JP2002525269A - Ｂｒｎ−３ｂの阻害因子ならびに乳癌および卵巣癌の治療のためのその使用 - Google Patents

Ｂｒｎ−３ｂの阻害因子ならびに乳癌および卵巣癌の治療のためのその使用

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JP2002525269A JP2000570307A JP2000570307A JP2002525269A JP 2002525269 A JP2002525269 A JP 2002525269A JP 2000570307 A JP2000570307 A JP 2000570307A JP 2000570307 A JP2000570307 A JP 2000570307A JP 2002525269 A JP2002525269 A JP 2002525269A
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ブダラム−マハデイオウ，ビシユワニー
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ユニバーシテイ・カレツジ・ロンドン
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Abstract

(57)【要約】 Ｂｒｎ−３ｂ発現および／あるいは活性の阻害因子は乳癌あるいは卵巣癌の治療において有用である。Ｂｒｎ−３ｂ発現の阻害因子を同定するための方法は：（ａ）コード配列に機能的に連結されたＢｒｎ−３ｂプロモーターを含む試験構築物を提供し、（ｂ）試験物質の不在下で当該コード配列によってコードされるポリペプチドを発現することができる条件下で試験物質を試験構築物に接触させ、そして（ｃ）当該物質がＢｒｎ−３ｂの発現を阻害するかどうかを調べることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、Ｂｒｎ−３ｂの発現および／あるいは活性の阻害因子、およびその
ような阻害因子の同定のためのスクリーニング方法に関する。さらに癌の治療に
おける上記阻害因子の使用に関する。
【０００２】 発明の背景 ＰＯＵ（Ｐｉｔ−Ｏｃｔ−Ｕｎｃ）ファミリーの転写因子は最初、哺乳類の転
写因子Ｐｉｔ−１、Ｏｃｔ−１およびＯｃｔ−２、ならびに線虫の調節蛋白質Ｕ
ｎｃ−８６において発見された共通の１５０−１６０アミノ酸ドメインに基づい
て定義された（検討にあたっては１、２参照）。共通ＰＯＵドメインはこれらの
蛋白質のＤＮＡ結合ドメインを構成し、２つの部分、ＰＯＵ因子に固有のＰＯＵ
特異的ドメインと他の多くの転写因子で認められるホメオボックスに関連するＰ
ＯＵホメオドメインから成る。
【０００３】 最初のＰＯＵファミリー転写因子の同定に続いて、このファミリーの他の多く
の成員が定義され（１−３）、遺伝子発現の調節において極めて重要な役割を果
たすことが示された。さらに、これらの因子のいくつかをコードする遺伝子の突
然変異が特定のヒト疾患の原因となることが示された。すなわち、たとえばＰｉ
ｔ−１をコードする遺伝子における突然変異は、マウスとヒトの両方において脳
下垂体の発育不全とその結果としての小人症を生じさせることが示され（検討に
あたっては４参照）、一方Ｂｒｎ−４をコードする遺伝子での突然変異はＸ連鎖
難聴をもたらすことが示された（５）。最近になって、進行性晩発性難聴を有す
る家系ではＰＯＵ因子、Ｂｒｎ−３ｃをコードする遺伝子に突然変異が存在する
ことが明らかにされた（６）。
【０００４】 Ｂｒｎ−３ａ、Ｂｒｎ−３ｂおよびＢｒｎ−３ｃは、異なる遺伝子（７）によ
ってコードされるＰＯＵファミリーの緊密に関連する成員であり、発育中および
成体の神経系において異なるが重複するパターンで発現される（３、８−１１）
。さらに、しかしながら、Ｂｒｎ−３ａとＢｒｎ−３ｂの発現は子宮頚部上皮の
ような一部の非神経細胞においても検出されている（９、１２）。
【０００５】 Ｂｒｎ−３ａは急速進行性神経内分泌腫瘍で過剰発現されることが示されてい
るが（１４）、Ｂｒｎ−３ａとＢｒｎ−３ｂの両方がヒト神経芽細胞腫において
高いレベルで発現される（１５、１６）。Ｂｒｎ−３ａとＢｒｎ−３ｂはこれま
でにヒト乳癌細胞系、ＭＣＦ−７において検出されている（１３）。我々は最近
、正常なヒト子宮頚部標本と比較して、グレード３の頚部上皮内癌（ＣＩＮ３）
を示すヒトサンプルでは平均Ｂｒｎ−３ａレベルが３００倍以上上昇しているが
、Ｂｒｎ−３ｂレベルは２つの群のサンプルにおいて同様であることを明らかに
した（１２）。
【０００６】 発明の要旨 本発明は、ＢＲＣＡ−１遺伝子の発現レベルが低下した乳癌組織はＰＯＵファ
ミリー転写因子、Ｂｒｎ−３ｂの発現上昇を示すという所見に基づく。ＢＲＣＡ
−１遺伝子は家族性乳癌の多くの症例におけるその突然変異に基づいて同定され
、その不活性化がこの疾患を引き起こしうることが示唆された。ＢＲＣＡ−１は
散発性乳癌の症例では突然変異を起こしていないと思われるが、その発現が低下
していることが多くの症例で明らかにされている。
【０００７】 Ｂｒｎ−３ｂの発現上昇は、ＢＲＣＡ−１遺伝子レベルの低下を示さない正常
乳房細胞、良性腫瘍あるいは悪性腫瘍標本では認められない。これに対し、ＢＲ
ＣＡ−１の発現レベルと関連するＰＯＵファミリー転写因子、Ｂｒｎ−３ａの発
現の間には相関は見られない。さらに、Ｂｒｎ−３ｂは乳癌細胞で起こるトラン
スフェクションにおいてＢＲＣＡ−１プロモーターを約２０倍強く抑制すること
ができるが、Ｂｒｎ−３ａにはその作用がない。
【０００８】 従ってＢｒｎ−３ｂは、Ｂｒｎ−３ｂの発現が上昇し、その結果ＢＲＣＡ−１
の発現が低下している乳癌において、ＢＲＣＡ−１の発現を調節する上で重要な
役割を果たし、それによって潜在的に腫瘍の進行に関与すると考えられる。薬理
的治療あるいは遺伝子治療によるＢｒｎ−３ｂ発現の抑制は乳癌を治療するため
の潜在的な方法である。
【０００９】 そこで本発明は、ヒトあるいは動物の身体の治療法において使用するためのＢ
ｒｎ−３ｂの発現および／あるいは活性の阻害因子を提供する。そのような阻害
因子は、特に乳癌および／あるいは卵巣癌の治療において有用である。
【００１０】 Ｂｒｎ−３ｂ発現および／あるいは活性の阻害因子を同定するためのスクリー
ニングを実施することができる。従って本発明はまた、 （ａ）コード配列に機能的に連結されたＢｒｎ−３ｂプロモーターを含む試験構
築物を提供し、 （ｂ）試験物質不在下で当該コード配列によってコードされるポリペプチドを発
現することができる条件下で試験物質を試験構築物に接触させ、そして （ｃ）当該物質がＢｒｎ−３ｂの発現を阻害するかどうかを調べる ことを含むＢｒｎ−３ｂ発現の阻害因子を同定するための方法、ならびに （ａ）Ｂｒｎ−３ｂポリペプチド又はその相同体、あるいはそれらの断片を提供
し、 （ｂ）当該物質不在下でポリペプチドの活性を可能にする条件下で試験物質をＢ
ｒｎ−３ｂポリペプチドに接触させ、そして （ｃ）当該物質がＢｒｎ−３ｂの活性を阻害するかどうかを調べる ことを含むＢｒｎ−３ｂ活性の阻害因子を同定するための方法を提供する。
【００１１】 本発明はさらに、Ｂｒｎ−３ｂの発現および／あるいは活性の阻害因子と治療
上許容される担体あるいは希釈剤を含む製薬組成物を提供する。
【００１２】 上述したように、Ｂｒｎ−３ｂ発現および／あるいは活性の阻害因子は乳癌あ
るいは卵巣癌を治療するのに使用でき、それ故本発明は、乳癌あるいは卵巣癌に
罹患している宿主を治療する治療方法を提供し、かかる方法は、治療上有効な量
のＢｒｎ−３ｂ発現および／あるいは活性の阻害因子を宿主に投与することを含
む。
【００１３】 図面の簡単な説明 図１は、閉経前あるいは閉経後女性からの正常／良性乳房標本あるいは悪性乳
癌におけるＲＴ／ＰＣＲアッセイによって測定したＢｒｎ−３ａ ｍＲＮＡのレ
ベルを示す。棒は、平均値プラス標準偏差（ＳＤ）と母集団の大きさ「ｎ」を表
わす。
【００１４】 図２は、閉経前あるいは閉経後女性からの正常／良性乳房標本あるいは悪性乳
癌におけるＲＴ／ＰＣＲアッセイによって測定したＢｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡのレ
ベルを示す。棒は、平均値プラス標準偏差（ＳＤ）と母集団の大きさ「ｎ」を表
わす。
【００１５】 図３は、閉経前（パネルａ）あるいは閉経後（パネルｂ）女性から採取した悪
性乳癌標本、あるいは良性乳房標本（パネルｃ）におけるＢｒｎ−３ｂとＢＲＣ
Ａ−１のｍＲＮＡレベルの比較を示す。Ｂｒｎ−３ｂレベルは黒い棒で、ＢＲＣ
Ａ−１レベルは白い棒で示されている。
【００１６】 図４は、閉経前（パネルａ）あるいは閉経後（パネルｂ）女性から採取した悪
性乳癌標本、あるいは良性乳房標本（パネルｃ）におけるＢｒｎ−３ａとＢＲＣ
Ａ−１のｍＲＮＡレベルの比較を示す。Ｂｒｎ−３ａレベルは黒い棒で、ＢＲＣ
Ａ−１レベルは白い棒で示されている。
【００１７】 図５は、Ｂｒｎ−３ｂレベルが低い乳癌あるいはＢｒｎ−３ｂレベルが高い乳
癌におけるＢＲＣＡ−１レベルの比較を示す。棒は、平均値プラス標準偏差（Ｓ
Ｄ）と母集団の大きさ「ｎ」を表わす。
【００１８】 図６は、挿入部（Ｖ）を持たない発現ベクターあるいはＢｒｎ−３ａ又はＢｒ
ｎ−３ｂのいずれかを発現する同じベクターと共に完全長のＢＲＣＡ−１プロモ
ーターを含む、プロモーター／レポーター構築物でコトランスフェクションした
ＭＣＦ７細胞のルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。数値は、レポーター
構築物と挿入部不含発現ベクターでのコトランスフェクションにおいて得られる
活性（すなわち１００％）に対して等化しており、５回の測定の平均値であって
、標準偏差を棒で示している。
【００１９】 発明の詳細な説明 Ｂｒｎ−３ｂの発現あるいは活性のいかなる適当な阻害因子も本発明において
使用できる。たとえば、Ｂｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることがで
きるポリヌクレオチドが細胞内に存在することにより、その細胞におけるＢｒｎ
−３ｂの発現が低下しうる。それ故、Ｂｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡにハイブリダイズ
することができるポリヌクレオチドはＢｒｎ−３ｂ発現の適切な阻害因子を構成
しうる。これに関して、次のような２つのアプローチがある。
【００２０】 （１）アンチセンスＲＮＡ Ｂｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるＲＮＡの発現を可
能にする核酸構築物を送達する。これは、たとえばヌクレアーゼに対する感受性
を与える、翻訳の直接阻害および／あるいは標的メッセージの不安定化を生じさ
せうるＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖の形成をもたらす。それ故核酸構築物は、典型的に
はリボソーム結合領域あるいはＢｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡのコード領域にハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドの発現を導く。
【００２１】 （２）アンチセンスオリゴヌクレオチド Ｂｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを送達する
。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、プロセシング、翻訳および代謝回転を含
めたＲＮＡ代謝の１又はそれ以上の局面に干渉することにより、標的遺伝子の発
現を阻害すると推定される。化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドが使用でき
、ヌクレアーゼに対する耐性および／あるいは細胞透過性を高めると考えられる
。
【００２２】 アンチセンス Ｂｒｎ−３ｂのコード配列を配列番号１に示す。Ｂｒｎ−３ｂの阻害因子は、
Ｂｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを
含む。典型的には、そのようなポリヌクレオチドはＲＮＡである。かかるポリヌ
クレオチドはＢｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡの全部又は一部にハイブリダイズしうる。
典型的には、当該ポリヌクレオチドはＢｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡの全部あるいはそ
の領域に相補的である。たとえば、ポリヌクレオチドはＢｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡ
の全部又は一部の正確な相補物である。しかし、絶対的な相補性は必要ではなく
、生理的条件下で４０℃を越える融解温度を持つ二重鎖を形成するのに十分な相
補性を有する好ましいポリヌクレオチドが、本発明における使用に特に適する。
当該ポリヌクレオチドは、約５０から約６０℃で塩化ナトリウム０．０３Ｍおよ
びクエン酸ナトリウム０．０３Ｍのような中から高ストリンジェンシー条件下で
Ｂｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドでありうる。
【００２３】 ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド２１３−３９２によって定義
されるコード配列に対応するｍＲＮＡの領域にハイブリダイズすることが好まし
い。ポリヌクレオチドはこの領域の全部又は一部にハイブリダイズしうる。しか
し、ｍＲＮＡの５’あるいは３’非翻訳領域の全部又は一部にハイブリダイズす
るポリヌクレオチドも使用できる。これらの領域は配列番号１のヌクレオチド１
−２１２および１４４６−３１１０に対応する。
【００２４】 当該ポリヌクレオチドは典型的には少なくとも４０、たとえば少なくとも６０
又は少なくとも８０ヌクレオチドの長さであり、１００、２００、３００、４０
０、５００、６００又は７００ヌクレオチドまでの長さ、あるいは配列番号１よ
り短い、５又は１０ヌクレオチドのような数個のヌクレオチドの長さである。
【００２５】 ポリヌクレオチドがアンチセンスＲＮＡであるときには、組換え複製可能ベク
ターから細胞において発現することができる。そのような複製可能ベクターは、
転写されたときにアンチセンスＲＮＡを生じるポリヌクレオチドを含む。好まし
くは、アンチセンスＲＮＡを生じるポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡを
生じるポリヌクレオチドの転写をもたらすことできる制御配列に機能的に連結さ
れている。「機能的に連結された」という用語は、記述されている成分が意図さ
れたように機能することができる関係にある近位をさす。アンチセンスＲＮＡを
生じる配列に「機能的に連結された」制御配列を、制御配列と適合する条件下で
配列の転写が実現できるようにライゲーションする。
【００２６】 ベクターは、たとえば、複製起点、任意に転写を生じさせるためのプロモータ
ーおよび任意に当該プロモーターのレギュレーターを備えたプラスミドあるいは
ウイルスベクターでありうる。ベクターは１又はそれ以上の選択用マーカー遺伝
子、たとえば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子あるいは哺乳類
ベクターについてはネオマイシン耐性遺伝子を含みうる。ベクターは、たとえば
アンチセンスＲＮＡの作製のため、あるいは宿主細胞をトランスフェクションす
る又は形質転換するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで使用できる。ベクターはまた、た
とえば遺伝子治療法においてｉｎ ｖｉｖｏで使用するために適合させることも
できる。
【００２７】 プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターを
設計する宿主細胞と適合するように選択しうる。たとえば、ｂ−アクチンプロモ
ーターのような哺乳類プロモーターが使用できる。組織特異的プロモーター、特
に神経細胞特異的プロモーター（たとえばチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、
Ｌ７あるいはニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター）は特に好ま
しい。ウイルスプロモーター、たとえばモロニーマウス白血病ウイルスロングタ
ーミナルリピート（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイウル
ス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーターあるいはア
デノウイルスプロモーターも使用できる。これらのプロモーターはすべて当該技
術において容易に入手可能である。好ましいプロモーターは、カゼイン遺伝子プ
ロモーターのような組織特異的プロモーターである。
【００２８】 ベクターはさらに、真核生物ゲノム配列、好ましくは哺乳類ゲノム配列、ある
いはウイルスゲノム配列に相同な配列を含むアンチセンスＲＮＡを生じさせるポ
リヌクレオチドに隣接する配列を含みうる。これは、相同的組換えによって本発
明のポリヌクレオチドを真核細胞あるいはウイルスのゲノムに導入することを可
能にする。特に、ウイルス配列、たとえばＨＳＶ１あるいはＨＳＶ２配列によっ
て隣接される発現カセットを含むプラスミドベクターを使用して、本発明のポリ
ヌクレオチドを哺乳類細胞に送達するのに適したウイルスベクター、たとえばＨ
ＳＶベクターを調製することができる。適当なウイルスベクターの他の例は、レ
ンチウイルスを含めたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイル
スを含む。これらのウイルスを用いた遺伝子導入手法は当業者には周知である。
たとえばレトロウイルスベクターは、アンチセンスＲＮＡを生じさせるポリヌク
レオチドを宿主ゲノムに安定に組み込むために使用しうる。これに対し、複製欠
損アデノウイルスベクターはエピソームのままであり、それ故一過性の発現を可
能にする。
【００２９】 アンチセンスオリゴヌクレオチド アンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的に、Ｂｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡに結合
するような配列を持つ。従って典型的には、配列番号１に示す配列の領域の相補
物である配列を持つ。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に６−４０ヌクレ
オチドの長さである。好ましくは１２−２０ヌクレオチドの長さである。
【００３０】 一般に、使用するオリゴヌクレオチドは標的配列に絶対的に相補的な配列を持
つ。しかし、絶対的な相補性は必ずしも必要ではなく、一般に標的核酸と安定な
二重らせん（あるいは場合によっては三重らせん）を形成するのに十分な相補性
を持ついかなるオリゴヌクレオチドも適当とみなされる。二重らせん（あるいは
三重らせん）の安定性は、特に、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの配列
と長さおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドと標的配列間の相補性の度合に依
存する。より長いオリゴヌクレオチドを使用するときには、相補性が低くても系
で許容されうる。しかしながら、生理的条件下で４０℃を越える融解温度を持つ
二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するオリゴヌクレオチド、特に６−４０
ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが本発明における使用に特に適する。
当該ポリヌクレオチドは、約５０−約６０℃で塩化ナトリウム０．０３Ｍおよび
クエン酸ナトリウム０．０３Ｍのような中から高ストリンジェンシー条件下でハ
イブリダイズするポリヌクレオチドでありうる。
【００３１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは化学的に修飾されていてもよい。たとえば
、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが使用できる。他のデオキシヌクレオ
チド類似体は、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエー
ト、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホルアミデートおよびオリゴリボヌクレオチドホスホロ
チオエートとそれらの２’−Ｏ−アルキル類似体ならびに２’−Ｏ−メチルリボ
ヌクレオチドメチルホスホネートを含む。
【００３２】 その代わりとして、混合骨格オリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）が使用できる。Ｍ
ＢＯは、ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのセグメントと、修飾オ
リゴデオキシヌクレオチドあるいはオリゴリボヌクレオチドの適切に配置された
セグメントを含む。ＭＢＯは、ホスホロチオエート結合のセグメントと、非イオ
ン性でヌクレアーゼあるいは２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチドに対し
て非常に抵抗性である、メチルホスホネートのような他の修飾オリゴヌクレオチ
ドの他のセグメントを持つ。
【００３３】 投与 従って、本発明のベクターとアンチセンスオリゴヌクレオチドを、任意に付加
的な治療用ポリペプチドあるいは当該治療用ポリペプチドをコードする核酸／ベ
クターと共に、治療を必要とするヒトあるいは動物に投与することができる。本
発明のベクター、ウイルス株、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび組成物を
使用して治療しうる癌は、乳癌あるいは卵巣癌を含み、特に非家族性乳癌のよう
なＢｒｎ−３ｂ発現が上方調節される乳癌あるいは卵巣癌を含む。そのような癌
に罹患している患者の状態を改善することができる。
【００３４】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび本発明のアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを含む組成物は、治療する部位、たとえば乳房組織への直接注入に
よって投与することができる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを
製薬上許容される担体あるいは希釈剤と組み合わせて製薬組成物を生成する。適
当な担体および希釈剤は、等張食塩水、たとえばリン酸緩衝食塩水を含む。組成
物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内あるいは経皮投与用に製剤すること
ができる。
【００３５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する用量は、患者の年齢、体重
および全身状態、治療する癌および癌が達している段階、ならびに投与する個々
のアンチセンスオリゴヌクレオチドのような様々な因子に依存するであろう。し
かしながら適当な用量は、１−４０ｍｇ／ｋｇ体重のような０．１−１００ｍｇ
／ｋｇ体重であると考えられる。
【００３６】 本発明のアンチセンスＲＮＡを生じさせるポリヌクレオチドは、裸の核酸構築
物として直接投与しうる。いくつかの既知のトランスフェクション手法、たとえ
ばトランスフェクション剤を使用する手法によって、哺乳類細胞による裸の核酸
構築物の取り込みが高められる。それらの作用物質の例は、カチオン性物質（た
とえばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクタン
ト（たとえばｌｉｐｏｆｅｃｔａｍＴＭおよびｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍＴＭ）を
含む。
【００３７】 典型的には、核酸構築物をトランスフェクション剤と混合して組成物を生成す
る。
【００３８】 好ましくは、裸の核酸構築物、ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターある
いは組成物を、製薬上許容される担体あるいは希釈剤と組み合わせて製薬組成物
を生成する。適当な担体および希釈剤は等張食塩水、たとえばリン酸緩衝食塩水
を含む。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内あるいは経皮投与用に
製剤することができる。
【００３９】 製薬組成物は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子治療のためのウイルスベク
ターが適当な領域で細胞に組み込まれるように投与する。本発明のポリヌクレオ
チドがウイルスベクターによって細胞に送達されるとき、投与するウイルスの量
は、ヘルペスウイルスベクターについては１０４−１０８ｐｆｕ、好ましくは１
０５−１０７ｐｆｕ、より好ましくは約１０６ｐｆｕの範囲であり、アデノウイ
ルスベクターについては１０６−１０１０ｐｆｕ、好ましくは１０７−１０９ｐ
ｆｕ、より好ましくは１０８ｐｆｕの範囲内である。注入するときには、典型的
には製薬上許容される適当な担体あるいは希釈剤中１−２ｍｌのウイルスが投与
される。本発明のポリヌクレオチドを裸の核酸として投与するときには、投与さ
れる核酸の量は典型的には１μｇ−１０ｍｇの範囲内である。
【００４０】 アンチセンスＲＮＡを生じさせるポリヌクレオチドが誘導的プロモーターの制
御下にある場合には、治療期間中の遺伝子発現を誘導するだけでよい。ひとたび
状態が治療されれば、誘導物質は除去され、本発明のポリペプチドの発現は停止
する。これは明らかに臨床的利点を持つであろう。そのような系は、たとえばｔ
ｅｔレプレッサー／ＶＰ１６融合蛋白への作用を通して遺伝子発現を活性化する
ための抗生物質、テトラサイクリンの投与を含みうる。
【００４１】 組織特異的プロモーターを使用することは、本発明のポリペプチド、ポリヌク
レオチドおよびベクターを使用する疾患の治療において役立つであろう。たとえ
ばいくつかの神経系疾患は、小さな細胞のサブセットだけに起こる特定遺伝子産
物の異常発現によるものである。該当する罹患細胞型においてだけ治療遺伝子を
発現できることは、特にそのような遺伝子が他の細胞型で発現したときに毒性で
ある場合には、有益であろう。
【００４２】 上述した投与経路と用量は単に手引きとしてのみを意図したものであり、熟達
した医師は個々の患者と状態についての至適投与経路と用量を容易に決定できる
であろう。
【００４３】 Ｂｒｎ−３ｂ発現および／あるいは活性の阻害因子に関するスクリーニング 本発明は、 （ｉ）コード配列に機能的に連結されたＢｒｎ−３ｂプロモーターを含む試験構
築物を提供し、 （ｉｉ）試験物質不在下で発現される当該コード配列によってコードされるポリ
ペプチドの発現を可能にする条件下で、試験物質を試験構築物に接触させ、そし
て （ｉｉｉ）当該物質がＢｒｎ−３ｂの発現を阻害するかどうかを調べる ことを含むＢｒｎ−３ｂ発現の阻害因子を同定するための方法を提供する。
【００４４】 Ｂｒｎ−３ｂ発現の阻害因子を同定するために、適当ないかなるアッセイ方式
も使用できる。しかしながら典型的には、プロモーター：レポーターポリペプチ
ド構築物を内包する細胞を用いてアッセイを実施する。典型的なアッセイは次の
通りである： −一定数の細胞を、たとえば１００μｌの増殖培地中で、試験物質の存在下に
プラスチック製マイクロタイタープレートの穴に接種する、 −使用するレポーターポリペプチドに適した方法に従って、レポーターポリペ
プチドの発現を５９０ｎｍの光学密度（ＯＤ）で測定する、 −マイクロタイタープレートに蓋をし、暗室において３７℃でインキュベーシ
ョンする、 −再びＯＤを読取り、適当な時間間隔をおいてレポーターポリペプチドを検定
する。ＯＤの変化が細胞増殖の測定値である。試験物質を省いて対照実験を実施
することができる。
【００４５】 試験物質が遺伝子発現の一般的阻害因子である可能性を排除するために、他の
既知のプロモーターを用いて物質を試験することもできる。
【００４６】 どのようなレポーターポリペプチドも使用でき、たとえばＧＵＳあるいはＧＦ
Ｐが使用される。ＧＵＳは、適当な基質、たとえば５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）あるいは４−メチルウン
ベリフェリル−β−グルクロニド（ＭＵＧ）の加水分解を測定することによって
検定される。ＧＦＰは、４９４ｎｍで励起したあと５９０ｎｍで蛍光を測定する
ことによって定量される。これらの方法は当業者には周知である。
【００４７】 その代わりとして、コード配列がＢｒｎ−３ｂをコードする配列それ自体であ
ってもよい。そのような実験では、Ｂｒｎ−３ｂの過剰発現を示す乳癌細胞系が
使用できる。Ｂｒｎ−３ｂの発現は、たとえばノーザン／ＲＮＡブロット法、ウ
エスタン／抗体ブロット法、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションあ
るいは免疫局在法によって追跡できる。
【００４８】 本発明はさらに、 （ｉ）Ｂｒｎ−３ｂポリペプチド又はその相同体、あるいはそれらの断片を提供
し、 （ｉｉ）当該物質の不在下でポリペプチドの活性を可能にする条件下で試験物質
をＢｒｎ−３ｂポリペプチドに接触させ、そして （ｉｉｉ）当該物質がＢｒｎ−３ｂの活性を阻害するかどうかを調べる ことを含むＢｒｎ−３ｂ活性の阻害因子を同定するための方法を提供する。
【００４９】 アッセイのための適当なＢｒｎ−３ｂは、たとえば当業者に既知の方法による
組換えを通して入手することができる。Ｂｒｎ−３ｂの阻害因子を同定するため
に適当ないかなる方式も使用できる。
【００５０】 試験物質が転写因子活性の一般的阻害因子である可能性を排除するために、他
の既知の転写因子を用いて物質を試験することもできる。
【００５１】 Ｂｒｎ−３ｂポリペプチドに加えて、反応混合物は適当な緩衝剤を含みうる。
適当な緩衝剤は、Ｂｒｎ−３ｂの反応必要条件を導くｐＨで緩衝能力を提供する
ことができる適当ないかなる生物学的緩衝剤も含む。
【００５２】 試験物質 Ｂｒｎ−３ｂの発現を阻害する物質は、プロモーターに直接結合することによ
り、従って転写の開始を妨げることにより、発現を阻害すると考えられる。その
代わりに物質が、プロモーターに結びつき、転写のために必要とされる蛋白質に
結合する場合もある。これは転写レベルの低下をもたらすと考えられる。
【００５３】 本発明のＢｒｎ−３ｂプロモーター：レポーターポリペプチド構築物は、Ｂｒ
ｎ−３ｂ遺伝子の非翻訳領域を含みうる。それ故、物質はＢｒｎ−３ｂ遺伝子の
非翻訳領域に結合することによってＢｒｎ−３ｂの発現を低下させると考えられ
る。これは翻訳の開始を妨げることができる。その代わりとして、物質が非翻訳
領域に結びつく蛋白質に結合して、かかる蛋白質が非翻訳領域に結合するのを妨
げることができる。
【００５４】 Ｂｒｎ−３ｂの活性を阻害する物質は、酵素の１つ又は両方に結合することに
よって活性を阻害すると考えられる。そのような酵素阻害は可逆性あるいは非可
逆性のいずれでもよい。非可逆性阻害因子は、共有結合あるいは非共有結合のい
ずれかによって酵素に非常に強く結合するので、その標的酵素から極めてゆっく
りと解離する。非可逆性阻害と異なって、可逆性阻害は酵素−阻害因子複合体の
速やかな解離を特徴とする。
【００５５】 試験物質は競合的阻害因子であってもよい。競合的阻害においては、酵素は基
質（酵素−基質複合体を形成する）あるいは阻害因子（酵素−阻害因子複合体）
に結合しうるが、その両方に結合することはできない。多くの競合的阻害因子は
基質に類似しており、酵素の活性部位に結合する。それ故基質は同じ活性部位に
結合するのを妨げられる。競合的阻害因子は、基質に結合する酵素分子の比率を
減じることによって触媒作用の速度を低下させる。
【００５６】 阻害因子はまた非競合的阻害因子であってもよい。可逆性でもある非競合的阻
害においては、阻害因子と基質が同時に酵素分子に結合することができる。これ
は、それらの結合部位が重複しないことを意味する。非競合的阻害因子は、基質
に結合する酵素分子の比率を低下させるのではなく、酵素の転換数を低下させる
ことによって働く。
【００５７】 阻害因子はまた混合阻害因子であってもよい。混合阻害は、阻害因子が基質の
結合をもたらし、且つ酵素の転換数を変化させるときに起こる。
【００５８】 Ｂｒｎ−３ｂの活性を阻害する物質はまた、基質に結合することによって活性
を阻害する場合もある。物質それ自体が基質の反応を触媒すると考えられ、その
結果酵素が基質を使用できなくなる。その代わりに、阻害因子が単に酵素への基
質の結合を妨げる場合もある。
【００５９】 適当な候補物質は、Ｂｒｎ−３ｂに特異的な抗体産物（たとえばモノクローナ
ルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体ならびにＣＤＲ移植抗体
）を含む。さらに、組合せライブラリー、定義された化学単位、ペプチドおよび
ペプチドミメティック、オリゴヌクレオチドならびに天然産物ライブラリーを、
下記に述べるようなアッセイにおいてＢｒｎ−３ｂの阻害因子としての活性に関
してスクリーニングすることができる。候補物質を、たとえば各反応につき１０
個の物質の初期スクリーニングにおいて使用し、これらのバッチの阻害を示す物
質を個々に試験する。
【００６０】 Ｂｒｎ−３ｂ発現および／あるいは活性の阻害因子 Ｂｒｎ−３ｂの発現および／あるいは活性の阻害因子は、上述したアッセイに
おいてＢｒｎ−３ｂ発現および／あるいは活性の測定可能な低下を生じさせるも
のである。好ましい物質は、１μｇ／ｍｌ−１、１０μｇ／ｍｌ−１、１００μ
ｇ／ｍｌ−１、５００μｇ／ｍｌ−１、１ｍｇ／ｍｌ−１、１０ｍｇ／ｍｌ−１ 、１００ｍｇ／ｍｌ−１の阻害因子濃度でＢｒｎ−３ｂの発現および／あるいは
活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４
０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８
０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９９％阻害す
るものである。阻害パーセンテージは、試験物質の存在下と不在下でのアッセイ
の比較における発現／活性の低下パーセンテージである。上述した度合の阻害パ
ーセンテージと阻害因子濃度のどのような組合せも本発明の阻害因子を規定する
ために使用しうるが、より低い濃度でより大きな阻害が好ましい。
【００６１】 下記に述べるようなアッセイにおいて活性を示す候補物質を、その後たとえば
乳癌細胞系に関して試験することができる。候補阻害因子を、Ｂｒｎ−３ｂが上
方調節される乳癌細胞系においてＢｒｎ−３ｂの発現を減衰させる能力に関して
、またＢＲＣＡ−１が下方調節される乳癌細胞系においてＢＲＣＡ−１発現への
作用に関して試験することができるであろう。
【００６２】 人体での使用 上述したスクリーニング手順によって同定されたＢｒｎ−３ｂ発現および／あ
るいは活性の阻害因子を使用して、乳癌あるいは卵巣癌、特に非家族性乳癌のよ
うなＢｒｎ−３ｂの発現が上方調節される乳癌あるいは卵巣癌を治療することが
できる。従って、そのような阻害因子の投与によって癌に罹患している患者の状
態を改善することができる。そのような阻害因子の治療上有効な量を、その必要
のあるヒト患者に投与することができる。
【００６３】 乳癌あるいは卵巣癌を予防あるいは治療する際に使用する阻害因子の製剤は、
同定された物質の性質、製薬用あるいは動物薬用のいずれを意図しているか、等
の因子に依存するであろう。典型的には、阻害因子は製薬上許容される担体ある
いは希釈剤と共に用途に合わせて製剤される。たとえば、局所、非経口、静脈内
、筋肉内、皮下、眼内、経皮あるいは経口投与用に製剤することができる。医師
は、各々の患者に合わせて必要な投与経路を決定することができるであろう。製
薬担体あるいは希釈剤は、たとえば等張液でありうる。
【００６４】 阻害因子の用量は様々なパラメータに従って、特に使用する物質、治療する患
者の年齢、体重および状態、投与経路、ならびに必要なレジメに従って決定され
うる。やはり、医師は個々の患者に合わせて必要な投与経路と用量を決定するこ
とができるであろう。
【００６５】 下記の実施例は本発明を例示するものである。
【００６６】 実施例 試験材料および方法 特に異なる指示がない限り、使用する方法は標準的な生化学および分子生物学
手法である。適当な一般的方法論のテキストの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子
クローニング、実験室マニュアル（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、分子生
物学における現在のプロトコール（１９９５）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を含む。
【００６７】 正常および乳癌標本 正常な乳腺と悪性乳癌（閉経前および閉経後の女性からのもの）からの総ＲＮ
ＡをＣａｎｄｉｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ
Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより入手した。
【００６８】 逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ 各標本からのＲＮＡ約０．１μｇをｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。合成
したｃＤＮＡを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて先に記述されてい
るような（１７）ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用した：Ｂｒｎ−３ａ：５’
ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＣＧＧＡＣＡＣＧ−３’，３’−ＡＣＧＧＴＧＡＡ
ＴＧＡＣＴＣＣＣＣＣＧＡ−５’；Ｂｒｎ−３ｂ：５’ＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣ
ＧＣＡＡＧＣ−３’，３’ＣＴＧＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＡＧＧＴＣＴ−５’。平
行して、対照として用いる不変的に発現されるヒトシクロフィリンｍＲＮＡの増
幅を、次のプライマーを用いて実施した：５’−ＴＴＧＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣ
ＴＣＣＴＴＴＣＡ−３’および３’−ＴＴＴＣＧＴＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＣ
Ｇ−５’。
【００６９】 すべての場合に、各々のＰＣＲ産物２０μｌを２％アガロースゲル上で分画し
、Ｈｙｂｏｎ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）にブロ
ットし、相同な相補的３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズした。膜をフィルム
（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に露光し
、その後得られたオートラジオグラフをデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて分析した。我々は
以前にこのブロット法が、使用するＲＴ−ＰＣＲの条件と合わせて、構成的に発
現されるシクロフィリンｍＲＮＡに比してＢｒｎ−３ａおよびＢｒｎ−３ｂ ｍ
ＲＮＡの正確な定量を可能にすることを示した（９、１２、１７）。
【００７０】 プラスミド構築物 Ｂｒｎ−３ａおよびＢｒｎ−３ｂ発現ベクターは、モロニーマウス白血球ウイ
ルスプロモーターの制御下で完全長のｃＤＮＡクローンを含み、これまでにも記
述されている（７、１７）。ＢＲＣＡ−１プロモーター／レポーター構築物は、
ｐＧＬ２ルシフェラーゼベクターにクローニングされたＢＲＣＡ−１αおよびβ
プロモーターを担う４キロ塩基あるいは４００塩基の上流配列を含む。
【００７１】 一過性トランスフェクション １０％ウシ胎児血清とｍｌ当り１０ｎｇのインスリンを補足したＬ−グルタメ
ートおよびフェノールレッドを含有するダルベッコ修正イーグル培地においてＭ
ＣＦ７細胞を常套的に増殖させた。実験を行う前に、集密下細胞を、Ｍｉｇｌｉ
ａｃｃｉｏら（１８）が述べた方法に従って調製した、１０％デキストランで被
覆し、炭処理ウシ胎児血清とｍｌ当り１０ｎｇのインスリンを含むフェノールレ
ッド不含のダルベッコ修正イーグル培地中に７２時間保持した。トランスフェク
ションの１２時間前に培地を新鮮培地５ｍｌと交換した。Ｇｏｒｍａｎ（１９）
の方法に従ってプラスミドＤＮＡのトランスフェクションを実施した。常套的に
、レポーターＤＮＡ５μｇと各発現ベクター５μｇを５×１０５細胞にトランス
フェクションし、７２時間後に細胞を採集した。各々の場合に細胞によって取り
込まれたＤＮＡの量を、抽出物１５μｌのスロットブロット法およびプラスミド
ベクター中のアンピリシン耐性遺伝子から誘導したプローブとのハイブリダイゼ
ーションによって測定した（２０）。バンドの強度の差をデンシトメトリーによ
って測定し、その後のアッセイに使用する抽出物の容積を等しくするために使用
した。またすべてのトランスフェクションが、トランスフェクション効率を制御
するために実施する二元的ルシフェラーゼアッセイに関しての、ｒｅｎｉｌｌａ
ルシフェラーゼをコードする内部レポーター遺伝子を含んだ。ルシフェラーゼア
ッセイは製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコールに記載されているように実施
し、Ｔｕｍｅｒ ２０−Ｅルミノメーターで結果を測定した。
【００７２】 実験結果 Ｂｒｎ−３ａおよびＢｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡのレベルを定量するために、我々
がこれまで少量の臨床試料や他の材料においてこれらのｍＲＮＡを信頼可能に定
量するために使用してきた逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
アッセイを用いた（１２、１５）。これらのアッセイを使用して、正常乳房組織
あるいは良性乳腫瘍材料におけるＢｒｎ−３ａおよびＢｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡの
レベルを閉経前あるいは閉経後女性からの悪性乳癌から得たものと比較した。Ｂ
ｒｎ−３ａ（図１）とＢｒｎ−３ｂ（図２）の平均レベルはいずれも、正常／良
性腫瘍材料から得たものと比較して閉経前悪性腫瘍から調製した試験材料におい
て多少の上昇を示し、閉経後腫瘍材料では両者ともさらなる上昇を認めたが、こ
れは統計的に有意ではなかった（正常対腫瘍レベルのすべての比較においてｐ＜
０．０５）。
【００７３】 しかしながら興味深いことに、種々の腫瘍標本においてＢｒｎ−３ａとＢｒｎ
−３ｂの発現レベルの分布パターンに明瞭な相違を認めた。すなわち、Ｂｒｎ−
３ａレベルは種々の標本間で継続的な分布を示すと思われた。これに対し、Ｂｒ
ｎ−３ｂレベルは種々の腫瘍標本で二分する分布を示し、標本の約４０％は正常
サンプルで認められた範囲内の低レベルのＢｒｎ−３ｂを示したが、残りのサン
プルは正常範囲よりはるかに高いレベルを示した。この二分する分布は、閉経前
および閉経後の女性から採取した腫瘍標本について認められた。
【００７４】 この二分分布が機能的有意性を持つのかどうかを調べるため、それぞれ低レベ
ルあるいは高レベルのＢｒｎ−３ｂ発現を示す腫瘍サンプル間の相違を探索した
。特に、家族性乳癌の多くの症例で突然変異が生じており（２１、２２）、また
非遺伝性（散発性）乳癌において発現低下を示すことが報告されている（２３）
、ＢＲＣＡ−１蛋白質をコードするｍＲＮＡの種々のサンプルでのレベルを検討
した。最も興味深い点として、種々のサンプルにおけるＢＲＣＡ−１のレベルは
Ｂｒｎ−３ｂに関して認められたものと逆の発現パターンを示した。すなわち、
閉経前（図３ａ）と閉経後（図３ｂ）女性の両方から誘導したサンプルで認めら
れた、低レベルのＢｒｎ−３ｂを示すサンプルが高レベルのＢＲＣＡ−１レベル
を示したが、その作用は閉経前女性からのサンプルにおいて特に著明であった。
これに対し、正常乳房試料あるいは良性腫瘍からの試験材料の種々の標本ではＢ
ＲＣＡ−１ ｍＲＮＡレベルの有意の変動を認めず、これらは同様のＢｒｎ−３
ｂレベルを有していた（図３ｃ）。
【００７５】 Ｂｒｎ−３ｂに関する結果と異なって、閉経前（図４ａ）あるいは閉経後（図
４ｂ）女性からの悪性試験材料におけるＢＲＣＡ−１ ｍＲＮＡレベルは、種々
の標本中のＢｒｎ−３ａ ｍＲＮＡレベルと相関を示さなかった。さらに、種々
の標本でＢｒｎ−３ａレベルが異なるにもかかわらず、正常あるいは良性試験材
料では同様のレベルのＢＲＣＡ−１ ｍＲＮＡが認められた（図４ｃ）。高いＢ
ｒｎ−３ｂレベルと低いＢＲＣＡ−１発現の特異的な結びつきは、サンプルを高
いＢｒｎ−３ｂを有するものと低いＢｒｎ−３ｂを有するものに分けることによ
って確認された。図５に例示するように、ＢＲＣＡ−１レベルは、高いＢｒｎ−
３ｂを有するサンプル群でのレベルに比べて、低いＢｒｎ−３ｂを有するサンプ
ル群では大きく上昇していた。この作用は統計的に有意であった（Ｂｒｎ−３ｂ
の高発現群と低発現群におけるＢＲＣＡ−１レベルを比較してｐ＜０．００１）
。
【００７６】 それ故これらの所見は、Ｂｒｎ−３ｂ転写因子がＢＲＣＡ−１発現に対する阻
害作用を有しており、一部の悪性乳癌標本で認められた高いレベルのＢｒｎ−３
ｂは低いレベルのＢＲＣＡ−１に結びつくという可能性を提起する。この可能性
をさらに検討するため、我々はＭＣＦ７細胞を、Ｂｒｎ−３ａあるいはＢｒｎ−
３ｂをコードする発現ベクターおよびＢＲＣＡ−１プロモーターの４ｋｂ断片が
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を推進する構築物とコトランスフェクシ
ョンした。
【００７７】 この実験において（図６）、挿入部を含まない対応する発現ベクターでコトラ
ンスフェクションしたサンプルで認められたレベルと比較して、Ｂｒｎ−３ａで
コトランスフェクションしたサンプルではプロモーターの活性が約５０％低下し
た。しかし、Ｂｒｎ−３ｂでコトランスフェクションしたサンプルでははるかに
劇的な阻害作用が認められ、プロモーター活性は、挿入部のない空発現ベクター
でトランスフェクションしたサンプルで認められたレベルの約５％にまで低下し
た。４００塩基対のＢＲＣＡ−１プロモーターだけを含むレポーター構築物に関
しても同様の結果が得られ、この作用がこの短いプロモーター領域に依存するこ
とを示唆した（データは示していない）。エストロゲン応答要素を含むレポータ
ーで同じＢｒｎ−３ｂ発現ベクターをトランスフェクションすると、我々の以前
の結果と一致して（１３）プロモーターへの強い刺激作用を生じたことから（デ
ータは示していない）、この作用はＢＲＣＡ−１プロモーターに特異的であった
。それ故、Ｂｒｎ−３ｂは実際に、乳癌細胞へのコトランスフェクションにおい
てＢＲＣＡ−１プロモーターを直接阻害することができる。
【００７８】
【参考文献】
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ｓｓ，Ｓ．，Ｋａｇｅｎ，Ｍ．Ｆ．，Ａｈｉｔａｕ，Ｎ．，Ｍｏｒｒｏｗ，Ｊ．
Ｅ．，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．，Ｓｋｖｏｒａｋ，Ａ．Ｂ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．
，Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ，Ａ．，Ｆｒｙｄｍａｎ，Ｍ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｔ
．Ｂ．，Ｋｉｎｇ，Ｍ−Ｃ．およびＡｖｒａｈａｍ，Ｋ．Ｂ．ヒトにおける進行
性聴力損失に関連する転写因子ＰＯＵ４Ｆ３の突然変異。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７
９：１９５０−１９５４，１９９８。 ７．Ｔｈｅｉｌ，Ｔ．，ＭｃＬｅａｎ−Ｈｕｎｔｅｒ，Ｓ．，Ｚｏｍｉｇ，Ｍ．
およびＭｏｒｏｙ，Ｔ．ＰＯＵ転写因子のマウスＢｒｎ−３ファミリー：新しい
アミノ末端ドメインはＢｒｎ−３Ａの腫瘍形成作用にとって決定的に重要である
。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：５９２１−５９２９
，１９９３。 ８．Ｇｅｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｒ．，ＭｃＥｖｉｌｌｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｕｎｅｒ，Ｅ
．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．，Ｊｅｎｎｅ，Ｋ．Ｊ．，Ｈ
ｏｂｂｓ，Ｍ．Ｖ．およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．Ｂｒｎ３．０：既知の
八量体モチーフとは異なる要素に関して機能する、感覚免疫系および内分泌系で
発現されるＰＯＵドメイン蛋白質。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９０：１０８４１−１０８４５，１９９３。 ９．Ｌｉｌｌｙｃｒｏｐ，Ｋ．Ａ．，Ｂｕｄｈｒａｍ−Ｍａｈａｄｅｏ，Ｖ．Ｓ
．，Ｌａｋｉｎ，Ｎ．Ｄ．，Ｔｅｒｒｅｎｇｈｉ，Ｇ．，Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｎ．，
Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．およびＬａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．新規ＰＯＵファミリー
転写因子はＢｒｎ−３に緊密に関連するが、神経細胞において異なる発現パター
ンを持つ。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：５０９３−
５０９６，１９９２。 １０．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｅ．Ｅ．，Ｊｅｎｎｅ，Ｋ．Ｊ．およびＲｏｓｅｎｆｅｌ
ｄ，Ｍ．Ｇ．Ｂｒｎ−３．２：特殊な中枢神経系発現を有し、レチノイン酸によ
って調節されるＢｒｎ−３関連転写因子。Ｎｅｕｒｏｎ １２：２０５−２１８
，１９９４。 １１．Ｎｉｎｋｉｎａ，Ｎ．Ｎ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｇ．Ｅ．Ｍ．，Ｗｏｏｄ，
Ｊ．Ｎ．およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｗ．Ｄ．ラット感覚および脊髄ニューロ
ンのサブセットにおいて発現される新規Ｂｒｎ−３様ＰＯＵ転写因子。Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：３１７５−３１８２，１９９３
。 １２．Ｎｄｉｓｄａｎｇ，Ｄ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｃ
．，Ｈｏ，Ｌ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ａ．およびＬａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．ＨＰＶ
活性化転写因子Ｂｒｎ−３ａはＣＩＮ３病変において過剰発現される。Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １０１：１６
８７−１６９２，１９９８。 １３．Ｂｕｄｈｒａｍ−Ｍａｈａｄｅｏ，Ｖ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．およびＬａ
ｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．ＰＯＵドメイン因子Ｂｒｎ−３ａおよびＢｒｎ−３ｂは
エストロゲンレセプタと相互作用し、ＥＲＥを通して弁別的に転写活性を調節す
る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８：
１０２９−１０４１，１９９７。 １４．Ｌｅｂｌｏｎｄ−Ｆｒａｎｃｉｌｌａｒｄ，Ｍ．，Ｐｉｃｏｎ，Ａ．，Ｂ
ｅｒｔａｇｎａ，Ｘ．およびＫｅｙｚｅｒ，Ｙ．急速進行性神経内分泌腫瘍にお
けるＰＯＵ因子Ｂｒｎ−３ａの高い発現。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８２：８
９−９４，１９９７。 １５．Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｄ．とＬａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．機能的に拮抗性であ
るＰＯＵファミリー転写因子Ｂｒｎ−３ａとＢｒｎ−３ｂは、ヒト神経芽腫細胞
の増殖停止と分化の際に正反対の発現変化を示す。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ６７：６５３−６６０，１９９６。 １６．Ｄｅａｎｓ，Ｚ．Ｃ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｉｌｉｍａｎ，Ｍ．
Ｗ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．およびＬａｔｃｈｍａｎ
，Ｄ．Ｓ．シナプス蛋白質をコードする遺伝子のＯｃｔ−２転写因子による弁別
的調節。Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５１：１−７，１９９７。 １７．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｔｈｅｉｌ，Ｔ．，Ｒｉｎｇ，Ｃ．Ｊ．Ａ．，
Ｌｉｌｌｙｃｒｏｐ，Ｋ．Ａ．，Ｍｏｒｏｙ，Ｔ．およびＬａｔｃｈｍａｎ，Ｄ
．Ｓ．緊密に関連するＰＯＵファミリー転写因子が標的プロモーター活性に及ぼ
す正反対の拮抗的作用はＰＯＵドメインにおける相違に依存する。Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：６９０７−６９１
４，１９９４。 １８．Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ，Ａ．，Ｐａｇａｎｏ，Ｍ．およびＡｕｒｉｃｃｈ
ｉｏ，Ｆ．ＭＣＦ−７細胞でのエストラジールによる蛋白チロシンリン酸化の即
時的で一過性の刺激。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２１８３−２１９１，１９９３。
１９．Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．哺乳類細胞への高い効率での遺伝子導入。Ｇｌｏ
ｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．編集のＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａ
ｐｐｒｏａｃｈより。ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５，ｐ．１４３−１９０。 ２０．Ａｂｋｅｎ，Ｈ．とＲｅｉｆｅｎｒａｔｈ，Ｂ．ＣＡＴレポーター遺伝子
アッセイを標準化するための手順。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ２０：３５２７，１９９２。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、閉経前あるいは閉経後女性からの正常／良性乳房標本あるいは悪性乳
癌におけるＲＴ／ＰＣＲアッセイによって測定したＢｒｎ−３ａ ｍＲＮＡのレ
ベルを示す。棒は、平均値プラス標準偏差（ＳＤ）と母集団の大きさ「ｎ」を表
わす。
【図２】 図２は、閉経前あるいは閉経後女性からの正常／良性乳房標本あるいは悪性乳
癌におけるＲＴ／ＰＣＲアッセイによって測定したＢｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡのレ
ベルを示す。棒は、平均値プラス標準偏差（ＳＤ）と母集団の大きさ「ｎ」を表
わす。
【図３】 図３は、閉経前（パネルａ）あるいは閉経後（パネルｂ）女性から採取した悪
性乳癌標本、あるいは良性乳房標本（パネルｃ）におけるＢｒｎ−３ｂとＢＲＣ
Ａ−１のｍＲＮＡレベルの比較を示す。Ｂｒｎ−３ｂレベルは黒い棒で、ＢＲＣ
Ａ−１レベルは白い棒で示されている。
【図４】 図４は、閉経前（パネルａ）あるいは閉経後（パネルｂ）女性から採取した悪
性乳癌標本、あるいは良性乳房標本（パネルｃ）におけるＢｒｎ−３ａとＢＲＣ
Ａ−１のｍＲＮＡレベルの比較を示す。Ｂｒｎ−３ａレベルは黒い棒で、ＢＲＣ
Ａ−１レベルは白い棒で示されている。
【図５】 図５は、Ｂｒｎ−３ｂレベルが低い乳癌あるいはＢｒｎ−３ｂレベルが高い乳
癌におけるＢＲＣＡ−１レベルの比較を示す。棒は、平均値プラス標準偏差（Ｓ
Ｄ）と母集団の大きさ「ｎ」を表わす。
【図６】 図６は、挿入部（Ｖ）を持たない発現ベクターあるいはＢｒｎ−３ａ又はＢｒ
ｎ−３ｂのいずれかを発現する同じベクターと共に完全長のＢＲＣＡ−１プロモ
ーターを含む、プロモーター／レポーター構築物でコトランスフェクションした
ＭＣＦ７細胞のルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。数値は、レポーター
構築物と挿入部不含発現ベクターでのコトランスフェクションにおいて得られる
活性（すなわち１００％）に対して等化しており、５回の測定の平均値であって
、標準偏差を棒で示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８７ Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブダラム−マハデイオウ，ビシユワニー イギリス国、ロンドン・ダブリユ・１・ピ ー・６・デイー・ピー、クリーブランド・ ストリート・46、ザ・ウインデイヤー・ビ ルデイング、デパートメント・オブ・マレ キュラー・パサラジー、デイビジヨン・オ ブ・パサラジー、ユー・シー・エル・メデ イカル・スクール (72)発明者 ヌデイサング，ダニエル イギリス国、ロンドン・ダブリユ・１・ピ ー・６・デイー・ピー、クリーブランド・ ストリート・46、ザ・ウインデイヤー・ビ ルデイング、デパートメント・オブ・マレ キュラー・パサラジー、デイビジヨン・オ ブ・パサラジー、ユー・シー・エル・メデ イカル・スクール Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB02 FB03 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA12 HA17 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR56 QR60 QR62 QR77 QR80 QS05 QS25 QS34 QS36 QX02 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 AA17 AA27 BA01 BA02 BA05 BA08 BA09 BA10 BA17 BA18 BA19 BA20 BA23 BA24 BA25 BA35 CA01 CA18 CA53 CA56 CA59 DC50 MA17 MA58 MA63 MA66 MA67 NA14 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 EA18 MA05 MA17 MA56 MA58 MA63 MA66 MA67 NA14 ZB26 ZC80 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 MA17 MA52 MA56 MA58 MA63 MA66 MA67 NA14 ZB26

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 乳癌および／または卵巣癌の治療において使用する薬剤の製
    造のためのＢｒｎ−３ｂの発現および／または活性の阻害因子の使用。
  2. 【請求項２】 阻害因子が、Ｂｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡにハイブリダイズする
    ことができるポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の使用。
  3. 【請求項３】 阻害因子が、宿主細胞において請求項２で定義されたような
    ポリヌクレオチドを発現することができる核酸ベクターを含む、請求項１に記載
    の使用。
  4. 【請求項４】 ベクターがウイルスベクターである、請求項３に記載の使用
    。
  5. 【請求項５】 ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイル
    スベクター、アデノ随伴ウイルスベクターあるいは単純ヘルペスウイルス株であ
    る、請求項４に記載の使用。
  6. 【請求項６】 治療によるヒトあるいは動物の身体の処置方法において使用
    するためのＢｒｎ−３ｂの発現および／または活性の阻害因子。
  7. 【請求項７】 乳癌あるいは卵巣癌の治療方法において使用するための、請
    求項６に記載の阻害因子。
  8. 【請求項８】 Ｂｒｎ−３ｂ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる
    ポリヌクレオチドを含む、請求項６又は７に記載の阻害因子。
  9. 【請求項９】 宿主細胞において請求項８で定義されたようなポリヌクレオ
    チドを発現することができる核酸ベクターを含む、請求項６又は７に記載の阻害
    因子。
  10. 【請求項１０】 ベクターがウイルスベクターである、請求項９に記載の阻
    害因子。
  11. 【請求項１１】 ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイ
    ルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターあるいは単純ヘルペスウイルス株で
    ある、請求項１０に記載の阻害因子。
  12. 【請求項１２】 （ａ）コード配列に機能的に連結されたＢｒｎ−３ｂプロ
    モーターを含む試験構築物を提供し、 （ｂ）試験物質不在下で当該コード配列によってコードされるポリペプチドを発
    現することができる条件下で試験物質を試験構築物に接触させ、そして （ｃ）当該物質がＢｒｎ−３ｂの発現を阻害するかどうかを調べる ことを含む、Ｂｒｎ−３ｂ発現の阻害因子を同定するための方法。
  13. 【請求項１３】 コード配列がＢｒｎ−３ｂポリペプチドをコードする、請
    求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 コード配列がレポーターポリペプチドをコードする、請求
    項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 宿主細胞が試験構築物を内包する、請求項１２から１４の
    いずれか一項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 （ａ）Ｂｒｎ−３ｂポリペプチド又はその相同体、あるい
    はそれらの断片を提供し、 （ｂ）当該物質不在下でポリペプチドの活性を可能にする条件下で試験物質をＢ
    ｒｎ−３ｂポリペプチドに接触させ、そして （ｃ）当該物質がＢｒｎ−３ｂの活性を阻害するかどうかを調べる ことを含む、Ｂｒｎ−３ｂ活性の阻害因子を同定するための方法。
  18. 【請求項１８】 （ｄ１）Ｂｒｎ−３ｂを阻害すると判定された当該物質を
    哺乳類細胞に投与し、そして （ｅ１）ＢＲＣＡ−１の発現への当該物質の作用を調べる ことをさらに含む、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 哺乳類細胞が乳癌細胞あるいは卵巣癌細胞である、請求項
    １８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 当該物質が細胞の増殖を抑制する能力を測定する、請求項
    １９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１２から２０のいずれかに記載の方法によって同定
    される阻害因子。
  22. 【請求項２２】 治療によるヒトあるいは動物の身体の処置方法において使
    用するための、請求項２１に記載の阻害因子。
  23. 【請求項２３】 乳癌あるいは卵巣癌の治療方法において使用するための、
    請求項２２に記載の阻害因子。
  24. 【請求項２４】 乳癌および／または卵巣癌の治療において使用する薬剤の
    製造のための、請求項２１で定義されたような阻害因子の使用。
  25. 【請求項２５】 請求項１から６および２１のいずれか一項に記載の阻害因
    子と製薬上許容される担体あるいは希釈剤を含む製薬組成物。
  26. 【請求項２６】 乳癌あるいは卵巣癌に罹患している宿主に治療上有効な量
    のＢｒｎ−３ｂの発現および／あるいは活性の阻害因子を投与することを含む、
    上記の宿主を治療する治療方法。
  27. 【請求項２７】 阻害因子が請求項１から６および２１のいずれか一項で定
    義された通りである、請求項２６に記載の治療方法。
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