JP2002531066A - イカロス（ｉｋａｒｏｓ）アイソフォームおよび突然変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特定のイカロス突然変異体、ならびに上記特定のイカロス突然変異体および他の野生型非ＤＮＡ結合性イカロスアイソフォームとリンパ球系細胞異常との相関を提供するものである。本発明はさらに、血液系悪性腫瘍を含むリンパ球系細胞異常の検出および治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 ［発明の分野］ 本発明は、血液系悪性腫瘍、特に、幹細胞性白血病やＴ細胞性およびＢ細胞性
の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含むリンパ系悪性腫瘍（lymphoid malig
nancy）の診断および治療に有用な、イカロスの野生型アイソフォームおよび突
然変異体、ならびにイカロスをコードする核酸シークエンスに関する。

【０００２】 ［発明の背景］ 急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、ＡＬＬ患者の小児性白血病クローンに
おける最も一般的な癌形態である。小児性白血病クローンは、Ｔリンパ球または
Ｂリンパ球の発達過程における種々の段階で停止した正常なリンパ球前駆体より
分化すると考えられており、したがって、正常なリンパ球の発達を制御する決定
的な（critical）調節ネットワークが、白血病誘発性事象の潜在的な標的である
。

【０００３】 正常なリンパ球生成に不可欠なこのような調節ネットワークの一つに、クルッ
ペルファミリー（Kruppel family）の「ジンクフィンガー」ＤＮＡ結合性タンパ
ク質であるイカロス（Ikaros）が関与している。イカロスは、造血を起こさせる
進化論的に保存された「マスタースイッチ（master switch）」として働き、リ
ンパ球の個体発生および分化の最も初期段階における転写調節を左右する（Geor
gopolous et al., 1994, Cell, 79:143-156; Georgopolous et al., 1992, Scie
nce, 258:808-812; Hahm et al., 1994, Mol. Cell Biol., 14:7111-7123; Mol
nar and Georgopolous, 1994, Mol. Cell Biol., 14: 8292-8303; Wang et al
., 1996, Immunity, 5:537-549; Winandy et al., 1995, Cell, 83:289-299; Mo
lnar et al., 1996, J. of Immunol., 156:585-592; Sun et al., 1996, EMBO
J., 15:5358-5369; Hansen et al., 1997, Eur. J. Immunol, 27:3049-3058;
Georgopolous et al., 1997, Ann. Rev. Immunol., 15:155-176; Brown et al
., 1997, Cell, 91:845-854; and Klug et al., 1998, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 95:657-662）。イカロス遺伝子のプログラムされた発現と機能は、イ
カロスのプレｍＲＮＡ（pre-mRNA）の選択的スプライシングによって厳密に制御
されており、これにより８種の異なるイカロスアイソフォームが生成される。８
種のイカロスアイソフォーム（Ｉｋ−１、Ｉｋ−２、Ｉｋ−３、Ｉｋ−４、Ｉｋ
−５、Ｉｋ−６、Ｉｋ−７、およびＩｋ−８）は、全て共通のカルボキシ（Ｃ）
末端ドメインを有しており、このＣ末端ドメインには転写活性化モチーフと、イ
カロスアイソフォーム同士でのホモ二量体またはヘテロ二量体の形成や他のタン
パク質との相互作用に必要な２個のジンクフィンガーモチーフとが含まれる。

【０００４】 しかしながら、標的遺伝子のプロモーターにおけるイカロス特異性コアＤＮＡ
シークエンスモチーフへの高親和性結合に必須な３〜４個のアミノ（Ｎ）末端ジ
ンクフィンガーを含有している（Sun et al., 1996, EMBO J., 15:5358-5369）
のは、８種のイカロスアイソフォームのうち３種（Ｉｋ−１、Ｉｋ−２、および
Ｉｋ−３）のみである。これらのＤＮＡ結合性アイソフォーム間でホモ二量体お
よびヘテロ二量体を形成するとＤＮＡに対する親和力が増すが、ＤＮＡ結合性ア
イソフォーム（Ｉｋ−１、Ｉｋ−２、およびＩｋ−３）と非ＤＮＡ結合性アイソ
フォーム（Ｉｋ−４、Ｉｋ−５、Ｉｋ−６、Ｉｋ−７、およびＩｋ−８）とで形
成したヘテロ二量体はＤＮＡに結合することができない。したがって、Ｎ末端ジ
ンクフィンガーが３個未満である非ＤＮＡ結合性イカロスタンパク質は、ＤＮＡ
と結合し得るイカロスアイソフォームの活性を妨害することができる（Molnar e
t al., 1996, J. Immunol., 156:585-592; and Sun et al., 1996, EMBO J., 15
:5358-5369）。

【０００５】 マウスにおいて、正常なイカロス遺伝子が存在しない場合、胎児期および成年
期の両方における造血の際に、あらゆるリンパ球系の発達が初期段階で完全に停
止してしまう（Georgopolous et al., 1994, Cell, 79:143-156）。また、イカ
ロスが不足したマウスには胸腺の未発達や抹消リンパ節の欠乏が見られ、成熟し
たＢリンパ球、Ｔリンパ球、およびナチュラルキラー細胞はもちろん、リンパ球
前駆細胞も全く存在しないことを特徴としている。イカロスはまた、そのＤＮＡ
結合能に依存した、非常に重要な白血病抑制機能を有している。イカロスの決定
的なジンクフィンガーを喪失させる生殖系列の突然変異体に対してヘテロ接合性
（heterozygous）であるマウスは、生後３ヶ月から６ヶ月の間に、これに伴いヘ
テロ接合性が喪失した、非常に攻撃的なリンパ芽球性白血病を発達させる（Wina
ndy et al., 1995, Cell, 83:289-299）。さらに、イカロスは、未成熟リンパ球
前駆体中の動原体性ヘテロクロマチンに局在しており、イカロスは潜在的に「白
血病誘発性」である成長調節遺伝子の動員（recruitment）と動原体関与性サイ
レンシングにおいて、重要な役割を果たしているのかもしれないとの提唱がなさ
れている（Brown et al., 1997, Cell, 91:845-854; and Klug et al., 1998, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:657-662）。

【０００６】 イカロス遺伝子における特定の分子欠陥（defects）およびそれにコードされ
るタンパク質はこれまでに同定されておらず、また、イカロスまたはそのアイソ
フォームはヒトの疾患と関連付けられていない。このような欠陥や、特定の欠陥
とヒト白血病性疾患との相関が判定できれば、特に有用な診断用および治療用の
ツールを提供できる。

【０００７】 ［発明の概要］ 本発明は、非ＤＮＡ結合性イカロスアイソフォームおよび／または特定のイカ
ロス遺伝子突然変異体および突然変異タンパク質と、リンパ系疾患との直接的相
関、特に白血病のような癌との直接的相関の発見に基づき、診断用および治療用
のツールを提供するものである。スプライスバリアントにより、転写活性化ドメ
インの上流側の、カルボキシ末端ジンクフィンガーに近接する１０個のアミノ酸
（ΔKSSMPQKFLG［SEQ ID NO: 13］）のフレーム内欠失（in-frame deletion）が
生じた特定のイカロス突然変異体が、機能障害性のドミナントネガティブなイカ
ロスアイソフォームが高レベルで発現している急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ
）の小児および乳児おいて同定されている。さらに、２０個のアミノ酸TYGADDFR
DFHAIIPKSFSR［SEQ ID NO: 11］がフレーム内挿入（in-frame insertion）され
た第二の特定のイカロス突然変異体もまた、白血病細胞中で同定されている。

【０００８】 これら特定の欠陥およびこれら欠陥とＡＬＬとの関連、ならびにドミナントネ
ガティブなイカロスアイソフォームと血液系悪性腫瘍との相関を同定することに
より、癌および、特にリンパ系悪性腫瘍やリンパ腫を含む血液系悪性腫瘍の診断
および監視に有用なツールが提供される。このような診断用ツールは、多数のド
ミナントネガティブなイカロスアイソフォーム（非ＤＮＡ結合性アイソフォーム
）および／または特定のイカロス突然変異体の存在を、悪性腫瘍を含む血液系細
胞異常と関連付ける。白血病細胞のような異常細胞中のイカロス発現におけるこ
れら欠陥の相関により、欠陥を修復し、かつ正常な血液系細胞機能を回復させる
ための治療ツールがさらに提供される。

【０００９】 したがって、本発明は、特定のイカロス突然変異体の核酸シークエンスおよび
タンパク質シークエンスを提供する。さらに本発明は、イカロスタンパク質を分
析する方法、ならびにＤＮＡ結合性アイソフォームと非ＤＮＡ結合性アイソフォ
ームとの区別はもちろん、野生型と突然変異体とをも区別する方法を提供する。

【００１０】 本発明の診断方法は、多数のイカロスの非ＤＮＡ結合性形態、例えば１を超え
る比率で存在する場合を、疾患、特に癌と関連付ける。多数の非ＤＮＡ結合性ア
イソフォームおよび／または突然変異体は、リンパ系疾患と相関し、ＡＭＬ、Ａ
ＬＬ、および二次性白血病を含む白血病と最も著しく相関する。アイソフォーム
と突然変異体を含めたイカロスタンパク質、およびこれらをコードする核酸シー
クエンスは、以下に示す詳細な説明と実施例とに記載されている１以上の方法に
より分析することができる。

【００１１】 さらに本発明は、疾患の治療、例えば、ＤＮＡ結合性形態が減少しているかま
たは存在していない白血病等の癌の治療において、イカロスのＤＮＡ結合性形態
の補充（replacement）にも対応する。

【００１２】 ［図面の簡単な説明］ 図１Ａ〜１Ｉは、正常な細胞と白血病細胞におけるイカロスタンパク質アイソ
フォームの発現を示すウエスタンブロット図である。図１Ａ．１〜１Ａ．２は、
ジャーカット（Jurkat）Ｔ細胞系ＡＬＬ細胞ならびに正常な胎児肝臓由来のヒト
リンパ球前駆体株化細胞ＦＬ８．２⁺およびＦＬ８．２^-に発現したイカロスタン
パク質を示している。図１Ｂは、正常な胸腺細胞（ＮＴＨＹ−５）および６種の
異なるＢ細胞系ＡＬＬ株化細胞に発現したイカロスタンパク質を示している。図
１Ｃは、正常な胸腺細胞（ＮＴＨＹ−４）および非乳児性Ｂ細胞系ＡＬＬの８名
の小児より得た白血病細胞に発現したイカロスタンパク質を示している。図１Ｄ
は、正常な骨髄細胞（ＮＢＭ−１）、正常な乳児胸腺細胞（ＮＴＨＹ）、および
胎児胸腺細胞（ＦＴ）に発現したイカロスタンパク質を示している。図１Ｅ〜１
Ｇは、ＪＫ−Ｅ６−１およびＭＯＬＴ−３白血病株化細胞、正常骨髄単核細胞（
ＮＢＭ−２）、ならびにＴ−ＡＬＬの小児より得た白血病細胞に発現したイカロ
スタンパク質を示している。図１Ｈは、正常な乳児骨髄細胞（ＮＢＭ−１）、正
常な乳児胸腺細胞（ＮＴＨＹ）、および胎児胸腺細胞（ＦＴ）における発現を示
している。図１Ｉは、正常な乳児骨髄単核細胞（ＮＢＭ−２）および新たにＡＬ
Ｌと診断された６名の乳児における発現を示している。

【００１３】 図２Ａ〜２Ｒは、イカロスの発現と細胞下局在（subcellular localization）
を示す、白血病細胞の共焦画像である。図２Ａ〜２Ｊは、Ｂ細胞系ＡＬＬ患者よ
り得た白血病細胞を示している。図２Ｋおよび２Ｌは、正常な胎児肝臓由来のリ
ンパ球前駆体株化細胞ＦＬ８．２⁺（プロＢ／Ｔ（Pro-B/T））およびＦＬ８．２ ^- （プロＢ（Pro-B））をそれぞれ示している。図２Ｍは、正常な胸腺細胞を示し
ている。図２Ｎおよび２Ｏは、白血病Ｔ細胞であるＭＯＬＴ−３細胞およびＪＫ
−Ｅ６−１細胞をそれぞれ示している。図２Ｐ〜２Ｒは、Ｔ−ＡＬＬ患者より得
た原発性白血病細胞を示している。

【００１４】 図３Ａおよび３Ｂは、正常な胸腺細胞（ＮＴＨＹ）、Ｔ−ＡＬＬ患者より得た
白血病Ｔ細胞、および株化細胞ＭＯＬＴ−３より抽出した核タンパク質のイカロ
ス特異性ＤＮＡ結合活性を示している。

【００１５】 図４は、エクソン（Ｅ）１〜７にコードされた特定の成分ドメイン（composit
ion domain）と、記載のＰＣＲプライマーとを有するイカロスアイソフォーム１
〜８を模式的に表した図である。

【００１６】 図５Ａ〜５Ｃは、胎児胸腺細胞（ＦＴ）、正常な骨髄単核細胞（ＮＢＭ−２）
、Ｍｏｌｔ−３細胞、ジャーカット（Jurkat）細胞（ＪＫ−Ｅ６−１）、Ｔ−Ａ
ＬＬ患者より得た原発性白血病細胞（Ｔ−ＡＬＬ）、およびＢ−ＡＬＬ患者より
得た原発性白血病細胞（ＩＮＦ）を増幅して得たＰＣＲ産物を示す臭化エチジウ
ム（ethiduim bromide）で染色した代表的なゲルである。

【００１７】 図６は、エクソン２〜４に野生型Ｉｋ−２をコードするシークエンスを有する
対照用クローン（Ｔ−ＡＬＬ#５）およびＩｋ−２の挿入型突然変異体を示すＴ
−ＡＬＬ患者の細胞（Ｔ−ＡＬＬ#５）におけるエクソン２およびエクソン４間
の接合部全体に対するシークエンストレーシングである。図６は、エクソン２お
よびエクソン４間の接合部にわたる野生型Ｉｋ−２のｃＤＮＡシークエンス［SE
Q ID NO: 27］とこれに対応して誘導されるアミノ酸シークエンス［SEQ ID NO:
28］、ならびにエクソン２およびエクソン４間の接合部にわたるＩｋ−２の挿入
型突然変異体のｃＤＮＡシークエンス［SEQ ID NO: 29］とこれに対応して誘導
されるアミノ酸シークエンス［SEQ ID NO: 30］を示している。

【００１８】 図７は、ＤＮＡ二本鎖の主要な溝と相互作用する、Ｉｋ−２における最初の３
つのジンクフィンガー（Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４）の相互作用を示したリボン図
である。

【００１９】 図８Ａ〜８Ｆは、野生型イカロス２のアイソフォームを発現している白血病細
胞および欠失型突然変異体を発現している白血病細胞におけるエクソン６および
エクソン７間の接合部全体に対するシークエンストレーシングである。図８Ａ〜
８Ｃは、Ｔ−ＡＬＬ患者およびＭＯＬＴ−３株化細胞より得た野生型イカロスア
イソフォームおよび欠失型突然変異体イカロスアイソフォームのシークエンスト
レーシングを示している。図８Ｄ〜８Ｆは、Ｂ−ＡＬＬ患者およびＭＯＬＴ−３
株化細胞より得た野生型イカロスアイソフォームおよび欠失型突然変異体イカロ
スアイソフォームのシークエンストレーシングを示している。Ｉｋ−２と欠失型
突然変異体、Ｉｋ−４、Ｉｋ−８、およびＩｋ−７に関するエクソン６およびエ
クソン７間の接合部にわたるｃＤＮＡシークエンスとこれに対応して誘導される
アミノ酸シークエンスを図示している。

【００２０】 図９Ａおよび９Ｂは、イカロスｃＤＮＡにおける一塩基多型（single nucleot
ide polymorphism）を示し、正常および異常なイカロスアイソフォームの２対立
遺伝子性の発現を表している。図９Ａは、イカロスｃＤＮＡの模式図である。ジ
ンクフィンガーをＦ１〜Ｆ６で表し、イカロスエクソンをＥ１〜Ｅ７で表し、Ｐ
ＣＲプライマー（矢印）をＦ１、Ｆ２（進行方向）およびＲ１、Ｒ２（逆行方向
）で表した。二連活性化ドメイン（bipartite activation domain）における一
塩基多型部位（１００２位置のＣまたはＡ）の位置も図示している。

【００２１】 図９Ｂは、ＮＡＩＬ−６Ｂ株化細胞ＡＬＬ細胞における７個のＲＴ−ＰＣＲク
ローンの一塩基多型部位全体に対するシークエンスデータを示している。１００
２位置におけるＡまたはＣの何れかに下線を付している。２個のＩｋ４（非ＤＮ
Ａ結合性アイソフォーム［ＷＴ］）クローン、１個のＩｋ４＋欠失（非ＤＮＡ結
合性アイソフォーム（ΔKSSMPQKFLG））クローン、２個のＩｋ２＋欠失（ＤＮＡ
結合性アイソフォーム［ＷＴ］）クローン、および２個のＩｋ２＋欠失（ＤＮＡ
結合性アイソフォーム（ΔKSSMPQKFLG）クローンにおけるタイプ分けの結果とｃ
ＤＮＡシークエンスの結果とを図示している。また、これに対応して誘導される
アミノ酸シークエンスも図示している。

【００２２】 図１０Ａ〜１０Ｅは、実施例４に記載のように、エクソン６／７のスプライシ
ング接合部を覆っているシークエンスを判定するために用いられたＰＣＲ産物を
明らかにする、臭化エチジウムによって染色した代表的なゲルの写真である。図
１０Ａは、エクソン６の供与部位領域を増幅して生成した、ネステッドＰＣＲ産
物（nested PCR products）を示している。

【００２３】 図１０Ｂは、エクソン７のスプライシング受容部位（slice acceptor site）
を取り囲むネステッドＰＣＲ産物を示している。

【００２４】 図１０Ｃは、プライマーセットＰ１ａおよびＰ４、またはＰ１ｂおよびＰ４を
用いて得た、エクソン６の供与部位のゲノムＰＣＲ増幅産物を示している。

【００２５】 図１０Ｄは、対照用細胞および原発性白血病細胞より得たエクソン６供与部位
のゲノムＰＣＲ増幅産物を示している。

【００２６】 図１０Ｅは、対照用細胞および患者の原発性白血病細胞より得たエクソン７の
受容部位のゲノムＰＣＲ増幅産物を示している。陰性対照例（Ｎｅｇ．Ｃｏｎ．
）は、鋳型（ライブラリダイジェストまたはゲノムＤＮＡサンプル）を用いない
複製反応物であった。陽性対照例（Ｐｏｓ．Ｃｏｎ）は、組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子（ｔＰＡ）、１．５ｋｂの予測バンドを有するネステッドプライマ
ーセット（nested primer set）、ＡＰ２およびＰＣＰ２であった。

【００２７】 図１１Ａ〜１１Ｂは、エクソン６に欠失を発現している白血病患者におけるイ
カロスエクソン６のスプライシング供与部位のゲノムシークエンスを示している
。図１１Ａは、エクソン６のスプライシング供与部位を取り囲み、エクソン６お
よび７間をつなぐイントロン内のＥｃｏＲＶ部位で終止する野生型シークエンス
を示している。このシークエンスの判定に使用するＰＣＲプライマーの位置を図
示している。コードシーケンスを大文字で、イントロンシークエンスを小文字で
示している。２個の選択的スプライシング供与部位（供与部位１および供与部位
２）を図示している。

【００２８】 図１１Ｂは、対照用ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球株化細胞（ＬＣＬ）と、２個
のＴ細胞ＡＬＬ株化細胞であるジャーカットとＭｏｌｔ−３、および２名のＡＬ
Ｌ患者であるＵＰＮ１とＵＰＮ２より得た白血病細胞におけるイカロスエクソン
６の供与部位のシークエンスアラインメント（sequence alignment）と同一度（
identity）を示している。

【００２９】 図１２Ａ〜１２Ｂは、エクソン６に３０塩基対の欠失が見られる異常型イカロ
スアイソフォームを発現している白血病細胞における、イカロスエクソン６〜７
のスプライシング受容部位のゲノムシークエンスを示している。図１２Ａは、エ
クソン６のスプライシング供与部位を取り囲み、重複するＤｒａＩおよびＳｓｐ
Ｉの部位で終止する野生型シークエンスを示している。このシークエンスの判定
に使用するＰＣＲプライマー（Ｐ５、Ｐ６、およびＰ７）の位置を図示している
。コードシーケンスを大文字で、非コードシークエンスを小文字で示している。

【００３０】 図１２Ｂは、対照用ＥＶＢ形質転換Ｂリンパ芽球株化細胞ＬＣＬ、２個のＴ細
胞ＡＬＬ株化細胞であるジャーカットとＭｏｌｔ−３、および２名のＡＬＬ患者
であるＵＰＮ１とＵＰＮ２の白血病細胞におけるエクソン６〜７のスプライシン
グ受容部位のシークエンスアラインメントと同一度を示している。

【００３１】 ［発明の詳細な説明］ 本発明は、イカロスの突然変異体および／またはドミナントネガティブなアイ
ソフォームの発現は、癌ならびに乳児性幹細胞性白血病や小児性Ｔ−ＡＬＬとい
ったリンパ系悪性腫瘍を含む血液系異常のようなヒトの疾患と相関するとの発見
に関する。このため、試料中の突然変異体やドミナントネガティブなアイソフォ
ームの存在を測定することにより、異常な血液系細胞、特に悪性リンパ球系細胞
等の存在はもちろん、癌を含む疾患も検出する診断アッセイを行うことができる
。

【００３２】 ジンクフィンガーＤＡＮ結合性タンパク質であるイカロスは、決定的な（crit
ical）転写調節因子である。リンパ球の発達過程におけるイカロス遺伝子発現の
調節（Regulation）は、選択的プレｍＲＮＡスプライシングに部分的に媒介され
ている。Ｉｋ−１からＩｋ８までの特定のＩｋアイソフォームが同定されている
。これらのアイソフォームは、アミノ末端ジンクフィンガー組成、さらにＤＮＡ
結合特性および転写活性化特性がそれぞれ異なっている。

【００３３】 既知の８種のアイソフォーム中、３種（Ｉｋ−１、Ｉｋ−２、Ｉｋ−３）のみ
が、イカロスＤＮＡ結合性シークエンスであるGGGAAT［SEQ ID NO: 1］への高親
和性結合に必要な３〜４個のＮ末端ジンクフィンガーを含有している。これらの
ＤＮＡ結合性アイソフォームは、結合活性のため核に局在できる。残りのアイソ
フォーム（Ｉｋ−４〜８）は、必要数である３〜４個未満のジンクフィンガーを
含有し、細胞質に局在する。

【００３４】 Ｃ末端ジンクフィンガーは、ホモ二量体およびヘテロ二量体Ｉｋ複合体の形成
を調整（coordinate）する。ＤＮＡ結合性アイソフォームであるＩｋ−１、２、
および３間でホモ二量体およびヘテロ二量体を形成すると、これらアイソフォー
ムのＤＮＡに対する親和力が増す。これに対し、ＤＮＡ結合性アイソフォームと
非ＤＮＡ結合性アイソフォームであるＩｋ−４〜８とで形成したヘテロ二量体は
ＤＮＡに結合することができない。

【００３５】 多数のドミナントネガティブなアイソフォーム（Ｉｋ−４〜８）は、血液系悪
性腫瘍、例えば、リンパ腫や白血病といったリンパ系悪性腫瘍と関連付けられる
。リンパ球系細胞の細胞質中におけるこれらのアイソフォームの存在ならびに野
生型ＤＮＡ結合性アイソフォームであるＩｋ−１、２、および３の不在は、通常
のプログラム細胞死、すなわちアポトーシスに逆らって細胞を安定化させるもの
と考えられる。さらに、突然変異体アイソフォームの存在もまた、血液系悪性腫
瘍と関連付けられる。

【００３６】 ［定義付け］ 本出願中に使用されるあらゆる特定および技術的な用語は、特に記載がない限
り、当該技術分野で一般的に用いられている意味を有する。本出願中で使用され
ている以下の単語または語句は、以下に特定する意味を有する。

【００３７】 本出願中で使用される「突然変異体」は、対応する野生型のＤＮＡ、ＲＮＡ、
またはポリペプチドを基準にした、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリペプチドにおけ
る交互変化（alteration）を意味する。

【００３８】 本出願中で使用される「イカロスアイソフォーム」は、イカロス遺伝子の選択
的なスプライスバリアントを意味し、これによりサイズやシークエンスが変異す
るイカロスｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびタンパク質が生じる。

【００３９】 本出願中で使用される「突然変異体」は、エクソン２に挿入部分を有するか、
またはエクソン６〜７のスプライシング接合部に欠失部分が見られるＤＮＡ結合
性イカロスアイソフォーム（イカロス１〜３）および非ＤＮＡ結合性イカロスア
イソフォーム（Ｉｋ４〜８）の両方を含む。

【００４０】 本出願中で使用される「機能障害性」または「ドミナントネガティブ」のイカ
ロスアイソフォームは、イカロス結合部位におけるＤＮＡとの結合を妨げ、およ
び／またはイカロスの核への局在化を妨げる、野生型の非ＤＮＡ結合性イカロス
アイソフォームおよび突然変異体イカロスアイソフォームを意味する。

【００４１】 本出願中で使用される「ＤＮＡ結合性イカロスアイソフォーム」は、Ｉｋ−１
、Ｉｋ−２、およびＩｋ−３を含め、イカロスＤＮＡ結合性部位への高親和性結
合に必要な３以上のＮ末端ジンクフィンガーを有するアイソフォームを含む。

【００４２】 本出願中で使用される「非ＤＮＡ結合性イカロスアイソフォーム」は、Ｉｋ−
４、Ｉｋ−５、Ｉｋ−６、Ｉｋ−７、およびＩｋ−８を含め、イカロスＤＮＡ結
合性部位への高親和性結合に必要な３以上のＮ末端ジンクフィンガーを欠いたア
イソフォームを含む。

【００４３】 本出願中で使用される「治療」は、疾患の誘発または進行の予防、および／ま
たは、例えば、癌または患部細胞（diseasedt cell）の数を減少させることを含
む病状の緩和を意味する。

【００４４】 本出願中で使用される「リンパ系異常」または「リンパ系疾患」は、Ｔ細胞ま
たはＢ細胞が関与する疾患を意味し、悪性腫瘍または幹細胞性白血病、Ｔ細胞性
およびＢ細胞性ＡＬＬ、ならびに二次性白血病のような白血病を含む。

【００４５】発明の組成および方法 Ａ．突然変異体イカロスポリペプチドをコードする核酸シークエンス 本発明は、エクソン６および７間のイントロン−エクソンスプライシング部位
における新規なゲノムイカロスＤＮＡシークエンスを含む、イカロスアイソフォ
ームをコードする新規に同定された単離された（isolated）核酸シークエンスを
提供する。上記核酸シークエンスは、エクソン６に隣接するイントロンの５’末
端に、下記および図１１Ａ、１１Ｂに示すような２５４の塩基対の新規なゲノム
シークエンスを有し、

【化１】 さらに、下記および図１２Ａ、１２Ｂに示すような、エクソン７に隣接する３４
０塩基対の新規なゲノムイントロンシークエンスを有している。

【化２】

【００４６】 さらに、新規な突然変異体イカロスｃＤＮＡ分子も同定された。突然変異体イ
カロスｃＤＮＡ分子には、エクソン６〜７のスプライシング部位にフレーム内欠
失（in-frame deletions）を有するものや、エクソン２にフレーム内挿入（in-f
rame insertion）を有するものが含まれる。具体的な突然変異体としては、エク
ソン６〜７において、１０個のアミノ酸シークエンスKSSMPQKFLG［SEQ ID NO: 1
3］をコードする３０塩基対が欠失したもの、および／またはエクソン２におい
て、２０個のアミノ酸シークエンスTYGADDFRDFHAIIPKSFSR［SEQ ID NO: 11］を
コードする６０塩基対が欠失したものが挙げられる。

【００４７】 Ｂ．抗突然変異体イカロス抗体 本発明は、さらに突然変異体イカロスポリペプチドを特異的に識別して結合す
る抗突然変異体イカロス抗体を提供する。典型的な抗体としては、ポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体（humanized）、二重特異性抗体、お
よびヘテロ共役抗体が挙げられる。本発明の抗体は、モノクローナル抗体である
ことが好ましい。また、本発明の抗体は、突然変異体に固有な領域（unique reg
ion）（例えば、挿入部分または欠失によって発生した固有な領域）においてイ
カロスポリペプチドと結合することが好ましい。さらに、本発明の抗体は、ある
特定の突然変異体を欠失させるようにイカロスポリペプチドに結合することが最
も好ましい。突然変異体イカロスポリペプチド、またはそのタンパク質を、抗原
としても使用し、突然変異体イカロスアイソフォームと選択的に結合する抗体を
生成することが可能である。

【００４８】 モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein,1975, Nature, 256:495に記載
されているようなハイブリドーマ法や、米国特許第４，８１６，５６７号に記載
されているような組換えＤＮＡ法（recombinant DNA methods）、またはその他
の方法を用いて調製できる。また、ＤＮＡは、例えば、同種マウスのシークエン
スの代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメイン（human heavy and light chai
n constant domains）のコードシークエンスを用いることによって（米国特許第
４，８１６，５６７号）、または免疫グロブリンコードシークエンスを、非免疫
グロブリンポリペプチドのシコードークエンスの全体または一部に共有接合し、
キメラ抗体を生成することによって行える。抗体は、一価の抗体であってもよい
。抗体を分解してその断片、特にＦａｂフラグメントを生成することは、当該技
術分野では公知な日常的技術を用いることによって達成できる。

【００４９】 本発明の抗体は、例えば、リンパ球系細胞試料中における突然変異体イカロス
アイソフォームの発現または細胞下局在を検出する、突然変異体イカロスの診断
アッセイに用いることができる。

【００５０】 Ｃ．診断方法 イカロスの細胞下局在 突然変異体イカロス核酸シークエンス、突然変異体イカロスポリペプチド、お
よび抗突然変異体イカロス抗体を含む抗イカロス抗体により、有用な診断用ツー
ルが提供される。例えば、イカロスタンパク質の細胞下局在によってドミナント
ネガティブなイカロスアイソフォームを同定する診断方法を用い、リンパ系異常
を診断することができる。イカロスタンパク質の核区画化（nuclear compartmen
talization）は、ＩＫ−１、２、および３といった活性で正常なイカロスＤＮＡ
結合性アイソフォームと相関する。これに対し、イカロスタンパク質の細胞質内
の局在は、Ｉｋ−４〜Ｉｋ−８といった非ＤＮＡ結合性のドミナントネガティブ
なアイソフォームが多数存在することおよび単にこれらが存在することと相関し
、癌等の疾患と相関する。

【００５１】 イカロスタンパク質の散在性で非点状な核内の局在（Diffuse, non-punctate
nuclear localization）、散在性の核内および／または細胞質内の局在、および
／または細胞質内の局在は、癌およびリンパ系疾患と相関し、特に、ヒト血液系
悪性腫瘍と相関する。正常な細胞においては、イカロスは点状に核内に局在する
。したがって、イカロスアイソフォームの細胞下局在におけるこのような差異を
用いて癌および／またはリンパ系疾患を診断することが可能である。

【００５２】 タンパク質の局在分析に用いられる公知の方法を使用し、患者試料中のイカロ
スの細胞下局在を判定することができる。免疫蛍光染色を用いた免疫学的アッセ
イによりイカロスの検出を行うことが好ましい。

【００５３】 イカロス発現に関する免疫学的アッセイ 特定のイカロスアイソフォームは、例えば、ウエスタンブロット分析により同
定することができ、また、癌およびリンパ球系細胞異常の診断に使用することが
可能である。多数のドミナントネガティブなアイソフォーム、例えば、１以上の
Ｉｋ４〜８は血液系細胞異常と相関する。一般に、ＤＮＡ結合性アイソフォーム
に対する非ＤＮＡ結合性アイソフォームの比率が１以上であれば、リンパ系の疾
患であることを示している。

【００５４】 ウエスタンブロット分析によるドミナントネガティブなイカロスアイソフォー
ムの同定は、試料中に存在するイカロスアイソフォームの相対的なサイズを測定
することによっても達成できる。ドミナントネガティブなアイソフォームである
Ｉｋ４〜８の分子量は、約４７ｋＤａであるＩｋ２またはＩｋ３の分子量よりも
明らかに小さい。したがって、野生型アイソフォーム全８種または突然変異体イ
カロスアイソフォームを識別するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッ
ト分析におけるイカロスタンパク質の分析結果を使用し、ＤＮＡ結合性アイソフ
ォーム（分子量約４７ｋＤａ）に対するドミナントネガティブなアイソフォーム
（分子量約４７ｋＤａ未満）の相対比を測定することができる。

【００５５】 ＤＮＡ結合性アイソフォームと非ＤＮＡ結合性アイソフォームとを区別する特
定の抗体を使用することもできる。例えば、Ｉｋ４〜８に欠けているエピトープ
と反応する抗体との反応性（reactivity）を利用し、ＤＮＡ結合性アイソフォー
ムを選別することができる。

【００５６】 核酸分析 突然変異体イカロス核酸シークエンスの分析結果もまた、突然変異体イカロス
タンパク質、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または突然変異タンパク質をコードする遺伝子
の存在を同定する診断方法において使用可能である。イカロスの突然変異形は、
癌およびヒト血液系悪性腫瘍を含む血液系細胞異常といった疾患と相関している
ため、このような突然変異タンパク質、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または遺伝子の存在
を診断に用いることができる。直接的なシーケンシング、結合、または、ＰＣＲ
法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット、ザザンブロット、およびＲＮＡｓｅプ
ロテクション（RNAse protection）を含むハイブリダイゼーションアッセイを使
用することが可能である。例えば、エクソン２またはエクソン６〜７のような既
知のイカロス核酸変異領域のＰＣＲ増幅またはＲＴ−ＰＣＲ増幅を行うことがで
きる。エクソン２における２１個のアミノ酸挿入部分の存在は、血液系細胞異常
と相関する。

【００５７】 別の実施形態においては、逆転写反応を、１０個のアミノ酸欠失（３０個の核
酸欠失）が同定されることがわかっているエクソン６〜７の領域のＰＣＲ増幅と
組み合わせて用い、イカロス欠失突然変異体の存在と共に血液系細胞異常のアッ
セイを行うことができる。

【００５８】 同様に、逆転写反応をＰＣＲ増幅と組み合わせて用い、非ＤＮＡ結合性イカロ
スアイソフォームであるＩｋ４〜８を同定することができる。突然変異体ではな
い非ＤＮＡ結合性イカロスアイソフォームのＩｋ４〜８の存在は、血液系細胞異
常、癌、および、特にリンパ系疾患と相関する。

【００５９】 これらの診断方法はいずれも、疾患の検出、疾患の進行および／または症候緩
和の監視、および治療効果の評価に使用することができる。

【００６０】 Ｄ．治療方法 イカロス補充療法 ＤＮＡ結合性イカロスアイソフォームの不在または欠如は、リンパ系疾患と関
連付けられる。よって、ＤＮＡ結合性イカロスアイソフォームであるＩｋ−１〜
３、好ましくはＩｋ−１またはＩｋ−２を、治療目的で補充することが所望され
る。このような補充は、ＩＫタンパク質のＤＮＡ結合形態を直接投与すること、
および／またはこれらのタンパク質が生体内で生産されるよう、これらのタンパ
ク質をコードする核酸を投与することを含む公知の方法によって達成できる。

【００６１】 以下に示す非制限的な実施例を参照することにより、本発明のさらなる理解が
得られるであろう。

【００６２】 実施例１ ＡＬＬの小児におけるイカロス発現の特徴付け Ａ．患者および株化細胞 患者の母集団には、新たにＡＬＬと診断された６４名の小児（２１歳未満）が
含まれていた。これらの患者は、小児癌グループ（Children's Cancer Group）
（ＣＣＧ）のプロトコル、ＣＣＧ−１８８２およびＣＣＧ−１９６１（白血球数
（ＷＢＣ）が５０，０００μｌ以上である１〜９歳のＡＬＬ患者または１０歳以
上のＡＬＬ患者）、ＣＣＧ−１９０１（Ｔ−ＡＬＬを含む、リンパ腫の特徴が見
られるＡＬＬ患者）、またはＣＣＧ−１０７、ＣＣＧ−１８８３、およびＣＣＧ
−１９５３（ＡＬＬの乳児）に記載されている。１５名の患者がＴ細胞系ＡＬＬ
（T-lineage ALL）であり、４９名の患者がＢ細胞系ＡＬＬ（B-lineage ALL）で
あった。８名のＢ細胞系ＡＬＬ患者を除く全ての患者（８７．５％）が、ＮＣＩ
リスク分類（NCI risk classification）（Smith et al., 1996, J. Clin. Onco
l., 14:18-24）によるとハイリスクなＡＬＬであった。初回骨髄再発の５名の患
者についても調査を行った。

【００６３】 病床記録は全て国立癌研究所（National Cancer Institute）ならびに参与す
るＣＣＧ加入機関（participating CCG-affiliated institutions）の機関内再
審理委員会（Institutional Review Boards）が認めたものである。保険福祉省
のガイドライン（Department of Health and Human Services guidelines）に従
い、治療と臨床調査（laboratory studies）の両方に関して両親、患者本人、ま
たはその両者を適切に選択してインフォームド・コンセントを得た。

【００６４】 ＡＬＬの診断は、ライトギザム染色（Wright-Giemsa staining）、末端デオキ
シヌクレオチジル転移酵素の陽性核染色、ミエロペルオキシダーゼの陰性染色、
および先に述べたリンパ球分化抗原に対するモノクローナル抗体との反応性 （U
ckun et al., 1996, Leuk. Lymphoma, 24:57-70; Uckun et al., 1997, Blood,
90:28-35; and Uckun et al., 1997, J. Clin. Oncol., 15:2214-2221）によっ
て測定された、リンパ芽球の形態（morphology）を含む、白血病細胞の構造的、
生化学的、免疫学特徴に基づいて行なわれた。Ｔ細胞系ＡＬＬは全て、隔離白血
病細胞の３０％以上がパンＴ細胞マーカー（pan-T cell marker）ＣＤ７に対し
て陽性であり、かつ３０％未満がパンＢ細胞マーカー（pan-T cell marker）Ｃ
Ｄ１９に対して陽性であることからＴ細胞系ＡＬＬと分類された。同様に、Ｂ細
胞系ＡＬＬ患者は全て、白血病細胞の３０％以上がＣＤ１９に対して陽性であり
、かつ３０％未満がＣＤ７に対して陽性であることからＴ細胞系ＡＬＬと分類さ
れた。診断用の骨髄検体より得た余剰細胞を、分子遺伝学的な調査に用いた。新
たに診断された６４名の患者に見られる臨床的な特徴を表１に示している。新た
にＴ細胞系ＡＬＬと診断された１５名の患者のうち、１５名全員がＮＣＩリスク
分類（NCI risk classification）（Smith et al., 1996, J. Clin. Oncol., 14
:18-24）によるとハイリスクのＡＬＬであり、うち９名（６０％）が男児であり
、１４名（９７％）は白血球数が高く、１２名（８０％）に肝脾腫（hepatosple
nomegaly）が見られ、１１名（７３％）に縦隔腫瘤（mediastinal mass）が見ら
れた（表１）。また、新たにＢ細胞系ＡＬＬと診断された４９名の患者のうち、
４１名（乳児３０名と小児１１名）（８４％）がハイリスクのＡＬＬであり、２
８名（５７％）が男児で、２７名（５５％）は白血球数が高く、３４名（６９％
）に肝脾腫が見られた。

【００６５】 正常な骨髄検体を、骨髄ドナーである２名の小児より同胞間骨髄移植の際に得
た。正常な胸腺を、心臓疾患の胸部手術を受けている５名の小児より得た。胎児
胸腺を１個、胎生週齢２１週のプロスタグランジン誘発性ヒト流産児より得た。
これらの組織を、ヒューズインスティテュートのヒト被験者の使用に関する委員
会（Hughes Institute Committee on the Use of Human Subjects）のガイドラ
インに従って使用した。さらに、ヒトＴ−ＡＬＬ株化細胞のＭＯＬＴ−３および
ＪＫ−Ｅ６−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）と、Ｂ細胞系ＡＬＬ株化細胞ＬＣ
１；１９（Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１⁺）、ＫＭ−３、ＨＰＢ−ＮＵＬＬ、ＮＡＩＭ−６
、ＡＬＬ−１（ＢＣＲ−ＡＢＬ⁺）、およびＲＳ４；１１（ＭＬＬ−ＡＦ４＋）
に関しても分析を行った。また、胎児肝臓由来の未成熟リンパ球前駆体株化細胞
ＦＬ８．２⁺（Ｂ細胞系表面抗原ＣＤ１９とＴ細胞系表面抗原ＣＤ２とを共発現
する生殖系列ＩｇＨ遺伝子とＴＣＲα／β遺伝子とを有するＣＤ２⁺、ＣＤ１９⁺ 、ＣＤ１０⁺、ＣＤ３４⁺のプロＢ／Ｔ細胞系）およびＦＬ８．２^-（生殖細胞系
ＩｇＨ遺伝子を有するＣＤ２^-ＣＤ１９⁺ＣＤ１０⁺ＣＤ３４⁺Ｃμ^-ｓＩｇ^-のプロ
Ｂ／Ｔ細胞系）に関しても分析を行った。これら正常なリンパ球前駆体株化細胞
に関しては、Uckun et al., 1989, Blood, 73: 1000-1015および Uckun et al.,
1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3589-3593に報告されているよう
な立証と特徴付けがなされている。

【００６６】

【表１】

【００６７】 Ｂ．細胞遺伝学的分析 白血病細胞に対し、治療開始に先立って、現地機関による細胞遺伝学的分析を
行った。結合染色体を、Heerema et.al., 1985, Cancer, Genet, Cytogenet., 1
7:165-179に記載されているように、非刺激の末梢血から調製するか、あるいは
採取したばかりの骨髄を直接２４時間培養して得た培養物より調製した。そして
、ヒト細胞遺伝学的命名法に関する１９９５国際システム（1995 International
System for Human Cytogenetics Nomenclature）（Mitelman, 1995, IN: ISCN:
An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, （Karger）
）を用い、染色体異常を選定した。同一構造の染色体異常が見られる中期細胞が
２個以上存在する場合、または同一の染色体欠如が見られる細胞が３個以上存在
する場合を異常クローンと定義した。

【００６８】 C．ウエスタンブロットによるイカロスタンパク質発現分析 イカロス発現に関する調査を、異なる８個の株化細胞、正常組織、および５９
名のＡＬＬ小児より得た原発性白血病細胞中において、アイソフォーム全８種を
識別するポリクローナル抗イカロス抗体を用いて全細胞溶解物中に含まれるタン
パク質を分析するウエスタンブロット分析によって行った。

【００６９】方法 全細胞溶解物を、Uckun et al., 1996, Science, 273:1096-1100およびSun et
al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(2):680-685に記載のように、１
％のノニデット−Ｐ４０（Nonidet-P40）の溶解緩衝液を用いて調製した。イカ
ロス発現に関する全細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、Sun et al., 1996
, EMBO J, 15:5358-5369に記載されているポリクローナル抗イカロス抗体を用い
て行った。この抗体は、Uckun et al., 1996, Science, 273:1096-1100および S
un et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(2):680-685に記載されてい
るように、イカロスアイソフォーム全８種に反応する。簡潔に説明すると、全細
胞溶解物の試料３０μｇを、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加し、サイズ分
画タンパク質をＰＶＤＦ膜（Millipore）に移した。ＰＶＤＦ膜を、５％のミル
ク中で室温下にて少なくとも１時間ブロッキングし、次にミルクを５％含んだＰ
ＢＳ中で、ポリクローナル抗イカロス抗体（希釈度１：１０００）（Sun et al.
, 1996, EMBO J., 15:5358-5369）により４℃で一晩インキュベートした。次に
、ＰＶＤＦ膜を、室温下にてＰＢＳＴ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１６ｍＭのＮａ ₂ ＨＰＯ、４ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、０．１％のトゥイーン（Tween）、ｐＨ７．３
）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼを共役させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（希釈度１
：２０００）（Jackson Lab.）により室温下にて２時間インキュベートした。そ
して、免疫反応性タンパク質を、Uckun et al., 1996, Science, 273:1096-1100
および Sun et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 96(2):680-685に記載
のように、化学発光（ＥＣＬ）システム（Amersham）により検出した。

【００７０】結果 調査の結果を、図１Ａ〜１Ｉおよび表２に示している。正常な胎児肝臓由来の
リンパ球前駆体株化細胞ＦＬ８．２⁺（プロＢ／Ｔ（Pro-B/T））およびＦＬ８．
２^-（プロＢ（Pro-B））（図１Ａ）、ならびに正常な骨髄細胞および胸腺細胞（
図１Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、および表２）は、Ｉｋ−１のサイズに相当する５７ｋＤａ
の免疫反応性タンパク質と、Ｉｋ−２またはＩｋ−３の何れかに相当する４７ｋ
Ｄａの免疫反応性タンパク質を発現していた。これに対し、Ｔ細胞系ＡＬＬ株化
細胞ＭＯＬＴ−３細胞およびＪＫ−Ｅ６−１（図１Ｅ、表２の説明文）、Ｂ細胞
系ＡＬＬ株化細胞ＬＣ１；１９、ＫＭ−３、ＨＰＢ−ＮＵＬＬ、ＮＡＩＭ−６、
ＡＬＬ−１、およびＲＳ４；１１（図１Ｂ）、ならびにＴ細胞系ＡＬＬ患者１７
名のうち１６名（９４％）より得た原発性白血病細胞（図１Ｅ〜１Ｄ、表２）お
よびＢ細胞系ＡＬＬ患者４２名のうち４２名（１００％）より得た原発性白血病
細胞（表２、図１Ｃおよび１Ｉ）は、サイズと電気泳動の移動度が、小型の非Ｄ
ＮＡ結合性イカロスアイソフォームＩｋ−４、Ｉｋ−５、Ｉｋ−６、Ｉｋ−７、
および／またはＩｋ−８の１以上に対応した、約３７〜４０ｋＤａのより小型の
免疫反応性タンパク質バンドを発現していた。

【００７１】 要約すると、正常な細胞においては、大型（約４７ＫＤ以上）のＤＮＡ結合性
イカロスアイソフォーム、Ｉｋ−１〜３が発現したのに対し、ＴおよびＢ細胞系
の白血病細胞においては、より小型（４７ＫＤ未満）の非ＤＮＡ結合性アイソフ
ォーム（Ｉｋ４〜８）が多数発現していた。

【００７２】 異常な細胞下の区画化（Compartmentalization） 正常な胎児組織におけるイカロスタンパク質の細胞下の区画化と、４９名のＡ
ＬＬ小児（１１名のＴ細胞系ＡＬＬ患者と３８名のＢ細胞系ＡＬＬ患者）より得
た白血病細胞、２つのＡＬＬ株化細胞、および２つの正常な胎児肝臓リンパ球前
駆体株化細胞（ＦＬ８．２⁺およびＦＬ８．２^-）における区画化とを、共焦レー
ザ走査顕微鏡検査（confocal laser scanning microscopy）によって比較した。

【００７３】方法 イカロスタンパク質の細胞下局在を、Uckun et al., 1996, Science, 273:109
6-1100および Sun et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(2):680-685
に記載のように、免疫螢光法（immunofluorescence）および共焦レーザ走査顕微
鏡検査により調べた。細胞（２００×１０³）を、室温下での３０分のインキュ
ベーションによりポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたカバーグラスに付着させ
、ＰＢＳで２回洗浄し、氷冷（−２０℃）メタノール中で１５分間固定した。細
胞を透過性にし、かつ非特異性抗体の結合部位をブロッキングするため、細胞を
ＰＢＳ中にて０．１％のトリトンＸ−１００および１０％のヤギ血清で処理した
。

【００７４】 イカロスタンパク質を検出するため、細胞を、Sun et al., 1996, EMBO J., 1
5:5358-5369および Sun et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(2):68
0-685に記載されている親和性精製ポリクローナルウサギ抗イカロス抗体（希釈
度１：３００）で室温下にて1時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し
、ＦＩＴＣを共役させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Amersham Corp., Arlington Heig
hts, IL）（最終希釈度１：１０００）で室温下にて１時間インキュベートした
。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡ特異性核染料ｔｏｔｏ−３（Molecular Probes
, Inc.、希釈度１：１０００）により室温下で１０分間対比染色してから、再度
ＰＢＳで洗浄した。光退色を防止するため、カバーグラスを反転させてVectashi
eld（Vector Labs, Burlinghame, CA）のスライドに取り付け、Sun et al., 199
9, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(2):680-685に記載のように、爪つや出し（
nail varnish）でシールした。そして、Uckun et al., 1996, Science, 273:109
6-1100およびSun et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(2):680-685
に記載のように、落射蛍光用に開口率の高い対物レンズを装備したニコンエクリ
プスＥ−８００アップライト顕微鏡（Nikon Eclipse E-800 upright microscope
）に搭載したバイオラッドＭＲＣ １０２４レーザー走査共焦顕微鏡（Bio-Rad M
RC 1024 Laser Scanning Confocal Microscope）を用いてスライドを観察した。
光学切片を得て、レーザーシャープソフトウエア（Lasersharp software）（Bio
-Rad, Hercules, CA）を用いてこれを立体顕微鏡写真にした。次に、代表的なデ
ジタル画像をアドーブフォトショップソフトウエア（Adobe Photoshop software
）（Adobe Systems, Mountain View CA）を用いて加工した。そして、フジピク
トグラフィー熱転写プリンター（Fuji Pictography thermal transfer printer
）（Fuji Photo, Elmsford, NY）で画像を印刷した。

【００７５】結果 ＦＬ８．２⁺およびＦＬ８．２^-株化細胞（図２ＫおよびＬ）の核（細胞質では
ない）、胎児胸腺細胞、正常な胸腺細胞（図２Ｍ）、および正常な骨髄分子細胞
（表２）は、ｔｏｔｏ−３に標識されたブルーの核内の明瞭な点状の緑色蛍光染
色パターンより明らかなように、抗イカロス抗体によって明るく染色されており
、焦点が分離した高レベルな発現が見られた。

【００７６】 これに対し、Ｔ細胞系ＡＬＬ小児１１名のうち７名（６４％）の白血病細胞（
図２Ｐ〜Ｒ）の細胞質、Ｂ細胞系ＡＬＬ小児３８名のうち２０名（５３％）の白
血病細胞（図２Ａ〜Ｊ）の細胞質、ならびにＡＬＬ株化細胞ＪＫ−Ｅ６−１（図
２Ｏ）およびＭＯＬＴ−３（図２Ｎ）の細胞質においては、ｔｏｔｏ−３に標識
されたブルーの核を取り囲む明るい緑色蛍光染色の縁より明らかなように、イカ
ロスタンパク質の発現が優勢であった。Ｔ細胞系ＡＬＬ患者１１名のうち４名（
３６％）の白血病細胞とＢ細胞系ＡＬＬ患者３８名のうち１８名（４７％）の白
血病細胞において、異常に散在した「切れ切れの（patchy）」核染色が、細胞質
染色を伴って、あるいは細胞質染色を伴わずに観察された（表２）。

【００７７】 要約すると、これらのデータは、正常な細胞においてはイカロスタンパク質は
核に局在するが、白血病細胞においてはイカロスタンパク質の散在および／また
は細胞質染色が見られることを示している。

【００７８】 Ｅ．白血病Ｔ細胞におけるイカロス特異性ＤＮＡ結合活性の喪失 正常な胸腺細胞および白血病Ｔ細胞より得た核抽出タンパク質が呈するイカロ
ス特異性の高親和性ＤＮＡ結合活性に対する能力を、高親和性のイカロス結合部
位を１つ備えたＩｋ−ＢＳ１オリゴヌクレオチドプローブを用いたゲル移動度シ
フトアッセイ（gel mobility shift assays）（ＥＭＳＡ）により評価した。デ
ータを図３に示している。

【００７９】方法 核抽出物を、Dignam et. al.,1983, Nucleic Acid Res., 11:1475-1489の方
法によって調製した。Ｉｋ−ＢＳ１オリゴヌクレオチドを、イカロス結合部位を
太字にして下記に示す。 5'TCAGCTTTTGGGAATACCCTGTCA3' ［SEQ ID NO: 2］ 上記プローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた³²Ｐおよびγ³²Ｐ−Ａ
ＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で端部を標識し、ヌクトラッププローブ精製
カラム（Nuctrap probe purification column）（Stratagene）を用いて精製し
た。標識プローブの添加前に、上記核抽出物（３μｇ）を、１０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ、ｐＨ７．９、５０ｍＭ ＫＣＬ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１
０％グリセリン、２ｎｇ ポリｄＩ−ｄＣ／ｄＩ−ｄＣを含有する２０μｌの反
応性混合物（reaction mixture）中で、室温下にて１０分間プレインキュベート
した。標識プローブ（１ｎｇ；１×１０⁵ｃｐｍ／ｎｇ）を添加し、混合物をさ
らに２０分間室温にてインキュベートした。そして、ゲル添加液（gel loading
buffer）を添加することにより、反応を終了させた。競合反応を起こさせるため
、上記プレインキュベーションを行う前に、６０フォールドを超過する（60-fol
d excess）非標識特異性プローブまたは非特異性プローブを添加した。Ｉｋ−Ｂ
Ｓ１オリゴヌクレオチドを、特定の競争者（competitor）およびＩｋ−ＢＳ１Ｍ
オリゴヌクレオチドとしても使用した。このオリゴヌクレオチドにおいては、イ
カロス結合部位に２塩基対の突然変異が見られた。 5'TCAGCTTTTGGGggTACCCTGTCA3' ［SEQ ID NO: 3］

【００８０】 次に、グリセリンを４％含有する、７％のアクリルアミド：ビスアクリルアミ
ド（３７．５：１）（ｐＨ８．３）トリス−グリシン−ＥＤＴＡゲルを用いて電
気泳動を行った。ゲルに対し、１５０Ｖでのプレランを４℃で２時間行った。反
応性混合物（１５μｍ）を添加し、さらに４時間の電気泳動を行った。電気泳動
を行った後、ゲルを乾燥させ、フィルム上でオートラジオグラフィーを行った。

【００８１】結果 移動度シフトアッセイの結果を、図３Ａおよび３Ｂに示している。正常な胸腺
細胞（ＮＴＨＹ）より得た核タンパク質には、著しいイカロス特異性ＤＮＡ結合
活性と一致した移動度シフトが見られた（図３Ａ）。イカロス単量体、二量体、
およびより高い次数の多重結合複合体を含有するタンパク質−ＤＮＡ複合体に対
応した３つの主要なシフトバンドが検出された。この３重構造の結合パターンは
特異なものである。というのも、６０フォールドを超過する標識されていない野
生型Ｉｋ−ＢＳ１オリゴヌクレオチドは移動度シフトを阻害でき、一方、２つの
塩基対の突然変異をイカロス結合部位（それぞれ、レーン３対４）に有する突然
変異体Ｉｋ−ＢＳＭオリゴヌクレオチドプローブは移動度シフトを阻害しないか
らである。

【００８２】 正常な胸腺細胞より得た抽出物とは対照的に、ＭＯＬＴ−３株化細胞またはＴ
−ＡＬＬ患者の白血病Ｔ細胞より得た抽出物においては、検出可能なＩｋ−ＢＳ
１プローブの移動度シフトは見られなかった（図３Ｂ）。

【００８３】 これらの結果は、白血病細胞より得た核タンパク質は、イカロス特異性の高親
和性のＤＮＡ結合活性を欠くという、先例のない証拠を提示するものである。こ
れらの結果は、イカロスの発現が細胞質内には見られるものの、核内には見られ
ない白血病細胞の共焦画像とも一致している。さらに点状または斑状となる代わ
りに、異常に切れ切れに散在した核内のイカロス染色パターンを有する白血病細
胞内におけるイカロス活性の不在は、何人かのＡＬＬ患者におけるイカロス含有
複合体のＤＮＡ特性が変化したことを示している。

【００８４】

【表２】

【００８５】 実施例２ 白血病細胞におけるイカロス転写物の分子の特徴付け ネステッドＲＴ−ＰＣＲ（nested RT-PCR）およびヌクレオチドによるシーケ
ンシングを用い、正常な胸腺細胞、正常な骨髄細胞、およびＡＬＬの小児より得
た白血病細胞における、ＰＣＲによって増幅可能なイカロス転写体の発現を調べ
た。精製したＰＣＲ産物をヌクレオチドのシーケンシングによって特徴付けた。
図４は、イカロスアイソフォーム１〜８を示す模式図であり、エクソン（Ｅ）１
〜７によってコードされたドメインの組成およびＰＣＲプライマーの位置を特に
示している。

【００８６】方法 イカロスｍＲＮＡ発現に関するＲＴ−ＰＣＲアッセイは、何れもＣＣＧ ＡＬ
Ｌ生物学関連研究室（CCG ALL Biology Reference Laboratory）において、Ucku
n et al., 1998, Blood, 92:810-821に詳細に記載されているように、偽陽性な
結果（false positive results）を得ることがないよう必要な予防措置をすべて
行った上で実施された。簡潔に説明すると、全細胞のＲＮＡを、リネージィ（商
標）全ＲＮＡ単離キット（RNeasyTM total RNA isolation kit）（Qiagen, Sant
a Clarita, CA）を使用して抽出し、この全ＲＮＡ試料の２０％を用い、ｄＮＴ
Ｐの存在下で、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（GIBCO-
BRL, Gaithersburg, MD）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られた産物をアンプ
リタックＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq DNA polymerase）（Perkin Elmer Cetu
s Corp., Norwalk, CT）で増幅し、上記文献に記載のように、ＤＮＡ熱サイクラ
ー（DNA thermal cycler）中で３５サイクルの処理を行った。感度を向上させる
ため、ＰＣＲ産物をネステッドＰＣＲによってさらに増幅した。イカロス（Ｉｋ
）ｃＤＮＡを増幅するプライマーとして、下記のものを使用した。 F1: 5'ATGGATGCTGACGAGGGTCAAGAC3' [SEQ ID NO: 4]；および R1: 5'TTAGCTCATGTGGAAGCGGTGCTC3' [SEQ ID NO: 5] ネステッドＰＣＲには、下記のプライマーを使用した。 F2: 5'CTCATCAGGGAAGGAAAGCC3' [SEQ ID NO: 6]；および R2: 5'GGTGTACATGACGTGATCCAGG3' [SEQ ID NO: 7]

【００８７】 Ｉｋ１のｃＤＮＡに基づく開始部位に対するプライマーの５’末端の位置は、
Ｆ１に関しては＋１、Ｆ２に関しては＋３２、Ｒ１に関しては＋１５７０、Ｒ２
に関しては＋１４４４である。ＰＣＲ産物の予測サイズは、Ｉｋ１に関しては１
．５ｋｂ、Ｉｋ２とＩｋ３に関しては１．２８ｋｂ、Ｉｋ４に関しては１．１７
ｋｂ、Ｉｋ５に関しては１．１ｋｂ、Ｉｋ６に関しては０．８６ｋｂ、Ｉｋ７に
関しては１．１ｋｂ、Ｉｋ８に関しては１．０ｋｂである。

【００８８】 ＲＮＡの整合性（integrity）は、ヒト造血細胞に偏在的に発現するｃＡＢＬ
ｍＲＮＡを、下記のプライマーを用いてＰＣＲ増幅することによって確認できる
。 5'-TTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTT-3' [SEQ ID NO: 8]；および 5'-TGTGATTATAGCCTAAGACCCGGAG-3' [SEQ ID NO: 9].

【００８９】 正常な胎児胸腺細胞／乳児骨髄の単核細胞より単離したＲＮＡによる反応を、
イカロス転写物の陽性対照例として使用した。陰性対照例には、ＲＮＡを介さな
いｃＤＮＡの合成および増幅反応（RNA-free cDNA synthesis and amplificatio
n reaction）、ならびにＤＮＡポリメラーゼを介さない反応（DNA polymerase-f
ree reaction）によって得られたＰＣＲ産物が含まれる。

【００９０】 ネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応混合物より精製したイカロスｃＤＮＡ（QIAquick
TM PCR purification kit; Qiagen, Santa Clarita, CA）を、ＴＡクローン化キ
ット（TA Cloning kit）（Invitrogen, San Diego, CA）を用いてクローン化し
、ｐＣＲ ＩＩベクターを得た。クローン化したＰＣＲ産物を、キアゲンプラス
ミド単離キット（Qiagen plasmid isolation kit）を用いて精製し、サーモシー
クエナーゼシークエンシングキット（Thermosequenase sequencing kit）（Amer
sham, Arlington Heights, IL）とＡＬＦシークエンサー（ALF Sequencer）（Ph
armacia, LKB Biotech, Piscataway, NJ）とを用いて自動的にシークエンシング
した（Uckun et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3589-3593）。ま
た、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法（dideoxynucleotide chain termination
method）による手動のシークエンシングを、Ｔ７シークエナーゼ急速変性プラス
ミドシークエンシングキット（T7 Sequenase Quick-denature Plasmid Sequenci
ng kit）（Amersham）を製造業者の指示に従って用いて行った。得られたシーク
エンスを、GenBank（アソシエーションコードＳ８０８７６およびＵ４０４６２
）より得た、公表されているヒトイカロスｃＤＮＡシークエンスと比較した。

【００９１】結果 ＰＣＲ増幅とシークエンスの結果を、図５〜８に示している（As results of
the PCR amplification and sequencing, are shown in Figures 5-8）。正常な
胎児胸腺細胞において、およそ１．４ＫｂのＰＣＲ増幅産物が一つだけ観察され
、１０／１０の異なるＰＣＲクローンが野生型Ｉｋ−１のコードシークエンスを
有していた（図５Ａ、表２）。同様に、健康な小児より得た正常な骨髄細胞（Ｎ
ＢＭ−２）において、およそ１．２ＫｂのＰＣＲ増幅産物が一つだけ観察され、
３／３の異なるＰＣＲクローンが野生型Ｉｋ−２のコードシークエンスを有して
いた（図５Ａ、表２）。比較を行った結果、２１名のＡＬＬ小児のうち、２０名
の白血病細胞において、優勢なＰＣＲ増幅産物はＩＫ−２よりも小型であった（
図５Ｂおよび５Ｃ、表２）。

【００９２】 ２１例全てにおいて、シークエンス分析は首尾よく行われた。２１名のＡＬＬ
患者のうち、１名（Ｔ−ＡＬＬ患者）の白血病細胞、ならびにＴ−ＡＬＬ株化細
胞のＭＯＬＴ−３とＪＫ−Ｅ６−１とにおいて、エクソン２／エクソン４の接合
部におけるエクソン４のすぐ上流側に６０塩基対が挿入されたことにより、２０
個のアミノ酸の挿入（エクソン２ａ）が見られる異常型Ｉｋ−２アイソフォーム
（Ｉｋ−２（挿入型））が発現していた（図６）。これらの細胞は、挿入による
突然変異体を単独で、またはエクソン６の３’末端における３０の塩基対が欠失
したことによる、フレーム内の１０個のアミノ酸の欠失を伴って発現していた（
図８Ａ〜８Ｃ、表２）。

【化３】

【化４】 図８Ａ〜８Ｃに示すように、これによって得られる欠失型突然変異体には、下記
の突然変異シークエンスが見られた。

【化５】

【００９３】 １０名のＴ細胞系ＡＬＬ患者のうち８名（８０％）および１１名のＢ細胞系Ａ
ＬＬ患者のうち５名（４５％）より得た白血病細胞を分析した結果、非ＤＮＡ結
合性イカロスアイソフォームＩｋ−４が発現していた（表２）。２名のＴ細胞系
ＡＬＬ患者においては、野生型Ｉｋ−４のみが発現していた。別の２名のＴ細胞
系ＡＬＬ患者においては、野生型Ｉｋ−４と共に、野生型Ｉｋ−２またはフレー
ム内での１０個のアミノ酸欠失が見られる異常型が発現していた。１名のＴ細胞
系ＡＬＬ患者においては、エクソン６の３’末端に同様の３０ｂｐ（１０個のア
ミノ酸）の欠失が見られる異常型Ｉｋ−４のみが発現していた。これに対し、別
の１名のＴ細胞系ＡＬＬ患者および４名のＢ細胞系ＡＬＬ患者においては、この
欠失による突然変異体が、野生型Ｉｋ−１および／またはＩｋ−２と共に発現し
ていた。２名のＴ細胞系ＡＬＬ患者および１名のＢ細胞系ＡＬＬ患者においては
、野生型Ｉｋ−１および／またはＩｋ−２と共に、野生型Ｉｋ−４と欠失型のＩ
ｋ−４の両方が発現していた。

【００９４】 Ｉｋ−４とは対照的に、他のドミナントネガティブなイカロスのアイソフォー
ムは、ＡＬＬの小児より得た原発性白血病細胞において、頻繁には発現していな
かった。Ｉｋ−６は、１名のＢ細胞系ＡＬＬ患者より得た５個のＰＣＴクローン
中の５個において、野生型で発見された（表２）。Ｉｋ−７は、１名のＢ細胞系
ＡＬＬ患者より得た２個のＰＣＴクローンのうち２個において、野生型で発見さ
れ、１名のＴ細胞系ＡＬＬ患者および１名のＢ細胞系ＡＬＬ患者より得たＰＣＲ
クローンの少なくとも半数において、突然変異体で発見された。Ｉｋ−８は、１
１名のＢ細胞系ＡＬＬ患者のうち３名のＰＣＲクローンにおいては発見されたが
、１０名のＴ細胞系ＡＬＬ患者のいずれにも発見されなかった（表２）。

【００９５】 したがって、ＲＴ−ＰＣＲおよびシークエンシングにより、共焦顕微鏡検査お
よびウエスタンブロット分析により得た結果がさらに拡大され、ＡＬＬの各小児
より得た原発性白血病細胞は、小型の非ＤＮＡ結合性の野生型および／または変
異型イカロスアイソフォームを発現することが確認された。分析された２１の事
例のうち、１９例（９０．５％）がドミナントネガティブなイカロスアイソフォ
ームを発現していたが、その内訳は、Ｉｋ−４（２１患者中の１２名）、Ｉｋ−
６（２１患者中の１名）、Ｉｋ−７（２１患者中の３名）、およびＩｋ−８（２
１患者中の３名）であった。さらに、２１例中１５例（７１．４％）においては
、Ｉｋ−２、Ｉｋ−４、Ｉｋ−７、およびＩｋ−８のコードシークエンスを有す
るＰＣＲクローンに、エクソン６の３’末端に同一の３０塩基対の欠失が見られ
た。観察されたＮ末端の挿入およびＣ末端の欠失は、フレームシフトを引き起こ
すものではなく、よって下流側のアミノ酸シークエンスは変化しなかった。

【００９６】 要約すると、アイソフォームＩＫ４〜８および３０個のアミノ酸の挿入や１０
個のアミノ酸の欠失が見られる突然変異体を含むイカロスの非ＤＮＡ結合性形態
の発現は、リンパ系疾患、特に白血病と相関する。

【００９７】 実施例３ イカロスの２対立遺伝子性および多形性発現 白血病細胞中での異常型イカロスアイソフォームの発現は、シークエンス変化
または白血病が関与するトランス作用性因子の変化によるシスを引き起こすこと
がある。異常型発現のシス活性化が異常型アイソフォームの１対立遺伝子発現を
もたらすのに対し、トランス活性化は２対立遺伝子発現をもたらす可能性が高い
。２５名のＡＬＬ患者より得た１２８個のイカロスＲＴ−ＰＣＲクローンのシー
クエンスを、上述したＲＴ−ＰＣＲ法および核酸シークエンス分析により注意深
く検査して、多型シークエンス変異（polymorphic sequence variations）の存
在を調べ、( KSSMPQKFLGの欠失が見られる異常型アイソフォームが一対立遺伝子
性で発現しているのか、２対立遺伝子性で発現しているのかを調べた。

【００９８】結果 イカロスクローン内のヌクレオチド位置１００２（Ｉｋ−１−Ｇｅｎｂａｎｋ
＃Ｕ４０４６２ヒトイカロス／ＬＹＦ−１相同体（ｈＩＫ−１）ｍＲＮＡの翻訳
開始部位より番号付け）における単一ヌクレオチドの多型は、高度に保存された
二連活性化領域（bipartite activation region）のエクソン７内で、プロリン
（ＣＣＣまたはＣＣＡ）を決定する三重コドン（triplet codon）の第３番目の
塩基に影響を与えるサイレント変異として同定されている（図９Ａ）。この領域
は、種々のイカロススプライスバリアント中に保存されており、これによりあら
ゆるイカロスアイソフォームの分類が可能となっている。Ｃ対立遺伝子が最も優
勢（prevalent）であることが観察された（図９Ｂ、表３）。２５例中の８例に
おいて、イカロスの２つの多型変異形態（ＣまたはＡ）が、同様の発現レベルで
観察された。これに対し、残る１７例においては、対立遺伝子性の変異体（Ｃ（
Ｎ＝１５）またはＡ（Ｎ＝２））は一つしか観察されなかった。

【００９９】 全体的に見ると、１００２^C対立遺伝子の発現率は７７％（９９／１２８クロ
ーン）であり、１００２^A対立遺伝子の発現率は２３％（２９／１２８クローン
）であった。これら対立遺伝子の変異体は、いずれも野生型および異常型のΔKS
SMPQKFLG ＤＮＡ ＩＫ１〜３アイソフォーム、ならびに野生型および異常型のΔ
KSSMPQKFLG ＩＫ４〜８アイソフォームにおいて観察された（図９Ｂ、表３）。
種々のイカロスアイソフォームの、この２対立遺伝子性の発現パターンは、おそ
らくはスプライシング部位の識別に影響を与えるトランス作用性因子が、非ＤＮ
Ａ結合性アイソフォーム（ＩＫ４〜８）および異常型（ＩＫ（欠失型））ΔKSSM
PQKFLGイカロスアイソフォームの発生に関与していることを示唆している。２対
立遺伝子性発現は、ＩＫ（欠失型）突然変異体のみを発現している個々の患者お
よびＩＫ（欠失型）突然変異体と野生型イカロスの両方を発現している患者より
得た異常型イカロスΔKSSMPQKFLG RT-PCRクローンのシークエンス分析の際に観
察された（図９Ｂ）。この発見により、観察された欠失が、イカロス遺伝子内ま
たはその周辺におけるシス作用性の突然変異体によって起こるとは考えにくくな
った。しかしながら、Ａ対立遺伝子（４２％Ｃ／５８％Ａ）における異常型非Ｄ
ＮＡ結合性アイソフォーム（ＩＫ１〜３（欠失型））を発現するクローンの過剰
が、Ｃ対立遺伝子における異常型非ＤＮＡ結合性アイソフォーム（ΔKSSMPQKFLG
）（ＩＫ４〜８（欠失型））（９１％Ｃ／９％Ａ）の過剰な発現と共に観察され
ており、スプライシング部位の識別に対するシス作用の影響がわずかであること
を示唆している。

【０１００】

【表３】

【０１０１】 実施例４スプライシング供与部位領域および受容部位領域のゲノムシークエンス分析 ΔKSSMPQKFLGの欠失に含まれる１０個のアミノ酸は、転写活性ドメインの上流
に位置するエクソン６の３’末端にコードされている。ΔKSSMPQKFLGを有するイ
カロスの選択的スプライスバリアントを過剰発現している白血病細胞のスプライ
シング供与および受容領域の整合性を調べるため、エクソン６および７間のイン
トロン−エクソン接合部のゲノムウォーキング（genome walking）を行った。

【０１０２】方法 ピュアジーン（登録商標）ＤＮＡ単離キット（PuregeneR DNA isolation kit
）（Gentra Systems, Inc., Plymouth, MN）を製造業者の指示に従って用い、ゲ
ノムＤＮＡを患者細胞および株化細胞の両方から単離させた。イカロスのエクソ
ン６のイントロン−エクソン接合部における優勢なスプライシング供与および受
容部位を取り囲むゲノムシークエンスを、ゲノムウォーカー（商標）キット（Ge
nomeWalker^TM Kit）（Clontech, Palo Alto, CA）を使用して特徴付けた。この
キットは非常に高品質なヒト胎盤ゲノムＤＮＡを利用しており、このヒト胎盤ゲ
ノムＤＮＡは個々の制限酵素によって分解された後、特異的に設計された受容体
に結合して５個の別個の分解ＤＮＡ「ライブラリ」を作製する。これにより、末
端が未知であるゲノムシークエンスの増幅が、1個の遺伝子特異性プライマー（
Ｐ１）および1個のアダプター特異性プライマー（ＡＰ１）を用いることで可能
となる。第二の遺伝子特異性プライマー（Ｐ２）および第２のアダプター特異性
プライマー（ＡＰ２）によるネステッドＰＣＲ増幅を続けて行い、クローン化と
シークエンス分析に使用するのに十分な量の領域特異性産物を生成した。第１回
目の増幅において、イカロスのエクソン６より得た遺伝子特異性ＰＣＲプライマ
ー（Ｐ１）は、イカロスイカロスシークエンス＋７３２〜＋７５９と対応してい
た。 P1a： 5'-TAA TCA CAG TGA ATG GCA GAA GAC CTG-3' [SEQ ID NO: 14 ]

【０１０３】 第２回目の増幅において、ネステッド遺伝子特異性イカロスプライマー（nest
ed gene-specific Ikaros primer）は、イカロスシークエンス＋７４７〜＋７７
４と対応していた。 P2: 5'-GGC AGA AGA CCT GTG CAA GAT AGG ATC A-3' [SEQ ID NO: 15] .

【０１０４】 ＰＣＲプロトコルを、ゲノムウォーカー（商標）マニュアル（GenomeWalker^TM manual）に推奨されている通りに行った。簡潔に説明すると、長範囲にわたる
ＰＣＲを、アドバンテージ（登録商標）ゲノムＰＣＲポリメラーゼミックス（Ad
vanTAgeR genomic PCR polymerase mix）を用いて遂行した。アドバンテージゲ
ノムＰＣＲポリメラーゼミックスは、主要なポリメラーゼであるＴｔｈと、３’
→５’のエキソヌクレアーゼ活性を有する二次的な校正ポリメラーゼと、ホット
スタートＰＣＲを効果的に生成するＴｔｈスタート（商標）抗体（TthStart^TM a
ntibody）とを含有する製剤である。第１回目の増幅に関しては、二段階のサイ
クリングパラメータは以下の通りであった。９４℃で２５秒、７２℃で４分を７
サイクル；９４℃で２５秒、６７℃で４分を３２サイクル；続いて、６７℃で４
分間の最終伸長処理。ネステッド増幅反応（nested amplification reaction）
において、サイクリングパラメータは以下の通りであった。９４℃で２５秒、７
２℃で４分を５サイクル；９４℃で２５秒、６７℃で４分を２０サイクル；続い
て、６７℃で４分間の最終伸長処理。

【０１０５】 ３’スプライシング部位の増幅においては、アドバンテージ（登録商標）ＰＣ
Ｒポリメラーゼミックスの代わりに、ＴａｑポリメラーゼとＰｗｏポリメラーゼ
とを配合物を校正酵素として含有するエクスパンド（商標）ロングテンプレート
ＰＣＲシステム（Expand^TM Long Template PCR system）（Roche Molecular Bio
chemicals）を、正確な試薬緩衝液製剤（precise reagent buffer formulations
）と共に製造業者のプロトコルに従って使用した。異なる鋳型で調剤された、界
面活性剤（detergents）を含有する緩衝液３を、推奨されている希釈度で用いた
。第１回目の増幅において、イカロスエクソン７（＋９８９〜９７３）より得た
遺伝子特異性ＰＣＲプライマーは下記の通りであった。 P7: 5'-AGC GGG CGC AGG GAC TC-3' [SEQ ID NO: 16]

【０１０６】 第２回目の増幅においては、ネステッドプライマー（＋９７７〜９５７）は下
記の通りであった。 P6: 5'-GAC TCG GCC CCC AGG TAG TTG-3' [SEQ ID NO: 17]. 製造業者によって提供されたアダプター特異性プライマーＡＰ１およびＡＰ２を
、上記のように用いた。ＡＰ１を第１回目のＰＣＲ増幅に用い、上述のプライマ
ーＡＰ２を第２回目のネステッドＰＣＲ増幅に用いた。

【０１０７】 ＰＣＲプロトコルを、基本的にゲノムウォーカー（商標）マニュアル（Geno
meWalker^TM manual）の推奨に従い、上述のように実行した。ヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）ＰＣＲプライマーは、陽性対照例プライマー（
ＰＣＰ１、ＰＣＰ２）であり、ゲノムウォーカーキット（GenomeWalker kit）を
用いて用意したものである。ｔＰＡ対照用のサイクリングパラメータは、ゲノム
ライブラリダイジェストＰｖｕＩＩを用いた製造業者のプロトコルに記載されて
いる通りであった。

【０１０８】 ネステッドＰＣＲ産物を、トポ（商標）ＴＡクローニング（登録商標）キット
（TOPO^TM TA CloningR Kit）（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてクローン化
した。クローン化したＤＮＡのプラスミドミニプレップを、ハイピュア（商標）
プラスミド単離キット（High Pure^TM Plasmid Isolation Kit）（Roche Molecul
ar Biochemicals, Indianapolis, IN）を用いて行った。挿入部分を含有するク
ローンのシークエンシングを、サーモシークエンス（商標）プライマーサイクル
シークエンシングキット（Thermo Sequenase^TM primer cycle sequencing kit）
（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）およびＡＬＦ高速自動化ＤＮ
Ａシークエンサー（ALFexpress automated DNA sequencer）（Amersham Pharmac
ia）を用いて行った。３’スプライシング接合部の増幅において、ＤＭＳＯを、
最終濃度が５％ｖ／ｖになるように、サイクルシークエンシング反応物（cycle
sequencing reaction）に添加した。GenBankアソシエーション番号ＨＳＵ４０４
６２（ヒトイカロスｍＲＮＡ、ｈＩｋ［SEQ ID NO: 18］）およびＳ８０８７６
（ヒトイカロスｍＲＮＡ、選択的にスプライシングされた形態、ジャーカット［
SEQ ID NO: 19］）のイカロスｃＤＮＡを、シークエンスの比較とマッピングに
用いた。

【０１０９】 ゲノムウォーカー（商標）キットを用いて得たシークエンスを使用し、患者お
よび株化細胞のゲノムＤＮＡのイカロスエクソン６および７の５’スプライシン
グ接合部を取り囲む領域を直接増幅するプライマーを設計した。５’スプライシ
ング部位に関しては、イントロンの（アンチセンスな）プライマーの配置が異な
る２つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、３４２ｂｐおよび２１１ｂｐ
の断片を増幅した。これら産物の両方を増幅するのに用いたエクソン６のセンス
プライマーは下記の通りであった。 P1a: 5'-TAA TCA CAG TGA ATG GCA GAA GAC CTG-3' [SEQ ID NO: 14] （+732-7
59）；または P1b: 5'-TAA GCA CAG TGA AAT GGC AGA AGA CCT G-3' [SEQ ID NO: 20] （+732
-759）. 長さの異なる２つの断片、３２４および２１１ｂｐを増幅するのに使用したアン
チセンスなプライマーのシークエンスは、それぞれ下記の通りであった。 P4: 5'-ATG CTG CAA AAT CAA ATC TAG GAA AAA C-3' [SEQ ID NO: 21] （+223-
196）；および P3: 5'-TTT CCC TTT CTT CCA CCC TCA ACT CAT-3' [SEQ ID NO: 22] （+92
-65）

【０１１０】 ５００ｎｇのゲノムＤＮＡを５０μＬの反応体積中で使用し、エクスパンド（
商標）ロングテンプレートＰＣＲシステム（Expand^TM Long Template PCR syste
m）（Roche Molecular Biochemicals）を用いてＰＣＲを行った。緩衝液および
成分濃度はゲノムウォーカー（商標）キットの製造業者が推奨する通りであり、
異なる鋳型に対して緩衝液システム３を用いた。長範囲にわたるＰＣＲサイクリ
ングパラメータは、以下の通りであった。９５℃で２分（完全変性）；続いて、
９４℃で２５秒、６５℃で３０秒、６８℃で２分の伸長処理を１０サイクル；さ
らに、サイクル毎に伸長処理工程に２０秒を追加しながら、９４℃で２５秒、６
５℃で３０秒、６８℃で２分（伸長処理）を２０サイクル；最後に６８℃で１０
分の最終伸長処理。

【０１１１】 この結果得られた産物を、トポ（商標）ＴＡクローニング（登録商標）キット
（TOPO^TM TA Cloning^(R)Kit）（Invitrogen）を用いてクローン化した。クロー
ン化したＤＮＡのプラスミドミニプレップを、ハイピュア（商標）プラスミド単
離キット（High Pure^TM Plasmid Isolation Kit）（Roche Molecular Biochemic
als, Indianapolis, IN）を用いて行った。挿入部分を含有するクローンのシー
クエンシングを、サーモシークエンス（商標）プライマーサイクルシークエンシ
ングキット（Thermo Sequenase^TM primer cycle sequencing kit）（Amersham P
harmacia Biotech, Piscataway, NJ）およびＡＬＦ高速自動化シークエンサー（
ALFexpress automated sequencer）（Amersham Pharmacia）を用いて行った。

【０１１２】 ３’スプライシング部位に関しては、エクスパンド（商標）ロングテンプレー
トＰＣＲシステム（Expand^TM Long Template PCR system）（Roche Molecular B
iochemicals）を用い、緩衝液システム１および５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを使用す
る以外は上記と同様にしてゲノムＰＣＲを行った。３’スプライシング部位に対
するセンスプライマーはＰ５であり、スプライシング受容部位より−２４４〜−
２２３のイントロン部分を有している。アンチセンスプライマーはＰ６であり、
ｃＤＮＡ部分の＋９７７〜＋９５７を有している。 P5: 5'-GTA GGT CCT GGC TCG GTG TCC C-3' [SEQ ID NO: 23] （スプラ イシング受容部位より−２４４〜−２２３のイントロン部分）；および P6: 5'-GAC TCG GCC CCC AGG TAG TTG-3' [SEQ ID NO: 17] （ｃＤＮＡ ＋９７７〜９５７の部分）

【０１１３】 この場合、長範囲にわたるＰＣＲサイクリングパラメータは、１×９５℃で３
分；、１０×９５℃で３０秒、６６℃で４５秒、６８℃で２分、６８℃で２分；
２０×９５℃で３０秒、６６℃で４５秒、６８℃で２分＋１０秒／サイクル；１
×６８℃で５分であった。この３’断片の分析に関しては、ＤＭＳＯを、ゲノム
ＰＣＲおよびサイクルシークエンシング反応物の両方に、最終濃度が５％ｖ／ｖ
になるように添加した。

【０１１４】 結果 エクソン６および７間のイントロン−エクソン接合部のゲノムウォーキングに
より、野生型のシークエンスが明らかになった。５’スプライシング部位の分析
に関し、ゲノムウォーカー（商標）キットによって提供された５個のＤＮＡライ
ブラリのうちの２個より得られたネステッドＰＣＲの結果、単一バンドが首尾よ
く得られた（図１０Ａ）。これらの各ライブラリより４個のクローンを選択し、
シークエンス分析を行った。この初回シークエンス比較（図１１Ａ）の結果は、
イカロスｍＲＮＡ（アソシエーション番号ＨＳＵ４０４６２、１００％一致）の
エクソン６の３’末端と完全に一致していた。

【０１１５】 図１０Ａ〜１０Ｅは、エクソン６／７のスプライシング接合部を覆うシークエ
ンスの判定に用いられるＰＣＲ産物を明らかにする臭化エチジウムによって染色
した代表的なゲルの写真である。図１０Ａは、ゲノムウォーカー（商標）キット
によって、遺伝子特異性プライマーＰ２およびゲノムウォーカー（商標）接着体
プライマーＡＰ２を使用し、制限酵素（ＥｃｏＲＶまたはＳｓｐＩ）によって分
解された、アダプター結合ＤＮＡを増幅ことによって、エクソン６の供与部位領
域を増幅して発生させたネステッドＰＣＲ産物を示している。

【０１１６】 図１０Ｂは、ＤｒａＩまたはＳｓｐＩによって分解されたアダプター結合ＤＮ
ＡのＡＰ２および遺伝子特異性プライマー６、Ｐ６によって増幅して得たエクソ
ン７のスプライシング受容部位（slice acceptor site）を取り囲むネステッド
ＰＣＲ産物を示している。

【０１１７】 図１０Ｃは、対照用細胞（ＬＣＬ、ＥＢＶ−形質転換Ｂリンパ芽球対照用株化
細胞）、白血病株化細胞（ジャーカット、Ｍｏｌｔ−３）、および患者（ＵＰＮ
１およびＵＰＮ２）の原発性白血病細胞より得たエクソン６の供与部位を、プラ
イマーセット［Ｐ１ａおよびＰ４］または［Ｐ１ｂおよびＰ４］を使用して増幅
して得たゲノムＰＣＲ増幅産物を示している。

【０１１８】 図１０Ｄは、対照用細胞および患者の原発性白血病細胞より得たエクソン６の
供与部位を、プライマーセットＰ１ｂおよびＰ３を使用して増幅して得たゲノム
ＰＣＲ増幅産物を示している。

【０１１９】 図１０Ｅは、対照用細胞および患者の原発性白血病細胞より得たエクソン７の
受容部位を、プライマーセットＰ５（SEQ ID NO: 23）およびＰ６（SEQ ID NO:
17）を使用して増幅して得たゲノムＰＣＲ増幅産物を示している。分子量マーカ
ー（Ｍ）：１ｋｂＤＮＡラダー。陰性対照例（Ｎｅｇ．Ｃｏｎ）は、鋳型（ライ
ブラリダイジェストまたはゲノムＤＮＡサンプル）を用いない複製反応物であっ
た。陽性対照例（Ｐｏｓ．Ｃｏｎ）は、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ
ＰＡ）、１．５ｋｂの予測バンドを有するネステッドプライマーセット、ＡＰ２
およびＰＣＰ２であった。エクソン６の５’末端に隣接するイントロンへの２５
４塩基対の新規なゲノムシークエンスを［SEQ ID NO: 24］と特徴付けた。

【０１２０】 ３’スプライシング部位に関し、ゲノムウォーカー（商標）キットによって提
供された５個のゲノムＤＮＡライブラリ中の２個より、ネステッドＰＣＲの結果
、単一バンド（両ライブラリより５０３ｂｐ）が首尾よく得られた（図１０Ｂ）
。各ライブラリより平均的なクローンを４個選択し、シークエンス分析を行った
。ここでも、分析結果はイカロスｍＲＮＡ（アソシエーション番号ＨＳＵ４０４
６２）のエクソン７のシークエンスとの完全に一致していた（図１２Ａ）。この
領域に関し、エクソン７より上流に位置する３４０塩基対の新規なイントロンシ
ークエンスを［SEQ ID NO: 25］と特徴付けた。そして、このシークエンスを用
い、患者および株化細胞のゲノムＤＮＡにおけるスプライシング接合部のこの領
域およびイントロンシークエンスを直接増幅するためのプライマーを発達させた
。

【０１２１】 欠失型の変異を発現している白血病患者および株化細胞において、対応するエ
クソン６〜エクソン７のスプライシング接合領域に対するその後の増幅およびシ
ークエンス分析においては、優勢な５’（供与）または３’（受容）スプライシ
ング部位においてはもちろん、不顕性（cryptic）スプライシング部位領域にお
いても突然変異体は見受けられなかった。また、選択的スプライスバリアントを
発現している患者およびこれら試料の株化細胞より得たＤＮＡのゲノムＰＣＲに
より、予想サイズのバンドが得られた。図１０Ｃおよび１０Ｄは、５’スプライ
シング部位に関するデータを示している。図１０Ｅは、３’スプライシング部位
に関するデータを示している。５’および３’スプライシング部位の両方を覆う
多数のクローン単離体を制限解析（restriction analysis）したところ、サイズ
の違いは検出されなかった。

【０１２２】 各試料あたり最低６個のクローンをシークエンシングし、突然変異体を分析し
た。シークエンシングの結果、調査を行った全てのゲノムＤＮＡにおいて、選択
的なスプライシング部位間の領域の存在が確認された。正常なスプライシング供
与部位または欠失したシークエンスを直接取り囲む領域、すなわち、不顕性スプ
ライシング供与部位における２８４塩基対内には、突然変異体は存在しなかった
（図１１Ａおよび１１Ｂ）。同様に、３’スプライシング受容部位における３２
８塩基対内においても、突然変異体は発見されなかった（図１２）。

【０１２３】 要約すると、これらのデータは、ＩＫ−欠失型選択的スプライスバリアントを
発現している白血病細胞におけるエクソン６および７間のイントロン−エクソン
接合部にわたるスプライシング供与および受容領域の保存と整合性を示している
。

【０１２４】 本明細書中に記載したあらゆる刊行物および特許出願は、本発明が関連する技
術分野における通常の技術者の水準を示すものである。全ての刊行物および特許
出願は、引照により、それぞれの刊行物または特許出願を参考として特記および
別記した場合と同程度に本明細書に組み込まれる。

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ〜１Ｉ】 図１Ａ〜１Ｉは、正常な細胞と白血病細胞におけるイカロスタンパク質アイソ
フォームの発現を示すウエスタンブロット図である。図１Ａ．１〜１Ａ．２は、
ジャーカットＴ細胞系ＡＬＬ細胞ならびに正常な胎児肝臓由来のヒトリンパ球前
駆体株化細胞ＦＬ８．２⁺およびＦＬ８．２^-に発現したイカロスタンパク質を示
している。図１Ｂは、正常な胸腺細胞（ＮＴＨＹ−５）および６種の異なるＢ細
胞系ＡＬＬ株化細胞に発現したイカロスタンパク質を示している。図１Ｃは、正
常な胸腺細胞（ＮＴＨＹ−４）および非乳児性Ｂ細胞系ＡＬＬの８名の小児より
得た白血病細胞に発現したイカロスタンパク質を示している。図１Ｄは、正常な
骨髄細胞（ＮＢＭ−１）、正常な乳児胸腺細胞（ＮＴＨＹ）、および胎児胸腺細
胞（ＦＴ）に発現したイカロスタンパク質を示している。図１Ｅ〜１Ｇは、ＪＫ
−Ｅ６−１およびＭＯＬＴ−３白血病株化細胞、正常骨髄単核細胞（ＮＢＭ−２
）、ならびにＴ−ＡＬＬの小児より得た白血病細胞に発現したイカロスタンパク
質を示している。図１Ｈは、正常な乳児骨髄細胞（ＮＢＭ−１）、正常な乳児胸
腺細胞（ＮＴＨＹ）、および胎児胸腺細胞（ＦＴ）における発現を示している。
図１Ｉは、正常な乳児骨髄単核細胞（ＮＢＭ−２）および新たにＡＬＬと診断さ
れた６名の乳児における発現を示している。

【図２Ａ〜２Ｒ】 図２Ａ〜２Ｒは、イカロスの発現と細胞下の局在を示す、白血病細胞の共焦画
像である。図２Ａ〜２Ｊは、Ｂ細胞系ＡＬＬ患者より得た白血病細胞を示してい
る。図２Ｋおよび２Ｌは、正常な胎児肝臓由来のリンパ球前駆体株化細胞ＦＬ８
．２⁺（プロB／T）およびＦＬ８．２^-（プロB）をそれぞれ示している。図２Ｍ
は、正常な胸腺細胞を示している。図２Ｎおよび２Ｏは、白血病Ｔ細胞であるＭ
ＯＬＴ−３細胞およびＪＫ−Ｅ６−１細胞をそれぞれ示している。図２Ｐ〜２Ｒ
は、Ｔ−ＡＬＬ患者より得た原発性白血病細胞を示している。

【図３Ａ〜３Ｂ】 図３Ａおよび３Ｂは、正常な胸腺細胞（ＮＴＨＹ）、Ｔ−ＡＬＬ患者より得た
白血病Ｔ細胞、および株化細胞ＭＯＬＴ−３より抽出した核タンパク質のイカロ
ス特異性ＤＮＡ結合活性を示している。

【図４】 図４は、エクソン（Ｅ）１〜７にコードされた特定の成分ドメインと、記載の
ＰＣＲプライマーとを有するイカロスアイソフォーム１〜８を模式的に表した図
である。

【図５Ａ〜５Ｃ】 図５Ａ〜５Ｃは、胎児胸腺細胞（ＦＴ）、正常な骨髄単核細胞（ＮＢＭ−２）
、Ｍｏｌｔ−３細胞、ジャーカット細胞（ＪＫ−Ｅ６−１）、Ｔ−ＡＬＬ患者よ
り得た原発性白血病細胞（Ｔ−ＡＬＬ）、およびＢ−ＡＬＬ患者より得た原発性
白血病細胞（ＩＮＦ）を増幅して得たＰＣＲ産物を示す臭化エチジウム（ethidu
im bromide）で染色した代表的なゲルである。

【図６】 図６は、エクソン２〜４に野生型Ｉｋ−２をコードするシークエンスを有する
対照用クローン（Ｔ−ＡＬＬ#５）およびＩｋ−２の挿入型突然変異体を示すＴ
−ＡＬＬ患者の細胞（Ｔ−ＡＬＬ#５）におけるエクソン２およびエクソン４間
の接合部全体に対するシークエンストレーシングである。図６は、エクソン２お
よびエクソン４間の接合部にわたる野生型Ｉｋ−２のｃＤＮＡシークエンス［SE
Q ID NO: 27］とこれに対応して誘導されるアミノ酸シークエンス［SEQ ID NO:
28］、ならびにエクソン２およびエクソン４間の接合部にわたるＩｋ−２の挿入
型突然変異体のｃＤＮＡシークエンス［SEQ ID NO: 29］とこれに対応して誘導
されるアミノ酸シークエンス［SEQ ID NO: 30］を示している。

【図７】 図７は、ＤＮＡ二本鎖の主要な溝と相互作用する、Ｉｋ−２における最初の３
つのジンクフィンガー（Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４）の相互作用を示したリボン図
である。

【図８Ａ〜８Ｆ】 図８Ａ〜８Ｆは、野生型イカロス２のアイソフォームを発現している白血病細
胞および欠失型突然変異体を発現している白血病細胞におけるエクソン６および
エクソン７間の接合部全体に対するシークエンストレーシングである。図８Ａ〜
８Ｃは、Ｔ−ＡＬＬ患者およびＭＯＬＴ−３株化細胞より得た野生型イカロスア
イソフォームおよび欠失型突然変異体イカロスアイソフォームのシークエンスト
レーシングを示している。図８Ｄ〜８Ｆは、Ｂ−ＡＬＬ患者およびＭＯＬＴ−３
株化細胞より得た野生型イカロスアイソフォームおよび欠失型突然変異体イカロ
スアイソフォームのシークエンストレーシングを示している。Ｉｋ−２と欠失型
突然変異体、Ｉｋ−４、Ｉｋ−８、およびＩｋ−７に関するエクソン６およびエ
クソン７間の接合部にわたるｃＤＮＡシークエンスとこれに対応して誘導される
アミノ酸シークエンスを図示している。

【図９Ａ〜９Ｂ】 図９Ａおよび９Ｂは、イカロスｃＤＮＡにおける一塩基多型を示し、正常およ
び異常なイカロスアイソフォームの２対立遺伝子性の発現を表している。図９Ａ
は、イカロスｃＤＮＡの模式図である。ジンクフィンガーをＦ１〜Ｆ６で表し、
イカロスエクソンをＥ１〜Ｅ７で表し、ＰＣＲプライマー（矢印）をＦ１、Ｆ２
（進行方向）およびＲ１、Ｒ２（逆行方向）で表した。二連活性化ドメインにお
ける一塩基多型部位（１００２位置のＣまたはＡ）の位置も図示されている。図
９Ｂは、ＮＡＩＬ−６Ｂ株化細胞ＡＬＬ細胞における７個のＲＴ−ＰＣＲクロー
ンの一塩基多型部位全体に対するシークエンスデータを示している。１００２位
置におけるＡまたはＣの何れかに下線を付している。２個のＩｋ４（非ＤＮＡ結
合性アイソフォーム［ＷＴ］）クローン、１個のＩｋ４＋欠失（非ＤＮＡ結合性
アイソフォーム（ΔKSSMPQKFLG））クローン、２個のＩｋ２＋欠失（ＤＮＡ結合
性アイソフォーム［ＷＴ］）クローン、および２個のＩｋ２＋欠失（ＤＮＡ結合
性アイソフォーム（ΔKSSMPQKFLG）クローンにおけるタイプ分けの結果とｃＤＮ
Ａシークエンスの結果とを図示している。また、これに対応して誘導されるアミ
ノ酸シークエンスも図示している。

【図１０Ａ〜１０Ｅ】 図１０Ａ〜１０Ｅは、実施例４に記載のように、エクソン６／７のスプライシ
ング接合部を覆っているシークエンスを判定するために用いられたＰＣＲ産物を
明らかにする臭化エチジウムによって染色した代表的なゲルの写真である。図１
０Ａは、エクソン６の供与部位領域を増幅して生成した、ネステッドＰＣＲ産物
を示している。図１０Ｂは、エクソン７のスプライシング受容部位（slice acce
ptor site）を取り囲むネステッドＰＣＲ産物を示している。図１０Ｃは、プラ
イマーセットＰ１ａおよびＰ４、またはＰ１ｂおよびＰ４を用いて得た、エクソ
ン６の供与部位のゲノムＰＣＲ増幅産物を示している。図１０Ｄは、対照用細胞
および原発性白血病細胞より得たエクソン６供与部位に関するゲノムＰＣＲ増幅
産物を示している。図１０Ｅは、対照用細胞および患者の原発性白血病細胞より
得たエクソン７の受容部位に関するゲノムＰＣＲ増幅産物を示している。陰性対
照例（Ｎｅｇ．Ｃｏｎ．）は、鋳型（ライブラリダイジェストまたはゲノムＤＮ
Ａサンプル）を用いない複製反応物であった。陽性対照例（Ｐｏｓ．Ｃｏｎ）は
、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、１．５ｋｂの予測バンドを有
するネステッドプライマーセット、ＡＰ２およびＰＣＰ２であった。

【図１１Ａ〜１１Ｂ】 図１１Ａ〜１１Ｂは、エクソン６に欠失を発現している白血病患者におけるイ
カロスエクソン６のスプライシング供与部位のゲノムシークエンスを示している
。図１１Ａは、エクソン６のスプライシング供与部位を取り囲み、エクソン６お
よび７間をつなぐイントロン内のＥｃｏＲＶ部位で終止する野生型シークエンス
を示している。このシークエンスの判定に使用するＰＣＲプライマーに位置も図
示している。コードシーケンスは大文字で、イントロンシークエンスは小文字で
示している。２個の選択的スプライシング供与部位（供与部位１および供与部位
２）を図示している。図１１Ｂは、対照用ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球株化細胞
（ＬＣＬ）と、２個のＴ細胞ＡＬＬ株化細胞であるジャーカットとＭｏｌｔ−３
、および２名のＡＬＬ患者であるＵＰＮ１とＵＰＮ２より得た白血病細胞におけ
るイカロスエクソン６の供与部位のシークエンスアラインメントと同一度を示し
ている。

【図１２Ａ〜１２Ｂ】 図１２Ａ〜１２Ｂは、エクソン６に３０塩基対の欠失が見られる異常型イカロ
スアイソフォームを発現している白血病細胞における、イカロスエクソン６〜７
のスプライシング受容部位のゲノムシークエンスを示している。図１２Ａは、エ
クソン６のスプライシング供与部位を取り囲み、重複するＤｒａＩおよびＳｓｐ
Ｉの部位で終止する野生型シークエンスを示している。このシークエンスの判定
に使用するＰＣＲプライマー（Ｐ５、Ｐ６、およびＰ７）の位置を図示している
。コードシーケンスを大文字で、非コードシークエンスを小文字で示している。
図１２Ｂは、対照用ＥＶＢ形質転換Ｂリンパ芽球株化細胞ＬＣＬ、２個のＴ細胞
ＡＬＬ株化細胞であるジャーカットとＭｏｌｔ−３、および２名のＡＬＬ患者で
あるＵＰＮ１とＵＰＮ２の白血病細胞におけるエクソン６〜７のスプライシング
受容部位のシークエンスアラインメントと同一度を示している。 SEQUENCE LISTING <110> Parker Hughes Institute <120> IKAROS ISOFORMS AND MUTANTS <130> 12152.35WO02 <140> PCT/US99/26274 <141> 1999-11-05 <150> 60/107,229 <151> 1998-11-05 <150> 09/435,327 <151> 1999-11-05 <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gggaat 6 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tcagcttttg ggaataccct gtca 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tcagcttttg ggggtaccct gtca 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggatgctg acgagggtca agac 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ttagctcatg tggaagcggt gctc 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ctcatcaggg aaggaaagcc 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggtgtacatg acgtgatcca gg 22 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ttcagcggcc agtagcatct gactt 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tgtgattata gcctaagacc cggag 25 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gttacatatg gggctgatga ctttagggat ttccatgcaa taattcccaa atctttctct 60 cga 63 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Val Thr Tyr Gly Ala Asp Asp Phe Arg Asp Phe His Ala Ile Ile Pro 1 5 10 15 Lys Ser Phe Ser Arg 20 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 taagagctct atgcctcaga aatttcttgg 30 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Lys Ser Ser Met Pro Gln Lys Phe Leu Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 taatcacagt gaatggcaga agacctg 27 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ggcagaagac ctgtgcaaga taggatca 28 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 agcgggcgca gggactc 17 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gactcggccc ccaggtagtt g 21 <210> 18 <211> 3629 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gaattccggc gtcgcggacg catcccagtc tgggcgggac gctcggccgc ggcgaggcgg 60 gcaagcctgg cagggcagag ggagccccgg ctccgaggtt gctcttcgcc cccgaggatc 120 agtcttggcc ccaaagcgcg acgcacaaat ccacataacc tgaggaccat ggatgctgat 180 gagggtcaag acatgtccca agtttcaggg aaggaaagcc cccctgtaag cgatactcca 240 gatgagggcg atgagcccat gccgatcccc gaggacctct ccaccacctc gggaggacag 300 caaagctcca agagtgacag agtcgtggcc agtaatgtta aagtagagac tcagagtgat 360 gaagagaatg ggcgtgcctg tgaaatgaat ggggaagaat gtgcggagga tttacgaatg 420 cttgatgcct cgggagagaa aatgaatggc tcccacaggg accaaggcag ctcggctttg 480 tcgggagttg gaggcattcg acttcctaac ggaaaactaa agtgtgatat ctgtgggatc 540 atttgcatcg ggcccaatgt gctcatggtt cacaaaagaa gccacactgg agaacggccc 600 ttccagtgca atcagtgcgg ggcctcattc acccagaagg gcaacctgct ccggcacatc 660 aagctgcatt ccggggagaa gcccttcaaa tgccacctct gcaactacgc ctgccgccgg 720 agggacgccc tcactggcca cctgaggacg cactccgttg gtaaacctca caaatgtgga 780 tattgtggcc gaagctataa acagcgaagc tctttagagg aacataaaga gcgctgccac 840 aactacttgg aaagcatggg ccttccgggc acactgtacc cagtcattaa agaagaaact 900 aatcacagtg aaatggcaga agacctgtgc aagataggat cagagagatc 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cttctcgctc 1800 ccgccagcag catagactgg actggaccag acaatgttgt gtttggattt gtaactgttt 1860 tttgtttttt gtttgagttg gttgattggg gtttgatttg cttttgaaaa gatttttatt 1920 tttagaggca gggctgcatt gggagcatcc agaactgcta ccttcctaga tgtttcccca 1980 gacgctggct gagattccct cacctgtcgc ttcctagaat ccccttctcc aaacgattag 2040 tctaaatttt cagagagaaa tagataaaac acgccacagc ctgggaagga gcgtgctcta 2100 ccctgtgcta agcacggggt tcgcgcacca ggtgtctttt tccagtcccc agaagcagag 2160 agcacagccc ctgctgtgtg ggtctgcagg tgagcagaca ggacaggtgt gccgccaccc 2220 aagtgccaag acacagcagg gccaacaacc tgtgcccagg ccagcttcga gctacatgca 2280 tctagggcgg agaggctgca cttgtgagag aaaatactta tttcaagtca tattctgcgg 2340 taggaaaatg attgggttgg ggaaagtcgg tgtctgtcag actgccctgg gtggagggag 2400 acgccgggtt agagcctttg ggatcgtcct ggattcactg gcttggggga ggctgttcag 2460 atggcctgag cctcccgagg cttgctgccc cgtaggagga gactgtcttc ccgtgggcat 2520 atctggggag ccctgttccc cgctttttca ctcccatacc tttaatggcc cccaaaatct 2580 gtcactacaa tttaaacacc agtcccgaaa tttggatctt ctttcttttt gaatctctca 2640 aacggcaaca ttcctcagaa accaaagctt tatttcaaat ctcttccttc cctggctggt 2700 tccatctagt accagaggcc tcttttcctg aagaaatcca atcctagccc tcattttaat 2760 tatgtacatc tgtttgtagc cacaagcctg aatttctcag tgttggtaag tttctttacc 2820 taccctcact atatattatt ctcgttttaa aacccataaa ggagtgattt agaacatcat 2880 taattttcca actcaatgaa aatatgtgaa gcccagcatc tctgttgcta acacacagag 2940 ctcacctgtt gaaacccaag ctttcaaaca tgttgaagct ctttactgta aaggcaagcc 3000 agcatgtgtg tccacacata cataggatgg ctggctctgc acctgtagga tattggaatg 3060 cacagggcaa ttgagggnct gagccagacc ttcggagagt aatgccacca gatcccctag 3120 gaaagaggag gcaaatggca ctgcaggtga gaaccccgcc catccgtgct atgacatgga 3180 ggcactgaag cccgaggaag gtgtgtggag attctaatcc caacaagcaa gggtctcctt 3240 caagattaat gctatcaatc attaaggtca ttactctcaa ccacctaggc aatgaagaat 3300 ataccatttc aaatatttac agtacttgtc ttcaccaaca ctgtcccaag gtgaaatgaa 3360 gcaacagaga ggaaattgta cataagtacc tcagcattta atccaaacag gggttcttag 3420 tctcagcact atgacatttt gggctgacta cttatttgtt aggcgggagc tctcctgtgc 3480 attgtaggat aattagcagt atccctggtg gctacccaat agacgccagt agcaccccga 3540 attgacaacc caaactctcc agacatcacc aactgtcccc tgcgaggaga aatcactcct 3600 gggggagaac cactgaccca aatgaattc 3629 <210> 19 <211> 1788 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 agtgatttag agtgcagtgt ctggtatagg tgtgtattct tcccttttcg gtctatgttc 60 tctcatttgt attgtgtggg gagaagtgac tttttttata aaaagaaaaa ggtatatgca 120 tcccagcaga gaagcactgg ctccacccag tacctgcctc ctcatgccac cctctcaagc 180 caaaagccgg gggaagccca ggcaccttga ccatgaccgc ccgagactca cacttctatg 240 gatgctgacg agggtcaaga catgtctttc tcatcaggga aggaaagccc ccctgtaagc 300 gatactccag atgagggcga tgagcccatg ccgatccccg aggacctctc caccacctcg 360 ggaggacagc aaagctccaa gagtgacaga gtcgtggcca gtaatgttaa agtagagact 420 cagagtgatg aagagaatgg gcgtgcctgt gaaatgaatg gggaagaatg tgcggaggat 480 ttacgaatgc ttgatgcctc gggagagaaa atgaatggct cccacaggga ccaaggcagc 540 tcggctttgt cgggagttgg aggcattcga cttcctaacg gaaaactaaa gtgtgatatc 600 tgtgggatca tttgcatcgg gcccaatgtg ctcatggttc acaaaagaag ccacactgga 660 gaacggccct tccagtgcaa tcagtgcggg gcctcattca cccagaaggg caacctgctc 720 cggcacatca agctgcattc cggggagaag cccttcaaat gccacctctg caactacgcc 780 tgccgccgga gggacgccct cactggccac ctgaggacgc actccgttgg taaacctcac 840 aaatgtggat attgtggccg aagctataaa cagcgaacgt ctttagagga acataaagag 900 cgctgccaca actacttgga aagcatgggc cttccgggca cactgtaccc agtcattaaa 960 gaagaaacta agcacagtga aatggcagaa gacctgtgca agataggatc agagagatct 1020 ctcgtgctgg acagactagc aagtaatgtc gccaaacgta agagctctat gcctcagaaa 1080 tttcttgggg acaagggcct gtccgacacg ccctacgaca gtgccacgta cgagaaggag 1140 aacgaaatga tgaagtccca cgtgatggac caagccatca acaacgccat caactacctg 1200 ggggccgagt ccctgcgccc gctggtgcag acgcccccgg gcggttccga ggtggtcccg 1260 gtcatcagcc cgatgtacca gctgcacagg cgctcggagg gcaccccgcg ctccaaccac 1320 tcggcccagg acagcgccgt ggagtacctg ctgctgctct ccaaggccaa gttggtgccc 1380 tcggagcgcg aggcgtcccc gagcaacagc tgccaagact ccacggacac cgagagcaac 1440 aacgaggagc agcgcagcgg tcttatctac ctgaccaacc acatcgcccg acgcgcgcaa 1500 cgcgtgtcgc tcaaggagga gcaccgcgcc tacgacctgc tgcgcgccgc ctccgagaac 1560 tcgcaggacg cgctccgcgt ggtcagcacc agcggggagc agatgaaggt gtacaagtgc 1620 gaacactgcc gggtgctctt cctggatcac gtcatgtaca ccatccacat gggctgccac 1680 ggcttccgtg atccttttga gtgcaacatg tgcggctacc acagccagga ccggtacgag 1740 ttctcgtcgc acataacgcg aggggagcac cgcttccaca tgagctaa 1788 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 taagcacagt gaaatggcag aagacctg 28 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 atgctgcaaa atcaaatcta ggaaaaac 28 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tttccctttc ttccaccctc aactcat 27 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gtaggtcctg gctcggtgtc cc 22 <210> 24 <211> 467 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 attaaatgaa atacaataac ataattaaac taatctttgg ttcccctatt tatgtattca 60 tttatccaac aaaatctcct taagtgctta taatgggtag gtcctggctc ggtgtcccct 120 agacagacgc atgggccttc ccccagcccg tcagtatggt gcaggtgtga tgtgtccgca 180 ggtgtgtgtg tatgtgtgca ggtgtggggt ccgcaggcgt gctgggcccc caggccgtgt 240 tccccttccc ctccccggtt gtagatttca gctgttgctg ccagacctga ccggttccgg 300 aggtggccgc gccccactca ctgtcgcctg ctttccacag gggacaaggg cctgtccgac 360 acgccctacg acagcagcgc cagctacgag aaggagaacg aaatgatgaa gtcccacgtg 420 atggaccaag ccatcaacaa cgccatcaac tacctggggg ccgagtc 467 <210> 25 <211> 373 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 taagcacagt gaaatggcag aagacctgtg caagatagga tcagagagat ctctcgtgct 60 ggacagacta gcaagtaacg tcgccaaacg taagagctct atgcctcaga aatttcttgg 120 taagagttaa atgtttgctg tctcttaaaa aaaaactatg tgggtgtttt agatgcaagt 180 agaaatgagt tgagggtgga agaaagggaa aaaaatctta ttttttcaaa aggaaaaatt 240 ggtaagctta acattcctta aatatcttag aattttttcc aataagtatc ttaaaaataa 300 caaacctccc atcagttttt cctagatttg attttgcagc atctggggcc tgccctgtga 360 tctgcctgtg gac 373 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ctcgccaaac gggacaaggg cctg 24 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Val Ala Lys Arg Asp Lys Gly Leu 1 5

【手続補正書】

【提出日】平成１３年８月８日（２００１．８．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９２】 ２１例全てにおいて、シークエンス分析は首尾よく行われた。２１名のＡＬＬ
患者のうち、１名（Ｔ−ＡＬＬ患者）の白血病細胞、ならびにＴ−ＡＬＬ株化細
胞のＭＯＬＴ−３とＪＫ−Ｅ６−１とにおいて、エクソン２／エクソン４の接合
部におけるエクソン４のすぐ上流側に６３塩基対が挿入されたことにより、２１ 個のアミノ酸の挿入（エクソン２ａ）が見られる異常型Ｉｋ−２アイソフォーム
（Ｉｋ−２（挿入型））が発現していた（図６）。これらの細胞は、挿入による
突然変異体を単独で、またはエクソン６の３’末端における３０の塩基対が欠失
したことによる、フレーム内の１０個のアミノ酸の欠失を伴って発現していた（
図８Ａ〜８Ｃ、表２）。

【化３】

【化４】 図８Ａ〜８Ｃに示すように、これによって得られる欠失型突然変異体には、下記
の突然変異シークエンスが見られた。

【化５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｍ Ｃ１２Ｎ 15/01 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｘ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/10 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA26 BA14 BB24 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FB02 FB03 FB07 4B024 AA12 BA36 CA04 CA12 HA01 HA19 4B063 QA08 QA19 QQ08 QQ53 QQ58 QQ79 QR32 QR36 QR48 QR62 QR77 QS25 4C084 AA02 AA03 AA13 BA35 CA53 NA14 ZB272 ZC412 4H045 AA10 AA30 BA10 CA41 EA51 FA74

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イカロス（ＩＫＡＲＯＳ）タンパク質の少なくとも一部をコー
   ドし、［SEQ ID NO: 24］、［SEQ ID NO: 25］、［SEQ ID NO: 10］、および［S
   EQ ID NO: 26］の１以上を含む核酸シークエンス。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の核酸シークエンスの発現により生成されるイ
   カロスペプチド。
3. 【請求項３】 リンパ球系細胞（lymphoid cells）の試料を分析し、異常型に
   スプライシングされたイカロスアイソフォームの存在を検出することを含む、異
   常なリンパ系造血細胞（lymphohematopoietic cells）の検出方法。
4. 【請求項４】 前記細胞を分析し、分子量が約４７ｋＤａ未満であるイカロス
   アイソフォームを検出することをさらに含む請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記細胞を分析し、エクソン６〜７に少なくとも部分的にコー
   ドされ、かつ下記のイカロスアミノ酸シークエンスを欠いているイカロスアイソ
   フォームを検出することをさらに含む請求項３に記載の方法： KSSMPQKFLG。
6. 【請求項６】 前記細胞を分析し、下記のアミノ酸シークエンスが挿入された
   イカロスアイソフォームを検出することをさらに含む請求項３に記載の方法： VTVGADDFRDFHAIIPKSFSR。
7. 【請求項７】 前記リンパ系造血細胞が悪性細胞である請求項３に記載の方法
   。
8. 【請求項８】 前記分析がウエスタンブロット検出であり、約４２ｋＤａ未満
   の小型アイソフォームが多数存在することをリンパ系造血細胞異常と診断する請
   求項３に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記分析が共焦光顕微鏡法（confocal light microscopy）で
   あり、イカロスタンパク質が散在した状態で細胞質内に局在していることをリン
   パ系造血細胞異常と診断する請求項３に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記細胞を分析してイカロスアイソフォームの発現を検出し
    、ドミナントネガティブなアイソフォームが多数存在することをリンパ系造血細
    胞異常と診断する請求項３に記載の方法。
11. 【請求項１１】 イカロスアイソフォームＩｋ−４、Ｉｋ−６、Ｉｋ−７、Ｉ
    ｋ−８、またはこれらの組合せの発現をリンパ系造血細胞異常と関連付ける請求
    項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記分析に、イカロスをコードするシークエンスを増幅する
    ことが含まれる請求項３に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記分析に、抗イカロス抗体と免疫反応させることが含まれ
    る請求項３に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記異常が白血病またはリンパ腫である請求項３に記載の方
    法。
15. 【請求項１５】 血液系悪性腫瘍（hematologic malignancy）を検出する方法 であって、 血液系細胞試料を分析してイカロスタンパク質アイソフォームの発現を検出す
    ることと、 ドミナントネガティブなイカロスアイソフォームの発現を血液系悪性腫瘍と関
    連付けることとを含む方法。
16. 【請求項１６】 前記悪性腫瘍がリンパ腫である請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記悪性腫瘍が非ホジキンリンパ腫である請求項１５に記載
    の方法。
18. 【請求項１８】 前記悪性腫瘍がホジキンリンパ腫である請求項１５に記載の
    方法。
19. 【請求項１９】 前記悪性腫瘍が一般的なＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、乳児ＡＬＬ、
    またはＡＭＬのいずれかである請求項１５に記載の方法。
20. 【請求項２０】 血液系悪性腫瘍を治療する方法であって、Ｉｋ−１またはＩ ｋ−２を血液系細胞中に量を増加させて発現させることを含み、前記発現が非 処理の対照例と比べて増加している方法。
21. 【請求項２１】 癌細胞の診断方法であって、細胞試料を分析して非ＤＮＡ結
    合性イカロスタンパク質アイソフォームを検出することと、 ドミナントネガティブなイカロスアイソフォームの発現を血液系悪性腫瘍と関
    連付けることを含む方法。