WO2003025176A2 - Sequences impliquees dans les phenomenes de suppression tumorale, reversion tumorale, apoptose et/ou resistance aux virus et leur utilisation comme medicaments - Google Patents

Sequences impliquees dans les phenomenes de suppression tumorale, reversion tumorale, apoptose et/ou resistance aux virus et leur utilisation comme medicaments Download PDF

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WO2003025176A2
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Adam Telerman
Robert Amson
Marius Tuijnder
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Molecular Engines Laboratories
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Definitions

  • the present invention relates to the detection of genes involved in the molecular pathways of tumor suppression, tumor reversion, apoptosis and / or resistance to viruses.
  • the present invention has been made possible by the isolation of cDNAs corresponding to messenger RNAs expressed or repressed during tumor suppression, tumor reversion and / or during the process of apoptosis.
  • MPSS Massively Parallel Signature Sequencing
  • the Inventors made the assumptions following: if it was possible to select, from a tumor which is sensitive to the cytopathic effect of parvovirus H1, cells which were resistant, then this resistance could be due to a change in their malignant phenotype. At the molecular level, it has been observed that this suppression of the malignant phenotype goes hand in hand with activation of the expression of the p2j afi gene and this ⁇ j nc ⁇ independently of the expression of the p53 gene.
  • sequences are sequences whose function is known because they are involved in the process of suppression of the malignant phenotype, tumor reversion, apoptosis and / or in resistance to viruses.
  • Tumor reversion is distinguished from tumor suppression by the fact that it encompasses a broader domain than that of tumor suppressor genes.
  • tumor reversion is achieved by the use of metabolic and / or molecular pathways not limited to the metabolic and molecular pathways in which the tumor suppressor genes are involved.
  • the present invention relates in particular to new sequences as well as the use of these sequences in matters of diagnosis and for the implementation of methods for screening for compounds to be tested.
  • the invention also relates to methods for detecting and / or assaying the sequences of the invention or their expression product (s) in a biological sample.
  • the present invention relates first of all to an isolated nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence chosen from the group comprising: a) SEQ ID N ° 1 to SEQ ID N ° 6053, preferably SEQ ID N ° 1885 (Mus musculus septin 2 (Sept2 )), b) a nucleotide sequence of at least 15 consecutive nucleotides of a sequence as defined in a), c) a nucleotide sequence having a percentage identity of at least 80%, after optimal alignment, with a sequence defined in a) or b), d) a nucleotide sequence hybridizing under high stringency conditions with a sequence defined in a) or b), and e) a complementary nucleotide sequence where the RNA sequence corresponding to a sequence such as defined in a), b), c) or d).
  • a nucleotide sequence chosen from the group comprising: a) SEQ ID N ° 1 to SEQ ID
  • nucleotide sequence according to the invention defined in c) has a percentage identity of at least 80% after optimal alignment with a sequence as defined in a) or b) above, preferably at least 90% , most preferably at least 98%.
  • nucleotide sequence, nucleic acid, nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, terms which will be used interchangeably in the present description is intended to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or region of a nucleic acid, which may or may not contain unnatural nucleotides, and which may correspond to both double-stranded DNA, single-stranded DNA and transcripts of said DNAs.
  • the nucleic acid sequences according to the invention also include PNA (Peptid Nucleic Acid), or the like.
  • the fragments of the nucleotide sequences of the invention comprise at least 15 consecutive nucleotides. Preferably, they comprise at least 20 consecutive nucleotides and even more preferably, they comprise at least 30 consecutive nucleotides.
  • nucleotide sequences in their natural chromosomal environment that is, ie in its natural state.
  • sequences which have been isolated and / or purified that is to say that they have been taken directly or indirectly, for example by copying, their environment having been at least partially modified.
  • This also means the nucleic acids obtained by chemical synthesis.
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • the term “best alignment” or “optimal alignment” is intended to denote the alignment for which the percentage of identity determined as below is the highest. Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window" to identify and compare the regions. sequence similarity locale.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out, besides manually, by means of the algorithm of local homology of Smith and Waterman (1981), by means of the algorithm of local homology of Neddleman and Wunsch (1970 ), using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988), using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
  • the BLAST program is preferably used with the BLOSUM 62 matrix.
  • the PAM or PAM250 matrices can also be used.
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two aligned sequences of optimally, the nucleic acid or amino acid sequence to be compared may include additions or deletions with respect to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions compared and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • nucleic acid sequences having a percentage identity of at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 98%, after optimal alignment with a reference sequence is meant the sequences nucleic acids exhibiting, with respect to the reference nucleic acid sequence, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion, and / or a substitution, in particular pointwise, and whose nucleic sequence has at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 98%, of identity after optimal alignment with the reference nucleic sequence.
  • the specific hybridization or high stringency conditions will be such that they ensure at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 98% of identity after optimal alignment between one of the two sequences and the complementary sequence of the other.
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two fragments of complementary nucleic acids.
  • high stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the nucleotide sequences described above are advantageously as follows.
  • DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two stages: (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) actual hybridization for 20 hours at a temperature depending on the size of the probe (ie: 42 ° C, for a probe of size> 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 ° C in 2 x SSC + 2% SDS, 1 wash for 20 minutes at 20 ° C in 0.1 x SSC + 0.1% SDS.
  • the last washing is carried out in 0.1 ⁇ SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C. for a probe of size> 100 nucleotides.
  • the conditions of high stringency hybridization described above for a polynucleotide of defined size can be adapted by the skilled person for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook et al., 1989 .
  • nucleotide sequences having a percentage identity of at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 98%, after optimal alignment with the sequences according to the invention it is preferred also the nucleic sequences variants of the sequences of the invention, or of their fragments, that is to say all of the nucleic sequences corresponding to allelic variants, that is to say individual variations of the sequences of l 'invention.
  • variant nucleotide sequence is meant any RNA or cDNA resulting from a mutation and / or variation of a splicing site of the genomic DNA corresponding to the nucleotide sequences of the invention.
  • the present invention also relates to a polypeptide encoded by a nucleotide sequence in accordance with the invention.
  • polypeptide is meant, within the meaning of the present invention, indifferently designated proteins or peptides.
  • the polypeptides in accordance with the invention comprise a polypeptide chosen from: a) a polypeptide encoded by a nucleotide sequence in accordance with the invention, b) a polypeptide having at least 80% identity with a polypeptide as defined in a), c) a fragment of at least 5 amino acids of a polypeptide as defined in a) or b), d) a biologically active fragment of a polypeptide as defined in a), b) or c), and e) a modified polypeptide of a polypeptide as defined in a ), b), c) or d).
  • polypeptide whose amino acid sequence has a percentage identity of at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 98% after optimal alignment with a reference sequence, intends to designate the polypeptides having certain modifications compared to the reference polypeptide, such as in particular, one or more deletion (s), truncation (s), an extension, a chimeric fusion and / or one or more substitution (s).
  • the variant polypeptides encoded by the variant nucleotide sequences as defined above are preferred, in particular the polypeptides whose amino acid sequence has at least a mutation corresponding in particular to a truncation, deletion, substitution and / or addition of at least one residue with respect to the polypeptide sequences of the invention or with one of their fragments.
  • the present invention also relates to a cell cloning and / or expression vector characterized in that it comprises a nucleotide sequence according to the invention or that it codes for a polypeptide according to the invention.
  • a vector can also contain the elements necessary for the expression and optionally for the secretion of the polypeptide in a host cell.
  • a host cell is also an object of the present invention.
  • Vectors comprising promoter and / or regulatory sequences are also part of the present invention.
  • Said vectors preferably comprise a promoter, translation initiation and termination signals, as well as the appropriate regions for regulating transcription. They must be able to be maintained in a stable manner in the cell and can also have specific signals such as to allow the secretion of the translated protein.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host or integrative vectors of the chosen host.
  • plasmid or viral type systems are preferably used depending on the host cell, the viral vectors possibly being in particular adenoviruses (5), retroviruses, lentiviruses, poxviruses or herpesviruses. (5a). Those skilled in the art know the technologies that can be used for each of these systems.
  • the vectors according to the invention comprise a sequence ensuring targeting and / or specific tissue expression.
  • a sequence ensuring targeting and / or specific tissue expression.
  • viruses are, for example, retroviruses (6), or AANs (7).
  • naked polynucleotides such as naked DNA or naked RNA are preferred according to the technique developed by the company VICAL, artificial bacteria chromosomes (BAC, bacterial artificial chromosome), artificial yeast chromosomes (YAC, yeast artificial chromosome) for expression in yeast, mouse artificial chromosomes (MAC) for expression in murine cells and preferably human artificial chromosomes (HAC, hu an artificial chromosome) for expression in human cells.
  • VICAL artificial bacteria chromosomes
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • MAC mouse artificial chromosomes
  • HAC human artificial chromosomes
  • Such vectors are prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as, for example, lipofection, electroporation, heat shock, transformation after chemical permeabilization of the membrane, cell fusion.
  • the invention further comprises the host cells, in particular the eukaryotic and prokaryotic cells, transfected by the vectors according to the invention as well as the transgenic animals, preferably mammals, except humans, comprising one of said cells transformed according to the invention .
  • These animals can be used as models, for the study of the etiology of inflammatory and / or immune diseases, and in particular of inflammatory diseases of the digestive tract, or for the study of cancers.
  • bacterial cells Among the cells which can be used for the purposes of the present invention, mention may be made of bacterial cells (8), but also yeast cells (9), as well as animal cells, in particular mammalian cell cultures (10), including Chinese hamster ovary (CHO) cells. Mention may also be made of insect cells in which methods can be used, for example using baculoviruses (11).
  • a preferred cellular host for the expression of the proteins of the invention consists of COS cells.
  • mammals according to the invention animals such as rodents, in particular mice, rats or rabbits, which express a polypeptide according to the invention, are preferred.
  • transgenic animals are obtained for example by homologous recombination on embryonic stem cells, transfer of these stem cells to embryos, selection of the affected chimeras at the level of the reproductive lines, and growth of said chimeras.
  • transgenic animals according to the invention can thus overexpress the gene coding for the protein according to the invention, or their homologous gene, or express said gene into which a mutation is introduced.
  • transgenic animals in particular mice, are obtained for example by transfection of a copy of this gene under the control of a strong promoter of ubiquitous nature, or selective for a type of tissue, or after viral transcription.
  • the cells and mammals according to the invention can be used in a method for producing a polypeptide according to the invention, as described below, and can also be used as an analysis model.
  • the transformed cells or mammals as described above can also be used as models in order to study the interactions between the polypeptides according to the invention, and the chemical or protein compounds, involved directly or indirectly in the activities of the polypeptides according to the invention, this in order to study the different mechanisms and interactions involved.
  • polypeptides according to the invention can in particular be used for the selection of products interacting with the polypeptides according to the invention, or their, as a cofactor, or an inhibitor, in particular a competitive one, or else having an agonist or antagonist activity of the activity of the polypeptides according to the invention.
  • said transformed cells or transgenic animals are used as a model, in particular for the selection of products making it possible to combat pathologies linked to an abnormal expression of this gene.
  • a subject of the present invention is also a monoclonal or polyclonal antibody, a fragment of this antibody or a chimeric antibody capable of specifically recognizing a polypeptide in accordance with the present invention.
  • the specific monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of culture of hybridomas well known to those skilled in the art.
  • the antibodies according to the invention are for example humanized antibodies, Fab or F (ab ') 2 fragments. They can also be presented with labeled immunoconjugates or antibodies in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the antibodies according to the invention but also the immunoconjugates are therefore capable of specifically recognizing a polypeptide according to the present invention.
  • the specific polyclonal antibodies can be obtained from the serum of an animal immunized against the polypeptides of the invention, in particular produced by genetic recombination or by peptide synthesis, according to the usual procedures.
  • a subject of the invention is also the use of a nucleotide sequence in accordance with the present invention as a probe or primer for the detection, identification, assay and / or amplification of nucleic acid sequences.
  • the nucleotide sequences which can be used as probe or as primer in methods of detection, identification, assay and / or amplification of nucleic acid sequence have a minimum size of 15 bases, preferably 20 bases, or better 25 to 30 bases.
  • the probes and primers according to the invention can be labeled directly or indirectly with a radioactive or non-radioactive compound by methods well known to those skilled in the art, in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the unlabeled nucleic acid sequences according to the invention can be used directly as a probe or primer.
  • sequences are generally marked to obtain sequences which can be used for numerous applications.
  • the labeling of the primers or probes according to the invention is carried out with radioactive elements or with non-radioactive molecules.
  • Non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemoluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
  • the nucleotide sequences according to the invention can thus be used as a primer and / or probe in methods using in particular the PCR technique (polymerase chain reaction) (1 Ibis).
  • This technique requires the choice of pairs of ohgonucleotide primers framing the fragment which must be amplified.
  • the amplified fragments can be identified, for example after agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography, and then sequenced.
  • the specificity of the amplification can be controlled by using as primers the nucleotide sequences of the invention and as templates, plasmids containing these sequences or even the amplification products derived therefrom.
  • the amplified nucleotide fragments can be used as reagents in hybridization reactions in order to set up evidence of the presence, in a biological sample, of a target nucleic acid of sequence complementary to that of said amplified nucleotide fragments.
  • the invention also relates to the nucleic acids capable of being obtained by amplification using primers according to the invention.
  • Other techniques for amplifying the target nucleic acid can advantageously be used as an alternative to PCR (PCR-like) using pairs of primers of nucleotide sequences according to the invention.
  • PCR-like is meant to denote all the methods implementing direct or indirect reproductions of the nucleic acid sequences, or in which the labeling systems have been amplified, these techniques are of course known. In general it is the amplification of DNA by a polymerase; when the original sample is an RNA, a reverse transcription should be carried out beforehand.
  • the target polynucleotide to be detected is an mRNA
  • the cDNA obtained will then serve as a target for the primers or probes used in the amplification or detection method according to the invention.
  • the probe hybridization technique can be performed in various ways (20).
  • the most general method consists in immobilizing the nucleic acid extracted from cells of different tissues or cells in culture on a support (such as nitrocellulose, nylon, polystyrene) and incubating, under well defined conditions, the target nucleic acid immobilized with the probe. After hybridization, the excess probe is eliminated and the hybrid molecules formed are detected by the appropriate method (measurement of radioactivity, fluorescence or enzymatic activity linked to the probe).
  • the latter can be used as capture probes.
  • a probe called a “capture probe”
  • a probe is immobilized on a support and is used to capture by specific hybridization the target nucleic acid obtained from the biological sample to be tested and the target nucleic acid is then detected.
  • a second probe called a “detection probe”, marked by an easily detectable element.
  • nucleotide sequences according to the invention may moreover be of interest when they are used as antisense nucleotides, that is to say whose structure ensures, by hybridization with the target sequence, an inhibition of expression of the corresponding product. They can also be used as sense nucleotides which, by interaction with proteins involved in the regulation of the expression of the corresponding product, will induce either an inhibition or an activation of this expression.
  • a subject of the invention is also the use of a nucleotide sequence according to the present invention for the production or the synthesis of a recombinant polypeptide.
  • the method for producing a polypeptide of the invention in recombinant form, itself included in the present invention is characterized in that the transfected cells, in particular the cells or mammals of the present invention, are cultivated in conditions allowing the expression of a recombinant polypeptide encoded by a nucleotide sequence according to the invention, and that said recombinant polypeptide is recovered.
  • Recombinant polypeptides characterized in that they are capable of being obtained by said production method, also form part of the invention.
  • the recombinant polypeptides obtained as indicated above can be both in glycosylated and non-glycosylated form and may or may not have the natural tertiary structure.
  • sequences of the recombinant polypeptides can also be modified in order to improve their solubility, in particular in aqueous solvents. Such modifications are known to those skilled in the art, such as the deletion of hydrophobic domains or the substitution of hydrophobic amino acids with hydrophilic amino acids.
  • polypeptides can be produced from the nucleic acid sequences defined above, according to the techniques for producing recombinant polypeptides known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid sequence used is placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • An efficient system for producing a recombinant polypeptide requires having a vector and a host cell according to the invention. These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • the methods used for the purification of a recombinant polypeptide are known to those skilled in the art.
  • the recombinant polypeptide can be purified from lysates and cell extracts, from the culture medium supernatant, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using '' specific monoclonal or polyclonal antibodies, etc.
  • polypeptides according to the present invention can also be obtained by chemical synthesis using one of the many known peptide syntheses, for example techniques using solid phases (21) or techniques using partial solid phases, by condensation of fragments or by a synthesis in conventional solution.
  • polypeptides obtained by chemical synthesis and which may contain corresponding unnatural amino acids are also included in the invention.
  • the present invention also relates to a DNA chip characterized in that it contains at least one nucleotide sequence in accordance with the present invention.
  • nucleotide sequences according to the invention which it is intended to use as a probe or primer for the detection, identification, assay and or amplification of nucleic acid sequences can be immobilized on a support, covalently or non-covalently, this support being a DNA chip or a high density filter.
  • DNA chip or "high density filter” means a support on which DNA sequences are fixed, each of which can be identified by its geographic location. These chips or filters differ mainly in their size, the material of the support, and possibly the number of sequences attached to them. 77
  • a synthesis can be carried out in situ by photochemical addressing or by ink jet.
  • Other techniques consist in carrying out an ex situ synthesis and in fixing the probes on the support of the DNA chip by mechanical, electronic or inkjet training. These different methods are well known to those skilled in the art.
  • the invention also relates to a protein chip comprising a polypeptide or an antibody according to the invention.
  • Such a protein chip allows the study of interactions between the polypeptides according to the invention and other proteins or chemical compounds and can thus be useful for the screening of compounds interacting with the polypeptides according to the invention.
  • the protein chips according to the invention can detect the presence of antibodies directed against the polypeptides according to the invention in the serum of patients to be tested. It is also possible to use a protein chip comprising an antibody according to the invention for this time detecting the presence of polypeptides in the serum of patients capable of being recognized by said antibody.
  • the present invention also relates to the use of a compound chosen from a nucleotide sequence, a polypeptide, a vector, a cell or an antibody according to the invention for the preparation of a medicament.
  • the pathologies more specifically targeted are viral diseases and diseases characterized by the development of tumor cells or cellular degeneration such as Alzheimer's disease or schizophrenia.
  • the above drug is intended for the prevention and / or treatment of these diseases.
  • the disease targeted is cancer.
  • One of the advantages of the present invention is that it has demonstrated the involvement of a large number of nucleotide sequences in the phenomena of tumor suppression, tumor reversion, apoptosis and / or viral resistance. These sequences are therefore expressed differently when one of these aforementioned processes is started. Consequently, in the presence of a patient whose initiation of one of these processes is suspected or for whom one wishes to verify the absence of such an initiation, it is useful to be able to determine, even to quantify, the expression of one or more sequence (s) in accordance with the invention from a biological sample from said patient.
  • the analysis of the expression of one or more of said sequences can be accompanied by a comparison with a reference expression level corresponding to that of a healthy individual.
  • the invention therefore also includes a method for the diagnosis and / or prognostic evaluation of a viral disease or characterized by tumor development or cell degeneration comprising the analysis of the expression of at least one sequence of the invention from a biological sample from a patient to be tested.
  • said method comprises the following steps: isolation of the messenger RNA from a biological sample from a patient to be tested,
  • amplification of a portion of complementary DNA corresponding to at least one sequence of the invention and detection of the complementary DNA possibly amplified.
  • the analysis of the expression of the sequence can be carried out by means of a DNA chip as described above.
  • the present invention also relates to a screening method of compounds capable of binding to a peptide in accordance with the invention and comprising the following steps:
  • a method for screening for compounds may also be advantageous in relation to compounds capable of interacting with a nucleotide sequence according to the invention, or even with the sequences necessary for the expression or regulation of these sequences. Indeed, the compounds are capable of interacting with said sequences with the effect of reducing, inhibiting or on the contrary potentiating the expression of the sequences in question.
  • Such a method comprises the following steps: contacting a nucleotide sequence or a cell according to the invention with a candidate compound, and
  • Such a detection and / or assay method comprises the following steps: bringing a labeled nucleotide sequence according to the invention into contact with the biological sample to be tested, under the conditions necessary for the formation of a hybrid, and
  • This method can also comprise a step of amplifying the nucleic acid of said biological sample using primers chosen from the nucleotide sequences according to the invention.
  • this process can be carried out by means of the chip
  • a reagent kit comprising: a) a nucleotide sequence according to the invention used as a probe, b) the reagents necessary for the implementation of a hybridization reaction between said probe and the nucleic acid of the biological sample, c) the reagents necessary for the detection and / or the assay of the hybrid formed between said probe and the nucleic acid of the biological sample.
  • a kit can also contain positive or negative controls to ensure the quality of the results obtained.
  • this process can be carried out by means of the protein chip as described above.
  • a reagent kit comprising: a) a monoclonal or polyclonal antibody according to the invention; b) optionally reagents for constituting a medium suitable for the antigen / antibody reaction; c) reagents for detecting the antigen / antibody complex.
  • the subject of the present invention is also a computer-readable medium or a computer medium on which are recorded at least one nucleotide sequence according to claim 1 and / or at least one polypeptide sequence as defined in claim 3 or 4.
  • this medium is chosen from the group comprising: a) a floppy disk, b) a hard disk, c) a random access memory (RAM), d) a read only memory (ROM), e) a CD-ROM.

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Abstract

La présente invention concerne notamment de nouvelles séquences impliquées dans les voies moléculaires de la suppression tumorale, la réversion tumorale, l'apoptose et/ou la résistance aux virus. Elle concerne également l'utilisation de ces séquences ou le traitement contre le cancer, maladies virales, maladies neurodégénératives ainsi qu'en matière de diagnostique ainsi que pour la mise en oeuvre de procédés de criblage de composés à tester. Cette invention a également pour objet des procédés de détection et/ou de dosage des séquences de l'invention ou de leurs produits d'expression dans un prélèvement biologique.

Description

SEQUENCES IMPLIQUEES DANS LES PHENOMENES
DE SUPPRESSION TUMORALE, REVERSION TUMORALE,
APOPTOSE ET/OU RESISTANCE AUX VIRUS ET
LEUR UTILISATION COMME MEDICAMENTS
La présente invention concerne la mise en évidence de gènes impliqués dans les voies moléculaires de la suppression tumorale, la réversion tumorale, l'apoptose et/ou de la résistance aux virus. La présente invention a été rendue possible par l'isolement d'ADNc correspondant à des ARN messagers exprimés ou réprimés lors de la suppression tumorale, de la réversion tumorale et/ou lors du processus d'apoptose.
Afin d'isoler les gènes activés ou inhibés lors de la réversion tumorale, on a effectué un ratissage global de l'expression des gènes dans une lignée de cellules de leucémie myéloïde (Ml) et des cellules Ml transfectées de façon stable avec un mutant sensible à la température val 135 p53 (LTR6, 37°/32°C). Ces lignées ont été décrites par les inventeurs dans le brevet français n° 2 742 766. La comparaison des gènes exprimés (ARN messagers exprimés dans les deux types de cellule) a permis de mettre en évidence des gènes exprimés différentiellement, c'est-à-dire exprimés dans l'une des cellules alors qu'ils ne le sont pas dans l'autre (les gènes peuvent être activés ou inhibés).
On en déduit aisément que ces gènes sont au moins impliqués dans le processus de cancérisation, dans un cas par leur absence, et, dans l'autre cas, par leur présence. Pour cette étude différentielle, la méthode utilisée est la méthode
MPSS (Massively Parallel Signature Sequencing) décrite en 2000 par Brenner et al. (Nature Biotechnology, vol. 18, n° 6, juin 2000, p630-634), analyse faite avec p<0,01.
De façon à élaborer un modèle, les Inventeurs ont fait les hypothèses suivantes : s'il était possible de sélectionner, à partir d'une tumeur qui soit sensible à l'effet cytopathique du parvovirus H-l, des cellules qui étaient résistantes, alors cette résistance pourrait être due à un changement de leur phénotype malin. Au niveau moléculaire, on a pu remarquer que cette suppression du phénotype malin allait de paire avec une activation de l'expression du gène p2j afi et ce^ jnc}épendamment de l'expression du gène p53.
L'approche du problème selon la présente invention a permis d'isoler des séquences directement reliées à plusieurs fonctions précises. Dès lors, au contraire du séquençage aléatoire des EST, les séquences sont des séquences dont la fonction est connue du fait qu'elles sont impliquées dans le processus de suppression du phénotype malin, de réversion tumorale, d'apoptose et/ou dans la résistance aux virus.
La réversion tumorale se distingue de la suppression tumorale par le fait qu'elle englobe un domaine plus large que celui des gènes suppresseurs de tumeurs. En d'autres termes, la réversion tumorale est réalisée par la mise en œuvre de voies métaboliques et/ou moléculaires non limitées aux voies métaboliques et moléculaires dans lesquelles sont impliqués les gènes suppresseurs de tumeurs. Ainsi, la présente invention concerne notamment de nouvelles séquences ainsi que l'utilisation de ces séquences en matière de diagnostic et pour la mise en œuvre de procédés de criblage de composés à tester. L'invention concerne également des procédés de détection et/ou de dosage des séquences de l'invention ou de leur(s) produit(s) d'expression dans un prélèvement biologique. La présente invention concerne tout d'abord une séquence nucléotidique isolée comprenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe comprenant: a) SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 6053, de préférence SEQ ID N° 1885 (Mus musculus septin 2 (Sept2)), b) une séquence nucléotidique d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence telle que définie en a), c) une séquence nucléotidique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, après alignement optimal, avec une séquence définie en a) ou b), d) une séquence nucléotidique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence définie en a) ou b), et e) une séquence nucléotidique complémentaire où la séquence d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b), c) ou d).
La séquence nucléotidique selon l'invention définie en c) présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ci-dessus, de préférence d'au moins 90 %, de façon la plus préférée d'au moins 98 %. Par séquence nucléotidique, acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs. Ainsi, les séquences nucléiques selon l'invention englobent également les PNA (Peptid Nucleic Acid), ou analogues.
Les fragments des séquences nucléotidiques de l'invention comprennent au moins 15 nucléotides consécutifs. Préférentiellement, ils comprennent au moins 20 nucléotides consécutifs et encore plus préférentiellement, ils comprennent au moins 30 nucléotides consécutifs.
Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est- à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, de façon plus préférée d'au moins 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, de façon plus préférée au moins 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, de façon plus préférée au moins 98 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'acides nucléiques complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989.
Parmi les séquences nucléotidiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, de façon plus préférée d'au moins 98 %, après alignement optimal avec les séquences selon l'invention, on préfère également les séquences nucléiques variantes des séquences de l'invention, ou de leurs fragments, c'est-à-dire l'ensemble des séquences nucléiques correspondant à des variants alléliques, c'est-à-dire des variations individuelles des séquences de l'invention. Par « séquence nucléotidique variante », on entend désigner tout ARN ou ADNc résultant d'une mutation et/ou variation d'un site d'épissage de l'ADN génomique correspondant aux séquences nucléotidiques de l'invention.
La présente invention a également pour objet un polypeptide codé par une séquence nucléotidique conforme à l'invention Par « polypeptide » on entend, au sens de la présente invention, désigné indifféremment des protéines ou des peptides.
Selon un mode de réalisation particulier, les polypeptides conformes à l'invention comprennent un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide codé par une séquence nucléotidique conforme à l'invention, b) un polypeptide présentant au moins 80 % d'identité avec un polypeptide tel que définit dans a), c) un fragment d'au moins 5 acides aminés d'un polypeptide tel que défini dans a) ou b), d) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide tel que défini dans a), b) ou c), et e) un polypeptide modifié d'un polypeptide tel que défini dans a), b), c) ou d).
L'évaluation du pourcentage d'identité s'entend après alignement optimal des séquences concernées. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, de façon plus préférée d'au moins98 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier, une ou plusieurs délétion(s), troncation(s), un allongement, un fusion chimérique et/ou une ou plusieurs substitution(s).
Parmi les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 % et de façon plus préférée d'au moins 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence tel qu'un polypeptide conforme à la présente invention ou avec l'un de ses fragments, on préfère les polypeptides variants codés par les séquences nucléotidiques variantes telles que précédemment définies, en particulier les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, délétion, substitution et/ou addition d'au moins un résidu par rapport aux séquences polypeptidiques de l'invention ou avec un de leurs fragments. La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression cellulaire caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'invention ou qu'il code pour un polypeptide selon l'invention. Un tel vecteur peut également contenir les éléments nécessaires à l'expression et éventuellement à la sécrétion du polypeptide dans une cellule hôte. Une telle cellule hôte est également objet de la présente invention.
Les vecteurs comprenant des séquences promotrices et/ou de régulation font également partie de la présente invention. Lesdits vecteurs comportent de préférence un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que les régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent également posséder des signaux particuliers de nature à permettre la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral, les vecteurs viraux pouvant notamment être des adénovirus (5), des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques (5bis). L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes.
Avantageusement, les vecteurs conformes à l'invention comportent une séquence assurant le ciblage et/ou l'expression tissu spécifique. Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus (6), ou les AAN (7). Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC, bacterial artificial chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, hu an artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, la transformation après perméabilisation chimique de la membrane, la fusion cellulaire.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, transfoiTnées par les vecteurs selon l'invention ainsi que les animaux transgéniques, de préférence les mammifères, excepté l'Homme, comprenant une desdites cellules transformées selon l'invention. Ces animaux peuvent être utilisés en temps que modèles, pour l'étude de l'étiologie de maladies inflammatoires et/ou immunes, et en particulier des maladies inflammatoires du tube digestif, ou pour l'étude de cancers.
Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente invention, on peut citer les cellules bactériennes (8), mais aussi les cellules de levure (9), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (10), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO). On peut citer également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en œuvre des baculovirus (11). Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules COS. Parmi les mammifères selon l'invention, on préfère des animaux tels que les rongeurs, en particulier les souris, les rats ou les lapins, exprimant un polypeptide selon l'invention.
Ces animaux transgéniques sont obtenus par exemple par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères.
Les animaux transgéniques selon l'invention peuvent ainsi surexprimer le gène codant pour la protéine selon l'invention, ou leur gène homologue, ou exprimer ledit gène dans lequel est introduite une mutation. Ces animaux transgéniques, en particulier des souris, sont obtenus par exemple par transfection de copie de ce gène sous contrôle d'un promoteur fort de nature ubiquitaire, ou sélectif d'un type de tissu, ou après transcription virale.
Les cellules et mammifères selon l'invention sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide selon l'invention, comme décrit ci- dessous, et peuvent également servir à titre de modèle d'analyse.
Les cellules ou mammifères transformés tels que décrits précédemment peuvent aussi être utilisés à titre de modèles afin d'étudier les interactions entre les polypeptides selon l'invention, et les composés chimiques ou protéiques, impliqués directement ou indirectement dans les activités des polypeptides selon l'invention, ceci afin d'étudier les différents mécanismes et interactions mis enjeu.
Ils peuvent en particulier être utilisés pour la sélection de produits interagissant avec les polypeptides selon l'invention, ou leurs, à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou antagoniste de l'activité des polypeptides selon l'invention. De préférence, on utilise lesdites cellules transformées ou animaux transgéniques à titre de modèle notamment pour la sélection de produits permettant de lutter contre les pathologies liées à une expression anormale de ce gène. 77
La présente invention a également pour objet un anticorps monoclonal ou polyclonal, un fragment de cet anticorps ou un anticorps chimérique capable de reconnaître spécifiquement un polypeptide conforme à la présente invention. Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes bien connue de l'homme du métier.
Les anticorps selon l'invention sont par exemple des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Les anticorps conformes à l'invention mais également les immunoconjugués sont donc capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon la présente invention.
Les anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre les polypeptides de l'invention, notamment produits par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels.
On note notamment l'intérêt d'anticorps reconnaissant de façon spécifique les polypeptides, leurs variants ou leurs fragments immunogènes, selon l'invention.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique conforme à la présente invention en tant que sonde ou amorce pour la détection, l'identification, le dosage et/ou l'amplification de séquences d'acides nucléiques. Selon l'invention, les séquences nucléotidiques pouvant être utilisées comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage et/ou d'amplification de séquence d'acides nucléiques, présentent une taille minimale de 15 bases, de préférence de 20 bases, ou mieux de 25 à 30 bases. Les sondes et amorces selon l'invention peuvent être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Les séquences nucléiques selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde ou amorce.
Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives.
Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou le 125I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent ainsi être utilisées comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (1 Ibis). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces ohgonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N° 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquences. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorces les séquences nucléotidiques de l'invention et comme matrices, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention. D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en œuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (12), la technique TAS (Transcription- based Amplification System) décrite par (13), la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Réplication) décrite par (14), la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) décrite par (15) la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par (16), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par (17), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par (18), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par (19). Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées. Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en œuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.
La technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses (20). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).
Selon un autre mode de mise en œuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent par ailleurs présenter un intérêt quand elles sont utilisées au titre de nucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Elles peuvent également être utilisées au titre de nucléotides sens lesquels, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique selon la présente invention pour la production ou la synthèse d'un polypeptide recombinant. 75
La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante, elle-même comprise dans la présente invention, se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transfonnées, notamment les cellules ou mammifères de la présente invention, dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant codé par une séquence nucléotidique selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Les polypeptides recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par ladite méthode de production, font également partie de l'invention. Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Les séquences des polypeptides recombinants peuvent être également modifiées afin d'améliorer leur solubilité, en particulier dans les solvants aqueux. De telles modifications sont connues de l'homme du métier comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la substitution d'acides aminés hydrophobes par des acides aminés hydrophiles.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur et d'une cellule hôte selon l'invention. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci- dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. Les procédés utilisés pour la purification d'un polypeptide recombinant sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffmité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques, etc..
Les polypeptides selon la présente invention peuvent aussi être obtenus par synthèse chimique en utilisant l'une des nombreuses synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en œuvre des phases solides (21) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique.
Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention.
La présente invention a également pour objet une puce à ADN caractérisée en ce qu'elle contient au moins une séquence nucléotidique conforme à la présente invention.
En fait, les séquences nucléotidiques selon l'invention que l'on entend utiliser à titre de sonde ou d'amorce pour la détection, l'identification, le dosage et ou l'amplification de séquences d'acides nucléiques peuvent être immobilisées sur un support, de manière covalente ou non covalente, ce support étant une puce à ADN ou un filtre à haute densité.
Par « puce à ADN » ou « filtre à haute densité », on entend désigner un support sur lequel sont fixées des séquences d'ADN, chacune d'entre elles pouvant être repérée par sa localisation géographique. Ces puces ou filtres diffèrent principalement par leur taille, le matériau du support, et éventuellement le nombre de séquences qui y sont fixées. 77
En particulier, on peut effectuer une synthèse in situ par adressage photochimique ou par jet d'encre. D'autres techniques consistent à effectuer une synthèse ex situ et à fixer les sondes sur le support de la puce à ADN par un dressage mécanique, électronique ou par jet d'encre. Ces différents procédés sont bien connus de l'homme du métier.
L'invention a également pour objet une puce à protéines comprenant un polypeptide ou un anticorps selon l'invention.
Une telle puce à protéines permet l'étude des interactions entre les polypeptides selon l'invention et d'autres protéines ou des composés chimiques et peut ainsi être utile pour le criblage de composés interagissant avec les polypeptides selon l'invention.
On peut également utiliser les puces à protéines selon l'invention pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre les polypeptides selon l'invention dans le sérum de patients à tester. On peut également mettre en œuvre une puce à protéines comprenant un anticorps selon l'invention pour cette fois détecter la présence de polypeptides dans le sérum de patients susceptibles d'être reconnus par ledit anticorps.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un composé choisi parmi une séquence nucléotidique, un polypeptide, un vecteur, une cellule ou un anticorps selon l'invention pour la préparation d'un médicament.
Les pathologies plus spécifiquement visées sont les maladies virales et les maladies se caractérisant par le développement de cellules tumorales ou une dégénérescence cellulaire comme la maladie d'Alzheimer ou la schizophrénie. Ainsi, le susdit médicament est destiné à la prévention et/ou au traitement de ces maladies. En particulier, la maladie visée est le cancer.
L'un des intérêts de la présente invention est qu'elle a mis en évidence l'implication un grand nombre de séquences nucléotidiques dans les phénomènes de suppression tumorale, réversion tumorale, apoptose et/ou résistance virale. Ces séquences s'expriment donc différentiellement lorsque l'un de ces susdits processus est enclenché. Par conséquent, en présence d'un patient dont on soupçonne le déclenchement de l'un de ces processus ou pour lequel on souhaite vérifier l'absence d'un tel déclenchement, il est utile de pouvoir déteπniner, voire de quantifier, l'expression d'une ou plusieurs séquence(s) conforme(s) à l'invention à partir d'un prélèvement biologique dudit patient. Eventuellement, l'analyse de l'expression d'une ou plusieurs desdites séquences peut s'accompagner d'une comparaison avec un niveau d'expression de référence correspondant à celui d'un individu sain. Par conséquent, l'invention comprend donc également une méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique d'une maladie virale ou se caractérisant par un développement tumoral ou une dégénérescence cellulaire comprenant l'analyse de l'expression d'au moins une séquence de l'invention à partir d'un prélèvement biologique d'un patient à tester. Selon un mode de réalisation préféré, ladite méthode comprend les étapes suivantes : isolement de l'ARN messager à partir d'un prélèvement biologique issu d'un patient à tester,
- préparation de l'ADNc complémentaire à partir dudit ARN messager,
- éventuellement, amplification d'une portion d'ADN complémentaire correspondant à au moins une séquence de l'invention, et détection de l'ADN complémentaire éventuellement amplifié. En particulier, l'analyse de l'expression de la séquence peut être réalisée au moyen d'une puce à ADN telle que ci-dessus décrite.
Parmi les séquences de la présente invention, certaines présentent la caractéristique d'être des récepteurs exprimés à la surface des cellules et afin d'en comprendre le mécanisme dans le cadre des processus ci-dessus mentionnés, il est intéressant de rechercher des composés susceptibles d' interagir avec ce récepteur, c'est-à-dire d'interagir avec un polypeptide confoπne à l'invention, il faut aussi prévoir la protéine sécrétée. Ceci s'applique également aux polypeptides conformes à l'invention correspondant à des protéines sécrétées (à la surface ou à l'extérieur des cellules), hormones-like... Par conséquent, la présente invention a également pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles de se fixer sur un peptide conforme à l'invention et comprenant les étapes suivantes :
- mise en contact d'un polypeptide ou d'une cellule selon l'invention avec un composé candidat, et détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit polypeptide ou ladite cellule. Un procédé de criblage de composés peut également être intéressant relativement à des composés susceptibles d'interagir avec une séquence nucléotidique selon l'invention, voire avec les séquences nécessaires à l'expression ou la régulation de ces séquences. En effet, les composés sont susceptibles d'interagir avec lesdites séquences avec pour effet de réduire, d'inhiber ou au contraire de potentialiser l'expression des séquences en question. Un tel procédé comprend les étapes suivantes : - mise en contact d'une séquence nucléotidique ou d'une cellule selon l'invention avec un composé candidat, et
- détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ladite séquence nucléotidique ou ladite cellule.
Pour des raisons invoquées plus haut, il peut donc être intéressant de rechercher et/ou de doser, dans un échantillon ou prélèvement biologique d'un patient à tester, la présence d'une séquence nucléotidique selon l'invention. Un tel procédé de détection et/ou de dosage comprend les étapes suivantes : mise en contact d'une séquence nucléotidique selon l'invention marquée avec l'échantillon biologique à tester, dans les conditions nécessaires à la formation d'un hybride, et
- détection et/ou dosage de l'hybride éventuellement fonné entre ladite séquence nucléotidique et l'acide nucléique présents dans ledit prélèvement biologique. Ce procédé peut en outre comprendre une étape amplification de l'acide nucléique dudit prélèvement biologique à l'aide d'amorces choisies parmi les séquences nucléotidiques selon l'invention. En particulier, ce procédé peut être réalisé au moyen de la puce à
ADN ci-dessus décrite.
L'homme du métier sait mettre en œuvre un tel procédé et peut en particulier utiliser une trousse de réactifs comprenant : a) une séquence nucléotidique selon l'invention utilisée en tant que sonde, b) les réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction d'hybridation entre ladite sonde et l'acide nucléique du prélèvement biologique, c) les réactifs nécessaires à la détection et/ou le dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'acide nucléique du prélèvement biologique. Une telle trousse peut également contenir des contrôles positifs ou négatifs afin d'assurer la qualité des résultats obtenus.
De la même manière, la détection et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention est également envisageable dans le cadre de la présente invention et ce procédé comprend donc les étapes suivantes :
- mise en contact du prélèvement biologique avec un anticorps marqué selon l'invention, et détection et/ou dosage du complexe formé par ledit anticorps de polypeptide présent dans ledit prélèvement.
Avantageusement, ce procédé peut être réalisé au moyen de la puce à protéines telle que ci-dessus décrite. Là encore, l'homme du métier sait mettre en œuvre un tel procédé et peut en particulier, utiliser une trousse de réactifs comprenant : a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention ; b) éventuellement des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction antigène / anticorps ; c) les réactifs peπnettant la détection du complexe antigène / anticorps.
Enfin, la présente invention a également pour objet un support lisible par ordinateur ou un support informatique sur lequel sont enregistrées au moins une séquence nucléotidique selon la revendication 1 et/ou au moins une séquence de polypeptide tel que défini dans la revendication 3 ou 4. En particulier, ce support est choisi dans le groupe comprenant : a) une disquette, b) un disque dur, c) une mémoire vive (RAM), d) une mémoire morte (ROM), e) un cédérom.
L'invention n'est pas limitée à la présente description mais qu'elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence nucléotidique isolée comprenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe comprenant : a) SEQ ID N° 1885, b) une séquence nucléotidique d'au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence telle que définie en a), c) une séquence nucléotidique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, après alignement optimal, avec une séquence définie en a) ou b), d) une séquence nucléotidique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence définie en a) ou b), et e) une séquence nucléotidique complémentaire ou la séquence d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b), c) ou d).
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que son expression est impliquée lors de la suppression tumorale, la réversion tumorale, l'apoptose et/ou la résistance virale.
3. Polypeptide codé par une séquence nucléotidique selon la revendication 1.
4. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide selon la revendication 3, b) un polypeptide présentant au moins 80 % d'identité avec un polypeptide tel que défini dans a), c) un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'un polypeptide tel que défini dans a) ou b), d) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide tel que défini dans a), b) ou c), et e) un polypeptide modifié d'un polypeptide tel que défini dans a), b), c) ou d).
5. Vecteur de clonage et/ou d'expression cellulaire caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou codant pour un polypeptide selon la revendication 3 ou 4.
6. Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, un virus herpès ou un poxvirus.
7. Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur à acide nucléique nu.
8. Vecteur selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence assurant le ciblage et/ou l'expression tissu spécifique.
9. Cellule hôte transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 5 à 8.
10. Animal, de préférence un mammifère excepté l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule selon la revendication 9.
1 1. Anticorps monoclonal ou polyclonal, fragment de cet anticorps ou anticorps chimérique, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'une des revendications 3 et 4.
12. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1 en tant que sonde ou amorce pour la détection, l'identification, le dosage et/ou l'amplification de séquences d'acides nucléiques.
13. Utilisation in vitro d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1, comme nucléotide sens ou antisens.
14. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1 pour la production d'un polypeptide recombinant.
15. Procédé d'obtention d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce qu'on utilise une cellule selon la revendication 9 dans des conditions permettant l'expression dudit polypeptide et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
16. Puce à ADN caractérisée en ce qu'elle contient au moins une séquence nucléotidique selon la revendication 1.
17. Puce à protéines caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon la revendication 3 ou 4 ou un anticorps selon la revendication 11.
18. Utilisation d'un composé choisi parmi : a) une séquence nucléotidique selon la revendication 1, b) un polypeptide selon la revendication 3 ou 4, c) un vecteur selon l'une des revendications 5 à 8, d) une cellule selon la revendication 9, e) un anticorps selon la revendication 11, pour la préparation d'un médicament
19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée par le fait que le médicament est destiné à la prévention et/ou au traitement de maladies virales ou se caractérisant par le développement de cellules tumorales ou une dégénérescence cellulaire.
20. Utilisation selon la revendication 19, caractérisée par le fait que la maladie est le cancer.
21. Méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique d'une maladie virale ou se caractérisant par un développement tumoral ou un dégénérescence cellulaire comprenant l'analyse de l'expression de SEQ ID N° 1885, à partir d'un prélèvement biologique d'un patient à tester.
22. Méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique selon la revendication 21, comprenant les étapes suivantes :
- isolement de TARN messager à partir d'un prélèvement biologique issu d'un patient à tester,
- préparation de l'ADN complémentaire à partir dudit ARN messager,
- éventuellement, amplification de portions d'ADN complémentaire correspondant à SEQ ID N° 1885,
- détection de l'ADN complémentaire éventuellement amplifié.
23. Méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique selon la revendication 22, dans laquelle l'analyse de l'expression de la séquence est réalisée au moyen d'une puce à ADN selon la revendication 16.
24. Procédé de criblage de composés susceptibles d'interagir avec une séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en contact d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1, ou d'une cellule selon la revendication 9 avec un composé candidat, et
- détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ladite séquence nucléotidique ou ladite cellule.
25. Procédé de criblage de composés susceptibles de se fixer sur un polypeptide selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact d'un polypeptide selon la revendication 3 ou 4 ou d'une cellule selon la revendication 9 avec un composé candidat, et
- détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit polypeptide ou ladite cellule.
26. Procédé de détection et/ou de dosage d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1 dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1 marquée avec le prélèvement biologique à tester, dans les conditions nécessaires à la formation d'un hybride, - détection et/ou dosage de l'hybride éventuellement formé entre ladite séquence nucléotidique et l'acide nucléique présent dans ledit prélèvement biologique.
27. Procédé de détection et/ou de dosage selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'amplification de l'acide nucléique dudit prélèvement biologique à l'aide d'amorces choisies parmi les séquences nucléotidiques telles que définies dans la revendication 1.
28. Procédé de détection et/ou de dosage selon la revendication 26 ou 27, caractérisé par le fait qu'il est réalisé au moyen de la puce à ADN telle que définie dans la revendication 16.
29. Procédé de détection et/ou de dosage d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 3 ou 4 dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact du prélèvement biologique avec un anticorps marqué tel que défini dans la revendication 11 , - détection et/ou dosage du complexe formé entre ledit anticorps et le polypeptide présent dans ledit prélèvement.
30. Procédé de détection et/ou de dosage d'un polypeptide selon la revendication 29, caractérisé par le fait qu'il est réalisé au moyen de la puce à protéines telle que définie dans la revendication 17.
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