KR20090060212A - 암의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흑색종 또는 피부암을 검출하고 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이며, 보다 특히 본 발명은 BCSC-1 발현이 흑색종 및 피부암 세포에서 변질되므로 상기 상태에 있어서 효과적인 검출 방법 및 키트를 계획할 수 있도록 하며, 본 발명은 또한 흑색종 및 피부암 세포에서 BCSC-1 발현의 회복 또는 증가로 종양성이 억제되며, 이것이 흑색종 및 피부암의 치료에 효과적인 신규의 접근법을 제공하며, 본 발명은 흑색종 및 피부암의 존재, 단계 또는 형태뿐만 아니라 이를 예견하기 위해서 사용될 수 있으며, 임의의 포유류 피험자, 특히 인간 피험자에 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다.

Description

암의 검출 및 치료 방법{DETECTION AND TREATMENT OF CANCERS}

본 발명은 흑색종(melanoma) 및 피부암의 검출 및 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 특히 본 발명은 흑색종 및 피부암 세포에서 BCSC-1 발현이 달라지므로 흑색종 및 피부암의 상태에 있어서의 효과적인 검출 방법 및 키트의 도안을 가능하게 한다는 것을 밝히고 있다. 본 발명은 또한 흑색종 및 피부암 세포에서 BCSC-1의 발현이 증가하거나 또는 회복되면 종양성(tumorigenicity)이 억제되며, 이것은 흑색종 및 피부암의 치료를 위해서 신규이며 효과적인 접근 방법을 나타낸다는 것을 보여주고 있다. 본 발명은 흑색종 및 피부암의 존재, 단계 또는 형태뿐만 아니라 이것의 성질을 검출하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명은 임의의 표유류 피험자, 특히 인간 피험자에 사용할 수 있다.

흑색종은 광범위하게 퍼져있는 전이성 질환을 야기시키는 경향의 공격적인 암이다. 현재까지 피부에만 한정되어 있는 경우에 암을 제거하는 것이 유일하게 성공적인 치료 방법이기 때문에 초기에 진단하는 것이 필수적이다. 불행하게도 흑색종은 대부분이 종래의 화학적 요법에 저항하며, 전이성 흑색종에 있어서의 새로운 치료 방법이 절박하다.

도 1: 착색된 피부 손상의 진행 모델

도 2: BSCS-1의 발현은 흑색종 환자에서 약화되었다. 양성 모반 또는 흑색종 피부 손상이 있는 환자의 피부 생체 조직에서 BCSC-1 유전자의 실시간 PCR에 의한 RNA 발현. 0의 값은 양성 모반(건강한 공여자) 환자에서의 상기 유전자의 평균 발현을 나타낸다. 모든 전이성 흑색종 환자는 건강한 공여자의 평균 발현 값과 비교해서 낮은 발현(20배까지 낮음)을 보여준다.

도 3: 흑색종 환자에서는 BSCS-1의 긴 아이소형이 선별적으로 약하게 발현된다. BSCS-1 유전자의 몇 가지 아이소형을 기재하였다. 여러가지 엑손의 실시간 PCR 분석으로 긴 아이소형(엑손 13-18)에서 배타적으로 존재하는 엑손은 흑색종 환자에서 감소된 엑손이라는 것을 확인하였다.

도 4: 흑색종 환자 및 흑색종 세포주에서 BSCS-1의 발현이 약화된다. 이러한 결과는 큰 코호트의 환자에서 확인하였고, 또한 흑색종 세포주에서도 확인하였다. BCSC-1 유전자의 긴 아이소형의 별현은 흑색종 환자 및 흑색종 세포주에서 현저하게 감소하였다.

도 5: BCSC-1의 이소성 발현(ectopic expression)은 흑색종 세포 분열을 감소시킨다. 흑색종 세포주를 BCSC-1을 암호화하는 렌티벡터(lentivector)로 형질도입시켰다. BCSC-1을 발현시키는 흑색종 세포는 음성 대조군과 비교해서 이들의 분열이 정지되거나 또는 현저하게 감소하였다. 이러한 효과는 BCSC 벡터로 형질 도입된 비-흑색종 세포주 (Hela)에서는 관찰되지 않았다.

도 6: BCSC-1의 이소성 발현은 웨스턴 블럿 및 실시간 PCR로 확인하였다. (왼쪽) BCSC-1 단백질의 생성은 12 일에 렌티바이러스 벡터를 암호화하는 BCSC-1의 증가된 투입량(2 및 20 ㎕)으로 형질 도입된 SK-Mel23 세포에서, 그러나 엠피티 벡터(C-)로 형질 도입된 세포는 아닌 세포에서 항-HA 항체를 사용한 웨스턴 블럿으로 확인하였다. BCSC-1의 긴 및 짧은 아이소형의 벡터 둘다로 트랜스펙션된 293T 세포는 항-HA 항체와 함께 BCSC-1을 검출할 수도 있는 양성 대조군으로서 사용하였다. (오른쪽) 실시간 PCR로 SK-Mel23 세포는 형질 도입 전에, 및 8일에 엠피티 벡터로 형질되입되는 때에 BCSC-1의 검출가능한 수준이 발현되지 않았다는 것을 알 수 있다. 그러나 BCSC-1 벡터로 형질 도입된 SK-Mel23 세포는 BCSC-1 mRNA가 높은 수준으로 발현되었다.

도 7: BCSC-1의 이소성 발현으로 흑색종 세포주 분열이 차단되었다.

도 8: BCSC-1이 세포 주기의 G2-M 상의 흑색종 세포를 차단하였다.

도 9: BCSC-1을 암호화하는 Hela는 세포 주기 G2 및 M 상에서 저지되었다. A) BCSC-1의 짧은 아이소형으로 형질 도입된 Hela 세포; B) BCSC-1의 긴 아이소형으로 형질 도입된 Hela 세포.

도 10: BCSC-1은 전이성 흑색종의 뮤린 모델에서 폐-전이성의 수를 감소시킨다.

발명의 상세한 설명

흑색종의 발병률은 증가하고 있다. 이것은 광범위한 질병을 야기시키는 경향을 갖는 공격적인 암이다. 흑색종 발암 현상을 기본으로 하는 질병을 이해하기 위해서는 전체적인 유전자 발현 연구를 기본으로 하는 신규의 방법이 필요하다.

도 1에서 밝히고 있는 것과 같이 양성 모반(왼쪽), 이형성 모반(중간) 및 악성 흑색종(오른쪽) 사이의 전이는 형태학 기술을 사용하여 분석할 수 있다. 그러나 이러한 전이를 증명하는 분자 결과는 부분적으로만 이해할 수 있다.

양성 모반과 흑색종 사이의 전이를 통제하는 분자 형태를 규명하기 위해서 본 연구자들은 DATAS(선택적 스플라이싱을 가지고 전사의 분화 분석; Differential Analysis of Transcripts with Alternative Splicing)라고 하는 유전자 프로파일링 기술을 사용하여 착색된 흑색종에서 선택적 스플라이싱을 연구하기로 하였다. 이러한 전체적인 유전자 발현 분석을 통해서 본 연구자들은 종양-관련 스플라이싱 결과로부터 수득된 신규의 서열을 유도하였다. 착색된 피부 손상의 상이한 단계 및 양성 모반(음성 대조군)의 생체 조직을 포함하는, 총 70명의 환자의 생체 조직에서 추출된 RNA를 실시간 반-정량 RT-PCR을 사용하여 본 연구자들은 전이성 질환 환자에서 BCSC-1의 발현이 선별적으로 약해진 것을 설명할 수 있었다.

추가로 본 연구자들은 짧은 아이소형에는 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 흑색종에서 BCSC-1의 긴 아이소형의 발현이 선별적으로 약해진 것을 규명하였다.

또한 흑색종 세포주에서 HA가 부착된 BCSC-1을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로부터의 이소성 발현은 이러한 세포 분열의 강한 감소를 유도한다.

동시에 본 결과로 흑색종 및 피부암에서 선별적으로 발현이 약화된 신규의 유전자(BCSC-1)를 규명했다. 단지 상기 유전자의 선택된 "긴" 아이소형(c,f)은 전이성 흑색종에서 발현이 약화되며, 반면에 "짧은" 아이소형은 영향을 받지 않아 전이성 종양에서 손실된 아이소형을 검출하기 위한 보다 특이적인 진단 방법의 개발 가능성을 발견하였다. 최종적으로 이소성 발현이 전이성 흑색종 세포주의 세포 분열을 서서히 약화시켜 BCSC-1이 전이성 질환 진행에서 기능적인 역활을 수행한다는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명은 흑색종 및 피부암의 진단 및 치료 뿐만 아니라 치료 활성 약물의 스크리닝을 위한 BCSC-1 유전자 및 상응하는 발현 제품을 사용하는 것을 제안한다. 본 발명은 다양한 피험자, 특히 성인과 아이들을 포함하는 인간에 사용할 수 있다.

정의

본 발명의 내용에서 "BCSC-1 유전자"라는 용어는 코딩 서열, 비-코딩 서열, 전사 및/또는 전이를 제어하는 조절 서열(예를 들면 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등) 뿐만 아니라 모든 상응하는 발현 물질, 예컨대 RNAs(예를 들면 mRNAs)를 포함하는 세포 또는 조직에서의 모든 BCSC-1 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. "유전자"라는 용어는 게놈 DNA(gDNA), 상보적 DNA(cDNA), 합성 또는 반-합성 DNA를 포함하는 임의의 형태의 코딩 핵산 뿐만 아니라 상응하는 RNA의 임의의 형태를 포함하는 것으로 해석할 수 있다. 유전자라는 용어는 특히 재조합 핵산, 즉 어셈블링, 컷팅, 라이게이팅 또는 서열 증폭에 의헤서 인공적으로 만들어진 비 자연적으로 발생된 핵산 분자를 포함한다. 유전자는 다른 형태, 예컨대 단일 가닥을 기획할 수도 있지만 통상적으로 이중 가닥이다. 유전자는 다양한 공급원을 통해서 및 당업에 공지된 다양한 기술, 예컨대 DNA 라이브러리 스크리닝 또는 다양한 천연 공급원으로부터의 증폭에 의해서 수득될 수 있다. 재조합 핵산은 화학적 합성, 유전 공학, 효소적 기술 또는 이의 결합 방법을 포함하는 종래 기술에 의해서 제조할 수 있다.

BCSC-1 유전자 서열은 유전자 뱅크, 예컨대 NM_014622 및 NM_198315에서 찾을 수 있다. 엑손의 경계가 굻은 문자로 되어있고, 시작 및 종결 코돈에 밑줄이 있는 서열 번호 14를 참조할 수 있다.

"BCSC-1 유전자"라는 용어는 임의의 변체, 단편 또는 상기에서 규정한 임의의 코딩 서열의 유사물을 포함한다. 이러한 변체는 예를 들면 개개 사이의 대립유전자의 변종(예를 들면 다형성), 변이된 대립유전자, 선택적 스플라이싱 형태 등에 의해 자연적으로 발생하는 변체를 포함한다. 변체라는 용어는 또한 다른 공급원 또는 조직에서 취득한 BCSC-1 유전자 서열을 포함한다. 변체는 상기에서 규정한 코딩 서열과 실제적으로 유사한 것이 바람직하며, 즉 상기에서 규정한 코딩 서열과 약 65 % 이상, 통상적으로는 약 75 % 이상, 바람직하게는 약 85 % 이상, 보다 바람직하게는 약 95 % 이상이 확인된 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. BCSC-1의 변체 및 유사체는 통상적으로 엄격한 교잡화 조건하에서 상기에서 규정한 서열(또는 이의 상보적인 가닥)과 교잡하는 핵산 서열을 포함한다.

통상적으로 엄격한 교잡화 조건은 온도가 30 ℃ 이상, 바람직하게는 35 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 42 ℃ 초과이며, 및/또는 염도는 약 500 mM 이하, 바람직하게는 200 mM 이하이다. 교잡화 조건은 온도, 염도 및/또는 다른 시약, 예컨대 SDS, SSC 등의 농도를 조정하여 당업에 통상의 지식을 가진 자들에 의해서 조정될 수 있다.

BCSC-1 유전자 단편은 상기에서 기재된 서열의 약 8 이상의 연속 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 15 이상, 보다 바람직하게는 약 20 뉴클레오티드 이상, 보다 더 바람직하게는 30 이상의 뉴클레오티드의 임의의 부분을 나타낸다. 단편은 8 내지 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 15 내지 100, 보다 바람직하게는 20 내지 100의 모든 가능한 뉴클레오티드 길이를 포함한다.

BSCS-1 유전자의 몇가지 아이소형은 선택적 스플라이싱의 결과로서 존재한다. 이러한 관점에서 BCSC-1의 긴 아이소형 및 짧은 아이소형은 이들의 보유하는 엑손(엑손의 수)에 따라서 결정할 수 있다. 보다 특히 BCSC-1 게놈 DNA는 선택적으로 스플라이싱될 수 있는 18개 엑손을 포함한다. 각 엑손의 위치는 서열 번호 14에 나타냈으며, 서열 번호 14의 cDNA 서열을 참조하여 나타낸 위치로서 하기 표에 요약하였다:

본 발명의 내용에서 긴 BCSC-1 아이소형은 엑손 13-18의 1개 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 아이소형이다. 짧은 BCSC-1 아이소형은 엑손 13-18의 임의의 1개의 뉴클레오티드 서열 또는 상응하는 아미노산 서열을 포함하지 않는 아이소형이다. 긴 BCSC-1 아이소형의 예로는 엑손 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17 또는 1-18의 뉴클레오티드 서열 또는 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 관점에서 긴 아이소형은 모든 엑손 11-18을 함유하는 NM_014622에 나타냈다. 유사하게 엑손 8-16이 결손되었으며, 엑손 18을 함유하는 AY366504 및 AY366507에 나타낸 아이소형은 본 발명의 내용에서 긴 아이소형이다. 긴 아이소형의 또 다른 예로는 AY366508에 개시하였다.

BCSC-1 단백질은 상기에서 규정한 BCSC-1 유전자에 의해 암호화된 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. "폴리펩티드"라는 용어는 아미노산의 확장을 포함하는 임의의 분자를 나타낸다. 상기 용어는 다양한 길이의 분자, 예컨대 펩티드 및 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 예컨대 글리코실화 및/또는 아세틸화 및/또는 화학 반응 또는 커플링으로 변형될 수 있으며, 하나 또는 몇개의 비-자연 또는 합성 아미노산을 함유할 수 있다. BCSC-1 폴리펩티드의 특이적 예로는 NM_014622 또는 NM_198315에 나타낸 서열 모두 또는 일부를 포함한다(서열 번호 13 참조).

검출/진단

본 발명은 현재 피험자에서의 BCSC-1 유전자 아이소형의 모니터링을 기초로 하는 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 내용에서 "진단"이라는 용어는 성인 또는 어린아이에서 초기, 증상발현전기 및 마지막 단계를 포함하는 다양한 단계에서의 검출, 모니터링, 도싱, 비교 등을 포함한다. 진단은 예후, 발병 위험 또는 소인의 평가, 보다 적당한 치료를 규명하기 위한 피험자의 특성 파악 등을 포함하는 것이 통상적이다.

본 발명의 일반적인 목적은 피험자에서의 암의 존재, 단계 또는 형태를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 피험자로부터 취한 시료에서 변질된 긴 아이소형 BCSC-1 유전자 발현의 존재를 실험실 또는 생체외에서 검출하는 단계를 포함하며, 상기 변질된 긴 아이소형 BCSC-1 유전자 발현의 존재는 상기 피험자에서의 존재, 단계 또는 형태를 나타낸다.

본 발명의 추가의 일반적인 측면은 피험자로부터 취한 BCSC-1 긴 아이소형(들)을 검출하는 단계를 포함하는, 피험자에서의 암, 특히 고형암을 검출하는 방법이며, 이의 감소된 발현은 암의 존재, 단계 또는 형태를 나타낸다.

본 발명의 특정 목적은 피험자에서의 흑색종 또는 피부암의 존재, 단계 또는 형태를 검출하는 방법이며, 상기 방법은 피험자로부터 취한 시료에서 변질된 BCSC-1 유전자 발현의 존재를 실험실 또는 생체외에서 검출하는 것을 포함하며, 상기 변질된 BCSC-1 유전자 발현의 존재는 상기 피험자에서의 흑색종 또는 피부암의 존재, 단계 또는 형태를 나타낸다.

본 발명의 추가의 목적은 피험자로부터 취한 시료를 제공하는 일차 단계를 포함하는 상기에서 규정한 방법이다.

치료 또는 약물의 반응을 분석 및 예견하거나 또는 치료 또는 약물의 부작용을 분석 및 예견하는 진단은 특정 치료 약물로 치료할 수 있는 지의 여부를 결정하기 위해서 사용할 수 있다. 예를 들면 진단으로 개인이 특정 약물로 치료하는데 양성 반응을 나타낼 것이라는 진단이 나오면 그 약물을 그 사람에게 투여할 수 있다. 대조적으로 특정 약물의 치료에 부정적인 반응이 나타날 것으로 진단된다면 대안적인 치료 방법을 처방할 수 있다. 부정적인 반응은 독성 부작용의 존재 또는 효과적인 반응의 부재로 규정할 수 있다.

변질된 BCSC-1 발현은 예를 들면 RNA 또는 폴리펩티드의 수준에서 당업에 공지된 임의의 기술에 의해서 결정할 수 있다.

본 발명에서 개시하고 있는 것과 같이 BCSC-1 발현은 흑색종 또는 피부암 세포에서 변질된다. 보다 특히 BCSC-1의 발현 수준은 비암성 피부세포 또는 평균 값과 비교해서 흑색종 또는 피부암 세포에서 감소한다. 보다 더 특히 BCSC-1 아이소형(들)의 발현 수준이 비암성 세포 또는 평균 값과 비교해서 암세포에서 감소한다. 따라서 바람직한 실시양태에서 본 발명의 방법은 BCSC-1 유전자, 특히 이의 긴 아이소형(들)의 발현 수준의 감소를 검출하는 단계를 포함한다. 통상적인 실시양태에서 본 방법은 시료의 BCSC-1 RNA 또는 폴리펩티드 종류, 특히 시료에서 BCSC-1 RNA 또는 폴리펩티드 긴 아이소형(들)의 (상대적인) 양을 검출하는 단계, 및 대조군 조직(예를 들면 비암성 세포)에서 측정한 것과 또는 평균 값 또는 참조 값과 상기 양을 비교하는 단계를 포함하며, 낮은 값은 암을 나타낸다. 추가의 특정 실시양태에서 본 방법은 긴 BCSC-1 RNA 또는 단백질 아이소형/짧은 BCSC-1 RNA 또는 단백질 아이소형의 비율을 각각 측정하는 단계를 포함하며, 대조군/참조 값과 비교하여 상기 비율의 임의의 변형은 암의 존재를 나타낸다. 몇개의 긴 아이소형의 (상대적인) 양을 측정할 수 있는데도 불구하고, 하나의 긴 아이소형/하나의 짧은 아이소형의 비율을 측정하거나 또는 단지 하나의 긴 아이소형의 양을 측정하는 것으로도 충분하다. 이러한 측정은 예를 들면 상응하는 프로브 또는 프라이머를 사용하여 엑손 13, 14, 15, 16, 17 또는 18의 검출, 또는 하기에서 설명할 예정인 이의 특이적 리간드를 사용한 암호화 아미노산 잔기의 검출을 기본으로 할 수 있다.

또한 본 발명은 BCSC-1 유전자 또는 폴리펩티드 내의 암-관련된 구조의 변질을 검출하는 것을 포함할 수도 있다. BCSC-1 유전자 또는 폴리펩티드에서의 이러한 변질은 다양한 재조합(들)에서 또는 다양한 재조합에 따라 코딩 및/또는 비-코딩 구역에서의 삽입, 재배열(들), 결실(들) 및/또는 변이(들)의 임의의 형태일 수 있다. 변이는 보다 특이적으로 점 돌연변이를 포함한다. 결실은 유전자의 코딩 또는 비-코팅 부위에서의 2개 이상의 잔기의 임의의 부위, 예컨대 2개 잔기 내지 전체 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 결실은 더 큰 결실이 발생할 수도 있지만 약 50개 이하의 연속 염기쌍의 단편 또는 반복 서열 또는 도메인(인트론)과 같은 작은 부위에 영향을 준다. 삽입은 유전자의 코딩 또는 비-코딩 부위에서 1개 또는 몇개의 첨가를 포함할 수 있다. 삽입은 통상적으로 유전자에 1개 내지 50개의 염기쌍의 첨가를 포함할 수 있다. 재배열은 서열의 역위를 포함한다. BCSC-1의 구조적 변질(들)로 정지 코돈의 생성, 프레임시프트 돌연변이, 아미노산 치환, 특정 RNA 스플라이싱 또는 진행, 물질 불안정성, 절단된 폴리펩티드 생성 등의 결과가 발생할 수 있다. 변질로 변질된 기능, 안정성, 표적화 또는 구조를 갖는 BCSC-1 폴리펩티드의 생성이 결과로서 발생할 수 있다.

당업에 공지된 다양한 기술을 변질된 BCSC-1 발현을 검출하고 정량하기 위해 사용할 수 있으며, 시퀀싱, 교잡화, 증폭 및/또는 특이 리간드(예컨대 항체)와의 결합을 포함한다. 다른 적당한 방법은 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드(ASO), 대립유전자-특이적 증폭, 서던 블럿(DNAs용), 노던 블럿(RNAs용), 단일-가닥 배좌 분석(SSCA), PFGE, 형광동소보합법(FISH), 겔 이동, 클램프 변성 겔 전기영동, 이형접합자 분석, RNase 보호법, 화학적 불일치 분할법, ELISA, 방사-면역 분석법(RIA) 및 면역-효소 분석법(IEMA)을 포함한다.

증폭은 당업에 공지된 다양한 기술, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 가닥 치환 증폭법(SDA) 및 핵산 서열 기본 증폭법(NASBA)에 따라 실행할 수 있다. 이러한 기술은 상업적으로 시판되는 시약 및 방법을 사용하여 실행할 수 있다. 바람직한 기술은 대립유전자-특이적 PCR 또는 PCR-SSCP를 사용하는 것이다. 증폭은 통상적으로 반응을 개시하기 위해서 특이적 핵산 프라이머를 사용해야 한다.

BCSC-1 유전자 또는 RNA로부터의 서열을 증폭시키기 위해 유용한 핵산 프라이머는 BCSC-1 유전자 또는 RNA 부위와 특이적으로 교잡하며, 상보적이다. BCSC-1 유전자 또는 RNA의 모든 부위 또는 일부에 사용할 수 있는 프라이머는 BCSC-1 그 자체의 서열을 기본으로 도안할 수 있다.

본 발명에 사용하기에 보다 바람직한 프라이머로 BCSC-1의 긴 아이소형(들)을 증폭시키며, 즉 BCSC-1 유전자 또는 RNA의 엑손 13-18의 임의의 하나 내에 위치하는 서열과 상보적이며, 특이적으로 교잡되는 서열을 함유한다.

이러한 관점에서 본 발명은 또한 BCSC-1 유전자 또는 RNA의 엑손 13-18의 임의의 하나 내에 위치하는 서열과 상보적이며, 특이적으로 교잡하는 핵산 프라이머에 관한 것이다. 이러한 프라이머를 사용하면 시료에서의 BSCS-1 유전자 또는 RNA의 긴 아이소형을 검출할 수 있다.

본 발명의 통상적인 프라이머는 약 5개 내지 60개의 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 약 8개 내지 25개의 뉴클레오티드 길이의 단일-가닥 핵산 분자이다. 상기 서열은 BCSC-1 유전자 서열에서 직접 유도할 수 있다. 완벽하게 상보적인 것이 특이성을 높이기 위해 바람직하다. 그러나 특정 불일치는 내성이 될 수 있다.

상기 프라이머의 특이적 예는 실시예의 표 1에 개시하였다(서열 번호 1-12).

본 발명은 또한 암 치료 피험자의 반응을 평가하는 방법 또는 피험자에서 암의 존재 또는 예견을 검출하는 방법에서 상기에서 기재한 핵산 프라이머 쌍 또는 핵산 프라이머를 사용하는 것에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서 선택적 교잡 방법을 사용하는 기술로 검출을 실행한다.

특정 검출 기술은 BCSC-1 유전자 또는 RNA에 있어서의 특이적인 핵산 프로브을 사용한 후에 하이브리드의 존재 및/또는 (상대적) 양을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 프로브는 (핵산 어레이 또는 칩 기술로서) 기재 또는 서포터 상에 고정되거나 또는 현탁액에 있을 수 있다. 하이브리드의 검출을 촉진시키기 위해서 프로브로 표지하는 것이 통상적이다.

이러한 관점에서 본 발명의 특정 실시양태는 BCSC-1의 긴 아이소형(들)에 트이적인 핵산 프로브와 피험자로부터 취한 시료를 접촉시키는 단계 및 하이브리드 형성을 평가하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서 방법은 BCSC-1의 다양한 긴 아이소형에 있어서 각각 특이적인 프로브 셋트와 시료를 동시에 접촉시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 내용에서 프로브는 BCSC-1 유전자 또는 RNA(의 표적 부위)와 특이적으로 교잡할 수 있으며, 상보적이고, 시료에서의 이의 존재 또는 (상대적) 양을 검출하기에 적당한 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 프로브는 BCSC-1 유전자 또는 RNA의 서열과 완벽하게 상보적인 것이 바람직하다. 프로브는 통상적으로 길이가 8개 내지 1000개의 뉴클레오티드, 예를 들면 10개 내지 800개, 보다 바람직하게는 15개 내지 700개, 통상적으로 20개 내지 500개의 단일-가닥 핵산을 포함한다. 더 긴 프로브도 또한 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 프로브는 길이가 8개 내지 500개의 단일 가닥 핵산 분자이며, BCSC-1 유전자 또는 RNA의 엑손 13-18의 임의의 하나 내에 함유하는 부위와 특이적으로 교잡할 수 있다.

특이성은 표적 서열에의 교잡화로 비-특이적 교잡화를 통해 발생되는 신호와는 구별할 수 있는 특이적 신호를 발생하는 것을 나타낸다. 완벽하게 상보적인 서열은 본 발명에 따른 프로브를 도안하기 위해 필요하다. 그러나 어느 정도의 불일치는 특이적 신호가 비-특이적 교잡화와는 구별할 수 있을 때 까지는 허용할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

프로브의 서열은 본 발명에서 제공되는 BCSC-1 유전자 및 RNA의 서열로부터 유도할 수 있다. 프로브의 화학적 변형뿐만 아니라 뉴클레오티드 치환도 실행할 수 있다. 하이브리드(예를 들면 삽입성 기)의 안정성을 증가시키거나 또는 프로브를 표지화하기 위해서 상기 화학적 변형을 성취할 수 있다. 표지의 통상적인 예로는 제한 없이 방사선, 형광성, 발광성, 효소적 표지화 등을 포함한다.

본 발명은 또한 피험자에서 암의 진행의 존재, 형태 또는 단계를 검출하는 방법에 상기에서 기재한 핵산 프로브를 사용하는 것에 관한 것이거나, 또는 암 치료에 대한 피험자의 반응을 평가하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기에서 규정한 프로브를 포함하는 핵산 칩에 관한 것이다. 상기 칩은 당업에 공지된 기술에 의해서 클론을 퇴적시키거나 또는 제자리에 제조할 수 있으며, 예컨대 (유리, 폴리머, 금속 등) 슬라이드와 같은 매트릭스 상에 표시된 핵산의 어레이를 포함하는 것이 통상적이다.

상기에서 지시한 것과 같이 BCSC-1 유전자 발현의 변질은 또한 BCSC-1 폴리펩티드의 존재 또는 (상대적) 양을 검출함으로써 검출할 수도 있다. 이러한 관점에서 본 발명의 특이적 실시양태는 BCSC-1 폴리펩티드에 특이적인 리간드와 시료(혈액, 혈장, 혈청 등과 같은 생물학적 유액을 포함할 수 있음)를 접촉시키는 단계 및 복합체 형성을 측정하는 단계를 포함한다.

상이한 형태의 리간드는 예컨대 특이적 항체로서 사용될 수 있다. 특이 실시양태에서 시료는 BCSC-1 폴리펩티드에 특이적인 항체와 접촉하며, 면역 복합체의 형성을 측정한다. 면역 복합체의 검출을 위한 다양한 방법은 예컨대 ELISA, 방사면역분석법(RIA) 및 면역-효소적 분석법(IEMA)을 사용할 수 있다.

본 발명의 내용에서 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 뿐만 아니라 실질적으로 동일한 항원 특이성을 갖는 이의 임의의 단편 또는 유도체를 나타낸다. 단편은 Fab, Fab'2, CDR 부위 등을 포함한다. 유도체는 단일-사슬 항체, 인간 항체, 다-관능성 항체 등을 포함한다.

가장 바람직한 리간드는 BCSC-1의 긴 아이소형(들)에 특이적이며, 즉 엑손 13-18의 임의의 하나에 의해 암호화되는 아미노산 서열내에 포함된 에피톱과 결합한다.

BCSC-1 폴리펩티드에 특이적인 항체는 BCSC-1 폴리펩티드와 선택적으로 결합하는 항체를 나타낸다. 보다 특히 BCSC-1 폴리펩티드 또는 이의 에피톱-함유 단편에 대해 발생하는 항체를 나타낸다. 다른 항원에 비-특이적인 결합이 발생하지만 표적 BCSC-1 폴리펩티드와의 결합은 높은 친화도로 발생하며, 비-특이적 결합과는 확실하게 구별할 수 있다.

특이적 실시양태에서 본 방법은 BCSC-1 폴리펩티드에 특이적인 항체(상기 항체로 코팅된 서포터)와 피험자로부터 취한 시료를 접촉시키는 단계 및 면역 복합체의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서 시료는 상이한 BCSC-1 아이소형에 특이적인 다양한 항체(상기 항체로 코팅된 서포터)와 동시에, 또는 평행으로 또는 순차적으로 접촉할 수 있다.

다른 특이적 실시양태에서 본 발명은 피험자에서의 암의 존재 또는 예견을 검출하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 BCSC-1 폴리펩티드의 긴 아이소형에 특이적인 리간드와 피험자로부터 취한 시료(혈액, 형장, 혈청 등과 같은 생물학적 유액을 포함할 수 있음)를 실험실 또는 생체외에서 접촉시키는 단계와 암의 존재 또는 예견을 암시하는, 형성된 복합체의 (상대적인) 양을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 피험자에서의 암의 존재, 단계 또는 형태를 검출하는 방법 또는 암 치료에 대한 피험자의 반응을 평가하는 방법에서 상기에서 기재한 리간드, 바람직하게는 항체, 단편 또는 이의 유도체를 사용하는 것과 관련이 있다.

본 발명은 또한 BCSC-1 유전자, RNA 또는 폴리펩티드의 존재 또는 (상대적) 양을 피험자로부터 취한 시료에서 검출하기 위한 제품과 시약을 포함하는 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 진단 키트는 본 발명에서 기재하는 임의의 프라이머, 임의의 프라이머 쌍, 임의의 핵산 프로브 및/또는 임의의 리간드, 바람직하게는 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 상기 진단 키트는 교잡화, 증폭 또는 항체-항원 면역 반응을 실행하기 위한 시약 및/또는 방법을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 진단 방법은 실험실, 생체외 또는 생체내, 바람직하게는 실험실 또는 생체외에서 실행할 수 있다. 피험자로부터 취한 시료를 사용하여 BCSC-1 유전자 발현에서의 임의의 변질을 평가한다. 상기 시료는 핵산 또는 폴리펩티드를 함유하는 피험자로부터 유도된 생물학적 시료일 수 있다. 상기 시료의 예로는 유액, 조직, 세포 시료, 기관, 생체 조직 등을 포함한다. 조직, 생체 조직, 예를 들면 피부 암 세포, 조직 또는 시료가 가장 바람직한 시료이다. 시료는 종래 기술에 따라 수집할 수 있으며, 진단용으로 바로 사용할 수 있으며, 또는 저장할 수도 있다. 시료는 시험하기 위한 핵산 또는 폴리펩티드의 유용성을 확실히하거나 또는 개선시키기 위해서 방법을 실행하기 이전에 처리할 수 있다. 처리는 예를 들면 세포용해(예를 들면 기계적, 물리적, 화학적 세포 용해 등), 원심분리 등을 포함한다. 또한 핵산 및/또는 폴리펩티드는 종래의 기술에 의해서 미리 정제하거나 또는 양을 늘릴 수 있으며, 및/또는 복잡도를 감소시킬 수 있다. 핵산 및 폴리펩티드는 또한 이의 단편을 제조하기 위해서 효소 또는 다른 화학적 또는 물리적 처리로 처리할 수 있다. 본 방법의 높은 민감성 때문에 매우 소량의 시료를 가지고 분석을 실행해도 충분하다.

지시한 것과 같이 시료는 프로브, 프라이머 또는 리간드와 같은 시약과 접촉시켜 BCSC-1 유전자 또는 RNA 또는 폴리펩티드의 존재 및/또는 (상대적) 양을 평가하는 것이 바람직하다. 접촉은 임의의 적당한 장치, 예컨대 플레이트, 튜브, 웰, 유리 등에서 실행할 수 있다. 특이적 실시양태에서 접촉은 예컨대 핵산 어레이 또는 특이적 리간드 어레이와 같은 시약이 코팅된 기재 상에서 실행한다. 상기 기재는 고체이거나 또는 반-고체 기재, 예컨대 유리, 플라스틱, 나일론, 종이, 금속, 폴리머 등을 포함하는 임의의 서포터일 수 있다. 상기 기재는 다양한 형태 및 크기, 예컨대 슬라이드, 막, 비드, 컬럼, 겔 등일 수 있다. 접촉은 시약과 시료의 핵산 또는 폴리펩티드 사이에서 형성되는 복합체에 적당한 조건하에서 이루어질 수 있다.

시료에서 변질된 BCSC-1 발현이 발견되면 흑색종 또는 피부암 진행의 존재, 형태 또는 단계를 나타낸다. 변질된 BCSC-1 발현의 존재가 확인되면 보다 효과적이며, 환자에게 맞는 적당한 치료학적 중재를 계획한다. 또한 증상발현전 수준에서의 이러한 측정으로 적용시킬 예방법을 계획한다.

약물 스크리닝

본 발명은 또한 약물 후보물 또는 선두물질을 스크리닝하기 위한 신규의 표적 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 결합 분석 및/또는 기능적 분석을 포함하며, 동물 등의 모든 시스템을 실험실에서 실행할 수 있다.

이러한 관점에서 본 발명의 목적은 흑색종 또는 피부암 상에서 생물학적인 활성 화합물을 선별하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 BCSC-1 발현 또는 활성을 모방하거나 또는 자극시키는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.

본 발명의 추가의 목적은 흑색종 또는 피부암 상에서 생물학적 활성 화합물을 선별하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 시험 화합물과 리포터 컨스트럭트를 포함하는 재조합 숙주 세포를 접촉시키는 단계 및 리포터 유전자의 발현을 촉진시키는 시험 화합물을 선별하는 단계를 포함하며, 상기 리포터 컨스트럭트는 BCSC-1 유전자 프로모터의 제어하에 리포터 유전자를 포함한다.

본 발명의 특정 목적은 흑색종 또는 피부암 상에서 활성이 있는 화합물을 선별하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 BCSC-1 유전자 또는 폴리펩티드와 시험 화합물을 실험실에서 접촉시키는 단계 및 상기 BCSC-1 유전자 또는 폴리펩티드 각각에 결합하는 상기 시험 화합물의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 유전자 또는 폴리펩티드와의 결합은 상기 화합물의 능력이 상기 표적의 활성을 조절하여 흑색종 또는 피부암을 유도하는 경로에 영향을 주는 것에 관한 징후이다. BCSC-1 폴리펩티드는 긴 아이소형인 것이 바람직하다.

결합의 측정은 다양한 기술, 예컨대 시험 화합물의 표지화, 표지된 참조 리간드와의 결합 등에 의해 실행할 수 있다.

본 발명의 추가의 목적은 흑색종 또는 피부암 상에서 활성이 있는 화합물을 선별하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 BCSC-1 폴리펩티드와 시험 화합물을 실험실에서 접촉시키는 단계 및 상기 폴리펩티드의 활성을 조절하는 상기 시험 화합물의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. BCSC-1 폴리펩티드는 긴 아이소형인 것이 바람직하다.

본 발명의 추가의 목적은 생물학적으로 활성인 화합물을 선별하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 BCSC-1 유전자와 시험 화합물을 실험실에서 접촉시키는 단계 및 상기 유전자의 긴 아이소형(들)의 발현을 조절하는 상기 시험 화합물의 능력을 검출하는 단계를 포함한다.

스크리닝 방법의 특정 실시양태에서 조절이 활성화된다.

상기 스크리닝 분석은 임의의 다양한 장치, 예컨대 플레이트, 튜브, 디쉬, 플라스크 등에서 실행할 수 있다. 통상적으로 분석은 다중-웰 플레이트에서 실행된다. 몇 가지의 시험 화합물을 평행하게 분석할 수 있다. 또한 시험 화합물은 다양한 원천, 천연물 및 조성물의 시험 화합물일 수 있다. 상기는 다른 물질과의 혼합물로 또는 단독으로 임의의 유기 또는 무기 물질, 예컨대 지질, 펩피드, 폴리펩티드, 핵산, 작은 분자 등일 수 있다. 상기 화합물은 예를 들면 물질의 분자 다양성 혼합물(combinatorial library) 모두 또는 일부일 수 있다.

약학적 조성물, 치료

본 발명의 추가의 목적은 (i) BCSC-1 폴리펩티드의 긴 아이소형, 동일한 것을 암호화하는 핵산, 하기에서 설명하는 벡터 또는 재조합 숙조 세포, 및 (ii) 약학적 허용 담체 또는 운반체를 포함하는 약학적 조성물이다.

본 발명은 또한 피험자에서의 흑색종 또는 피부암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기에서 기재한 것과 같은 조성물을 상기 피험자에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 피험자에서의 흑색종 또는 피부암을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 BCSC-1 폴리펩티드의 긴 아이소형의 유효량을 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 흑색종 또는 피부암을 치료하는 약제의 제조를 위해 BCSC-1 단백질을 암호화하는 핵산 또는 BCSC-1 단백질을 사용하는 것이다. BCSC-1 단백질은 긴 아이소형인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 암을 치료하는 약제의 제조를 위한 긴 BCSC-1 단백질 아이소형의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 또한 흑색종 또는 피부암의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 BCSC-1 작용제의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 또한 흑색종 또는 피부암의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 BCSC-1 유전자 발현을 자극하는 화합물의 사용을 포함한다.

본 발명의 내용에서 "치료(treating)"라는 용어는 암 진행의 억제, 암 분열의 억제, 암 크기 감소, 암 세포의 종양성 억제, 질환의 진행 연기를 포함한다.

피부암은 기저 세포암종, 편평 세포암종, 메켈 암종, 원발성 피부성 림프종 뿐만 아니라 피부 또는 관련된 표면 조직의 임의의 다른 세포 분열성 질환으로부터 선별할 수 있다.

실시예에서 나타낸 것과 같이 BCSC-1 긴 이아소형을 피부암 세포에 적용하면 종양의 분열이 억제된다. 피험자에게 이러한 기능을 적용하는 것은 유전자 또는 단백질 치료를 통해서, 또는 BCSC-1 폴리펩티드 활성을 조절하거나 또는 모방하는 화합물(예를 들면 상기 스크리닝 분석에서 규명한 작용제)을 투여하여 완성할 수 있다. 특히 BCSC-1 유전자는 예를 들면 바이러스 벡터 또는 플라즈미드를 사용하여 이를 필요로하는 피험자 세포에 도입시킬 수 있다. 다양한 바이러스계 운반체를 사용할 수 있으며, 예컨대 렌티바이러스를 포함하는 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스 및 레트로바이러스등이 있다. 예를 들면 US 특허 6,069,134 및 6,143,290에서는 암 세포에 암 억제 유전자를 이동시켜 발현시키는 인간 아데노바이러스의 사용을 밝히고 있다. 상기 유전자는 또한 내이키드 DNA(naked DNA)로서 도입될 수 있다. 상기 유전자는 수용체 숙주 세포의 게놈으로 통합하거나, 또는 염색체외에 남아있도록 제공될 수 있다. 통합은 상동 재조합을 통해서 무작위로 발생하거나 또는 정학하게 규정된 위치에서 발생할 수 있다. 추가의 기술은 유전자 총, 리포좀-매개 트랜스펙션, 양이온성 지질-매개 트랜스펙션 등을 포함한다. 유전자 치료는 직접적인 유전자 주입 또는 기능적 BCSC-1 단백질 폴리펩티드를 발현시키는 제조된 유전적 변형 세포를 생체외에서 투여함으로써 완성할 수 있다. 단백질 치료는 또한 당업에 통상의 지식을 가진 자들에게 공지된 기술에 의해서 성취될 수 있다. 이러한 단백질 치료는 특히 BCSC-1이 분비 단백질인 것을 참조하는 것이 적합하다. 유전자 치료 목적에 있어서 BCSC-1 유전자의 통상적인 투여량은 10⁴-10⁹ BCSC-1 발현 벡터 사이에 포함한다. 단백질 치료 목적에 있어서 BCSC-1 단백질의 통상적인 투여량은 투여량 당 1 ng 내지 100 mg을 포함한다. 일반적으로 치료학적 유효량은 질환 세포내에 세포 분열을 억제하거나 또는 감소시킬 수 있는 투여량이다. 이러한 투여량은 병상의 심각성, 방법, 환자 등을 기본으로 숙련된 자에 의해서 조정될 수 있다.

BCSC-1 단백질 및 BCSC-1 발현 벡터 또는 세포는 제한 없이 경구, 전신, 국소 및 장관외(예를 들면 피하, 복강내, 혈관내 등)를 포함하는 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 하나의 실시양태에서 화합물은 예를 들어 수술 중에 암 부위 또는 암 부근(또는 제거된 암의 부위)에 직접 적용시키거나, 또는 암에 직접 접근하도록 하는 다른 수단(예를 들면 카테터)에 의해서 적용시킨다.

벡터 및 재조합 세포

본 발명의 추가 측면은 진단, 치료 또는 스크리닝에 사용하는 신규 물질에 관한 것이다.

보다 특히 본 발명의 추가 목적은 BCSC-1 폴리펩티드, 바람직하게는 이의 긴 아이소형을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터이다. 상기 벡터는 클로닝 벡터, 또는 보다 바람직하게는 발현 벡터, 즉 수용 숙주 세포(competent host cell)에 상기 벡터로부터 BCSC-1 폴리펩티드의 발현을 야기시키는 조절 서열을 포함하는 벡터일 수 있다.

이러한 벡터들은 유전자 도입 또는 "넉 아웃(Knock Out)" 비-인간 동물을 만들기 위한 실험실, 생체외 또는 생체내의 BCSC-1 폴리펩티드를 발현시키고, 핵산을 증폭시키고, 안티센스 RNAs를 발현시키는 것 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 벡터는 통상적으로 조절 서열, 예를 들면 프로모터, 폴리A 등에 시술 가능하게 연결된 본 발명에 따른 BCSC-1 코딩 서열을 포함한다. "시술 가능한 연결(operably linked)"이라는 용어는 코딩 및 조절 서열이 기능적으로 연관되어 조절 서열이 코딩 서열의 발현(예를 들면 전사)을 야기시키는 것을 나타낸다. 벡터는 추가로 하나 또는 몇개의 복제 및/또는 선별가능한 마커의 원천을 포함할 수 있다. 프로모터 부위는 코딩 서열에 대하여 동종이거나 또는 이종일 수 있으며, 생체내 사용을 위한 것을 포함하여, 임의의 적당한 숙주 세포에서 편재하는, 구성되는, 조절 및/또는 조직 특이적 발현을 위해서 제공할 수 있다. 프로모터의 예로는 박테리아 프로모터(T7, pTAC, Trp 프로모터 등), 바이러스 프로모터(LTR, TK, CMV-IE 등), 포유동물 유전자 프로모터(알부민, PGK 등) 등을 포함한다.

벡터는 플라스미드, 바이러스, 코스미드, 파아지, BAC, YAC 등일 수 있다. 플라즈미드 벡터는 상업적으로 이용가능한 벡터, 예컨대 pBluescript, pUC, pBR 등으로부터 제조될 수 있다. 바이러스 벡터는 당업에 공지된 재조합 DNA 기술에 따라 배큘로바이러스, 레트로바이러스(예를 들면 렌티바이러스), 아데노바이러스, AAVs 등으로부터 제조될 수 있다.

재조합 바이러스는 바람직하게는 복제-결함, 보다 바람직하게는 E1- 및/또는 E4-결함 아데노바이러스, Gag-, pol- 및/또는 env-결함 레트로바이러스 및 Rep- 및/또는 Cap-결함 AAVs로부터 선택한다. 이러한 재조합 바이러스는 당업에 공지된 기술, 예컨대 포장 세포를 트랜스펙션시키거나 또는 헬퍼 플라즈미드 또는 바이러스로 전달 트랜스펙션에 의해서 제조할 수 있다. 바이러스 포장 세포의 통상적인 예로는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등을 포함한다. 상기 복제-결함 재조합 바이러스를 제조하는 상세한 방법은 예를 들면 WO95/14785, WO96/22378, US5,882,877, US6,013,516, US4,861,719, US5,278,056 및 WO94/19478에서 찾을 수 있다.

본 발명의 추가의 목적은 상기에서 규정한 재조합 BCSC-1 유전자 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 적당한 숙주 세포는 제한하지는 않지만 원핵 세포(예컨대 박테리아) 및 진핵 세포(예컨대 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)을 포함한다. 특이적인 예로는 E. coli, 클루이베로마이세스 또는 사카로마이세스 효모, 포유류 세포주(예를 들면 베로 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등) 뿐만 아니라 원발성 또는 확립된 포유류 세포 배양(예를 들면 섬유아 세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방 세포 등으로부터 제조됨)을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 BCSC-1 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 (i) 상기에서 기재한 것과 같은 재조합 핵산 또는 벡터를 수용 숙주 세포로 실험실 도는 생체외에서 도입하는 단계, (ii) 수득된 재조합 숙주 세포를 실험실 또는 생체외에서 배양하는 단계 및 (iii) 선택적으로 BCSC-1 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 선택하는 단계를 포함한다.

상기 재조합 숙주 세포는 BCSC-1 폴리펩티드의 제조 뿐만 아니라 하기에 기재한 것과 같은 활성 분자의 스크리닝을 위해 사용할 수 있다. 이러한 세포는 또한 피부암을 연구하기 위한 모델 시스템으로서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 임의의 적당한 배양 장비(플레이트, 플라스크, 디쉬, 튜브, 파우치 등)에서 적당한 배양 배지, 예컨대 DMEM, RPMI, HAM 등으로 유지할 수 있다.

본 발명의 추가의 측면 및 이점은 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 예증적으로 간주해야하는 하기 실시에에서 설명할 것이다.

착색된 피부 손상 및 흑색종의 유전자 발현 프로파일링을 연구하기 위해서 DATAS 기술을 이용하여 양성 모반(benign nevus) 및 전이성 흑색종의 선택적 스플라이싱을 전체적으로 분석하였다. 양성 모반과 전이성 흑색종 사이에서 다르게 발현되는 217개의 클론을 포함하는 양성 모반-전이성 흑색종의 DATAS 라이브러리는 상기 방법으로 만든다. 세포 사멸(apoptosis), 세포 주기, 물질 대사 등과의 밀접과 관계를 기본으로 흑색종의 진행에 영향을 줄 수 있는 몇 가지의 클론을 실시간 PCR(Real-Time PCR)를 사용하여 스크리닝하였다. 이러한 유전자 중에서 본 발명자들은 전이성 흑색종 환자에서 지속적으로 BCSC-1(Martin 등, PNAS 2003)의 발현이 약해지는 것을 확인하였다.

본 발명자들은 추가로 양성 모반, 비전형적인 모반, 원발성 흑색종 또는 전이성 흑색종 환자에서의 70개의 피부 생체 조직 코호트를 실시간 PCR에 의해서 BCSC-1의 발현을 관찰하였다. 이러한 결과로서 건강한 공여자와 비교해서 흑색종 환자 모두에서 BCSC-1의 발현이 감소한 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 분석한 흑색종 세포주 및 분석한 모든 흑색종 환자에서 확인되었다.

중요하게 BCSC-1 유전자가 흑색종 세포주 밖에서 발현되는 경우에 흑색종 세포의 분화가 정지하고, 세포 사멸이 실행되었다. 이러한 세포에서의 BCSC 단백질의 발현은 웨스턴 블럿(Western Blot)으로 확인하였다.

또한 본 발명자들은 BCSC-1을 전이성 흑색종의 뮤린 모델의 생체내에 주입하였을 때 폐-전이성의 수가 감소한 것을 확인하였다.

결론적으로 본 발명은 피부암에서 BCSC-1의 발현이 약해지며, 상기 암세포에서 BCSC-1의 발현을 유도하면 암의 진행을 억제시킨다는 것을 보여준다. 이러한 결과로서 BCSC-1이 흑색종 및 피부암의 병인에 중요한 역할을 하며, 신규의 진단 표지뿐만 아니라 흑색종 및 피부암에 있어서의 약물 개발에 가치있는 표적이 된다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 첫번째 목적은 피험자에서 흑색종 또는 피부암의 존재, 단계 또는 형태를 검출하는 방법에 있으며, 상기 방법은 피험자로부터 취한 시료에서 변질된 BCSC-1 유전자 발현의 존재를 실험실 또는 생체외에서 검출하는 단계를 포함하며, 이러한 변질된 BCSC-1 유전자 발현의 존재는 상기 피험자에서의 흑색종 또는 피부암의 존재, 단계 또는 형태를 나타낸다.

본 방법의 특이 실시양태에 따르면 변질된 발현은 상기 시료에서의 BCSC-1 유전자의 감소된 발현이며, 심지어 바람직하게는 상기 시료에서 BCSC-1 유전자의 긴 아이소형(들)(long isoform)의 감소된 발현을 의미한다.

본 발명의 또 다른 목적은 피험자에서의 암의 존재, 단계 또는 형태의 검출 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 피험자로부터 취한 시료에서 BCSC-1 유전자 또는 단백질의 긴 아이소형(들)의 (상대적인) 양을 실험실 또는 생체외에서 결정하는 단계를 포함하며, 이러한 양은 상기 피험자에서의 암의 존재, 단계 또는 형태를 나타낸다. 특정 실시양태에서 측정된 양은 대조군 또는 평균 값과 비교하거나, 또는 대조군 시료에서 측정한 것과 비교한다. 다른 실시양태에서 BCSC-1의 긴 아이소형(들)/BCSC-1의 짧은 아이소형(들)의 비율을 측정하며, 이러한 비율의 감소는 상기 암의 존재를 나타낸다. 상기 방법은 임의의 암, 특히 고형암의 검출에 사용할 수 있다.

이러한 점에 있어서 본 발명의 다른 목적은 피험자에서의 암의 존재, 단계 또는 형태의 검출 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 실험실 또는 생체외에서의 BCSC-1의 긴 아이소형(들)/BCSC-1의 짧은 아이소형(들)의 비율을 측정하는 단계를 포함하며, 대조군 상태 또는 참조 또는 평균 값과 비교해서 상기 값이 감소하면 상기 암이 존재함을 나타낸다. 상기 방법은 임의의 암, 특히 고형암의 검출에 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 피험자에서의 암의 존재, 단계 또는 형태를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 피험자로부터 유도된 유액 시료에서 BCSC-1 단백질의 (상대적인) 양을 실험실 또는 생체외에서 측정하는 단계를 포함하며, 상기 양은 상기 피험자에서의 암의 존재, 단계 또는 형태를 나타낸다. 통상적으로, BCSC-1 단백질의 긴 아이소형(들)의 (상대적인) 양을 측정하며, 대조군 또는 참조값과 비교해서 상기 양이 감소하면 암이 존재함을 나타낸다. 통상적인 실시양태에서, 유액 시료는 총 혈액, 혈청, 혈장, 소변 등에서 (예를 들면 희석, 농축, 정제, 분리 등에 의해서) 유도된다. 상기 방법은 임의의 암, 특히 고형암의 검출에 사용될 수 있다.

본 발명의 추가 목적은 피험자에서의 흑색종 및 피부암의 효과적인 치료의 평가 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 치료 전 및 후에 피험자로부터 취한 시료에서 BCSC-1 유전자 발현을 (실험실 또는 생체외에서) 비교하는 단계를 포함하며, 발현이 증가한 것은 치료에 양성 반응임을 나타낸다.

본 발명은 또한 흑색종 또는 피부암의 치료를 위한 약제 제조뿐만 아니라 치료에 상응하는 방법을 위한 BCSC-1 단백질을 암호화하는 핵산 또는 BCSC-1 단백질을 사용하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 흑색종 또는 피부암의 치료에 있어서의 약학적인 조성물의 제조를 위한 BCSC-1 작용제의 사용 뿐만 아니라 상응하는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 측면은 흑색종 또는 피부암의 치료에 있어서의 약학적인 조성물의 제조를 위한 BSCS-1 유전자 발현을 자극하는 화합물의 사용 뿐만 아니라 상응하는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기에서 규정한 화합물의 유효량을 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로하는 피험자의 흑색종 또는 피부암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 흑색종 또는 피부암에 생물학적으로 활성이 있는 화합물을 선별하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 BCSC-1 발현 또는 활성을 자극하거나 또는 모방하는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.

특이적 실시양태에서 본 방법은 리포터 컨스트럭트(reporter construct)를 포함하는 재조합 숙주 세포와 시험 화합물을 접촉시키는 단계, 및 리포터 유전자의 발현을 자극하는 시험 화합물을 선별하는 단계를 포함하며, 상기 리포터 컨스트럭트는 BCSC-1 유전자 프로모터를 제어하면서 리포터 유전자를 포함한다.

피부암은 기저 세포암종, 편평 세포암종, 메켈 암종, 원발성 피부성 림프종 뿐만 아니라 피부 또는 관련된 표면 조직의 임의의 다른 세포 증식성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

BCSC-1 유전자 발현은 종래 문헌에 공지된 임의의 기술, 예컨대 시퀀싱, 선별적 교잡화, 선별적 증폭 및/또는 특이적 리간드 결합에 의해서 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서 본 발명은 BCSC-1의 긴 아이소형의 검출, 또는 긴 아이소형 및 짧은 아이소형 사이의 구별, 또는 긴 아이소형(들)/짧은 아이소형(들)의 비율 측정을 위한 시약 및/또는 기술을 사용한다.

본 발명의 추가 측면은 BCSC-1의 긴 아이소형(들)을 (특이적으로) 증폭시키거나, 또는 긴 아이소형 및 짧은 아이소형을 구별하는 핵산 프라이머에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 측면은 BCSC-1의 긴 아이소형에 (특이적으로) 교잡되거나, 또는 긴 아이소형 및 짧은 아이소형을 구별하는 핵산 프로브에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 측면은 BCSC-1 단백질의 긴 아이소형과 (특이적으로) 결합하거나 또는 긴 아이소형 및 짧은 아이소형 사이를 구별하는 항체(이의 유도체를 포함하며, 하이브리도마를 제조함)에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 상기에서 규정한 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 컨테이너 또는 서포터, 및/또는 증폭, 교잡화 또는 결합 반응을 실행하기 위한 시약를 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 측면은 BCSC-1의 1개 이상의 긴 아이소형을 특이적으로 검출하도록 도안된 프라이머, 프로브 및/또는 항체를 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다.

A - 재료 및 방법

1. RNA 추출 및 cDNA 합성

총 RNA를 상이한 단계의 흑색종 환자 70명의 냉동 피부 조직 및 정상 모반 조직에서 분리하였다. 총 RNA 중 1 ㎍을 사용하여 하기의 제조 지시사항을 따라 랜덤 헥사머와 슈퍼스크립트 II 역전사효소(Invitrogen)로 cDNA를 합성하였다.

2. 실시간 반-정량적 RT-PCR

cDNA를 여러가지 프라이머를 결합한 것을 사용하여 BCSC-1의 다양한 엑손에 대해서 증폭시켰다. 증폭산물(amplicon)은 가능하다면 엑손 경계에 걸쳐 도안하고, 서열은 시험할 유전자에 특이적이 되도록 BLAST에 의해서 인간 게놈에 대항하여 정렬시켰다. 사용한 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다. 각 디자인의 효율성은 cDNA를 일련으로 희석하여 시험하였다. 올리고뉴클레오티드 PCR 반응(10 ㎕ 부피)은 희석 cDNA, 2 × SYBR 그린 마스터 믹스(Applied Biosystems), 300 nM 전방 및 역 프라이머를 함유한다. PCR은 하기 조건으로 SDS 7900 HT 장치(Applied Biosystems) 상에서 실행하였다: 50 ℃ 2 분, 95 ℃ 10 분, 및 95 ℃ 15 초 40 사이클 - 60 ℃ 1 분. 각 반응은 384-웰 플레이트에서 6회 복제로 실행하였다. Raw Ct 값은 SDS 2.2(Applied Biosystems)로 수득하였다. 4개의 상이한 관리 유전자(housekeeping gene)는 GenNorm 소프트웨어로 실행한 정상화를 위해 사용하였다. 상대적인 발현은 정상 조직(양성 모반)의 평균 발현과 비교한 암에서의 발현 비율로서 계산하였다.

하기는 BCSC-1 연구에 사용한 올리고뉴클레오티드이다:

3. BCSC-1을 암호화하는 렌티바이러스 벡터의 구조 및 제조

HA-단백질 서열로 태그된 BCSC-1의 아이소형 F의 완전한 코딩 서열을 2개의 상이한 렌티바이러스 벡터(Switzerland, Epalinges, EPFL의 D.Trono 기증) 및 변형된 형태(Naldini 등, 1996; Salmon 등, 2000), PGK Ires Neo 및 PWIR GFP 플라즈미드에 삽입하였다. 293T 및 HeLa 세포주는 10% FCS가 보충된 Dulbecco's 변형된 Eagle's 배지에서 배양하였다. 재조합 렌티바이러스는 표준 방법에 따라서 293T 세포의 전달 트랜스펙션에 의해서 제조하였다. 요약하면 융합된 293T 세포는 칼슘 포스페이트 침전에 의해서 20 ㎍의 플라즈미드 벡터(PGK BCSC Ires Neo/PWIR BCSC GFP), 15 ㎍의 pCMV-델타R8.91 및 5 ㎍의 pMD2G-VSVG를 가지고 코트랜스펙션시켰다. 16 시간 후에 배지를 교환하고, 재조합 렌티바이러스 벡터를 24 시간에 수집하였다. 모든 시험 FACS, 웨스턴 블럿 및 세포 형질 도입은 이전에 개시한 것과 유사한다(Arrighi 등, 2004).

B - 실시예

실시예 1 - BCSC-1 발현이 피부암에서 변질된 것의 규명

유전자 프로파일링 기술 DATAS(선택적 스플라이싱을 가지고 전사의 분화 분석; Differential Analysis of Transcripts with Alternative Splicing)(Schweighoffer 등, 2000)으로 2개의 조건 사이에서 상이하게 발현되는 대안적인 스플라이싱된 서열의 라이브러리를 분리하며, 상기 라이브러리는 이후에 빌딩 어레이 또는 표적 유전자의 분리를 위해서 사용될 수 있다.

DATAS는 2개의 별도 집단(양성 모반 대 전이성 흑색종)에서 총 RNA를 추출한 후 메신저 RNA를 분리(Dynabeads oligodT-Dynal를 사용함)하여 획득된다. 역 전사는 제1 가닥 cDNA를 발생시키기 위해서 비오틴화 올리고뉴클레오티드 dT를 사용해서 mRNA 상에서 실행한다. 하나의 집단으로부터의 mRNA와 다른 집단으로부터의 cDNA 사이의 교차-교잡(cross-hybridisation)으로 스트렙타비딘-코팅 비드를 사용하여 분리된 이형접합자(heteroduplexes)가 형성된다. 이형접합자에서 cDNA에 교잡하지 않는 mRNA 루프를 떼어내기 위해서 RNAse H를 처리한다. 선택적 스플라이싱 서열을 암호화하는 이러한 mRNA 루프는 5개의 퇴화 프라이머(degenerate primer)를 사용하여 RT-PCT를 실행한 후 AT 클로닝 벡터(TOPO, Invitrogen)의 PCR 제품의 클로닝을 실행한다. 모든 클론에서의 cDNA 삽입물(insert)을 T7 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 최종 결과물은 주어진 조건에서 특이적인 선택적 스플라이싱 mRNA 서열의 라이브러리이다. 시퀀싱 후에 DATAS 클론으로 생명정보 분석을 실행하여 이들의 원천 유전자를 규명한다. 상기에 의해서 정확성이 높은 특정 형태의 스플라이싱 조건[예컨대 엑손 건너뛰기(exon skipping), 인트론 보유(intron retention), 신규의 엑손 존재, 선택적 스플라이싱 부위의 사용(alternative splice site usage)]의 분석이 가능하다.

본 연구자들은 전이성 흑색종으로 고통받는 환자 집단과 양성 모반이 존재하는 건강한 환자 집단에서 수득된 조직에서 DATAS 프로파일링 분석을 실행했다. 본 연구자들은 전이성 흑색종 군에서의 10명의 환자와 양성 모반 군에서의 11명의 환자의 조직 상의 DATAS 라이브러리를 제작했다. 총 RNA 80 ㎍의 풀을 mRNA 1.6 ㎍을 추출한 각 집단에 이용하였다: cDNA 합성으로 800 ng 사용 및 mRNA로서 800 ng 보유.

모든 RNA 조직 시료의 양과 품질은 Agilent Bioanalyser를 사용하여 측정했다. 단지 양호한 품질의 총 RNA 시료만을 DATAS를 위해 사용했다.

총 755 클론이 조직 RNA 상의 DATAS로부터 수득되었다. 클론 중 대략 25 %가 mRNA 전이성 흑색종/cDNA 양성 모반 상태에서 수득되었으며, 클론 중 나머지 75 %는 mRNA 양성 모반/cDNA 전이성 흑색종 상태에서 수득되었다. 삽입물의 평균 크기는 300 내지 500 bp이다. 시퀀싱 후 개개 클론은 상기에서 기재한 것과 같이 처리 및 분석하였다. 시퀀싱한 755 클론 중에서 217개의 단편이 중복되지 않았으며, 알려지지 않은 유전자 서열을 포함하고 있었다.

DATAS 분석으로 수득된 217 클론에서 본 연구자들은 잠재적으로 흥미있는 특성을 가진 약 10개를 선별하고, 멜라닌 세포가 손상된 생체 조직에서 추출된 RNA를 실시간 반-정량적 RT-PCR을 실행했다. 이러한 두번째 스크리닝으로 본 연구자들은 잠재적으로 흥미있는 후보로서 BCSC-1을 규명하였다.

실시예 2 - 흑색종 환자에서 약화된 BCSC-1 발현

BCSC-1 유전자 발현은 양성 모반의 생체 조직(음성 대조군)과 여러 단계의 착색된 피부 손상 부위의 생체 조직을 포함하는, 총 70명의 환자의 생체 조직에서 추출된 RNA의 실시간 반-정량적 RT-PCR로 측정하였다. 상기 결과로서 전이성 흑색종을 가진 모든 환자는 양성 모반 시료에서의 BCSC의 평균 발현과 비교해서 현저하게 낮은 발현이 나타났음을 확인했다(도 2). 몇몇 전이성 생체 조직에서 BCSC 발현은 양성 모반의 평균 발현 보다 20배 더 낮게 나타났다. 비전형적인 양성 모반의 생체 조직에서는 양성 모반보다 BCSC 발현이 더 높게 나타났으며, 원발성 흑색종 및 림프노드에서의 생체 조직 둘 다에서는 양성 보반과 유사한 BCSC 발현을 나타냈다.

실시예 3 : 흑색종에서 선택적으로 약화된 BCSC-1의 긴 아이소형

7개의 상이한 아이소형을 BCSC-1 유전자에 있어서 기재하였다(도 3A 참조). 본 연구자들은 아이소형의 발현이 약화된 것을 측정하기 위해서 여러 개의 프라이머결합물을 사용하여 BCSC-1 발현의 보다 특이적인 분석을 실행하였다. 상기 결과로서 동일한 단백질을 코딩하는 긴 아이소형 c 및 f는 흑색종 환자에서 발현이 선택적으로 약화되었음을 확인하였다(도 3B).

실시예 4 : 흑색종 환자 및 흑색종 세포주에서 약화된 BCSC-1 발현

이전의 결과를 확인하기 위해서 새로운 실시간 PCR 실험을 피부 손상이 있는 생체 조직의 더 큰 코호트에서 실행하였다. 이전의 결과와 동일하게 전이성 손상이 있는 모든 환자에게서 건강한 공여자에서의 평균 발현과 비교해서 BCSC-1의 발현이 더 낮게 나타났다(도 4A).

또한 멜라민 세포의 몇몇 세포주를 BCSC-1 발현을 위해 시험하였다(도 4B). 상기 결과로서 모든 흑색종 세포주는 건강한 공여자에 비해 현자하게 낮은 발현을 나타냄을 확인하였다. SK-Mel23(L1)과 같은 몇몇 세포주에서 BCSC-1의 발현은 검출되지 않았으며, 단지 시험한 원발성 흑색종의 2개의 세포주에서만 양성 모반과 보다 유사한 BCSC-1의 발현을 나타냈다.

실시예 5 : 흑색종 세포 분열을 감소시키는 BCSC-1의 이소성 발현

PGK BCSC Ires Neo 또는 PWIR BCSC GFP 벡터는 BCSC-1 발현을 유도하는 SK-Mel23 및 Hela 세포를 형질 도입시키기 위해서 사용하였다. 또한 상응하는 엠피티 벡터로 형질 도입된 세포는 음성 대조군으로 사용하였다.

상기 결과로서 흑색종 세포주 SK-Mel23에서 BCSC-1의 이소성 발현으로 세포의 분열이 현저하게 감소하였음을 알 수 있다(도 5). BCSC-1의 발현은 항-HA 항체를 사용하는 실시간 PCR과 웨스턴 블럿(도 6)으로 확인하였다. BCSC-1의 이소성 발현의 이러한 효과는 Hela와 같은 다른 비-멜라닌 세포주에서는 관찰되지 않았다.

실시예 6 : 흑색종 세포 분열을 차단하는 BCSC-1의 이소성 발현

흑색종 세포주에 BCSC-1 유전자의 긴 아이소형(Iso F)의 이소성 발현을 유도하기 위해서 렌티벡터로 형질 도입시켰다. 도 7에 나타낸 결과로서 형질 도입된 전이성 흑색종 세포 Mewo 및 SK23(도 7A) 및 원발성 흑색종 세포 Me257(도 7B)은 BCSC-1의 짧은 아이소형(Iso A) 또는 엠피티 벡터로 형질 도입된 세포 및 음성 대조군과 비교해서 분열이 현저하게 감소되었거나 또는 분열이 정지되었다는 것을 확인하였다. 이러한 효과는 BCSC-1의 짧은 아이소형 또는 엠피티 벡터로 형질 도입된 세포에서는 관찰되지 않았다.

실시예 7 : 세포 주기 G2-M 상에서 흑색종 세포를 차단하는 BCSC-1

본 연구자들은 BCSC-1의 항-분열 효과가 형질 도입된 세포의 세포 주기를 방해하기 때문에 발생할 수 있는지의 여부를 관찰하였다. BrdU 및 7-AAD 염색을 사용하여 본 연구자들은 세포 주기의 G0/G1(R3), S(R4), G2-M(R5) 상의 세포 및 또한 자가 사멸 세포(R6)의 퍼센트를 결정하였다. FACS 프로파일을 도 8A에 나타냈으며, 퍼센트 값은 도 8B에 나타냈다. 상기 결과로서 BCSC-1의 긴 아이소형(iso F)으로 형질 도입된 세포는 G2-M 상을 차단한다는 것을 확인하였다. 이러한 효과는 세포가 세포 주기의 G0/G1 및 S 상에서 주로 분포하는, BCSC-1의 짧은 아이소형(iso A) 또는 엠피티 벡터로 형질 도입된 세포 및 비-형질 도입 세포에서는 관찰되지 않았다.

실시예 8 : 세포 주기의 G2 및 M 상에서 저지된 BCSC-1을 암호화하는 Hela

본 연구자들은 G2-M 상의 단계가 BCSC-1의 이소성 발현에 의해 유도되는 세포 주기를 차단하는 지를 결정하기 위해 DAPI 및 튜불린 항체로 면역 형광 염색을 실행하였다. 본 연구자들은 크로마틴이 축합된 세포가 높은 퍼센트로 존재하며, 또는 비-형질 도입 세포 또는 BCSC-1의 짧은 아이소형 또는 엠피티 벡터로 형질되입된 세포에서의 다른 상의 유사 분열에서 존재함을 관찰하였다(도 9A). 그러나 본 연구자들은 BCSC-1의 긴 아이소형으로 형질 도입된 세포에서는 유사 분열하는 세포를 관찰할 수 없었다(도 9B). 본 연구자들은 BCSC-1의 이소성 발현으로 세포 주기 G2 및 M 상 사이의 차단이 유도되어 세포의 유사 분열을 피한다는 것으로 결론을 내릴 수 있었다.

실시예 9 : 전이성 흑색종의 뮤린 모델에서 폐-전이성의 수를 감소시키는 BCSC-1

BCSC-1의 생체내 효과를 관찰하기 위해서 본 연구자들은 BCSC-1 벡터의 긴 아이소형 또는 엠피티 벡터로 형질 도입된 B16 흑색종 세포를 정맥내에 주입하였다(10⁴ 내지 10⁷ 세포에 있어서 바이러스 입자 대략 500 ng). 15일 후 상기 세포는 폐에서 전이가 나타났으며, 전이 세포를 카운팅하였다(도 10A). 엠피티-벡터 형질 도입 B16(n=10) 또는 긴-BCSC-1 벡터(n=6)를 주입한 쥐의 폐에서의 전이의 수는 도 10B에 나타냈다. 본 연구자들은 엠피티 형질 도입 세포를 주입한 쥐와 비교해서 BCSC-1 형질 도입 세포를 주입한 쥐에서 폐-전이 수가 감소함을 관찰하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Exonhit Therapeutics SA Hopitaux Universitaires de Gen�e Universit�de Gen�e <120> Detection and Treatment of Cancers <130> B0462WO <160> 14 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 1 aaattatgac tgcagctgtt ttcact 26 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 2 gtagaacagg ctgggcttcc t 21 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctgatttact acaatgaggt gcatacc 27 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 4 catcaaatga cctggcttca tg 22 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 5 agaaacacag gtaggaagaa aatgtga 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 6 tcatgtagca ctagagtctg tgtgtca 27 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 7 agcctgatgt caacctcacc at 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> 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Ser Ser Gly Trp Ala Thr Ile Leu Ala Val Ile Trp Leu His Ser 725 730 735 Asn Gly Lys Asp Leu Lys Cys Glu Trp Glu Leu Leu Glu Arg Lys Ala 740 745 750 Val Ala Trp Met Arg Ala His Ala Gly Ser Thr Met Pro Ser Val Val 755 760 765 Lys Ala Ala Ile Thr Phe Leu Lys Ser Ser Val Asp Pro Ala Ile Phe 770 775 780 Ala Phe 785 <210> 14 <211> 3438 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cggttctttc cggaaattat gactgcagct gttttcactc cgctgtgact cagagcgctc 60 cgggctgcag gagaggaaga aatcttgcat caccatggtg cacttctgtg gcctactcac 120 cctccaccgg gagccagtgc cgctgaagag tatctctgtg agcgtgaaca tttacgagtt 180 tgtggctggt gtgtctgcaa ctttgaacta cgagaatgag gagaaagttc ctttggaggc 240 cttctttgtg ttccccatgg atgaagactc tgctgtttac agctttgagg ccttggtgga 300 tgggaagaaa attgtagcag aattacaaga caagatgaag gcccgcacca actatgagaa 360 agccatctcc cagggccacc aggccttctt attggagggg gacagcagct ccagggatgt 420 cttctcttgc aatgtgggta acctccaacc tgggtcgaag gcggcagtca ccctgaagta 480 tgtgcaggag ctgcctctgg aagcagatgg ggctctgcgc tttgtgctcc cagctgtcct 540 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Claims (18)

1. 피험자에서 흑색종 또는 피부암의 존재, 단계 또는 형태를 검출하는 방법으로서,

   상기 방법은 피험자로부터 취한 시료에서 변질된 BCSC-1 유전자 발현(altered BCSC-1 gene expression)의 존재를 실험실 또는 생체외에서 검출하는 단계를 포함하며, 이러한 변질된 BCSC-1 유전자 발현의 존재는 상기 피험자에서의 흑색종 또는 피부암의 존재, 단계 또는 형태를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 시료에서의 BCSC-1 유전자 발현의 감소는 상기 피험자에서의 흑색종 또는 피부암의 존재, 단계 또는 형태를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 시료에서의 BCSC-1 유전자의 긴 아이소형(long isoform) 발현의 감소는 상기 피험자에서의 흑색종 또는 피부암의 존재, 단계 또는 형태를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서,

   긴 아이소형은 엑손 13, 14, 15, 16, 17 또는 18을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 피험자에서의 흑색종 또는 피부암의 치료 효율성을 평가하는 방법으로서,

   상기 방법은 치료 이전 및 이후에 피험자로부터 취한 시료에서 BCSC-1 유전자 발현을 비교하는 단계를 포함하며, 발현의 증가는 치료 반응에 양성인 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

   BCSC-1 유전자 발현은 시퀀싱, 선택적 교잡화(selective hybridization), 선택적 증폭(selective amplification) 및/또는 특이적 리간드 결합(specific ligand binding)에 의해서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

   암은 기저 세포암종, 편평 세포암종, 메켈 암종 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. BCSC-1의 긴 아이소형을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 핵산 프라이머.
9. BCSC-1의 긴 아이소형과 특이적으로 교잡하는 것을 특징으로 하는 핵산 프로브.
10. BCSC-1 단백질의 긴 아이소형과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머, 프로브 또는 항체를 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
12. BCSC-1 단백질을 암호화하는 핵산 또는 BCSC-1 단백질을 흑색종 또는 피부암을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하는 것을 특징으로 하는 BCSC-1 단백질을 암호화하는 핵산 또는 BCSC-1 단백질의 용도.
13. BCSC-1 작용제를 흑색종 또는 피부암 치료용의 약학적 조성물을 제조하기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 BCSC-1 작용제의 용도.
14. BCSC-1 유전자 발현을 자극하는 화합물을 흑색종 또는 피부암 치료용의 약학적 조성물을 제조하기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
15. 흑색종 또는 피부암 상의 생물학적 활성 화합물을 선별하는 방법으로서,

    상기 방법은 BCSC-1 발현 또는 활성을 모방하거나 또는 자극하는 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 흑색종 또는 피부암 상의 생물학적 활성 화합물을 선별하는 방법으로서,

    상기 방법은 리포터 컨스트럭트(reporter construct)를 포함하는 재조합 숙주 세포와 시험 화합물을 접촉시키는 단계 및 리포터 유전자의 발현을 자극하는 시험 화합물을 선별하는 단계를 포함하며, 상기 리포터 컨스트럭트는 BCSC-1 유전자 프로모터의 제어하에서 리포터 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 피험자에서 암의 존재, 단계 또는 형태를 검출하는 방법으로서,

    상기 방법은 피험자로부터 취한 시료에서 BCSC-1 유전자 또는 단백질의 긴 아이소형의 (상대적) 양을 실험실 또는 생체외에서 측정하는 단계를 포함하며, 상기 양은 상기 피험자에서의 암의 존재, 단계 또는 형태를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 피험자에서 암의 존재, 단계 또는 형태를 검출하는 방법으로서,

    상기 방법은 피험자로부터 유도된 유액 시료에서 BCSC-1 단백질의 (상대적) 양을 실험실 또는 생체외에서 측정하는 단계를 포함하며, 상기 양은 상기 피험자에서의 암의 존재, 단계 또는 형태를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.