WO2000071708A2 - UTILISATION DE EF-Ts DANS LE CADRE DES HYPERPLASIES DES CELLULES MUSCULAIRES LISSES (CML) - Google Patents

UTILISATION DE EF-Ts DANS LE CADRE DES HYPERPLASIES DES CELLULES MUSCULAIRES LISSES (CML) Download PDF

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Kazem Zibara
Marie-Claude Bourdillon
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Definitions

  • the present invention relates to the use of the gene coding for mammalian EF-Ts in the context of the treatment and diagnosis of diseases involving hyperplasia of smooth muscle cells (CML), de-differentiation of CML and / or cell transformation or carcinogenesis of SMCs.
  • CML smooth muscle cells
  • the invention also relates to the use of a compound capable of inhibiting the expression or activity of EF-Ts, in particular an antisense oligonucleotide or an antibody for the treatment of cardiovascular diseases and of Cancer.
  • the arterial smooth muscle cell (CML) is a major component of atherosclerotic and restenotic plaques (1). It is known that the migration and proliferation of these cells play a crucial role in the formation of lesions and atherogenesis (2,3,4). During the initial stages of these pathological processes, arterial CMLs migrate into the intima, modify the level of myofilaments in the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus (5,6), proliferate and produce extracellular matrix components (1 , 7,8). Then, the SMCs transform into foam cells by accumulating lipids (9,10,1 1).
  • CML undergoes phenotypic modulation (12,13), during which they pass from a contractile state to a synthetic state, then to a proliferating state.
  • SMCs harvested during cell culture passages gradually lose their contractile phenotype and exhibit characteristics identical to those observed in SMCs for synthesis of diffuse intima thickening (13,14).
  • some rat aortic SMCs have been observed to have a transformed phenotype (15,16) with many similarities to that of highly proliferating cells (17). At present, many uncertainties remain as to the cascade of genes involved in changes in the phenotype of CML (18).
  • a gene (2A3-2) has been isolated which is overexpressed in a line of fast proliferating rat smooth muscle cells, but not in cells in a state of synthesis. . This was then confirmed by Northern blot experiments carried out on both types of cells. In addition, a rat carotid balloon catheter lesion showed, by a virtual Northern blot technique, an upregulation of this gene in hyperplastic vessels.
  • This 2A3-2 gene (1.2 kb) is expressed in skeletal muscle, heart, aorta, lung, liver, kidney and spleen.
  • the rapid 5 'amplification of cDNA ends (5'RACE) allowed the cloning and sequencing of this 1.2 kb gene.
  • the gene 2 A3 -2 plays a role in the cascade of events involved in the passage of cells from a quiescent phenotype to a proliferating phenotype.
  • the present invention relates to the use of the gene coding for EF-Ts of mammals, in particular humans (SEQ ID No. 1), rats (SEQ ID No. 2) and mice (SEQ ID No. 3) in the framework for the treatment and diagnosis of diseases involving (a) hyperplasia of smooth muscle cells (CML), (b) de-differentiation of CML and / or (c) cell transformation or carcinogenesis of CML.
  • mammals in particular humans (SEQ ID No. 1), rats (SEQ ID No. 2) and mice (SEQ ID No. 3) in the framework for the treatment and diagnosis of diseases involving (a) hyperplasia of smooth muscle cells (CML), (b) de-differentiation of CML and / or (c) cell transformation or carcinogenesis of CML.
  • “Hyperplasia” is understood to mean not only intimal hyperplasia in the case of the carotid but also hyperplasia in any organ where smooth muscle cells play a role, such as in the uterus or the brain.
  • V8 cell line As an illustration of de-differentiation of smooth muscle cells (CML), mention may be made of the model of the V8 cell line used in the context of the present invention.
  • the V8 cell line model has been described in Dusserre E. et al.
  • Lipoprotein binding sites is associated with decrease in intracellular cholesterol efflux in dedifferentiated aortic smooth muscle cells.
  • Lipid biosynthesis in cultured arterial smooth muscle cells is related to their phenotype. Lipids 1993; 28: 589-592.
  • CMLs having a phenotype similar to V8 such as tumors in the uterus, leiomyosarcomas and leiomyomium.
  • V8 cell line in cell transformation and tumorigenicity has been described in Blaes N et al. Isolation of two morphologically distinct cell Unes from rat arterial smooth muscle expressing high tumorigenic potentials. In vitro Cell Dev Biol. 1991; 27A: 725-734.
  • the invention relates to an oligonucleotide of 8 to 100 nucleotides in length, characterized in that it hybridizes with a nucleic acid coding for the elongation factor of translation EF-Ts and in what it is capable of inhibiting the expression of EF-Ts in mammals.
  • This oligonucleotide targets the 5 'or 3' untranslated region, the translation initiation site, or the coding region of the EF-Ts mRNA.
  • the antisense oligonucleotide targets the 5 'region of the gene. Indeed, the amino terminal part of the protein is that which carries the active site. In addition, it is always more efficient to block in 5 ′, not far from the transcription initiation codon.
  • the oligonucleotide according to the invention hybridizes with a nucleic acid comprising at least 80% homology with the mRNA of the human gene coding for EF-Ts. It can comprise a sequence having at least 80%, 90%), 95% or 99% homology with a sequence of 10 to 50 consecutive nucleotides of a sequence selected from the sequences SEQ ID no. 1, SEQ ID no. 2 and SEQ ID n ° 3.
  • oligonucleotides is understood to mean, in the context of the inversion, antisense oligonucleotides approximately 8 to 100 nucleotides long, preferably 10 to 50 nucleotides long, capable of inhibiting the expression of the protein EF-Ts in a mammal, especially in humans.
  • the nucleotides can be linked to each other either by 5'-3 'or 3'-3' bonds (inverted nucleotides).
  • the nucleotides of the invention can be 2'-deoxynucleotides or modified nucleotides 2 'that facilitate the hybridization of the target mRNA.
  • the nucleotides can also be modified at the 3 'position of the sugar, in particular at the 3' terminal end of the oligonucleotides (esterification with a phosphate or with a phosphate analog).
  • the internucleotide bond of the oligonucleotide according to the invention can be a phosphodiester, phosphorothioate or p- bond. ehoxyphosphodiester.
  • the oligonucleotide may have protective groups at its 3 ′ and 5 ′ ends, in particular groups protecting against attack by nucleases.
  • the 3 ′ terminal end may preferably be protected by comprising a majority of 5 ′ -3 ′ bonds of the phosphorothioate or p-alkyloxyphosphotriester type and / or may comprise nucleotides substituted in the 3 ′ position such as for example nucleotides comprising groups of the alkyloxy type.
  • the 5 ′ end of the oligonucleotide according to the invention can also contain phosphorothioate or p-alkyloxyphosphotriester bonds and optionally the last 5 ′ hydroxyl group can be esterified with a phosphorus-based group, in particular phosphate, a phosphorothioate group or p-ethoxyphosphate.
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window” to identify and compare the regions sequence similarity locale.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be achieved, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math.
  • sequences and the percentages of identity can also be obtained using internet computing resources.
  • These algorithms are presented in Current Methods in Sequencing and Synthesis Methods and Applications, pages 127-149, 1988, Ala R. Liss, Inc.
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences by "comparison window" in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared may include additions or deletions with respect to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window. and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • nucleic acid sequences or oligonucleotides having a percentage identity of at least 80%, 90%, 95% or 99%> after optimal alignment with a reference sequence, we mean the nucleic acid sequences presenting, relative to the sequence reference nucleic acid certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion, and / or a substitution, in particular point, and whose nucleic sequence has at least 80%. 90%, 95% or 99% identity after optimal alignment with the reference nucleic sequence.
  • They are preferably sequences whose complementary sequences are capable of hybridizing specifically with the sequence SEQ ID No. 1, 2, or 3 of the invention.
  • the specific hybridization conditions or high stringency will be such that they ensure at least 80%, 90%, 95% or 99% identity after alignment between one of the two sequences and the complementary sequence of l 'other.
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two complementary DNA fragments.
  • High stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the polynucleotide fragments described above, will be adapted by the skilled person for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook and al. Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) in paragraphs 11.1 to 1 1.61.
  • the invention relates to an EF-Ts expression vector comprising a sequence having at least 80% identity with a sequence selected from the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 and SEQ ID n ° 3.
  • said sequence is fused to a promoter which is effective in eukaryotic and / or prokaryotic cells and the vector can also comprise a selection gene.
  • the invention also relates to a cell, in particular to a smooth muscle cell transformed by this vector according to one of claims 6 to 8.
  • the invention also relates to a transgenic animal, in particular a mouse or a rat, with the exception of humans, comprising said cell.
  • a transgenic animal in particular a mouse or a rat, with the exception of humans, comprising said cell.
  • Such an animal models diseases involving hyperplasia of smooth muscle cells (SMC), de-differentiation of SMC and / or cell transformation or carcinogenesis of SMC.
  • a complementary aspect of the invention relates to a polyclonal or monoclonal antibody capable of specifically recognizing EF-Ts of rats, mice or humans.
  • a polyclonal antibody was obtained using two peptides. These peptides have been coupled to carrier proteins (carriers, which is Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH). An immunization protocol for 2 rabbits was continued.
  • an antibody was obtained using the peptides comprising the sequence KZ-16CA: CGGDLKAAEAWLHKQA (SEQ ID No. 8) or KZ-15CL: CETDFVSRNVKFQQL (SEQ ID No. 9).
  • the invention also relates to a cell, in particular a hybridoma, producing a monoclonal antibody described above.
  • the invention relates to a method for selecting the antisense oligonucleotides capable of inhibiting the expression of EF-Ts, said method consisting in identifying, among the various possible oligonucleotides, the oligonucleotides having a strong affinity for EF-Ts mRNA.
  • a method for selecting the antisense oligonucleotides capable of inhibiting the expression of EF-Ts said method consisting in identifying, among the various possible oligonucleotides, the oligonucleotides having a strong affinity for EF-Ts mRNA.
  • the oligonucleotide according to the invention may comprise at least one chemical modification of the skeleton and / or of one or more nucleotide (s), some of said modifications relative to the natural structure of the oligonucleotides being explained above.
  • the invention relates to compounds inhibiting the expression or the activity of EF-Ts, characterized in that it comprises the following steps: a) Treatment of a cell expressing EF-Ts with one or more several compounds, b) measurement of the expression and / or of the activity of EF-Ts, c) selection of the compounds inhibiting the expression of EF-Ts and which exhibit little or no toxicity with respect to said cell.
  • the screening method according to the invention can also be characterized in that it comprises a step using a cell or an animal described above.
  • the measurement of the expression of EF-Ts can be done directly by measuring the quantity of protein produced relative to the quantity naturally present in the untreated cells.
  • the methods of protein electrophoresis, western blot or immunoprecipitation are particularly suitable for this quantification.
  • Expression can also be assessed by measuring the amount of mRNA synthesized using probes labeled with a radioactive or fluorescent agent.
  • probes comprise at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3.
  • Step b) of the method mentioned above can also consist in measuring the activity of EF-Ts. Any method within the reach of those skilled in the art can be implemented. It is possible, for example, to evaluate the capacity of the EF-Tu * EF-Ts mt complex to polymerize phenylalanine as an amino acid (polymerization assay). The complex is active in vitro using other elongation factors possibly from other species, including humans and cattle.
  • the invention also relates to a compound capable of being obtained from the process described above.
  • any equivalent method aimed at identifying compounds having an affinity for the gene, the mRNA or the protein EF-Ts and blocking the activity of the latter is also subject of the invention.
  • Such compounds can be selected from: (a) antisense according to the invention,
  • Said compound can target a specific sequence on EF-Ts. Indeed, the structure of the EF-Tu * EF-Ts complex of Escherichia coli has been elucidated (T. Kawashima, C. Berthet-Colominas, M. Wulff, S. Cusack, R. Leberman, 1996. Nature 379, 511- 518, incorporated in the description by reference). It is of special interest to choose a compound interacting on a specific part of the 3-dimensional structure of the EF-Ts protein, in particular with the part which has similarities with P21 (the product of the Ha-Ras oncogene ).
  • the invention relates to an anti-EF-Ts antibody, in particular an anti-EF-Ts antibody of humans or rats, and to its use for the treatment of hyperplasias, in particular for the treatment of atherosclerosis, restenosis induced by angioplasty, unstable angina, and / or the treatment of tumors, in particular tumors of the Leimyosarcoma type.
  • a composition comprising a compound selected from an oligonucleotide, an antibody or a compound according to the invention and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • this medicament is intended for the treatment of diseases involving the hyperplasia of smooth muscle cells (CML), the de-differentiation of CML and / or the cellular transformation or carcinogenesis of CML and advantageously for the treatment of tumors, in particular tumors in the uterus, leiomyosarcomas and leiomyomium.
  • CML smooth muscle cells
  • This medication can also be used to treat arteriosclerosis, angioplasty-induced restenosis and / or unstable angina.
  • angiogenesis inhibitor it can optionally be used in combination with an angiogenesis inhibitor.
  • angiogenesis inhibitors mention may especially be made of endostatin and angiostatin described by J. Folkman, thrombospondin-1 and -2 (TSP-1, -2) Locopo et al (1998); the factors IFN gamma, TNFalpha, and IL-1 alpha, Maier et al (1999), U-995, an inhibitor derived from shark cartilage, Sheu et al (1998), and the compounds described in the journals Paper et al ( 1998), and Harris et al (1998).
  • the following documents are incorporated by reference in the description: - Locopo N; Fanelli M; Gasparini G, Clinical significance of angiogenic factors in breast cancer, Breast Cancer Res Treat 1998; 52 (l-3): 159-73
  • the present invention also relates to a probe or a nucleotide primer comprising a sequence having at least 12, 15, 20 or 25 consecutive nucleotides of the gene coding for EF-Ts.
  • probes and primers for isolating the EF-Ts homolog in mice are given below: 5'-TCA TGA AGC TGG GCG GAC AA-3 '(SEQ ID No. 6) 5'-ACA TAA GAG CCG ACA TAG AAC-3 '(SEQ ID n ° 7)
  • the invention relates to a diagnostic kit comprising a compound selected from a probe or primer comprising a sequence having at least 12, 15, 20 or 25 consecutive nucleotides of the gene coding for EF-Ts, in particular sequences SEQ ID n ° 1, SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3 and an antibody according to the invention.
  • This kit can be used for determining the advancement of atheroma plaques, for studying the polymorphism of the gene coding for EF-Ts in the context of hyperplasia, and / or for detecting tumors, especially tumors in the uterus.
  • the 2A3-2 gene (1.2 kb) was isolated which is overexpressed in the rapidly proliferating rat, lis, A muscle cell line, but not in the cell line. synthesis.
  • a balloon lesion of rat carotids showed, by a virtual Northern blot technique, an upregulation of this gene in hyperplastic vessels.
  • the results of the differentiation display show an upregulation of 2A3-2 in rapidly proliferating SMCs (V8), but not in synthetic SMCs (P9). These results were then confirmed by Northern blots on several tissues which showed the presence of this 1.2 kb gene in different rat tissues.
  • the SMART technique in tandem with the Northern blot shows an upregulation of 2 A3 -2 in carotids injured by balloon compared to the controls.
  • the 5'-RACE technique allowed us to clone and sequence the entire 1.2 kb gene.
  • This gene shows, by research in databases, an important homology with the translational elongation factors human and bovine mitochondrials (44) (EF-Ts).
  • EF-Ts translational elongation factors human and bovine mitochondrials
  • EF-Ts is a gene encoded in the nucleus in mammals.
  • the expression of the gene coding for EF-Ts appears after attacks or repeated lesions of the artery and participates in vascular remodeling. Indeed, the expression of EF-Ts is 4 times higher in the injured carotids compared to that of the controls, 3 weeks after the balloon lesion.
  • in situ hybridization must be carried out on carotids left for different periods of time (7 to 40 days) after the balloon lesion. It is interesting to note that the expression of EF-Ts in synthetic cells (P9), under quiescence (48, 72 h) or proliferation (0, 4, 8, 24) conditions, did not not altered by the state of proliferation of cells. It therefore appears that the level of expression of the gene, between P9 and V8, is linked to the phenotypic state of the cells and not to their growth rate.
  • CML phenotypes induces the upregulation of a number of genes such as c-myc (45), c-myb (46), c-fos (47), the p65 subunit of Nf -kB (48), ras proteins (49), osteopontin (50), protein kinases activated by a mitogen (MAP) (51), angiotensin II (52) kinase cdk2 (53).
  • MAP mitogen
  • angiotensin II 52
  • sgk kinase regulated by serum and glucocorticoids
  • collagen type VIII 55
  • nucleophosmin 56
  • IP- 10 Interferon-inducible protein
  • BART-I 58
  • TGF- ⁇ type II receptor can play a central role in atherosclerosis and the proliferation of cancer tumor cells (21,22) and are common to both. diseases.
  • EF-Tu elongation factor family
  • the elongation factor EF-Ts acts as a catalyst in the displacement of GDP from the EF-Tu * GHDP complex and allows the binding of GTP. This reaction allows the formation of the ternary complex EF-Tu * GTP * aminoacyl-tRNA.
  • the vascular proliferation of CML contributes to the pathogenesis of atherosclerosis.
  • the proliferation of SMCs is a key event in the formation of neointima after balloon angioplasty and restenosis.
  • the molecular signals that mediate in these processes have not yet been identified. This study made it possible to identify a gene, 2A3-2 or EF-Ts, whose involvement in the functions of CML had not been previously reported.
  • Fig. 1 Analysis by difference display (DD) showing the cDNA band 2A3-2.
  • Total RNA was extracted from synthetic CML (P9) and proliferating (V8), then subjected to DD.
  • the migration of the PCR products was carried out on a denaturing gel containing 6% polyacrylamide using an arbitrary primer AP2 and a primer 3 '(dT ⁇ A). Lanes 1 and 2 correspond to synthetic and proliferating cells, respectively.
  • Fig. 2 Northern blot analysis with the cDNA band 2A3-2.
  • the 2A3-2 gene is upregulated in proliferating cells (V8), but not in synthetic cells (P9).
  • the quantification of the 2A3-2 signals, related to the ⁇ actin levels, showed a multiplication by 4 in the P200 cells compared to the P9 cells.
  • the 2A3-2 gene has a molecular mass of 1.2 kb, as shown in the Northern blot.
  • Lanes 1 and 2 correspond respectively to synthetic cells and to rapid proliferation.
  • B Analysis of several rat tissues by Northern blot with the cDNA band 2A3-2. The fingerprint contained 16 ⁇ g of total RNA from various rat tissues and was probed by the cDNA fragment of 2A3-2 isolated by DD. The sizes of the RNA markers are presented on the left (in kb). Transcripts of approximately 1200 bp were observed in all of the rat tissues analyzed. We observe a less abundant transcript of approximately 2.4 kb for the skeletal muscle. Lane 1, skeletal muscle; lane 2, heart; lane 3, lung; lane 4, liver; lane 5, spleen; lane 6, kidney; lane 7, aorta.
  • the proliferation of SMCs inside the original intimal layer resulted in intimal hyperplasia (HI). This was observed 3 weeks after the lesion (x60).
  • the arrowheads s represent the internal elastic blade, IEL.
  • Fig. 4 Northern blot experiment showing the positive regulation of 2A3-2 under in vitro and in vivo conditions.
  • 2 A3 -2 is upregulated in a carotid artery with hyperplasia (lane 5) compared to a healthy carotid artery (lane 4) and an aorta (lane 3).
  • the size of the gene transcript (1.2 kb) was observed to be the same under in vitro and in vivo conditions. Actin served as a charge control.
  • Fig. 5 Analysis of the different parts of the rat EF-Ts gene (2A3-2).
  • A The nucleotide sequence (1149 bp) with the poly-A signal (AATAAA) underlined.
  • the poly-A tail is designated by (A) n , while the initiation and stop codons are presented in bold (ATG is in position +1).
  • A n
  • initiation and stop codons are presented in bold (ATG is in position +1). It is important to note that both human and bovine EF-Ts genes have an intron of 224 bp at position 99 and they have a very short (18 bp) 5 '(5'UTR) untranslated region.
  • Fig. 6 Multiple alignments of sequences with the corresponding bovine and human EF-Ts genes.
  • EF-Ts proteins Comparison of sequences of EF-Ts proteins from pigs, rats and humans.
  • the bovine EF-Ts protein sequence is presented in the one-letter code and only the differences are indicated for the other two sequences.
  • the mature rat protein begins from the Ser residue underlined at position 41 and measures 284 aa, while the bovine and human homologous EF-Ts proteins measure 283 aa. (".” indicates a missing residue, while "-" indicates a similar amino acid).
  • Fig. 7 Human EF-Ts gene LOCUS HUMMTTSF1 1040 bp
  • ACCESSION L37936 SOURCE Homo sapiens liver cDNA corresponding to mRNA.
  • Fig. 8 Alignment between the human EF-Ts gene and the mouse EF-Ts gene
  • EXAMPLE 1 Identification and cloning of the 2A3-2 gene. Materials and methods
  • P9 and P200 cells were respectively seeded at 14 x 10 and 10 x 10 3 cells / cm 2 in 25 cm 2 dishes. These cells reached confluence in 5 to 7 days, they were trypsinized and we counted aliquots
  • RNA and polyA + after culture of the cells, the cells were washed with Hanks medium (Sigma, France), and they were used for the preparation of RNA.
  • Total RNA was extracted using the guanidinium thiocyanate method (33).
  • DNase I messageClean, GenHunter, EUA
  • poly (A +) RNA was isolated from total RNA using primers oligodT30 (Kit Oligotex mRNA, Qiagen, France).
  • Reverse transcription reaction 0.2 ⁇ g of total RNA from each sample was subjected to reverse transcription with 100 U of MMLV reverse transcriptase in the presence of 250 ⁇ mol / 1 of dNTP and 2 ⁇ mol / 1 HTl 1M (M can represent dA, dG, dC and H represents the restriction site of Hind III).
  • the RT reaction mixture of 20 ⁇ l was subjected to reverse transcription for 1 h at 37 ° C., then the enzyme was denatured by heating at 75 ° C. for 5 min.
  • PCR amplification 2 ⁇ l of the single-stranded cDNA mixture thus obtained was used for 8 different PCR reactions, each reaction mixture containing an arbitrary primer different from the 5 'end.
  • the 18 ⁇ l PCR mixture contained 2 ⁇ mol / 1 of the HTl 1M primer (the same as for RT), 2 ⁇ mol / 1 of a specific arbitrary primer, 25 ⁇ mol / 1 of the dNTPs with 0.25 ⁇ l of ⁇ - 32 P dATP (2000 c / mmol, Amersham, RU) and 1 U of Taq DNA polymerase (Perkin Elmer).
  • Amplification parameters by thermal cycles (40 cycles) using the system
  • sequences obtained were compared with sequences known by searching in the various databases (GenBank, EMBL, EST, STS, etc.) using the BLAST (36) and FASTA (37) programs .
  • Probes and Northern blot The total RNA was extracted as indicated above, it was denatured, separated by electrophoresis in a formaldehyde-MOPS-agarose gel, then transferred to a nylon membrane (Hybond, Amersham). After capillary blotting performed overnight, the membrane was baked for 2 h at 80 ° C. Probes for the Northern blots were prepared by following the random priming method (High Prime, Boeringher, Germany), using the PCR amplified inserts in the PCR II vector described above, then they were purified using G-sephadex (Quick Spin Columns, Boehringer). Prehybridization and hybridization were performed according to standard protocols (28). The fingerprints were exposed with intensifying screens against Kodak film for one week at -70 ° C. A similar load of RNA was tested using the actin probe. Results.
  • Skeletal muscle contains not only normal 1.2 kb mRNA, but also a less abundant transcript of approximately 2.4 kb. This transcript may originate from the use of another polyadenylation site (41).
  • the multiple Northern blot shows that the 2A3-2 gene is not an artefact induced by cell culture, but that it is present in different tissues.
  • EXAMPLE 3 SMART and Northern virtual blot of carotids. Materials and methods
  • Balloon catheter lesion of the left carotid artery of rat Carotid arteries were obtained in male Sprague-Dawley rats aged 10 to 14 weeks (350 g). The formation of neointima was induced as previously described (39). In summary, the left carotid was exposed under an operating microscope (OPMI7, Cari Zeiss, Oberkochen, Germany). After incision of the left external carotid artery, the balloon catheter (2F Fogarty, Baxter, EUA) was introduced through the primary carotid artery. A lesion of the left primary carotid was produced by passing the inflated balloon catheter back and forth three times through the carotid.
  • the balloon was inflated enough to produce slight resistance, and the catheter was then removed to ligate the external artery.
  • the rats were kept in ad libitum conditions for a total of 3 weeks after the balloon injury, after which they were anesthetized with urethane (Sigma) for the extraction of the vessels.
  • urethane Sigma
  • Each carotid artery was cut into two pieces, the first was immediately quickly frozen in liquid nitrogen for RNA extraction, while the second was fixed for use in histological and morphological.
  • the right carotid artery which was considered the normal control artery, was also extracted. This experimental model is known to induce neointimal hyperplasia similar to that observed in humans after angioplasty.
  • SMART technique and virtual Northern blot The quantities of total RNA being limited, the expression of the rat carotid genes was analyzed by a tandem of SMART-PCR (Clontech, California) and virtual Northern blot, rather than by standard Northern blot. A full description of SMART technology, and its applications, is given in the Clontech manual. In short, DNA is synthesized with 1 ⁇ g of total RNA from various samples (P9 and V8 cells, aorta, treated right and left carotids). RT was carried out for 1 h at 42 ° C.
  • the full-length single-strand cDNA obtained contains a sequence complementary to oligo SMART, which is then used as a PCR template to produce double-stranded cDNA.
  • the optimal number of PCR cycles it is ensured that the double-stranded cDNA will remain in the exponential amplification phase. In the experiments which led to the invention, the optimal number of cycles is 16, because the plateau has been reached after 17 cycles. Only ss cDNAs having the SMART sequence at the 5 'end and the oligo (dT) at the 3' end are exponentially amplified by PCR.
  • the 100 ⁇ l PCR reaction mixture contains 10 mmol / 1 of dNTP, 10 ⁇ mol / 1 of the PCR primer (complementary to oligo SMART and the CDS primer), 2 ⁇ l of KlenTaq 50x polymerase, and 10 ⁇ l of KlenTaq 10X PCR buffer.
  • the PCR conditions are as follows: a step at 95 ° C (1 min); then 16 cycles at 95 ° C (15 s), 65 ° C (30 s), and 68 ° C (6 min).
  • a virtual Northern blot is obtained by first migrating 0.5 ⁇ g of cDNA amplified by SMART PCR on an agarose / EtBr gel.
  • Neoinimal hyperplasia of rat carotids was used to study the in vivo role of this gene in SMCs.
  • Left rat carotids were treated with a balloon catheter to initiate CML proliferation and the formation of a neointima.
  • the untreated straight carotids were used as controls (Fig. 3).
  • the amount of total RNA extracted from a carotid being less than 2 ⁇ g, we used a tandem of SMART-PCR and virtual Northern blot to assess the expression levels of 2A3-2. This tandem approach to technologies gave information similar to that obtained by a standard Northern blot.
  • the 2 A3 -2 gene has been shown to be upregulated (multiplication by 4) in the left carotid treated with the balloon, compared to the right control carotid.
  • the virtual Northern blot experiment was repeated, and confirmed on 5 different fingerprints.
  • Virtual Northern blots further confirmed the upregulation of 2A3-2 in V8 cells, but not in P9, as previously observed by standard Northern blot (Fig. 4A). It is interesting to note that the expression of EF-Ts in P9 cells, in quiescence (48, 72 h) or proliferation (0, 4, 8, 24) condibons was not altered by state of proliferation of cells (Fig. 4C).
  • EXAMPLE 4 5'RACE and sequencing of the 2A3-2 gene.
  • Materials and methods Rapid 5 'amplification of cDNA ends (5'RACE): To obtain the 5' region upstream of the gene, the 5 'RACE technique was implemented essentially by applying the principle of impact PCR ( 40) and using the Marathon and Advantage KlenTaq Polymerase cDNA amplification kits (Clontech).
  • the second step consisted in the synthesis of double-stranded DNA carried out at 16 ° C. for 3 h in a mixture of enzymes containing DNA I polymerase. coli, RNase H, and E. coli DNA ligase. coli. These enzymes allow ds cDNA synthesis, RNA degradation, and the formation of blunt ends, respectively.
  • a 1% agarose gel electrophoresis is then carried out to estimate the quantity and the quality of the synthesized ds cDNA.
  • the gel is then dried and brought into contact with a Kodak film at -70 ° C. in order to visualize the trace of DNA.
  • the third step made it possible to obtain a ds cDNA library, from V8 cells, by ligating an adapter at the two ends of the ds cDNA, using a T4 DNA ligase at 16 ° C. overnight (iv) In the last step, an aliquot of the library was subjected to PCR.
  • the 50 ⁇ l PCR reaction mixture contains 10 ⁇ mol / 1 of dNTP, 10 ⁇ mol / 1 of the adapter primer (complementary to the cDNA adapter), 5 ⁇ l of KlenTaq 50x polymerase, and 10 ⁇ mol / 1 d 'specific primer of the gene (GSP, Gene Specifies Primer) complementary to the 3' fragment with differential expression (GSP of 2A3-2: 5'-GGGTAAAGTTATTAAATATACAATGTAATAAACG-3 ') (S ⁇ Q ID n ° 5).
  • the mixture was subjected to a PCR step at 94 ° C (1 min) followed by 33 cycles at 94 ° C (30 s), 60 ° C (30 s), and 68 ° C (2 min 15 s); and an extension step of 5 min at 72 ° C.
  • the amplified DNA fragments were cloned into the PCR II vector and purified using the Qiagen Plasmid Midi kit (Qiagen). The DNA insert is then commercially sequenced (Genome Express, France).
  • the full length of this gene was obtained by 5 '-RACE using a cDNA library constructed from rapidly proliferating V8 cells.
  • the molecular weight of the 5 'RACE product was 1.2 kb as previously indicated by Northern blot (Fig. 5).
  • PCR product was amplified, purified, cloned and sequenced (Fig. 6A).
  • the complete nucleotide sequence of 2A3-2 was then sent to the EMBL database, using Sequin software, to obtain an access number (AJ006151).
  • Characteristics of the 2A3-2 gene The open reading frame of the sequence gene (1149 bp) has been identified and has been shown to contain 972 bp ranging from the start codon ATG to a stop codon TAG (FIG. 6) .
  • This gene includes a very short 5 'untranslated region (7 bp long).
  • the initiation codon (designated by +1) is preceded by a residue G in position -3 and followed by a residue T in position +4. Analysis of numerous sites at the start of translation shows that the consensus sequence contains a purine at position -3 and a residue G at position +4 (42).
  • the cDNA contained 170 bp in the 3 'untranslated region with a typical poly-A signal (43) (AATAAA), which was determined 27 bp upstream from the poly-A tail.
  • AATAAA poly-A signal
  • the full length nucleotide sequence was analyzed for homologies in the GenBank database using FASTA, it was observed to have 72% homology with elongation factors, EF-Ts , human and bovine mitochondrials (44).
  • the presumed initiation ATG was assigned to the first methionine residue and the deduced protein sequence of 324 amino acid residues (aa) was called protein 2A3-2 (Fig. 6B).
  • the deduced protein 2 A3 -2 sequence gave a calculated molecular mass of 27 kDa.
  • Mitochondrial import signals are generally not preserved between different species; however, they are generally devoid of acidic amino acids, are enriched in basic and hydroxylated amino acids, and can form an ⁇ helix or an amphiphilic ⁇ sheet.
  • the intermediate peptide for rat EF-Ts is devoid of acid residues and is moderately rich in basic and hydroxylated residues (30%>).
  • the protein sequence comprises 324 aa (the human protein comprises 294, while the bovine comprises 338), while the mature form of the protein has 284 aa (283 aa for the bovine and human homologs).
  • the N-terminal part of the protein in rats contains 29 aa more than humans.
  • Antisense oligonucleotides to the p65 subunit of NF-kB inhibit human vascular smooth muscle cell adhesion and proliferation and prevent neointima formation in rat carotid arteries. Biochem Biophys Res Commun. 1995; 213: 3, 827-36. - Indolfi C, Avvedimento EV, Rapacciuolo A, Di Lorenzo E, Esposito G, Stabile E, Feliciello A, Mêle E, Giuliano P, Condorelli G. Inhibition of cellular ras prevents smooth muscle cell proliferation after vascular injury in vivo. Nat Med.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation du gène codant pour EF-Ts de mammifères dans le cadre du traitement et du diagnostique de maladies impliquant les hyperplasies des cellules musculaires lisses (CML), la dé-différenciation des CML et/ou la transformation cellulaire ou cancérogenèse des CML. L'invention porte également sur l'utilisation d'un composé capable d'inhiber l'expression ou l'activité de EF-Ts, notamment d'un oligonucléotide antisens ou d'un anticorps pour le traitement des maladies cardio-vasculaires et du cancer.

Description

Utilisation de EF-Ts dans le cadre des hyperplasies des cellules musculaires lisses (CML)
La présente invention concerne l'utilisation du gène codant pour EF-Ts de mammifères dans le cadre du traitement et du diagnostique de maladies impliquant les hyperplasies des cellules musculaires lisses (CML), la dé-différenciation des CML et/ou la transformation cellulaire ou cancérogenèse des CML. L'invention porte également sur l'utilisation d'un composé capable d'inhiber l'expression ou l'activité de EF-Ts, notamment d'un oligonucleotide antisens ou d'un anticorps pour le traitement des maladies cardio-vasculaires et du cancer.
La cellule musculaire lisse (CML) artérielle est un composant majeur des plaques athéroscléreuses et resténotiques (1). On sait que la migration et la prolifération de ces cellules jouent un rôle crucial dans la formation de lésions et l'athérogénèse (2,3,4). Au cours des stades initiaux de ces processus pathologiques, les CML artérielles migrent dans l'intima, modifient le taux de myofilaments dans le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi (5,6), prolifèrent et produisent des composants de matrice extracellulaire (1,7,8). Ensuite, les CML se transforment en cellules spumeuses en accumulant des lipides (9,10,1 1). Dans ces pathologies, les CML subissent une modulation phénotypique (12,13), au cours de laquelle elles passent d'un état contractile à un état de synthèse, puis à un état proliférant. Les CML récoltées pendant les passages de culture de cellules perdent progressivement leur phénotype contractile et présentent des caractéristiques identiques à celles observées dans des CML de synthèse d'épaississement diffus de l'intima (13,14). Dans les cultures à long terme, on a observé que certaines CML aortiques de rat avaient un phénotype transformé (15,16) présentant plusieurs similitudes avec celui des cellules hautement proliférantes (17). A l'heure actuelle, de nombreuses incertitudes subsistent quant à la cascade des gènes impliqués dans les modifications du phénotype des CML (18). Certains auteurs ont suggérés que la prolifération des CML dans l'intima de la paroi du vaisseau est le résultat d'un processus inflammatoire(l) ou bien celui d'une croissance monoclonale (19,20). Selon Ross (1), les lésions athéroscléreuses sont dues à une réponse inflammatoire fibroproliférative excessive à diverses formes d'agressions de l'endothélium et des CML de l'artère. Un grand nombre de facteurs de croissance, de cytokines et de molécules vasorégulatrices participent à ce processus. Après la formation de la lésion, les cellules endothéliales sécrètent des facteurs chimiotactiques qui induiraient une prolifération des CML et le dépôt de lipides. Des lipoprotéines de basse densité (LDL) qui ont été oxydées participent également à la formation des cellules spumeuses et des lésions athéroscléreuses. Par ailleurs, Benditt a émis l'hypothèse selon laquelle un processus néoplasique pourrait se déclencher pendant l'athérogénèse en réponse à un événement de mutation ou viral (19,20). En effet, il a été montré que certains gènes étaient impliqués dans la pathologie de l'athérosclérose et du cancer (21,22). L'hypothèse de Benditt est étayée par des résultats expérimentaux démontrant l'apparition de CML dans des aortes d'animaux ayant reçu des injections d'un carcinogène seul (23), en combinaison avec de la méthoxamine (24) ou avec l'herpèsvirus de Marek oncogène (25). En outre, l'ADN provenant de plaques humaines transforme complètement des cellules NIH 3T3 transfectées (26). D'autres facteurs, tels que des agents bactériens (27) (Chlamydia pneumoniae) ou viraux (28) (herpèsvirus, cytomégalovirus) ont été détectés et pourraient être impliqués dans l'initiation et le maintien des lésions athéroscléreuses.
Dans le cadre de la présente invention, en utilisant la technique différenciai display , on a isolé un gène (2A3-2) qui est surexprimé dans une lignée de cellules musculaires lisses de rat en prolifération rapide, mais non dans des cellules en état de synthèse. Ceci a ensuite été confirmé par des expériences de Northern blot effectuées sur les deux types de cellules. En outre, une lésion par cathéter à ballonnet de carotides de rat a montré, par une technique de Northern blot virtuel, une régulation positive de ce gène dans les vaisseaux hyperplasiques. Ce gène 2A3-2 (1,2 kb) est exprimé dans le muscle squelettique, le coeur, l'aorte, le poumon, le foie, le rein et la rate. De plus, l'amplification rapide en 5' d'extrémités d'ADNc (5'RACE) a permis le clonage et le séquençage de ce gène de 1,2 kb. La comparaison de ce gène nouvellement identifié avec les séquences disponibles dans les banques de données a montré une forte homologie avec les facteurs d'élongation traductionnelle (EF-Ts) mitochondriaux humain et bovin. Ainsi, le gène 2 A3 -2 joue un rôle dans la cascade d'événements impliqués dans le passage des celllules d'un phénotype quiescent à un phénotype proliférant.
Description
La présente invention concerne l'utilisation du gène codant pour EF-Ts de mammifères, en particulier des humains (SEQ ID n°l), du rat (SEQ ID n°2) et de la souris (SEQ ID n°3) dans le cadre du traitement et du diagnostique de maladies impliquant (a) les hyperplasies des cellules musculaires lisses (CML), (b) la dé- différenciation des CML et/ou (c) la transformation cellulaire ou cancérogenèse des CML.
On entend par « hyperplasies », non seulement une hyperplasie intimale dans le cas de la carotide mais aussi une hyperplasie dans n'importe quel organe où des cellules musculaires lisses jouent un rôle, comme dans l'utérus ou le cerveau.
Comme illustration de dé-différenciation des cellules musculaires lisses (CML), on peut citer le modèle de la lignée cellulaire V8 utilisé dans le cadre de la présente invention. Le modèle de la lignée cellulaire V8 a été décrit dans Dusserre E. et al.
Decrease in High Density Lipoprotein binding sites is associated with decrease in intracellular cholestérol efflux in dedifferentiated aortic smooth muscle cells. Biochem.
Biophys. Acta 1994;1212:235-244 et Dusserre E. et al. Lipid biosynthesis in cultured arterial smooth muscle cells is related to their phénotype. Lipids 1993;28:589-592.
Pour la transformation cellulaire ou cancérogenèse des CML, on peut citer également des CML présentant un phénotype similaire aux V8, comme des tumeurs dans l'utérus, leiomyosarcomes et leiomyomium. Le modèle de la lignée cellulaire V8 en transformation cellulaire et tumorigenicité a été décrite dans Blaes N et al. Isolation of two morphologically distinct cell Unes from rat arterial smooth muscle expressing high tumorigenic potentials. In vitro Cell Dev Biol. 1991;27A:725-734.
Dans un premier mode de réalisation, l'invention se rapporte à un oligonucleotide de 8 à 100 nucléotides de long caractérisé en ce qu'il s'hybride avec un acide nucléique codant pour le facteur d'élongation de la traduction EF-Ts et en ce qu'il est capable d'inhiber l'expression de EF-Ts chez les mammifères. Cet oligonucleotide cible la région 5 'ou 3' non traduite, le site d'initiation de la traduction, ou la région codante de l'ARNm de EF-Ts. De préférence, l 'oligonucleotide antisens cible la région 5' du gène. En effet, la partie amino terminale de la protéine est celle qui porte la site actif. De plus, il est toujours plus efficace de bloquer en 5', non loin du codon d'initiation de la transcription.
De préférence, l' oligonucleotide selon l'invention s'hybride avec un acide nucléique comprenant au moins 80 % d'homologie avec l'ARNm du gène humain codant pour EF-Ts. Il peut comprendre une séquence ayant au moins 80 %, 90%), 95% ou 99% d'homologie avec une séquence de 10 à 50 nucléotides consécutifs d'une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID n°l, SEQ ID n°2 et SEQ ID n°3.
On entend par « oligonucléotides » dans le cadre de l'inverîion, des oligonucléotides antisens d'environ 8 à 100 nucléotides de long, de préférence de 10 à 50 nucléotides de long, capables d'inhiber l'expression de la protéine EF-Ts chez un mammifère, en particulier chez les humains. Les nucléotides peuvent être liés entre eux soit par des liaisons 5'-3', soit 3'-3' (nucléotides inversés). Les nucléotides selon l'invention peuvent être des 2'-déoxynucléotides ou des nucléotides modifiés en 2' qui facilitent l'hybridation sur l'ARNm cible. On peut citer par exemple les 2'-fluoro, les 2'- methoxy, 2'-ethoxy, 2"-methoxyethoxy, 2'-allyloxy (-OCH2CH=CH )-nucléotides.
Les nucléotides peuvent également être modifiés en position 3' du sucre, en particulier à l'extrémité 3' terminale des oligonucléotides (estérification avec un phosphate ou avec un analogue du phosphate). La liaison internucléotidique de l' oligonucleotide selon l'invention peut être une liaison phosphodiester, phosphorothioate ou p- ehoxyphosphodiester. L'oligonucléotide peut comporter des groupes protecteurs en ses extrémités 3' et 5', en particulier des groupes protégeant contre une attaque par les nucléases. L'extrémité 3' terminale peut être protégée de préférence en comportant une majorité de liaisons 5 '-3' du type phosphorothioate ou p-alkyloxyphosphotriester et/ou comporter des nucléotides substitués en position 3' tels que par exemple des nucléotides comportant des groupes du type alkyloxy. L'extrémité 5' de l'oligonucléotide selon l'invention peut également comporter des liaisons phosphorothioate ou p-alkyloxyphosphotriester et éventuellement le dernier groupe 5' hydroxyle peut être estérifié avec un groupe à base de phosphore, notamment du phosphate, un groupe phosphorothioate ou p-ethoxyphosphate.
Les différentes structures possibles des oligonucléotides antisens et leur procédé de synthèse sont explicités en détail dans les documents WO 98/13526, WO 98/37240, WO 98/26062, WO 98/05770, WO 98/05771 et WO 97/21808. Ces documents sont incorporés dans la description par référence.
Par " pourcentage d'identité " entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par " fenêtre de comparaison " pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 : 482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) et (DNASISNersion 2.5 pour Windows ; Hitachi Software Engineering Co., Ltd, South San Francisco, CA, en utilisant les paramètres standards décrits dans le manuel du fabriquant).
Dans ce contexte, les séquences et les pourcentages d'identité peuvent également être obtenus en utilisant les ressources informatiques internet. On peut citer les programmes Blast (WWW.ncbi.nlm.nih.gov) et le programme FastDB avec les paramètres suivants " Mismatch penalty 1.00 ; Gap Penalty 1.00 ; Gap Size Penalty 0.33 ; joining penalty 30.0. Ces algorithmes sont présentés dans Current Methods in Sequencing and Synthesis Methods and Applications, pages 127-149, 1988, Ala R. Liss, Inc.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par " fenêtre de comparaison " dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par séquences nucléiques ou oligonucléotides présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, 90 %, 95 % ou 99 %>, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entendra désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %. 90 %, 95 % ou 99 % d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID n° 1 , 2, ou 3 de l'invention. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % d'identité après alignement entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. Des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) aux paragraphes 11.1 à 1 1.61.
Dans un deuxième mode de réalisation, l'invention a trait à un vecteur d'expression de EF-Ts comprenant une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID n°l, SEQ ID n°2 et SEQ ID n°3.
De préférence, ladite séquence est fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules eucaryotes et/ou procaryotes et le vecteur peut comporter en outre un gène de sélection.
L'invention se rapporte également à une cellule, notamment à une cellule musculaire lisse transformée par ce vecteur selon l'une des revendications 6 à 8.
L'invention vise également un animal transgénique, notamment une souris ou un rat, à l'exception des humains, comprenant ladite cellule. Un tel animal modélise des maladies impliquant les hyperplasies des cellules musculaires lisses (CML), la dé- différenciation des CML et/ou la transformation cellulaire ou cancérogenèse des CML. Un aspect complémentaire de l'invention porte sur un anticorps polyclonal ou monoclonal capable de reconnaître spécifiquement EF-Ts de rat, de souris ou des humains. Un anticorps polyclonal a été obtenu en utilisant deux peptides. Ces peptides ont été couplés sur des protéines porteuses (carriers, qui est le Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH). Un protocole d'immunisation de 2 lapins a été poursuivi. Après des injections sous-cutanée et intradermique, les lapins ont été saignés et les sérum ont été récoltés. Ces anticorps sont positifs sur western-blot. Ledit anticorps reconnaît spécifiquement les protéines EF-Ts et les peptides dérivés de EF-Ts. Par exemple, un anticorps a été obtenu en utilisant les peptides comprenant la séquence KZ-16CA : CGGDLKAAEAWLHKQA (SEQ ID n°8) ou KZ-15CL : CETDFVSRNVKFQQL (SEQ ID n°9).
L'invention porte également sur une cellule, en particulier un hybridome, produisant un anticorps monoclonal décrit ci-dessus.
Dans un autre mode de réalisation particulier, L'invention concerne un procédé pour sélectionner les oligonucléotides antisens capables d'inhiber l'expression de EF-Ts, ladite méthode consistant à identifier, parmi les différents oligonucléotides envisageables, les oligonucléotides possédant une forte affi nié pour l'ARNm de EF- Ts. Un tel procédé, basé par exemple sur le calcul de la variance de l'énergie libre, est décrit dans WO 98/37242 incorporé dans la description par référence. Ce procédé peut être mise en œuvre par l'homme du métier par des expériences de routine. Les oligonucléotides susceptibles d'être obtenus par un tel procédé font également partie de la définition générale des oligonucléotides selon l'invention.
Ainsi, l'oligonucléotide selon l'invention peut comporter au moins une modification chimique du squelette et/ou d'un ou de plusieurs nucléotide(s), certaines desdites modifications par rapport à la structure naturelle des oligonucléotides étant explicitées ci-dessus. Ainsi, plus généralement, l'invention se rapporte à de composés inhibant l'expression ou l'activité de EF-Ts caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Traitement d'une cellule exprimant EF-Ts avec un ou plusieurs composés, b) mesure de l'expression et/ou de l'activité de EF-Ts, c) sélection des composés inhibant l'expression de EF-Ts et qui présentent peu ou pas de toxicité vis-à-vis de ladite cellule.
Le procédé de criblage selon l'invention peut également être caractérisé en ce qu'il comprend une étape mettant en oeuvre une cellule ou un animal décrit précédemment.
Il est d'un intérêt particulier de tester des composés provenant de librairies obtenues par chimie combinatoire. Les différentes étapes de ce procédé sont à la portée de l'homme du métier. Par exemple, la mesure de l'expression de EF-Ts peut se faire directement en mesurant la quantité de protéine produite par rapport à la quantité naturellement présente dans les cellules non traitées. Les méthodes d'électrophorèse des protéines, de western blot ou d'immunoprécipitation sont particulièrement adaptée à cette quantification. L'expression peut également être évaluée en mesurant la quantité d'ARNm synthétisé en utilisant des sondes marquées avec un agent radioactif ou fluorescent. De telles sondes comprennent au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID n° 1 , SEQ ID n°2 ou SEQ ID n°3.
L'étape b) du procédé évoqué ci-dessus peut également consister en une mesure de l'activité de EF-Ts. Toute méthode à la portée de l'homme du métier peut être mise en œuvre. II est possible par exemple d'évaluer la capacité du complexe EF-Tu*EF-Tsmt de polymériser la phénylalanine comme acide aminé (polymerization assay). Le complexe est actif in vitro en utilisant d'autres facteurs d'élongation provenant éventuellement d'autres espèces, notamment des humains et des bovins. L'incorporation de phénylalanine dans un complexe peptidique est un test rapide qui permet de mesurer la quantité des molécules d'EF-Ts présent dans un échantillon sachant qu'on connaît le nombre des molécules d'EF-Tu qu'on introduit et étant donné qu'une molécule d'EF- Ts est capable de faire 10 tours de polymérization peptidique, C. J. Schwartzbach, L. L. Spermulli ; J. Biol. Chem., 1991 :266, 16324-16330, incorporé dans la description par référence.
L'invention porte également sur un composé susceptible d'être obtenu à partir de du procédé décrit ci-dessus. Bien entendu, tout procédé équivalent visant à identifier des composés ayant une affinité pour le gène, l'ARNm ou la protéine EF-Ts et bloquant l'activité de ces derniers, est également objet de l'invention. De tels composés peuvent être sélectionnés parmi : (a) des antisens selon l'invention,
(b) un anticorps selon l'invention,
(c) un peptide synthétique ou naturel,
(d) un bas poids moléculaire organique,
(e) ou une protéine EF-Ts recombinante ayant perdu son activité naturelle.
Ledit composé peut cibler une séquence spécifique sur l'EF-Ts. En effet, la structure du complexe EF-Tu*EF-Ts de Escherichia coli a été élucidée (T. Kawashima, C. Berthet-Colominas, M. Wulff, S. Cusack, R. Leberman, 1996. Nature 379, 511-518, incorporé dans la description par référence). Il est d'un intérêt spécial de choisir un composé interagissant sur une partie spécifique de la structure 3-dimensionelle de la protéine EF-Ts, notamment avec la partie qui présente des similitudes avec le P21 (le produit de l'oncogène Ha-Ras).
Une autre cible peut être les domaines de « binding » des nucléotides Guanines (GTP), en position amino terminal. Le blocage de ces sites représente une possibilité intéressante pour le traitement des hyperplasies. Une autre possibilité réside en l'utilisation d'anticorps anti-peptide TDFV qui est probablement le site actif où le Mg2+ se lie afin d'assurer la polymérization. Ainsi, l'invention porte sur un anticorps anti-EF-Ts, notamment un anticorps anti-EF-Ts d'humain ou de rat, et sur son utilisation pour le traitement des hyperplasies, notamment pour le traitement de l'arthérosclérose, de la resténose induite par angioplastie, de l'angor instable, et/ou au traitement des tumeurs, notamment des tumeurs du type Leimyosarcome. Un autre aspect de l'invention a trait à une composition comprenant un composé sélectionné parmi un oligonucleotide , un anticorps ou un composé selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
De préférence, ce médicament est destiné au traitement de maladies impliquant les hyperplasies des cellules musculaires lisses (CML), la dé-différenciation des CML et/ou la transformation cellulaire ou cancérogenèse des CML et avantageusement pour le traitement des tumeurs, notamment des tumeurs dans l'utérus, des leiomyosarcomes et leiomyomium.
Ce médicament peut également être destiné au traitement de l'arthérosclérose, de la resténose induite par angioplastie et/ou de l'angor instable.
Il peut être éventuellement utilisé en combinaison avec un inhibiteur de l'angiogénèse. Parmi les inhibiteurs de l'angiogénèse, on peut notamment citer l'endostatine et l'angiostatine décrites par J. Folkman, les thrombospondine-1 et -2 (TSP-1 , -2) Locopo et al (1998) ; les facteurs IFN gamma, TNFalpha, et IL- 1 alpha , Maier et al (1999), U-995, un inhibiteur dérivé du cartilage de requin, Sheu et al (1998), et les composés décrits dans les revues Paper et al (1998), et Harris et al (1998). Les documents suivants sont incorporés par référence dans la description : - Locopo N; Fanelli M; Gasparini G, Clinical significance of angiogenic factors in breast cancer, Breast Cancer Res Treat 1998;52(l-3): 159-73
- Maier JA; Morelli D; Lazzerini D; Menard S; Colnaghi MI; Balsari A,
Inhibition of fibronectin activated migration of microvascular endothelial cells by IL1 alpha, TNF alpha and IFgamma , Cytokine 1999 Feb;l 1(2): 134-9 - Sheu JR; Fu CC; Tsai ML; Chung WJ, Effect of U-995, a potent shark cartilage- derived angiogenesis inhibitor, on anti-angiogenesis and anti-tumor activities, Anticancer Res 1998 Nov-Dec;18(6A):4435-41
- Paper DH, Natural products as angiogenesis inhibitors, Planta Med 1998 Dec;64(8):686-95 - Harris SR; Thorgeirsson UP, Tumor angiogenesis: biology and therapeutic prospects, In Vivo 1998 Nov-Dec;12(6):563-70 La présente invention a également pour objet une sonde ou une amorce nucléotidique comportant une séquence possédant au moins 12, 15, 20 ou 25 nucléotides consécutifs du gène codant pour EF-Ts. Des exemples de sondes et amorces pour isoler l'homologue de EF-Ts chez la souris sont donnés ci-après : 5'-TCA TGA AGC TGG GCG GAC AA-3' (SEQ ID n° 6) 5'-ACA TAA GAG CCG ACA TAG AAC-3' (SEQ ID n°7)
Ainsi, l'invention porte sur un kit de diagnostique comprenant un composé sélectionné parmi une sonde ou amorce comportant une séquence possédant au moins 12, 15, 20 ou 25 nucléotides consécutifs du gène codant pour EF-Ts, en particulier des séquences SEQ ID n°l, SEQ ID n°2 et SEQ ID n°3 et un anticorps selon l'invention. Ce kit peut être mis en oeuvre pour la détermination de l'avancement de plaques d'athérome, pour l'étude du polymorphisme du gène codant pour EF-Ts dans le cadre des hyperplasies, et/ou pour la détection des tumeurs, notamment des tumeurs dans l'utérus.
En utilisant la technique «différenciai display», on a isolé le gène 2A3-2 (1,2 kb) qui est surexprimé dans la lignée de cellules musculaires lis ,.A de rat en prolifération rapide, mais pas dans la lignée de cellules de synthèse. En outre, une lésion par ballonnet de carotides de rat a montré, par une technique de Northern blot virtuel, une régulation positive de ce gène dans des vaisseaux hyperplasiques. Plusieurs faisceaux de preuves appuient l'affirmation ci-dessus : Les résultats de la différenciai display montre une régulation positive de 2A3-2 dans les CML en prolifération rapide (V8), mais pas dans les CML de synthèse (P9). Ensuite, ces résultats ont été confirmés par des Northern blot sur plusieurs tissus qui ont montré la présence de ce gène de 1 ,2 kb dans différents tissus de rat. La technique SMART en tandem avec le Northern blot montre une régulation positive de 2 A3 -2 dans des carotides lésées par ballonnet par rapport aux témoins. La technique 5'-RACE nous a permis de cloner et de séquencer le gène de 1,2 kb entier. Ce gène montre, par recherche dans des banques de données, une homologie importante avec les facteurs d'élongation traductionnelle mitochondriaux humain et bovin (44) (EF-Ts). En outre, on peut noter que EF-Ts est un gène codé dans le noyau chez les mammifères. Enfin, sur un Northern blot sur plusieurs tissus, Xin et al ont découvert un transcrit de 2,4 kb, comme nous l'avons fait, présent seulement dans les muscles squelettiques (44). Lors de la mise en oeuvre de la différenciai display sur des CML de synthèse et à prolifération rapide, un certain nombre de bandes ont été isolées. Ces bandes à expression différentielle ont montré une homologie de 72% avec les facteurs d'élongation traductionnelle (EF-Ts) mitochondriaux bovin et humain. La protéine est homologue à 85 % avec les EF-Ts bovin et humain.
L'expression du gène codant pour EF-Ts apparaît après des agressions ou des lésions répétées de l'artère et participe au remodelage vasculaire. En effet, l'expression d'EF- Ts est 4 fois supérieure dans les carotides lésées par rapport à celle des témoins, 3 semaines après la lésion par ballonnet. Pour mieux comprendre le rôle d'EF-Ts dans la modulation des CML passant d'un phénotype contractile à un phénotype de synthèse, une hybridation in situ doit être effectuée sur des carotides laissées pendant différents laps de temps (7 à 40 jours) après la lésion par ballonnet. Il est intéressant de noter que l'expression d'EF-Ts dans des cellules de synthèse (P9), dans des conditions de quiescence (48, 72 h) ou de prolifération (0, 4, 8, 24), n'a pas été altérée par l'état de prolifération des cellules. Il apparaît par conséquent que le niveau d'expression du gène, entre P9 et V8, est lié à l'état phénotypique des cellules et non de leur vitesse de croissance.
On sait que la modulation des phénotypes de CML induit la régulation positive d'un certain nombre de gènes tels que c-myc (45), c-myb (46), c-fos (47), la sous-unité p65 de Nf-kB (48), les protéines ras (49), l'ostéopontine (50), les kinases de protéines activées par un mitogène (MAP) (51), l'angiotensine II (52) la kinase cdk2 (53). En outre, on a récemment découvert que certains nouveaux gènes étaient positivement régulés dans des CML en prolifération activées, tels que sgk (54) (kinase régulée par le sérum et les glucocorticoïdes), le collagène de type VIII (55), la nucléophosmine (56) (une phosphoprotéine nucléaire impliquée dans la régulation de la croissance cellulaire et la synthèse de protéines). La protéine- 10 inductible par l'interféron (IP- 10) (57), et BART-I (58) (transcrit répondant à l'angioplastie par ballonnet dans les artères carotides de rat). Il est intéressant de noter que certains gènes, tels que le récepteur TGF-β de type II (RII), peuvent jouer un rôle central dans l'athérosclérose et la prolifération des cellules de tumeur cancéreuse (21,22) et sont communs aux deux maladies. Il est en effet concevable qu'un certain mécanisme commun soit présent dans les deux pathologies. Enfin une récente étude (59), publiée par l'équipe de King et al. a montré que le glucose induisait, dans les CML aortiques bovines, un gène homologue au facteur d'élongation 2 humain, qui est un membre de la famille des GTPases et qui est essentiel pour la synthèse des polypeptides. Le gène 2 A3 -2 (EF- Ts), identifié dans cette étude dans les CML également, est essentiel pour la synthèse des protéines. En effet, EF-Ts est un facteur de traduction impliqué dans l'étape d'élongation et la synthèse de toutes les protéines cellulaires. En outre, un membre de la famille des facteurs d'élongation (EF-Tu), à laquelle appartient EF-Ts, facilite la liaison d'aminoacyl-ARNt au ribosome pendant le cycle d'élongation de la biosynthèse des protéines. Le facteur d'élongation EF-Ts agit comme un catalyseur dans le déplacement de GDP à partir du complexe EF-Tu* GHDP et permet la liaison de GTP. Cette réaction permet la formation du complexe ternaire EF- Tu* GTP*aminoacyl-ARNt. Une cartographie précise de la cascade de gènes impliqués dans la migration et la prolifération des CML, dans l'athérosclérose et la resténose, pourrait permettre à terme une meilleure compréhension de la modulation du phénotype des CML.
La prolifération vasculaire des CML contribue à la pathogénèse de l'athérosclérose. En outre, la prolifération des CML est un événement clé dans la formation de la néo- intima après angioplastie par ballonnet et resténose. Les signaux moléculaires qui assurent la médiation dans ces processus n'ont pas encore été identifiés. Cette étude a permis d'identifier un gène, 2A3-2 ou EF-Ts, dont l'implication dans les fonctions des CML n'avait pas été rapportée auparavant.
Pour la suite de la description, on se référera aux légendes des figures présentées ci- après. LEGENDES
Fig. 1 : Analyse par différenciai display (DD) montrant la bande d'ADNc 2A3-2. On a extrait l'ARN total à partir de CML de synthèse (P9) et proliférantes (V8), puis on l'a soumis à une DD. La migration des produits de PCR a été effectuée sur un gel dénaturant à 6% de polyacrylamide en utilisant une amorce arbitraire AP2 et une amorce 3' (dTπA). Les pistes 1 et 2 correspondent aux cellules de synthèse et proliférantes, respectivement.
Fig. 2 : Analyse par Northern blot avec la bande d'ADNc 2A3-2.
(A)Le gène 2A3-2 est positivement régulé dans les cellules proliférantes (V8), mais non dans les cellules de synthèse (P9). La quantification des signaux 2A3-2, rapportée aux niveaux d'actine β, a montré une multiplication par 4 dans les cellules P200 par rapport aux cellules P9. Cette augmentation de l'expression du gène 2A3-2 dans P200 par rapport à P9 a été observée plusieurs fois (n=3) dans différents Northern blot. Le gène 2A3-2 a une masse moléculaire de 1,2 kb, comme le montre le Northern blot.
Les pistes 1 et 2 correspondent respectivement à des cellules de synthèse et en prolifération rapide. (B) Analyse de plusieurs tissus de rat par Northern blot avec la bande d'ADNc 2A3-2. L'empreinte contenait 16 μg d'ARN total provenant de divers tissus de rat et elle a été sondée par le fragment d'ADNc de 2A3-2 isolé par DD. Les tailles des marqueurs d'ARN sont présentées sur la gauche (en kb). On a pu observer des transcrits d'environ 1200 pb dans tous les tissus de rat analysés. On observe un transcrit moins abondant d'environ 2,4 kb pour le muscle squelettique. Piste 1, muscle squelettique ; piste 2, coeur ; piste 3, poumon ; piste 4, foie ; piste 5, rate ; piste 6, rein ; piste 7, aorte.
Fig. 3 : Comparaison de carotides non traitées et de carotides traitées par ballonnet
(A) Artère carotide droite témoin normale, x60 (B) Artère carotide gauche lésée par ballonnet avec formation de néo-intima. La prolifération des CML à l'intérieur de la couche intimale originelle a donné une hyperplasie intimale (IH). Ceci a été observé 3 semaines après la lésion (x60). a : adventice ; m : couche médiane ; L : lumière ; IH : hyperplasie intimale. Les pointes de flèche s représentent la lame élastique interne, IEL.
Fig. 4 : Expérience de Northern blot montrant la régulation positive de 2A3-2 en conditions in vitro et in vivo.
(A) Northern blot virtuel typique montrant une régulation positive de 2 A3 -2 dans des cellules P200 (piste 2) comparées aux cellules p9 (piste 1). Les données ci-dessus, sur 2 A3 -2, confirment celles obtenues par des Northern blot. En outre, 2 A3 -2 est positivement régulé dans une carotide avec une hyperplasie (piste 5) comparée à une carotide saine (piste 4) et à une aorte (piste 3). On a observé que la taille du transcrit de gène (1,2 kb) était la même en conditions in vitro et in vivo. L'actine a servi de témoin de charge.
(B) Quantification de 5 expériences de Northern blot virtuel qui inclut les expériences ci-dessus. Les différences de régulation positive, pour 2A3-2, entre des cellules P9 et P200 (pistes 1 et 2) et des carotides saines ou traitées par cathéter à ballonnet (pistes 4 et 5) sont significatives (<0,01). (C) Northern blot montrant l'expression de 2 A3 -2 dans des cellules P9 dans des états quiescent et proliférant. La quantification des signaux 2A3-2, rapportée aux niveaux de 28S, a montré que l'expression de ce gène n'a pas été altérée par l'état proliférant des cellules (rapport 1 à 1 dans toutes les pistes). Il apparaît par conséquent que le niveau d'expression du gène, entre les cellules P9 et V8, est lié à l'état phénotypique des cellules et non à leur vitesse de croissance. Les pistes 1, 2, 3, 4, 5 et 6 correspondent à des teneurs en ARN au bout de 0 ,4 ,8, 24, 48 et 72 heures de stimulation par FCS. Le ribosome 28S sert de témoin pour la charge et la quantification.
Fig. 5 : Analyse des différentes parties du gène EF-Ts de rat (2A3-2). (A) La séquence nucléotidique (1149 pb) avec le signal poly-A (AATAAA) souligné. La queue poly-A est désignée par (A)n, tandis que les codons d'initiation et stop sont présentés en gras (ATG est en position +1). Il est important de noter que les gènes EF-Ts tant humain que bovin ont un intron de 224 pb en position 99 et ils ont une région non traduite en 5' (5'UTR) de très courte longueur (18 pb).
(B) Séquence protéique prédite de EF-Ts (2 A3 -2) (324 aa) dans lequel les codons de méthionine (M) et stop (Z) sont présentés en gras. La protéine mature (*284 aa) commence à partir du résidu Ser souligné en position 41.
Fig. 6 : Alignements multiples de séquences avec les gènes EF-Ts bovin et humain correspondants.
Comparaison des séquences des protéines EF-Ts de cochon, de rat et humaine. La séquence protéique d'EF-Ts bovin est présentée dans le code à une lettre et seules les différences sont indiquées pour les deux autres séquences. La protéine mature de rat commence à partir du résidu Ser souligné en position 41 et mesure 284 aa, tandis que les protéines EF-Ts homologues bovine et humaine mesurent 283 aa. ("." indique un résidu manquant, tandis que "-" indique un acide aminé similaire).
Fig. 7 : Gène EF-Ts humain LOCUS HUMMTTSF1 1040 bp
DEFINITION : « Human nuclear-encoded mitochondrial elongation factor Ts (EF- Ts) »
ACCESSION L37936 SOURCE : Homo sapiens liver ADNc correspondant à l'ARNm.
Référence : Xin,H., WoriaxN., Burkhart,W. and Spremulli,L.L. Cloning and expression of mitochondrial translational elongation factor Ts from bovine and human liver, J. Biol. Chem. 270 (29), 17243-17249 (1995).
Les protocoles chirurgicaux et les soins procurés aux animaux, décrits ci-dessous, respectent strictement les recommandations du National Institute of Health and Médical Research (décret N° 87-848 du 19 octobre 1987). Les rats Sprague-Dawley (espèce Rattus rattus, souche : OFA, Iffa Credo, France) utilisés dans cette étude ont été anesthésiés par une injection intrapéritonéale de pentobarbital (0,1 1 ml/ 100 mg de poids corporel).
Fig. 8 : Alignement entre le gène EF-Ts humain et le gène EF-Ts de souris
(partiel)
On observe un pourcentage d'identité de 87% entre ces deux séquences.
EXEMPLE 1 : Identification et clonage du gène 2A3-2. Matériels et méthodes
Culture de cellules : On a obtenu des CML primaires à partir d'expiants d'aortes thoraciques médianes de rats Sprague-Dawley mâles âgés de 7 à 8 semaines (250 g) et on les a cultivées comme préalablement décrit (14,30,31,32). On a conservé des échantillons de cellules dans l'azote liquide aux passages 2 à 10, puis tous les 10 passages. On a montré que les CML au passage 9 étaient au stade de synthèse. On a utilisé dans cette étude une lignée de cellules musculaires lisses de rat spontanément hautement proliférantes (17) (V8). On a établi cette lignée cellulaire à partir de cellules aortique de rat adulte soumises à plus de 200 passages (17). On a cultivé les deux types de cellules dans du milieu MEM supplémenté par 10% de sérum de veau nouveau-né (NCS). On a montré que la vitesse de croissance des cellules à 200 passages P200 était supérieure (x 1,4) à celle des cellules de synthèse P9 (17). Afin qu'elles atteignent, en même temps, une densité de cellules et une confluence
3 similaires, les cellules P9 et P200 ont été respectivement ensemencées à 14 x 10 et 10 x 10 3 cellules/cm 2 dans des boîtes de 25 cm 2. Ces cellules sont parvenues à confluence en 5 à 7 jours, on les a trypsinisées et on a compté des fractions aliquotes
(60 x 10 3 à 80 x 103 cellules/cm 2 ). Avant extraction de TARN, on a stoppé la croissance des cultures par incubation dans du milieu MEM supplémenté par 0,1%) de
NCS pendant 24 heures. Préparation d'ARN total et polyA+ : après culture des cellules, on a lavé les cellules avec du milieu de Hanks (Sigma, France), et on les a utilisées pour la préparation d'ARN. On a extrait l'ARN total en utilisant la méthode au thiocyanate de guanidinium (33). Pour l'analyse par différenciai display, on a éliminé la contamination par l'ADN génomique avec de la DNase I (MessageClean, GenHunter, EUA). Pour la construction de la banque d'ADNc et l'amplification rapide des extrémités 5' d'ADNc (5'-RACE), on a isolé l'ARN poly(A+) de l'ARN total en utilisant des amorces oligodT30 (Kit Oligotex mRNA, Qiagen, France).
Analyse par visualisation différenciai display : La tehnique « différenciai display » a été effectuée comme préalablement décrit (29) (RNAimage, GenHunter). En résumé, cette technique comprend les étapes suivantes :
(i) Réaction de transcription inverse (RT) : On a soumis 0,2 μg d'ARN total provenant de chaque échantillon à une transcription inverse avec 100 U de transcriptase inverse de MMLV en présence de 250 μmol/1 de dNTP et 2 μmol/1 HTl lM (M peut représenter dA, dG, dC et H représente le site de restriction de Hind III). Le mélange réactionnel de RT de 20 μl a été soumis à une transcription inverse pendant 1 h à 37°C, puis on a dénaturé l'enzyme par chauffage à 75°C pendant 5 min. (ii) Amplification par PCR : On a utilisé 2 μl du mélange d'ADNc monocaténaire ainsi obtenu pour 8 réactions de PCR différentes, chaque mélange réactionnel contenant une amorce arbitraire différente de l'extrémité 5'. Le mélange de PCR de 18 μl contenait 2 μmol/1 de l'amorce HTl lM (la même que pour la RT), 2 μmol/1 d'une amorce arbitraire spécifique, 25 μmol/1 des dNTP avec 0,25 μl de α- 32 P dATP (2000 c/mmol, Amersham, RU) et 1 U de polymérase d'ADN Taq (Perkin Elmer). Les paramètres d'amplification par cycles thermiques (40 cycles) en utilisant le système
GeneAmp PCR 9600 (Perkin Elmer) étaient les suivants : 94°C (15 s), 40°C (2 min),
72°C (30 s) et une étape d'extension finale de 5 min à 72°C.
(iii) Séparation par électrophorèse : On a séparé 3,5 μl des produits de PCR sur un gel dénaturant à 6 %> de polyacrylamide dans du tampon TBE après addition de 2 μl de colorant de charge (formamide 95%, EDTA 10 mmol/1, pH 8,0, xylène cyanole 0,09%), et bleu de bromophénol 0,09%). On a soumis les gel à une tension de 1400 V pendant 4 h, on les a séchés sans fixation pendant 2 h à 80°C, exposés pendant 72 h, puis visualisés par autoradiographie.
Récupérations des bandes, clonage et séquençage :
(i) Les bandes présentant une expression différentielle (régulées positivement ou négativement) ont été recueillies dans des conditions stériles en excisant la tranche de gel à partir du gel séché en utilisant une lame de rasoir. On a placé chaque tranche de gel dans 100 μl d'eau stérile, on a fait bouillir le tout pendant 15 min pour solubiliser l'ADN, puis on l'a précipité à l'éthanol.
(ii) La réamplification est effectuée avec 4 μl de fragment purifié en utilisant la même paire d'amorces et les mêmes paramètres de PCR que ceux qui ont permis d'obtenir la bande.
(iii) On a fait migrer les fragments d'ADN réamplifiés sur un gel à 1,5% d'agarose. On a clone les bandes que l'on a avait réussi à amplifier dans un vecteur PCR II (kit de clonage IA, Invitrogen, Pays-Bas).
(iv) Pour le séquençage d'ADN, on a effectué des minipréparations d'ADN plasmidique (34), puis on a appliqué la méthode de séquençage aux didésoxy (35) (Kit de séquençage T7, Pharmacia, France).
Résultats.
Sur les gels de « différenciai display », on a observé 51 bandes, en utilisant 8 amorces arbitraires et 3 amorces de RT, qui présentaient une expression différentielle entre les cellules de synthèse et les cellules en prolifération rapide (P9 et V8). Les bandes de faibles masses moléculaires n'ont donné que peu d'informations sur les séquences et se sont souvent révélées, comme on a pu le vérifier par réamplification par PCR et Northern blot, être des faux positifs. Parmi les 36 bandes de masses moléculaires élevées retenues, on a réamplifié 22 bandes et on les a clonées dans un plasmide PCR II. Les séquences provenant de différents clones ont ensuite été envoyées à des banques de données pour des recherches d'identité et d'homologies. On a ensuite utilisé la technique Northern blot pour certains des fragments d'ADNc nouvellement identifiés, pour évaluer les niveaux d'expression dans les deux types de cellules. Un des gènes qui a nettement donné une visualisation différentielle était la bande 2 A3 -2 (Fig. 1). Ce fragment d'ADN présentait une régulation positive, en employant des Northern blot, dans les cellules en prolifération rapide par rapport aux cellules de synthèse (Fig. 2A). La quantification des signaux de 2A3-2, rapportée au niveau de l'actine, a montré une multiplication par 4 dans les cellules P200 par rapport aux cellules P9. Cette augmentation de l'expression a été observée plusieurs fois (n=3) dans différents Northern blot. On a déterminé que la masse moléculaire de 2 A3 -2, selon le Northern blot, était de 1,2 kb.
Homologies avec les banques de données : on a comparé les séquences obtenues avec des séquences connues par recherche dans les différentes banques de données (GenBank, EMBL, EST, STS, etc.) en utilisant les programmes BLAST (36) et FASTA (37).
EXEMPLE 2 : Distribution du gène 2A3-2 dans les tissus.
Matériels et méthodes
Sondes et Northern blot : On a extrait l'ARN total comme indiqué ci-dessus, on l'a dénaturé, séparé par électrophorèse dans un gel de formaldéhyde-MOPS-agarose, puis transféré sur une membrane de nylon (Hybond, Amersham). Après buvardage capillaire effectué sur une nuit, on a cuit la membrane pendant 2 h à 80°C. On a préparé des sondes pour les Northern blot en suivant la méthode d'amorçage aléatoire (High Prime, Boeringher, Allemagne), en utilisant les inserts amplifiés par PCR dans le vecteur PCR II décrit ci-dessus, puis on les a purifiées en utilisant du G-sephadex (Colonnes Quick Spin, Boehringer). La préhybridation et l'hybridation ont été effectuées selon des protocoles standard (28). On a exposé les empreintes avec des écrans d'intensification contre un film Kodak pendant une semaine à -70°C. On testé une charge similaire d'ARN en utilisant la sonde d'actine. Résultats.
Un Northern blot sur plusieurs tissus de rat, sondé par la bande d'ADNc 2A3-2, a montré que le gène de 1,2 kb était présent dans les tissus de muscle squelettique, de coeur, d'aorte, de poumon, de foie, de rein et de rate (Fig. 2B). Le muscle squelettique contient non seulement l'ARNm de 1 ,2 kb normal, mais également un transcrit moins abondant d'environ 2,4 kb. Ce transcrit peut provenir de l'utilisation d'un autre site de polyadénylation (41). Le Northern blot multiple montre que le gène 2A3-2 n'est pas un artefact induit par la culture de cellules, mais qu'il est présent dans différents tissus.
EXEMPLE 3 : SMART et Northern blot virtuel de carotides. Matériels et méthodes
Lésion par cathéter à ballonnet de l'artère carotide gauche de rat : On a obtenu des artères carotides sur des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 10 à 14 semaines (350 g). On a induit la formation de néo-intima comme préalablement décrit (39). En résumé, on a exposé la carotide gauche sous un microscope opératoire (OPMI7, Cari Zeiss, Oberkochen, Allemagne). Après incision de l'artère carotide externe gauche, on a introduit le cathéter à ballonnet (2F Fogarty, Baxter, EUA) par l'artère carotide primitive. On a produit une lésion de la carotide primitive gauche en faisant passer le cathéter à ballonnet gonflé d'avant en arrière trois fois dans la carotide. Le ballonnet était suffisamment gonflé pour produire une légère résistance et on a ensuite retiré le cathéter pour ligaturer l'artère externe. On a maintenu les rats dans des conditions ad libitum pendant une durée totale de 3 semaines, après la lésion par le ballonnet, au bout desquelles on les a anesthésiés à l'uréthane (Sigma) pour l'extraction des vaisseaux. Chaque artère carotide a été coupée en deux morceaux, le premier a été immédiatement rapidement congelé dans de l'azote liquide pour l'extraction d'ARN, tandis que l'on a fixé le second afin de l'utiliser pour des contrôles histologiques et morphologiques. On a également extrait la carotide droite, considérée comme l'artère témoin normale. Ce modèle expérimental est connu pour induire une hyperplasie néo-intimale similaire à celle observée chez les humains après une angioplastie. Technique SMART et Northern blot virtuel : Les quantités d'ARN total étant limitées, on a effectué l'analyse de l'expression des gènes de carotides de rat par un tandem de SMART-PCR (Clontech, Californie) et de Northern blot virtuel, plutôt que par Northern blot standard. Une description complète de la technologie SMART, et de ses applications, est donnée dans le manuel Clontech. En bref, on synthétise de l'ADN avec 1 μg d'ARN total provenant de divers échantillons (cellules P9 et V8, aorte, carotides droite et gauche traitées). La RT a été mise en oeuvre pendant 1 h à 42°C en utilisant 200 unités/μl de transcriptase Superscript II (Gibco-BRL), 10 μmol/1 de l'amorce de synthèse d'ADNc (CDS), 10 μmol/1 d'oligo SMART, 10 mmol/1 de dNTP, et 20 mmol/1 DTT. Lorsque l'extrémité 5' de l'ARNm est atteinte, l'activité de transférase terminale de l'enzyme ajoute quelques nucléotides, principalement des désoxycytidines, à l'extrémité 3' de l'ADNc. La RT change alors de matrices et continue la réplication vers l'extrémité de l'oligo à l'extrémité 5' de l'ARNm. Le mélange réactionnel de RT a ensuite été chauffé à 72°C pendant 5 min. L'ADNc simple brin de longueur totale obtenu contient une séquence complémentaire de l'oligo SMART, qui est ensuite utilisée comme matrice en PCR pour produire de l'ADNc bicaténaire. En choisissant le nombre optimal de cycles de PCR, on s'assure que l'ADNc double brin restera en phase exponentielle d'amplification. Dans les expériences qui ont conduit à l'invention, le nombre optimal de cycles est de 16, car le plateau a été atteint au bout de 17 cycles. Seul les ADNc ss ayant la séquence SMART à l'extrémité 5' et l'oligo(dT) à l'extrémité 3' sont exponentiellement amplifiés par PCR. Le mélange réactionnel de PCR de 100 μl contient 10 mmol/1 de dNTP, 10 μmol/1 de l'amorce de PCR (complémentaire de l'oligo SMART et de l'amorce CDS), 2 μl de la polymérase KlenTaq 50x, et 10 μl du tampon de PCR KlenTaq 10X. Les conditions de PCR sont les suivantes : une étape à 95°C (1 min) ; puis 16 cycles à 95°C (15 s), 65°C (30 s), et 68°C (6 min). On obtient un Northern blot virtuel en faisant tout d'abord migrer 0,5 μg d'ADNc amplifié par PCR SMART sur un gel agarose/EtBr. Ensuite, on transfère le matériau soumis à l'électrophorèse sur une membrane de nylon (Hybond N+, Amersham), que l'on sonde ensuite avec un fragment de 2A3-2 marqué au 32 P, comme dans un Northern blot standard. On utilise également de l'actine pour évaluer une charge similaire.
Résultats. On a utilisé une hyperplasie néo-intimale de carotides de rat, induite par une lésion par cathéter à ballonnet, pour étudier le rôle in vivo de ce gène dans les CML. On a traité des carotides gauches de rat par un cathéter à ballonnet pour initier la prolifération de CML et la formation d'une néo-intima. Par ailleurs, on a utilisé les carotides droites non traitées comme témoins (Fig. 3). La quantité d'ARN total extrait d'une carotide étant inférieure à 2 μg, nous avons utilisé un tandem de SMART-PCR et de Northern blot virtuel pour évaluer les niveaux d'expression de 2A3-2. Cette approche en tandem de technologies a donné des informations similaires à celles obtenues par un Northern blot standard. On a montré que le gène 2 A3 -2 était positivement régulé (multiplication par 4) dans la carotide gauche traitée par le ballonnet, par rapport à la carotide droite témoin. L'expérience de Northern blot virtuel a été répétée, et confirmée sur 5 empreintes différentes. Les Northern blot virtuels ont en outre confirmé la régulation positive de 2A3-2 dans les cellules V8, mais pas dans les P9, comme préalablement observé par Northern blot standard (Fig. 4A). Il est intéressant de noter que l'expression de EF-Ts dans les cellules P9, dans des condibons de quiescence (48, 72 h) ou de prolifération (0, 4, 8, 24) n'a pas été altérée par l'état de prolifération des cellules (Fig. 4C).
EXEMPLE 4 : 5'RACE et séquençage du gène 2A3-2. Matériels et méthodes Amplification rapide en 5' d'extrémités d'ADNc (5'RACE) : Pour obtenir la région 5' amont du gène, on a mis en oeuvre la technique 5' RACE essentiellement en appliquant le principe de PCR par impact (40) et en utilisant les kits d'amplification d'ADNc Marathon et Advantage KlenTaq Polymérase (Clontech). (i) Dans la première étape, on synthétise de l'ADNc simple brin avec 1 μg de d'ARN poly(A+) de V8, en utilisant 10 μmol/1 de l'amorce de synthèse d'ADNc et de RT de MMLV pendant 1 h à 42°C. On a vérifié la synthèse d'ADN par l'addition de dNTP dont l'un était de l'a- 32 P-CTP marqué par un isotope radioactif (1 μc/μl, NEN,
France).
(ii) La seconde étape a consisté en la synthèse d'ADN double brin effectuée à 16°C pendant 3 h dans un mélange d'enzymes contenant de la polymérase d'ADN I d'E. coli, de la RNase H, et de la ligase d'ADN d'E. coli. Ces enzymes permettent la synthèse d'ADNc ds, la dégradation de l'ARN, et la formation de bouts francs, respectivement.
On effectue ensuite une électrophorèse sur gel à 1% d'agarose pour estimer la quantité et la qualité de l'ADNc ds synthétisé. Le gel est ensuite séché et mis en contact avec un film Kodak à -70°C afin de visualiser la trace d'ADN.
(iii) La troisième étape a permis d'obtenir une banque d'ADNc ds, à partir de cellules V8, en ligaturant un adaptateur aux deux extrémités de l'ADNc ds, en utilisant une ligase d'ADN de T4 à 16°C une nuit, (iv) Dans la dernière étape, on a soumis une fraction aliquote de la banque à une PCR. Le mélange réactionnel de PCR de 50 μl contient 10 μmol/1 de dNTP, 10 μmol/1 de l'amorce adaptateur (complémentaire de l'adaptateur d'ADNc), 5 μl de la polymérase KlenTaq 50x, et 10 μmol/1 d'amorce spécifique du gène (GSP, Gène Spécifie Primer) complémentaire du fragment 3' à expression différentielle (GSP de 2A3-2: 5'-GGGTAAAGTTATTAAATATACAATGTAATAAACG-3') (SΕQ ID n°5). Le mélange a été soumis à une étape de PCR à 94°C (1 min) suivie de 33 cycles à 94°C (30 s), 60°C (30 s), et 68°C (2 min 15 s) ; et d'une étape d'extension de 5 min à 72°C. Les fragments d'ADN amplifié ont été clones dans le vecteur PCR II et purifiés en utilisant le kit Qiagen Plasmid Midi (Qiagen). L'insert d'ADN est ensuite commercialement séquence (Génome Express, France).
Résultats.
La longueur totale de ce gène a été obtenue par 5 '-RACE en employant une banque d'ADNc construite à partir de cellules V8 en prolifération rapide. La masse moléculaire du produit de 5 'RACE était de 1,2 kb comme préalablement indiqué par Northern blot (Fig. 5). Le produit de PCR a été amplifié, purifié, clone et séquence (Fig. 6A). La séquence nucléotidique complète de 2A3-2 a ensuite été envoyée à la banque de données EMBL, en utilisant le logiciel Sequin, afin d'obtenir un numéro d'accès (AJ006151).
Caractéristiques du gène 2A3-2 : Le cadre de lecture ouvert du gène séquence (1149 pb) a été identifié et on a montré qu'il contenait 972 pb allant du codon de début ATG jusqu'à un codon stop TAG (Fig. 6). Ce gène comprend une très courte région non traduite en 5' (7 pb de long). Le codon d'initiation (désigné par +1) est précédé d'un résidu G en position -3 et suivi d'un résidu T en position +4. L'analyse de nombreux sites de début de traduction montre que la séquence consensus contient une purine en position -3 et un résidu G en position +4 (42). Enfin, l'ADNc contenait 170 pb dans la région non traduite en 3' avec un signal poly-A typique (43) (AATAAA), qui a été déterminé 27 pb en amont de la queue poly-A. Lorsque l'on a analysé la séquence nucléotidique de longueur totale par recherche d'homologies dans la banque de données GenBank, en utilisant FASTA, on a observé qu'elle présentait une homologie de 72% avec des facteurs d'élongation, EF-Ts, mitochondriaux humain et bovin (44). L'ATG d'initiation présumé a été attribué au premier résidu méthionine et la séquence protéique déduite de 324 résidus d'acide aminé (aa) a été appelée protéine 2A3-2 (Fig. 6B). La séquence de la protéine 2 A3 -2 déduite donnait une masse moléculaire calculée de 27 kDa. La séquence a été testée sur la banque de données Swissprot, ce qui a confirmé les résultats de GenBank. Les homologies avec les EF-Ts bovin et humain étaient de 85%> dans la protéine mature et de 70% sur la séquence protéique globale. Ces homologies importantes suggèrent que nous avons clone le gène EF-Ts homologue de rat. Une comparaison de notre séquence avec les gènes EF-Ts humain et bovin est présentée sur la figure 7. Il est intéressant de noter que la séquence protéique d'E. coli a une homologie de 29% avec la séquence bovine. L'analyse de l'extrémité NH2-terminale de la séquence indique que la forme mature de l'EF-Ts de rat commence par Ser-41 dans le long cadre de lecture ouvert (figure. 6B et figure 7). Le signal d'importation mitochondrial est donc long de 40 aa tandis qu'il est de 55 aa dans la forme bovine. Les signaux d'importation mitochondriaux ne sont généralement pas conservés entre des espèces différentes ; cependant, ils sont généralement dépourvus d'acides aminés acides, sont enrichis en acides aminés basiques et hydroxylés, et peuvent former une hélice α ou une feuille β amphiphiles. Le peptide intermédiaire pour l'EF-Ts de rat est dépourvu de résidus acides et est modérément riche en résidus basiques et hydroxylés (30%>). Pour résumer, la séquence protéique comprend 324 aa (la protéine humaine en comprend 294, tandis que la bovine en comprend 338), tandis que la forme mature de la protéine a 284 aa (283 aa pour les homologues bovin et humain). La partie N-terminale de la protéine chez le rat comprend 29 aa de plus que l'humaine.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation du gène codant pour EF-Ts de mammifères, en particulier des humains (SEQ ID n°l), du rat (SEQ ID n°2) et de la souris (SEQ ID n°3) dans le cadre du traitement et du diagnostique de maladies impliquant les hyperplasies des cellules musculaires lisses (CML), la dé-différenciation des CML et/ou la transformation cellulaire ou cancérogenèse des CML.
2. Oligonucleotide de 8 à 100 nucléotides de long caractérisé en ce qu'il s'hybride avec un acide nucléique codant pour le facteur d'élongation de la traduction EF-Ts et en ce qu'il est capable d'inhiber l'expression de EF-Ts chez les mammifères.
3. Oligonucleotide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il cible la région 5'ou 3' non traduite, le site d'initiation de la traduction, ou la région codante de l'ARNm de EF-Ts, de préférence la région 5' du gène.
4. Oligonucleotide selon l'une des revendications 2 et 3 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec une séquence de 10 à 50 nucléotides consécutifs d'une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID n° 1 , SEQ ID n°2 et SEQ ID n°3.
5. Oligonucleotide selon l'une des revendications 2 à 4 caractérisé en ce qu'il comporte au moins une modification chimique du squelette et/ou d'un ou de plusieurs nucléotide(s).
6. Vecteur d'expression de EF-Ts comprenant une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID n°l, SEQ ID n°2 et SEQ ID n°3.
7. Vecteur selon la revendication 6 caractérisé en ce que ladite séquence est fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules eucaryotes et/ou procaryotes.
8. Vecteur selon l'une des revendications 6 et 7 caractérisé en ce qu'il comporte en outre un gène de sélection.
9. Cellule transformée par un vecteur selon l'une des revendications 6 à 8.
10. Cellule selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle est une cellule musculaire lisse.
1 1. Animal transgénique, à l'exception des humains, comprenant une cellule selon l'une des revendications 9 et 10.
12. Animal selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souris ou d'un rat.
13. Animal selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il modélise des maladies impliquant les hyperplasies des cellules musculaires lisses (CML), la dé- différenciation des CML et/ou la transformation cellulaire ou cancérogenèse des CML.
14. Anticorps polyclonal ou monoclonal capable de reconnaître spécifiquement EF-Ts de rat, de souris ou des humains.
15. Anticorps selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement le peptide dérivé de EF-Ts comprenant la séquence SEQ ID n°8.
16. Anticorps selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement le peptide dérivé de EF-Ts comprenant la séquence SEQ ID n°9.
17. Cellule produisant un anticorps monoclonal selon l'une des revendications 14 à 16.
18. Procédé de criblage de composés inhibant l'expression ou l'activité de EF-Ts caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Traitement d'une cellule exprimant EF-Ts avec un ou plusieurs composés, b) mesure de l'expression et/ou de l'activité de EF-Ts, c) sélection des composés inhibant l'expression de EF-Ts et qui présentent peu ou pas de toxicité vis-à-vis de ladite cellule.
19. Procédé de criblage de composés inhibant l'expression ou l'activité de EF-Ts caractérisé en ce qu'il comprend une étape mettant en oeuvre une cellule selon l'une des revendications 9 et 10.
20. Procédé de criblage de composés inhibant l'expression ou l'activité de EF-Ts caractérisé en ce qu'il comprend une étape mettant en oeuvre un animal selon l'une des revendications 11 à 13.
21. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que l'on test des composés provenant de librairies obtenues par chimie combinatoire.
22. Composé susceptible d'être obtenu à partir d'un procédé selon l'une des revendications 18 à 21.
23. Composé selon la revendication 22 caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi :
(a) des antisens selon l'une des revendications 2 à 5,
(b) un anticorps selon l'une des revendications 14 à 16, (c) un peptide synthétique ou naturel,
(d) un bas poids moléculaire organique,
(e) ou une protéine EF-Ts recombinante ayant perdu son activité naturelle.
24. Composition comprenant un composé sélectionné parmi un oligonucleotide selon l'une des revendications 2 à 5, un anticorps selon l'une des revendications 14 à 16 ou un composé selon l'une des revendications 22 et 23 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
25. Utilisation d'un composé sélectionné parmi un oligonucleotide selon l'une des revendications 2 à 5, un anticorps selon l'une des revendications 14 à 16 ou un composé selon l'une des revendications 22 et 23 pour la préparation d'un médicament.
26. Utilisation selon la revendication 25 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies impliquant les hyperplasies des cellules musculaires lisses (CML), la dé-différenciation des CML et/ou la transformation cellulaire ou cancérogenèse des CML.
27. Utilisation selon la revendication 25 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des tumeurs, notamment des tumeurs dans l'utérus, des leiomyosarcomes et leiomyomium.
28. Utilisation selon la revendication 25 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'arthérosclérose, de la resténose induite par angioplastie et/ou de l'angor instable.
29. Utilisation selon l'une des revendications 25 à 28 en combinaison avec un inhibiteur de l'angiogénèse.
30. Kit de diagnostique caractérisé en ce qu'il comprend un composé sélectionné parmi une sonde ou amorce comportant une séquence possédant au moins 12 nucléotides consécutifs du gène codant pour EF-Ts, en particulier des séquences SEQ ID n°l , SEQ ID n°2 et SEQ ID n°3 et un anticorps selon l'une des revendications 14 à 16.
31. Utilisation du kit selon la revendication 30 pour la détermination de l'avancement de plaques d'athérome, pour l'étude du polymorphisme du gène codant pour EF-Ts dans le cadre des hyperplasies, et/ou pour la détection des tumeurs, notamment des tumeurs dans l'utérus.
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