーションを用いることによってディスプレイされるということである。さらに、サブトラクティブライブラリーを用いたＤＤＲＴ−ＰＣＲアプローチは、示差的に発現された遺伝子のサブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーを効率的にスクリーニングするためにも貴重であることを実証できるであろう。しかし、サブトラクティブハイブリダイゼーションとＤＤＲＴ−ＰＣＲの組合わせが上記の理由によって魅力的に思われようと、このアプローチを使おうとした以前の試みは、生成されるシグナルの複雑さを一貫して減少させることにおいて，標準的ＤＤＲＴ−ＰＣＲ法と比較して、最低限の成功をもたらしたにすぎないことを実証した（Ｈａｋｖｏｏｒｔら， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ８７８−８７９）。
【００１０】
Ｋａｎｇら（１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １３７８８−１３７９３）は、ＤＤＲＴ−ＰＣＲの複雑さを効率的に、かつ一貫して減少させ、そして予想された示差的発現を示す遺伝子の同定およびクローン化をもたらす、相互サブトラクションディファレンシャルＲＮＡディスプレイ（ＲＳＤＤ）アプローチを用いた。ＲＳＤＤのために用いられたモデルは、アデノウイルスによって形質転換されたラット胚細胞系Ｅ１１であった。この細胞は、無胸腺症ヌードマウスに注入し、細胞培養物中で再確立すると（Ｅ１１−ＮＭＴ）、攻撃的な発癌進行表現型を獲得する（Ｓｕ ＆ Ｆｉｓｈｅｒ， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ９１２５−９１３０； Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（編）Ａｄｏｌｐｈ， Ｋ．Ｗ． （Ａｃａｄｅｍｉｃ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ）， Ｖｏｌ． １， ｐｐ． ６８−１０２に掲載のＲｅｄｄｙら， １９９３；Ｂａｂｉｓｓら， １９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８： １０９９−１１０１）。ヌードマウスへのＥ１１細胞の注入は、腫瘍潜伏時間約３５−４０日で１００％の動物に腫瘍をもたらし、他方、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞は腫瘍潜伏時間約１５−２０日で１００％のヌードマウス中に腫瘍を形成する（同文献）。さらに、Ｅ１１細胞は寒天中で約３％の効率でコロニーを形成し、他方、Ｅ１１−ＮＭＴは＞３０％の寒天クローニング効率を示す（同文献）。増大した腫瘍形成性および増強された足場非依存的表現型が、Ｅ１１／Ｅ１１−ＮＭＴモデル系における腫瘍進行の重要なインジケーターである（同文献）。
【００１１】
前出のＫａｎｇらは、ＲＳＤＤは進行したラット腫瘍細胞中で発現の上昇を示す遺伝子［すなわち、進行によって促進される遺伝子（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｅｌｅｖａｔｅｄ ｇｅｎｅ： ＰＥＧｅｎ遺伝子）］および進行した腫瘍細胞中で発現の抑制を示す遺伝子［すなわち、進行によって抑制される遺伝子（ＰＳＧｅｎ遺伝子）］の同定をもたらしたと報告している。Ｋａｎｇらによって同定されたラット遺伝子の１つは、（ラット）ＰＳＧｅｎ １３（発明者Ｆｉｓｈｅｒらによる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０４３２３も参照されたい）であるが、全長ｃＤＮＡは単離されておらず、したがってその配列も、それによってコードされるタンパク質の配列も報告されていなかった。本発明は、完全なラットおよびヒトＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡのクローニングおよび特徴づけに関するものであり、それらの核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を提供し、そしてさらにＰＳＧｅｎ １３のレベルの上昇が悪性表現型に対して有する抑制効果を実証するものである。
【００１２】
３．発明の概要
本発明は、進行によって抑制される遺伝子１３ （ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクター、単離されたＰＳＧｅｎ１３タンパク質、ならびに癌細胞および／または新血管形成を阻止するため、そして結果的に癌患者を治療するためにこれらの分子を使用する方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的には、ラットおよびヒトＰＳＧｅｎ １３をコードする完全なｃＤＮＡのクローニングおよび特徴づけ、ならびにＰＳＧｅｎ １３の発現レベルの上昇はトランスフォームされた表現型を抑制することができ、かつ癌進行および血管新生に関連するプロモーター要素を抑制することができる、という発見に基づいている。本発明はさらに、ヒトＰＳＧｅｎ １３の染色体上の位置は、その観察された腫瘍抑制活性と一致して、種々の癌を患う患者において欠失を含むことが観察された領域であるという発見に基づいている。
【００１３】
種々の実施形態において、本発明は癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。この方法は、該癌細胞を、該癌細胞の増殖を阻止するように、十分な量のＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質またはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター化合物と接触させることを含む。本発明はまた、被験者における癌を治療する方法を提供する。この方法は、被験者の細胞を、該細胞にＰＳＧｅｎ １３タンパク質を発現させるように、十分な量のＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸と接触させ、それによって該被験者の癌を治療することを含む。
【００１４】
３．１． 定義
ＤＮＡ「コード配列」または特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれた時に、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列をいう。コード配列の境界は、５’−（アミノ）末端の開始コドンおよび３’−（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、限定するものではないが、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）供給源由来のゲノムＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ、および合成核酸配列をも含むことができる。転写終止配列は、通常コード配列の３’末端側に位置する。
【００１５】
ＤＮＡ「制御配列」という用語は、宿主中のコード配列の転写および翻訳を集合的に提供するプロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、エンハンサー等、ならびに５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）の総称である。
【００１６】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合してコード配列をｍＲＮＡに転写する時、細胞中でコード配列の「転写を指令する」。次に、ｍＲＮＡはコード配列によってコードされたポリペプチドに翻訳される。
【００１７】
本明細書に用いる「エンハンサー要素」という用語は、関心のある治療遺伝子の転写速度を増大させるが、プロモーター活性をもたないヌクレオチド配列をいう。
【００１８】
本明細書に用いる「遺伝子」という用語は、産物を直接的または間接的にコードする核酸をいう。例えば、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードするｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（ＰＳＧｅｎ １３をコードするｍＲＮＡがそこから転写されうる）が遺伝子と見なされると同じように、「ＰＳＧｅｎ １３遺伝子」と見なされるであろう。
【００１９】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域とは、天然においては他方の分子と会合して見出されることはない別のＤＮＡ分子の内部の、またはそれに連結された、識別可能なＤＮＡのセグメントである。異種コード配列の１例は、コード配列自体（例：ＰＳＧｅｎ １３突然変異体をコードする配列またはＰＳＧｅｎ １３をコードする核酸の断片）が天然に見いだされない構築物である（例：天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、異種構造遺伝子およびＰＳＧｅｎ １３をコードする遺伝子またはそのような遺伝子の一部を含み、組織特異的プロモーターに連結されているキメラ配列は、同一の遺伝子に由来しようと異なる遺伝子に由来しようと、異種と考えられるであろう。なぜなら、そのようなキメラ構築物は通常天然には見いだされないからである。対立遺伝子変異または天然に存在する突然変異現象は、本明細書に用いる意味でのＤＮＡの異種領域を生じさせない。
【００２０】
本明細書に用いる「核酸分子」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み、そして別途特定されていない場合は、２本鎖および１本鎖核酸の両方を含む。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド等のハイブリッドもまた含まれる。核酸配列への言及は、改変が該核酸によるリガンド（タンパク質等）の結合またはワトソン−クリック型塩基対合を重大な程度に妨げない限り（そのような妨げが意図されたものであるか、または望ましいものである場合を除いて）、改変された塩基も含みうる。
【００２１】
「機能しうる形で連結された」という表現は、上述の構成要素がそれらの通常の機能を達成するように配列されたヌクレオチド配列要素の配置をいう。このようにして、コード配列に機能しうる形で連結された制御配列は、コード配列の発現を果たすことができる。制御配列は、コード配列の発現を導くように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される配列がプロモーター配列とコード配列の間に介在することが可能であり、そしてこのような場合も該プロモーター配列はコード領域に「機能しうる形で連結されている」と考えることができる。
【００２２】
２つのＤＮＡまたはポリペプチド配列は、分子のある規定された長さにわたってヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％（好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％）が一致する場合、「実質的に相同」である。本明細書に用いる「実質的に相同」という用語はまた、特定されたＤＮＡまたはポリペプチド配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す配列をもいう。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系について規定されるストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なストリンジェント条件を規定することは、当技術分野における技術の範囲内である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００２３】
本明細書に用いる「治療遺伝子」という用語は、癌細胞に対して治療（例：増殖を抑制する、分化させる、および／またはアポトーシスを誘導する）効果を発揮することができる、または細胞内である機能の発現に対して調節効果を有する機能性タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを意味する。
【００２４】
細胞は、細胞膜内または、細菌の場合は、細胞壁内に外因性ＤＮＡが導入され場合、外因性ＤＮＡによって「形質転換」または「トランスフォーム」されている。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを作っている染色体ＤＮＡに組み込まれていても（すなわち、共有結合していても）、組み込まれていなくてもよい。例えば、原核生物および酵母においては、外因性ＤＮＡはプラスミド等のエピソーム性要素上に保持されうる。真核細胞においては、安定に形質転換された細胞とは、一般に、染色体複製を介して娘細胞によって外因性ＤＮＡが受け継がれるように外因性ＤＮＡが染色体内に組み込まれている細胞、または安定に保持された染色体外プラスミドを含む細胞である。この安定性は、細胞系または該外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなるクローンを樹立する真核細胞の能力によって示される。
【００２５】
４．図面の説明
（図面の簡単な説明については下記参照）
５．発明の開示
本発明の限定を目的とするものではないが、開示を明確にするために、発明の詳細な説明を以下の分節に分ける：
（ｉ） ＰＳＧｅｎ １３核酸；
（ｉｉ） ＰＳＧｅｎ １３タンパク質；
（ｉｉｉ） ＰＳＧｅｎ １３タンパク質に対する抗体；および
（ｉｖ） ＰＳＧｅｎ １３の使用。
【００２６】
５．１ ＰＳＧｅｎ １３ 核酸
本発明は、ＰＳＧｅｎ遺伝子および関連分子を含めて、ＰＳＧｅｎ １３核酸を提供する。「ＰＳＧｅｎ １３」という用語は、種に関わりなく、ＰＳＧｅｎ １３分子をいう。
【００２７】
特定の非限定的実施形態において、本発明は、図１および配列番号１または配列番号５に示す配列を有し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ； １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９に所在する機関）に寄託され、受託番号 ＰＴＡ−２４１４を付与されたラットＰＳＧｅｎ １３（ｒＰＳＧｅｎ １３）遺伝子、およびそれと実質的に相同な分子を提供する。この寄託物は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドベクターのＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ Ｉクローニング部位に挿入されたｒＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡインサートである。このインサートは、長さが約０．８ ｋｂである。上記プラスミドのセンス鎖プロモーターは、Ｔ７である。このプラスミドは、アンピシリンおよびネオマイシン耐性遺伝子を担持している。上記インサートの起源は、ＥＳＴクローンＡＴＣＣ ＃２００５７７７（下記参照）である。該ｃＤＮＡを単離するのに用いたラット組織は、副腎組織であった。
【００２８】
他の特定の非限定的実施形態において、本発明は、図２および配列番号３または配列番号６に示す配列を有し、そしてＡＴＣＣに寄託され、受託番号 ＰＴＡ−２４１３を付与されたヒトＰＳＧｅｎ １３（ＨｕＰＳＧｅｎ １３）遺伝子、およびそれと実質的に相同な分子を提供する。この寄託物は、プラスミドベクターｐＴ７Ｔ３−Ｐａｃ内に挿入されたインサートである。このインサートはＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔ Ｉクローニング部位内に挿入されている。このインサートは、長さが約０．８３ ｋｂである。上記プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を担持している。上記インサートの起源は、ＥＳＴクローンＡＴＣＣ ＃２５２５２６２（下記参照）である。該ＤＮＡを単離するのに用いたヒト組織は、ヒト腎組織であった。
【００２９】
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子および／またはＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子とハイブリダイズするであろう核酸を提供する。ストリンジェントな条件下とは、例えば、０．５ Ｍ ＮａＨＰＯ４， ７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）， １ ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中で６５℃でハイブリダイゼーション、および０．１ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で６８℃で洗浄、等である（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ． ２．１０．３）。したがって、本発明は、非ヒト霊長類動物、マウス、またはウシのＰＳＧｅｎ １３遺伝子を含む、他の生物種のＰＳＧｅｎ １３遺伝子、ならびに核酸プローブおよびアンチセンス分子（これらは、例えば、トランスフォームされた表現型を確認するために用いることができるであろう）を包含する。
【００３０】
本発明はまた、図１および２ならびに配列番号２および４に示すｒＰＳＧｅｎ １３およびＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸をも提供する。また、このようなＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【００３１】
図１および２に示す核酸配列は、標準的技法を用いた増幅によってＰＳＧｅｎ １３遺伝子を得るために使用可能なプライマー分子を同定するのに用いることができる。
【００３２】
本発明は、ｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子またはＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子等のＰＳＧｅｎ １３遺伝子を発現可能な形で提供する。「発現可能な形」とは、転写および／または翻訳にとって必要な要素および制御配列を含む形である。例えば、ＰＳＧｅｎ １３遺伝子は、適切なプロモーター要素（これはＰＳＧｅｎ １３プロモーターまたは異種プロモーターであってよい）に機能しうる形で連結されていて、そしてエンハンサー要素、転写開始および終止部位、核局在化配列をコードする核酸、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、ｍＲＮＡ安定化配列、等を含むことができる。
【００３３】
原核生物における発現を除外するわけではないが、好ましい実施形態において、本発明はｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子またはＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子等のＰＳＧｅｎ １３遺伝子を真核細胞中で発現可能な形で提供する。したがって、ＰＳＧｅｎ １３遺伝子は、例えば真核細胞中で活性なプロモーター要素と機能しうる形で連結されているとよい。適切なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、ヒト延長因子１αプロモーター、ヒトユビキチンｃプロモーター、等が含まれる。本発明の特定の実施形態においては、誘導性プロモーターを使用することが望ましい場合がある。誘導性プロモーターの非限定的例としては、マウス乳癌ウイルスプロモーター（デキサメタゾンで誘導可能）；市販のテトラサイクリン応答性またはエクダイソン誘導性プロモーター、等が含まれる。本発明の特定の非限定的実施形態において、プロモーターは、前立腺特異的抗原遺伝子プロモーター（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら， ２００， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ４５： １４９−１５７）、カリクレイン２遺伝子プロモーター（Ｘｉｅら， ２００１， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２： ５４９−５６１）、ヒトα−フェトプロテイン遺伝子プロモーター（Ｉｄｏら， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： ３１０５−３１０９）、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子プロモーター（Ｔａｋａｋｕｗａら， １９９７， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８８： １６６−１７５）、ヒト癌胎児性抗原遺伝子プロモーター（Ｌａｎら， １９９６， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． １１１： １２４１−１２５１）、ガストリン放出ペプチド遺伝子プロモーター（Ｉｎａｓｅら， ２０００， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８５： ７１６−７１９）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子プロモーター（ＰａｎおよびＫｏｅｎｍａｎ， １９９９， Ｍｅｄ． Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ ５３： １３０−１３５）、ヘキソキナーゼＩＩ遺伝子プロモーター（Ｋａｔａｂｉら， １９９９， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １０： １５５−１６４）、Ｌ−プラスチン遺伝子プロモーター（Ｐｅｎｇら， ２００１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１： ４４０５−４４１３）、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター（Ｔａｎａｋａら， ２００１， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２１： ２９１−２９４）、ミドカイン遺伝子プロモーター（Ａｄａｃｈｉら， ２０００， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０： ４３０５−４３１０）、ヒトムチン遺伝子ＭＵＣ１プロモーター（Ｓｔａｃｋｈｏｕｓｅら， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６： ２０９−２１９）、および膵臓癌細胞中で特に活性である（Ｐｅｒｒａｉｓら， ２００１； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． によって２００１年６月１９日に”ＪＢＣ Ｐａｐｅｒｓ ｉｎ Ｐｒｅｓｓ”に原稿Ｍ１０４２０４２００として刊行された）ヒトムチン遺伝子ＭＵＣ４プロモーター（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＡＦ２４１５３５）、等のように癌細胞中で選択的に活性であってよい。
【００３４】
ｒＰＳＧｅｎ １３およびＨｕＰＳＧｅｎ １３アミノ酸配列をコードする配列を（最初の寄託者が気付かないままに）含むエクスプレスド・シーケンス・タグ（ＥＳＴ）クローンが、米国特許出願第０９／６４８，３１０号の出願日前にＡＴＣＣに寄託され、それぞれ２００５７７７および２５２５２６２という受託番号を付与されていたことに注意しなければならない。これらのクローンは、本発明において完全なｒＰＳＧｅｎ １３およびＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子を特徴づけ、クローン化するのに使用された（下記の分節６参照）。しかし、上記ＥＳＴが寄託された時、これらの完全な遺伝子は公知ではなく、また上記ＥＳＴによってコードされるタンパク質の正体または機能はいずれも公知ではなかった。
【００３５】
真核細胞中で機能するプロモーター要素に機能しうる形で連結されたｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子またはＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子等のＰＳＧｅｎ １３核酸は、例えば、他の発現関連要素、抗生物質耐性に関連する遺伝子、等と共にベクター分子中に包含されていてよい。適切なベクター分子の例としては、限定するものではないが、ウイルスに基づくベクターおよびウイルスに基づかないＤＮＡまたはＲＮＡデリバリー系が含まれる。ウイルスに基づく遺伝子導入ベクターの適切な例としては、限定するものではないが、レトロウイルス由来のもの、例えばＬＸ、ＬＮＳＸ、ＬＮＣＸまたはＬＸＳＮなどのモロニーマウス白血病ウイルスに基づくベクター（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ， １９８９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７： ９８０−９８９）； レンチウイルス由来のもの、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づくベクター（Ｃａｓｅら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６： ２２９８８−２９９３； Ｃｕｒｒａｎら， ２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒ． １： ３１−３８； Ｏｌｓｅｎ， １９９８， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： １４８１−１４８７； 米国特許第６，２５５，０７１号および第 ６，０２５，１９２号）；アデノウイルス由来のもの（Ｚｈａｎｇ， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６（２）： １１３−１３８； Ｃｏｎｎｅｌｌｙ， １９９９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １（５）： ５６５−５７２； Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， １９９０， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １： ２４１−２５６； Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： ４３１−４３４； Ｗａｎｇら， １９９１， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３０９： ６１−６６； Ｊａｆｆｅら， １９９２， Ｎａｔ． Ｇｅｎ． １： ３７２−３７８； Ｑｕａｎｔｉｎら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９： ２５８１−２５８４； Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら， １９９２， Ｃｅｌｌ ６８： １４３−１５５； Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら， １９９３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９１： ２２５−２３４； Ｒａｇｏｔら， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３６１： ６４７−６５０； Ｈａｙａｓｋｉら， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ２３８７２−２３８７５； Ｂｅｔｔら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１： ８８０２−８８０６）、例えばＡｄ５／ＣＭＶに基づくＥ１欠失ベクター（Ｌｉら， １９９３， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４： ４０３−４０９）；アデノ随伴ウイルス由来のもの、例えばｐＳｕｂ２０１に基づくＡＡＶ２由来ベクター（Ｗａｌｓｈら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９： ７２５７−７２６１）；単純ヘルペスウイルス由来のもの、例えばＨＳＶ−１に基づくベクター（ＧｅｌｌｅｒおよびＦｒｅｅｓｅ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７： １１４９−１１５３）； バキュロウイルス由来のもの、例えば、ＡｃＭＮＰＶに基づくベクター（ＢｏｙｃｅおよびＢｕｃｈｅｒ， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９３： ２３４８−２３５２）； ＳＶ４０由来のもの、例えばＳＶｌｕｃ （ＳｔｒａｙｅｒおよびＭｉｌａｎｏ， １９９６， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３： ５８１−５８７）； エプスタイン−バーウイルス由来のもの、例えばＥＢＶに基づくレプリコンベクター（Ｈａｍｂｏｒら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８５： ４０１０−４０１４）； アルファウイルス由来のもの、例えばセムリキ森林熱ウイルスまたはシンドビスウイルスに基づくベクター（Ｐｏｌｏら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９６： ４５９８−４６０３）； ワクシニアウイルス由来のもの、例えば改変ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）に基づくベクター（ＳｕｔｔｅｒおよびＭｏｓｓ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９： １０８４７−１０８５１）、またはヒト腫瘍細胞に効率的に形質導入することができ、かつ治療上の効果に必要とされる核酸配列を収容することができる、任意の他のクラスのウイルスに由来するベクターが含まれる。特定の実施形態にとっては、シャトルベクターを用いることが望ましいであろう。
【００３６】
本発明は、適切なキャリアー中に上記ＰＳＧｅｎ １３核酸を含む組成物を提供する。治療用途のために、本発明は、例えば発現可能な形でベクター中に包含され、適切な医薬キャリアーに担持された、治療的量のＰＳＧｅｎ １３核酸を提供する。
【００３７】
本発明はまた、例えばベクター中に包含された、上記のＰＳＧｅｎ １３核酸を含む原核または真核宿主細胞を提供する。宿主細胞は、限定するものではないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞を含む、原核細胞または真核細胞であってよい。宿主細胞は悪性細胞であっても非悪性細胞であってもよい。本発明の特定の非限定的実施形態においては、宿主細胞は、例えば鼻咽頭腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、中枢神経系腫瘍細胞（例：神経芽腫、星状細胞腫、または多形性神経膠芽腫細胞）、黒色腫細胞、上皮腫瘍細胞、非上皮腫瘍細胞、血液腫瘍細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、神経芽腫細胞、子宮頸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、泌尿性器癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、骨肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、胃癌細胞または膵臓癌細胞を含むヒト腫瘍細胞であってよい。
【００３８】
５．２ ＰＳＧｅｎ １３ タンパク質
本発明は、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明は、図１に示すｒＰＳＧｅｎ １３タンパク質であって、配列番号２に示す配列を有する該タンパク質、およびそれと実質的に相同なタンパク質を提供する。別の特定の実施形態において、本発明は、図２に示すＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質であって、配列番号４に示す配列を有する該タンパク質、およびそれと実質的に相同なタンパク質を提供する。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明は、上記ＰＳＧｅｎ １３核酸によってコードされる、および／または以下に記述するｒＰＳＧｅｎ １３タンパク質および／またはＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質に対する抗体と交差反応するＰＳＧｅｎ １３タンパク質を提供する。したがって、ヒトおよびラットのＰＳＧｅｎ １３タンパク質に加えて、本発明はウシタンパク質、マウスタンパク質、および非ヒト霊長類動物ＰＳＧｅｎ １３タンパク質を提供する。
【００４０】
ＰＳＧｅｎ １３タンパク質は、天然の供給源から調製することも、化学的に合成することも、または遺伝子組換え技法によって生産することも可能である。例えば、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質は、適切な発現ベクターに含まれるＰＳＧｅｎ １３遺伝子を発現させることによって生産することができる。ＰＳＧｅｎ １３タンパク質は、標準的技法を用いて真核または原核細胞発現系中に発現させることができる。真核細胞発現系を用いる場合は、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸（好ましくは、ベクター中に発現可能な形で含まれる）を任意の標準的技法（トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、等を含む）を用いて真核細胞中に導入することができる。
【００４１】
本発明は、適切なキャリアー中に上記ＰＳＧｅｎ １３タンパク質を含む組成物を提供する。治療上の使用のためには、本発明は適切な医薬キャリアーに担持させた治療的量のＰＳＧｅｎ １３タンパク質を提供する。
【００４２】
５．３ ＰＳＧｅｎ １３ タンパク質に対する抗体
本発明は、本明細書に記述するＰＳＧｅｎ １３タンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。特定の実施形態において、該抗体は、図１および配列番号２に示す配列を有するｒＰＳＧｅｎ １３タンパク質と特異的に結合する。別の特定に実施形態において、該抗体は、図２および配列番号４に示す配列を有するＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質と特異的に結合する。そのような抗体は、ある場合には、異なる生物種に由来する数種のＰＳＧｅｎ １３タンパク質と交差反応する。
【００４３】
上記抗体は、限定するものではないが、例えばヒト抗体、マウス抗体、非ヒト霊長類動物抗体、ウシ抗体、ヒツジ抗体、ヤギ抗体、またはラット抗体であってよい。特定の非限定的実施形態において、抗体はマウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化霊長類動物モノクローナル抗体、またはヒト化ラットモノクローナル抗体であってよい。
【００４４】
本発明によれば、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質、その断片または他の誘導体（例えばヒスチジンタグを付けたタンパク質）またはその類似体を、抗体を作製するための免疫原として用いることができる。そのような抗体は、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーを含む。特定の実施形態においては、ｒＰＳＧｅｎ １３またはＨｕＰＳＧｅｎ １３を認識する抗体が作製される。
【００４５】
ＰＳＧｅｎ １３タンパク質と特異的に結合するポリクローナル抗体の作製には、当技術分野で公知の種々の技法を用いることができる。抗体を作製するためには、天然のＰＳＧｅｎ １３タンパク質、もしくはその合成タンパク質、またはその誘導体（例えばフラグメント）を注射することによって種々の宿主動物（限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、等を含む）を免疫することができる。宿主の種によって種々のアジュバントを用いて免疫応答を増大させることができる。これらのアジュバントには、限定するものではないが、フロインド（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、等の界面活性物質、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等の潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。
【００４６】
ＰＳＧｅｎ １３タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製するためには、培養下の連続した細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いることができる。そのような技法の例としては、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｒｉｎ （１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７）によって最初に開発されたハイブリドーマ技法、ならびにトリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６ に掲載のＣｏｌｅら， １９８５）が含まれる。本発明のさらなる実施形態においては、近年の技術（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５）を用いて、無菌動物中にモノクローナル抗体を産生させることができる。本発明によれば、ヒト抗体を用いることができ、かつヒトハイブリドーマを用いることによって（Ｃｏｌｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０： ２０２６−２０３０）、またはＥＢＶウイルスを用いてヒトＢ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで形質転換することによって（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６ に掲載のＣｏｌｅら， １９８５）ヒト抗体を得ることができる。さらに、本発明によれば、「キメラ抗体」の作製のために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１： ６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ４５２−４５４）を用いて、ＰＳＧｅｎ １３に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子とスプライシングすることによって抗体を作製することができる；そのような抗体は本発明の範囲内にある。
【００４７】
本発明によれば、１本鎖抗体の作製のために記述された技法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適合させてＰＳＧｅｎ １３特異的１本鎖抗体を作製することができる。本発明のさらなる実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために記述された技法（Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｎｅｃｅ ２４６： １２７５−１２８１）を用いて、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質誘導体または類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定を可能とする。
【００４８】
分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントを公知の技法によって作製することができる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作製することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製できるＦａｂ’フラグメント；抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製できるＦａｂフラグメントが含まれる。
【００４９】
本発明は、本明細書に記述する抗体およびキャリアーを含む組成物を提供する。本発明の特定の実施形態において、この組成物は医薬組成物である。
【００５０】
本発明による抗体は、例えばＰＳＧｅｎ １３タンパク質の精製に、または存在するＰＳＧｅｎ １３タンパク質の量を検出または測定する診断方法（細胞中のＰＳＧｅｎ １３タンパク質の量は、細胞がトランスフォームされた表現型に向かって進行するにつれて減少するであろう）に用いることができる。
【００５１】
５．４ ＰＳＧｅｎ １３ の使用
本発明は、悪性細胞のトランスフォームされた表現型を抑制するためのＰＳＧｅｎ １３の使用に関する。トランスフォームされた表現型の指標としては、限定するものではないが、細胞増殖、形態、接触阻止の欠如、形質転換関連遺伝子の発現の増大、分化特異的遺伝子の発現の減少、足場非依存的増殖能、老化またはアポトーシスの開始の欠如、腫瘍を形成し転移する傾向、等が含まれる。ＰＳＧｅｎ １３の効果は、ＰＳＧｅｎ １３核酸を発現可能な形で悪性細胞中に導入することによって、および／またはＰＳＧｅｎ １３タンパク質もしくはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター物質（下記参照）を導入することによって伝達されうる。
【００５２】
したがって本発明は、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質またはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター物質に癌細胞を接触させることを含む、癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。ＰＳＧｅｎ １３アクチベーター物質とは、細胞中に存在するＰＳＧｅｎ １３のレベルを上昇させるものである。例えば、プロモーターの活性化によってＰＳＧｅｎ １３遺伝子の転写を誘導する物質、またはＰＳＧｅｎ １３タンパク質もしくはｍＲＮＡの半減期を増大させる物質である。特定の実施形態においては、癌細胞はヒト癌細胞である。特定の非限定的実施形態において、本発明は、ヒト癌細胞を有効量のｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎ １３核酸（発現可能な形の）、またはｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎタンパク質に暴露することを含む、ヒト癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。例えば、限定するものではないが、ヒト癌細胞は鼻咽頭腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、中枢神経系腫瘍細胞（例：神経芽腫、星状細胞腫、または多形性神経膠芽腫細胞）、黒色腫細胞、上皮腫瘍細胞、非上皮腫瘍細胞、血液腫瘍細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、神経芽腫細胞、子宮頸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、泌尿性器癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、骨肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、胃癌細胞または膵臓癌細胞であることができる。
【００５３】
関連する実施形態において、本発明は、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質またはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター物質の治療上有効量を癌を患う被験者に投与することを含む、被験者を治療する方法を提供する。特定の非限定的実施形態において、被験者はヒトである。特定の非限定的実施形態において、本発明は、ｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎ １３核酸（発現可能な形の）またはｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質の治療上有効量を、癌を患うヒト被験者に投与することを含む、ヒト被験者の治療方法を提供する。例えば、治療されるべき癌は、鼻咽頭腫瘍、甲状腺腫瘍、中枢神経系腫瘍（例：神経芽腫、星状細胞腫、または多形性神経膠芽腫）、黒色腫、脈管癌、血管癌（例：血管腫、血管肉腫）上皮腫瘍、非上皮腫瘍、血液腫瘍、白血病、リンパ腫、神経芽腫、子宮頸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、肝癌、泌尿性器癌、卵巣癌、精巣癌、骨肉腫、軟骨肉腫、胃癌または膵臓癌であることができる。
【００５４】
ＰＳＧｅｎ １３核酸は、限定するものではないが、例えばベクター介在エントリー（例：感染）、リポソーム（例：ＤＣ−コレステロールリポソーム、カチオン性リポソーム、センダイウイルス外被タンパク質を含有するリポソーム）、イミダゾリウム脂質（例えば、２００１年６月１２日に発行されたＷａｎｇらによる米国特許第６，２４５，５２０号参照）、カチオン性脂質（例えば、２００１年５月２２日に発行されたＷａｎｇらによる米国特許第６，２３５，３１０号参照）、リポフェクション、アシアロ糖タンパク質ポリ（Ｌ）リシン複合体、および微小泡（例えば、２００１年６月１２日に発行されたＰｏｒｔｅｒらによる米国特許第６，２４５，７４７号参照）を用いる、当技術分野で公知の任意の方法によって導入することができる。ＰＳＧｅｎ １３タンパク質は、リポソーム、微小球体、または飲作用または食作用を容易にするビヒクル等の処方物を用いる方法を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって細胞に導入することができる。
【００５５】
被験者は、任意の適切な経路（腫瘍内点滴注入、静脈内、動脈内、鞘内、筋肉内、皮内、皮下、等を含む）によって治療上有効量のＰＳＧｅｎ １３遺伝子またはタンパク質を投与され得る。治療上有効量のこれらの作用物質は、下記の成果のうち１つ以上をもたらす：すなわち、腫瘍塊の減少、癌細胞数の減少、血清腫瘍マーカーの減少、腫瘍転移の減少、血管新生の減少、灌流の減少、腫瘍増殖速度の低下、臨床症状の改善、および／または患者の生存率の増大である。適切な場合は、最初に癌を外科的に処置して腫瘍塊を取り除いてもよい。
【００５６】
５．４．１ 潜在的標的細胞の同定
特定の癌が本発明の方法にとって適切な標的であるかどうかを評価することが望ましいであろう。そのような評価は、例えば、ＰＳＧｅｎ １３遺伝子（発現可能な形の）またはタンパク質を被験癌細胞に導入し、そして該細胞のトランスフォームされた表現型が抑制されるかどうかを、例えば、該細胞の増殖能および／または軟寒天中にコロニーを形成する該細胞の能力を試験することによって確認することにより行うことができる。
【００５７】
下記の分節６に、ＰＳＧｅｎ １３が進行関連遺伝子ＰＥＧ３に関連するプロモーターであるＰＥＧ３プロモーター［例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７１９９、公開番号ＷＯ ９９／４９８９８（１９９９年１０月７日に英語で公開；参照によりここに組み入れる）に記載されているＰＥＧ３プロモーター、およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３５１１３０参照］の活性を抑制することを示すデータを提示する。該プロモーターの活性は、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を用いてモニターされた。この発見に基づいて、本発明は、癌細胞がＰＥＧ３レベルの上昇を示すかどうかを確認することによって、ＰＳＧｅｎ １３の推定される治療標的を同定する方法を提供する。本発明の方法は、ＰＳＧｅｎ １３がＰＥＧ３発現を低下させうるかどうかを、例えばそのプロモーター活性を抑制することによって、確認することをさらに含むことができる。特定の実施形態において、そのような活性は、限定するものではないが、本明細書に例示するＰＥＧ３プロモーター／ルシフェラーゼ遺伝子リポーター系等のＰＥＧ３プロモーター／リポーター遺伝子構築物を用いてモニターすることができる。
【００５８】
下記の分節６に、ＰＳＧｅｎ １３が、血管内皮増殖因子の発現および新たな血管形成（血管新生）に関連するプロモーターであるＶＥＧＦプロモーターの活性を抑制することを示すさらなるデータを提示する。該プロモーターの活性は、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を用いてモニターされた。この発見に基づいて、本発明は、癌細胞がＶＥＧＦレベルの上昇を示すかどうかを確認することによって、ＰＳＧｅｎ １３の推定される治療標的を同定する方法を提供する。本発明の方法は、ＰＳＧｅｎ １３がＶＥＧＦ発現を低下させうるかどうかを、例えばそのプロモーター活性を抑制することによって、確認することをさらに含むことができる。特定の実施形態において、そのような活性は、限定するものではないが、本明細書に例示するＶＥＧＦプロモーター／ルシフェラーゼ遺伝子リポーター系等のＶＥＧＦプロモーター／リポーター遺伝子構築物を用いてモニターすることができる。または、血管新生に特に関連する腫瘍（例えば、黒色腫または血管腫等の血管腫瘍等）は、ＰＳＧｅｎ １３介在治療の適切な標的でありうる。
【００５９】
下記の分節８に示すように、ＨｕＰＳＧｅｎ １３は染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３にマップされた。この領域に欠失を有する癌細胞は、ＨｕＰＳＧｅｎ １３の形質転換抑制効果に対して特に感受性でありうる。したがって、本発明は、染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３に欠失を検出することを含む、ＨｕＰＳＧｅｎ １３による治療のヒト癌細胞標的を同定する方法を提供する。
【００６０】
５．４．２ 血管新生の抑制
本発明は、被験者における癌増殖に関連した血管新生を抑制するように、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードする核酸、ＰＳＧｅｎ １３タンパク質またはＰＳＧｅｎ １３アクチベーター化合物の十分量を含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、被験者における癌増殖に関連した血管新生を抑制する方法を提供する。特定の非限定的実施形態において、該被験者はヒトであり、そして該治療方法は治療上有効量の発現可能な形のｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎ １３核酸、または治療上有効量のｒＰＳＧｅｎ １３もしくはＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質を投与することを含む。非限定的実施形態においては、ＰＳＧｅｎ １３核酸またはタンパク質を、アンギオスタチンまたはサリドマイド等の抗血管新生活性を有する別の分子と共に投与することが望ましいかもしれない。
【００６１】
５．４．３ 診断方法
本発明は、ＨｕＰＳＧｅｎ １３の染色体上の位置、すなわち６ｑ２３．２−６ｑ２３．３を利用する診断方法をさらに提供する。
【００６２】
１組の実施形態において、本発明は、個体の染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３における欠失を検出することを含む、癌を発症する危険が増大した個体を同定する方法を提供する。特定の非限定的実施形態において、増大した危険とは、膵臓癌、腹膜の乳頭状漿液性癌、肝細胞癌、大Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、乳癌、胃癌、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含むリストより選択された癌の発症をいう。
【００６３】
別の１組の実施形態において、本発明は、個体の染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３における欠失を検出することを含む、被験者における癌の進行（すなわち、より悪性な表現型の発生）を検出する方法を提供する。特定の非限定的実施形態において、上記進行は、膵臓癌、腹膜の乳頭状漿液性癌、肝細胞癌、大Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、乳癌、胃癌、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含むリストより選択された癌に起こる。
【００６４】
欠失は、制限断片長多型の分析を含むが、それだけに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって検出することができる。
【００６５】
６．実施例： 進行によって抑制される遺伝子 １３ （ＰＳＧｅｎ １３） は、齧歯動物およびヒトの癌細胞におけるトランスフォームされた状態を抑制する
要約： 全長齧歯動物ＰＳＧｅｎ １３遺伝子を作製し、発現ベクターに導入し、そして進行した、齧歯動物のトランスフォームされた細胞系であるＥ１１−ＮＭＴおよびＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞系中に安定にトランスフェクトした。一連のランダムな単一細胞クローンを単離し、そして文献に記述されているトランスフォームされた状態の発現について、足場非依存的に増殖するそれらの能力によって評価した。ラットＰＳＧｅｎ １３遺伝子を欠く対照発現ベクターではなく、ラットＰＳＧｅｎ １３発現ベクターを用いてトランスフェクトした特定のＥ１１−ＮＭＴおよびＤＵ−１４５クローンは、足場非依存的に増殖するそれらの能力が抑制された。ラットＰＳＧｅｎ １３でトランスフェクトされたＥ１１−ＮＭＴ形質転換体の場合、特定の進行によって促進される遺伝子（ＰＥＧ−３）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の転写が抑制された。ラットＰＳＧｅｎ １３配列を用いて、ラットＰＳＧｅｎ １３配列にかなりのＤＮＡおよびタンパク質相同性を有する（それぞれ７５および９４％）ヒトＰＳＧｅｎ １３（ＨｕＰＳＧｅｎ １３）遺伝子が同定された。以下に記述する試験は、ＰＳＧｅｎ １３が癌表現型の抑制物質であること、および抑制は癌進行誘導遺伝子および血管新生刺激遺伝子の発現に変化をもたらすことを示す。
【００６６】
６．１ 材料および方法
細胞培養および寒天増殖アッセイ： Ｅ１１は、Ｈ５ｔｓ１２５で形質転換されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ二次ＲＥ細胞の単一細胞クローンである（Ｆｉｓｈｅｒら， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．７５： ２３１１−２３１４）。Ｅ１１−ＮＭＴは、Ｅ１１細胞系によって誘導されたヌードマウス腫瘍に由来するＥ１１細胞のサブクローンである（Ｂａｂｉｓｓら， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８： １０９９−１１０１）。Ｒ１２は、Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換されたＥ１１クローンである（Ｄｕｉｇｏｕら， １９８９， ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ５６７ ：３０２−３０６）。Ｆ１およびＦ２は、Ｅ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞の間に形成された、平坦な形態を有する、抑制された体細胞ハイブリッドである（Ｄｕｉｇｏｕら， １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０： ２０２７−２０３４）。Ｒ１およびＲ２は、Ｅ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞を融合させて作製した、丸い形態を有する、進行した体細胞ハイブリッドである（同文献）。Ｅ１１−ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７は、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６／Ｅ７遺伝子領域で形質転換したＥ１１細胞のクローンである（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９４： ９１２５−９１３０）。Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６および３ｂは、Ｅ１１細胞とＥ１１−ＮＭＴ細胞の間に形成された、進行表現型を示さない独立した体細胞ハイブリッドクローンである（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａｄｏｌｐｈ（編）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｐ． ６８−１０２に掲載のＲｅｄｄｙら， １９９３）。進行表現型を示さないＥ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ細胞（同文献）。Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６ＴＤは、Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６体細胞ハイブリッドによってヌードマウス中に誘導された腫瘍を単離することによって形成された、進行した体細胞ハイブリッドである（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９４： ９１２５−９１３０； Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａｄｏｌｐｈ（編）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｐ． ６８−１０２に掲載のＲｅｄｄｙら， １９９３）。Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ ＩＩａは、Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴの間に形成された、進行表現型を示す体細胞ハイブリッドクローンである（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａｄｏｌｐｈ（編）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｐ． ６８−１０２に掲載のＲｅｄｄｙら， １９９３）。Ｅ１１−ＮＭＴ ＡｚａＢ１およびＡｚａ Ｃ１は、５−アザシチジンで処理したＥ１１−ＮＭＴ細胞の独立したクローンであり、進行表現型の抑制を示す（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９４： ９１２５−９１３０； Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａｄｏｌｐｈ（編）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｐ． ６８−１０２に掲載のＲｅｄｄｙら， １９９３）。ＣＲＥＦは、Ｆｉｓｃｈｅｒラット胚繊維芽細胞の特定の不死の非形質転換および非腫瘍形成性クローンである（Ｆｉｓｈｅｒら， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７９： ３５２７−３５３１）。ＤＵ−１４５は、ホルモン屈折性（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ）ヒト前立腺癌細胞系である（Ｊｉａｎｇら， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３： ９１６０−９１６５）。全ての培養物は、５％ ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃にて、湿潤化５％ ＣＯ２／９５％空気インキュベーター中で増殖させた。足場非依存的増殖アッセイは、以前に記述されたように、０．８％ ｎｏｂｌｅ ａｇａｒ含有培地である基層上の０．４％ ｎｏｂｌｅ ａｇａｒ含有培地中に異なる数の細胞を播くことによって実施した（Ｋａｎｇら，１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １３７８８−１３７９３； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３９： ３０５１−３０５７； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２８１： ５９１−５９４； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃｅｌｌ １８： ６９５−７０５； Ｂａｂｉｓｓら， １９８５， Ｓｃｉｎｅｃｅ ２２８： １０９９−１１０１； Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ２１９５−９１３０； Ｓｕら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６： １５１１５−１５１２０； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７５： ２３１１−２３１４）。
【００６７】
ＰＳＧｅｎ １３ 発現 Ｅ１１−ＮＭＴ クローンの構築： Ｅ１１−ＮＭＴおよびＤＵ−１４５細胞を、以前に記述されているように（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ２１９５−９１３０）、完全なｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子を欠く、または有するｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（ネオマイシン耐性遺伝子を含む）を用いてトランスフェクトした。すなわち、１ ｘ １０５個の細胞を１０ ｃｍの組織培養プレートに播き、６時間後に１０ ｇの精製ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターまたはラットＰＳＧｅｎ １３／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）構築物を３０ μｌのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と共にインキュベートし、この混合物を８時間細胞に加えた。翌日、培地を５００ μｇ／ｍｌのＧ４１８を加えたものと交換し、そして培地は週に２回、３週間にわたって交換した。クローニング・シリンダーを用いてＧ４１８耐性コロニーを単離し、ＮＭＴ−ＰＳＧ１３クローン（ｃｌ ３、５、６、７、８、９、１０、１１および１２）およびＤＵ−ＰＳＧ１３クローン（ｃｌ １１、１２、１３、１４、１５および１７）と称する独立した細胞系として、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する完全培地で維持した。さらに、ＮＭＴ−ベクターおよびＤＵ−１４５−Ｖｅｃクローンを単離し、独立した細胞系として１０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する完全培地で維持した。
【００６８】
ノーザンブロッティングアッセイ： グアニジニウム／フェノール抽出法により全細胞ＲＮＡを単離した（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ２１９５−９１３０）。１５μｇのＲＮＡを変性させ、３％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲル中で電気泳動し、ナイロン膜に転写し、そして３２Ｐ標識化ｒＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡプローブと順次ハイブリダイズさせた。ブロットを剥がし、そして以前に記述されているように（同文献） ３２Ｐ標識化ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡプローブで再度釣り上げた。ハイブリダイゼーション後、フィルターを洗浄し、オートラジオグラフィーのために感光させた。
【００６９】
プロモーター分析： 全長ラットＰＥＧ３プロモーター（ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ）およびＶＥＧＦ−プロモーター構築物の活性を評価するため、細胞（Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＮＭＴ−ＰＳＧｅｎ １３）クローンを３５ ｍｍの組織培養プレート１枚あたり２ ｘ １０５個の割合で播き、約２４時間後に、５μｇのＰＥＧ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼまたはＶＥＧＦ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ構築物、および２００μｌの無血清培地中で１０μｌのリポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ）と混合した１μｇのＳＶ４０−β−ｇａｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてトランスフェクトした。２０分後、室温で、８００μｌの無血清培地を添加し、最終容量を１ ｍｌとした。このトランスフェクション混合物を１４時間後に除去し、細胞を無血清培地で３回洗浄し、そして完全増殖培地中３７℃でさらに４８時間インキュベートした。細胞を回収し、溶解して、β−ｇａｌおよびルシフェラーゼリポーターアッセイに用いる抽出物を調製した（Ｇｏｐａｌｋｒｉｓｈａｎら， １９９９， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：４７７５−４７８２）。ルシフェラーゼおよびβ−ｇａｌ活性の発光測定は、市販のキット（それぞれＰｒｏｍｅｇａおよびＴｒｏｐｉｘ）を用いて実施した。ルシフェラーゼアッセイのためには、１０μｌの細胞溶解物を４０μｌのルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。β−ｇａｌアッセイのためには、１０μｌの細胞溶解物を１００μｌの希釈Ｇａｌｅｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓおよび１５０μｌのＡｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ （Ｔｒｏｐｉｘ）と混合した。プロモーター分析のデータは、各実験ポイントについて３個１組のサンプルを用いて最低３回集めた。そして、データはβ−ｇａｌデータによって標準化した。
【００７０】
全長ラット ＰＳＧｅｎ １３ および ＨｕＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡ のクローニング： ＲＳＤＤおよび逆ノーザンハイブリダイゼーションを用いて、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞と比較してＥ１１細胞中で発現上昇を示す遺伝子として、もとのラットＰＳＧｅｎ １３ ＥＳＴが同定された（Ｋａｎｇら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１３７８８−１３７９３）。ラットＰＳＧｅｎ １３の全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、上記ＥＳＴ配列に基づく遺伝子特異的プライマーおよび電子データマイニングと共に完全オープンリーディングフレーム（Ｃ−ＯＲＦ）アプローチを用いてクローン化した。Ｃ−ＯＲＦに用いたプライマーは、ＰＳＧｅｎ１３−Ｒ２ （ＴＣＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＣＧ ＧＡＧ ＴＧＴ ＣＡＡ Ｇ）（配列番号７）およびＰＳＧｅｎ１３−Ｒ２ネステッド（ＴＧＴ ＣＡＡ ＧＴＧ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＧＡ ＣＴＡ ＡＧＡ ＡＴＧ Ｇ）（配列番号８）であった。さらに、ラットＰＳＧｅｎ １３ ＥＳＴ配列をＧｅｎＢａｎｋの配列とＢＬＡＳＴによって比較することにより、全長ｒＰＳＧｅｎ １３およびＨｕＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡクローンを同定した。選択したクローン（ラットＰＳＧｅｎ １３由来のＡＴＣＣ＃２００５７７７およびＨｕＰＳＧｅｎ １３由来のＡＴＣＣ＃２５２５２６２）を取得し（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、配列を決定した。
【００７１】
６．２ 実験結果
ＰＳＧｅｎ １３ の配列インフォーマティクス： クローン化した全長ラットＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）テイルを除いて、７８０ ｂｐからなる。ポリ（Ａ）シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）は７６３位に位置する（図１；配列番号１）。インフレーム終止コドンが８６ ｂｐに存在し（ＨｕＰＳＧｅｎ １３には存在しない）、そしてＯＲＦは１７０ ｂｐの最初のＡＴＧから始まり、４１５ ｂｐまで延びている。ｒＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡは、計算分子量が９ ｋＤａで、等電点（ｐＩ）が５．５２である、予想される８１個のアミノ酸（図１；配列番号２）を有するタンパク質をコードする。タンパク質配列分析は、膜にかかる領域のための疎水性パッチ、または分泌タンパク質に特徴的なシグナルペプチド配列を示さなかった。モチーフおよびパターン分析もまた、以前に報告された遺伝子との配列相同性（これはラットＰＳＧｅｎ １３の生物学的機能および／または作用機序への可能な洞察を提供するのに有用な情報である）を同定できなかった。この考察に基づくならば、ｒＰＳＧｅｎ １３は新規なクラスのタンパク質をコードしているように思われる。
【００７２】
ｒＰＳＧｅｎ １３のヒト相同体であるＨｕＰＳＧｅｎ １３を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに報告されている配列を分析することにより電子的にクローン化した（図２；配列番号３）。ＨｕＰＳＧｅｎ １３はヌクレオチドレベルではｒＰＳＧｅｎ １３と７５％同一であるが、タンパク質レベルではｒＰＳＧｅｎ １３と９４％同一である（７９／８１残基）（図３および４）。ＨｕＰＳＧｅｎ １３において独特な５個の残基のうち、３個（４位のＤ、３８位のＫおよび７７位のＩ）はｒＰＳＧｅｎ １３（４位のＥ、３８位のＲおよび７７位のＶ）の保存された置換であり、これは機能性における強い保存を示唆している。さらに、ＨｕＰＳＧｅｎ １３とｒＰＳＧｅｎ １３のタンパク質コード配列の配列同一性は、ヌクレオチドレベルで８７％である。５’および３’末端非翻訳領域は、それぞれ６８．７％および６８．３％の同一性を示す。これらの領域はｒＰＳＧｅｎ １３とＨｕＰＳＧｅｎ １３の間でＯＲＦ部分よりも多様であるが、これは種間相同体の間では珍しいことではない。ＯＲＦにおける保存の程度およびその結果としてのタンパク質配列を考えるならば、ＨｕＰＳＧｅｎ １３はｒＰＳＧｅｎ １３のオーソログである。クローン化したＨｕＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）テイルを除いて８３５ ｂｐからなり、そして標準的なポリ（Ａ）シグナルが８１４ ｂｐに観察される。インフレーム終止コドンは存在しなかったが、ＨｕＰＳＧｅｎ １３のＯＲＦは最初のＡＴＧ （１９７ ｂｐ）から始まり、４４２ ｂｐまで延びている。ＨｕＰＳＧｅｎ １３は計算された分子量が９ ｋＤａで、等電点が５．８６である、８１個のアミノ酸をコードしている。ｒＰＳＧｅｎ １３におけるように、コンピュータによるタンパク質配列分析は公知の機能モチーフを何らもたらさなかった。
【００７３】
ｒＰＳＧｅｎ １３ は Ｅ１１−ＮＭＴ および ＤＵ−１４５ 細胞における足場非依存的増殖を抑制する：
ｒＰＳＧｅｎ １３は、ＲＳＤＤを用いて、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞と比較してＥ１１細胞中で発現上昇を示す遺伝子として同定された（Ｋａｎｇら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１３７８８−１３７９３）。進行した表現型（＋）（これは寒天中における増殖の増大および短い腫瘍潜伏時間によって示される）、または進行しない表現型（−）（これは寒天中における増殖の減少および腫瘍潜伏時間の延長によって示される）を示す１群の齧歯動物細胞系を用いて、ｒＰＳＧｅｎ １３発現の減少と進行表現型との間に直接的な相関関係が見出された（図５、Ｋａｎｇら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１３７８８−１３７９３より）。ｒＰＳＧｅｎ １３のレベルは、進行表現型を示さないＥ１１、ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｆ１およびＦ２、Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６、およびＥ１１−ＮＭＴ ＡＺＡ Ｂ１細胞において上昇した。対照的に、進行したＥ１１−ＮＭＴ、ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｒ１およびＲ２、Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６ＴＤ、Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ ＩＩａ、Ｅ１１−Ｒａｓ Ｒ１２およびＥ１１−ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７細胞においては、ｒＰＳＧｅｎ １３の発現はより低かった。これらの知見は、進行表現型の発現とラットＰＳＧｅｎ １３発現の間に潜在的な逆の関係を実証する。これらの知見はまた、ＰＳＧｅｎ １３が進行プロセスにおいて機能的な役割をはたすかもしれないという可能性を提起した。
【００７４】
ｒＰＳＧｅｎ １３は発現ベクター中にクローン化され、そしてＥ１１−ＮＭＴおよびＤＵ−１４５細胞中に安定にトランスフェクトされた。ランダムクローンを単離し、そして半固体寒天中に播いた時に肉眼で見えるクローンを形成する能力について評価した（Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３９： ３０５１−３０５７； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２８１： ５９１−５９４； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃｅｌｌ １８： ６９５−７０５）。Ｅ１１細胞は寒天中では低い効率で増殖するが、他方、進行したＥ１１−ＮＭＴ細胞は寒天中で増大した増殖を示し、Ｅ１１細胞におけるよりも多数の、より大きいコロニーを形成する（図６）（同文献）。ランダムＮＭＴ−ＰＳＧｅｎ １３クローン（「ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ番号」で表わす）の分析は、足場非依存性の顕著な減少を何ら示さない特定のクローン（すなわちＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３および５）、ならびにＥ１１細胞に類似した寒天クローニング効率の低下を示すクローン（すなわちＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７および１２）を示した。さらに、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞に較べて足場非依存性の顕著な減少を示すが、ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７および１２よりも少ない増殖抑制を示すいくつかのクローンが同定された。これらは、ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ６、８、９、１０および１１を含む。
【００７５】
足場非依存性の抑制はｒＰＳＧｅｎ １３の発現増大と関連していることを確認するため、全ＲＮＡをＥ１１、Ｅ１１−ＮＭＴならびにＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３、５、７および１２から単離して、ノーザンブロッティングによって評価した（図７）。この実験は、Ｅ１１ならびにＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７および１２におけるＰＳＧｅｎ １３の発現を証明したが、Ｅ１１−ＮＭＴまたはＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３および５における発現は証明しなかった。これらの結果は、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞におけるｒＰＳＧｅｎ １３の強制発現が、このトランスフォーメーションモデル系における進行表現型のマーカーである足場非依存的増殖の抑制をもたらしたことを示している。
【００７６】
ｒＰＳＧｅｎ １３遺伝子がヒト癌細胞におけるトランスフォームされた表現型に効果を及ぼしうるかどうかを決定するため、全長ｒＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡをＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞中にトランスフェクトし、ランダムクローンを単離した。次に、これらのクローンを足場非依存的増殖について評価した（図８）。ＤＵ−１４５細胞と比較して足場非依存的増殖に顕著な減少を示す数個のクローン（ＤＵ−ＰＥＧ１３ ｃｌ １１、１２および１４を含む）が同定された。ベクターでトランスフェクトされたクローンならびにＤＵ−ＰＥＧ１３ ｃｌ １３、１５および１７を含むさらなるクローンは、寒天中でトランスフェクトされていないＤＵ−１４５細胞と類似のクローニング効率を示した。これらの結果は、ラットＰＳＧｅｎ １３がヒト癌細胞におけるトランスフォームされた表現型をも抑制することができることを示し、それによってこの遺伝子産物の腫瘍細胞におけるより一般的な抑制能力を示している。
【００７７】
ラット ＰＳＧｅｎ １３ は Ｅ１１−ＮＭＴ 細胞における転写活性を抑制する： 以前の研究は、Ｅ１１細胞と比較してＥ１１−ＮＭＴ細胞がＰＥＧ−３およびＶＥＧＦ遺伝子の転写の増大を示すことを明らかにした（Ｓｕら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６： １５１１５−１５１２０）。遺伝子発現におけるこれらの変化は、Ｅ１１細胞と較べてＥ１１−ＮＭＴ細胞の攻撃的で進行した癌表現型の重要な決定因子であると思われる（同文献）。ｒＰＳＧｅｎ １３発現がこれらの重要な進行関連遺伝子に効果を及ぼすことができるかどうかを決定するため、ルシフェラーゼリポーター遺伝子に連結したＰＥＧ３プロモーター（ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ）およびルシフェラーゼリポーター遺伝子に連結したＶＥＧＦプロモーター（ＶＥＧＦ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ）構築物の転写活性を、Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよび異なるＮＭＴ−ＰＳＧ１３クローンにおいて評価した（図９および１０）。以前に報告されているように（同文献）、ＰＥＧ−ＰｒｏｍおよびＶＥＧＦ−ＰｒｏｍはＥ１１細胞におけるよりもＥ１１−ＮＭＴ細胞においてより活性である。ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７および１２の両者は、Ｅ１１細胞のそれと類似したＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の減少を示した（図９）。対照的に、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞と比較した場合、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ活性のレベルはＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３および５において変化しておらず、これらは増大したｒＰＳＧｅｎ １３ ｍＲＮＡを発現しない（図７）。ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７および１２において観察されたよりも小規模ではあるが、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性レベルの低下がＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ６（最小低下）、８、９、１０および１１においても明らかであった。ＶＥＧＦ−Ｐｒｏｍの場合、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞と比較してＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３および５においてはプロモーター活性の変化は全く見られなかった（図１０）。しかし、ＶＥＧＦ−Ｐｒｏｍ活性における類似の低下（Ｅ１１細胞に観察されたものに近い）がＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ７、８、９、１０、１１および１２において明らかであった。これらの結果は、ＰＳＧｅｎ １３の発現がＰＥＧ−３およびＶＥＧＦの両方の発現を調節できることを示唆している。これら２つの遺伝
子のどちらについても、転写活性のこの調節が直接的または間接的作用機構によって起こるのかどうかは、現在のところ分かっていない。
【００７８】
６．３ 結論
ＲＳＤＤアプローチは、齧歯動物およびヒトの両方の腫瘍細胞における癌の進行を機能的に調節することができる新規な遺伝子、すなわちｒＰＳＧｅｎ １３をうまく同定した。攻撃的な癌表現型を示す齧歯動物腫瘍細胞（Ｅ１１−ＮＭＴ）におけるｒＰＳＧｅｎ １３の強制発現は、足場非依存的増殖の減少によってモニターされる癌表現型の抑制をもたらすという証拠が提示される。同様に、ヒト前立腺癌細胞系（ＤＵ−１４５）中で過剰発現させた場合も、ｒＰＳＧｅｎ １３は足場非依存性の抑制を誘導した。ＰＳＧｅｎ １３がその癌増殖抑制特性を誘導する作用機構は知られていない。しかし、Ｅ１１−ＮＭＴモデルにおいては、ｒＰＳＧｅｎ １３の強制発現は、２つの重要な癌進行調節遺伝子であるＰＥＧ−３およびＶＥＧＦの転写活性の抑制と直接相関していた。
【００７９】
配列相同性に基づいて、ヒトＰＳＧｅｎ １３遺伝子、すなわちＨｕＰＳＧｅｎ １３が単離された。この遺伝子はラットＰＳＧｅｎ １３遺伝子に高度に相同である。ヌクレオチドおよびタンパク質レベルでそれぞれ７５％および９４％同一である。以下の分節に示すように、ＨｕＰＳＧｅｎ １３もまたトランスフォームされた表現型を抑制することが示された。
【００８０】
７．実施例： ヒト ＰＳＧｅｎ １３ はトランスフォームされた表現型を抑制する
ＨｕＰＳＧｅｎ １３ は形質転換されたラット胚細胞のトランスフォームされた表現型を抑制した： ＣＲＥＦ細胞およびＨａ−ｒａｓによって形質転換したＣＲＥＦ細胞（「ＣＲＥＦ−ｒａｓ」細胞）を、空のベクターまたはＨｕＰＳＧｅｎ １３を含むベクターによってトランスフェクトした。このベクターはハイグロマイシン耐性遺伝子も含んでいた。ハイグロマイシン耐性によってトランスフェクタントを選択し、単層培養におけるコロニー形成を評価した。結果を図１１に示す。この図は、３枚反復プレートの結果±Ｓ．Ｄ．を示している。このデータは、ＨｕＰＳＧｅｎ １３がＣＲＥＦ−ｒａｓ形質転換ラット胚繊維芽細胞におけるコロニー形成に対して選択的抑制効果を発揮することを示している。さらに、トランスフェクトされたＨａ−ｒａｓ形質転換細胞におけるコロニー形成効率は、形質転換されていない、トランスフェクトされたＣＲＥＦ細胞に観察されたレベルに戻ることが見いだされた。
【００８１】
ＨｕＰＳＧｅｎ １３ はヒト乳癌細胞のトランスフォームされた表現型を抑制した； ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７の細胞を、ハイグロマイシン耐性遺伝子をも含むベクターに組み込んだＨｕＰＳＧｅｎ １３によってトランスフェクトした。次に、ハイグロマイシンの存在下でトランスフェクタントを選択し、単離したクローンを寒天中における足場非依存的増殖について評価した。図１２に示すように、ＨｕＰＳＧｅｎ １３でトランスフェクトしたいくつかの細胞系はトランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞と類似したクローニング効率を示したが（クローン４および５）、クローニング効率はヒトＰＳＧｅｎ １３でトランスフェクトしたＭＣＦ−７クローン６、７、１２、１３および１５において実質的に低下した。
【００８２】
８．実施例： ＨｕＰＳＧｅｎ １３ の染色体上の位置
ＨｕＰＳＧｅｎ １３の染色体上の位置は、染色体遺伝子座６ｑ２３．２−６ｑ２３．３にマップされた。膵臓癌、腹膜の乳頭状漿液性癌、肝細胞癌、大Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、乳癌、胃癌、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含む種々の癌において、この領域における欠失が注目されている。
【００８３】
本出願には本文内に種々の刊行物が著者名および日付によって言及されている。米国特許出願第０９／６４８，３１０号を含む、本明細書に引用したすべての特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ配列および刊行物は、本明細書に記載し、請求している発明のなされた日において当業者に公知の技術水準をより十分に記述するため、参照により本出願に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ラットＰＳＧｅｎ １３遺伝子（ｒＰＳＧｅｎ １３と称する）のヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列、それぞれ配列番号１および２。オープンリーディングフレームの開始ＡＴＧおよび終止コドンを丸で囲み、またポリ（Ａ）シグナルに下線を付している。
【図２】
ヒトＰＳＧｅｎ １３遺伝子（ＨｕＰＳＧｅｎ １３と称する）のヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列、それぞれ配列番号３および４。オープンリーディングフレームの開始ＡＴＧおよび終止コドンを丸で囲み、またポリ（Ａ）シグナルに下線を付している。
【図３】
ラット（ＰＳＧｅｎ １３；配列番号１）およびヒト（ＨｕＰＳＧｅｎ １３；配列番号３）ｃＤＮＡ間のヌクレオチド配列比較。ラットＰＳＧｅｎ １３およびヒトＨｕＰＳＧｅｎ １３遺伝子の開始および終止コドンを太字で示す。
【図４】
ラットＰＳＧｅｎ １３およびヒトＨｕＰＳＧｅｎ １３タンパク質（それぞれ配列番号２および４）のアミノ酸配列比較。
【図５】
ＲＳＤＤおよび逆ノーザンブロッティングによって同定されたｒＰＳＧｅｎ １３の、トランスフォーメーション進行に差を示す１群の齧歯動物細胞における示差的発現。種々の段階のトランスフォーメーション進行を示す細胞のノーザンブロットを、３２Ｐで放射性標識したｒＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡ（ＲＳＤＤおよび逆ノーザンブロッティングによって最初に同定された）で釣り上げた（Ｋａｎｇら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １３７８８−１３７９３）。ノーザンブロットのレーンに左から右にかけて以下の通り表示する細胞型からＲＮＡを得た：未進行Ｅ１１細胞（Ｅ１１ （−））；進行したＥ１１−ＮＭＴ（＋）細胞； ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｆ１（−）未進行細胞（ここで「細胞型Ａ ｘ 細胞型Ｂ」はＡ型細胞とＢ型細胞の間の体細胞ハイブリッドを示す）； ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｆ２（−）未進行細胞；ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｒ１（＋）進行細胞；ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｒ２（＋）進行細胞；ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６（−）未進行細胞；ＣＲＥＦ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ Ａ６ＴＤ（＋）ヌードマウス腫瘍由来進行細胞；Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ ３ｂ（−）未進行細胞；Ｅ１１ ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ ＩＩａ（＋）進行細胞；Ｅ１１−ＮＭＴ ＡＺＡ Ｂ１ （−）未進行５−アザシチジン処理Ｅ１１−ＮＭＴクローン；Ｅ１１−ＮＭＴ ＡＺＡ Ｃ１（−）未進行５−アザシチジン処理Ｅ１１−ＮＭＴクローン；Ｅ１１−Ｒａｓ Ｒ１２進行細胞；およびＥ１１−ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７（ＨＰＶ−１８のＥ６およびＥ７領域によって形質転換されたＥ１１クローン）。臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色によって、ＲＮＡの等しいローディングが示されている。このデータは、Ｋａｎｇら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５： １３７８８−１３７９３からのものである。
【図６】
ｒＰＳＧｅｎ １３は、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞における足場非依存的増殖を抑制する。図に示す細胞型の寒天クローニング効率を、以前に記述されているように測定した（Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３９： ３０５１−３０５７； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２８１： ５９１−５９４； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃｅｌｌ １８： ６９５−７０５）。細胞型は、Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴ、およびＰＳＧｅｎ １３でトランスフェクトしたＥ１１−ＮＭＴクローン（ＮＭＴ−ＰＳＧ１３ ｃｌ ３、５、６、７、８、９、１０、１１および１２と称する）を含む。３個１組のサンプルは変動が＜１０％で、レプリケートアッセイは変動が＜１５％であった。
【図７】
Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＭＮＴ−ＰＳＧ１３クローンにおけるラットＰＳＧｅｎ １３およびＧＡＰＤＨ発現のノーザンブロッティング分析。図に示す細胞型から単離された１５μｇの細胞ＲＮＡを電気泳動し、ナイロン膜に転写し、ラットＰＳＧｅｎ １３ ｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、次に以前に記述されているようにそれを剥がしてＧＡＰＤＨで釣り上げた（Ｓｕら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ９１２５−９１３０； Ｓｕら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６： １５１１５−１５１２０）。
【図８】
ラットＰＳＧｅｎ １３は、ＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞における足場非依存的増殖を抑制する。図に示す細胞型の寒天クローニング効率は、以前に記述されているように測定した（Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３９： ３０５１−３０５７； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２８１： ５９１−５９４； Ｆｉｓｈｅｒら， １９７９， Ｃｅｌｌ １８： ６９５−７０５）。細胞型は、ＤＵ−１４５、ＤＵ−１４５のベクターで形質転換したクローン（ＤＵ−１４５／Ｖｅｃ）、およびラットＰＳＧｅｎ １３でトランスフェクトしたＤＵ−１４５クローン（ＤＵ−ＰＳＧ１３ ｃｌ １１、１２、１３、１４、１５および１７と称する）を含む。３個１組のサンプルは変動が＜１０％で、レプリケートアッセイは変動が＜１２％であった。
【図９】
Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＭＮＴ−ＰＳＧ１３クローンにおける全長ＰＥＧ−３プロモーター−ルシフェラーゼ活性。異なる細胞型を、５μｇの全長ＰＥＧ−Ｐｒｏｍおよび１μｇのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドを用いて共トランスフェクトし、そして４８時間後にルシフェラーゼ活性を「材料および方法」に記述したように測定した。結果はβ−ガラクトシダーゼ活性によって標準化されており、そして変動が＜１５％であった３つの独立した実験の平均を表わす。
【図１０】
Ｅ１１、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＭＮＴ−ＰＳＧ１３クローンにおけるＶＥＧＦプロモーター−ルシフェラーゼ活性。異なる細胞型を、５μｇのＶＥＧＦ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ（Ｓｕら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６： １５１１５−１５１２０）および１μｇのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドを用いて共トランスフェクトし、そして４８時間後にルシフェラーゼ活性を「材料および方法」に記述したように測定した。結果はβ−ガラクトシダーゼ活性によって標準化されており、そして変動が＜１５％であった３つの独立した実験の平均を表わす。
【図１１】
ＨｕＰＳＧｅｎ １３は、Ｈａ−ｒａｓにより形質転換されたラット胚繊維芽細胞における単層コロニー形成を選択的に抑制した。
【図１２】
ＨｕＰＳＧｅｎ １３は、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞のトランスフォームされた表現型を、寒天中のクローニング効率の低下によって示されるように、抑制した。
Claims (88)
- 真核細胞中で活性なプロモーター要素に機能しうる形で連結された、進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする単離された核酸。
- 真核細胞中で活性なプロモーター要素に機能しうる形で連結された、ラットＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードし、かつ配列番号１に示す核酸配列を有する単離された核酸。
- 真核細胞中で活性なプロモーター要素に機能しうる形で連結された、ストリンジェントな条件下で請求項２に記載の核酸にハイブリダイズする単離された核酸。
- 真核細胞中で活性なプロモーター要素に機能しうる形で連結された、ヒトＰＳＧｅｎ １３タンパク質をコードし、かつ配列番号３に示す核酸配列を有する単離された核酸。
- 真核細胞中で活性なプロモーター要素に機能しうる形で連結された、ストリンジェントな条件下で請求項４に記載の核酸にハイブリダイズする単離された核酸。
- 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする単離された核酸。
- 配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする単離された核酸
- 請求項１に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項２に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項３に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項４に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項５に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項６に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項７に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 腫瘍細胞である、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
- 該腫瘍細胞が鼻咽頭腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、中枢神経系腫瘍細胞、神経芽腫細胞、星状細胞腫細胞、多形性神経膠芽腫細胞、黒色腫細胞、上皮腫瘍細胞、非上皮腫瘍細胞、血液腫瘍細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、神経芽腫細胞、子宮頸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、泌尿性器癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、骨肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、胃癌細胞または膵臓癌細胞からなる群より選択される、請求項２２に記載の宿主細胞。
- 治療上有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸を適切な医薬キャリアー中に含む医薬組成物。
- 治療上有効量の請求項８〜１４のいずれか１項に記載のベクターを適切な医薬キャリアー中に含む医薬組成物。
- 単離された進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質。
- 請求項２６に記載のＰＳＧｅｎ １３タンパク質を医薬キャリアーと共に含む組成物。
- 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、単離されたＰＳＧｅｎ １３タンパク質。
- 請求項２８に記載のＰＳＧｅｎ １３タンパク質を医薬キャリアーと共に含む組成物。
- 配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、単離されたＰＳＧｅｎ １３タンパク質。
- 請求項３０に記載のＰＳＧｅｎ １３タンパク質を医薬キャリアーと共に含む組成物。
- 請求項２８に記載のタンパク質と特異的に結合する抗体。
- 請求項３０に記載のタンパク質と特異的に結合する抗体。
- 請求項３２に記載の抗体と結合する単離されたタンパク質。
- 請求項３３に記載の抗体と結合する単離されたタンパク質。
- 細胞のトランスフォームされた表現型を抑制する方法であって、該細胞に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項３６に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項３６に記載の方法。
- 癌細胞増殖を抑制する方法であって、癌細胞に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項３９に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項３９に記載の方法。
- 腫瘍中の血管新生を抑制する方法であって、該腫瘍に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項４２に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項４２に記載の方法。
- 被験者の癌を治療する方法であって、該被験者に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項４５に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項４５に記載の方法。
- 細胞のトランスフォームされた表現型を抑制する方法であって、該細胞に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質を投与することを含む、該方法。
- 該タンパク質が配列番号２に示す配列を有する、請求項４８に記載の方法。
- 該タンパク質が配列番号４に示す配列を有する、請求項４８に記載の方法。
- 癌細胞増殖を抑制する方法であって、該癌細胞に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質を投与することを含む、該方法。
- 該タンパク質が配列番号２に示す配列を有する、請求項５１に記載の方法。
- 該タンパク質が配列番号４に示す配列を有する、請求項５１に記載の方法。
- 腫瘍中の血管新生を抑制する方法であって、該腫瘍に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質を投与することを含む、該方法。
- 該タンパク質が配列番号２に示す配列を有する、請求項５４に記載の方法。
- 該タンパク質が配列番号４に示す配列を有する、請求項５４に記載の方法。
- 被験者の癌を治療する方法であって、該被験者に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質を投与することを含む、該方法。
- 該タンパク質が配列番号２に示す配列を有する、請求項５７に記載の方法。
- 該タンパク質が配列番号４に示す配列を有する、請求項５７に記載の方法。
- 乳癌細胞のトランスフォームされた表現型を抑制する方法であって、該細胞に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項６０に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項６０に記載の方法。
- 乳癌細胞増殖を抑制する方法であって、該癌細胞に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項６３に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項６３に記載の方法。
- 乳癌中の血管新生を抑制する方法であって、該癌に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項６６に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項６６に記載の方法。
- 被験者の乳癌を治療する方法であって、該被験者に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項６９に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項６９に記載の方法。
- 前立腺癌細胞のトランスフォームされた表現型を抑制する方法であって、該細胞に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項７２に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項７２に記載の方法。
- 前立腺癌細胞増殖を抑制する方法であって、該癌細胞に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項７５に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項７５に記載の方法。
- 前立腺腫瘍中の血管新生を抑制する方法であって、該腫瘍に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項７８に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項７８に記載の方法。
- 被験者の前立腺癌を治療する方法であって、該被験者に、有効量の進行によって抑制される遺伝子１３（ＰＳＧｅｎ １３）タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で投与することを含む、該方法。
- 該核酸が配列番号１に示す配列を有する、請求項８１に記載の方法。
- 該核酸が配列番号３に示す配列を有する、請求項８１に記載の方法。
- ヒトＰＳＧｅｎ １３による治療のためのヒト癌細胞標的を同定する方法であって、染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３中の欠失を検出することを含む、該方法。
- 癌発症の危険が増大した個体を同定する方法であって、該個体における染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３中の欠失を検出することを含む、該方法。
- 該癌が膵臓癌、腹膜の乳頭状漿液性癌、肝細胞癌、大Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、乳癌、胃癌、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。
- 被験者における癌の進行を検出する方法であって、該被験者における染色体領域６ｑ２３．２−６ｑ２３．３中の欠失を検出することを含む、該方法。
- 該癌が膵臓癌、腹膜の乳頭状漿液性癌、肝細胞癌、大Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、乳癌、胃癌、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項８７に記載の方法。
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