WO1997017445A1 - Methode de traitement de maladies neurodegeneratives mettant en oeuvre un anticorps 1c2, un fragment ou derive de celui-ci et compositions pharmaceutiques correspondantes - Google Patents

Methode de traitement de maladies neurodegeneratives mettant en oeuvre un anticorps 1c2, un fragment ou derive de celui-ci et compositions pharmaceutiques correspondantes Download PDF

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WO1997017445A1
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fragment
proteins
disease
polyglutamine
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PCT/FR1996/001773
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Lazslo Tora
Yves Lutz
Yvon Trottier
Jean-Louis Mandel
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Definitions

  • the present invention relates to means for the treatment and diagnosis of neurodegenerative diseases. It relates more particularly to the use of a monoclonal antibody capable of recognizing and inactivating the homopolymer chains of glutamins in the proteins specifically associated with these diseases.
  • sequences in DNA are of different natures such as signal or enhancer sequences. They may also be sequences coding for a homopolymer forming part of a larger protein structure.
  • the object of the present invention is therefore to propose a method for the treatment of these diseases. It is based on the use of an antibody capable of binding to the pathogenic forms of proteins responsible for diseases associated with a repetition of glutamine.
  • the applicant is interested in the characterization of a system capable of binding in vitro to polyglutamine chains whose length corresponds to that present in the proteins responsible for neurodegenerative diseases. This led him to look for a monoclonal antibody capable of specifically recognizing polyglutamine chains containing a number of residues greater than 37 which corresponds to the lower limit value of the length of the polyglutamine chain in pathogenic proteins.
  • the Applicant has demonstrated that a specific monoclonal antibody, the monoclonal antibody 1C2 (mAclC2) proves capable of discriminating pathogenic proteins from normal proteins as a function of the length of their respective polyglutamine chains.
  • the monoclonal antibody 1C2 is already known for its affinity for a transcription factor binding to TATA (TATA-binding protein: TBP) sequences.
  • TATA TATA-binding protein
  • this antibody in fact has a very strong affinity for the polyglutamine sequences even in the absence of the peptide described above.
  • This affinity is, moreover, proportional to the length of the polyglutamine chain. Its affinity for the latter is all the more important as the chains are long. For normal length chains it is zero for a normal exposure time to the antibody and very low if this duration is increased.
  • the antibody 1C2 is able to recognize the long polyglutamine chains of the mutated alleles of the proteins responsible for Huntington's disease and spmocerebellar ataxias 1 and 3 as a pathological epitope.
  • the monoclonal antibody 1C2 specifically recognizes the pathological forms of the pathogenic proteins in Huntington's disease and the diseases associated with a repetition of triplets. It can be used to specifically inactivate pathogenic forms of these proteins, the binding of 1C2 can lead to
  • a first object of the present invention is therefore the use of the 1C2 antibody or a fragment or a derivative of the 1C2 antibody for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the preventive or curative treatment of neurodegenerative diseases associated with a repetition of glutam.
  • fragments or derivatives of antibodies are for example the Fab or F (ab) ′ 2 fragments, the VH regions or VL of an antibody or even single chain antibodies
  • Antibodies molecules of the immunoglobulin superfamily, are made up of different chains (2 heavy (H) and 2 light (L)) themselves made up of different domains (variable domain (V) junction domain (J), ete) .
  • the antibody fragment or derivative according to the invention comprises at least the site for binding of the antibody to the polyglutamine sequences. This fragment can either be the variable domain of a light chain
  • V L or heavy (V H ), optionally in the form of a Fab or F (ab ') 2 fragment or, preferably, in the form of single chain antibody (ScFv).
  • Single chain antibodies consist of a peptide corresponding to the binding site of the variable region of the light chain of an antibody linked by a peptide arm to a peptide corresponding to the binding site of the variable region of the heavy chain of an antibody.
  • This type of molecule that is to say comprising the binding site of the variable region of the light chain of the antibody 1C2 linked by a peptide arm to the binding site of the variable region of the heavy chain of the antibody 1C2, also constitutes an object of the present invention.
  • the antibody can be administered as such into the nervous system of patients, stereotaxically. In this case the antibody will be directed against the pathological molecules produced by the diseased cells.
  • the fixation of the antibody leads to the activation of these proteins, and leads to their degradation and also makes it possible to avoid their accumulation inside or outside the cells, one of the possible causes of the disease.
  • These antibodies or fragments of these antibodies can also penetrate inside cells and thus inactivate proteins which are not secreted.
  • a particular embodiment of the invention consists in expressing in the patient's cells a nucleic acid coding for the antibody 1C2 or for a fragment or derivative of the antibody 1C2 such as, for example, a ScFv fragment, of this antibody.
  • the nucleic acid sequence coding for the antibody 1C2 or a fragment or derivative of the antibody 1C2 can be administered as it is, in the form of naked DNA according to the technique described in application WO 90/11092. It can also be administered in complex form, for example with DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. I (1967) 891), with nuclear proteins (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375) , with lipids (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), in the form of liposomes (Fraley et al., J Biol Chem. 255
  • the sequence used in the context of the invention is part of a vector.
  • a vector indeed makes it possible to improve the administration of the nucleic acid in the cells to be treated, and also to increase its stability in said cells, which makes it possible to obtain a lasting therapeutic effect.
  • the vector used may be of various origins, as long as it is capable of transforming animal cells, preferably human cells.
  • a viral vector is used, which can be chosen from adenoviruses, retroviruses, adeno-associated viruses
  • the subject of the present invention is also any recombinant virus comprising, inserted into its genome, a nucleic acid coding for a ScFv fragment of the antibody 1C2.
  • the viruses used in the context of the invention are defective, that is to say that they are unable to replicate autonomously in the infected cell.
  • the genome of the defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can either be eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the sequence coding for a ScFv fragment of the 1C2 antibody.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • adenoviruses As regards more particularly adenoviruses, various serotypes, the structure and properties of which vary somewhat, have been characterized. Among these serotypes, it is preferred to use in the context of present invention human adenoviruses type 2 or 5
  • Ad 2. or Ad 5 adenoviruses of animal origin
  • Ad 2. or Ad 5 adenoviruses of animal origin
  • adenoviruses of animal origin mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [(Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR- 800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used in the context of the invention.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise the ITRs, a sequence allowing the packaging and the sequence coding for a ScFv fragment of the antibody 1C2.
  • the El region at least is non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, by means of genetic engineering techniques, or by treatment with mutagenic agents.
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the regions E1 and E4.
  • the deletion in the E1 region preferably extends from nucleotides 455 to 3329 on the sequence of the adenovirus Ad5.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to a person skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia the DNA sequence coding for a ScFv fragment of the antibody 1C2. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293
  • the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by co-transfection into a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing the sequence coding for a scFv fragment of the 1C2 antibody bordered of two inverted repeat regions (ITRs) of AAV. and of a plasmid carrying the packaging genes (rep and cap genes) of AAV.
  • a human helper virus for example an adenovirus
  • ITRs inverted repeat regions
  • rep and cap genes packaging genes
  • retroviruses are megrative viruses, selectively infecting dividing cells. They therefore constitute vectors of interest for cancer applications.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag. Pol and env).
  • the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("mu ⁇ ne moloney leukemia virus”: also designated MoMLV).
  • MoMuLV molecular leukemia virus
  • a plasmid comprising in particular the LTRs
  • the packaging sequence and said nucleic acid is constructed, then used to transfect a cell line called packaging, capable to bring in trans retroviral functions deficient in the plasmid.
  • packaging lines are therefore capable of expressing the gag genes. pol and approx.
  • Such packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4, 861,719), the line PsiCRIP (WO90 / 02806) and the line GP + envAm-12 (WO89 / 07150).
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol 61 (1987) 1639 ).
  • the Recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • the sequence coding for a ScFv fragment of the 1C2 antibody is placed under the control of signals allowing its expression in nerve cells.
  • these are heterologous expression signals, that is to say signals different from those naturally responsible for the expression of the antibody.
  • They may in particular be sequences responsible for the expression of other proteins, or synthetic sequences. In particular, they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus, including the virus used.
  • these expression sequences can be modified by adding activation, regulation or tissue-specific expression sequences.
  • the present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising either the 1C2 antibody, a fragment or derivative of this antibody or one or more vectors as described above.
  • These pharmaceutical compositions can be formulated in view of topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intracerebral stereotaxic, etc.
  • the pharmaceutical compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct infection in the brain of the patient. They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes. Direct injection into the brain of the patent is advantageous because it allows the therapeutic effect to be concentrated in the affected tissues.
  • compositions according to the invention are very particularly useful for the treatment of neurodegenerative diseases associated with the presence of a protein carrying a homopolymer chain of glutamine.
  • the doses of defective recombinant virus used for injection can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the viral vector, of the mode of administration used, of the pathology concerned or also of the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 14 pfu / ml, and preferably 10 6 to 10 10 pfu / ml.
  • compositions according to the invention can directly comprise the producer cells, with a view to their implantation.
  • Such a tool would also be particularly advantageous for the diagnosis of family predispositions to developing this type of disease.
  • the present invention therefore also aims to provide a method of diagnosing Huntington's disease based on a biological test.
  • the applicant is also interested in other possible applications of the antibody 1C2 in the context of the identification of agents responsible for neurodegenerative diseases.
  • the clinical symptoms manifested are often very different, the Applicant has observed that certain neurodegenerative diseases on the other hand have many points in common, as regards their mode of development, with Huntington's disease.
  • These similarities are above all an appearance of symptoms which are increasingly early and severe over the generations, notably but not exclusively by transmission of a mutated paternal allele.
  • the pathological agents responsible for these diseases are not known and are often difficult to identify. It is particularly interesting to investigate whether there exists in these diseases a pathogen resembling in structure the protein responsible for Huntington's disease.
  • 1C2 monoclonal antibody 1C2 to detect the presence of polyglutamine chains in subjects suffering from these diseases. This makes it possible to identify the proteins carrying these chains which are likely to be the desired pathalogic agents. 1C2 thus recognizes ataxins-1 to 55 glutamins or more, in the case of SCA 1 (spmocerebellar ataxia 1), and three proteins (a major protein at 68K and two miner proteins at 74K and 87K), in the case of SCA3 ( Machado-Joseph disease).
  • the antibody 1C2 also makes it possible advantageously to differentiate an SCA2 (spmocerebellar ataxia of type 2) from an ADCA II (autosomal dominant cerebellar ataxia of type II) by distinguishing the proteins involved in the respective phenotypes (protein of approximately 130K for ADCA II, protein of approximately 150K, for SCA2, molecular weights estimated by electrophoretic migration).
  • 1C2 can thus advantageously make it possible to identify the pathogenic forms of the proteins involved in any proven or suggested anticipation neurodegenerative disease, such as ADCA type I (SCA4, SCA5 for example), AD-FSP (familial spastic paraplegia) or else in certain forms and in certain cases of bipolar affective diseases (manic-depressive psychoses) or schizophrenia.
  • ADCA type I SCA4, SCA5 for example
  • AD-FSP familial spastic paraplegia
  • bipolar affective diseases manic-depressive psychoses
  • Identifying the proteins responsible for these diseases provides access to the sequencing stage.
  • the invention then provides the means of constructing appropriate DNA probes, for the identification of the responsible gene and the implementation of gene therapy treatments as described above.
  • the mutant SCA2 protein is cytoplasmic with an apparent molecular mass of approximately 150 kDa while the SCA7 protein is nuclear with a molecular mass of approximately 130 kDa.
  • the Applicant then used the surprising and advantageous properties of the 1C2 antibody to isolate, by expression screening, genes involved in polyglutamine-extending diseases.
  • 1C2 has thus made it possible, by screening cDNA expression libraries, to clone and then sequence 6 new genes containing CAG repeats and which may be involved in diseases with polyglutamine chains (motifs coding for polyglutamine chains of these genes in SEQ ID Nos. 1 to 6 and entire SCA2 cDNA in SEQ ID No. 7).
  • SCA2 spmocerebellar ataxia type 2
  • the alleles involved in SCA2 have, in their normal form, from 17 to 29 repeated CAG triplets between which are inserted from 1 to 3 CAA triplet (s).
  • 1C2 made it possible to clone cDNAs encoding chains of only 12 to 26 glutamines. This could be due to a higher sensitivity of expression cloning (higher local abundance of target proteins and lower complexity of other proteins), and / or a difference in the conditions for the antigen / antibody reaction (no denaturation by the SDS in the screening of colonies).
  • the use of the monoclonal antibody 1C2 is generalized to the early diagnosis of subjects likely to develop any neurodegenerative disease linked to the expression of a protein having in its structure a long polyglutamine chain, as well as at risk families which express proteins whose polyglutamine chain comprises a number of residues bordering on the pathological.
  • This diagnosis can directly use the 1C2 antibody or be done by DNA analysis at the level of genes coding for polyglutamines, genes identified using the 1C2 antibody.
  • a monoclonal antibody 1C2 is used. This antibody is brought into contact with a cell extract obtained from cells of the patient expressing the desired protein. The antibody interacts with this protein at the epitope represented by the long polyglutamine chain.
  • the Antibody-Antigen complexes are then revealed by any means known to those skilled in the art (labeling of the antibody, use of a second fluorescent anti-IC2 antibody, ELISA, etc.). The intensity of the interaction is determined. It is on the basis of the latter that the diagnosis can be established.
  • 1C2 can also be used for the subcellular localization of pathological forms of proteins involved in the disease, to monitor their accumulation or the accumulation of their degradation products.
  • the method which is the subject of the present invention opens the way to new methods of treating neurodegenerative diseases based on a better knowledge of the pathological proteins which are responsible for them.
  • the invention which is the subject of the present application relates not only to the use of the novel properties of the 1C2 antibody and to the proteins involved in the pathogenicity of neurodegenerative diseases with polyglutamine chains, but also to new genes also involved in these diseases. .
  • the six new genes that may be involved in neurodegenerative diseases with polyglutamine chains according to the invention are of crucial importance for understanding the pathogenicity mechanisms of these diseases. They allow the direct development of nucleic acid probes, possibly labeled so as to allow the detection of normal or mutated forms of these genes, capable of hybridizing with the nucleic acids (DNA or RNA) involved in these neurodegenerative diseases with polyglutamine chains.
  • nucleic acid probes are particularly useful for monitoring families at risk, prenatal genetic counseling and discrimination between different neurodegenerative diseases, some of which may have similar symptoms.
  • the present application therefore also relates to such nucleic acid probes, optionally carrying a chemical substitution, in free or associated form, of pharmaceutical compositions containing them in an appropriate buffer, an in vitro diagnostic and / or genetic counseling method using said probes using technology such as PCR, RT-PCR, and diagnostic kits comprising said probes.
  • Such probes can also serve as vectors of medicinal substances for delivering said medicinal substances to the areas presenting said genes, in their normal or pathological form.
  • the new genes according to the invention also allow the direct development of antisense nucleic acids (DNA or RNA) useful as medicaments, in the treatment of neurodegenerative diseases.
  • the present application therefore also relates to such antisense nucleic acids, optionally carrying, where appropriate, a chemical substitution, in free or associated form, optionally included, encapsulates or adsorbed, pharmaceutical compositions containing them in a appropriate buffer, and kits for therapeutic use comprising said antisense nucleic acids.
  • the present application relates not only to said new genes, nucleic probes, antisense acids according to the invention but also to any nucleic acid having a homology greater than or equal to 501 with these products, to any fragment of these products, and to any bank of nucleic acids obtained by expression screening using the antibody 1C2 from cell lines, originating from patients or animals suffering from a neurodegenerative disease.
  • the present application also relates to a method for identifying or purifying proteins with polyglutamine chains using an immunodetection or immunopurification step with the antibody 1C2, fragment or derivative of this antibody, or which may secondarily lead to identifying the corresponding gene .
  • the present application finally relates to a diagnostic method using PCR amplification on DNA or RT-PCR on RNA making it possible to detect mutated forms in genes coding for polyglutamine chains identified or cloned using the 1C2 antibody.
  • FIG. 1 represents the screening of expression of a cDNA library using the antibody 1C2
  • FIG. 2 represents the detection by PCR of extended alleles in an SCA2 family
  • FIG. 3 represents the structures of normal and pathological alleles
  • FIG. 4 represents the distribution of allelic sizes at the SCA2 locus
  • FIG. 5 represents the instability of the SCA2 repetition during transmissions from parents to children
  • FIG. 6 represents the correlation between the age of onset of the clinical disease and the number of repetitions
  • Figure 7 shows the sequence of the SCA2 cDNA
  • Figure 8 shows the Northern blot analysis of the expression of the SCA2 gene.
  • Example 1 Demonstration of the specific affinity of the monoclonal antibody 1C2 for the polyglutamine chains.
  • mAclC2 In order to demonstrate its ability to recognize proteins with a homopolymeric glutamine chain, mAclC2 first analyzed in "Western Blot" on extracts from cell lines lymphoblastoids (hereafter LCL) from normal individuals and individuals with Huntington's disease having varying lengths of polyglutamine chains in HDP (Huntington Disease Protein). These various proteins are first of all brought into contact with an anti-HDP monoclonal antibody. It is observed during the Western Blot analysis that normal proteins are very easily discriminated from those having an elongated polyglutamine chain, thanks to their difference in molecular weight.
  • LCL lymphoblastoids
  • HDP Huntington Disease Protein
  • the signal intensity depends on the length of the poluglutamine chain. This intensity is very strong for chains of more than 50 units and minimum for chains of 39-40 units.
  • Example 2 Demonstration of a correlation between the length of the polyglutamine chain and the increase in the affinity of 1C2 for it
  • a semi-quantitative comparison of the signal intensity detected with HDPs comprising 36, 60 and 85 glutamine residues was carried out using a series of dilutions of LCL extracts.
  • the intensity of the HDP signal observed is 2 to 4 times greater with chains of 85 residues than with chains of 60 residues and 10 to 20 times greater with chains of 60 residues than with chains of 39 residues .
  • Example 3 Demonstration that the epitope recognized by mAclC2 is only the polyglutamine chain
  • the HDP protein When the HDP protein is sequenced, it is noted that the LEEQQRQQQQQQ peptide from TBP which is recognized by the antibody is not present in the sequences which surround the glutamine residue chain in HDP. It is deduced therefrom that the HDP epitope which is recognized by the monoclonal antibody 1C2 is indeed only the polyglutamine chain and that the signal intensity is solely dependent on the length thereof.
  • a verification experiment was carried out with different alleles of TBP which also have polyglutamine chains whose length varies from 29 to 42 residues. Western blot analysis, after exposure to 1C2, made it possible to discriminate the alleles according to their size. Here too, the signal intensity is greater with large chains and chains comprising between 27 and 30 residues are not detected.
  • the 1C2 antibody is therefore capable of specifically recognizing a polyglutamine sequence.
  • the intensity of signal obtained depends on the length of said sequence the longer it is the stronger the intensity.
  • Example 4 Detection of a pathological epitope in spinocerebellar ataxias SCA1 and SCA3.
  • Example 5 Demonstration of the presence of protein containing a long polyglutamine chain in other neurodegenerative diseases using mAclC2.
  • the phenotypic characteristics common to all the diseases considered are found in other neurodegenerative diseases such as autosomal dominant cerebellar ataxia (ADCA) and familial spasmodic paraplegia (FSP) for which the protein (s) responsible as well as (s) ) matching gene (s) have not yet been identified.
  • ADCA autosomal dominant cerebellar ataxia
  • FSP familial spasmodic paraplegia
  • the columns carrying the band for a 130 kD protein correspond to samples from patients with type II ADCA causing retinal degeneration. Chromosome mapping experiments made it possible to locate the gene corresponding to this 130 kD protein on chromosome 3p, this locus corresponds to the locus presumed to be responsible for the disease. The same protein has also been found in other patients with ADCA type II belonging to other families.
  • the 150 kD protein has been sought in other patients with ADCA carrying a mutation in the SCA2 gene as well as in persons of the same family who have not developed the disease.
  • the protein is still present but in healthy subjects the length of the polyglutamine chain is shorter and therefore not detected under the experimental conditions as described above.
  • We can therefore deduce that this 150 • kD protein is indeed responsible for a neurodegenerative disease associated with the lengthening of a polyglutamine chain in a normal protein which has the same transmission characteristics as Huntington's disease.
  • Example 6 intracellular localization of pathological proteins.
  • the antibody mAclC2 was also used to determine the intracellular localization of the protein responsible for SCA3 as well as that of the proteins newly identified and which are linked to ADCA type II and to SCA2.
  • the analysis of cell fractions is carried out according to the Western Blot technique. Enriched fractions from different cell compartments are used: the cytoplasmic compartment and the nucleoplasmic compartment. Hybridization is carried out with labeled mAclC2.
  • Ataxins 2 and 3 as well as the mutant HDP were located in the cytoplasmic fraction.
  • the 130 kD protein linked to ADCA type II has been localized in the nucleoplasmic fraction. Control tests carried out with TBP, the cell localization of which is known, made it possible to validate these results.
  • Example 7 Cloning of the gene involved in type 2 cerebellar ataxia (SCA2).
  • Poly A + SCA2 and SCA7 RNAs were prepared from lymphoblastoid cell lines (LCL) SCA2 and SCA7 patients. Reverse transcription was performed using random hexameric oligonucleotides. The cDNAs were ligated to EcoRI adapters and cloned into EcoRI I-SCREEN-1 vector arms (Novagen®) and inserted according to the manufacturer's protocol.
  • the positive plates were eluted at 4 ° C in SM medium and the phages were transformed into the BL21 bacteria as described above. Secondary and, if necessary, tertiary screening was performed as above. The isolated positive phages were excised following the manufacturer's protocol (Novagen®) and the plasmids obtained were transformed into HB101 bacteria.
  • DAN1 CGTGCGAGCCGGTGTATGGG (UH13); GGCGACGCTAGAAGGCCGCT (UH10) DAN15 CCACCATGCCCACCACCTCC; CCGCGCCGCCCAAGCTGTTG
  • AAD10 CCTCGGACCTGATTCAAGGC; GCTGCTGGGAGGCATAAGGC,
  • AAD14 AAGTGCCCCTGTCCATCCTCT, GGAGAGGAGTGCAACAGACC ,
  • the primers produced for DAN1, DNA15, AAD14 and ADD20 allow the amplification of genomic DNA.
  • the products were analyzed on a 2% agarose gel and transferred to a nylon membrane for hybridization with an oligonucleotide probe.
  • CAG 16
  • 100 ng of genomic DNA were amplified in 20 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , glycerol 15%, 250 mM of each dNTP, and 10 pmol of primers UH10 and UH13.
  • 10 mM Tris-HCl pH 8.3
  • 50 mM KCl 1.5 mM MgCl 2
  • glycerol 15% 250 mM of each dNTP
  • 10 pmol of primers UH10 and UH13 10 pmol of primers UH10 and UH13.
  • 0.5 U of Tag polymerase was added, 35 cycles (30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 65 ° C, 30 seconds at 72 ° C) and one final elongation of 10 minutes at 72 ° C were carried out.
  • the products were deposited on a denaturing gel containing 6% polyacrylamide and 7 M urea. They are transferred and hybridized with a probe (CAG) 7.
  • CAG probe
  • 40 cycles were carried out (the "extended” alleles were better amplified in the absence of KCl and of glycerol) and the excised fragments were sequenced on an Applied Biosystems® automatic sequencer (ABI) with fluorescent dideoxynucleotides.
  • Northern and Zoo transfer analyzes A 2.5 kb EcoRI cDNA fragment corresponding to the 3 'end of the DAN1 clone served as a probe for the Northern and Zoo transfer analyzes.
  • Northern transfers of human MTN and MTN II from human brains were obtained by Clontech®.
  • the hybridization of the probes was carried out using the ExpressHyb® hybridization solution (Clontech®).
  • the transfers were washed in 0.1 x SSC, 0.1% SDS at 55 ° C.
  • Hybridization of Zoo transfers was carried out in 30% formamide. The washing was carried out in 0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS at 51 ° C.
  • the use according to the invention of the monoclonal antibody 1C2 had previously made it possible to detect in lymphoblastic lines of patients with the SCA2 and SCA7 forms of ADCA (autosomal dominant cerebellar ataxia) pathological proteins which must contain a long polyglutamine chain.
  • ADCA autosomal dominant cerebellar ataxia
  • lymphoblastic cDNA libraries were constructed in a bacteriophage I expression vector (I-Screen-1, Novagen®), using cell lines from SCA2 (AAD) or SCA7 patients. (DAN). About 8.10 5 clones were plated on each library and were screened with the 1C2 antibody.
  • the expression screening of a cDNA library is represented using the antibody 1C2: the upper left rectangular part shows the detection of the clone DAN1 at the primary screening step (approximately 20,000 pfu per dish ), with a very background clear.
  • the other rectangular parts correspond to the secondary screens of this clone (approximately 100 pfu per box).
  • CAG repeats as determined by hybridization with an oligonucleotide probe (CAG) 10.
  • the 19 CAG positive clones correspond to 8 different transcripts and are presented in the following table.
  • Table 1 clones obtained by screening with 1C2 KO -I t ( ⁇ clones size p ° 'yg' n analog polygln coding motifs on databases
  • AAD 1 4 1 .9 kb 12 and 14 (CAG) 7 CAA (CAG) 4 (NNN) 25 (CAG) 14 M62043; F1 1363; STS G 16005
  • the 19 positive clones include a normal huntingtin cDNA (20 gin) and a cDNA for the transcription factor hSNF- ⁇ 32 , which also contains a polyglutamine repeat (26 gin).
  • the size of the last protein (174 kDa) excludes it as a candidate for the SCA2 or SCA7 genes.
  • the other six transcripts correspond to genes containing new CAGs.
  • PCR of extended alleles in a SCA2 family the PCR analysis was carried out using the probes UH10 and UH13; the allelic sizes (number of repetitions) are 22/37, 23/38, 22/43, 22/43, 22/23 and 22/22 for individuals 1 to ⁇ respectively; the father in generation II transmitted extended alleles by 5 repetitions to these two affected daughters; this is correlated with a strong anticipation (the age of onset of the disease is indicated on the pedigree); there is an apparent heterogeneity of the mutant alleles; the larger band was used to determine the repetition sizes.
  • these primers amplify the corresponding fragment in four YACs of the SCA2 candidate region of 12q23-24.1 (CEPH YAC 674f2, 722h7, 774a3 and 910gl) which also contain the microsatellite D12S1340 (AFM291xe9).
  • CAA dispersed in the most common cases (9 out of 17) two CAA are observed with a structure (CAG) 8 CAA (CAG) 4 CAA (CAG) 8, as for DAN1.
  • the distribution of allelic sizes at the SCA2 locus is represented: the PCR analyzes of normal French individuals and SCA2 were carried out as described above; the 110 normal alleles are independent alleles while the 31 pathological alleles (solid bars) derive from 8 families.
  • the clone DAN1 (4.0kb) has been completely sequenced: in FIG. 7, SEQ ID No. 7 is represented.
  • FIG. 7 indeed represents the sequence of the SCA2 cDNA.
  • EST 3986 comes from the clone DAN1.
  • the last 177 base pairs (in italics) come from EST (H92640, N90240 and Z13574 from dbEST) which overlap, unambiguously, the 3 'end of the DANI sequence. Only the sequences common to the three ESTs have been added here to the DANI sequence.
  • the internal polyA chain at position 4002 differs in length from the three ESTs (indicated by a lowercase a) and is not preceded by a polyadenylation signal.
  • EST N90240 has two putative AATAAA polyadenylation signals located 33 and 59 base pairs 3 'to the end of the proposed consensus sequence.
  • the first methionine codon at position 243 and the Kozak consensus which precedes it are underlined. This codon is in phase with a putative amino acid sequence located upstream (in italics).
  • the first termination codon in the frame (position 2745) is underlined.
  • the overlapping open reading frame is also shown (in italics) and its terminating codon underlined (position 3638).
  • the sequence from position 2560 to position 2880 is confirmed by overlapping ESTs (H70616, R00491, R10603), which rules out an artefactual mutation of the reading frame in the DANI clone.
  • An open reading frame starts at position 1 to position 2745.
  • the first methionine is at position 243 and is preceded by a very good consensus sequence for initiating translation (6/9 agreement including the important A to -3).
  • the upstream sequence is very rich in GC, which could explain the absence of stop codons in the three reading frames.
  • a 2.5 kb DANI fragment was used as a probe in Northern blots with human polyA + RNA. Ubiquitous expression has been found in different regions of the brain and strong expression has been observed in other organs.
  • FIG. 8 an analysis of a Northern transfer is represented.
  • a 2.5 kb probe (from position 1370 to 3985 in Figure 7) was used for Northern blots (MTN Clontech® and MTN2 from the brain) containing human polyA + RNA from brain regions and fabrics indicated.
  • the length of the mRNA was evaluated at 4.4 kb, which is very close to the 4.2 kb sequence derived from DANI and overlapping the ESTs.
  • the protein (s) predicted from the two open reading frames does not show significant homology with proteins known in humans or in other organisms.
  • the gene appears to be well conserved in mammals (cattle, rabbits, sheep, pigs and mice) and chickens as indicated by the strong cross-reaction fragments observed on Zoo transfer using the same probe.
  • cDNA and hybridization and washing conditions as for Northern blot analysis.
  • SCA2 is the sixth clone locus corresponding to a disease in which an extension of CAG / polyglutamine repeats is involved.
  • a lower pathogenicity limit of 37 glutamines was found, which is very close to the limit of 36 found in very rare patients with Huntington's disease. This limit is not definitive and can only be established by studying a larger number of patients.
  • the lower limits for other diseases are 40, 40, 49 and 61 respectively for SBMA, SCA1, DRPLA and MJD / SCA3.
  • SCA3 for which the pathogenicity threshold is however higher. This suggests that the protein involved in SCA2 (ataxme 2) is very sensitive to polyglutamines.
  • this increased sensitivity could be a property of the affected neurons.
  • TBP protein TATA binding protein
  • glutamines up to 42 glutamines are found in normal alleles. It is more possible that the toxicity of a truncated ataxme is higher than that of the whole protein, with a protective role of the truncated protein part.
  • Such increases occur in 20 to 30% of paternal HD transmissions, preferably in parental alleles with more than 45 glutamines, and are very rare, for SCA1 or SBMA, for similar repetition sizes.
  • SCA2 locus Another trait of the SCA2 locus is the interruption, in normal alleles, of repetition of CAG by 1 to 3 CAA (which also code for glutamines).
  • the SCA2 gene As in four of the five other polyglutamine diseases (the exception being SBMA and the androgen receptor gene), the SCA2 gene has no obvious function and appears to be expressed in a ubiquitous manner in the brain and even in areas such as the putamen which remains unaffected in patients.
  • the apparent size of the mutant SCA2 protein is 150 kDa on Western transfers, but the extended chains of polyglutamines can affect electrophoretic migration and a size of approximately 120-130 kDa.
  • the main open reading frame starting at the first methionine codon (characterized by very good agreement with the Kozak consensus), codes for a protein of 834 amino acids and a molecular weight of 89.9 kDa.
  • a reading frame mutation -1 would correspond to a normal protein of 1132 amino acids and molecular weight 121.7 kDa, which is in very good agreement with the estimated molecular weight.
  • CTCCCCGCCC CTTCGTCGTC GTCCTTCTCC CCCTCGCCAG CCCGGGCGCC CCTCCGGCCG 120
  • CTCCAGTAGC AAGGACCAGT CCCTCGGGGG GAACGTGGTC ATCAGTGGTC AGTGGGGTTC 1800
  • AAGGTATATC ACCAGTTGTT TCTGAACATA GAAAACAGAT TGATGATTTA AAGAAATTTA 2160
  • AAATATGCCC CAACAGCGGC AAGACCAGCA TCATCAGAGT GCCATGATGC ACCCAGCGTC 2760
  • GCATCCTCAT GTCTATAGTC CTGTAATACA GGGTAATGCT AGAATGATGG CACCACCAAC 2940

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Abstract

La présente invention concerne des moyens pour le traitement et le diagnostic des maladies neurodégénératives associées à la présence de chaînes polyglutaminiques, mettant en oeuvre un anticorps 1C2.

Description

MOYENS POUR LE TRAITEMENT ET LE DIAGNOSTIC DE MALADIES NEURODEGENERATIVES
La présente invention concerne des moyens pour le traitement et le diagnostic de maladies neurodégénératives. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation d'un anticorps monoclonal capable de reconnaître et d'inactiver les chaînes homopolymères de glutammes dans les protéines spécifiquement associées à ces maladies.
La présence de séquences répétées dans l'ADN est un phénomène connu. Ces séquences peuvent être de différentes natures comme des séquences signal ou enhancer. Il peut également s'agir de séquences codant pour un homopolymere faisant partie d'une structure protéique de plus grande taille.
Dans le cas précis de la maladie de Huntington il s'agit d'une séquence répétée de codons CAG codant pour une chaîne homopolymere de glutamme
(polyglutamine) . Il a été montré que cette séquence est bien exprimée dans les protéines traduites. L'implication de ces protéines dans le déclenchement ou le développement: de la maladie dépend essentiellement du nombre de résidus glutamme enchaînés dans la protéine. Plus celui-ci est important plus la maladie sera sévère et précoce.
On a pour l'instant dénombré au moins cinq maladies neurodégénératives humaines génétiques associées à la présence de ces chaînes de résidus glutamme : l'atrophie musculaire spino-bulbaire associée au chromosome X ou maladie de Kennedy, la maladie de Huntington dominante autosomale, l'ataxie spmocérébelleuse de type 1, l'atrophie dentarorubral- pallidoluysienne et l'ataxie spmocérébelleuse de type 3 ou maladie de Machado-Joseph. Dans les gènes codant pour les protéines responsables de ces maladies, le nombre de triplets CAG répétés est très variable. Par exemple dans le gène responsable de la maladie de Huntington, ce nombre varie, entre 10 et 35 unîtes chez les sujets non atteints et de 37-40 jusqu'à 60-120 chez les malades. De plus chez les malades, on observe une instabilité de ce nombre de répétitions d'une génération à l'autre. Une explication à cette variabilité repose sur les phénomènes de recombinaison et réplication se produisant lors des divisions cellulaires au cours de la gamétogénèse. Ces phénomènes peuvent soit conduire à une augmentation du nombre de répétitions soit, plus rarement, à une diminution. Dans la plupart des cas le nombre de triplets CAG augmente chez les descendants et l'on observe que cette amplification de taille se fait surtout sur les allèles paternels du gène concerné. Le nombre de recombinaisons subies par l'ADN lors de la spermatogénese est en effet plus élevé que celui des recombinaisons survenant lors de l'ovogénese. Ceci est dû au nombre très élevé de divisions survenant au cours de la spermatogénese.
Une étude réalisée au sein de plusieurs familles atteintes de la maladie de Huntington, a permis de comparer sur plusieurs générations quelques paramètres tels que la longueur de ces séquences répétées, l'âge auquel se développe la maladie et la sévérité de celle- ci. Les résultats obtenus font apparaître une corrélation inverse entre le nombre de triplets CAG (déterminant la longueur de la chaîne polyglutamine) d'une part et l'âge d'apparition et la gravité des symptômes d'autre part. Ceci permet d'expliquer la plus grande précocité et la plus grande sévérité de ces maladies de génération en génération.
A ce jour il n'existe aucun outil thérapeutique pour le traitement de la maladie αe Huntington et d'une manière générale des maladies neurodégénératives associées a une répétition de glutamme. La présente invention a ainsi pour objet de proposer une méthode de traitement de ces maladies. Elle est fondée sur l'utilisation d'un anticorps capable de se fixer sur les formes pathogènes des protéines responsables des maladies associées à une répétition de glutamine.
Plus précisément, la demanderesse s'est intéressée à la caracterisation d'un système capable de se lier in vitro à des chaînes polyglutamine dont la longueur correspond à celle présente dans les protéines responsables de maladies neurodégénératives. Ceci l'a conduit à rechercher un anticorps monoclonal à même de reconnaître spécifiquement les chaînes polyglutamine contenant un nombre de résidus supérieur à 37 ce qui correspond à la valeur limite inférieure de la longueur de la chaîne polyglutamine dans les protéines pathogènes.
De manière inattendue, la demanderesse a mis en évidence qu'un anticorps monoclonal spécifique, l'anticorps monoclonal 1C2 (mAclC2) s'avère capable de discriminer les protéines pathogènes des protéines normales en fonction de la longueur de leurs chaînes polyglutamines respectives.
L'anticorps monoclonal 1C2 est déjà connu pour son affinité pour un facteur de transcription se liant aux séquences TATA (TATA-binding protein : TBP) . Jusqu'à présent le peptide LEEQQRQQQQQQ, localisé à l'extrémité N-terminale de la chaîne homopolymere de glutamine de la TBP, était considéré comme l'épitope pour lequel l'affinité de cet anticorps était la plus importante (Lescure A et al. EMBO Journal 13, 1166-1175 (1995)) .
De manière tout à fait surprenante la demanderesse a montré que cet anticorps possédait en fait une très forte affinité pour les séquences polyglutamines même en l'absence du peptide décrit ci-dessus. Cette affinité est, de plus, proportionnelle à la longueur de la chaîne polyglutamine. Son affinité pour ces dernières est d'autant plus importante que les chaînes sont longues. Pour les chaînes de longueur normale elle est nulle pour un temps d'exposition normal à l'anticorps et très faible si l'on augmente cette durée. De ce fait l'anticorps 1C2 est capable de reconnaître les longues chaînes polyglutamines des allèles mutés des protéines responsables de la maladie de Huntington et des ataxies spmocérébelleuses 1 et 3 comme epitope pathologique. Avantageusement, il permet le diagnostic précoce des sujets qui vont développer l'une de ces maladies ainsi que des familles à risques qui expriment des protéines dont la chaîne polyglutamine ccmprend un nombre de résidus à la limite du pathologique. L'anticorps monoclonal 1C2 reconnaît spécifiquement les formes pathologiques des protéines pathogènes dans la maladie de Huntington et les maladies associées a une répétition de triplets. Il peut être utilisé afin d'inactiver spécifiquement les formes pathogènes de ces protéines, la liaison de 1C2 pouvant entraîner
- un changement de conformation de la protéine lui faisant perdre ses propriétés pathogènes, ou,
- une plus grande sensibilité aux systèmes de dégradation aussi bien intracellulaires qu'extracellulaires.
Un premier objet de la présente invention est par conséquent l'utilisation de l'anticorps 1C2 ou d'un fragment ou d'un dérivé de l'anticorps 1C2 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement préventif ou curatif des maladies neurodégénératives associées à une répétition de glutamme.
Les fragments ou dérivés d'anticorps sont par exemple les fragments Fab ou F(ab) '2, les régions VH ou VL d'un anticorps ou encore des anticorps simple chaîne
(ScFv) comprenant une région VH liée à une région VL par un bras. Ce type de domaine est particulièrement avantageux puisqu'il peut être dirigé contre toute molécule.
Les anticorps, molécules de la superfamille des immunoglobulines, sont constitués de différentes chaînes (2 lourdes (H) et 2 légères (L) ) elles-mêmes composées de différents domaines (domaine variable (V) domaine de jonction (J) , ete) . Le fragment ou dérivé d'anticorps selon l'invention comprend au moins le site de liaison de l'anticorps aux séquences polyglutamines. Ce fragment peut être soit le domaine variable d'une chaîne légère
(VL) ou lourde (VH) , éventuellement sous forme de fragment Fab ou F(ab')2 ou, préférentiellement, sous forme d'anticorps simple chaîne (ScFv) . Les anticorps simple chaîne sont constitués d'un peptide correspondant au site de liaison de la région variable de la chaîne légère d'un anticorps relié par un bras peptidique à un peptide correspondant au site de liaison de la région variable de la chaîne lourde d'un anticorps. La construction de séquences d'acides nucléiques codant pour de tels anticorps modifiés selon l'invention a été décrite par exemple dans le brevet US 4 946 778 ou dans les demandes WO 94/02610, WO 94/29446. Ce type de molécule c'est-à-dire comprenant le site de liaison de la région variable de la chaîne légère de l'anticorps 1C2 relié par un bras peptidique au site de liaison de la région variable de la chaîne lourde de l'anticorps 1C2, constitue également un objet de la présente invention.
Pour inactiver lesdites protéines pathogènes l'anticorps peut être administré tel quel dans le système nerveux des patients, par voie stéréotaxique. Dans ce cas l'anticorps sera dirigé contre les molécules pathologiques produites par les cellules malades. La fixation de l'anticorps entraîne l'mactivation de ces protéines, et entraîne leur dégradation et permet aussi d'éviter leur accumulation à l'intérieur ou l'extérieur des cellules, une des causes possibles de la maladie. Ces anticorps ou des fragments des ces anticorps peuvent également pénétrer a l'intérieur des cellules et ainsi inactiver les protéines qui ne sont pas sécrétées. Ils sont particulièrement avantageux pour le traitement des maladies telles que par exemple la maladie de Huntington, l'ataxie spmocérébelleuse de type 1, 2 ou 3, l'atrophie musculaire spmo-bulbaire associée au chromosome X ou maladie de Kennedy, l'atrophie dentarorubral- pallidoluysienne et l'ataxie spmocérébelleuse autosomale dominante. Un autre mode d'utilisation de l'anticorps consiste a le faire agir directement à l'intérieur de la cellule. Pour ce faire on utilise les méthodes connues de transfert de gènes. Un mode particulier de réalisation de l'invention consiste a faire exprimer dans les cellules du patient un acide nucléique codant pour l'anticorps 1C2 ou pour un fragment ou dérive l'anticorps 1C2 comme par exemple un fragment ScFv, de cet anticorps.
La séquence d'acides nucléiques codant pour l'anticorps 1C2 ou un fragment ou un dérivé de l'anticorps 1C2 peut être administrée telle quelle, sous forme d'ADN nu selon la technique décrite dans la demande WO 90/11092. Elle peut également être administrée sous forme complexée, par exemple avec du DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. I (1967) 891), avec des protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), avec des lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), sous forme de liposomes (Fraley et al., J Biol Chem. 255
(1980) 10431), etc. Préférentiellement, la séquence utilisée dans le cadre de l'invention fait partie d'un vecteur. L'emploi d'un tel vecteur permet en effet d'améliorer l'administration de l'acide nucléique dans les cellules à traiter, et également d'augmenter sa stabilité dans lesdites cellules, ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable. De plus, il est possible d'introduire plusieurs séquences d'acide nucléique dans un même vecteur, ce qui augmente également l'efficacité du traitement.
Le vecteur utilise peut être d'origine diverse, dès lors qu'il est capable de transformer les cellules animales, de préférence les cellules humâmes. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut être chois parmi les adénovirus, les rétrovirus, les virus adéno-associes
(AAV) ou le virus de l'herpès. A cet égard, la présente invention a également pour objet tout virus recombinant comprenant, inséré dans son génome, un acide nucléique codant pour un fragment ScFv de l'anticorps 1C2. Préférentiellement, les virus utilisés dans le cadre de l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule infectée. Généralement, le génome des virus défectifs utilises dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie) , soit rendues non- fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence codant pour un fragment ScFv de l'anticorps 1C2. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, on été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5
(Ad 2. ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO 94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology
75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne
(exemple SAV) . De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [(souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR- 800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour un fragment ScFv de l'anticorps 1C2. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, aux moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agent mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) et L5 (WO 95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Les adénovirus recombinants défectifs selon 1 ' invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917) . En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour un fragment ScFv de l'anticorps 1C2. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii) , comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293
(Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12%) . Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n°FR 93 05954 et FR 93 08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV) , il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux, la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239 ; US 4,797,368. USS.139.941 EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection dans une lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour un fragment ScFv de l'anticorps 1C2 bordé de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV. et d'un plasmide portan les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203 : EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985)235:Mc Cormick, BioTechnology 3(1985)689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus mtégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag. pol et env) . Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("muπne moloney leukemia virus" : encore désigné MoMLV) . le MSV
("murme moloney sarcomavirus") , le HaSV ("harvey sarcoma virus"), le SNV ("spleen necrosis virus") ; le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention comportant un acide nucléique selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ledit acide nucléique est construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag. pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4, 861,719) , la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150) . Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifies par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes. L'adénovirus est particulièrement préféré pour le transfert de gènes dans le système nerveux (WO94/08026) . Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour un fragment ScFv de l'anticorps 1C2 est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules nerveuses. Préférentiellement, il s'agit de signaux d'expression hetérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression de l'anticorps. Il peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs E1A, MLP, CMV, LTR-RSV. etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu- spécifique.
La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant soit l'anticorps 1C2, un fragment ou dérivé de cet anticorps soit un ou plusieurs vecteurs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intracérébral stéréotaxique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une infection directe dans le cerveau du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans le cerveau du patent est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés.
Les compositions selon l'invention sont tout particulièrement utiles pour le traitement des maladies neurodégénératives associées à la présence d'une protéine portant une chaîne homopolymere de glutamine. Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence IO6 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit*) correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation.
Sur le plan thérapeutique il serait également nécessaire de disposer d'un outil de diagnostic fiable.
Un tel outil serait en outre particulièrement avantageux pour le diagnostic des prédispositions familiales à développer ce type de maladies.
La présente invention a donc d'autre part pour objet de proposer une méthode de diagnostic de la maladie Huntington fondée sur un test biologique.
La demanderesse s'est également intéressée à d'autres applications possibles de l'anticorps 1C2 dans le cadre de l'identification d'agents responsables de maladies neurodégénératives. Bien que les symptômes cliniques manifestés soient souvent très différents la demanderesse a observé que certaines maladies neurodégénératives présentent en revanche de nombreux points communs, quant à leur mode de développement, avec la maladie de Huntington. Ces ressemblances sont surtout une apparition des symptômes de plus en plus précoces et sévères au cours des générations, notamment mais pas exclusivement par transmission d'un allèle paternel muté. Les agents pathologiques responsables de ces maladies ne sont pas connus et sont souvent difficilement identifiables. Il est particulièrement intéressant de rechercher s'il existe dans ces maladies un agent pathogène ressemblant dans sa structure à la protéine responsable de la maladie de Huntington. Il est alors très avantageux d'utiliser l'anticorps monoclonal 1C2 pour détecter chez des sujets atteints de ces maladies la présence de chaînes polyglutamine. Ceci rend possible l'identification des protéines portant ces chaînes qui sont susceptibles d'être les agents pathalogiques recherchés. 1C2 reconnaît ainsi les ataxιnes-1 à 55 glutammes ou plus, dans le cas des SCA 1 (ataxie spmocérébelleuse 1), et trois protéines (une protéine majeure a 68K et deux protéines mineuses a 74K et 87K) , dans le cas des SCA3 (Maladie de Machado-Joseph) .
L'anticorps 1C2 permet, en outre, avantageusement de différencier une SCA2 (ataxie spmocérébelleuse de type 2) d'une ADCA II (ataxie cérébelleuse autosomale dominante de type II) en distinguant les protéines impliquées dans les phénotypes respectifs (protéine de 130K environ pour ADCA II, protéine de 150K environ, pour SCA2, poids moléculaires estimés par migration électrophorétique) .
1C2 peut ainsi avantageusement permettre d'identifier les formes pathogènes des protéines impliquées dans toute maladie neurodegenerative à anticipation prouvée ou suggérée, telle que les ADCA de type I (SCA4, SCA5 par exemple), AD-FSP (paraplégie spastique familiale) ou bien encore dans certaines formes et dans certains cas de maladies affectives bipolaires (psychoses maniaco-dépressives) ou de schizophrénie.
L'identification des protéines responsables de ces maladies permet d'accéder à l'étape de séquençage. L'invention fournit alors les moyens de construire des sondes d'ADN appropriées, pour l'identification du gène responsable et la mise en oeuvre de traitements de thérapie génique tels que décrit ci-dessus.
Après avoir caractérisé l'anticorps 1C2 et montré qu'il détecte de manière spécifique sur transferts Western les protéines pathologiques présentes chez les patients atteints de HD, de SCA1 et de SCA5, la demanderesse a également démontré que des protéines anormales étaient présentes dans des patients de familles SCA2 ou SCA7. Ceci est en très bonne corrélation avec les observations cliniques d'anticipation chez ces familles. La protéine SCA2 mutante est cytoplasmique avec une masse moléculaire apparente de 150 kDa environ alors que la protéine SCA7 est nucléaire avec une masse moléculaire d'environ 130 kDa.
La demanderesse a alors utilisé les propriétés surprenantes et avantageuses de l'anticorps 1C2 pour isoler, par criblage d'expression, des gènes impliqués dans des maladies à extensions polyglutaminiques.
En plus de trois gènes connus, 1C2 a ainsi permis, par criblage de banques d'expression ADNc, de cloner puis de séquencer 6 nouveaux gènes contenant des répétitions CAG et pouvant être impliqués dans des maladies à chaînes polyglutaminiques (motifs codants les chaînes polyglutaminiques de ces gènes en SEQ ID n°l à 6 et ADNc de SCA2 en entier en SEQ ID n°7) .
Ces six nouveaux gènes ne présentent que de très faibles homologies avec les gènes connus. Un de ces nouveaux gènes (SEQ ID n°7 et 3) porte une mutation chez les patients atteints d'ataxie spmocérébelleuse de type 2 (SCA2), c'est-à-dire liée au chromosome 12q. Ce gène présente une expression ubiquitaire. L'invention, objet de la présente demande, a donc également pour objet six nouveaux gènes susceptibles d'être impliqués dans des maladies neurodégénératives ou psychiatriques à chaînes polyglutaminiques, et, en particulier le gène impliqué dans l'ataxie spmocérébelleuse de type 2 (gène SCA2) .
Les allèles impliqués dans SCA2 ont, dans leur forme normale, de 17 à 29 triplets CAG répétés entre lesquels s'intercalent de 1 à 3 triplet(s) CAA.
Dans leur forme mutée, les allèles impliqués dans SCA2 présentent chez les patients étudiés de 37 à 50 triplets CAG répétés, ce nombre n'étant pas limitatif et étant -en tout état de cause supérieur à 30 triplets.Ils apparaissent comme particulièrement instables lors des transmissions à la fois paternelles et maternelles. La séquence de trois d'entre eux présente des chaînes purement CAG.
Le fait qu'une corrélation inverse particulièrement abrupte soit observée entre l'âge où se déclare la maladie et le nombre de répétitions CAG suggère une plus grande sensibilité à la longueur des chaînes polyglutaminiques pour SCA2 que pour les autres maladies liées à une extension polyglutaminique.
Les expériences précédentes en transferts Western suggéraient que le seuil inférieur de détection en utilisant l'anticorps 1C2 était d'environ 30 glutamines.
De manière surprenante et inattendue, 1C2 a permis de cloner des ADNc codant pour des chaînes de seulement 12 à 26 glutamines. Cela pourrait être dû à une plus forte sensibilité du clonage d'expression (plus forte abondance locale de protéines cibles et plus faible complexité des autres protéines) , et/ou à une différence dans les conditions pour la réaction antigène/anticorps (pas de dénaturation par le SDS dans le criblage des colonies) .
En conséquence l'utilisation de l'anticorps monoclonal 1C2 se généralise au diagnostic précoce de sujets susceptibles de développer toute maladie neurodegenerative liée à l'expression d'une protéine ayant dans sa structure une longue chaîne polyglutamine, ainsi que des familles à risques qui expriment des protéines dont la chaîne polyglutamine comprend un nombre de résidus à la limite du pathologique. Ce diagnostic peut utiliser directement l'anticorps 1C2 ou se faire par analyse de l'ADN au niveau de gènes codant pour des polyglutamines, gènes identifiés grâce à l'anticorps 1C2. Pour procéder à ces différents diagnostics, on utilise un anticorps monoclonal 1C2. Cet anticorps est mis en contact avec un extrait cellulaire obtenu à partir de cellules du patient exprimant la protéine recherchée. L'anticorps interagit avec cette protéine au niveau de l'épitope représenté par la longue chaîne polyglutamine. Les complexes Anticorps-Antigènes sont ensuites révélés par tout moyen connu de l'homme du métier (marquage de l'anticorps, utilisation d'un deuxième anticorps fluorescent anti-lC2, ELISA, etc.). L'intensité de l'interaction est déterminée. C'est en fonction de cette dernière que l'on peut établir le diagnostic. 1C2 peut également être utilisé pour la localisation subcellulaire des formes pathologiques des protéines impliquées dans la maladie, pour suivre leur accumulation ou l'accumulation de leurs produits dégradation. La méthode objet de la présente invention ouvre la voie à de nouvelles méthodes de traitement des maladies neurodégénératives basées sur une meilleure connaissance des protéines pathologiques qui en sont responsables. L'invention objet de la présente demande, porte non seulement sur l'utilisation des propriétés nouvelles de l'anticorps 1C2 et sur les protéines impliquées dans la pathogénicité des maladies neurodégénératives à chaînes polyglutaminiques, mais aussi sur de nouveaux gènes également impliqués dans ces maladies.
Les six nouveaux gènes pouvant être impliqués dans des maladies neurodégénératives à chaînes polyglutaminiques selon l'invention, gène SCA2 inclus, sont d'une importance cruciale pour la compréhension des mécanismes de pathogénicité de ces maladies. Ils permettent la mise au point directe de sondes d'acides nucléiques, éventuellement marquées de manière a permettre la détection des formes normales ou mutées de ces gènes, capables de s'hybπder avec les acides nucléiques (ADN ou ARN) impliques dans ces maladies neurodégénératives à chaînes polyglutaminiques.
De telles sondes nucléiques sont particulièrement utiles pour le suivi des familles à risques, le conseil génétique prénatal et la discrimination entre les différentes maladies neurodégénératives, certaines d'entre elles pouvant présenter des symptômes proches.
La présente demande a donc également pour objet de telles sondes nucléiques, portant éventuellement une substitution chimique, sous forme libre ou associée, des compositions pharmaceutiques les renfermant dans un tampon approprié, une méthode m vitro de diagnostic et/ou de conseil génétique mettant en oeuvre lesdites sondes a l'aide d'une technologie telle que PCR, RT-PCR, et des kits de diagnostic comprenant lesdites sondes.
De telles sondes, selon l'invention, peuvent également servir de vecteurs de substances médicamenteuses pour délivrer lesdites substances médicamenteuses au niveau des zones présentant lesdits gènes, sous leur forme normale ou pathologique.
Les nouveaux gènes selon l'invention permettent également la mise au point directe d'acides nucléiques anti-sens (ADN ou ARN) utiles comme médicaments, dans le traitement de maladies neurodégénératives. La présente demande vise donc également de tels acides nucléiques anti-sens, portant éventuellement, le cas échéant, une substitution chimique, sous forme libre ou associée, éventuellement inclus, encapsule ou adsorbé, des compositions pharmaceutiques les renfermant dans un tampon approprié, et des kits à usage thérapeutique comprenant lesdits acides nucléiques anti-sens.
La présente demande porte non seulement sur lesdits nouveaux gènes, sondes nucléiques, acides anti- sens selon l'invention mais aussi sur tout acide nucléique présentant une homologie supérieure ou égale à 501 avec ces produits, sur tout fragment de ces produits, et sur toute banque d'acides nucléiques obtenues par criblage d'expression à l'aide de l'anticorps 1C2 de lignées cellulaires, issues de patients ou d'animaux atteints d'une maladie neurodegenerative.
La présente demande vise également un procédé d'identification ou de purification de protéines à chaînes polyglutaminiques utilisant une étape d'immunodétection ou d'immunopurification par l'anticorps 1C2, fragment ou dérivé de cet anticorps, ou pouvant conduire secondairement à identifier le gène correspondant.
La présente demande vise enfin une méthode de diagnostic utilisant l'amplification PCR sur ADN ou RT- PCR sur ARN permettant de détecter des formes mutées dans des gènes codant pour des chaînes polyglutaminiques identifiées ou clonées grâce à l'anticorps 1C2.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui vont suivre et qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 8: - la figure 1 représente le criblage d'expression d'une banque d'ADNc en utilisant l'anticorps 1C2,
- la figure 2 représente la détection par PCR d'allèles étendus dans une famille SCA2, la figure 3 représente les structures d'allèles normaux et pathologiques,
- la figure 4 représente la distribution des tailles alléliques au locus SCA2, - la figure 5 représente l'instabilité de la répétition SCA2 au cours de transmissions de parents à enfants,
- la figure 6 représente la corrélation entre l'âge de déclenchement de la maladie clinique et le nombre de répétitions,
- la figure 7 représente la séquence de l'ADNc SCA2, et la figure 8 représente l'analyse par transfert Northern de l'expression du gène SCA2.
EXEMPLES:
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telle que la technique de Western Blot, le marquage d'anticorps, etc.. sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature (Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M.. et al, (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987) .
Exemple 1: Mise en évidence de l'affinité spécifique de l'anticorps monoclonal 1C2 pour les chaînes polyglutamines.
Afin de mettre en évidence sa capacité à reconnaître des protéines possédant une chaîne homopolymere de glutamine, mAclC2 a tout d'abord analysé en "Western Blot" sur des extraits de lignées cellulaires lymphoblastoïdes (ci-après LCL) provenant d'individus normaux et d'individus atteints de la maladie de Huntington présentant des longueurs variées de chaînes polyglutamines dans les HDP (Huntington Disease Protein) . Ces différentes protéines sont tout d'abord mises au contact d'un anticorps monoclonal anti-HDP. On observe lors de l'analyse en Western Blot que l'on discrimine très facilement les protéines normales de celles ayant une chaîne polyglutamine allongée, grâce à leur différence de poids moléculaire. Par contre, lorsque le même lot est analysé avec l'anticorps monoclonal 1C2, seules les protéines HDP à longue chaine polyglutamine sont détectées, les protéines normales ne donnant pas de réponse. La réponse obtenue avec mAclC2 est spécifique des protéines pathologiques.
Il est également très intéressant de constater que l'intensité du signal dépend de la longueur de la chaîne poluglutamine. Cette intensité est très forte pour les chaînes de plus de 50 unités et minimale pour des chaînes de 39-40 unités.
Exemple 2: Mise en évidence d'une corrélation entre la longueur de la chaine polyglutamine et l'augmentation de l'affinité de 1C2 pour celle-ci
Cette relation entre intensité du signal et longueur de chaîne a ensuite été examinée à l'aide d'échantillons ordonnés en ordre de longueurs de chaînes décroissantes en partant du plus grand allèle. On observe que la valeur de l'affinité de l'anticorps monoclonal 1C2 pour les formes mutantes de HDP dépend clairement de la longueur de la chaîne de polyglutamine. En effet, l'intensité du signal est plus forte pour les protéines ayant une chaîne de 60 à 85 résidus que pour les protéines ayant une chaîne de 39 ou 40 résidus, cette dernière étant elle-même plus forte que celle observée pour des chaînes plus courtes. On observe également qu'une durée d'exposition à l'anticorps prolongée permet la détection des protéines ayant une chaîne dont la longueur se situe à la limite supérieure des protéines normales (> 28) . Une comparaison semi-quantitative de l'intensité du signal détecté avec des HDP comprenant 36, 60 et 85 résidus glutamine a été effectuée à partir d'une série de dilutions d'extraits de LCL. L'intensité du signal HDP observée est 2 à 4 fois plus importante avec des chaînes de 85 résidus qu'avec des chaînes de 60 résidus et de 10 à 20 fois plus importante avec des chaînes de 60 résidus qu'avec des chaînes de 39 résidus.
Exemple 3: Mise évidence que l'épitope reconnu par mAclC2 est uniquement la chaine polyglutamine
Lorsqu'on procède au séquencçage de la protéine HDP on remarque que le peptide LEEQQRQQQQQQ de TBP qui est reconnu par l'anticorps n'est pas présent dans les séquences qui entourent la chaîne de résidus glutamine dans HDP. On en déduit que l'épitope de HDP qui est reconnu par l'anticorps monoclonal 1C2 est bien uniquement la chaîne polyglutamine et que l'intensité du signal est uniquement dépendante de la longueur de celle- ci. Une expérience de vérification a été faite avec différents allèles de TBP qui possèdent également des chaînes polyglutamine dont la longueur varie de 29 à 42 résidus. L'analyse en Western Blot, après exposition à 1C2, a permis de discriminer les allèles en fonction de leur taille. Là aussi l'intensité du signal est plus importante avec les chaînes de grandes tailles et les chaînes comprenant entre 27 et 30 résidus ne sont pas détectées.
L'anticorps 1C2 est donc capable de reconnaître spécifiquement une séquence polyglutamine. L'intensité du signal obtenu dépend de la longueur de ladite séquence plus celle-ci est longue plus l'intensité est forte.
Exemple 4: Détection d'une epitope pathologique dans les ataxies spinocérébelleules SCA1 et SCA3.
Pour mettre en évidence la capacité de mAclC2 à détecter sélectivement d'autres protéines pathogènes comprenant une longue chaîne polyglutamine, nous avons analyse en Western Blot des extraits de LCL provenant de patients atteints de SCA1 et SCA3.
Lors de l'expérience de liaison avec mAclC2, une protéine de 100 kD a été spécifiquement détectée dans les extraits provenant de patients atteints de SCA1 alors qu'elle était absente des extraits provenant de patients atteints de SCA3. Cette protéine correspond à l'ataxme 1, la protéine responsable de SCA1. Inversement, dans les extraits de LCL provenant de patients atteints de SCA3 on a détecte au moins 4 protéines (une bande majeure correspondant a une protéine de 68 kD et trois bandes mineures correspondant à des protéines de 64, 74 et 87 kD) qui sont absentes des extraits provenant de patients atteints de SCA1. Un contrôle effectué sur 9 LCL provenant de sujets sais ne montre aucune de ces bandes. Dans tous les cas, aussi bien chez les sujets sains que chez les sujets atteints, on retrouve une bande correspondant à la TBP et une autre correspondant à une protéine d'environ 230 kD. On peut en conclure que mAclC2 est spécifiquement des protéines responsables de SCA1 et SCA3 et peut donc être utilisé dans le diagnostic de ces deux maladies.
Exemple 5: Mise en évidence de la présence de protéine contenant une longue chaîne polyglutamine dans d'autres maladies neurodégénératives grâce à mAclC2. Les caractéristiques phénotypiques communes à toutes les maladies considérées se retrouvent dans d'autres maladies neurodégénératives comme l'ataxie cérébelleuse autosomale dominante (ADCA) et la paraplégie spasmodique familiale (FSP) pour lesquelles la/les protéine (s) responsables ainsi que le (s) gène (s) correspondant n'ont pas encore été mis en évidence.
On a testé en aveugle des extraits de LCL provenant de sujets atteints de ces deux maladies, et de SCA1, SCA3 et la maladie de Huntington.
Sur les 9 LCL testées, 4 montrent une bande correspondant à une protéine spécifique de 130 kD ou de 150 kD, 3 ne montrent aucun signal spécifique et les deux autres présentent des bandes correspondant aux protéines mutées responsables de SCA1 et appartiennent aux témoins.
Les résultats obtenus ont été comparés aux données des dossiers médicaux des sujets de l'expérience.
Les colonnes portant la bande pour une protéine de 130 kD correspondent à des échantillons provenant de patients atteints d'ADCA de type II entraînant une dégénération rétinienne. Des expériences de cartographie chromosomique ont permis de localiser le gène correspondant à cette protéine de 130 kD sur le chromosome 3p, ce locus correspond au locus présumé responsable de la maladie. On a également retrouvé cette même protéine dans d'autres patients atteints d'ADCA de type II appartenant à d'autres familles.
La protéine de 150 kD a été recherchée chez d'autres patients atteints d'ADCA portant une mutation dans le gène SCA2 ainsi que chez des personnes de la même famille n'ayant pas développé la maladie. La protéine est toujours présente mais chez les sujets sains la longueur de la chaîne polyglutamine est plus petite et donc non détectée dans les conditions expérimentales telles que décrites ci-dessus. On peut donc en déduire que cette protéine de 150 • kD est bien responsable d'une maladie neurodegenerative associée à l'allongement d'une chaîne polyglutamine dans une protéine normale qui présente les mêmes caractéristiques de transmission que la maladie de Huntington.
Exemple 6: localisation intracellulaire des protéines pathologiques. L'anticorps mAclC2 a également été utilisé pour déterminer la localisation intracellulaire de la protéine responsable de SCA3 ainsi que celle des protéines nouvellement identifiées et qui sont liées à l'ADCA de type II et à SCA2. L'analyse des fractions cellulaires est effectuée selon la technique du Western Blot. On utilise des fractions enrichies provenant des différents compartiments cellulaires : le compartiment cytoplasmique et le compartiment nucléoplasmique. L'hybridation est réalisée avec mAclC2 marqué.
Les ataxines 2 et 3 ainsi que la HDP mutante ont été localisées dans la fraction cytoplasmique. La protéine de 130 kD liée à l'ADCA de type II a quant à elle été localisée dans la fraction nucléoplasmique. Des tests de contrôle effectué avec la TBP dont la localisation cellulaire est connue ont permis de valider ces résultats.
Exemple 7: clonage du gène impliqué dans l'ataxie cérébelleuse de type 2 (SCA2) .
. Méthode
Banques d'expression ADNc
Des ARN poly A+ SCA2 et SCA7 ont été préparés à partir de lignées cellulaires lymphoblastoïdiques (LCL) de patients SCA2 et SCA7. La transcription inverse a été réalisée en utilisant des oligonucléotides hexamériques aléatoires. Les ADNc ont été ligaturés à des adaptateurs EcoRI et clones dans des bras de vecteur EcoRI I-SCREEN-1 (Novagen®) et insérés en suivant le protocole du fabricant.
Criblage des banques d'expression en utilisant 1'anticorps 1C2. Les phages ont été incubés pendant 15 minutes pour infection avec les bactéries BL21 dans LB contenant du maltose 0,2 mM, MgS04 10 mM et du chloramphénicol à 40 mg/ml. Environ 8.105 pfu de chaque banque ont été déposées sur un milieu NZY. Lorsque les plaques furent visibles, une membrane en nylon imbibée de IPTG lOmM a été placée sur les boîtes et l'induction de l'expression a été réalisée pendant 3 heures 30 minutes. Les membranes ont été ensuite lavées deux fois dans du PBS lx, Tween 0,05% pendant 5 et 30 minutes respectivement. Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5% puis incubées avec l'anticorps monoclonal 1C2. L'anticorps secondaire (immunoglobulines de chèvre anti-souris) a été couplé à une peroxydase pour permettre une révélation avec le kit ECL (Amersham®) . Les temps d'exposition sont couramment de 20 minutes.
Les plaques positives ont été éluées à 4°C dans un milieu SM et les phages ont été transformés dans les bactéries BL21 comme ci-dessus décrit. Un criblage secondaire et, si nécessaire, tertiaire a été réalisé comme ci-dessus. Les phages positifs isolés ont été excisés en suivant le protocole du fabricant (Novagen®) et les plasmides obtenus ont été transformés dans des bactéries HB101.
Analyses PCR et séquençage direct Des RT-PCR ont été réalisées en utilisant les amorces suivantes:
DAN1: CGTGCGAGCCGGTGTATGGG (UH13); GGCGACGCTAGAAGGCCGCT (UH10) DAN15 CCACCATGCCCACCACCTCC; CCGCGCCGCCCAAGCTGTTG
DAN26 AATGACGTGCTGCACCACTG, CCAGGCATCTGGATGGGAGG
AAD10: CCTCGGACCTGATTCAAGGC; GCTGCTGGGAGGCATAAGGC,
AAD14: AAGTGCCCCTGTCCATCCTCT, GGAGAGGAGTGCAACAGACC,
AAD20. CGGTCGCGGCAATCCTAG, GAGGTTCCGGCTCGGACT
Les amorces réalisées pour DAN1, DNA15, AAD14 et ADD20 permettent l'amplification de l'ADN génomique. Les produits ont été analysés sur un gel d'agarose à 2% et transférés sur une membrane de nylon pour hybridation avec une sonde oligonucléotidique
(CAG) 16. Pour l'analyse PCR des allèles SCA2, 100 ng d'ADN génomique ont été amplifiés dans 20 ml de Tris-HCl lOmM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, glycerol 15%, 250 mM de chaque dNTP, et 10 pmoles d'amorces UH10 et UH13. Après un démarrage à chaud de 5 minutes à 96°C, 0,5 U de Tag polymérase a été ajoutée, 35 cycles (30 secondes à 94°C, 30 secondes à 65°C, 30 secondes à 72°C) et une elongation finale de 10 minutes à 72°C ont été réalisés. Les produits ont été déposés sur un gel dénaturant à 6% de polyacrylamide et 7 M d'urée. Ils sont transférés et hybrides avec une sonde (CAG) 7. Pour le séquençage direct des allèles SCA2, 40 cycles ont été réalisés (les allèles "étendus" ont été mieux amplifiés en l'absence de KCl et de glycerol) et les fragments excisés ont été séquences sur un séquenceur automatique Applied Biosystems® (ABI) avec des didésoxynucléotides fluorescents.
Analyses des transferts Northern et Zoo Un fragment d'ADNc EcoRI de 2,5 kb correspondant à l'extrémité 3' du clone DAN1 a servi de sonde pour les analyses de transferts Northern et Zoo. Les transferts Northern de MTN humains et MTN II issus de cerveaux humains ont été obtenus par Clontech®. L'hybridation des sondes a été réalisée en utilisant la solution d'hybridation ExpressHyb® (Clontech®) . Les transferts ont été lavés dans du SSC 0,lx, SDS 0,1% à 55°C. L'hybridation des transferts Zoo a été réalisée dans du formamide à 30%. Le lavage a été réalisé dans du SSC 0, 5 x, SDS 0, 1% à 51°C.
. Résultats
Clonage d'expression d'ADNc contenant des polyglutamines
L'utilisation selon l'invention de l'anticorps monoclonal 1C2 avait permis précédemment de détecter dans des lignées lymphoblastiques de patients présentant les formes SCA2 et SCA7 de ADCA (ataxie cérébelleuse autosomale dominante) des protéines pathologiques devant contenir une longue chaîne polyglutaminique.
Pour essayer de cloner les ADNc correspondants, deux banques d'ADNc lymphoblastiques ont été construites dans un vecteur d'expression de bactériophages I (I- Screen-1, Novagen®), en utilisant des lignées cellulaires de patients SCA2 (AAD) ou SCA7 (DAN) . Environ 8.105 clones ont été déposés sur plaques à partir de chaque banque et ont été criblés avec l'anticorps 1C2.
21 clones positifs ont été obtenus après trois itérations de criblage.
En figure 1, est représenté le criblage d'expression d'une banque d'ADNc en utilisant l'anticorps 1C2: la partie supérieure gauche rectangulaire montre la détection du clone DAN1 à l'étape primaire de criblage (environ 20 000 pfu par boîte) , avec un arrière-plan très clair. Les autres parties rectangulaires correspondent aux criblages secondaires de ce clone (environ 100 pfu par boîte) .
Tous, excepté deux, contiennent des répétitions CAG telles que déterminées par hybridation avec une sonde oligonucléotidique (CAG) 10.
Les 19 clones positifs à CAG correspondent à 8 transcrits différents et sont présentés dans le tableau suivant.
3 o
Tableau 1 : clones obtenus par criblage avec 1C2 KO -I t (Λ clones taille p°'yg'n motifs codants polygln analogues sur banques de données
nouveaux gènes
ΛAD 10 0.7 kb 1 1 et 8 (CAG)6 CAA (CAG)4 (NNN)O (CAG)2 CAA (CAG)3 (NNN)97 X85325 (i) (CAG)5 (CAA)2 CAG CAC CAA CAG CAA
AAD 1 4 1 .9 kb 12 et 14 (CAG)7 CAA (CAG)4 (NNN)25 (CAG)14 M62043; F1 1363; STS G 16005
DAN 1 4 kb 22 (CAG)O CAA (CAG)4 CAA (CAG)8 6 ESTs
DAN 15 4 kb 1 8 (CAG)7 CAA (CAG)7 CAA (CAG) CAA aucune
DΛN2G 1 .0 kb 1 2 (CΛG)G CAA (CAG)5 M05636; R72355; M4G 102; 1 143 176
AAD20 1.9 kb ( 14) (ii) (CAG) 14 M65150 (glutaminase de rat) gènes connus
AAD5 Huntington 20 (CAG)IO CAA CΛG
AAD38 liSNFalpha 23 to 26 CAG (CAA)2 (CAG)3 CAA (CAG) 13 CAA (CAG)2 CCA (CAG)3 (NNN)6 CAG (CAA)2 (CAG)2
DΛN20 actine beta aucune
O
(i) l'extrémité 3' de AADIO chevauche l'extrémité 5' de X85325 ce qui a été décrit comme contenant une chaîne glutaminique non polymorphique H interrompue. Cette chaîne apparaît comme étant dans le cadre de lecture avec les régions codantes polyglutaminiques de AADIO. κ oO
Figure imgf000033_0001
\ (ii) le plus grand cadre de lecture ouvert de AAD20 prédit que la répétition code pour une polyleucine. (iii) excepté pour G 16005, l'homologie ne chevauche pas les répétitions CAG. -i
Les 19 clones positifs incluent un ADNc d'huntingtine normale (20 gin) et un ADNc pour le facteur de transcription hSNF-α32, qui contient aussi une répétition polyglutaminique (26 gin) . La taille de la dernière protéine (174 kDa) l'exclut comme candidat pour les gènes de SCA2 ou SCA7.
Les six autres transcrits correspondent a des gènes contenant CAG nouveaux.
Aucun des clones ne présente cependant un nombre de répétitions pathologique attendu ( > 35 gin) , les plus longues chaînes consistant en 14 CAG ininterrompus (AAD14 et AAD20) . Dans tous les gènes exceptes AAD20, le cadre de lecture ouvert permet de prédire de manière non ambiguë une chaîne polyglutaminique. En tenant compte des interruptions par les codons CAA, les plus longues chaînes polyglutaminiques prédites ont été trouvées dans DAN1 (22 gin) et DAN15 (18 gin) . Ce résultat est inattendu par rapport aux résultats obtenus au préalable par transferts Western pour lesquels 1C2 ne détecte que les chaînes d'une longueur supérieure a 30 gin dans des extraits cellulaires entiers.
Identification d'un clone SCA2. Bien que les répétitions obtenues n'apparaissent très étendues, il restait possible qu'un des clones représente un allèle normal au locus SCA2 ou SCA7, ou bien la rétractation d'un allèle étendu du fait de l'instabilité des longues répétitions dans les bactéries.
Des amorces adjacentes aux répétitions (voir méthode) ont donc été construites et testées par RT-PCR ou PCR sur, respectivement, de l'ARNm ou de l'ADN génomique obtenus de patients SCA2 et SCA7. Une paire d'amorces (dérivées de DAN1) détecte les fragments RT-PCR étendus des patients SCA2. Cela a été confirmé en utilisant les mêmes sondes dans toutes les familles SCA2 testées au niveau de l'ADN génomique. En figure 2 est représentée la détection par
PCR d' allèles étendus dans une famille SCA2 : l'analyse PCR a été réalisée en utilisant les sondes UH10 et UH13; les tailles alléliques (nombre de répétitions) sont 22/37, 23/38, 22/43, 22/43, 22/23 et 22/22 pour les individus 1 à β respectivement; le père dans la génération II a transmis des allèles étendus par 5 répétitions à ces deux filles affectées; ceci est corrélé avec une forte anticipation (l'âge de déclenchement de la maladie est indiqué sur le pedigree) ; on note une hétérogénéité apparente des allèles mutants; la plus forte bande a été utilisée pour la détermination des tailles de répétitions.
De plus, ces amorces amplifient le fragment correspondant dans quatre YAC de la région candidate SCA2 de 12q23-24.1 (CEPH YAC 674f2, 722h7, 774a3 et 910gl) qui contiennent également le microsatellite D12S1340 (AFM291xe9) .
Allèles normaux et pathologiques La répétition originelle dans le clone DAN1 est interrompue par deux triplets CAA. Afin de vérifier si les interruptions sont trouvées dans les allèles normaux de manière générale, les produits PCR correspondants à 17 allèles normaux indépendants ont été séquences. Tous les allèles analysés contiennent de 1 à 3
CAA dispersés, dans les plus communs des cas (9 sur 17) deux CAA sont observés avec une structure (CAG) 8 CAA (CAG) 4 CAA (CAG) 8, comme pour DAN1.
En figure 3, est représentée la structure d'allèles normaux et pathologiques: le séquençage direct des produits PCR montre des codons CAA intercalaires (cercles pleins) parmi des répétitions CAG (cercles vides) ; deux allèles pathologiques à 40 et 41 répétitions et un allèle à 34 répétitions d'un porteur cliniquement normal d'un haplotype SCA2 ont été amplifiés dans différentes conditions et ne montrent pas de CAA intercalaires.
Par analyse PCR de 110 allèles, un nombre normal de 17 à 29 répétitions a été observé. 22 répétitions ont été observées pour 75% des allèles alors que le nombre lié a la pathogénicité était de 37 à 50 répétitions (n=31) .
En figure 4, est représentée la distribution des tailles alléliques au locus SCA2 : les analyses PCR d'individus français normaux et SCA2 ont été réalisées comme décrit ci-dessus; les 110 allèles normaux sont des allèles indépendants alors que les 31 allèles pathologiques (barres pleines) dérivent de 8 familles.
Deux allèles mutants indépendants ont été séquences et se présentent comme constitués de pures chaînes CAG (voir figure 3), tout comme s'est présenté un allèle à 34 CAG d'un individu âgé de 32 ans cliniquement normal issu d'une famille SCA2. Cet individu est porteur de l'haplotype pathologique.
Instabilité et âge de déclenchement de la maladie
Dans les 16 cas de transmissions de parents à enfants que nous avons pu étudier, 13 ont mis en évidence une instabilité. Un seul cas a mis en évidence une diminution (de 3 unités), et de manière plus frappante, 5 cas ont mis en évidence une augmentation de 5 à 10 répétitions. Voir, à ce sujet, la figure 2 et voir également la figure 5 qui représente l'instabilité de la répétition SCA2 lors d'une transmission de parents à enfants: la différence entre le nombre d'unîtes de répétitions dans les allèles étendus de parents et enfants a ete déterminée pour neuf transmissions paternelles et sept transmissions maternelles chez 8 familles.
Ces grands sauts ont été observes pour les transmissions à la fois paternelles et maternelles, contrairement à ce qui a été observé dans les autres maladies liées aux chaînes polyglutaminiques. Une forte corrélation inverse entre l'âge de déclenchement de la maladie et la longueur des répétitions a été observée pour 26 patients (r = -0,86 avec une régression quadratique, p = 0,0001) .
En figure 6, est représentée la corrélation entre l'âge de déclenchement de la maladie clinique et le nombre de répétition: les données proviennent de 26 patients (âge moyen de déclenchement de la maladie = 34 ans, gamme allant de 13 à 60 ans) ; le coefficient de corrélation est calculé pour une régression quadratique (r = -0,86; p < 0,0001) .
L'effet de répétitions additionnelles est frappant: pour quatre patients présentant 37 répétitions, l'âge de déclenchement de la maladie s'est situé entre 45 et 60 ans alors que pour les trois patients présentant de 46 à 50 répétitions, l'âge de déclenchement de la maladie s'est situé entre 13 et 18 ans.
Le gène SCA2 et son expression
Le clone DAN1 (4,0kb) a été entièrement séquence: en figure 7, est représentée la SEQ ID n°7.
La figure 7 représente en effet la séquence de l'ADNc SCA2. La séquence nucleotidique de la position 1 à
3986 provient du clone DAN1. Les dernières 177 paires de bases (en italique) proviennent de EST (H92640, N90240 et Z13574 de dbEST) qui chevauchent, de manière non ambiguë, l'extrémité 3' de la séquence DANI. Seules les séquences communes aux trois EST ont été ici ajoutées à la séquence DANI. La chaîne polyA interne à la position 4002 diffère en longueur des trois EST (indiqués par un a en lettre minuscule) et n'est pas précédée par un signal de polyadénylation. EST N90240 présente cependant deux signaux de polyadénylation putatifs AATAAA situés à 33 et 59 paires de bases en 3' de l'extrémité de la séquence consensus proposée. Le premier codon méthionine à la position 243 et le consensus Kozak qui le précède sont soulignés. Ce codon est en phase avec une séquence d'aminoacides putative située en amont (en italique) . Le premier codon de terminaison dans le cadre (position 2745) est souligné. Le cadre de lecture ouvert chevauchant est également montré (en italique) et son codon de terminaison souligné (position 3638) . La séquence de la position 2560 à la position 2880 est confirmée par des EST chevauchant (H70616, R00491, R10603), ce qui écarte une mutation artéfactuelle du cadre de lecture dans le clone DANI.
Un cadre de lecture ouvert commence à la position 1 jusqu'à la position 2745. La première méthionine est à la position 243 et est précédée d'une très bonne séquence consensus pour l'initiation de la traduction (accord de 6/9 y compris l'important A à -3). La séquence amont est très riche en GC, ce qui pourrait expliquer l'absence de codons d'arrêt dans les trois cadres de lecture.
De manière inattendue, un second cadre de lecture ouvert de 348 codons chevauche, dans un cadre différent, le plus grand cadre de lecture ouvert. La probabilité pour que cela soit le résultat du hasard est faible; cela suggère une mutation du cadre de lecture dans le clone originel DANI. Une comparaison avec la séquence de 3 EST chevauchant cette région (positions 2560 à 2880) a cependant confirmé la séquence du clone DANI et la présence du codon d'arrêt prédit. L'existence d'un déphasage du cadre de lecture lors de la traduction reste une possibilité distincte, d'autant plus que le programme informatique GRAIL la donne au cadre de lecture ouvert 3' un score "excellent" pour sa capacité à coder des protéines. Une autre possibilité est l'existence d'épissages alternatifs produisant diverses formes d'ARNm, certaines étant porteuses d'un décalage du cadre de lecture (exemple: le gène FMR1 fragile X mental retardation 1) . Trois autres EST chevauchant étendent la région 3' non traduite de 177 paires de bases (voir figure 7) .
Un fragment DANI de 2,5 kb a été utilisé comme sonde dans des transferts Northern avec de l'ARN polyA + humain. Une expression ubiquiste a été trouvée dans différentes régions du cerveau et une forte expression a été observée dans d'autres organes.
En figure 8, est représenté une analyse d'un transfert Northern. Une sonde de 2,5 kb (de la position 1370 à 3985 sur la figure 7) a été utilisée pour les transferts Northern (MTN Clontech® et MTN2 issu de cerveau) contenant de l'ARN polyA + humain des régions de cerveau et des tissus indiqués. La longueur de l'ARNm a été évaluée à 4,4 kb, ce qui est très proche de la séquence de 4,2 kb dérivée du DANI et chevauchant les EST.
La ou les protéine (s) prédite (s) à partir des deux cadres de lecture ouverts ne présente (nt) pas d'homologie significative avec des protéines connues chez les humains ou chez les autres organismes. Le gène apparaît bien conservé chez les mammifères (bovins, lapins, moutons, cochons et souris) et les poulets comme l'indiquent les fragments à fortes réactions croisées observés sur transfert Zoo en utilisant les mêmes sonde d'ADNc et conditions d'hybridation et de lavage que pour l'analyse par transfert Northern.
Discussion
SCA2 est le sixième locus clone correspondant à une maladie où se trouve impliquée une extension de répétitions CAG/polyglutamine. Dans la population étudiée, une limite inférieure de pathogénicité de 37 glutamines a été trouvée, ce qui est très proche de la limite de 36 trouvée chez les très rares patients atteints de la maladie de Huntington. Cette limite n'est pas définitive et ne pourra être établie que par l'étude d'un nombre plus élevé de patients. Les limites inférieures pour les autres maladies sont respectivement 40, 40, 49 et 61 pour SBMA, SCA1, DRPLA et MJD/SCA3.
Malgré un seuil de pathogénicité similaire, l'effet des glutamines additionnelles apparaît plus important dans SCA2 que dans HD puisque le déclenchement juvénile de la maladie (inférieur ou égal a 20 ans) est atteint avec 46 répétitions pour SCA2 alors que, pour HD, les cas juvéniles sont majoritairement atteints avec plus de 60 répétitions et, pour SCA1, à plus de 55 répétitions.
La courbe, très abrupte, de corrélation semble plus proche de celle de la maladie de Machado-Joseph
(SCA3) , pour laquelle le seuil de pathogénicité est cependant plus élevé. Cela suggère que la protéine impliquée dans SCA2 (ataxme 2) est très sensible aux polyglutamines.
En alternative, cette sensibilité accrue pourrait être une propriété des neurones affectés. L'existence d'un effet "contexte protéique" est supporté par le fait que dans la protéine TBP (TATA binding protein), jusqu'à 42 glutamines sont trouvées dans les allèles normaux. Il est oe plus possible que la toxicité d'une ataxme troncaturée soit plus élevée que celle de la protéine entière, avec un rôle protecteur de la partie protéique troncaturée.
Un autre caractère très frappant chez les familles SCA2 est la haute instabilité de la répétition. 13 des 16 transmissions mettent en évidence une instabilité et 5 d'entre elles, en particulier, présentent une augmentation de 5 à 10 répétitions.
De telles augmentations se produisent dans 20 à 30% des transmissions paternelles de HD, préférentiellement chez des allèles parentaux à plus de 45 glutamines, et sont très rares, pour SCA1 ou SBMA, pour des tailles de répétitions similaires.
Ces grandes extensions additionnelles se produisent, de plus, lors de transmissions paternelles et maternelles. Ce fait est en bonne corrélation avec le manque de biais parental dans l'anticipation de SCA2 pour laquelle les mêmes 11-16 années d'anticipation de l'âge de déclenchement de la maladie ont été observées indépendamment du sexe du parent transmetteur.
Le biais paternel pour l'extension qui est observée chez HD, SCA1, DRPLA et aussi chez des dystrophies myotoniques (pour des allèles dans la gamme des 50-100 CTG) , et, dans une moindre mesure chez SBMA, n'est pas une propriété intrinsèque des répétitions CAG ou CTG. Des effets dus à la position (nature des séquences environnantes et localisation de la séquence relativement aux origines de réplication) pourraient jouer un rôle important dans l'instabilité.
Un autre trait du locus SCA2 est l'interruption, chez les allèles normaux, de la répétition de CAG par 1 à 3 CAA (qui codent également pour des glutamines) .
Les trois allèles pathologiques séquences
(issus de familles différentes) contiennent cependant des répétitions purement CAG. Ceci est très similaire au cas de SCA1 pour lequel les allèles normaux sont interrompus par des codons CAT (histidine) alors que les allèles étendus sont constitués purement de CAG.
Ces interruptions dans les répétitions pourraient avoir un effet stabilisant et la perte des interruptions CAA pourrait constituer un événement initial dans l'histoire de la mutation.
Comme dans quatre des cinq autres maladies à polyglutamine (l'exception étant SBMA et le gène du récepteur androgène), le gène SCA2 n'a pas de fonction évidente et apparaît comme s 'exprimant de manière ubiquiste dans le cerveau et cela même dans des zones telles que le putamen qui reste non affecté chez les patients. La taille apparente de la protéine SCA2 mutante est de 150 kDa sur transferts Western mais les chaînes étendues de polyglutamines peuvent affecter la migration électrophorétique et une taille d'environ 120-130 kDa
(environ 1100-1200 acides aminés) pour 1 ' ataxine 2 normale peut être estimée.
Le cadre de lecture ouvert principal commençant au premier codon méthionine (caractérisé par une très bonne concordance avec le consensus Kozak) , code pour une protéine de 834 acides aminés et d'un poids moléculaire de 89,9 kDa.
Pour expliquer un tel écart, on peut supposer que, soit le vrai codon d'initiation est en amont de la séquence présentée, soit le cadre de lecture ouvert 3' qui chevauche le cadre principal est utilisé par déphasage du cadre de lecture lors de la traduction sur les ribosomes. Une troisième possibilité est que les ADN séquences correspondent à un épissage alternatif altérant la phrase de lecture. Etant donné que la séquence présentée (4,2 kb) est très proche de la longueur d'ARNm estimée sur transfert Northern (4,4 kb, polyA inclus), il n'y a pas beaucoup de place pour un site d'initiation amont additionnel.
Il est donc possible qu'un déphasage ribosomique du cadre de lecture, qui est observé pour plusieurs gènes viraux et aussi pour quelques gènes humains, soit impliqué.
Une mutation -1 du cadre de lecture correspondrait à une protéine normale de 1132 acides aminés et de poids moléculaire 121,7 kDa, ce qui est en très bon accord avec le poids moléculaire estimé.
Par analyse informatique de la séquence ARNm, des structures secondaires de pseudonoeuds, qui peuvent constituer des séquences stimulant les événements de mutation du cadre de lecture, n'ont pu être mises en évidence. La mutation -1 du cadre de lecture telle que suggérée ci-dessus ne constitue donc qu'une explication possible des écarts de tailles observés.
La mise en évidence d'un éventuel épissage alternatif pourra être établie par RT-PCR en utilisant des amorces basées sur la séquence de la figure 7 à partir d'ARN provenant de divers tissus.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: C.N.R.S.
(B) RUE: 3, rue Michel-Ange
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75016
(A) NOM: I.N.S.E.R.M.
(B) RUE: 101, rue de Tolbiac
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75013
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Moyens pour le traitement et le diagnostic des maladies neurodégénératives
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D* EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 399 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: AAD10
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1
CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA ACAGCAGCAG CAGNNNNNNN 40
NNNNNNNNNN NNNNNNNCAG CAGCAACAGC AGCAGNNNNN 80
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 120
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 160
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 200
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 240
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 280
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 320
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 360
NNNNNNCAGC AGCAGCAGCA GCAACAACAG CACCAACAGC 400
AA 402 (3) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 152 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: AAD14
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAACAGCAG CAGCAGNNNN 40
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 80
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NCAGCAGCAG 120
CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAG 153
(4) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: DANI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAACAG CAGCAGCAGC 40 AACAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAG 66
(5) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 54 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: des deux (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: DANI5
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAACAGCAG CAGCAGCAGC 40 AGCAGCAACA GCAA 54
(6) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: DAN26
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA ACAGCAGCAG CAGCAG 36
(7) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: des deux
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: AAD20
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AG 42 (8) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
U) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 4199 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: des deux
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (lil) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(vil) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE: DANI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ACGGCAACGG CGGCGGCGCG TTTCGGCCCG GCTCCCGGCG GCTCCTTGGT CTCGGCGGGC 60
CTCCCCGCCC CTTCGTCGTC GTCCTTCTCC CCCTCGCCAG CCCGGGCGCC CCTCCGGCCG 120
CGCCAACCCG CGCCTCCCCG CTCGGCGCCC GTGCGTCCCC GCCGCGTTCC GGCGTCTCCT 180
TGGCGCGCCC GGCTCCCGGC TGTCCCCGCC CGGCGTGCGA GCCGGTGTAT GGGCCCCTCA 240
CCATGTCGCT GAAGCCCCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAACAGCAG CAGCAGCAAC 300
AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCCGCCGC CCGCGGCTGC CAATGTCCGC AAGCCCGGCG 360
GCAGCGGCCT TCTAGCGTCG CCCGCCGCCG CGCCTTCGCC GTCCTCGTCC TCGGTCTCCT 420
CGTCCTCGGC CACGGCTCCC TCCTCGGTGG TCGCGGCGAC CTCCGGCGGC GGGAGGCCCG 480
GCCTGGGCAG AGGTCGAAAC AGTAACAAAG GACTGCCTCA GTCTACGATT TCTTTTGATG 540
GAATCTATGC AAATATGAGG ATGGTTCATA TACTTACATC AGTTGTTGGC TCCAAATGTG 600
AAGTACAAGT GAAAAATGGA GGTATATATG AAGGAGTTTT TAAAACTTAC AGTCCGAAGT 660
GTGATTTGGT ACTTGATGCC GCACATGAGA AAAGTACAGA ATCCAGTTCG GGGCCGAAAC 720
GTGAAGAAAT AATGGAGAGT ATTTTGTTCA AATGTTCAGA CTTTGTTGTG GTACAGTTTA 780
AAGATATGGA CTCCAGTTAT GCAAAAAGAG ATGCTTTTAC TGACTCTGCT ATCAGTGCTA 840
AAGTGAATGG CGAACACAAA GAGAAGGACC TGGAGCCCTG GGATGCAGGT GAACTCACAG 900
CCAATGAGGA ACTTGAGGCT TTGGAAAATG ACGTATCTAA TGGATGGGAT CCCAATGATA 960
TGTTTCGATA TAATGAAGAA AATTATGGTG TAGTGTCTAC GTATGATAGC AGTTTATCTT 1020
CGTATACAGT GCCCTTAGAA AGAGATAACT CAGAAGAATT TTTAAAACGG GAAGCAAGGG 1080
CAAACCAGTT AGCAGAAGAA ATTGAGTCAA GTGCCCAGTA CAAAGCTCGA GTGGCCCTGG 1140
AAAATGATGA TAGGAGTGAG GAAGAAAAAT ACACAGCAGT TCAGAGAAAT TCCAGTGAAC 1200
GTGAGGGGCA CAGCATAAAC ACTAGGGAAA ATAAATATAT TCCTCCTGGA CAAAGAAATA 1260 GAGAAGTCAT ATCCTGGGGA AGTGGGAGAC AGAATTCACC GCGTATGGGC CAGCCTGGAT 1320
CGGGCTCCAT GCCATCAAGA TCCACTTCTC ACACTTCAGA TTTCAACCCG AATTCTGGTT 1380
CAGACCAAAG AGTAGTTAAT GGAGGTGTTC CCTGGCCATC GCCTTGCCCA TCTCCTTCCT 1440
CTCGCCCACC TTCTCGCTAC CAGTCAGGTC CCAACTCTCT TCCACCTCGG GCAGCCACCC 1500
CTACACGGCC GCCCTCCAGG CCCCCCTCGC GGCCATCCAG ACCCCCGTCT CACCCCTCTG 1560
CTCATGGTTC TCCAGCTCCT GTCTCTACTA TGCCTAAACG CATGTCTTCA GAAGGGCCTC 1620
CAAGGATGTC CCCAAAGGCC CAGCGACATC CTCGAAATCA CAGAGTTTCT GCTGGGAGGG 1680
GTTCCATATC CAGTGGCCTA GAATTTGTAT CCCACAACCC ACCCAGTGAA GCAGCTACTC 1740
CTCCAGTAGC AAGGACCAGT CCCTCGGGGG GAACGTGGTC ATCAGTGGTC AGTGGGGTTC 1800
CAAGATTATC CCCTAAAACT CATAGACCCA GGTCTCCCAG ACAGAACAGT ATTGGAAATA 1860
CCCCCAGTGG GCCAGTTCTT GCTTCTCCCC AAGCTGGTAT TATTCCAACT GAAGCTGTTG 1920
CCATGCCTAT TCCAGCTGCA TCTCCTACGC CTGCTAGTCC TGCATCGAAC AGAGCTGTTA 1980
CCCCTTCTAG TGAGGCTAAA GATTCCAGGC TTCAAGATCA GAGGCAGAAC TCTCCTGCAG 2040
GGAATAAAGA AAATATTAAA CCCAATGAAA CATCACCTAG CTTCTCAAAA GCTGAAAACA 2100
AAGGTATATC ACCAGTTGTT TCTGAACATA GAAAACAGAT TGATGATTTA AAGAAATTTA 2160
AGAATGATTT TAGGTTACAG CCAAGTTCTA CTTCTGAATC TATGGATCAA CTACTAAACA 2220
AAAATAGAGA GGGAGAAAAA TCAAGAGATT TGATCAAAGA CAAAATTGAA CCAAGTGCTA 2280
AGGATTCTTT CATTGAAAAT AGCAGCAGCA ACTGTACCAG TGGCAGCAGC AAGCCGAATA 2340
GCCCCAGCAT TTCCCCTTCA ATACTTAGTA ACACGGAGCA CAAGAGGGGA CCTGAGGTCA 2400
CTTCCCAAGG GGTTCAGACT TCCAGCCCAG CATGTAAACA AGAGAAAGAC GATAAGGAAG 2460
AGAAGAAAGA CGCAGCTGAG CAAGTTAGGA AATCAACATT GAATCCCAAT GCAAAGGAGT 2520
TCAACCCACG TTCCTTCTCT CAGCCAAAGC CTTCTACTAC CCCAACTTCA CCTCGGCCTC 2580
AAGCACAACC TAGCCCATCT ATGGTGGGTC ATCAACAGCC AACTCCAGTT TATACTCAGC 2640
CTGTTTGTTT TGCACCAAAT ATGATGTATC CAGTCCCAGT GAGCCCAGGC GTGCAATACC 2700
AAATATGCCC CAACAGCGGC AAGACCAGCA TCATCAGAGT GCCATGATGC ACCCAGCGTC 2760
AGCAGCGGGC CCACCGATTG CAGCCACCCC ACCAGCTTAC TCCACGCAAT ATGTTGCCTA 2820
CAGTCCTCAG CAGTTCCCAA ATCAGCCCCT TGTTCAGCAT GTGCCACATT ATCAGTCTCA 2880
GCATCCTCAT GTCTATAGTC CTGTAATACA GGGTAATGCT AGAATGATGG CACCACCAAC 2940
ACACGCCCAG CCTGGTTTAG TATCTTCTTC AGCAACTCAG TACGGGGCTC ATGAGCAGAC 3000
GCATGCGATG TATGCATGTC CCAAATTACC ATACAACAAG GAGACAAGCC CTTCTTTCTA 3060
CTTTGCCATT TCCACGGGCT CCCTTGCTCA GCAGTATGCG CACCCTAACG CTACCCTGCA 3120
CCCACATACT CCACACCCTC AGCCTTCAGC TACCCCCACT GGACAGCAGC AAAGCCAACA 3180 TGGTGGAAGT CATCCTGCAC CCAGTCCTGT TCAGCACCAT CAGCACCAGG CCGCCCAGGC 3240
TCTCCATCTG GCCAGTCCAC AGCAGCAGTC AGCCATTTAC CACGCGGGGC TTGCGCCAAC 3300
TCCACCCTCC ATGACACCTG CCTCCAACAC GCAGTCGCCA CAGAATAGTT TCCCAGCAGC 3360
ACAACAGACT GTCTTTACGA TCCATCCTTC TCACGTTCAG CCGGCGTATA CCAACCCACC 3420
CCACATGGCC CACGTACCTC AGGCTCATGT ACAGTCAGGA ATGGTTCCTT CTCATCCAAC 3480
TGCCCATGCG CCAATGATGC TAATGACGAC ACAGCCACCC GGCGGTCCCC AGGCCGCCCT 3540
CGCTCAAAGTG CACTACAGCC CATTCCAGTC TCGACAACAG CGCATTTCCC CTATATGACG 3600
CACCCTTCAG TACAAGCCCA CCACCAACAG CAGTTGTAAG GCTGCCCTGG AGGAACCGAA 3660
AGGCCAAATT CCCTCCTCCC TTCTACTGCT TCTACCAACT GGAAGCACAG AAAACTAGAA 3720
TTTCATTTAT TTTGTTTTTA AAATATATAT GTTGATTTCT TGTAACATCC AATAGGAATG 3780
CTAACAGTTC ACTTGCAGTG GAAGATACTT GGACCGAGTA GAGGCATTTA GGAACTTGGG 3840
GGCTATTCCA TAATTCCATA TGCTGTTTCA GAGTCCCGCA GGTACCCCAG CTCTGCTTGC 3900
CGAAACTGGA AGTTATTTAT TTTTTAATAA CCCTTGAAAG TCATGAACAC ATCAGCTAGC 3960
AAAAGAAGTA ACAAGAGTGA TTCTTGCTGC TATTACTGCT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 4020
AaaaaaaaTC AAGACTTGGA ACGCCCTTTT ACTAAACTTG ACAAAGTTTC AGTAAATTCT 4080
TACCGTCAAA CTGACGGATT ATTATTTATA AATCAAGTTT GATGAGGTGA TCACTGTCTA 4140
CAGTGGTTCA ACTTTTAAGT TAAGGGAAAA ACTTTTACTT TGTAGATAAT ATAAAATCC 4199

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation αe l'anticorps 1C2 ou d'un fragment ou d'un dérive de l'anticorps 1C2 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement préventif ou curatif des maladies neurodégénératives associées à une répétition de glutamine.
2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre l'anticorps 1C2.
3. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un fragment ScFv de l'anticorps 1C2.
4. Utilisation d'un acide nucléique codant pour un fragment ScFv de l'anticorps 1C2 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement préventif ou curatif des maladies neurodégénératives associées a une répétition de glutamine.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour le traitement des maladies telles que par exemple la maladie de Huntington, l'ataxie spmocérébelleuse de type 1, 2, 3, 4, 5 ou 7, l'atrophie musculaire spmo-bulbaire associée au chromosome X ou maladie de Kennedy, l'atrophie dentarorubral- pallidoluysienne, l'ataxie spinocérébelleuse autosomale dominante, et la paraplégie spastique familiale, ou encore la maladie affective bipolaire, la psychose maniaco-dépressive ou la schizophrénie.
6. Molécule comprenant le site de liaison de la région variable de la chaîne légère de l'anticorps 1C2 relié par un bras peptidique au site de liaison de la région variable de la chaîne lourde ce l'anticorps 1C2.
7. Séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle code pour la molécule selon la revendication 6.
8.Vecteur comprenant la séquence selon la revendication 7 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les cellules de mammifères.
9. Vecteur selon la revendication 8 caractérise en ce qu'il s'agit d'un adénovirus recombinant défectif.
10. Vecteur selon la revendication 8 caractérise en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus recombinant défectif.
11. Vecteur selon la revendication 8 caractérise en ce qu'il s'agit d'un virus adéno associe recombinant défectif.
12. Vecteur selon la revendication 8 caractérise en ce qu'il s'agit du virus de l'herpès recombinant défectif.
13. Composition pharmaceutique comprenant l'anticorps 1C2, un fragment ou dérivé de cet anticorps.
14. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 12.
15. Composition pharmaceutique destinée au traitement des maladies neurodégénératives associées à la présence d'une protéine portant une chaîne homopolymere de glutamine caractérisée en ce qu'elle comprend l'anticorps 1C2, un fragment ou dérivé de cet anticorps, notamment selon la revendication 6, ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 12.
16. Méthode de diagnostic des maladies neurodégénératives caractérisée en ce que l'on détecte m vitro, au moyen de l'anticorps 1C2, a un fragment ou d'un dérivé de l'anticorps 1C2 la présence de protéines portant une chaîne polyglutamine de longueur pathologique.
17. Méthode selon revendication 16 caractérisée en ce que la détection de ces protéines est réalisée par mise en contact d'un extrait cellulaire avec l'anticorps monoclonal 1C2 et révélation des complexes anticorps- antigènes formés.
18. Méthode selon l'une des revendications 16 ou 17 caractérisée en ce que la détection est réalisée sur un extrait de cellules sanguines.
19. Méthode selon l'une quelconque des revendications 16 à 18 pour la mise en évidence de prédisposition à la maladie de Huntington ou à une ataxie spinocérébelleule 1, 2 ou 3.
20. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes 16 à 18 pour la mise en évidence de maladies dégénératives du système nerveux central causées par la présence d'une chaine polyglutamine dans une protéine exprimée.
21. ADN caractérisé en ce qu'il comporte tout ou partie d'au moins une des séquences SEQ ID n°l, n°2, n°3, n°4, n°5, n°6, n°7 ou d'au moins une séquence présentant une homologie supérieure ou égale à 50% avec ces séquences.
22. Les ARN correspondant à la transcription d'au moins un ADN selon la revendication 21, les séquences complémentaires de ces ADN ou ARN, ou leurs séquences anti-sens.
23. Procédé de criblage d'expression d'ADNs à répétition CAG ou de leurs produits d'expression caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation de l'anticorps 1C2 ou d'un fragment ou d'un dérivé de cet anticorps.
24. Procédé d'identification ou de purification de protéines à chaînes polyglutaminiques utilisant une étape d'immunodétection ou d'immunopurification par l'anticorps 1C2, fragment ou dérivé de cet anticorps, ou pouvant conduire secondairement à identifier le gène correspondant.
25. Méthode de diagnostic utilisant l'amplification PCR sur ADN ou RT-PCR sur ARN permettant de détecter des formes mutées dans des gènes codant pour des chaînes polyglutaminiques identifiées ou clonées grâce à l'anticorps 1C2.
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