JP2001521392A

JP2001521392A - 新規なヒト腫瘍抑制遺伝子

Info

Publication number: JP2001521392A
Application number: JP54456098A
Authority: JP
Inventors: キャラハン，マイケル，ジェイ．; サザランド，ロバート，エル．; ワッツ，コリン，ケイ．，ダブリュ．
Original assignee: ガーヴァンインスティチュートオブメディカルリサーチ
Priority date: 1997-04-21
Filing date: 1998-04-20
Publication date: 2001-11-06
Also published as: EP0979277B1; AUPO633497A0; EP0979277A4; US7105652B2; DE69823022D1; WO1998048010A1; DE69823022T2; CA2287438A1; EP0979277A1; US20020192160A1

Abstract

(57)【要約】キイロショウジョウバエ由来のHYDタンパク質(hyperplastic discs)およびラット由来の100kDa HECT(homologous to E6-AP carboxyl terminus：E6-APカルボキシ末端に相同性の)ドメインタンパク質に対して顕著なアミノ酸配列同一性を示す産物をコードするEDD(E3 isolated by Differential Display：ディファレンシャルディスプレーにより単離されたE3)と称する新規なヒトのプロゲスチン調節遺伝子を開示する。このEDD遺伝子は腫瘍抑制遺伝子に相当するようであり、被験者からの該遺伝子の多型または変異の検出は癌のような過増殖性疾患を診断し、また、過増殖性疾患に罹りやすい素質を判定するのに有用でありうる。被験者のプロゲスチン応答性を評価するアッセイ法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】新規なヒト腫瘍抑制遺伝子発明の利用分野本発明は、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)由来のHYDタンパク質(hyperplastic discs)およびラット由来の100kDaHECT(homologous to E6- AP carboxyl terminus：E6-APカルボキシ末端に相同性の)ドメインタンパク質に対して顕著なアミノ酸配列同一性を示す産物をコードする、EDD(E3 isolated by Differential Display：ディファレンシャルディスプレーにより単離されたE3) と称する新規なヒトのプロゲスチン調節遺伝子（プロゲスチンにより調節される遺伝子）に関する。発明の背景正常乳房組織および乳癌組織における細胞の増殖と分化の制御には、ステロイドホルモン（特に、エストロゲンとプロゲステロン）、ペプチドホルモン、増殖因子の複雑な働きおよび相互作用が関与している(1，2)。これらの作用物質が細胞周期の重要な制御時点でどのように作用して、細胞周期のサイクルの進行に影響を及ぼすのか、あるいは分化の経路に入るのか、については、ほんの一部しか理解されていない(3，5)。プロゲスチン（黄体ホルモン）は妊娠中の乳腺小葉胞の発達に関係しているが (6)、正常な閉経期前乳房における上皮細胞増殖の刺激の際には、プロゲスチンよりもエストロゲンの方が主要な役割を果たしているという証拠がある(7，8)。プロゲスチンは乳癌上皮細胞の増殖をin vitroで刺激も抑制もするが、主な作用は恐らく分化の誘導による増殖抑制である(3，4，7，9)。プロゲスチンの作用は主としてプロゲステロン受容体(PR)により媒介され、該受容体は大きな未確定セットのプロゲスチン応答性遺伝子の転写トランスアクチベーターとして作用し、続いてこれらのプロゲスチン応答性遺伝子が転写的にまたは転写後に更なる遺伝子もしくは遺伝子産物に影響を及ぼすと考えられる。細胞増殖に対するプロゲスチンの作用には、ほんの限られた数の遺伝子が関与してきた。本発明者らによる以前の研究から、ヒト乳癌細胞におけるプロゲスチン刺激細胞周期進行の主要な下流標的としてc-mycとサイクリンD1が同定されており(3，10)、一方、プロゲスチンの遅延増殖抑制作用はサイクリンD1およびE遺伝子発現の低下を必要とする(4，9)。c-myc遺伝子発現に対するプロゲスチン作用は急速で数分以内に現れるが、サイクリン発現に対する作用は数時間後に開始され、未確定の初期事象が存在することを示す。プロゲスチンの作用は複雑で、多数の遺伝子（その多くが現在知られていない）が関与しているらしいので、ヒト乳癌細胞培養物において標的遺伝子を同定するためにディファレンシャルディスプレーRT-PCR法(DD-PCR)(11)が採用された。このアプローチの有効性は、6-ホスホフルクト-2-キナーゼ／フルクトース-2,6- ビスホスファターゼのイソフォームに対して顕著な相同性をもつ遺伝子であるPR G1のクローニングにより以前に実証されている(12)。同じ手法を使って、新規なプロゲスチン調節遺伝子EDD(本出願人のオーストラリア仮特許出願No.PO6334ではDD5という)が同定された。アミノ酸配列の類似性に基づいて、EDDはショウジョウバエの腫瘍抑制遺伝子h yperplastic discs(hyd)のヒト相同体であるらしい(13)。HYDタンパク質の機能は不明であるが、そのカルボキシル末端と、ヒトE6-APおよびデータベース検索により同定された幾つかのタンパク質のカルボキシル末端と、の間に顕著な相同性が存在する(14)。これらのHECTドメインファミリータンパク質はユビキチン− タンパク質リガーゼ(E3酵素)として機能し(14-16)、タンパク質分解のための特異的基質タンパク質を標的とするユビキチン化カスケードにおいて、ある種の役割を果たしている。特に注目すべき点として、EDDによりコードされるタンパク質は、ユビキチンと共有結合しうるシステイン残基を含むカルボキシ末端のHECT ドメインをもっている。このアミノ酸は全ての既知のHECTドメイン含有E3酵素において保存されており、ユビキチンの転移に関与している。したがって、EDD遺伝子はユビキチン−タンパク質リガーゼをコードする新規なヒト腫瘍抑制遺伝子に相当することが提起される。発明の開示第１の態様において、本発明は、次のN-末端アミノ酸配列：を含むタンパク質または該タンパク質の生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましくは、コードされるタンパク質は次のN-末端アミノ酸配列：を含む。より好ましくは、コードされるタンパク質はユビキチン−タンパク質リガーゼであり、おおよその分子量が300kDaである。最も好ましくは、単離されたポリヌクレオチド分子は、図3Bに示したヌクレオチド34からヌクレオチド8424までのヌクレオチド配列もしくはその部分と実質的に一致する、または少なくとも90%以上（より好ましくは、95%以上）相同性であるヌクレオチド配列を含む。これに関連して、「その部分」という用語は、生物学的に活性なペプチドもしくはポリペプチド部分または抗原決定基をコードするヌクレオチド配列の部分をさすと理解すべきである。典型的には、「その部分」は50ヌクレオチド以上の長さのヌクレオチド配列を含むだろう。しかし、ハイブリダイゼーションアッセイに有用なプローブを作製するにあたっては、ヌクレオチド配列のより短い部分（例えば、長さが８ヌクレオチド以上の部分）も使用することができる。かくして、第２の態様において、本発明は、図3Bに示したヌクレオチド34からヌクレオチド8424までのヌクレオチド配列の８ヌクレオチド以上の部分と実質的に一致するまたは相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、適切に検出可能な標識（例えば、放射性同位体）で標識されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブ分子を提供する。このようなプローブ分子はDNAでもRNAでもよい。それらは、例えば、１以上の組織から単離された全RNAまたはポリ(A)RNA中のEDD mRNAを定量的または定性的に検出するために使用される。以下で述べるように、こうしたアッセイは診断および／または予後判定に有用である。本発明はさらに、前記配列用のオリゴヌクレオチドプライマー、アンチセンス配列、該プライマーおよびアンチセンス配列の相同体、相補的リボザイム配列、触媒抗体結合部位、該ポリヌクレオチド分子の優性ネガティブ突然変異体にも及ぶ。好ましくは、第１の態様のポリヌクレオチド分子はヒト由来のものである。より好ましくは、該ポリヌクレオチド分子はヒト癌細胞由来のものである。第１の態様の単離されたポリヌクレオチド分子をプラスミドまたは発現ベクターもしくはカセットに組み込み、その後適当な細菌、酵母、昆虫または哺乳動物宿主細胞の中に導入することができる。かかる宿主細胞を用いて、単離されたポリヌクレオチド分子によりコードされるタンパク質またはその生物学的に活性な断片を発現させることができる。上述したように、EDD産物(pEDD)のアミノ酸配列はショウジョウバエのHYDタンパク質のアミノ酸配列に対して顕著な配列類似性を示す。ショウジョウバエのhy d遺伝子は腫瘍抑制遺伝子であり、それゆえにEDD遺伝子も同様に腫瘍抑制遺伝子であると予想される。さらに、pEDDタンパク質はHYDタンパク質と類似した活性をもつことが期待される。とりわけ、EDDの不活性化または他の突然変異が起こると癌に罹りやすくなり、したがって、EDDは予防的または治療的戦略のための可能性のある標的となろう。EDDの突然変異は癌への罹りやすさを診断するのに役立ち、特に正常または前新生物疾患の早期診断に役立ち、あるいは腫瘍の進行または治療に対する応答を予測するのに（すなわち、予後マーカーとして）有用であろう。さらに、EDDはプロゲスチンや他のマイトジェンによる細胞周期の調節に関与しているらしいので、EDDは抗増殖剤（すなわち、癌治療薬）の可能性のある標的となる。その上、EDDはプロゲスチンにより調節されるほんの少数の既知遺伝子の一つであるので、EDDはプロゲスチン作用の重要なメディエーターであり、かつプロゲスチンに対する臨床応答性のマーカーとなる。腫瘍抑制遺伝子として、EDDは例えばp16(多発性腫瘍抑制遺伝子１：MTS1)または家族性乳癌感受性遺伝子BRCA1のような家族性癌感受性遺伝子であるかもしれない。また、EDDは散発性の癌においてある役割を担っている可能性がある。第３の態様において、本発明は、次のN-末端アミノ酸配列：を含むタンパク質（pEDDという）または該タンパク質の生物学的に活性な部分を実質的に純粋な形で提供する。好ましくは、第３の態様の前記タンパク質は次のN-末端アミノ酸配列：を含む。より好ましくは、第３の態様の前記タンパク質はユビキチン−タンパク質リガーゼであり、おおよその分子量が300kDaである。最も好ましくは、第３の態様の前記タンパク質は図3Cに示したアミノ酸配列と実質的に一致するアミノ酸配列を含む。生物学的に活性な部分は、該タンパク質の生物学的作用を抑制する、模倣するまたは増強するポリペプチドまたはペプチド配列からなり得る。加えて、生物学的に活性な部分は、該タンパク質に特異的な抗体を生起させるのに有用な抗原決定基を提示してもよい。第３の態様に従う前記タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、天然源（例えば、全脳、心臓、精巣、虫垂）もしくは適当な細胞系から精製するか、または当技術分野で公知の方法(Sambrookら，1989)により組換え的に生産することができる。第４の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のポリヌクレオチド分子で形質転換された非ヒト生物を提供する。第１の態様のポリヌクレオチド分子で有益に形質転換され得る生物としては、大腸菌や枯草菌のような細菌、CHOのような真核細胞系、真菌、植物などがある。第５の態様において、本発明は、pEDDと称するタンパク質またはその抗原性部分に特異的な抗体を提供する。抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、当技術分野で公知の方法により生成することができる。また、本発明は診断アッセイ用のキットにも関係していることを理解すべきである。前記キットは第２の態様に従うタンパク質もしくはその生物学的に活性な部分および／または第５の態様に従う抗体を含む。これに加えて、あるいはこれとは別に、前記キットはハイブリダイゼーションアッセイ用のオリゴヌクレオチドプローブまたはPCRに基づいたアッセイ用のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでいてもよい。第６の態様において、本発明は、抗pEDD抗体と結合することができるタンパク質またはその抗原性部分を提供する。以下に示すように、いくつかの組織では、EDDがプロゲスチンにより調節されているようである。したがって、EDDは被験者におけるプロゲスチン応答性の有用なマーカーを提供しうる。例えば、乳癌、子宮内膜腫または髄膜腫のマーカーとして、プロゲスチンまたはプロゲスチンアンタゴニスト（抗プロゲスチン）に対する応答性、すなわち、その高レベルはその腫瘍がプロゲスチン／抗プロゲスチンに応答し、プロゲスチン／抗プロゲスチン療法に感受性であることを示すのかもしれない。EDDはまた有用な予後マーカーでもあり得る。なぜならば、ホルモン応答性の腫瘍はしばしば良好な予後を示す（すなわち、患者が疾病フリーの状態でより長い期間または全期間生存する）からである。あるいはまた、EDD遺伝子の突然変異、欠失または増幅は、プロゲスチン調節遺伝子としてのその役割とは無関係に、腫瘍の進行および疾病の予後を予告する可能性がある。こうして、分離された細胞または組織サンプル中に存在するEDDm RNAのレベルをハイブリダイゼーションアッセイまたはPCR分析でDNAもしくはRNA プローブまたはプライマーによりアッセイすることができる。あるいはまた、上記の抗体を用いてpEDDタンパク質のレベルをアッセイしてもよい。したがって、第７の態様において、本発明は、 (i)被験者から細胞または組織を分離し、 (ii)図3Cに示したアミノ酸配列と実質的に一致するアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出する、各ステップを含んでなる、被験者におけるプロゲスチン応答性を評価するためのアッセイ法を提供する。いくつかの状況においては、分離した細胞または組織を、プロゲスチンまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニスト化合物にさらし、その後、プロゲスチンまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニスト化合物がpEDDタンパク質の生産を誘導したかどうか調べることが好ましい。第８の態様において、本発明は、被験者における過増殖性疾患、または過増殖性疾患もしくは発達異常に罹りやすい素質を示すものであるEDD遺伝子の多型または変異を検出することを含んでなる、過増殖性疾患（特に、癌）を診断する方法、または過増殖性疾患に罹りやすい素質を判定する方法を提供する。また、EDD活性のモジュレーションは、悪性または非悪性の過増殖性疾患（例えば、乳癌や他の癌）のような増殖障害、および皮膚病学的疾患または発達異常の治療に有効でありうる。さらに、EDDのモジュレーションは、プロゲスチン標的器官におけるプロゲスチン作用を必要とするプロセス（例えば、受精のコントロール、生殖組織の機能）において治療的価値を有するかもしれない。 EDD活性は、以下により調節することができる。すなわち、 −刺激性または抑制性のいずれかの合成化合物（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）、 −EDDに特異的なリボザイム（すなわち、内因性EDD活性をダウンレギュレートする）、 −EDDセンス（すなわち、内因性pEDDタンパク質のレベルおよび活性を増強する）またはEDDアンチセンス（すなわち、内因性pEDDタンパク質のレベルおよび活性をダウンレギュレートする）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたはオリゴヌクレオチドまたは他の送達系（例えば、ウイルス）を用いる遺伝子治療。センスベクターは、該タンパク質の個々の部分に別個の望ましい活性があると分かった場合には、EDDコード配列の一部分のみを含むことができる。このようなベクターは、例えば、内因性pEDDタンパク質の活性を低下または排除することにより、表現型の変化を引き起こす遺伝子産物をコードするEDDの優性ネガティブ突然変異体を含んでいてもよい。表現型の変化は、酵素複合体の形成の妨害、基質の競合、または欠陥のある基質もしくは反応産物の形成により引き起こされよう。優性ネガティブ突然変異体の特定の例は、タンパク質−タンパク質相互作用または基質認識に関与するpEDD配列を保持しているが、pEDDタンパク質のどこか他の部分にある酵素活性や他の活性を欠失している末端切断型のタンパク質をコードする突然変異体でありうる。このような突然変異体の発現は正しい基質の修飾またはプロセシングを阻害するだろう。こうして、推定上のユビキチン−タンパク質リガーゼとして、タンパク質基質の結合を可能にするが、後続のユビキチン化とこれらの配列の分解に必要な配列を欠失している末端切断型pE DDタンパク質が発現され得るだろう。 pEDDタンパク質は細胞増殖、分化、細胞死を含めた細胞周期（成長）の調節に関与しているように思われるので、pEDDタンパク質またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストは癌の化学療法による治療において化学保護剤として使用できる可能性がある。すなわち、標準的な抗癌剤（例えば、メトトレキセート、ビンブラスチン、シスプラチン）で治療する前に、正常細胞における細胞増殖、分化、細胞死を含めた細胞周期を停止させるために患者にpEDDタンパク質またはアゴニスト／アンタゴニストを投与しうる。これにより停止した細胞は化学療法剤の毒性による損傷をそれほど受けないだろう。ヌクレオチド配列に関して本明細書中で用いる「実質的に一致する」という用語は、DNAコードの縮重のためにコード化タンパク質を変化させないヌクレオチド配列の小さな変化を含むことを意味する。さらに、この用語は、特定の系での発現を増大させるのに必要とされる該配列の他の小さな変化（しかし、この変化は結果的にコード化タンパク質の生物学的活性を低下させるものではない）を含むことを意味する。アミノ酸配列に関して本明細書中で用いる「実質的に一致する」という用語は、コード化タンパク質の生物学的活性を低下させないアミノ酸配列の小さな変化を含むことを意味する。これらの変化は同類アミノ酸置換を含む。考えられる置換は、G，A，V，I，L，M;D，E;N，Q;S，T;K，R，H;F，Y，W，H;およびP，Nα-アルキルアミノ酸;である。本明細書全体を通して用いられる「含む」および「含んでなる」という用語は、記載した１つのステップ、成分もしくは特性、または１グループのステップ、成分もしくは特性を、更なる１つのまたはグループのステップ、成分もしくは特性を含めてまたは含めないで、含むことを意味するものである。以下の非限定的な実施例および添付の図面を用いて本発明をさらに説明することにする。添付図面の簡単な説明図１．合成プロゲスチンORG 2058で処理したT-47D細胞において示差的に発現されたcDNAの同定。 A) ディファレンシャルディスプレーによるEDDの同定。ORG 2058またはビヒクル対照（エタノール）で３時間処理したT-47D細胞から得られた全RNAを、ディファレンシャルディスプレーPCR反応用の鋳型として用いた。PCR産物を4.5%ポリアクリルアミド変性ゲル上で分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。矢印は対照レーンと比べて高レベルでプロゲスチン処理レーン(ORG 2058)に存在するEDD DD-PCR産物(DD5-1;図3A参照）を示す。 B) ノーザンブロット分析によるEDDのプロゲスチン誘導の確認。5%チャーコール処理FCSを補充した培地中で増殖しているT-47D細胞を、アクチノマイシンD( ACT)の存在下または非存在下に10nM ORG 2058またはエタノールビヒクル（対照）で処理し、３時間後ノーザン分析のために全RNAを回収した。ノーザンブロットはEDDクローンP19を用いてプローブした。 C) EDD mRNAのプロゲスチン誘導に及ぼすシクロヘキシミドの影響。5%チャーコール処理FCSを補充した培地中で増殖しているT-47D細胞を、ORG 2058(10nM)、シクロヘキシミド(CHX，20μg/ml)、同時にORG 2058とCHX、またはエタノールビヒクルで処理し、１時間で全RNAを回収した。ノーザンブロットはEDD DD-PCR断片であるDD5-1でプローブした。図２．ヒト組織におけるEDD mRNAの発現。 A) ヒト組織由来のポリA⁺RNAのノーザンブロット分析。ブロットをEDDのP19 cDNAクローンとハイブリダイズさせた。マーカーの分子サイズを示してある。PB L、末梢血白血球。 B) ヒト組織由来のポリA⁺RNAのドットブロット分析。ブロットをEDDのP19 cD NAクローンとハイブリダイズさせた。Ａ列：1，全脳；2，扁桃；3，尾状核；4，小脳；5，大脳皮質；6，前頭葉；7，海馬；8，延髄；B列：1，後頭葉；2，被殻；3，黒質；4，側頭葉；5，視床；6，視床下核；7，脊髄；C列：1，心臓；2，大動脈；3，骨格筋；4，結腸；5，膀胱；6，子宮；7，前立腺；8，胃；D 列：1，精巣；2，卵巣；3，膵臓；4，下垂体；5，副腎；6，甲状腺；7，唾液腺：8，乳腺；E列：1，腎臓；2，肝臓；3，小腸；4，脾臓；5，胸腺；6，末梢血白血球；7，リンパ節；8，骨髄；F列：1，虫垂；2，肺；3，気管；4，胎盤；G列： 1，胎児脳；2，胎児心臓；3，胎児腎臓；4，胎児肝臓；5，胎児脾臓；6，胎児胸腺；7，胎児肺。図３．EDDのクローニングおよび推定アミノ酸配列。 A) 全長EDD構築物のクローニングに用いた部位を示すEDD cDNAの制限地図を伴うEDD構造体、および下記のEDD配列を導き出すのに用いたcDNAクローンの模式図。ディファレンシャルディスプレーで同定されたDD-PCR cDNA断片をDD5-1と命名し、5'RACE産物と元のDD-PCR産物から誘導されたcDNAクローンをDD5-2と命名した。全てのcDNAクローンはヒト胎盤cDNAライブラリーから分離されたものであるが、Hlはヒト心臓cDNAライブラリーから分離された。 B) EDDのヌクレオチド配列。開始コドンと停止コドンには下線が引いてある。 C) pEDDの推定アミノ酸配列。HYDに対して高い相同性（約60%）を示す２つの領域（中心の配列およびHECTドメインを含むカルボキシル末端配列）が存在し、これらの配列と他の高度に保存された配列を太字で示し、２つの推定核局在化シグナルを四角で囲ってある。HECTドメインは太字と下線で示され、残基2768に保存されたシステインを含む。ポリA結合タンパク質に相同性を示す領域はイタリック体で示し、抗血清AbPEP1が誘導されたペプチド配列には下線が引いてある。数字はアミノ酸の位置を示す。図４．EDD遺伝子の染色体位置確認。 Hlプローブを用いたFISHを示す中期染色体。正常な男性染色体をDAPIで染色した。第８染色体上のハイブリダイゼーション部位を矢印で示す。図５．EDDタンパク質の特徴づけ。 A) AbPEP1による組換えEDDタンパク質の検出。末端切断型のEDD構築物(EDD10 0kDa)を含むバキュロウイルスを感染させたSf9細胞をSDS-サンプル緩衝液中で煮沸し、その後6%ゲルでSDS-PAGEにかけ、ニトロセルロースに移行させてAbPE P1またはペプチドブロックしたAbPEP1でブロットした。 B) EDDタンパク質のサイズの決定。AbPEP1を用いてT-47D溶解物からEDDを免疫沈降させた。免疫沈降物(IP)を、in vitro翻訳した全長EDDの産物(IVT)および免疫沈降したin vitro翻訳EDD(IVT−IP)と共に、6%ゲルのSDS-PAGEにかけて分離した。T-47D免疫沈降物をニトロセルロースに移行させ、AbPEP1でEDDについてブロットし、ゲルの残部は乾燥させてオートラジオグラフィーに供した。マーカータンパク質の分子量を示してある。 C) T-47D溶解物中のEDDの検出。免疫沈降したEDDをT-47D溶解物からの40μg 全タンパク質と共に電気泳動にかけた。全タンパク質をAbPEP1またはペプチドブロックしたAbPEP1のいずれかでブロットし、免疫沈降物をAbPEP1でブロットした。図６．ヒト組織および細胞系におけるEDDタンパク質の発現。正常乳房細胞系および乳癌細胞系におけるEDDの発現。いくつかの細胞系からの全細胞溶解物を6%ゲルのSDS-PAGEにかけて分離し、ニトロセルロースに移行させてAbPEP1でブロットした。184は正常乳房細胞系であり、l84B5は不死化誘導体であり、残りは乳癌細胞系である。MCF-7MはMCF-7のサブラインである。図７．ラット100kDaタンパク質cDNAの配列。１つのクローンをEDD特異的FC2プライマーを用いて配列決定したときに得られたシークエンシングゲルのオートラジオグラフ。このオートラジオグラフに沿って配列(a)を示す。発表された配列(b)も一緒に示してあり、欠失している塩基を星印で表す。図８．EDDによるユビキチンチオールエステル形成。³⁵S-メチオニンの存在下での末端切断型(A)または全長(B)のEDD野生型または変異型(C2768A)タンパク質のin vitro翻訳に続いて、精製したGST-ユビキチン( またはパートAではGST)融合タンパク質の存在下または非存在下に25℃で10分インキュベートした。4M尿素を含む非還元サンプル緩衝液中25℃で20分インキュベートするか、または100mM DTTを含むサンプル緩衝液中で煮沸した後にサンプルをSDS-PAGE(A，7%ゲル；B，6%ゲル）で分離した。ユビキチン-およびGST- ユビキチン-結合体を矢印で示す。実施例材料および方法試薬ステロイド類および増殖因子は次のソースから入手した。ORG2058(16α-エチル-21-ヒドロキシ-19-ノルプレグナ-4-エン-3,20−ジオン)、Amersham Australi a Pty Ltd(Sydney，Australia);ヒト・トランスフェリン、Sigma Chemical Co． (St．Louis，Mo.);およびヒト・インスリン、Actrapid(CSL-Novo，North Rocks ，Australia)。ステロイドは無水エタノール中の1000倍濃縮ストック溶液として -20℃で保存した。シクロヘキシミド(Calbiochem-Behring Corp.，LaJolla，CA) は水に20mg/mlの濃度で溶解し、濾過滅菌した。アクチノマイシンD(Cosmegen，M erck Sharp and Dohme Research Pharmaceuticals，Rahway，NJ)は滅菌水に0.5m g/mlの濃度で溶解した後すぐに使用した。組織培養用の試薬類は一般的なソースから購入した。細胞培養用いたヒト乳癌細胞系および正常細胞系のソースおよび維持は以前に記載されたとおりにおこない(12，22)、組織培養実験も同様におこなった(12)。簡単に説明すると、プロゲスチン(ORG 2058，10nM)および／またはシクロヘキシミド(20 μg/ml)またはアクチノマイシンD(5μg/ml)を培地に添加し、対照フラスコには同容量のビヒクルのみを添加した。ディファレンシャルディスプレー用のRNAを得るために、細胞をインスリン補充無血清培地で増殖させ、ORG 2058またはエタノールビヒクルで３時間処理した。後続のプロゲスチン刺激実験は5%チャーコールでストリップしたウシ胎児血清を含みインスリンを含まない培地で実施した。 RNA分離およびノーザン分析２つの150cm²フラスコから回収した細胞をプールし、グアニジンイソチオシアネート-塩化セシウム法によりRNAを抽出し、以前に記載されたとおりにレーン当たり20μgの全RNAを用いてノーザン分析をおこなった(3，23)。膜は、Prime-a-G eneラベリングキット(Promega Corp.，Sydney，Australia)を使って[ α-³²P]dCTP(Amersham Australia Pty Ltd)で標識したプローブと一夜(50℃)ハイブリダイズさせた。0.2X SSC(30mM NaCl，3mMクエン酸ナトリウム[pH7.0])/1% ドデシル硫酸ナトリウム中65℃の最も高度のストリンジェンシーで膜を洗浄し、 Kodak X-OMATまたはBIOMAXフィルムに-70℃で露光した。ヒト多組織ノーザンブロットまたはRNA Masterブロット(CLONTECH Laboratories Inc.，Palo Alto，CA )を製造業者が推奨する条件下でハイブリダイズさせた。mRNAの量はMolecular D ynamicsデンシトメーターおよびソフトウェア(Molecular Dynamics，Sunnyvale ，CA)を使ってオートラジオグラフのデンシトメトリック分析により定量した。ローディング(loading)の精度は、膜を18S rRNAに相補的な[γ-³²P]ATP末端標識オリゴヌクレオチドと再ハイブリダイズすることで評価した(24，25)。ディファレンシャル（示差）ディスプレーディファレンシャルディスプレーは、Heiroglyph mRNA Profile Kit No.1(Gen omyx Corporation，Foster City，CA)および推奨されたプロトコールを用いて以前に記載されたとおりにおこなった(11)。96ウェルフォーマットの0.2ml薄壁チューブ内で第１鎖cDNA合成を実施した。典型的には、合成プロゲスチンORG 2058 で３時間処理したT-47D細胞または対照T-47D細胞に由来する200ngの全RNAを、4p molのアンカープライマー(5'ACGACTCACTATAGGGCT₁₂AC)とアニーリングしたあとでExpand Reverse Transcriptase酵素(Boehringer Mannheim Pty Ltd，Castle H ill，Australia)により逆転写した。後続のPCR増幅は、アンカープライマー(0.2 μM)、任意のプライマー(5'ACAATTTCACACAGGAGCTAGCAGAC，0.2μM)およびExpand Long Template Taq DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)と共に[α-³³P]dAT Pを含む２通りの反応液中で、得られたcDNAの10分の１を用いておこなった。PCR 産物を変性し、Genomyx Long Read Sequencing System試薬および装置を用いて4 .5%変性ポリアクリルアミドゲル上で800vにて16時間分離した。ゲルをガラス板の上で乾燥し、Ｘ線フィルムに16〜72時間露光した。関心のあるDD-PCR産物をゲルから切り出し、キット製造業者の推奨する条件下でM13フォワードプライマー( 5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)およびT7プロモータープライマー(5'TAATACGACTCA CTATAGGG)を用いてPCR増幅した。再増幅PCR産物は QIAEX試薬(Qiagen Pty Ltd，Clifton Hill，Australia)を用いて0.8%アガロースゲルから精製した。 cDNAのクローニングおよび配列決定二本鎖DNA鋳型は[³³P]-標識プライマーを用いてfmol DNA Cycle Sequencing S ystem(Promega Corp.)により配列決定した。DD-PCR産物の直接配列決定のために M13プライマーを使用し、pGEM-Tベクター(Promega Corp.)にクローニングしたPC R産物の配列決定にはT7およびSP6(5'GATTTAGGTGACACTATAG)プロモータープライマーを使用した。BlastまたはFastaネットワークサービスを用いてNCBIで配列データベース検索をおこなった。Prositeデータベースに対してペプチドモチーフ検索を実施した。報告されたラット100kDa開始コドンを含む領域(26)に隣接する２つのプライマー(FC2:5'GACGAAGGGCCCTGACTGCGCGAGAAGAAGCおよびR2:5'AAAGAAT TCTGTCATGGAGTCTGAACGTCG)を用いて、ラット視床下部ライブラリー(CLONTECH)から抽出されたcDNAを増幅した。得られたPCR産物をpGEM-T(Promega Corp.)にクローニングし、４つのクローンの配列を決定した。 cDNA 5'末端の迅速増幅(5'RACE) 5'RACEキット(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)を製造業者の指示に従って用いて追加の配列を得た。簡単に述べると、第１鎖cDNA合成を開始させるために遺伝子特異的プライマー(GSP1:5'CACGCTCCAATGCAAGCTGG)を使用した。R NA鎖の除去後、cDNAの5'末端にポリdCを付加し、PCRで増幅した。標的cDNAはアンカープライマー(UAP:5'GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG，ここでIはデオキシイノシンを表す)を第２の遺伝子特異的プライマー(GSP2:5'CGATCTTCCCTGA TTCGAGGTGGC)と共に用いて増幅した。種々のゲル精製PCR産物を、UAPおよび第３の遺伝子特異的ネステッド(nested)プライマー(GSP3:5'CTGTATTGACAATGCTCCACC) によりさらにPCR増幅し、プライミングした。 cDNAライブラリーのスクリーニングオリゴ(dT)およびランダムプライマー(Stratagene，LaJolla，CA)でプライミングしたLambda ZAPIIベクター中のヒト心臓cDNAライブラリーからの10⁶個のプラークをナイロン膜(Hybond N，Amersham Australia Pty Ltd)に移行させ、もとのDD-PCR断片とRACE産物の両方を[³²P]-標識プローブとして用いてスクリーニングした。これによりクローンHl(2.55kb)が分離された。このクローンとRACE産物を使って、オリゴ(dT)およびランダムプライマー(CLONTECH Laboratories，Inc. )でプライミングしたlgt10中のヒト胎盤5'-STRETCHPLUScDNAライブラリーからの 10⁶個の組換え体をスクリーニングした。pBluescriptまたはlgt10中のcDNAクローンの配列決定はベクター特異的または遺伝子特異的プライマーを用いて上記のように実施した。数回の陽性クローンの分離とそのライブラリーの更なるスクリーニングにより、全EDDオープンリーディングフレームをカバーする次のオーバーラップするクローンが分離された：P61(1.95kb)、P43(2.1kb)、Pl(1.5kb)、P1 9(3kb)およびP47(2.1kb)。蛍光in situハイブリダイゼーションクローンH1に対応するプローブをビオチン-14-dATPでニックトランスレーションし、二人の正常男性からの中期染色体に最終濃度20ng/mlでin situハイブリダイズさせた。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法では、以前に記載された方法(27)を改良して、染色体を分析前にヨウ化プロピジウム（対比染色として）とDAPI（染色体同定のため）の両方で染色した。中期調製物の画像は、Cyto Vision Ultraイメージコレクションおよび増強システム(Applied Imaging Int L td)を用いてCCDカメラにより捕らえた。FISHシグナルとDAPIバンドパターンは図の準備のために結合させた。 in vitro翻訳およびタンパク質発現のための組換えcDNAクローンの構築全長EDD配列は、オープンリーディングフレームにわたる３つのPCR産物をpBlu escriptに連結することによりクローン化した。これらの断片を連結するために使用した既存のSalIおよびEcoRI制限部位は図3Aに示してある。推定されるラット100kDaタンパク質に対応する890アミノ酸からなる末端切断型タンパク質（アミノ酸1910〜2799）が翻訳されるように、cDNAのカルボキシル側3分の1をpBlues criptにクローン化した。Spodoptera frugiperda(Sf9)細胞中でBAC-TO-BACバキュロウイルス発現系を用いてタンパク質を発現させるために、同一の末端切断型 cDNA断片をpFASTBAC1発現ベクター(Life Technologies Inc.)にクローン化し、H EK-293細胞への一過性トランスフェクションのために全長EDD cDNAをpRcCMV発現ベクター(Invitrogen，Leek，The Netherlands)にクローン化した。システイン2768のアラニンへの突然変異誘発は、Quick-Change部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を使って、pBluescript中の全長および末端切断型構築物に対して実施した。in vitro転写および翻訳は、TNT T7 Quick coupledウサギ網状赤血球溶解液系(Promega Corp.)および[³⁵S]-メチオニン(1000Ci/mmole， ICN Biomedicals Australasia Pty Ltd，Seven Hills，Australia)を用いておこなった。 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびイムノブロッティング 50mM 4-(2−ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES;pH7.5) 、150mM NaCl、10%グリセロール、1.5mM MgCl₂、1mM EGTA、10mMピロリン酸ナトリウム、20mMフッ化ナトリウム、1mMジチオトレイトール(DTT)、10μg/mlずつのアプロトニンおよびロイペプチン、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF) および200μMオルトバナジン酸ナトリウムを含む1% Triton X100緩衝液中で中期対数期で増殖している細胞を溶解した。この溶解物を遠心により清澄化し、改良したBradford法(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)に従って定量し、一般的には、5% β−メルカプトエタノールを含むSDS-サンプル緩衝液(50mM Tris-HCl ，pH6.8，2% SDS，10%グリセロール，0.2%ブロモフェノールブルー)中の40μgの全タンパク質を6% SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース(TransBlot，Bio-Rad Laboratories)に移し、免疫検出にかけた。EDD特異的ペプチド(SSEKVQQENRKRHGSS)を合成し、グルタルアルデヒドを介してジフテリア毒素に結合させ、これを用いてウサギ抗EDD抗体(AbPE P1という)を生成させた。免疫沈降清澄化した細胞溶解物（典型的には1mgの全タンパク質）またはin vitro翻訳反応物を、10倍過剰の競合用ペプチドの存在下または非存在下に4℃で1〜2時間、対照ウサギ血清またはAbPEP1のいずれかとインキュベートした。プロテインA セファロース4B(Zymed，San Francisco，CA)とのインキュベーション後、免疫沈降物を上記の1% Triton X100溶解緩衝液中で３回洗浄し、SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースに移してAbPEP1でイムノブロットし、適宜にワットマン3MM紙上で乾燥後、オートラジオグラフィーにかけた。ユビキチン結合アッセイ in vitro翻訳し、[³⁵S]-標識した末端切断型（約100kDa）または全長タンパク質のユビキチン結合能は、５μlの翻訳反応物を、５μgの精製GSTタンパク質またはGST-ユビキチン融合タンパク質の存在下または非存在下に25℃で10分インキュベートして試験した(28)。反応混合物を100mM DTT含有SDS-サンプル緩衝液中9 5℃で5分インキュベートするか、またはDTTの代わりに4M尿素を含むSDS-サンプル緩衝液中25℃で20分インキュベートすることにより反応を終了させた。サンプルを6%または7%ゲルのSDS-PAGEで分離し、乾燥後オートラジオグラフィーにかけた。結果プロゲスチン調節cDNAの単離およびノーザンブロット分析合成プロゲスチンORG 2058による3時間の処理に応答して発現レベルが変化しているT-47Dヒト乳癌細胞中のmRNAを同定するために、ディファレンシャルディスプレー法を採用した。アンカープライマー5'ACGACTCACTATAGGGCT₁₂ACを任意のプライマー5'ACAATTTCACACAGGAGCTAGCAGACと共に用いた場合に、対照サンプルよりも処理サンプル中に豊富に存在していた約850bpのcDNA断片が同定され、これをEDDと命名した（図1A）。T-47D細胞由来の全細胞RNAのノーザン分析から、EDD mRNAレベルの観察されたORG 2058誘導には転写が必要であることが示された。というのは、誘導がアクチノマイシンDの存在下でブロックされたからである（図1B）。誘導はシクロヘキシミドによっても妨害され、このことはEDDがプロゲステロン受容体(PR)を介して作用するプロゲスチンにより直接転写的に調節されるものでないことを示唆している（図1C）。 EDD遺伝子発現の組織特異性は、ヒト組織から分離したポリA⁺RNAのノーザンブロットをEDD cDNA断片にハイブリダイズさせることで調べた。9.5kbの単一の転写産物が種々の組織において検出され（図2A）、最高の発現が精巣、心臓、胎盤および骨格筋に見られた。より定量的にローディングしたRNAドットブロットへのハイブリダイゼーション（図2B）から、EDDは試験したあらゆる組織において様々なレベルで発現されており、そのmRNAは精巣に最も多く、脳、下垂体、腎臓で高レベルに発現されることが確認された。有意な発現レベルは胎盤、子宮、前立腺、胃、胎児肺および種々の脳組織でも認められた。EDD mRNAはまた、いくつかの乳癌細胞系（そのうちの全部がプロゲスチン応答性というわけではない）においても発現された（データは示してない）。全長EDD cDNAのクローニング DD-PCRにより単離された元のDD5-1断片は長さが850bpであり、図3Aに模式的に示してある。この断片のDNA配列は既知のいずれのヒト遺伝子配列に対しても相同性を示さない。EDDが誘導された完全なコード配列を得るために、5'RACEとヒト心臓および胎盤cDNAライブラリーのスクリーニングとを組み合わせて用いた。これにより、8.5kbの配列をカバーする一連のオーバーラップするクローンが得られた（図3A;Genbank受託番号AF006010）。ヌクレオチド配列の解析（図3B）は 2799個のアミノ酸からなるオープンリーディングフレームを明らかにした（図3C ）。オーバーラップする1800bpのセグメントにEDD配列を分割し、GenBankデータベースのBlastx検索に用いた。機能が知られたヒト配列に対する唯一の相同性は 50アミノ酸に沿ったポリA結合タンパク質に対してであるが（50%,図3C）、この領域での哺乳動物ポリA結合タンパク質間の類似性は通常ほぼ100%である。 EDDのDNA配列はデータベース中の２つの配列に対して有意な類似性を示した。これらの遺伝子は両方ともユビキチン−タンパク質リガーゼのHECTファミリーに属するタンパク質をコードしているが、それらの特異性は不明である。HECTタンパク質はチオエステル結合を介してユビキチンと結合し得るシステイン残基を含む約300アミノ酸の保存されたドメインを含む。EDDのヌクレオチド5667〜8502はラット100kDaタンパク質のcDNA配列(26)と88%同一であり、ヌクレオチド572〜74 0および3498〜3867はキイロショウジョウバエのhyperplastic discs遺伝子(hyd) の２領域と69%同一であり、ヌクレオチド7560〜8430はhydの3分の1の領域と60% 同一であった。推定上の開始コドンは強力な翻訳開始のためのコンセンサス配列 (ACCATGA，(29))で囲まれており、ショウジョウバエのhyd遺伝子の可能性のある開始コドンに一致する(13)。停止コドンはラット100kDaタンパク質およびhyd遺伝子が共有するものに一致する。EDDと同様に、hyd遺伝子もラット100kDaタンパク質の遺伝子もmRNA転写産物のサイズは9.5kbであると概算されている(14，26)。予想されるEDDタンパク質はHYDに対してアミノ酸残基の40%で同一であり、アミノ酸残基の64%で類似している。一方、EDDのカルボキシル側3 分の1はラット100kDaタンパク質に対して96%の同一性および98.5%の類似性を示す。HYDとEDDとの間で最も高度に保存された領域は図3Cに太字で表してある。これらの領域の２つには、HYDと、EDDと、２つのオーバーラップするコスミド(Gen bank受託番号G1729554およびG1729549)内に含まれるHYDの可能性のあるC．elega ns相同体と、の間で高度に保存されている40〜80アミノ酸の広がりが存在する。 EDDとHYDの間の最長の保存領域は、約400アミノ酸の中心ドメイン(58%の同一性、72%の類似性)、およびHECTドメインと保存システイン残基を含むカルボキシル側の300アミノ酸(64%の同一性、80%の類似性)である。この後の方の領域はまた、酵母RSP5またはPUB-1およびRAD26(14，30，31)を含む他のHECTタンパク質、並びに哺乳動物タンパク質UreB1(19)、Nedd-4(15，20，32，33)およびE6-AP(15，1 7，18)に対しても約30%の同一性および50%の類似性を示した。２つの推定上の核局在化シグナル(34)を除いて、他のコンセンサス機能性ドメインはEDD配列内に確認されなかった。 EDD遺伝子の染色体位置決定 EDD遺伝子の位置確認のためにHISHを採用した。正常な男性からの18の中期染色体を蛍光シグナルについて調べた。これらの中期染色体のうち17が第８染色体の一方または両方の染色分体（クロマチド）において領域q22にシグナルを示した。８つの中期染色体の高分解能研究により、q22.3にシグナルが見られた（図4 ）。これら18の中期染色体には合計４個の非特異的バックグラウンドドットが観察された。同様の結果が第２組の正常男性由来の11の中期染色体に対するプローブのハイブリダイゼーションからも得られた（データは示してない）。この染色体位置は、放射線ハイブリッドパネルGenebridge 4を用いた、EDDに対応するEST (EST116344)の独立した評価結果と一致した。 EDDタンパク質の特徴づけ EDDタンパク質のカルボキシ末端に向かう配列にマッチするEDD特異的ペプチドに対するウサギ抗血清(AbPEP1)は、ウェスタンブロットで、バキュロウイルス系を用いてSf9細胞において発現された末端切断型(100kDa)組換えEDDタンパク質と強く反応した（図5A）。２番目に強く反応する約200kDaのバンドも見られたが、これは抗体の結合がEDDペプチドによって競合しなかったので非特異的であるように見えた。全長EDD cDNAをpBluescriptにクローン化し、ウサギ網状赤血球溶解液系でin vitro翻訳させた。主要産物のサイズはアミノ酸配列から予測された該タンパク質の分子量（約300kDa、図5B）と一致した。翻訳されたタンパク質の正体は、翻訳反応物またはT-47D全細胞溶解物からAbPEP1で免疫沈降させて確認した（図5B）。T-47D細胞からの全細胞溶解物のAbPEP1によるウェスタンブロッティングは２つの主要なバンドを検出し、両方（約230kDaのメジャー種とそれより高分子量のマイナー種）とも競合性ペプチドの存在下で消失した（図5C）。この後者のバンドはサイズがin vitro翻訳タンパク質と一致し、AbPEP1（図5C ）および２つの他のEDD特異的ペプチド抗体（示してない）により免疫沈降する。しかし、230kDaタンパク質は細胞溶解物からこれらの抗体によって免疫沈降しない。ノーザンブロットでは単一のEDD mRNA転写産物が検出されたので、EDDタンパク質は230kDa形態にプロセシングされ、この230kDa形態は天然状態では免疫沈降を受けにくいように折りたたまれていると仮定された。しかし、HEK-293細胞における全長EDDの一過性発現と、その後の全細胞溶解物のウェスタンブロッティングからは、300kDa種のみの発現の増加が明らかになった（示してない）。正常な乳房および乳癌のいくつかの上皮細胞系からの全細胞溶解物のウェスタンブロッティングは、全ての不死化細胞系と癌細胞系においてEDDタンパク質が発現されるが、正常な乳房細胞系184では発現されないことを示した（図６）。ラット遺伝子産物の正体 EDD遺伝子に対して高度に相同である、以前に記載されたラットcDNAは、報告によれば、cDNA配列データから推定された100kDaタンパク質をもたらす。このcD NA配列データはEDDのアミノ酸残基1910に対応する推定上の開始コドン(26)の上流にいくつかのインフレーム(in-frame)停止コドンを示した。これらの停止コドンはEDD cDNAには存在しなかった。さらに、我々は、抗HYD抗体がラット筋溶解物中の約100kDaタンパク質を検出することを確認できたが、たとえヒトおよびラットタンパク質の推定配列がAbPEP1抗体の誘導に使用されたペプチドのあらゆる残基レベルで同一であっても、この種はAbPEP1によって検出されなかった。これは、100kDaタンパク質が実際のラット遺伝子産物であるのか、という疑問を本発明者らに投げかけた。提案された開始コドンの上流の配列の広がりを含み、かつリーディングフレームを変えることによって上流の停止コドンを除く追加の塩基を含むラットcDNAのセグメントがクローン化された（図７）。この明らかな誤りを修正すると、ヒト cDNAによくマッチし、配列全体を通して一つの連続したオープンリーディングフレームが存在するラットcDNA配列が得られる。EDDのアミノ末端側3分の2に対応するラットcDNA配列はクローン化しなかったが、この領域の部分をカバーするマウス発現配列のいくつかがGenBankデータベース（受入れ番号AA183561、AA17726 0、AA183970、AA231351、AA087561）に記録されており、これらは発表されたラット配列の場合に見られるものと同様のレベルのEDD DNA配列類似性を示す。それゆえ、ラット遺伝子の真の産物は100kDaタンパク質ではなく、もっと大きな種として存在しうるように思える。しかし、ラット溶解物において、AbPEP1はヒト (EDD)およびショウジョウバエ(HYD)遺伝子産物と一致する分子量のタンパク質を検出しない。 EDDによるユビキチン結合 HECTファミリーのE3酵素の重要な特性は、HECTドメイン内に保存されたシステイン残基においてユビキチンとチオエステルを可逆的に形成できる点である。この性質はHECTタンパク質であるヒトE6-AP、ラット100kDaタンパク質および酵母R SP5について実証されており、これらの場合にチオエステル結合は還元剤の非存在下ではそのまま残存しているが、100mM DTTの存在下では分解される(14)。保存されたシステイン残基を置換すると、ユビキチンとのチオエステル結合の形成が妨げられる。しかし、この性質はHYDタンパク質の場合には見られない。E3として機能するEDDの能力を評価するために、EDDが保存システインC2768を介してユビキチンと可逆的な結合を形成できるか否かを試験した。³⁵S-標識、in vitro 翻訳した末端切断型タンパク質（約100kDaのカルボキシ末端配列）を、DTTの存在下または非存在下で精製GST-ユビキチン融合タンパク質とインキュベートし、その後SDS-PAGEにかけた（図8A）。 DTTの非存在下では、より高分子量の追加のタンパク質バンドが観察されたが、これはEDD-GST-ユビキチン結合体（約130kDa、図8Aの上の矢印）の予測されたサイズに一致する。この種は100mM DTTの存在下で消失した。このことはその種の形成へのチオエステル結合の関与を示唆している。これはC2768A突然変異を含む in vitro翻訳タンパク質を用いた実験により確認された。すなわち、これらの条件下ではGST-ユビキチンの結合が見られなかった（図8A）。EDDよりわずかに高分子量の種も観察され（図8Aの下の矢印）、これはユビキチン-EDD結合体の形成と一致する（ユビキチンはウサギ網状赤血球溶解液の一成分として存在する）。再度、この種は突然変異型タンパク質を使用したり100mM DTTを存在させると観察されなかった。in vitro翻訳により得られた全長EDDタンパク質に関しても同様の結果が達成された（図8B）。考察培養したヒト乳癌細胞モデル（プロゲスチンに対する明確に規定された増殖性応答が観察される）にディファレンシャルディスプレーPCR法を適用することで、キイロショウジョウバエの腫瘍抑制遺伝子hyperplastic discs(13)のおそらくヒト相同体である新規遺伝子EDDが同定された。EDDはラット100kDaタンパク質(2 6)をコードするcDNAの発表された部分配列に対しても高度に相同性である。３つの遺伝子はすべてが大きな（約9.5kb）mRNAを生成し、2799個のアミノ酸からなる推定全EDDオープンリーディングフレームは、ショウジョウバエhydのそれと40 %の同一性を共有し、他方、EDDのカルボキシル末端側の889アミノ酸はラットタンパク質と96%の同一性を共有する。ウェスタン分析から、EDD遺伝子産物は約30 0kDaのタンパク質であることが示された。このタンパク質はまた、３種の異なるペプチド特異的EDD抗体により免疫沈降され、in vitro翻訳された主要な遺伝子産物のサイズにも一致する。ヒトとラットのタンパク質の推定サイズの大きな相違は、発表された翻訳開始部位に一つの誤りを開示したラットcDNA配列の再試験により明白に解決され、より大きな遺伝子産物が存在する可能性を示した。 EDD、そのラット相同体およびHYDはすべて、カルボキシル末端に高度に相同性のHECTドメインを含み、ユビキチン−タンパク質リガーゼ(E3)として機能するタンパク質のより大きなファミリーのメンバーであることを示す。標的タンパク質のユビキチン化は複数の相互作用性タンパク質、すなわち、ユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2)およびユビキチン−タンパク質リガーゼ(E3) 、の働きで起こる。基質特異性は主としてE3により決定され、E3はユビキチンと結合して、特異的E2との相互作用後の標的タンパク質にユビキチンを移す。HECT クラスのE3の重要な特性は、そのHECTドメインに位置する保存システイン残基を介してユビキチンと共有結合するその能力である(14)。EDDのこの性質は、保存システイン(C2768)が置換されると、そのユビキチン結合能を失うin vitro翻訳タンパク質を用いて実証された。したがって、EDDはE3であると結論された。 E3遺伝子は少数（ヒト由来は２つのみ）しかクローン化されていないが、ユビキチン依存性タンパク質分解は多くの細胞プロセスに関与しており、多くの既知タンパク質を標的としているので、他にも存在しそうである。ユビキチンにより媒介されるタンパク質分解は、細胞周期の進行を制御するうえで極めて重要であり、サイクリン(35-37)やサイクリン依存性キナーゼ阻害剤(38，39)を含む重要な細胞周期調節物質の周期的分解に関与し、また、転写因子(40-43)、腫瘍抑制タンパク質p53(18)および細胞−細胞シグナル伝達成分、例えばβカテニン(44) を標的としている。E3をコードするマウスItch遺伝子座の破壊はリンパ系と胃腸上皮組織の過形成および異常な炎症反応(21)を引き起こし、一方、ヒトE6-APの突然変異は神経系の異常をもたらす。これらは、E3タンパク質の非常に重要な、おそらく組織特異的な、役割を示唆するものである(45)。 EDDとそのラットおよびショウジョウバエ相同体の基質は今後確定されねばならないが、EDDとHYDの中心ドメイン間の保存は、この領域がおそらく基質認識の点で重要な機能を担っていることを示唆する。酵母E3 Rsp5の場合は、基質特異性がアミノ末端ドメインにより決定され、HECTドメインを必要としない(16)。あるいはまた、この領域は、EDDと特異的に相互作用する、今のところはまだ知られていないE2タンパク質の結合に係わっている可能性がある。マウスE3 Nedd4は少なくとも２つの明確に異なるE2結合ドメインをもっており、そのうちの１つだけがHECTドメイン内にある(15)。他方、ヒトE6-APはE2認識のためにHECTドメインのみを必要とする(46)。末端切断型EDDから生産されたタンパク質は依然としてユビキチンと可逆的に結合するので、少なくとも一部のE2認識機能がこのカルボキシル末端ドメインに存在している。保存された中心ドメインのその他の可能な機能としては、細胞局在化または細胞質と核間の移行（トランスロケーション）、補因子結合、リン酸化などが含まれる。ユビキチン化は明らかに細胞周期の進行を調節するといったステロイド応答プロセスに関与しているが、ステロイドホルモンによるユビキチン経路の特異的調節が以前に報告されたことはない。プロゲスチン作用におけるEDDの正確な役割は不明であり、特にEDDが、このホルモンに応答して起こり、最終的に細胞の増殖・分化へのその影響に関与している重要な初期事象に参加しているのかどうか、はっきりしない。de novoタンパク質合成を必要とするEDD mRNAのプロゲスチン調節は一過性で、対照より3〜4倍多い最大レベルが6時間で観察された。したがって、このEDD発現レベルの増加は、同一条件下でORG 2058処理した後のT-47D 細胞のS期フラクションの増加(典型的には、12〜14時間で起こる(3))に先行し、それゆえに、細胞周期の進行を制御するうえで考えられる役割と合致する。同様のレベルのEDD誘導が17β-エストラジオールで処理した抗エストロゲン停止MCF- 7乳癌細胞において観察され（示してない）、これがマイトジェンに対する普遍化応答でありうることを示唆する。しかしながら、EDDが非プロゲスチン標的組織においても発現されることを考えると、プロゲスチン作用を特異的に媒介することよりも広範囲に及ぶ役割が期待される。ショウジョウバエでの突然変異誘発研究からもたらされるHYDの生物学的役割に関する情報が、最終的にEDDの機能についての手がかりを与えるかもしれない。ヌルhyd表現型は致命的であり、踊または幼虫期における重大な突然変異も同様である。それほど重大でない突然変異は、幼虫の成虫芽（羽、足、触角などの成虫構造体を生じさせる細胞増殖の幼虫中心）の過増殖（過形成）をもたらす。こうした過増殖（過形成）は明らかに、成虫芽がその特徴的なサイズに達したときに細胞増殖を停止させることに失敗した結果として起こり、そのためにhydは腫瘍抑制遺伝子であると規定された。生存している成虫は生殖細胞の欠陥のため生殖不能であり、また、興味深いことに、ヒトおよびラットの精巣では EDDとラット100kDaタンパク質のmRNAの発現レベルが高いことが認められ、これらはこの器官での重要な機能を示唆する。ショウジョウバエの腫瘍抑制遺伝子のいくつかのヒト相同体の研究は、これらの遺伝子が細胞増殖を制御するうえで両生物種において類似した役割を担っており、このような遺伝子がヒト遺伝性および散発性癌において重要でありうることを強く示唆している。例えば、patched(47)は、その突然変異が基底細胞癌と関連しており、discs large(45，48)は、散発性結腸直腸癌および家族性腺腫様結腸ポリープ症において突然変異を起こしているAPC遺伝子の標的である。したがって、EDDがヒト腫瘍形成および腫瘍進行に関係しているらしいことには特に興味がもてる。染色体8q22のEDD遺伝子座はしばしば種々の癌において破壊されており、卵巣および肺の腺癌(49，50)、肝細胞癌(51)および頭と首の偏平上皮細胞癌(52)では欠失されており、胃腸癌および原発性乳癌(53，54)を含めた多くの腫瘍型では増幅されており、そして急性骨髄性白血病(55)では転座に関係している。また、染色体8q22はヒトの発達障害であるKlippel-Feil症候群で冒されている領域でもある(56)。本明細書中で用いた略号は次のとおりである。DD-PCR，ディファレンシャルディスプレー・ポリメラーゼ連鎖反応;DTT，ジチオトレイトール;EDD，ディファレンシャルディスプレーにより単離されたE3;FISH，蛍光in situハイブリダイゼーション;GST，グルタチオンS-トランスフェラーゼ;HECT，E6-APカルボキシル末端に相同性の;PAGE，ポリアクリルアミドゲル電気泳動;PMSF，フッ化フェニルメチルスルホニル;PR，プロゲステロン受容体;RACE，cDNA末端の迅速増幅。特定の実施形態として示した本発明に対して、広範囲に記載された本発明の精神もしくは範囲から逸脱することなく、多くの変更および／または修飾をなし得ることが、当業者であれば理解されよう。したがって、ここに記載した実施形態は、すべての点に関して、例示するもので制限するものではないと見なされるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者サザランド，ロバート，エル. オーストラリア国 2070 ニューサウスウェールズ州，リンドフィールド，ノースコートロード 20 (72)発明者ワッツ，コリン，ケイ．，ダブリュ. オーストラリア国 2107 ニューサウスウェールズ州，アヴァロン，アヴァロンパレード 167

Claims

【特許請求の範囲】１．次のN-末端アミノ酸配列：を含むタンパク質または該タンパク質の生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド分子。２．コードされたタンパク質が次のN-末端アミノ酸配列：を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。３．コードされたタンパク質がユビキチン−タンパク質リガーゼであり、約300k Daの分子量を有する、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド分子。４．図3Bに示したヌクレオチド34からヌクレオチド8424までのヌクレオチド配列またはその部分に対して90%以上の相同性を示すヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子。５．図3Bに示したヌクレオチド34からヌクレオチド8424までのヌクレオチド配列またはその部分に対して95%以上の相同性を示すヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子。６．図3Bに示したヌクレオチド34からヌクレオチド8424までのヌクレオチド配列またはその部分に実質的に一致するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子。７．図3Bに示したヌクレオチド34からヌクレオチド8424までのヌクレオチド配列の８ヌクレオチド以上の部分に実質的に一致するかまたは相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、適切に検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブ。８．プロモーター配列に機能しうる形で連結された請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子を含有する発現ベクターまたはカセット。９．請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子で安定に形質転換された非ヒト生物。 10．請求項８に記載の発現ベクターまたはカセットで安定に形質転換された非ヒト生物。 11．実質的に純粋な形の、次のN-末端アミノ酸配列：を含むタンパク質または該タンパク質の生物学的に活性な部分。 12．前記タンパク質が次のN-末端アミノ酸配列：を含む、請求項11に記載のタンパク質。 13．前記タンパク質がユビキチンータンパク質リガーゼであり、約300kDaの分子量を有する、請求項11または12に記載のタンパク質。 14．前記タンパク質が図3Cに示したアミノ酸配列に実質的に一致するアミノ酸配列を含む、請求項11〜13のいずれか１項に記載のタンパク質。 15．請求項11〜14のいずれか１項に記載のタンパク質またはその抗原性部分と特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。 16．抗pEDD抗体と結合することができるタンパク質またはその抗原性部分。 17．被験者におけるプロゲスチン応答性を評価するためのアッセイ法であって、 (i)被験者から細胞または組織を分離し、そして (ii)図3Cに示したアミノ酸配列に実質的に一致するアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出する、ことを含んでなるアッセイ法。 18．ステップ(ii)の前に、分離した細胞または組織をプロゲスチンまたはプロゲスチンのアゴニストもしくはアンタゴニストにさらす、請求項17に記載のアッセイ法。 19．請求項15に記載の抗体またはそのフラグメントを用いてステップ(ii)をおこなう、請求項16または17に記載のアッセイ法。 20．過増殖性疾患を診断する、または過増殖性疾患に罹りやすい素質を判定する方法であって、被験者において、図3Bに示したヌクレオチド34からヌクレオチド8424までのヌクレオチド配列に実質的に一致するヌクレオチド配列を含む遺伝子の多型または変異を検出することを含んでなり、前記多型または変異が過増殖性疾患もしくは過増殖性疾患に罹りやすい素質を示すものである、上記方法。 21．過増殖性疾患が癌である、請求項20に記載の方法。 22．前記癌が乳癌である、請求項21に記載の方法。