CA2339322A1

CA2339322A1 - Genes impliques dans les voies moleculaires de la suppression tumorale et/ou la resistance aux virus

Info

Publication number: CA2339322A1
Application number: CA002339322A
Authority: CA
Inventors: Robert Amson; Adam Telerman
Original assignee: Individual
Current assignee: MOLECULAR ENGINE LABORATORIES
Priority date: 1998-08-05
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2000-02-17
Also published as: WO2000008147A1; EP1105483A1; US6956110B1; FR2782085B1; JP2002524041A; FR2782085A1

Abstract

L'invention concerne des gènes impliqués dans les voies moléculaires de la suppression tumorale et/ou la résistance aux virus, et dont l'expression cellulaire est notamment induite ou inhibée lors de l'apoptose et/ou la suppression tumorale.

Description

WO 00/08147 __ PCT/FR99/01479 GENES IMPLIQUES DANS LES VOIES MOLECULAIRES DE LA
SUPPRESSION TUMORALE ET/OU LA RESISTANCE AUX VIRUS
5 La présente invention concerne la mise en évidence de gènes impliqués dans les voies moléculaires de la suppression tumorale et/ou de 1a résistance aux virus.
La présente invention a été rendue possible par l'isolement d'ADNc correspondant à des ARN messagers exprimés ou réprimés lors de la suppression 10 tumorale et/ou lors du processus d'apoptose induit par le gène suppresseur pS3.
L'un des gènes suppresseurs les plus importants impliqués dans l'apoptose est le gène pS3. Dans sa fonction normale, ce gène contrôle la croissance cellulaire et le processus d'apoptose ; en particulier, c'est ce gène qui bloque la croissance cellulaire et qui doit induire le processus apoptotique afin d'éviter le 15 développement d'un cancer. On a ainsi mis en évidence que des souris nullizygotes pour le pS3 étaient beaucoup plus sensibles à la formation de tumeurs.
On a égaiement mis en évidence le fait que, dans les cancers, le gène pS3 était très souvent altéré et conduisait à la production de protéines incapables de véhiculer le message d'apoptose.
20 C'est cette particularité qui a été mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention.
En effet, la présente invention repose sur la constatation qu'il n'est pas possible, ou du moins qu'il paraît très difficile, de mettre en place une thérapie de substitution directe lors d'un dysfonctionnement du gène p53. En effet, le pS3 23 muté comme il l'est dans le cancer va annuler l'effet physiologique du pS3 normal.
Il a donc fallu renoncer, du moins dans un premier temps, à une thérapie de substitution agissant directement au niveau de pS3.
La présente invention s'est donc attachée à étudier les gènes situés en amont et en aval de p53 afin de « bipasser » la difficulté évoquée précédemment.
30 Af n d'isoler les gènes activés ou inhibés par le pS3 normal {wild-type pS3) on a effectué un ratissage global de l'expression des gènes dans une lignée maligne (KS62) et une cellule dérivée (KS) avec une suppression du phénotype WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479_

2 malin, plus particulièrement, dans une cellule exprimant le p53 normal (KS) dans sa fonction et dans une cellule n'exprimant pas de p53 (K562). La comparaison des gènes exprimés (ARN messagers exprimés dans les deux types de cellule) a permis de mettre en évidence des gènes exprimés différentiellement, c'est-à-dire exprimés dans l'une des cellules alors qu'ils ne le sont pas dans l'autre {les gènes peuvent être activés ou inhibés).
On en déduit aisément que ces gènes sont impliqués dans le processus de cancérisation, dans un cas par leur absence, et, dans l'autre cas, par leur présence.
Pour cette étude différentielle, la méthode utilisée est la méthode décrite en l0 1992 par Liang et Pardee (Differential display o eucaryotic mRNA by mean of a polymerase chaine reaction).
L'approche du problème selon la présente invention a permis d'isoler des séquences directement reliées à une fonction. Dès lors, au contraire du séquençage aléatoire des EST, les séquences sont des séquences dont la fonction est connue et 15 qui sont impliquées dans le processus de suppression du phénotype malin et/ou d'apoptose induit par le gène suppresseur p53 et/ou dans la résistance aux virus.
Ainsi, la présente invention concerne de nouvelles séquences et les gènes les comportant ainsi que l'utilisation de ces séquences, tant au niveau du diagnostic qu'au niveau de la thérapie, de même que pour la réalisation de modèles destinés à
2o tester des produits anti-cancéreux et anti-viraux.
La présente invention concerne tout d'abord une séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant (a) une séquence selon l'une des IND.SEQ 1 à 15 ou un gène équivalent qui comporte:
25 (b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a), (c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec (a) ou (b), ou (d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon (a), {b) ou (c) ou pour une protéine équivalente, et leur application notamment dans la suppression du cancer et/ou la résistance 3o aux virus ainsi que dans le suivi thérapeutique.
Il convient de rappeler que les séquences 1 à 15 ne constituent qu'une partie des gènes en cause mais que la présente invention couvre aussi bien la WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479

3 séquence nucléotidique correspondant au gène entier que des fragments de ce gène, notamment lorsqu'ils codent pour une protéine équivalente comme cela sera décrit ci-après.
Les séquences nucléotidiques peuvent être aussi bien de l'ADN que de 5 TARN ou des séquences dans lesquelles certains des nucléotides sont non naturels, soit pour améliorer leurs propriétés pharmacologiques, soit pour permettre leur identification.
Les séquences mentionnées en (b) sont essentiellement les séquences complémentaires totales ou partielles (notamment pour les cas évoqués lo précédemment).
Ainsi, l'invention concerne également les séquences nucléotidiques des gènes présentant une forte homologie avec les gènes mentionnés précëdemment, de préférence une homologie supérieure à 80 % sur les parties essentielles desdits gènes, soit en général au moins SO % de la séquence, de préférence l'homologie 15 sera sur ces parties supérieure à 90 %.
Enfin, lorsque lesdits gènes codent pour une protéine, la présente invention concerne également les séquences codant pour la même protéine, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, mais également pour les protéines équivalentes, c'est-à-dire produisant les mêmes effets, notamment les protéines 2o délétées et/ou ayant subi des mutations ponctuelles.
Les séquences selon la présente invention sont plus particulièrement les séquences qui sont induites ou inhibées lors de l'apoptose cellulaire, notamment celles induites par p53 et/ou p21 et/ou TSAP3 (HUMSIAH) et/ou antisens-TSIP2 (antisens-PS1). En d'autres termes, ces séquences correspondent à des gènes dont 25 l'expression cellulaire est activée par l'un au moins des transfectants choisi dans le groupe comprenant les transfectants p21, les transfectants TSAP3 et les transfectants anti-sens TSIP2.
Lesdits gènes sont regroupés en TSAP ou "Tumor Suppressor Activated WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479_

4 Pathway", et dénommés de TSAP 9 à TSAP 22 correspondant aux TND.SEQ I à
14, et en TSIP ou "Tumor Suppressor Inhibited Pathvay", et dénommé TSIP 3, correspondant à IND.SEQ 15.
Les caractéristïques des séquences sont rassemblées dans les tableaux ci-3 annexés.
Les séquences nucléotidiques correspondant aux gènes TSAP sont des séquences exprimées lors du processus d'apoptose alors que lorsqu'ils ne sont pas exprimés le processus d'oncogénèse se poursuit. II est donc intéressant:
- de détecter toute anomalie dans le gène correspondant, laquelle peut conduire à
l0 une plus grande susceptïbilité à l'oncogénèse, et - de pouvoir prévoir une thérapie de remplacement.
Il faut d'ailleurs rappeler que ces gènes peuvent intervenir dans d'autres processus que les processus de suppression tumorale ; en effet, p53 est en quelque sorte le gardien de l'intégrité du génome, dans ces conditions les gènes TSAP
ou 15 TSIP sont sans doute également impliqués dans cette fonction de contrôle, c'est donc l'ensemble des altérations possibles du génome qui peuvent être redevables de la détection et de la thérapie précédente. Au contraire, !es gènes 'TSIP
sont exprimés lors de I'oncogénèse et cette expression est diminuée voire inhibée lors de l'apoptose et de la suppression tumorale, il est donc là aussi intéressant de 20 détecter l'éventuelle anomalie des TSIP et également de prévoir une thérapie d'inhibition/biocage.
La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à-dire en introduisant le gène TSAP avec les éléments qui permettent son expression in vivo. Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut 2~ utiliser des vecteurs particuliers, viraux ou non viraux, par exemple des adénovirus, rétrovirus, virus herpès ou poxvirus. La plupart du temps ces vecteurs sont utilisés sous forme défectifs qui serviront de véhicules d'expression de TSAP
avec ou sans intégration. Les vecteurs peuvent être également synthétiques, c'est-à-dire mimer des séquences virales, ou bien être constitués par de l'ADN ou de 30 l'ARN nu selon la technïque développée notamment par la société VICAL.

WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479 Dans la plupart des ças, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression tissus ou organes spécifiques, en effet, il n'est pas possible d'envisager d'activer un phénomène d'apoptose incontrôlé.
La présente invention concerne donc l'ensemble des vecteurs décrits

5 précédemment.
La présente invention concerne également les cellules transformées par un vecteur d'expression tel que décrit précédemment ainsi que la protéine pouvant être obtenue par culture de cellules transformées.
Les systèmes d'expression pour produire des protéines peuvent être aussi 10 bien des systèmes eucaryotes tels que les vecteurs précédents que des systèmes procaryotes dans des cellules de bactéries.
L'un des intérêts de la présente invention est qu'elle a mis en évidence l'implication de plusieurs gènes dans l'apoptose ; ainsi, la surexpression de l'un des gènes par thérapie génique peut, pour certains d'entre eux, ne conduire à
15 l'apoptose que les cellules dans lesquelles s'expriment déjà d'autres gènes déréglés, c'est-à-dire des cellules malignes.
La présente invention concerne également, à titre de médicament, un composé assurant l'expression cellulaire d'au moins une des séquences nucléotidiques précédentes lorsqu'elle est induite lors de l'apoptose et/ou de la 20 suppression tumorale, notamment des gènes TSAP 9 à TSAP 22, ou au contraire assurant l'inhibition de l'expression cellulaire d'au moins une séquence cellulaire telle que décrite précédemment lorsqu'elle est inhibée lors de l'apoptose et/ou de la suppression tumorale, notamment TSIP 3. Il peut s'agir par exemple d'un nucléotide activé assurant le blocage de la séquence nucléotidique ou encore d'un 25 anticorps monoclonal dressé contre la ou les protéines) codées) par la séquence nucléotidique.
Par ailleurs, il est possible de prévoir d'autres approches que la thérapie génique, notamment l'utilisation de séquences nucléotidiques en stratégie sens ou antisens, c'est-à-dire pouvant bloquer l'expression de TSIP ou au contraire, 30 agissant en amont, favorisant l'expression de TSAP.
On peut également prévoir une stratégie de remplacement directe par apport de protéines correspondant à TSAP ou d'anticorps inhibiteurs WO 00/08147 __ PCT/FR99/01479_

6 correspondant à TSIP, Enfin, il est possible de prévoir l'utilisation de molécules non protéiques dont l'activité sera d'activer TSAP ou de mimer l'action de son produit d'expression ou bien d'inhiber TSTP ou bien de bloquer l'action de son produit 5 d'expression.
Ces produits peuvent être aisément testés sur les cellules modifiées qui sont décrites dans les exemples en introduisant les produits à tester dans la culture cellulaire et en détectant l'apparition du phénomène apoptatique.
Dans les stratégies à ADN, ARN ou protéique tes produits sont bien entendu lo élaborés en fonction des séquences qui sont décrites.
La présente ïnvention concerne en particulier l'utilisation des médicaments précédents en tant qu'agent anti-cancéreux.
Mais le produit des gènes TSAP 9 à 22 et TSIP 3 est également utile comme agent antiviral, comme cela apparaîtra à la lecture de l'exemple.
15 La présente invention concerne donc également l'utilisation des médicaments précédents comme agent antiviral.
De plus, la présente invention concerne à titre d'agent de diagnastic pour la détermination de la prédisposition au cancer, tout ou partie des séquences selon l'invention à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce 2o d'amplification, mais également à titre d'agent de diagnostic pour la détermination de la prédisposition au cancer un antigène correspondant à tout ou partie des protéines codées par la séquence selon l'invention ou les anticorps correspondants, éventuellement après culture.
Les méthodes de diagnostic sont connues, il peut s'agir, par exemple, de 25 techniques de microséquençage des parties variables après isolement et amplification éventuelle, ou des méthodes de détection type RFLP, ou d'amplification simple notamment. Les techniques différentielles peuvent, en particulier, permettre de mettre en évidence l'écart entre le TSAP {ou TSIP) normal et anormal.
30 L'invention concerne également des modèles mettant en oeuvre les séquences précédentes.
Par ailleurs, il convient de souligner que les inventeurs, ont mis en

7 ,_ PCT/FR99/01479 évidence, par extension des séquences conformes à l'invention initialement mises en évidence, des homologies présentées par lesdites séquences étendues avec des séquences correspondant à des protéines connues.
Plus particulièrement, outre l'homologie de TSAP 9 avec une chaperonine s de souris contenant le gène TCP-1 (9), les inventeurs ont mis à jour une forte homologie que présente TSAP 13 avec la sous-unité p40. S du protéasome humain (10, 11) et une forte homologie que présente TSAP 21 avec la syntaxine 11 appartenant au groupe des protéines SNARE (12).
Les chaperonines interviennent dans le processus de repliement et 10 l'assemblage des protéines dans le cytosol eucaryote. EIles sont soupçonnées de ralentir ce repliement en piégeant des intermédiaires qui s'agrégeraient sans cela.
Parmi les protéines sur lesquelles agirait la chaperonine contenant le gène homologue de TSAP 9, on peut citer l'actine, la tubuline et la protéine de capside du virus de l'hépatite E.
15 Le protéasome, au méme titre que l'ubiquitine, est le principal composant du système protéolytique majeur responsable de la dégradation de nombreuses protéines intracellulaires, y compris de protéines aberrantes résultant de mutations ou de stress environnementaux. La sous-unité p40.5 du protéasome 26S humain a récemment été mise en évidence, ainsi que son homologue chez la lewre Nas7p.
2o Chez l'homme, le mRNA correspondant à la susdite sous-unité est plus particulièrement exprimé dans le pancréas, le placenta, les testicules, le coeur et le muscle squelettique. Il semble par ailleurs que ies cellules de levures déficientes pour Nas7p soient particulièrement sensibles au stress dû à la chaleur. Ceci contribue à suggérer que la fonction du protéasome 26S est dégradée lors d'un 23 stress dû à la chaleur.
Les protéines SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor- -attachment protein receptor) sont des protéines dont l'expression différentielle et les associations sont impliquées dans l'organisation des compartiments membranaires des cellules. Ces protéines sont spécifiquement localisées dans la 3o région de l'appareil de Golgi, des endosomes et des lysosomes, ce qui suggère qu'elles jouent un rôle: dans la régulation des échanges membranaires à partir de WO 00/08147 ,. PCT/FR99/01479_

8 ces organelles. Plus particuliérement, la syntaxine 11 serait localisée dans la région post-Golgi.
Il serait intéressant de pouvoir déterminer si les voies moléculaires dans lesquelles sont impliquëes les séquences conformes à l'invention présentent des 5 points communs avec les voies moléculaires dans lesquelles sont impliquées les susdites protéines, ce qui permettrait d'envisager de nouveaux modes d'action sur les susdites séquences à des fins par exemple thérapeutiques ou diagnostiques.
La Figure 1 représente la séquence de TSAP 13 étendue (SEQ ID N°
5).
La partie soulignée correspond à la séquence telle que mise à jour à l'origine par 10 les inventeurs. Les caractères gras correspondent à la séquence présentant d'homologie avec la sous-unité p40.5 du protéasome 26S humain.
La Figure 2 représente la séquence de TSAP 21 étendue (SEQ ID N°
13).
La partie soulignée correspond à la séquence telle que mise à jour à l'origine par les inventeurs. Les caractères gras correspondent à la séquence présentant 100 15 d'homologie avec la syntaxine 11 du groupe des protéines SNARE
D'autres caractérïstiques de l'invention apparaîtront à la lecture de l'exemple ci-après.
2o MATERIELS ET METHODES
Cultures cellulaires Les cellules K562. KS. KS2 et KS3 ont été utilisées comme modèles. La lignée K562 est une lignée tumorale, dérivée d'une leucémie chronique de type érythromyéloïde. Elle est caractérisée notamment par un chromosome de 25 Philadelphie qui contïent la translocation (9,22), où il y a un réarrangement du gène bcr avec te proto-oncogène abl. Cette lignée a par ailleurs un caryotype anormal et surexprime les oncogènes myc et pim-1. Ces lignées sont décrites dans la référence A. Telerman et al. : A model for tumor suppression using H-1 parvovirus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90, pp. 8702-8706, September 1993.
3o En résumé, un monoclone de K562 a été infecté par le parvovitus H-1.
Cette infection a causë une mort massive de la culture cellulaire. Après un maintien de cette culture pendant une période de deux mois, le clone KS a été

WO 00/08147 ., PCT/FR99/01479

9 isolé. La même expérience effectuée une seconde fois a fourni, après trois mois d'incubation, les clones KS2 et KS3.
En employant la même approche, les inventeurs ont dérivé d'une population de cellules malignes U937 les lunées US3 et US4 qui sont résistantes au parvovirus H-I et qui présentent une suppression du phénotype malin. Ces lignées sont décrites dans la référence (7).
Des cellules de leucémie myéloïde M1 et des cellules M1 ont été
transfectées de façon stable avec un mutant sensible à la température val 135 p53 (LTR6).
lo Ces cellules sont cultivées sur milieu RPMI 1640 avec IO % FCS à 5 % de C02 à 37°C (3). Pour la modification de la température, les cultures sont placées dans un second incubateur à 32°C.
Lunée U937 transfectée par p21 W''r1 ~ la partie codante complète du cDNA du gène p21 W~~ a été clonée dans le vecteur pBK-RS V (Stratagene, La 1~ Jolla, Californie). 3,5 millions de cellules U937 ont été transfectées avec microgrammes d'ADN/30 microgrammes Lipofectin (Life Technologies;).
Les transfectants stables ont été sélectionnés à l'aide de 1,5 mg/ml de 6418 (Sigma). Les caractéristiques de cette lignée décrivent notamment une suppression du phénotype malin.
2o Lignée U937 transfectée par TSIP~ (PSI) en~osition antisens : la partie codante complète du cDNA du gène TSIP2 (PS I ) a été clonée en position antisens dans le vecteur pBK-RSV (Stratagene, La Jolla, Californie). 3 millions de cellules U937 ont été transfectées avec 20 microgrammes d'ADN/30 microgrammes Lipofectin {I,ife Technologies).
25 Les transfectants stables ont été sélectionnés à l'aide de 1,~ mg/ml de 6418 (Sigma). Les caractéristiques de cette lignée, décrivant notamment un ralentissement de la croissance, une activation de l'apoptose et une suppression du phénotype malin, ont été décrites dans la référence (8).
Lignée U937 transfectée par TSAP3 (HUWSIAH) : la partie codante 3o complète du cDNA du gène TSAP3 a été clonée dans le vecteur pBK-RSV
(Stratagene, La Jolla, Californie). 3 millions de cellules U937 ont été
transfectées avec 20 microgrammes d'ADN/30 micro~rammes Lipofectin (Life Technologies).

WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479_

10 Les transfectants stables ont été sélectionnés à l'aide de 1,5 mg/ml de 6418 (Sigma). Les caractéristiques de cette lignée, comportent notamment une activation de l'apoptose et une suppression du phénotype malin.
5 Etude des ADNc différentiels Pour effectuer les tests dans des conditions expérimentales standards et pour obtenir une reproductivité totale des résultats, les modifications suivantes au protocole d' origine ( 1 ) ont été effectuées On utilise toujours des ARNm polyA+ purifiés deux fois sur colonne 1o d'oligodT utilisant Fast Track (Invitrogen, San Diego CA). Après transcription réverse (M-MLV Reverse Transcriptase, Gibco BRL) sur 0,05 ~g de polyA+
utilisant 20 N.M de chacun des dNTP (Boehringer-Mannheim), aucun dNTP
additionné n'est ajouté au mélange de PCR final. Un « hot start » à
94°C pendant S minutes est effectué avant la PCR (GeneAmp PCR system 9600 Perkin Elmer 15 Cetus). Les échantillons sont refroidis rapidement sur de l'eau glacée. Un « touch down » (2) de 10 cycles de 50°C à 40°C est effectué (94°C
30 secondes - 50°C 1 minute - 72°C 30 secondes), suivi par 35 cycles (94°C 30 secondes - 40°C 1 minute - 72°C 30 secondes) et une extension finale de 5 minutes à
72°C. Les produits de la PCR sont séparés sur gels de polyacrylamide à 6 % non dénaturant 20 (4). Les gels sont exposés sans séchage. Chaque présentation différentielle est effectuée en comparant M1S6 et LTR6 à 37°C et après 4 heures d'incubation des deux lignées cellulaires à 32°C.
La procédure de présentation différentielle est répétée dans 3 expériences différentes pour confirmer une parfaite reproductibilité.
23 Les bandes exprimées différentiellement sont découpées à partir du gel, éluées et réamplifiées (1). Les produits de PCR sont sous-clonés en utilisant le système TA-cloning (Invitrogen, San Diego CA) en suivant les indications fournies.
Pour chaque réaction de ligation, 10 clones recombinants sont séquencés 3o en utilisant le système automatique ABI.
Extraction des ARN, analyses et sondes Northern blots WO 00/08147 ._ PCT/FR99/01479_ L'ARN total est extrait avec du Trizol (Life Technologies). Les ARN
polyl+ sont préparés en utilisant le kit OligotexdT (Qjagen, CA). 30 p.g de l'ARN
total ou 2 ~g d'ARN polyA+ sont séparés sur agarose 1 % 1 x MOPS/2 % gel de formaldéhyde, transférés sur membrane de nylon (Hybond N+, Appligène, 5 France) comme cela a été décrit précédemment (5). Les Northern Mots sont hybridés avec des sondes marqués au P32 sur les inserts TSAP et TSIP et lavés comme décrit précédemment (5). Pour vérifier l'induction de la fonction du p53 sauvage, les Northern blots sont hybridés avec une sonde cycline G (6). A
titre de contrôle pour la quantité d'ARNm chargée, les bots sont hybridés avec une sonde lo GAPDH. Différents Northern blots (Clontech CA) sont utilisés dans des conditions identiques et hybridés pour contrôle avec une sonde [i-active. Les Northern blots sont exposés pendant 10 jours à - 80°C.
Exemple 1 15 Le but recherché est de caractériser les voies moléculaires qui mènent à la suppression du cancer.
De façon à élaborer un modèle, on a fait l'hypothèse suivante : s'il était possible de sélectionner, à partir d'une tumeur qui soit sensible à l'effet cytopathique du parvovirus H-1, les cellules qui étaient résistantes, cette résistance 2o pourrait être due à un changement de leur phénotype malin. Ceci a pu être démontré pour les cellules KS sélectionnées à partir des cellules érythro-leucémiques K562. Contrairement à la lignée parentale K562, les clones KS, KS2 et KS3 sont résistants à l'effet cytopathique du parvovirus H-1. En outre, les cellules KS, KS2 et KS3 ont une réduction de leur tumorigénicité de 90 %, alors 25 que cultivées dans du "sort agar", ces mêmes lignées KS ont une réduction de leur tumorigénicité in vivo lorsqu'injectées dans des souris immunodéprimées Scid-Scid. Au niveau moléculaire, on a pu remarquer que cette suppression du phénotype malin allait de pair avec une réexpression du gène suppresseur p53.
15 ADNc exprimés de manière différentielle entre les cellules K562 et KS
30 ont été isolés. TSAP 9 est homologue aux chaperonines.
Le Tableau 1 rassemble ies molécules caractérisées, en reprenant les amorces ainsi que les tailles des mRNAs détectés par Northern blot.

WO 00/08147 ,. PCTlFR99/01479_ De ces 15 molécules, toutes sont induites dans les cellules KS, hormis TSIP 3, dont l'expression est~inhibée durant la suppression du phénotype malin.
Dans des expériences de transfection, on a également pu démontrer que la résistance à l'effet cytopathique du parvovirus H-1 allait de pair avec une fonction 5 intacte du gène p53 et que des cellules transfectées avec des mutants p53 devenaient sensibles à l'et~et cytopathique du parvovirus H-1.
Les 15 molécules que nous avons isolées codent donc des gènes dont la surexpression ( TSAP '9 - TSAP 22) ou l'inhibition ( TSIP 3) est associée non seulement à la suppression du cancer mais également à la résistance au parvovirus lo ~-I-1. Ces gènes codent par conséquent pour des molécules faisant partie des voies moléculaires de la suppression du cancer et sont de potentiels gènes suppresseurs.
Afin de mieux cerner les voies d'activation p53/p21, les inventeurs ont étudié
- l' activation de ces TSAP / inhibition des TSIP dans le modèle p53 15 thermosensible développé dans Moshe Oren, - l'activation de ces TSAP / inhibition des TSIP dans le modèle où les cellules U937 sont transfectées par le gène p21, - l'activation des nouveaux TSAP / inhibition des TSIP dans le modèle où ies cellules U937 sont transfectées par le gène TSAP3, et 2o - l'activation de ces nouveaux TSAP/TSIP dans le modèle où les cellules U937 sont transfectées par le gène TSIP2 (PS1) en position antisens.
Le Tableau l ci-après rend compte de résultats d'expressions différentielles analysées par Northern blot des différentes sondes (TSAP9 TSAP22, TSIP3) du modèle K562/KS ainsi que des autres modèles U937/US3 2~ US4, c'est-à-dire dans un modèle de suppression tumorale dans lequel le gène p21 est activé par la voie p53 indépendante. Ces ADNc sont donc activés dans deux systèmes cellulaires différents de suppression tumorale (le modèle d'érythroleucémie K562/KS et le modèle myélomonocytaire U937/US).
D'après ce tableau, on constate que dans la majeure partie des cas, les 3o gènes exprimés différentiellement dans le modèle K562/KS sont également exprimés différentiellement dans ie modèle U937/LJS3-US4. Il existe donc une machinerie moléculaïre de la suppression tumorale commune à différents types de WO 00!08147 .. PGT/FR99/01479_ cancer. Cette conclusion est également valable pour le modèle Ml/LTR-6. Il Faut noter dans ce dernier cas que l'absence de signaux dans certains TSAP-TSIP est probablement due au fait que les expérimentations ont été réalisées dans deux systèmes hétérologues (des sondes humaines sur de l' ARN de souris).

WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479 _ CLONE A AMORCES SONDE ADNc MODELE
E.~PRESSION 3' ET 5' IC562/IVS FiOhIOLOCIE 1C561JIVS
' DIFFRENTIELLE mRNA Icb TSAP 9 T11AA-9 K26 D3 Cha eronine02,6 TSAP 10 T11AA-9 K25.0 Al l 1,6 TSAP 11 T11AA-9 K25.0 B7 EST 2,9 TSAP 12 TI lAA-9 K27.1 C7 EST 5,5 TSAP 13 T11AA-23 K25.1 F3 Protasome 1,8 TSAP 14 T11AC-5 K33.2 F10 EST 2,5 TSAP 15 T11AG-19 K22 E3 EST I,6 TSAP 16 T11GC-2 K12.1 FS 2,8 TSAP 17 TI1GC-12 K16.1 C7 1,8 TSAP 18 T I 1 GG-5K3.1 D2 EST 2,0 TSAP 19 T11GG-23 K5.2 E 10 EST 1,5 TSAP 20 TI1GG-23 K5.1 A12 1,7 TSAP 21 T1IGG-23 K5.1 A1 SNARE 2,1 TSAP 22 T11GG-5 K3.1 A12 EST 2,8 TSIP 3 T11AC-5 K33.1 B11 EST 9,5 * les chiffres et les séquences des amorces en 5' correspondent à ceux rapportés par Bauer et al.
0 HUMTCG1DD ARNm humain pour l'ORF (équivalent humain de la chaperonine de souris contenant le gène TCP-1 (t-complexe polypeptide).
° Sous unité p40.5 du Protéasome (Nas7p) ° Syntaxine 11 SNARE;

WO 0(1/08147 .. PCT/FR99/01479 I~
TABLEAU 1 (suite) CLONE A MODEL U937/US3-US.I CLONE a hIODELE
ERPRESSION E.\pRl?SSIONMl/LTR-6 DIFFRENTIELLERSULTAT mRNA DIFFERI?\'l'IELLERSULTAT hIRNA
kb kb TSAP 9 EXP. DIFI~2,0 TSAP 9 Exl' 2 DIFir 6 . , .

TSAP 10 EXP. DIFF.1,6 TSAP 10 NO SIGNAL1 , TSAP 11 NO EXf'. 2,8 TSAP 11 NO SIGNAL2 , TSAP 12 NO SIGNAL 5,5 TSAP 12 NO SIGNAL5 , TSAP 13 EXP. DIFF.1,5 TSAP 13 EXP 1 . , .

TSAP 14 EXP. DIFF.2,8 TSAP 14 EXP 2 TSAP IS Eue. DIS. 1,8 TSAP IS . , . 1 NO StcrrAL6 , TSAP 16 EXP. DIFF.2,0 TSAP 16 EXP 2 . , .

TSAP 17 EXP. DIFF.1,9 TSAP 17 EXP 1 . , .

TSAP 18 NO Exla. 1,8 TSAP 18 ExP 2 DIFF. DIS 0 TSAP 19 EXP. DIFF.1,6 TSAP 19 . , . 1 , TSAP 20 EXP. DIFF.1,9 TSAP 20 NO SIGNAL1 TSAP 21 EXP. DIF'F.1,9 TSAP 21 EXP , I

. , .

TSAP 22 EXP. DIFF.2,6 TSAP 22 E;G' 2 TSIP 3 EXP. DIFF.9,5 TSIP 3 . , . 9,5 NO SIGNAL

EXP DIFF. = Expression différentiel le NO EXPR. DTFF. = Pas d'expression différentielle WO 00/08147 ,. PCT/FR99/01479 Le Tableau 2 ci-après résume l'expression différentielle de certaïns clones TSAP et TSIP dans ditiérentes lignées de transfectants.
Il se dégage de ce tableau que, dans la majeure partie des cas, les 5 transfectants p21 ou transfectants TSAP3 ou transfectants antisens-TSIP2 sont capables d'activer la machinerie moléculaire de ia suppression tumorale commune aux systèmes U937/US et K562/KS.

lo TRANSFECT.1NTSTR.-1NSFECTrINTSTR-~.~iSFECTANTS
CLONE PZ1 TS.~P3 TSIP2 E.1PRESSION E.\YItESSION A1VTISENS
DIFFERENTIELLEDIFFRENTIELLE E.~PRESSIOV
DIFFRENTIELLE

WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479_ Le Tableau 3 ci-après récapitule les caractéristiques d'expression différentielle des clones d'ADNc par Northern blot.

cDNA mRNA HOMOLOGIEK562/KU9371USU937 U937 U937 clones kb p21 AS SIAHrTSAP3 TSPA9 2,6 Cha eronine0D D D D D

TSAP10 1,6 EST D D D D D

TSAP11 2,8 EST D N N N N

TSAP12 5,5 EST D N N N N

TSAP13 1,8 ProtasomeD D D D D

TSAP14 2,5 EST D D D D D

TSAP15 1,6 EST D D D D D

TSAP16 2,5 NO D D N N D

TSAP17 1,8 NO D D D N N

TSAP 2,0 EST D N N D D

TSAP19 1,5 EST D D N N N

TSAP20 1,7 NO D D D D N

TSAP21 2,1 SNARE D D D D D

TSAP22 2,6 EST D D D D D

TSIP3 9,5 EST D D D D D

D : Expression dif~'érentielle lo N : Pas d'expression différentielle 0 : Chaperonine contenant le gène TCP 1 ° : Sous unité p40.5 du protéasome (Nas 7p) ° : Syntaxine 11 SNARE

WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479_ REFERENCES
( 1 ) Liang P. & Pardee A.B. ( 1992) Science, 257, 967-971 (2) Don R.H., Cox P.T., Wainwright B.J., Baker K. & Mattick J.S. (1991) Nucl.
. Acids Res., 19, 4008 (3) Yonish-Rouach E., Resnitzky D., Lotem J., Sachs L., Kimchi A. 8c Oren M.
(1991) Nature 352, 345-34?
(4) Bauer D., Muller H., Reich J., Riedel H., Ahrenkiel V., Warthoe P. &
Strauss M. (1993) Nucl. Acids Res. 21, 4272-4280 lo (5) Sambrook J., Fritsch E.F. & Maniatis T. (1989) Molecular Cloning : a laboratory manual (6) Okamoto K. & Beach D. ( 1994) EMBO J., 13, 4816-4822 (7) NemaniM., Linares-Cruz G., Bruzzoni-Giovanelli H., Roperch J.-P., Tuynder M., Bougueleret L., Cherif D., Medhioub M., Pasturaud P., Alvaro 15 V., Der Sarkissan H., Cazes L., Le Paslier D., Le GaII L, Israeli D., Dausset J., Sigaux F., Chumakov L, Oren M., Calvo F., Amson R. B., Cohen D. and Telerman A., Activation of the human homologue of the Drosophila Bina gene in apoptosis and tumor suppression, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1996) 93, 9039-9057 20 (8) Roperch J.-P., Alvaro V., Prieur S., Tuynder M., Nemani M., Lethrosne F., Piouffre L., Gendron M-G., Israeli D., Dausset J., Oren M., Amson R., and Telerman A., Inhibition of presenilin 1 expression is promoted by p53 and p21 WAF-1 and resuIts in apoptosis and tumor suppression, Nature Medicine (1998) 4, 835-838.
25 (9) Kubota et al., 1995, Eur. J. Biochem. 230, 3-16, (10) Hori et al., 1998, Gene, 216, 113-122,

(11) Baumeister et al., 1998, Cell, Vol. 92, 367-380,

(12) Advani et al., 1998, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, N° 17, 10317-I 0324.

WO 00/08147 .. PCT/PR99/01479_ LISTAGE DE SEQUENCES
<110> FONDATION JEAN DAUSSET (CEPH) <120> SEQUENCES ASSOCIEES A LA SUPRESSION DES CANCERS ET A LA

<130> D16333 <160> 15 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 303 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSRP9 <400> 1 tcggtcatag tctggatggg attcatgata tgaagcaaca gcatgtcata gaaaccttga 60 ttggcaaaaa gcaacagata tctcttgcaa cacaaatggt tagaatgatt ttgaagattg 120 atgacattcg taagcctgga gaatctgaag aatgaagaca ttgagaaaac tatgtagtaa 180 gatccacttc tgtgattaag taaatggatg tctcgtgatg cgtctacagt tatttattgt 240 tacatccttt tccagacact gtagatgcta taataaaaat agctgtttgg ttaaaaaaaa 300 aaa 303 <210> 2 <211> 1356 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP10 <400> 2 tgagcagggc gacggcggcg gtggaacctg cggggctggg gcgccgccat gggcgcctgc 60 actgcactga ggacccggtg ccggaccggt gggcggcgac atgcagcagc tgaaccagct 120 gggcgcgcac gagttctcag ccctgacaga ggtgcttttc cacttcctaa ctgagccaaa 180 agaggtggaa agatttctgg ctcagctctc tgaatttgcc accaccaatc agatcagtct 290 tggctccctc agaagcatcg tgaaaagcct ccttctggtt ccaaatggtg ctttgaagaa 300 gagtctcaca gccaagcagg tccaggcgga tttcataact ctgggtctta gtgaggagaa 360 agccacttac ttttctgaaa agtggaagca gaatgctccc acccttgctc gatgggccat 420 aggtcagact ctgatgatta accagctcat agatatggag tggaaatttg gagtgacatc 480 tgggagcagc gaattggaga aagtgggaag tatattttta caactaaagt tggtggttaa 540 gaaaggaaat caaaccgaaa atgtgtatat agaattaacc ttgcctcagt tctacagctt 600 cctgcacgag atggagcgag tcagaaccag catggagtgt ttctgctgat ttctgtccct 660 gcatctcccc tggccccgtt ccctgccctc ctcccttccc tgggtgactg ctctgagagg 720 cacttcactc acaggcctgt gggatgctcc atggggccct gctggctcca tggggcccag 780 gtgcaaaggg tttctgaaaa acagcaggat taagtactga aagagcccaa cacaattacc 840 ctgtaaactc tctgttaggg caaccaccac cacctgtctt ccaggacaca tttttagata 900 ctctgacagg ccactgcatc tcagattcag gggagaaaat aagttgtcac ctccccttca 9fi0 aagttccaga gtaaacaaat ggtgccatca ttcaagataa catgctgatc accctcctcc 1020 caaaaagcaa gagcttgttt atggctgagg aatcggcgga ttgtctgaat gacacatata 1080 cagagccccc acggatttct gcacactctg ggtctgtgct ggtggaacat tgccaatcag 1140 WO 00/08147 .. PC,'T/FR99/01479.

ttcttaatga ggcacctgtg tgtaaataca tgcttggtct tctctgcaga gaactgaggc 1200 taaactctgt ccctacttct ggttttgccc tgtcatgtcg taacgaggtg ggccttttga 1260 ggccatttta gtttgagttc gaaccaacca cctctgttgg ttagatgatg aataaaaagg 1320 ttctgaâgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1356 <210> 3 <211> 100 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP11 <900> 3 tcggtcatag cggttccaag attagcttct actgcttcct gtagcttggc taatatactc 60 tgctttacag ctgatgatat ggtgttgtta aaaaaaaaaa 100 <210> 4 <211> 967 <212> ADN
<213> Homo sapiens <z2o>
<223> TSAP12 <400> 4 tcggtcatag taaattcagc atgaaagaga atattacaga aaagacagca gcagaagcat 60 tagcattatc taatatttat atatgttatc aacataacac agcagtaaaa ggtttaaatg 120 catatcaatg ggtaccatgt ctaaaaatta ctatagtacc tatttagtgt attggatatt 18G
tttcttaaag agtgtttgct gtaactagaa cagcataata catgatttag tacagttaat 24G
tcttattgat taaataatgt atttatgtac tgaagaaagt gaaaaggaga cagatatttt 30G
ttgcttcatt ttgattccag atttaacatt taaatgaaga ttccaaagga ccatgacatg 36G
tcattattta actgaaatgg gcttcaaaat atttaaaaga cggtatgatt tgtatctaaa 42G
cagcaaggtg gcaccagata cacgtaatgc tactggccta tgaccga 46T
<210> 5 <211> 1547 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP13 HOMOLOGUE PROTEASOME
<400> 5 tttttttttt tttttttttt ttttttaaca aagcagaggg gtttattata ggaacattct 60 caaactgcaa cggaaaagat gtccgtacag gtggatgggg atggagatcc acctcggagt 120 acacagactt cagggggcct cctgcctggc acgttctttc tctcccgtat cacctaagac 180 cctgagacct ccaccctctg caggagagac ccacaaagaa gcctcctccc tgtggcctgg 240 ctcccatcag ggacagtcct gtttttagag caagaacagt ctgtacttca gacaggatcc 30G
caacccccac ccaaattcaa tgtcgaccgt ctgagcagcc agcttcattg gctgcaaacg 360 cctctctcag gtgagtcaaa ggagacacga cggggaacca gggggcccta ggtgaggatg 420 tcatgggcct ggtgctccac cagcatctcc atgctcttca catccgtgca ccagaactcc 480 aggcggtcct tcattccctt gatctgttgc aaatccaaca ctcggggctg cacccaggtc 540 atgtggactc gtttgtccac ctcgtctata ctgcctttca ccagccccac cgaaagggcc 600 ttcatcacca gaagctccac ctcattcact gtgattttag cacttttggc aatttcttca 660 aaagtgagtt gtctgtgatt ggcaggtcgt gtgaaagtca tctccatgag gcacaacaac 720 tgaattttcc tcagaagctg ggcttcatta gctgctaaat caggctgctg gccccaggca 780 gtcttcagag tctggaaccg ctctacgttg ccactgttga aggcatagag ggtgtcaatc 840 WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479 _ agccactgcc ggtcagtatt cctcagggac tccagcacag ggtgcatgag gagttctcca 900 aagttaaaaa ctccctcgcc gagaagtcct gctagcccca gcgtgaaggc tctctcctgc 960 tgctcagaca ctggtagatc cttgatgtca acacagccca aaaaccgcag agcatctttg 1020 tagtaggacg cgtggtttcc gattgtttga tagtatttac tggagagatc atagaaacga 1080 ctgtgaaccg atgtcacacc aggaaggttg ttgagcattt cttcaacatc ttcaattgtt 1140 tcctttgtaa cctgtaggtc cccgatgttt aattttagag ctccaattgc tgttttacac 1200 aggatcactg cctcatcact acttttcacc ttctcacgag tcttttccag aaaagtaaga 1260 gccacattag gatcagtcat ctgtctaact acgtgaagaa t-gatttccac gagggacaga 1320 ggattcaccc tgtgttcaaa ttcactgata aagttttcat aaagcttaat gagaccatct 1380 ccttgggcaa ac~cacggatc ctgcacaaaa tcaagcacct gaagtgtcag ctgatgccac 1440 aacttcttcg tgtagagctc ctccagacgg tgccacacag cgggctgccc gggcccggag 1500 ctctggctct gctgtaggaa gcccggtacg tccttcatga cagcagg 1547 <210> 6 <211> 102 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP14 <400> 6 ggaaccaatc ctaaagaata ttcttacata taataaagaa ttcccatttg atgttcagcc 60 tgtcccatta agaagaattt tggcacctgg taaaaaaaaa aa 102 <210> 7 <211> 1825 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP15 <400> 7 tcggcctttc acctcttcac ttatccttag tcccagtagc caggatacct gatggccacg 60 tgtgccttgg ccacgggagg ctgctgagat tggccacgtg gctgggctgg gtggtggcct 120 cactctccca cagagctgga aatggggggt gggggacaga ttcttacgga aattttttta 180 cctgacttgc tatgaaaaaa ctcatcacac aagaagagaa acagtaacct cactttgaaa 240 attagctcca ctcaagacta gtccacgaac gagacccgcc ttttctacac aggatccaag 300 ctcacgagaa gcagccagag tgccccgcct ccgccggctc tggtctgcca ttcgccagtg 360 cagggatctg gcatggacca gatgtggcga atggcagcac agcgcggtgg ctgggtctgc 420 acactggcct ctgcagccag atttctatat tgggagtttt ttaaaaagac atttcatagc 480 caacaagaat cagtagaagt gctgggagca gcagctgggg aagctgccgc ccacgggctc 540 tgccccttcc agctggagcc gcccgtgcct ccaggggcca agaggatgat gtcgtggcct 600 ccattctcgt ttctatgcag ccccatagtc caaggacacc cagtccacat ctaccatata 660 gcaagtttag taagggaagg cagcatacgt cccagggaca gtgggtttgg atctgtctag 720 aacagcggtt tgtggctgtg gcccagctcc gagagtgata tttgctctgg taggtgaggg 780 cctgagggta catttctcca cctgtgcccc ctcatgttca cagaggattt cagcagctgc 840 aactgcgcac gccaggtggg gaagggtggg ggtgggcctg gttgccccat gttaggaaat 900 cactaccagt caggtggggc tggggctggg tggacaggat caggattccc ttgaaagccc 960 aggcagggtg agcagtccca gtggtcctag tgccgcatca gatccaggtg ggtgagggca 1020 ggaggccatg cggaggagcc gtggatctgc ccacacatag gctactggaa tagtttaacc 1080 cagcaacttt cctttttata aaacaacaaa tcggttcaac tctgtctgca aattaacagc 1140 tgaacacctg caactgaaat gttttttgat ccgacgtact gaaatacgga agtcatgctc 1200 ttcccaccct ccacccacca gagtggaacc cgctgcaaaa tccccagcct taattcttgc 1260 ttcaggaccc agaccggtgt cttgctc~ag ggcaacccag ggcagagggg ccaggtctgc 1320 ccagcgttta ccactgctgt caagcacagc ccttggcacc atacgggcca tcctcagtga 1380 ggcagccccc cataggcttc cgcaagctct ggtcccgaag aggctgtgcg agcccttccc 1440 WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479 ggccctcccc aggccccccg ccccctcctc tgcctgctgc gtggaggcag ccatgggaag 1500 gagcccaggg gagctggcct gggggagcga agcccatgtt cgcttcctga cttagagctg 1560 gggggggtgg ggggtggggc ttgttcccct gcagtatctg ttctgtgaag tttgttaaat 1620 gtaaggaaag cttaaattct tgtatcttta aaagagaaaa tcttatttaa. cccttttgtg 1680 ttctagattt acttacacac atagcctaga gctcagtttt agttttaaca ttgtgaaaat 1790 attaaaagaa tcttgtaact ttattctttt ttctcctgct gaaaaaaaaa attaaaccaa 1800 tcgtatgaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1825 <2I0> B
<211> 90 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP16 <400> 8 tggattggtc caggattggg gttttgctag tccatagcaa ttcgaagggc agtgggctag 60 tgttatgaga atattggcaa aaaaaaaaaa g0 <210> 9 <211> 131 <2I2> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP17 <400> 9 ctgcttgatg taggagggat taagttagta tttcccgtat cgaccaagac aaaattacaa 60 tatacgcata acaaagacaa acaccagtta cttggctcaa tatccaagtt ttaacctagc 120 aaaaaaaaaa a 131.
<210> 10 <211> 121 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP18 <400> 10 ggaaccaatc ccaacacaac tggattctac tgaaattacc acatatttga ggtccacaag 60 cacaagtata gatctaatgc aaactgggct cagattagca gatccatgcc aaaaaaaaaa 120 a 121 <210> 11 <211> 893 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP19 <900> 11 atggagggcc acatctgcca gagcctggag tctgcgaagg ccgggacccg gttccccggc 60 ccacagtggg ggtgtgcaaa cccgagagaa ctgggttgca aattcgtgaa gaatcagcat 120 catgtttggc agctgagtat tggagccagg agcctgccat gaggttttga gaacagagtg 180 WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479-ctgttttaga gctggcagca gcatctcagc ccaagagaag gttatattcc cagaggatgt 240 cagtcccaag gaccagtagc tgccatcagt ttggattctg aaaactaact ggcatcaaca 300 ctgggtgtag aaacatgctt gccttatgta tcagaggaca tgctcagcag atccaagaga 360 tatatttggc aactttttct agaaaaggca çattgggtat cattcattac attcttgagt 420 ttttttgggt tttttttttt ttttttgaga cagtcttgct gtattgccca ggctggagtg 480 tggtggcaca atcacagctc attgcatcct caatcaccca ggcctaagca atcctcccac 540 cttgtagctg ggactacagc tcacagcaca cctggctaaa attttttttt tgttgagacg 600 gattctctat gttgcccagg ctggtctcag gctcctgggc tcagatggtc ctcctgcctc 660 agcttccaaa ggcacaggcc aagttgtagc tttgtccctt gccatcatgc ccaacaagag 720 gttctatacc ttttaatgaa ttgactttca taaattggtt atgttggtgg gcaagttctt 780 taagctggaa attgtaaatt cctcctgaaa tgttttttca tgcagttacc atgaactaat 841) actacaataa aggatggtct tgggtgtcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 893 <210> 12 <211> 151 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP20 <400> 12 gatctgactg tagggactat attcattact gctggactat gctgctttcc ccaaccccct 60 aggattttaa aaatagcacg ctgcacttga aacaggggaa gacactgtat aacatccaaa 120 tgttcttctt ccctagaggc caaaaaaaaa a 151 <210> 13 <211> 1295 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP21 HOMOLOGUE SNARE
<400> 13 atccagcgcc agctggagat catgggcaag gaagtctcgg gcgaccagat cgaggacatg 60 ttcgagcagg gtaagtggga cgtgttttcc gagaacttgc tggccgacgt gaagggcgcg 120 cgggccgccc tcaacgagat cgagagccgc caccgcgaac tgctgcgcct ggagagccgc 180 atccgcgacg tacacgagct cttcttgcag atggcggtgc tggtggagaa gcaggccgac 240 accctgaacg tcatcgagct caacgtacaa aagacggtcg actacaccgg ccaggccaag 300 gcgcaggtgc ggaaggccgt gcagtacgag gagaagaacc cctgccggac cctctgctgc 360 ttctgctgtc cctgcctcaa gtagcaggcc ggcccgggcc gccaccgccc atcccagacc 420 atggagcgcg ctgggaagga cgtcaccaaa gccgggagct ctgccctgca gggagttgcc 480 ccaacccttt ccggaactca gtctttagaa aagaaacgcc aggttcaaga attgcaaacc 540 agcctgtgct tggaaagatg gttagttgat accgtccgat gattcttcag taaagataga 600 ttcccacaaa gttgtgcaat gtcattatat gacaccttgc actcttaccg tcttgacaga 660 agccaagtaa ggaactgaag ttgtatctga ctgtagggtg aatgtctgag gcctgcctcc 720 taataaagac tcaaggagga agtcaattgg gcatctgcta atagaatgaa ctcatgatgg 780 aaacttcagt tcatttactt tgtccctgaa aattccctgg ttctgttcca ttttgagcga 840 aattggcctt gggaaaaacc acgttcttcc tttccgattc ttcatccggt ctacggctat 900 gcaattcctc cccaaatata gatcttattt ctgctcattt cccctactta ttaaaatcac 960 accaaacact tactattttc ttatctcttt cactttttaa atatctttca ccaggttata 1020 ttttggtatt atttttccaa acatttttaa gcactgaata tcgaacaagc actcaaattg 1080 aagtatcagt catgttttgt gtattttt~g ctgataaaaa ttatttaaca tttatatttt 1140 tacttgatta catatgcaca tgtatgtaaa tgtaaaatac taatattcac taatatatgt 1200 acataatgat caattggttt aacttctttt atgtaagtat ggtatataaa tttcaagacg 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1295 WO 00/08147 .. PCT/FR99/01479 _ <210> 14 <211> 2242 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSAP22 <900> 14 agggctcgag cggccgcccg ggcaggttgt gttcttaatt tgcttttccc ttgtgagtcc 60 tgcatcattt gâaaatgtcc atgcaaagtg gtatcctgag gtgcggcacc actgtcccaa 120 cactcccatc atcctagtgg gaactaaact tgatcttagg gatgataaag acacgatcga 180 gaaactgaag gagaagaagc tgactcccat cacctatccg cagggtctag ccatggctaa 240 ggagattggt atggaatcct gtgtttttcc tcctccttgt acctctttta ttgtagtgac 300 agactggagt ccagtctggg aaaggagggt gtgtgtctcc cactcagggc ctggtgtact 360 cttggggaac cagctggcaa ggccctctgg gtcttaacgt cagcgttgga aggtggaagc 420 agggctggga gccggcagaa ggcgcccggg ccccaggagc cgcctcccgc tggtggtgtg 480 atcagaagag'agtggggtcg agtgtacatt gccgtgtggt cgtgtttcct gtaggtgctg 540 taaaatacct ggagtgctcg gcgctcacac agcgaggcct caagacagtg tttgacgaag 600 cgatccgagc agtcctctgc ccgcctcccg tgaagaagag gaagagaaaa tgcctgctgt 660 tgtaaatgtc tcagcccctc gttcttggtc ctgtcccttg gaacctttgt acgctttgct 720 caaaaaaaaa caaaaaaaag aaaaaagtcg caaaaaaaaa aaacaacggt ggagccttcg 780 cactcaatgc caactttttg ttacagatta atttttccat aaaaccattt tttgaaccaa 840 tcagtaattt taaggttttg tttgttctaa atgtaagagt tcagactcac attctattaa 900 aatttagccc taaaatgaca agccttctta aagccttatt tttcaaaagc gcccccccca 960 ttcttgttca gattaagagt tgccaaaata ccttctgaac tacactgcat tgttgtgccg 1020 agaacaccga gcactgaact ttgcaaagac cttcgtcttt gagaagacgg tagcttctgc 1080 agttaggagg tgcagacact tgctctccta tgtagttctc agatgcgtaa agcagaacag 1140 cctcccgaat gaagcgttgc cattgaactc accagtgagt tagcagcacg tgttcccgac 1200 ataacattgt actgtaatgg agtgagcgta gcagctcagc tctttggatc agtctttgtg 1260 atttcatagc gagttttctg accagctttt gcggagattt tgaacagaac tgctatttcc 1320 tctaatgaag aattctgttt agctgtgggt gtgccgggtg gggtgtgtgt gatcaaagga 1380 caaagacagt attttgacaa aatacgaagt ggagatttac actacattgt acaaggaatg 1440 aaagtgtcac gggtaaaaac tctaaaaggt taatttctgt caaatgcagt agatgatgaa 1500 agaaaggttg gtattatcag gaaatgtttt cttaagcttt tcctttctct tacacctgcc 1560 atgcctcccc aaattgggca tttaattcat ctttaaactg gttgttctgt tagtcgctaa 1620 cttagtaagt gcttttctta tagaacccct tctgactgag caatatgcct ccttgtatta 1680 taaaatcttt ctgataatgc attagaaggt ttttttgtcg attagtaaaa gtgctttcca 1740 tgttacttta ttcagagcta ataagtgctt tccttagttt tctagtaact aggtgtaaaa 1800 atcatgtgtt gcagctttat agtttttaaa atattttaga taattcttaa actatgaacc 1860 ttcttaacat cactgtcttg ccagattacc gacactgtca cttgaccaat actgaccctc 1920 tttacctcgc ccacgcggac acacgcctcc tggtagtcgc tttgcctatt gatggttcct 1980 ttgggtctgt gaggttctgt aaactggtgc tagtgctgac gatgttctgt acaacttaac 2040 tcactggcga gaatacaggg tgggaccctt cagccactac aacagaattt tttaaattgc 2100 cagttgcaaa attgtggagt gtttttacat tgatcttttg ctaatgcaat tagcattatg 2160 ttttgcatgt atgacttaat aaatccttga atcataaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaagcg gccgctgaaa cc 2292 <210> 15 <211> 144 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<223> TSIP3 <400> 15 ggaaccaatc caaatgccca tcaatgatag actagataaa gaaaatatag tacatatgca 60 WO 00/08147 ,. PCT/FR99/01479 ccatgtaata ctatgcagcc gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa agacagacaa ggccaaggcc 120 aggcacggtg ggtaaaaaaa aaaa 144

Claims

REVENDICATIONS

1 ) Séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant:
(a) une séquence selon l'une des IND. SEQ 1 à 15 ou un gène équivalent qui comporte:
(b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a), (c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec (a) ou (b), ou (d) une séquence caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est induite ou inhibée lors de l'apoptose et/ou suppression tumorale.

2) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'apoptose et/ou la suppression tumorale est(sont) induite(s) par p53 et/ou p21.

3) Séquence selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi TSAP 9 à TSAP 22 ou un gène équivalent.

4) Séquence selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'apoptose et/ou la suppression tumorale est(sont) induite(s) par p53 et/ou p21.

5) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle correspond au gène TSIP 3 ou un gène équivalent.

6) Séquence selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est inhibée lors de l'apoptose et/ou la suppression tumorale.

7) Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est activée par l'un au moins des transfectants choisi dans le groupe comprenant les transfectants p21, les transfectants TSAP3 et les transfectants antisens TSIP2.

8) Vecteur d'expression cellulaire d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 7.

9) Vecteur d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.

10) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus herpès ou d'un poxvirus.

11) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur à acide nucléique nu.

12) Vecteur selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence assurant le ciblage et/ou l'expression tissu spécifique.

13) Cellule transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 8 à 12.

14) Protéine pouvant être obtenue par culture de cellule transformée selon la revendication 13 et codée par la séquence selon l'une des revendications 1 à 7.

15) A titre de médicament, un vecteur selon l'une des revendications 8 à 12 ou une protéine selon la revendication 14.

16) A titre de médicament, un composé assurant l'expression cellulaire d'au moins une des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à

ou de leurs produits.

17) A titre de médicament selon la revendication 15, un vecteur nucléotidique assurant l'expression cellulaire de ladite séquence.

18) A titre de médicament, un composé assurant l'inhibition de l'expression cellulaire d'au moins un gène cellulaire selon l'une des revendications 1, 5 à 7 ou de leurs produits.

19) A titre de médicament selon la revendication 18, un nucléotide activé assurant la blocage de la séquence nucléotidique.

20) A titre de médicament selon la revendication 18, un anticorps monoclonal dressé contre la ou les protéines codées par la séquence nucléotidique.

21 ) A titre de médicament destiné au traitement du cancer, un médicament selon l'une des revendications 15 à 20.

22) A titre d'agent antiviral, un médicament selon l'une des revendications 15 à 20.

23) A titre d'agent de diagnostic, notamment pour la détermination de la prédisposition et le suivi des cancers, tout ou partie des séquences selon l'une des revendications 1 à 7 à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification.

24) A titre d'agent de diagnostic, notamment pour la détermination de la prédisposition et le suivant des cancers, un antigène correspondant à tout ou partie des protéines codées par la séquence selon l'une des revendications 1 à
7 ou les anticorps correspondants.

25) Modèle pour la mise en évidence de médicament anti-cancéreux, et/ou antiviral des cellules selon la revendication 13.