FR2809414A1

FR2809414A1 - Acide nucleique regulateur du gene abc1, molecules modulant son activite et applications therapeutiques

Info

Publication number: FR2809414A1
Application number: FR0105886A
Authority: FR
Inventors: Montus Marie Francoise Rosier; Catherine Prades; Cendrine Lemoine; Laurent Naudin; Patrice Denefle; Bryan Brewer; Nicolas Duverger; Alan Remaley; Fojo Silvia Santamarina
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 2000-05-02
Filing date: 2001-05-02
Publication date: 2001-11-30
Anticipated expiration: 2021-05-02
Also published as: WO2001083746A3; AU785155B2; NO20025265L; IL152548A0; US20020146792A1; NZ522360A; WO2001083746A2; FR2809414B1; US7378274B2; CA2407737A1; MXPA02010684A; KR20020097242A; JP2003531613A; AU6595601A; NO20025265D0; EP1280911A2; ZA200208847B; BR0110541A

Abstract

La présente invention concerne un acide nucléique capable de réguler la transcription du gène ABC1, qui est un gène causal de pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme du cholestérol induisant des maladies comme l'athérosclérose.Elle est également relative à des constructions nucléotidiques comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène ABC1.L'invention a également trait à des vecteurs recombinants, des cellules hôtes transformées et des mammifères transgéniques non humains comprenant un acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABC1 ou une construction nucléotidique précitée, ainsi que des procédés pour le criblage de molécules ou de substances capables de moduler l'activité de l'acide nucléique régulateur du gène ABC1.

Description

Acide nucléigue régulateur du gène ABC1, molécules modulant son activité et applications thérapeutiques
La présente invention concerne un acide nucléique capable de réguler la transcription du gène ABC1, qui est un gène causal de pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme du cholestérol induisant des maladies comme l'athérosclérose.

Elle est également relative à des constructions nucléotidiques comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène ABC1.

L'invention a également trait à des vecteurs recombinants, des cellules hôtes transformées et des mammifères transgéniques non humains comprenant un acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABC1 ou une construction nucléotidique précitée, ainsi que des procédés pour le criblage de molécules ou de substances capables de moduler l'activité de l'acide nucléique régulateur du gène ABC1.

L'invention est en outre relative à des procédés permettant de détecter une altération de la transcription du gène ABC1 chez un sujet à risque.

Elle a également pour objet des substances ou molécules modulant l'activité de l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABC1 ainsi que des compositions pharmaceutiques contenant de telles substances ou de telles molécules.

Les lipoprotéines de haute densité (HDL) sont l'une des quatre classes majeures de lipoprotéines qui circulent dans le plasma sanguin.

Ces lipoprotéines sont impliquées dans différentes voies métaboliques telles que le transport lipidique, la formation des acides biliaires, la stéroïdogénèse, la prolifération cellulaire et en outre interfèrent avec les systèmes de protéinase plasmatique.

Les HDL sont de parfaits accepteurs de cholestérol libre et, en combinaison avec les protéines de transfert d'ester de cholestérol (CETP), la lipoprotéine lipase (LPL), la lipase hépatique (HL) et la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT), jouent un rôle majeur dans le transport inverse du cholestérol, c'est à dire le transport du cholestérol en excès dans les cellules

périphériques vers le foie pour son élimination de l'organisme sous forme d'acide biliaire.

Il a été démontré que les HDL jouent un rôle central dans le transport du cholestérol des tissus périphériques vers le foie.

Diverses maladies liées à une déficience en HDL ont été décrites, comprenant la maladie de Tangier, la déficience en HDL et la déficience en LCAT.

La déficience impliquée dans la maladie de Tangier est reliée à un déficit cellulaire dans la translocation du cholestérol cellulaire qui entraîne une dégradation des HDLs.

Dans la maladie de Tangier, ce déficit cellulaire conduit à une perturbation du métabolisme lipoprotéique. Les particules HDL n'incorporant pas de cholestérol à partir des cellules périphériques et ne pouvant pas être métabolisées correctement, sont éliminées rapidement de l'organisme. La concentration plasmatique en HDL de ces patients est donc extrêmement réduite et les HDL n'assurent plus le retour du cholestérol vers le foie. Ce cholestérol s'accumule dans ces cellules périphériques et provoque des manifestations cliniques caractéristiques telles que la formation d'amygdales orangées. De plus, d'autres perturbations lipoprotéiques comme une surproduction de triglycérides ainsi qu'une synthèse et un catabolisme intracellulaire accrus des phospholipides sont observées.

La maladie de Tangier, dont les symptômes ont été décrits cidessus, est classée parmi les affections familiales liées au métabolisme des HDL qui sont les plus couramment détectées chez les patients affectés de maladies coronariennes.

De nombreuses études ont montré qu'un niveau réduit de cholestérol HDL est un excellent facteur de risque permettant de dépister une affection coronarienne.

Dans ce contexte, des syndromes liés aux déficiences en HDL ont présenté un intérêt accru durant la décennie passée du fait qu'ils permettent d'accroître la compréhension du rôle des HDL dans l'athérogénèse.

Plusieurs mutations dans le gène apo A-I ont été caractérisées.

Ces mutations sont rares et peuvent conduire à une absence de production d'apo A-I.

Des mutations dans les gènes codant pour la lipoprotéine lipase (LPL) ou son activateur apoC-11 sont associées à des hypertriglycéridémies sévères et des niveaux de HDL-c fortement réduits.

Des mutations dans le gène codant pour l'enzyme lécithine: cholestérol, acyltransférase (LCAT) sont également associées à une déficience sévère en HDL.

De plus, des dysfonctionnements dans le transport inverse du cholestérol pourraient être induits par des déficits physiologiques affectant une ou plusieurs des étapes de transport du cholestérol stocké, des vésicules intracellulaires vers la surface membranaire au niveau de laquelle celui-ci est pris en charge par les HDL.

Récemment, une étude de la ségrégation de différentes formes alléliques de 343 marqueurs microsatellites répartis sur l'ensemble du génome et distants entre eux en moyenne de 10,3 cM a été réalisée.

L'étude de liaison (linkage) a porté sur une famille bien caractérisée sur onze générations, dont de nombreux membres sont affectés par la maladie de Tangier, la famille comportant cinq lignées de consanguinité.

Cette étude a permis d'identifier une région localisée dans le locus 9q31 du chromosome 9 humain statistiquement associé à l'affection (Rust S. et al., Nature Genetics, vol. 20, Septembre 1998, pages 96-98).

Toutefois, l'étude de RUST et al. définit seulement une large région du génome dont des altérations sont susceptibles d'être associées à la maladie de Tangier. Il est simplement précisé que la région 9q31-34 concernée contient des ESTs mais aucun gène connu.

Il a été montré qu'une région d'environ 1 cM située dans le locus 9q31 chez l'homme était associée, de manière générale, à des déficiences familiales en HDL (Rust et al., 1999).

De manière plus précise, il a été montré qu'un gène codant pour une protéine de la famille des transporteurs ABC, localisé précisément dans la région de 1 cM du locus 9q31, était impliqué dans des pathologies liées à un déficit dans le transport inverse du cholestérol.

Plus particulièrement, il a été montré que le gène codant pour le transporteur ABC-1 est muté chez des patients affectés dans le transport

inverse du cholestérol, et tout particulièrement chez des patients atteints de la maladie de Tangier.

Les protéines transporteurs ABC (" ATP-binding cassette ") constituent une famille de protéines qui sont extrêmement conservées au cours de l'évolution, de la bactérie à l'homme.

Les protéines transporteurs ABC sont impliquées dans le transport membranaire de divers substrats, par exemple des ions, des acides aminés, des peptides, des sucres, des vitamines ou encore des hormones stéroïdes.

La caractérisation de la séquence complète en acides aminés de certains transporteurs ABC a permis de déterminer que ces protéines avaient une structure générale commune, notamment deux repliements de liaison aux nucléotides (Nucleotide Binding Fold ou NBF) avec des motifs de type Walker A et B ainsi que deux domaines transmembranaires, chacun des domaines transmembranaires étant constitué de six hélices. La spécificité des transporteurs ABC pour les différentes molécules transportées apparaît être déterminée par la structure des domaines transmembranaires, alors que l'énergie nécessaire à l'activité de transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du repliement NBF.

Plusieurs des protéines transporteurs ABC qui ont été identifiées chez l'homme, ont été associées à diverses maladies.

Par exemple, la mucoviscidose est provoquée par des mutations dans le gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator).

Par ailleurs, certains phénotypes de résistance multiple aux médicaments dans les cellules tumorales ont été associés à des mutations dans le gène codant la protéine MDR (multi-drug résistance), qui a également une structure de transporteur ABC.

D'autres transporteurs ABC ont été associés à des affections neuronales et tumorales (brevet US n 5,858,719) ou encore potentiellement impliqués dans des maladies provoquées par une altération de l'homéostasie des métaux, notamment la protéine ABC-3.

De même, un autre ABC transporteur, désigné PFIC2, semble impliqué dans une forme de cholestasie intrahépatique familiale progressive, cette protéine étant potentiellement responsable, chez l'homme, de l'exportation des sels biliaires.

En 1994, un ADNc codant pour un nouveau transporteur ABC de souris a été identifié et désigné ABC1 (Luciani et al., 1994). Cette protéine est caractéristique des transporteurs ABC en ce qu'elle comporte une structure symétrique comprenant deux domaines transmembranaires liés à un segment hautement hydrophobe et à deux motifs NBF.

Chez l'homme, un ADNc partiel comprenant la totalité de la phase de lecture ouverte du transporteur ABC1 humain a été identifié (Langmann étal., 1999).

Il a également été montré que le gène codant pour la protéine ABC1 humaine est exprimé dans divers tissus, et plus particulièrement à des niveaux élevés dans le placenta, le foie, le poumon, les glandes surrénales ainsi que les tissus f#taux.

Ces auteurs ont aussi montré que l'expression du gène codant pour la protéine ABC1 humaine était induite pendant la différenciation des monocytes en macrophages in vitro. De plus, l'expression du gène codant pour la protéine ABC1 est augmentée lorsque les macrophages humains sont incubés en présence de lipoprotéines de faible densité acétylées (AcLDLs).

Les travaux de Rust S. et al., 1999 ,Brooks-Wilson A. et al., 1999, Bodzioch M. et al 1999, Remaley A. et al., 1999 et de Marcil M. et al., 1999 ont montré que des patients atteints de la maladie de Tangier et de déficiences en HDL (FHD ; Familial HDL deficiency) comportaient un gène ABC1 muté. Plusieurs mutations distribuées dans différentes régions du gène ABC1 ont été identifiées dans le génome de différents malades, en particulier de malades affectés d'une forme sévère de la maladie associée à des désordres coronariens. Par ailleurs, divers polymorphismes ont été trouvés à la fois dans les exons et dans les introns du gène ABC1 chez des patients atteints de formes plus légères de la maladie, indiquant que ces patients portent des allèles particuliers du gène, distincts du ou des allèles " sauvages ".

Bien que l'expression du gène ABC1 humain semble être régulée selon le type de cellule ou encore la situation métabolique d'un type cellulaire donné, la ou les séquences permettant de réguler ce gène n'étaient pas connues.

Or, il existe un besoin dans l'état de la technique d'identifier ces séquences régulatrices pour les deux raisons principales suivantes: a) Ces séquences sont susceptibles d'être mutées chez des patients atteints d'une pathologie liée à un déficit dans le transport du cholestérol, en particulier chez les patients atteints de la maladie de Tangier, ou susceptibles de développer de telles pathologies.

La caractérisation des séquences régulatrices du gène ABC1 humain permettrait, d'une part, de détecter des mutations chez des patients, en particulier de diagnostiquer les individus appartenant à des groupes familiaux à risques. En outre, l'isolement de ces séquences régulatrices rendrait possible la complémentation de la séquence mutée par une séquence fonctionnelle susceptible de pallier les dysfonctionnements métaboliques induits par la ou les mutations diagnostiquées, grâce à la construction de moyens thérapeutiques ciblés, tels que des moyens destinés à la thérapie génique. b) La caractérisation des séquences régulatrices du gène ABC1 mettrait à la disposition de l'homme du métier des moyens aptes à permettre la construction par génie génétique puis l'expression de gènes déterminés dans les types cellulaires dans lesquels le gène ABC1 est préférentiellement exprimé. c) Par ailleurs, certaines parties des séquences régulatrices du gène ABC1 pourraient constituer des séquences promotrices constitutives à fort niveau d'expression, de nature à permettre la construction de moyens nouveaux pour l'expression de séquences déterminées dans les cellules, complétant un ensemble de moyens déjà existants.

Force est de constater que, malgré les efforts entrepris, les séquences régulatrices du gène ABC1 étaient restées jusqu'à ce jour totalement inconnues.

Les inventeurs ont désormais isolé puis séquence un ADN génomique comprenant les deux premiers exons du gène ABC1 (respectivement exon 1A et exon 1B) ainsi qu'une région non transcrite d'environ 2. 9 kb localisée du côté 5' de l'exon 1A et comprenant des signaux de régulation du gène ABC1.

DEFINITIONS GENERALES
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).

Par exemple un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".

Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.

Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.

Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.

Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel de génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.

Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.

Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04 064.

Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.

Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.

Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucléotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturel, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagenèse.

En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquences d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.

Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi résulter dans des substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre, des modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d'aminoacides.

De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent pour des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial.

Certains acides nucléiques variants coderont ainsi pour des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question. La connaissance de ces variants par rapport à la maladie étudiée est fondamentale puisqu'elle permet de comprendre la cause moléculaire de la pathologie.

On entendra par " fragment " un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à l'acide nucléique de référence.

Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucléotide plus grand duquel il est constitutif.

De tels fragments comprennent, ou alternativement consistent en, des oligonucléotides de longueur allant de 20 à 25,30, 40,50, 70,80, 100, 200,500, 1000 ou 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.

Par " fragment biologiquement actif " d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention, on entend un acide nucléique capable de moduler la transcription d'une séquence d'ADN placée sous son contrôle. Un tel fragment biologiquement actif comprend un promoteur de base et/ou un élément régulateur, tels que définis dans la présente description.

Par " acide nucléique régulateur"" selon l'invention, on entend un acide nucléique qui active et/ou régule l'expression d'une séquence d'ADN sélectionnée et placée sous son contrôle.

Par " promoteur ", on entend une séquence d'ADN reconnue par les protéines de la cellule impliquées dans l'initiation de la transcription d'un gène. Le promoteur de base est l'acide nucléique régulateur minimal capable d'initier la transcription d'une séquence d'ADN déterminée qui est placée sous son contrôle. En général, le promoteur de base consiste une région d'ADN génomique en amont du site d'initiation de la transcription où se trouve très souvent une séquence CAAT (où se fixe une ou plusieurs facteurs protèiques de transcription) ainsi, sauf dans de rares cas comme dans certains gènes domestiques, que la séquence TATA ou " TATA box " ou une boîte apparentée. C'est au niveau de cette boite que se fixe une ARN polymérase ainsi que un ou plusieurs facteurs de transcription, tels que les protéines se fixant sur la boîte " TATA " (TATA box Binding Proteins ou TBPs).

Une séquence nucléotidique est placée sous le contrôle " d'un acide nucléique régulateur lorsque cet acide nucléique régulateur est localisé, par rapport à la séquence nucléotidique, de telle manière à

contrôler l'initiation de la transcription de la séquence nucléotidique par une ARN polymérase.

Par " Elément régulateur " ou " séquence régulatrice " au sens de l'invention, on entend un acide nucléique comprenant des éléments capables de moduler la transcription initiée par un promoteur de base, tels que des sites de fixation de divers facteurs de transcription, des séquences " enhancer " d'augmentation de la transcription ou des séquences " silencer d'inhibition de la transcription.

Par séquence " enhancer ", on entend une séquence d'ADN incluse dans un acide nucléique régulateur capable d'augmenter ou de stimuler la transcription initiée par un promoteur de base.

Par séquence " silencer ", on entend une séquence d'ADN incluse dans un acide régulateur capable de diminuer ou d'inhiber la transcription initiée par un promoteur de base.

Des éléments régulateurs peuvent être présents en dehors de la séquence localisée du côté 5' du site d'initiation de la transcription, par exemple dans les introns et les exons, y compris dans les séquences codantes.

Le terme promoteur de base et l'élément régulateur peuvent être " spécifiques d'un ou plusieurs tissus ", s'ils permettent la transcription d'une séquence d'ADN déterminée, placée sous leur contrôle, préférentiellement dans certaines cellules (par exemple les cellules spécifiques d'un tissu), c'est à dire soit exclusivement dans les cellules de certains tissus, soit à des niveaux de transcription différents selon les tissus.

Par " facteur de transcription ", on entend des protéines qui interagissent préférentiellement avec des éléments régulateurs d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, et qui stimulent ou au contraire répriment la transcription. Certains facteurs de transcription sont actifs sous forme de monomères, d'autres étant actifs sous la forme d'homo- ou d'hétérodimères.

Le terme " modulation " vise soit une régulation positive (augmentation, stimulation) de la transcription, soit une régulation négative (diminution, inhibition, blocage) de la transcription.

Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé

en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.

La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.

Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.

L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison, WISCONSIN.

À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1. 4.9 de mars 1996, BLAST 2. 0.4 de février 1998 et BLAST 2. 0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et al, J. Mol.

Biol. 1990 215 : S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25 : 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence " requête " de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.

Par " conditions d'hybridation de forte stringence " au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes : 1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION : - Mélanger : 40 l ADN sperme de saumon (10mg/ml) + 40 l ADN placentaire humain (10mg/ml)

- Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange.

- Oter le tampon SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.

- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.

- Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.

2- Compétition de la sonde marquée : - Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 l ADN Cot I, selon la quantité d'hybridations non spécifiques.

- Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C.

- Incuber à 65 C pendant 2 à 5 heures.

3- HYBRIDATION : - Oter le mix de pré hybridation.

- Mélanger 40 l ADN sperme de saumon + 40 l ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace.

- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot1 dénaturée.

- Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation.

4- Lavages: - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.

- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1 % à 65 C.

- 2 fois 15 minutes à 65 C SSC 1X et SDS 0,1% à 65 C.

Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.

Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.

Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.

Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de F. AUSUBEL et al (1999).

Par " transformation " au sens de l'invention, on entend l'introduction d'un acide nucléique (ou d'un vecteur recombinant) dans une cellule hôte. L terme " transformation englobe également une situation dans laquelle le génotype d'une cellule a été modifié par un acide nucléique exogène, et que cette cellule ainsi transformée exprime ledit acide nucléique exogène, par exemple sous la forme d'un polypeptide recombinant ou encore sous le forme d'un acide nucléique sens ou antisens.

Par " animal transgénique " au sens de l'invention, on entend un animal non humain , de préférence un mammifère, dans lequel une ou plusieurs cellules contiennent un acide nucléique hétérologue introduit grâce à l'intervention humaine, tel que par des techniques de transgénèse bien connues de l'homme du métier. L'acide nucléique hétérologue est introduit directement ou indirectement dans la cellule ou le précurseur de la cellule, par manipulation génétique telle que micro-injection ou infection par un virus recombinant. L'acide nucléique hétérologue peut être intégré dans le chromosome, ou peut se présenter sous la forme d'ADN se répliquant de manière extra-chromosomique.

ACIDE NUCLEIQUE REGULATEUR DU GENE ABC1
A partir de banques de vecteurs de type BAC préparées à partir de matériel génomique humain, les inventeurs ont réussi à isoler un acide nucléique régulateur du gène ABC1 humain.

D'après l'analyse de séquence effectuée, les inventeurs ont déterminé que l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABC1, lorsqu'il est défini de la manière la plus large, est constitué d'un polynucléotide comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' : # une région non transcrite d'environ 2,9 kb localisée en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABC1 ; # la séquence nucléotidique du premier exon du gène ABC1, désigné également exon 1A; # la séquence nucléotidique partielle du premier intron du gène ABC1, désigné également sous le nom intron 1A ; et # la séquence nucléotidique du second exon du gène ABC1 humain, également désigné exon 1 B.

# la séquence nucléotidique partielle du deuxième intron du gène
ABC1, désigné également sous le nom intron 1 B;
Dans sa définition la plus générale, l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABC1 comprend l'ensemble des régions nucléotidiques telles que définies ci-dessus et est identifié comme la séquence SEQ ID N 1 selon l'invention.

De manière préférentielle, l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABC1 comprend l'ensemble des régions qui sont situées entre le nucléotide - 2228 et le nucléotide + 108 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène ABC1, à savoir une région comprise entre les nucléotides 653 à 3001 de la séquence SEQ ID N 1.

Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

La région d'environ 2,9 kb localisée en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABC1, et comprenant le promoteur de base et de multiples éléments régulateurs de la transcription est comprise également dans la séquence identifiée comme la SEQ ID N 3 selon l'invention.

Plus précisément, le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ ID N 3 est le nucléotide en position-2893, par rapport au site d'initiation de la transcription du gène ABC1.

Selon un second aspect, l'invention est relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N 3 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

Comme déjà précisé ci-dessus, l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABC1 de séquence SEQ ID N 1 comprend, outre une région 5' régulatrice non transcrite, également lepremier exon et la partie 5' du premier intron du gène ABC1 humain.

Le premier exon du gène ABC1, aussi désigné exon 1A, est défini comme la séquence SEQ ID N 4. la séquence de l'intron 1a a été partiellement caractérisée.

L'extrémité 5' de l'intron 1a est défini comme la séquence nucléotidique SEQ ID N 6. L'extrémité 3' de l'intron 1a est défini comme la séquence SEQ ID N 7.

Le second exon du gène ABC1 humain, aussi désigné exon 1 B, est défini comme la séquence SEQ ID N 5.

Selon un troisième aspect, l'invention est relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs d'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ SEQ ID N 3 à 7 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

De préférence, un acide nucléique selon l'invention sera sous une forme isolée et/ou purifiée.

Fait également partie de l'invention tout fragment " biologiquement actif " d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini ci-dessus.

L'invention englobe également un acide nucléique caractérisé en ce qu'il hybride, dans des conditions de forte stringence, avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention.

L'invention concerne aussi un acide nucléique ayant au moins 80%, avantageusement 90%, de préférence 95% et de manière tout à fait préférée

98% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8.

ANALYSE DETAILLEE DE LA SEQUENCE SEQ ID N 3
Selon une caractéristique principale, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 3, compris dans l'acide nucléique régulateur du gène ABC1 de séquence SEQ ID N 1, comprend les éléments constitutifs d'un promoteur de base, respectivement une boîte " TATA " ainsi qu'une homéo boîte, représentées sur la Figure 1.

La séquence régulatrice SEQ ID N 3 comprend également de nombreux sites de fixation de divers facteurs de transcription susceptibles de réguler positivement ou négativement l'activité du promoteur de base.

Ainsi, les différentes séquences caractéristiques des sites de fixation de divers facteurs de transcription dans la séquence SEQ ID N 3 ont été identifiées par les inventeurs de la manière détaillée ci-après.

La séquence SEQ ID N 3 a été utilisée comme séquence de référence et traitée selon les algorithmes des logiciels BLAST 2 version 2.10 et comparée aux données répertoriées dans plusieurs bases de données et la présence ainsi que la localisation des différentes sites caractéristiques de la séquence SEQ ID N 3, et particulièrement les sites de liaison des facteurs de transcription ont été déterminés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.

Plus particulièrement, une analyse détaillée a été réalisée sur les 1. 3 kb en amont du site d'initiation où a identifié un total de 1900 séquences, correspondant à des sites de liaison aux facteurs de transcription, lors de la première étape de la recherche. Après compilation et filtrage comme décrit ci-dessus, seuls 79 sites de fixation spécifiques de 27 facteurs de transcription différents ont été retenus. Ces sites sont présentés dans le tableau 1 ci-après.

Le tableau 1 représente les sites de fixation aux facteurs de transcription identifiés dans les 1318 nt dans la partie 3' de la séquence SEQ ID N 3 selon l'invention.

Les positions des nucléotides de début et de fin de chacun des sites de fixation aux facteurs de transcription sont désignées en référence à

la numérotation des nucléotides de la séquence SEQ ID N 3, telle que représentée sur la figure 1 (brin +) ou des nucléotides sur la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID N 3 (brin-).

TABLEAU 1

<tb>
<tb> Facteur <SEP> de <SEP> transcription <SEP> Début <SEP> Fin <SEP> Brin
<tb> RAR-1299 <SEP> -1294 <SEP> +
<tb> TFIID-1251 <SEP> -1246 <SEP> +
<tb> AP2-1203 <SEP> -1192 <SEP> + <SEP>
<tb> MYB-1177 <SEP> -1170 <SEP> +
<tb> GR <SEP> -1166 <SEP> -1153 <SEP> + <SEP>
<tb> T3R-1110 <SEP> -1095 <SEP> AP1 <SEP> (C-JUN)-1052 <SEP> -1046 <SEP> + <SEP>
<tb> CEBP(CEBPA <SEP> CEBPB)-1015 <SEP> -1008 <SEP> + <SEP>
<tb> SP1 <SEP> -992 <SEP> -986 <SEP> + <SEP>
<tb> HNF <SEP> (HNF3,HNF5) <SEP> -951 <SEP> -940 <SEP> - <SEP>
<tb> MYB-941 <SEP> -934 <SEP> + <SEP>
<tb> T3R-933 <SEP> -928 <SEP> +
<tb> CP2-924 <SEP> -918TFID-869 <SEP> -864 <SEP> + <SEP>
<tb> HNF <SEP> (HNF3,HNF5) <SEP> -865 <SEP> -854GATA1(NF-E1A) <SEP> -844 <SEP> -835GATA1(NF-E1A) <SEP> -829 <SEP> -820 <SEP> ± <SEP>
<tb> SP1 <SEP> -803 <SEP> -794 <SEP> + <SEP>
<tb> GR-788 <SEP> -775 <SEP> + <SEP>
<tb> HNF <SEP> (HNF3,HNF5) <SEP> -782 <SEP> -750 <SEP> +
<tb> AP1 <SEP> (C-JUN)-731 <SEP> -725 <SEP> ± <SEP>
<tb> PEA3-731 <SEP> -726 <SEP> ± <SEP>
<tb> PU.1(NF-JB) <SEP> -730 <SEP> -725 <SEP> - <SEP>
<tb> PU. <SEP> 1 <SEP> (NF-JB)-696 <SEP> -691 <SEP> - <SEP>
<tb> AP2-675 <SEP> -665 <SEP> - <SEP>
<tb> AP2-671 <SEP> -666 <SEP> + <SEP>
<tb> H-APF-1-658 <SEP> -652 <SEP> + <SEP>
<tb> NF-kappaB-658 <SEP> -647 <SEP> + <SEP>
<tb> GATA1(NF-E1A) <SEP> -631 <SEP> -626 <SEP> ± <SEP>
<tb> SP1 <SEP> -565 <SEP> -559CAC-bf <SEP> (htbeta)-557 <SEP> -547 <SEP> + <SEP>
<tb> SP1 <SEP> -551 <SEP> -542TFIID-537 <SEP> -532 <SEP> - <SEP>
<tb> NF-E(NF-E1C) <SEP> -509 <SEP> -505CCAT-bf <SEP> (CBF) <SEP> -508 <SEP> -502 <SEP> ± <SEP>
<tb> GATA1(NF-E1A) <SEP> -508 <SEP> -504 <SEP> + <SEP>
<tb> CTF/CBP(NF1) <SEP> -507 <SEP> -502 <SEP> + <SEP>
<tb> CP2-506 <SEP> -502NF-Y-506 <SEP> -502 <SEP> + <SEP>
<tb> CCAAT-bf <SEP> (CBF) <SEP> -464 <SEP> -458 <SEP> ±
<tb>

<tb>
<tb> CTF/CBP(NF1) <SEP> -464 <SEP> -459NF-Y-464 <SEP> -460SP1 <SEP> -462 <SEP> -453SP1 <SEP> -459 <SEP> -453 <SEP> +
<tb>
TABLEAU 1 (SUITE)

<tb>
<tb> Facteur <SEP> de <SEP> transcription <SEP> Début <SEP> Fin <SEP> Brin <SEP>
<tb> AP2 <SEP> -458 <SEP> -447 <SEP> +
<tb> PU.1(NF-JB) <SEP> -445 <SEP> -440 <SEP> +
<tb> PEA3-444 <SEP> -439 <SEP> ± <SEP>
<tb> SRY-439 <SEP> -428 <SEP> +
<tb> PEA3-431 <SEP> -426 <SEP> ± <SEP>
<tb> CEBP(CEBPA <SEP> CEBPB)-420 <SEP> -412PU.1(NF-JB) <SEP> -400-395 <SEP> +
<tb> PEA3-399 <SEP> -394 <SEP> ± <SEP>
<tb> AP2 <SEP> -305 <SEP> -294 <SEP> - <SEP>
<tb> SP1 <SEP> -302 <SEP> -287 <SEP> + <SEP>
<tb> AP2-291 <SEP> -282 <SEP> - <SEP>
<tb> CEBP(CEBPA <SEP> CEBPB)-272 <SEP> -261 <SEP> +
<tb> PEBP2-272 <SEP> -267 <SEP> + <SEP>
<tb> MYOD-257 <SEP> -250 <SEP> + <SEP>
<tb> E2A-255 <SEP> -249 <SEP> - <SEP>
<tb> SP1 <SEP> -244 <SEP> -235 <SEP> - <SEP>
<tb> CAC-bf(htbeta) <SEP> -240-211 <SEP> +SP1 <SEP> -238 <SEP> -223 <SEP> ± <SEP>
<tb> GATA1(NF-E1A) <SEP> -225 <SEP> -219 <SEP> + <SEP>
<tb> SP1 <SEP> -225 <SEP> -215 <SEP> + <SEP>
<tb> SP1 <SEP> -221 <SEP> -209 <SEP> - <SEP>
<tb> MYB <SEP> -211 <SEP> -204 <SEP> +
<tb> GR <SEP> -197 <SEP> -192SP1 <SEP> -189 <SEP> -183 <SEP> ± <SEP>
<tb> MYB-174 <SEP> -167SP1 <SEP> -166 <SEP> -152+MYC/MAX <SEP> -151 <SEP> -138 <SEP> ± <SEP>
<tb> USF <SEP> 1 <SEP> et <SEP> 2 <SEP> (MYOD) <SEP> (E-box)-147 <SEP> -142
<tb> AP1(C-JUN) <SEP> -131-121 <SEP> +
<tb> SP1 <SEP> -100 <SEP> -86 <SEP> ± <SEP>
<tb> CEBP(CEBPA <SEP> CEBPB)-90 <SEP> -83 <SEP> +
<tb> GR <SEP> -80 <SEP> -67 <SEP> - <SEP>
<tb> LXR-69 <SEP> -55 <SEP> +
<tb> TFIID(TBP <SEP> TATA <SEP> BOX)-31 <SEP> -26 <SEP> +
<tb> SIF-3 <SEP> 2 <SEP> +
<tb> SP1 <SEP> 22 <SEP> 31 <SEP> +
<tb>

La Figure 1 représente une partie de la séquence SEQ ID N 3. Le premier nucléotide en position 5' de la séquence de la Figure 1 est également le premier nucléotide en position 5' de l'une des séquences nucléiques SEQ ID N 1 et SEQ ID N 3. Sur la Figure, les sites de fixation aux facteurs de transcription sont illustrés par des boîtes qui délimitent leurs positions respectives de début et de fin, et leurs désignations respectives est indiquée au-dessus de chacune des boîtes correspondantes. La numérotation des nucléotides de la séquence représentée à la Figure 1 a été effectuée par rapport au site d'initiation de la transcription, numéroté " +1 ", le nucléotide en 5' du nucléotide +1 étant lui-même numéroté " -1 ".

La description des caractéristiques des sites de fixation à chacun des facteurs de transcription désignés dans la Figure 1 et le tableau 1 peut être aisément retrouvée par l'homme du métier. Une courte description de certains d'entre eux en est faite ci-après.

Facteur CAC: Les caractéristiques d'un site de fixation au facteur CAC peuvent être retrouvées notamment dans l'article de SCHUELE et al. (1988, Nature, vol. 332:87-90), l'entrée n T00077 de la base de données EMBL, l'article de MANTOVANI et al. (1988, Nucleic Acids Research, vo1.16: 4299-4313), l'article de CATALA et al. (1989, Nucleic Acid Research, vol.17:3811-3827) et l'article de WANG et al. (1993, Mol. Cell Biol., vol. 13:569-5701). La fixation de ce facteur a été montrée sur les régions régulatrices de plusieurs gènes, dont le promoteur du gène de la p- globine, du gène de la gamma-globine. Ce facteur semble agir en coopération avec le récepteur au glucocorticoïde.

Facteur C/EBP: C/EBP-g
Les caractéristiques d'un site de fixation au facteur C/EBP-a peuvent être retrouvées notamment dans les articles correspondant aux

entrées suivantes de la base de données Medline: 892020040,94023981, 96194262,96003748. Ce facteur inhibe la prolifération cellulaire en augmentant le niveau de p21 (WAF-1) due à une expression accrue du gène et à une stabilisation post-traductionnelle de p21.

C/EBP-p
Les caractéristiques de liaison au facteur C/EBP p peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline: 93315489, 91248826, 94193722, 93211931, 92390404,90258863, 94088523,90269225 et 96133958. Il s'agit d'un activateur de la transcription important dans la régulation de gènes impliqués dans les réponses immunes et inflammatoires. Il se fixe spécifiquement à un élément de réponse à IL-1 dans le gène de l'IL-6. Il joue vraisemblablement un rôle dans la régulation de la phase aiguë de l'inflammation et dans l'hémopoïése. Le site de reconnaissance consensus est le suivant : " T(T/G) NNGNAA(T/G)
Facteur c-Myb:
Les caractéristiques d'un site de liaison au facteur c-Myb peuvent être retrouvées dans les entrées suivantes de la base de données Medline:91122626, 87092302,93131991, 86261774,92049347, 90044066, 90265605,93101590, 94316485 et 90090611. Ce facteur reconnaît spécifiquement la séquence " YAAC(G/T)G ". Il joue un rôle important dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules précurseurs hématopoïétiques.

Facteur CP2:
Les caractéristiques des sites de fixation au facteur CP2 peuvent être retrouvées notamment dans les articles de KIM et al., (1990), Mol Cell Biol, Vol.10:5958-5966) et LIM et al. (1992), J. Biol. Chem. vol.268:18008- 18017.

Facteur CTF:
Les caractéristiques de fixation du facteur CTF peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline: 88319941,91219459, 86140112,87237877, 90174951,89282387, 90151633,892618136, 86274639,87064414, 89263791. Le facteur CTF/NF-I reconnaît la séquence palindromique suivante : " TGGCANNNTGCCA " qui est présente dans des promoteurs viraux et cellulaires et au niveau de l'origine de réplication des adénovirus de type 2.

Ces protéines sont capables d'activer la transcription et la réplication. Elles se fixent à l'ADN sous la forme d'un homodimère.

Facteur E2A:
Les caractéristiques d'un site de fixation du facteur E2A peuvent être notamment retrouvées dans les articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 91160969,91331308, 91115096, 91117219,90346284, 89168418,90150281. Ce facteur se fixe sur un site KAPPA-E2 de l'élément enhancer du gène de l'immunoglobuline KAPPA. Il forme un hétérodimère avec la protéine ASH1. Il appartient à la famille des facteurs de transcription de type hélice-boucle-hélice.

Facteur GR[alpha]:
Les caractéristiques d'un site de fixation du facteur GRa peuvent être notamment retrouvées dans les entrées suivantes de la base de données Medline: 88264449,93024441, 89091080,90319784, 92020837, 90381775,86298392, 91131612,86092211, 86092206. Il s'agit d'un récepteur au glucocorticoïde impliqué dans la régulation de l'expression des gènes eucaryotes et affectant la prolifération et la différenciation de tissus cibles. Ce facteur se fixe sur le site cible de type " GRE ". Il est composé de trois domaines et appartient à la sous-famille NR3 des récepteurs nucléaires aux hormones.

Facteur LXR :
Les caratéristiques des sites de fixation du facteur LXR (Liver X Receptor) ont été décrits par Apfel et al (Moll. Cell. Biol, 1994), Song et al (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1994) et Willy et al (Gènes Dev. , 1995). Les oxystérols sont les ligand physiologiques des élements LXR (Janowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1999). Comme d'autres récepteurs, LXR s'hétérodimèrise avec RXR (Retinoid X Receptor). Des éléments de réponse à LXR ont été identifiés en positions-1729/-1714 et -69/-55 (figure 1).

Facteur NF-EIC:
Les caractéristiques d'un site de fixation du facteur NF-EIC peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline: 91266910,91216113, 91334450,91203899, 91029498 et 910655813. Il s'agit d'un activateur transcriptionnel qui se fixe à un élément enhancer des gènes a et # du récepteur des cellules T. Il se fixe à la séquence consensus suivante: " AGATAG ". Il appartient à la famille des facteurs de transcription du type GATA.

Facteur HNF5:
L'homme du métier pourra se référer pour ce facteur de transcription notamment à l'article de GRANGE et al. (1991, Nucleic Acids Res. vo1.19: 131-139).

Facteur HNF3B:
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à l'article de OVERDIER et al. (1994, Mol. Cell Biol. vo1.14: 2755-2766).

Facteur Nfkappa-B:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 95369245,91204058, 94280766,89345587, 93024383,88248039,

94173892,91088538, 91239561,91218850, 92390404,90156535, 93377072,92097536, 93309429,93267517, 92037544,914266911, 91105848 et 95073993. Le facteur Nfkappa-B est un hétérodimère constitué d'une première sous-unité de 50 kDa et d'une seconde sous-unité de 65 kDa. Deux hétérodimères peuvent former un tétramère labile. Sa fixation à l'ADN dépend de la présence de zinc (Zn++). Il peut être induit par de nombreux agents tels que le TNF la PKA ou encore la PKC. C'est un régulateur clef de gènes impliqués dans des réponses à l'infection, à l'inflammation, ainsi qu'au stress.

Facteur NFY:
Le facteur NFY est notamment décrit dans l'entrée n P25.208 de la base de données Swissprot. C'est un facteur qui reconnaît un motif " CCAAT " dans les séquences promotrices telles que celles du gène codant pour le collagène de type 1, de l'albumine et de la p-actine. Il s'agit d'un stimulateur de la transcription.

Facteur PEA3:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 90059931, 90309995, 90291989,93181246 et 90384794. Ce facteur de transcription se fixe sur un motif PEA3 " AGGAAG " et peut jouer un rôle régulateur pendant l'embryogenèse.

Facteur PEBP2:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 95199266,94217721, 97188387,97325753 et 95347606. Ce facteur se fixe sur un site " PYGTYGGT " de nombreux éléments enhancers et promoteurs.

Facteur TFIID:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles suivants : FIKES et al. (1990, Nature, vol.346:291-294), GILL et al. (1991, Cell, vol. 65 : 333-340), HOFFMANN et al. (1990, Genes Dev. vol.4: 1141- 1148). Ce facteur joue un rôle majeur dans l'activation des gènes eucaryotes transcrits par l'ARN polymérase II. Ce facteur se fixe de manière spécifique sur l'élément promoteur TATA localisé à proximité du site d'initiation de la transcription.

Facteur T3R:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 92017776,90242396, 870903752,91212192. Ce facteur a une forte affinité pour la triiodothyroine. Il est composé de trois domaines et appartient à la famille des récepteurs nucléaires aux hormones.

Facteur SIF:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'article de WAGNER et al. (1990, EMBO J., vol.9:4477-4784). Ce facteur active l'expression du gène c-fos.

Facteur RAR:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 91216109,92017791, 92127595,91219411, 92103690,93321869, 91092269,91029504, 90242395,91029504. Ce facteur est un récepteur pour l'acide rétinique. Ce facteur contrôle les fonctions cellulaires en régulant directement l'expression des gènes. Il appartient à la famille des récepteurs nucléaires aux hormones.

Facteur PU:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 92107189,93165739, 95317607,92318913, 92275360,93028372, 93206099,90199884, 87257848 et 93275657. Ce facteur se fixe à la boîte PU, qui est une séquence d'ADN riche en purine, telle que la séquence " GAGGAA ", qui peut agir comme un élément enhancer spécifique des cellules lymphoïdes.

Il s'agit d'un facteur d'activation de la transcription qui peut être impliqué spécifiquement dans l'activation ou la différenciation des macrophages ou des cellules B.

SITE AP1:
Les caractéristiques d'un site de fixation au facteur de transcription AP1 peuvent être retrouvées dans différents articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: Numéros 89125693, 89252809,90318391, 91175677,911458338, 89313776,88217909, 911662, 91121514, 89017284, 88070595, 90097934, 88189275, 87301729, 88151062,90291989, 91330875,89051877 et 91219459. Ce facteur se fixe à un élément enhancer du type " TGA(C/G)TCA.

Facteur AP2:
Les caractéristiques d'un site de fixation au facteur de transcription AP2 peuvent être retrouvées notamment dans les articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 90127451,90174951 et 91009310.

Ce facteur se fixe sur des éléments de type enhancer afin de stimuler la transcription de certains gènes. En particulier, le facteur AP2 se fixe sur la séquence consensus suivante : CCCCAGGC ".

Facteur CCAAT:
Une séquence caractéristique du site de fixation au facteur CCAAT peut être retrouvée dans l'article de LUM et al. (1990, Mol Cell Biol, Vol.10: 6709-6717) et dans l'entrée n T 00086 de la base de données de L'EMBL.

Ce facteur a notamment été montré comme stimulateur de la transcription du promoteur du gène humain hsp70.

Facteur GATA-1:
Les caractéristiques d'un site de fixation du facteur GATA-1 peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline: 91340773,91093039, 91266910,90114418, 89385992,91268074, 89118131,91224987, 89218991 et 91081330. Ilest connu comme facteur " switch " dans le développement érythroïde. Il se fixe à l'ADN sur la séquence consensus suivante : "(A/T)GATA(A/G) " dans des régions régulatrices des gènes de la globine ainsi que d'autres gènes exprimés dans des cellules érythroïdes.

Facteur MyoD-Myf-3:
Les caractéristiques d'un site de liaison au facteur MyoD-Myf-3 peuvent être notamment retrouvées dans l'article de ROSENTHAL et al.

(1990, Nucleic Acids Res., vol. 18:6239). Ce facteur de transcription induit une différenciation des fibroblastes en myoblastes, actives des promoteurs spécifiques du muscle, interagit avec, et est inhibé par, la protéine twist.

Facteur MYC/MAX:
Les caractéristiques d'un site de fixation au facteur Nyc/MAX peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline: 94040733,93101610, 92229468,92112037, 93145325,93026389, 93157390,92366516, 93145324 et 91173288. Ce facteur de transcription se lie à l'ADN de manière non spécifique mais aussi

de manière spécifique par reconnaissance de la séquence CAC [GA]TG facteur semble activer la transcription de gènes associés à la croissance.

Facteur HNF3:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux entrées suivantes de la base de données Medline: 91352065,91032994, 92345837, 89160814,91187609, 91160974,91029477, 94301798 et 94218249. Ce facteur de transcription agit comme activateur de nombreux gènes du foie tels que des gènes AFT, de l'albumine, de la tyrosine aminotransférase et interagit avec des régions régulatrices agissant en cis de ces gènes.

Facteur SRY:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 92132550,95292338, 95112822,93049201. Ce facteur est notamment responsable de l'initiation de la détermination du sexe mâle.

Facteur Sp1:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline : 852707437,89091123, 89039842,89384647, 85061571,88111565, 91224491,91095025, 91357479,91139695. Ce facteur active la synthèse d'ARN messager à partir de gènes contenant des sites de reconnaissance fonctionnelle; il peut interagir avec des motifs riches en bases G/C du promoteur du gène de récepteur à la sérotonine.

Facteur USF:
Le Facteur USF appartient à la famille des facteurs de transcription
HLH (Helix-Loop-helix), se lie à un motif E-box (CACGTG), et comprend en outre les protéines Myc, Mad1, Max, MyoD (Littlewood et al., Oxford
University Press, New York, 1 pp. 1998). Bien que celui ci présente une

fonction bien établie de facteur de transcription (Gosh et al., Oncogene, 1997, 14:589-594), il présente au niveau de certains promoteurs, une activité de répresseur. En particulier, il a été prouvé que USF1 présente une activité importante de répression au cours du développement du gène LpS1 de Lytechinus pictus dans tous les types cellulaires à l'exception des cellules ectodermiques aborales qui n'expriment pas le facteur USF (Seid et al., J.

Mol Biol, 1996, 264 :7-19), USF1 inhibe l'autoactivation du gène MyoD du Xenope dont le produit se lie à une boîte E (Lun et al., Cell Growth Differ., 1997,8 : 275-282) et réprime la transcription du gène CYP1A1 en rentrant en compétition avec le complexe de stimulation AhR.Arnt pour la liaison avec l'élément XRE (Xenobiotique responsive element) qui contient un motif de boîte E (Takahashi et al., J Biol Chem, 1997,272 : 30025-30031). Carter et al. ont par ailleurs démontré que l'absence d'un fort domaine d'activation dans USF1 conduit à l'inhibition de la transcription du gène codant pour la chaîne lourde de l'immunoglobuline (IgH) (Carter et al., Mol Cell Biol, 1997, 17 :18-23). Des variants tronqués de USF2 voient leur activité de répression de l'expression du complexe majeur d'histocompatibilité de type 1 abrogée (Howcroft et al., Mol Ce// Biol, 1999,19 : 4788-4797), de l'expression du gène ATPA (Breen et al., J Biol Chem, 2000, 275:28539-28548) et de l'expression du gène de la prostaglandine G/H synthetase 2. Harris et al. (J. Biol Chem, 2000, 275 :28539-28548) ont prouvé que la proximité des éléments AP1 et E-Box sur le promoteur FGF-BP facilite la répression de la transcription par les interactions des protéines USF1, USF2, et AP1. De plus, la surexpression du facteur humain USF conduit à la diminution de la transcription AP1-dépendante dans les cellules F9 du teratocarcinome murin (Pognonec et al., Oncogène, 1997,14 : 2091-2098), et la fixation de USF au complexe formé par les facteurs AP-1, Fra2 et CREB aboutit à la répression du gène alpha A-crystalline du poulet (Cvekl et al., 1994, Mol Cell Biol, 147363-7376) . Les homodimères USF1 et USF2 inhibent la transcription des gènes ribosomiques (Sirito et al, Gen Expr, 1992,2 : 231-240). Il a été également montré que les motifs de liaison USF agissent comme des

éléments de régulation négative au niveau du promoteur des gènes de la protéase nexine -1 (Erno et al, Mol Ce// Neurosci, 1996,8 : 28-37) et de HLA-B (Gobin et al., J Immunol, 1999, 163:1428-1434). En outre, l'apolipoprotéine CIII qui comme ABC1 est impliquée dans le métabolisme des lipides est également réprimée par USF2 (Navantkasattusas et al., Mol Cell biol, 1994,14 : 7331-7339). Enfin, le facteur USF peut réguler à la fois de manières positive et négative le gène MLC-2v et la transcription des gènes ribosomiques. Plusieurs études ont montré que le facteur USF peut également se lier de manière constitutive et ainsi coopérer avec d'autres facteurs transcription constitutifs tels que TAF#55 (Chiang et al., Science, 1995,267 : 531-536) ou des facteurs inductibles tels que USA (Meisterernst et al., Cell, 1991, 66 :981-993), PC5 (Halle et al, J Biol Chem, 1995, 270 :21307-21311), c-Myc, Max (Harris et al., Ibid), CREB et JunD (Cvekl et al., Ibid), et ainsi assurer l'activation ou la répression de la transcription.

Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que le facteur USF peut inhiber la transcription en entrant en compétition avec d'autres activateurs transcriptionnels pour la fixation sur la boite E (Lun et al., Takahashi et al., Ibid). Le demandeur a toutefois démontré à l'Exemple 5, que les cellules RAW transfectées par des constructions comprenant une boîte E mutée ou tronquée présentaient une augmentation plutôt qu'une diminution de l'activité du promoteur ABC1, ce qui est cohérent avec son activité de répression du gène via la boîte E. De plus, des essais de retard sur gel à l'aide d'anticorps spécifiques de différents activateurs de la boîte E ont été réalisés. Des expériences de Western blot ont été également réalisées afin de déterminer les formes tronquées et les variants de USF2 dépourvus du domaine C-terminal de transactivation, qui sont capables de conduire à la répression du gène (Sirito et al.; Liu et al ; et Howcroft et al. Ibid).

USF peut en outre agir en tant que répresseur par interaction spécifique de type protéine-protéine avec des facteurs transcriptionnels qui se lient avec des motifs d'ADN distincts de la boîte E (Harris et al., Pognonec

et al., et Cvekl et al., Ibid). En effet, comme cela a été précédemment décrit, le motif de la boîte E est entouré, dans le promoteur humain ABC1, par deux sites Sp1 et un site AP1. Or, il est bien connu que les facteurs de transcription qui se lient aux sites AP1 et Sp1 sont impliqués dans la régulation d'autres gènes impliqués dans le métabolisme de lipides tels que Apo A-II (Ribeiro et al., J Biol chem, 1999, 274:1216 :1225), ApoC-III (Ogami et al. J Biol Chem, 1990,265 : 9808-9815), la vitellogénine Il de poulet (Seal et al., Mol Cell Biol, 1991, Il : 2704-2717), l'acide gras synthétase (Casado et al., J Biol Chem, 1999, 274 : 2009-2013), le récepteur LDL (Sanchez et al., J Biol chem, 1995, 270: 1161-1169) ou encore le récepteur LDL (Gaeta et al., BBA, 1994, 121 : 307-313).

Une caractéristique préférée de l'acide nucléique régulateur selon l'invention, et plus particulièrement de la séquence localisée en amont du site d'initiation de la transcription comprise à la fois dans la séquence SEQ ID N 1 et dans la séquence SEQ ID N 3 est la présence de huit motifs caractéristiques d'un site putatif de liaison aux protéines PPAR . Les PPAR, également désignés récepteurs activés par un proliférateur de peroxisome (" peroxisome proliferator-activated receptors "), qui peuvent être de type [alpha],#(ss) et y, forment une sous famille appartenant à la famille des gènes de récepteurs nucléaires. Tous les PPAR sont activés par des acides gras et leurs dérivés. Par exemple, le PPAR de type a se fixe aux fibrates hypolipidémiques alors que les glitazones antidiabétiques sont des ligands pour le PPAR de type gamma. L'activation du PPAR de type a induit des effets pléiotropiques tels que la stimulation de l'oxydation des lipides, l'altération du métabolisme des lipoprotéines et l'inhibition de l'inflammation vasculaire. Les activateurs de PPARa augmentent l'absorption hépatique et l'estérification des acides gras libres en stimulant l'expression de la protéine de transport des acides gras et de l'acyl-CoA synthétase. Dans le muscle squelettique et le coeur, le PPARa augmente l'absorption des acides gras libres par une mitochondrie et leur oxydation par la stimulation de la carnitine palmiltoyltransférase-I spécifique du muscle. L'effet des fibrates sur le

métabolisme des lipoprotéines riches en triglycérides est dû à la stimulation de la lipoprotéine lipase, stimulation dépendante du PPARa, ainsi qu'à l'inhibition de l'apolipoprotéine C-III, alors que l'augmentation du cholestérol plasmatique sous forme de HDL dépend d'une surexpression de l'apolipoprotéine A-I et l'apolipoprotéine A-II.

Les PPARa sont également exprimés dans les liaisons athérosclérotiques. Le PPARa inhibe la synthase d'oxyde nitrique inductible dans les macrophages et empêche l'expression de l'IL-6 et de la cyclooxygénase-2 induite par l'IL-1 ainsi que l'expression de l'endothéline-1 induite par la thrombine qui résulte d'une régulation transcriptionelle négative du facteur nucléaire des voies de signalisation du facteur nucléaire NFKAPPA B et de la protéine-1 activatrice.

L'activation du PPARa induit également l'apoptose chez des macrophages dérivés des monocytes, vraisemblablement par l'inhibition de l'activité du NFKAPPA B. Ainsi, les effets pléïotropiques des activateurs de PPARa sur le profil des lipides plasmatiques participent certainement à l'inhibition du développement de l'athérosclérose. Les activateurs de PPARa, tels que les fibrates, inhibent le développement de l'athérosclérose du fait de leurs activités normolipidémiques.

La présence de huit sites potentiels de fixation au PPAR ( Positions des nucléotides de début et de fin, par rapport au site d'initiation de la transcription, pour chacun des sites: - 1280-1276/-1270-1264, -889-883/- 878-872, -584-578/-575-569 et-366-360/-358-352) (Figure 1) sur un acide nucléique régulateur selon l'invention est compatible avec l'observation selon laquelle l'expression du gène codant pour la protéine ABC1 humaine est induite pendant la différenciation des monocytes en macrophages in vitro.

Elle est également compatible avec l'observation antérieure de la régulation du gène ABC1 par les fibrates. Elle est aussi compatible avec des résultats expérimentaux démontrant que l'expression du gène ABC1 est augmentée

lorsque les macrophages humains sont incubés en présence de lipoprotéines de faible densité acétylées (AcLDLs).

Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, le demandeur pense que les sites de liaison aux PPARS identifiés selon l'invention sur l'acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID N 1 sont fortement impliqués dans la régulation spécifique de tissu, et dans la régulation spécifique de la situation métabolique cellulaire du gène ABC1, et qu'en conséquence une séquence régulatrice comprenant au moins 4, préférentiellement au moins 5,6, 7 ou encore la totalité des 8 sites de fixation aux PPARS (figure 1)(de la séquence SEQ ID N 1 et comprenant en outre un élément promoteur de base est utile comme séquence régulatrice d'un polynucléotide dont l'expression est recherchée dans le foie, le poumon, les glandes surrénales, les monocytes/macrophages, le placenta ou les tissus foetaux, ou encore d'un polynucléotide dont l'expression est recherchée en réponse à une stimulation spécifique de la cellule, en relation avec le métabolisme du cholestérol telle que la présence, dans l'environnement cellulaire, de lipoprotéines de faible densité acétylées (Ac LDLs).

En outre, il a été montré selon l'invention qu'un acide nucléique régulateur du gène ABC1 humain, tel que défini ci-dessus, qui comprend l'ensemble des sites PPAR précités, est capable de réguler l'expression d'une séquence codante placée sous son contrôle d'une manière dépendante de la présence de cholestérol dans l'environnement cellulaire.

Les résultats sont présentés à l'exemple 4 ci-après.

Comme déjà mentionné précédemment, l'invention concerne un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.

Sont englobés dans la définition ci-dessus les acides nucléiques comprenant un ou plusieurs fragments " biologiquement actifs " de l'une des séquences SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2. L'homme du métier peut aisément

obtenir des fragments biologiquement actifs de ces séquences, en se référant notamment au tableau 1 ci-dessus ainsi qu'à la figure 2 dans lesquels les différents motifs caractéristiques de la séquence régulatrice du gène ABC1 sont présentés. L'homme du métier pourra ainsi obtenir de tels fragments biologiquement actifs par synthèse chimique totale ou partielle des polynucléotides correspondants ou encore en faisant agir des endonucléases de restriction afin d'obtenir des fragments d'ADN recherchés, les sites de restriction présents sur les séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2 pouvant être aisément retrouvés à partir de l'information de séquence, à l'aide de logiciels courants de cartographie de restriction tel que GCG version 9. 1 module map .

L'obtention de fragments d'acides nucléiques déterminés à l'aide d'endonucléases de restriction est par exemple décrite dans l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989).

L'invention est donc également relative à un acide nucléique tel que défini ci-dessus, capable de moduler la transcription d'un polynucléotide placé sous son contrôle.

Selon un premier mode de réalisation préféré, un fragment biologiquement actif d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention comprend le promoteur de base (boîte TATA et homéo boîte) allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position-300, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 2894 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1.

Selon un second mode de réalisation, un fragment biologiquement actif d'un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention comprend à la fois le promoteur de base et les éléments régulateurs proximaux, allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position-600, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 2894 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1.

Selon un troisième mode de réalisation, un tel fragment biologiquement actif d'un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention comprend, outre le promoteur de base (core promoteur) une région proximale de 200 pb du promoteur du gène ABC1, laquelle est riche en sites de fixation de facteurs de transcription, tels que le Sp1, le Ap1, LXR, et la boite E, qui sont vraisemblablement impliqués dans la modulation de l'expression ABC1.

Selon un quatrième mode de réalisation, un tel fragment biologiquement actif d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention comprend, outre le promoteur de base (core promoter) et les éléments régulateurs proximaux, également d'autres éléments régulateurs tels que les différents sites PPARa et s'étend du nucléotide en position -1 au nucléotide en position -2894, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 2894 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1.

Selon un cinquième mode de réalisation, un tel fragment biologiquement actif d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention, qui comprend, outre le promoteur de base (core promoter) et les éléments régulateurs proximaux, également d'autres éléments régulateurs tels que les différents sites PPARa, s'étend du nucléotide en position +120 au nucléotide en position -995, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 2894 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1.

Selon un sixième mode de réalisaiton, un fragment biologiquement actif d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention comprend une région allant du nucléotide +108 au nucléotide -2228 par rapport au point +1 de la transcription de la séquence SEQ ID NO: 1.

EXONS 1A et 1B ET INTRONS 1A et 1B
Le demandeur a également identifié les séquences nucléotidiques localisées en aval du site d'initiation de la transcription et correspondant respectivement, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3', à l'exon 1A, l'intron 1A, l'exon 1 B et l'intron 1 B du gène humain codant pour la protéine ABC1.

Plus précisément, l'exon 1A, d'une taille de 221 nucléotides, débute au nucléotide en position 2894 de la séquence SEQ ID N 1 et se termine au nucléotide en position 3114 de la séquence SEQ ID N 1. L'exon 1A est identifié comme la séquence SEQ ID N 4.

L'exon 1 B, d'une longueur de 109 nucléotides, débute au nucléotide en position 100 et se termine au nucléotide en position 258 de la séquence SEQ ID N 2. L'exon 1B est identifié comme la séquence SEQ ID N 5.

L'intron 1A a été partiellement séquence. L'extrémité 5' de l'intron 1A débute au nucléotide en position 3115 et se termine au nucléotide en position 3231 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, également définie comme la séquence SEQ ID N 6. L'extrémité 3' de l'intron 1A débute au nucléotide en position 1 et se termine au nucléotide en position 99 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2, également identifiée comme la séquence SEQ ID N 7.

L'intron 1 B a été partiellement séquence. L'extrémité 5' de l'intron 1 B débute au nucléotide en position 259 et se termine au nucléotide en position 357 de la séquence SEQ ID N 2. Cette séquence est également identifiée comme la séquence SEQ ID N 8.

L'exon 1 B contient le début de la phase ouverte de lecture du gène ABC1 humain, le nucléotide A du codon ATG étant localisé en position début en position 94 de la séquence SEQ ID N 5. L'exon 1 B code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N 9.

Les exons 1A et 1B ainsi que les introns 1A et 1B sont susceptibles de contenir des éléments de régulation de l'expression du gène ABC1,

notamment des éléments de type enhancer et/ou des éléments de type silencers.

En conséquence, un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention peut également contenir, outre des fragments biologiquement actifs de la séquence SEQ ID N 1, également des fragments nucléotidiques, voire la totalité des séquences SEQ ID N 2 à SEQ ID N 8.

Les séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8, ainsi que leurs fragments, peuvent être notamment utilisés comme sondes ou amorces nucléotidiques pour détecter la présence d'au moins une copie du gène ABC1 dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein de la séquence régulatrice du gène ABC1.

L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini ci-dessus, en particulier provenant de l'une des séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 1.

L'invention concerne également un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, en particulier un acide nucléique provenant d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8.

L'invention a également trait à un acide nucléique tel que défini cidessus et caractérisé en outre en ce qu'il est capable de moduler la transcription d'un polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.

Selon un premier aspect, un tel acide nucléique est capable d'activer la transcription du polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.

Selon un second aspect, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être caractérisé en ce qu'il est capable d'inhiber la transcription du polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de celui-ci.

Préférentiellement, un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention, lorsqu'il est localisé convenablement par rapport à un polynucléotide d'intérêt dont l'expression est recherchée, va permettre la

transcription dudit polynucléotide d'intérêt, soit de manière constitutive, soit de manière inductible.

Le caractère inductible de la transcription initiée par un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être conféré par un ou plusieurs des éléments régulateurs qu'il contient, par exemple la présence d'un ou plusieurs sites PPARa, de préférence au moins 4 sites PPARa, et de manière tout à fait préférée au moins 5,6, 7 sites ou les 8 sites PPARa de la séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 3.

De plus, une expression spécifique de tissu du polynucléotide d'intérêt peut être recherchée en plaçant ce polynucléotide d'intérêt sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention capable, par exemple, d'initier la transcription de ce polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans certaines catégories de cellules, par exemple des cellules du foie, des cellules de placenta ou des macrophages.

De manière préférée, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs éléments régulateurs " discrets", tels que des éléments enhancers et silencers. En particulier, un tel acide nucléique régulateur peut comprendre un ou plusieurs sites de fixation potentiels aux facteurs de transcription tels que définis dans la Figure 1.

Un acide régulateur selon l'invention englobe également une séquence ne comprenant pas le promoteur de base, c'est-à-dire la séquence allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position-300, par rapport au site d'initiation de la transcription.

Un tel acide nucléique régulateur comprendra alors préférentiellement un promoteur de base dit " hétérologue " , c'est-à-dire un polynucléotide comprenant une boîte " TATA " et une " homéo-boîte " ne provenant pas de l'acide nucléique régulateur du gène ABC1.

Fait également partie de l'invention un acide nucléique régulateur de la transcription comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N 1 qui a été modifié, par exemple par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides. De telles modifications peuvent moduler l'activité

transcriptionnelle en provoquant une augmentation ou au contraire une diminution de l'activité du promoteur ou de l'élément régulateur.

Une telle modification peut également affecter la spécificité tissulaire du promoteur ou de l'élément régulateur. Ainsi, par exemple, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être modifié afin de stimuler la transcription dans seulement l'un des tissus dans lequel il est naturellement exprimé.

Un acide régulateur de la transcription selon l'invention peut également être modifié et être rendu inductible par un composé particulier, par exemple en créant dans la séquence un site inductible par un composé thérapeutique donné.

Les modifications dans une séquence comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N 1 et comprenant le promoteur ou un élément régulateur peuvent être réalisées avec des méthodes bien connues de l'homme du métier, telle que la mutagenèse. L'activité du promoteur ou de l'élément régulateur modifié peut ensuite être testée, par exemple par clonage du promoteur modifié en amont d'un gène rapporteur, en transfectant la construction d'ADN résultante dans une cellule hôte et en mesurant le niveau d'expression du gène rapporteur dans la cellule hôte transfectée. L'activité du promoteur modifié peut également être analysée in vivo dans des animaux transgéniques. Il est également possible de construire des banques de fragments modifiés qui peuvent être criblées en utilisant des tests fonctionnels dans lesquels, par exemple, seuls les promoteurs ou les éléments régulateurs ayant l'activité désirée seront sélectionnés.

De tels essais peuvent être basés, par exemple sur l'utilisation de gènes rapporteurs conférant une résistance à des composés déterminés, par exemple à des antibiotiques. La sélection de cellules ayant une construction acide nucléique régulateur/gène rapporteur et contenant un promoteur ou un élément régulateur ayant la modification recherchée peut alors être isolée par culture des cellules hôtes transformées avec une telle

construction en présence du composé déterminé, par exemple de l'antibiotique déterminé.

Le gène rapporteur peut également coder pour toute protéine facilement détectable, par exemple une protéine optiquement détectable telle que la luciférase.

En conséquence, l'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant: a) un acide nucléique régulateur de la transcription telle que définie ci-dessus ; et b) un polynucléotide d'intérêt codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt.

Selon un premier aspect, le polynucléotide d'intérêt dont la transcription est recherchée code pour une protéine ou un peptide. La protéine peut être de toute nature, par exemple une protéine d'intérêt thérapeutique, y compris des cytokines, des protéines de structure, des récepteurs ou encore des facteurs de transcription. Par exemple, dans le cas où une transcription spécifiquement dans certains tissus est recherchée, comme par exemple dans des cellules de foie, de macrophage ou de placenta, l'acide nucléique régulateur de la transcription comprendra avantageusement un acide nucléique allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position-1318, par rapport au site d'initiation de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 3.

Dans ce cas, le polynucléotide d'intérêt codera pour un gène impliqué dans la lutte contre l'inflammation, tel qu'un récepteur aux cytokines ou encore pour une superoxyde dismutase. Si un effet antitumoral est recherché, on cherchera alors à stimuler le nombre et l'activation de lymphocytes T-cytotoxiques spécifiques d'un antigène tumoral donné.

Avantageusement, l'acide nucléique régulateur de transcription comprend un acide nucléique allant du nucléotide en position +108 au

nucléotide en position-2228 par rapport au site d'initiation de la transcription de la séquence SEQ ID NO: 1.

Dans un autre mode de réalisation, un acide nucléique régulateur selon l'invention sera utilisé en combinaison avec un polynucléotide d'intérêt codant pour la protéine ABC1.

Comme déjà mentionné, le polynucléotide d'intérêt peut également coder pour un acide nucléique, tel qu'un acide nucléique antisens spécifique d'un gène dont on cherche à inhiber la traduction.

Selon un autre aspect, le polynucléotide d'intérêt dont la transcription est régulée par l'acide nucléique régulateur est un gène rapporteur, tel que tout gène codant pour une protéine détectable.

Parmi les gènes rapporteurs préférés , on peut citer notamment le gène de la luciférase, de la ss-galactosidase (LacZ), de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) ou encore tout gène codant pour une protéine conférant une résistance à un composé particulier, particulièrement à un antibiotique.

VECTEURS RECOMBINANTS
Par " vecteur au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.

Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique régulateur selon l'invention qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.

Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique régulateur conforme à l'invention, des séquences dont l'expression est recherchée dans une cellule hôte ou dans un organisme multicellulaire déterminé.

Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants :

(1) un acide nucléique régulateur selon l'invention; (2) un polynucléotide d'intérêt comprenant une séquence codante comprise dans l'acide nucléique à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits au (1) ; et (3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.

En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection.

A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.

Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris.

De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996).

* Lorsque l'expression de la séquence génomique du gène ABC1 sera désirée, on aura préférentiellement recours à des vecteurs capables d'inclure de grandes séquences d'insertion. Dans ce mode de réalisation particulier, on utilisera de préférence des vecteurs de bactériophages, tels que les vecteurs de bactériophage P1 comme le vecteur p158 ou encore le vecteur p158/neo8 décrits par Sternberg (1992,1994).

Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322(ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223- 3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, ETATS-UNIS).

On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stratagene).

Il peut s'agir aussi du vecteur recombinant PXP1 décrit par Nordeen SK et al. (1988, BioTechniques, 6 : 454-457).

Il peut s'agir également de vecteurs de type Baculovirus tels que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivées de Spodoptera frugiperda.

Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5.

Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno-associés sont par exemple décrits par Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), ou encore McLaughlin BA et al. (1996).

Pour permettre l'expression d'un polynucléotide d'intérêt sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, la construction polynucléotidique comprenant la séquence régulatrice et la séquence codante doit être introduite dans une cellule hôte. L'introduction d'une telle construction polynucléotidique selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires. On peut aussi réaliser l'introduction des polynucléotides selon l'invention in vivo ou ex vivo, pour la prévention ou le traitement de maladies liées à un déficit dans le transport inverse du cholestérol.

Pour introduire les polynucléotides ou les vecteurs dans une cellule hôte, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à différentes techniques, comme la technique de précipitation au phosphate de calcium (Graham et al., 1973 ; Chen et al., 1987), le DEAE Dextran (Gopal, 1985), l'électroporation (Tur-Kaspa, 1896 ; Potter et al., 1984), la microinjection

directe (Harland et al., 1985), Les liposomes chargés en ADN (Nicolau et al., 1982, Fraley étal., 1979).

Une fois que le polynucléotide a été introduit dans la cellule hôte, il peut être intégré de manière stable dans le génome de la cellule. L'intégration peut être réalisée à un endroit précis du génome, par recombinaison homologue, ou peut être intégré au hasard. Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide peut être maintenu de manière stable dans la cellule hôte sous la forme d'un fragment d'épisome, l'épisome comprenant des séquences permettant le maintien et la réplication de ce dernier, soit de manière indépendante, soit de manière synchronisée avec le cycle cellulaire.

Selon un mode de réalisation particulier, une méthode pour introduire un polynucléotide selon l'invention dans une cellule hôte, en particulier une cellule hôte provenant d'un mammifère, in vivo, comprend une étape au cours de laquelle on introduit une préparation comprenant un vecteur pharmaceutiquement compatible et un polynucléotide " nu " selon l'invention, placé sous le contrôle de séquences de régulation appropriées, par injection locale au niveau du tissus choisi, par exemple un tissu musculaire lisse, le polynucléotide " nu " étant absorbé par les cellules de ce tissu.

Des compositions pour l'utilisation in vitro et in vivo comprenant des polynucléotides " nus " sont par exemples décrites dans la demande PCT N WO 95/11307 (Institut Pasteur, Inserm, Université d'Ottawa) ainsi que dans les articles de Tacson et al. (1996) et de Huygen et al. (1996) .

Selon un mode de réalisation spécifique de l'invention, il est fourni une composition pour la production in vivo d'une protéine d'intérêt. Cette composition comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide d'intérêt placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice selon l'invention , en solution dans un vecteur physiologiquement acceptable.

La quantité de vecteur qui est injecté à l'organisme hôte choisi varie selon le site de l'injection. A titre indicatif, il peut être injecté entre environ 0,1

et environ 100 g de la construction polynucléotidique séquence régulatrice/séquence codante dans le corps d'un animal.

Lorsque l'acide nucléique régulateur selon l'invention est localisé, sur la construction polynucléotidique (ou vecteur), de telle manière à contrôler la transcription d'une séquence comprenant un cadre de lecture ouvert codant la protéine ABC1, le vecteur est injecté de préférence dans le corps d'un patient susceptible de développer une maladie liée à un déficit dans le transport inverse du cholestérol ou ayant déjà développé cette maladie, en particulier un patient ayant une prédisposition pour la maladie de Tangier ou ayant déjà développé la maladie.

En conséquence, l'invention concerne également une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et un polynucléotide d'intérêt codant pour la protéine ABC1, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

Avantageusement, une telle composition comprendra l'acide nucléique régulateur défini par l'une des séquences SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, ou un fragment biologiquement actif de cet acide nucléique régulateur.

L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

L'invention est également relative à l'utilisation d'une construction polynucléotidique conforme à l'invention et comprenant un acide nucléique régulateur du gène ABC1 ainsi qu'une séquence codant pour la protéine ABC1, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.

L'invention a également trait à l'utilisation d'un vecteur recombinant selon l'invention, comprenant, outre un acide nucléique régulateur de l'invention, un acide nucléique codant pour la protéine ABC1, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.

Vecteurs utiles dans des procédés de thérapie génique somatique et compositions contenant de tels vecteurs
La présente invention concerne aussi une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées au transport du cholestérol. Elle propose une solution avantageuse aux inconvénients de l'art antérieur, en démontrant la possibilité de traiter les pathologies, notamment des pathologies liées au transport du cholestérol, par la thérapie génique, par le transfert et l'expression in vivo d'une construction polynucléotidique comprenant, outre un acide nucléique régulateur selon l'invention, une séquence codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le transport et le métabolisme du cholestérol. L'invention offre ainsi un moyen simple permettant un traitement spécifique et efficace des pathologies associées comme par exemple l'athérosclérose.

La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989)

375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.BioI.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.

La présente invention est donc également relative à une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées au transport du cholestérol, consistant à transférer et à exprimer in vivo des gènes codant pour ABC1 placés sous le contrôle d'un acide régulateur selon l'invention.

De manière particulièrement avantageuse, la demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de construire des virus recombinants contenant une séquence d'ADN comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le métabolisme du cholestérol, d'administrer ces virus recombinants in vivo, et que cette administration permet une expression stable et efficace d'une protéine ABC1 biologiquement active in vivo, et sans effet cytopathologique.

Les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression du gène ABC1. En particulier, l'utilisation d'adénovirus recombinants comme vecteurs permet d'obtenir des niveaux d'expression suffisamment élevés du gène d'intérêt pour produire l'effet thérapeutique recherché. D'autres vecteurs viraux, tels que les rétrovirus ou les virus adéno-associés (AAV), permettant une expression stable du gène sont aussi revendiqués.

La présente invention offre ainsi une nouvelle approche pour le traitement et la prévention des pathologies cardio-vasculaires et neurologiques liées aux anomalies du transport du cholestérol.

L'invention a donc aussi pour objet un virus recombinant défectif comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence

nucléique codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le métabolisme du cholestérol.

L'invention a également trait à l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies cardio-vasculaires.

La présente invention concerne également l'utilisation de cellules modifiées génétiquement ex vivo par un virus tel que décrit ci-dessus, ou de cellules productrices de tels virus, implantées dans l'organisme, permettant une expression in vivo prolongée et efficace d'une protéine ABC1 biologiquement active.

La présente invention montre qu'il est possible d'incorporer une séquence d'ADN codant pour ABC1 dans le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini ci-dessus dans un vecteur viral, et que ces vecteurs permettent d'exprimer efficacement une forme mature, biologiquement active. Plus particulièrement, l'invention montre que l'expression in vivo de ABC1 peut être obtenue par administration directe d'un adénovirus ou par implantation d'une cellule productrice ou génétiquement modifiée par un adénovirus ou par un rétrovirus incorporant un tel ADN.

La présente invention est particulièrement avantageuse, car elle permet d'induire une expression contrôlée et sans effet nocif de ABC1 dans des organes qui ne sont pas normalement concernés par l'expression de cette protéine. En particulier, une libération significative de la protéine ABC1 est obtenue par implantation de cellules productrices de vecteurs de l'invention, ou infectées ex vivo par des vecteurs de l'invention.

L'activité de transporteur du cholestérol produit dans le cadre de la présente invention peut être du type ABC1 humaine ou animale. La séquence nucléique utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), un ARN (dans le cas des rétrovirus) ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de

séquences synthétiques ou semi-synthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, l'utilisation d'un ADNg permet une meilleure expression dans les cellules humaines. Pour permettre leur incorporation dans un vecteur viral selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mutagenèse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des expressions importantes. Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une séquence nucléique codant pour une protéine ABC1 humaine. Par ailleurs, il est également possible d'utiliser une construction codant pour un dérivé de ces protéines ABC1. Un dérivé de ces protéines ABC1 comprend par exemple toute séquence obtenue par mutation, délétion et/ou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un produit conservant l'activité transporteur de cholestérol. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après). L'activité biologique des dérivés ainsi obtenus peut ensuite être aisément déterminée, comme indiqué notamment dans les exemples décrivant la mesure de l'afflux de cholestérol à partir des cellules.

Les dérivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.

Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement de nouvelles propriétés biologiques. Les dérivés incluent également les séquences d'ADN modifiées permettant une expression améliorée in vivo.

Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un virus recombinant défectif comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence d'ADNc codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le transport et le métabolisme du cholestérol. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg. La séquence d'ADNc codant pour la protéine ABC1, et utilisable dans un vecteur selon l'invention est avantageusement la séquence SEQ ID N 10.

Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus, des virus adéno-associés (AAV), des virus de l'herpès (HSV) ou des rétrovirus. Il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus, pour une administration directe ou pour la modification ex vivo de cellules destinées à être implantées, ou un rétrovirus, pour l'implantation de cellules productrices.

Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible.

Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence nucléique codant pour la protéine ABC1. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.

S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO 94/26914). Parmi les

adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche Manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour la protéine ABC1 placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention. Avantageusement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est rendue non fonctionnelle. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) et L5 (WO 95/02697).

Selon un mode préféré de mise en #uvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4 et la séquence codant pour ABC1 est insérée au niveau de la région E1 inactivée. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour ABC1 (Demande de brevet Français FR 94 13355).

Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al.,

Gene 101 (1991) 195, EP 185 573 ; EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour la protéine ABC1. La recombinaison homologue se produit après cotransfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Viral. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n WO 94/26914 et WO 95/02697.

Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.

Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la

réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.

L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Ces documents décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Toutefois, aucun de ces documents ne décrit ni ne suggère l'utilisation d'un AAV recombinant pour le transfert et l'expression in vivo ou ex vivo d'une protéine ABC1, ni les avantages d'un tel transfert. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour la protéine ABC1 bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.

Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist, 3 (1991) 203 ; EP 453242, EP
178220, Bernstein et al., Genet. Eng,. 7 (1985) 235 ; McCormick,BioTechnology, 3 (1985) 689, etc.

En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels

que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus" ; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.

Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour la protéine ABC1 placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US 4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO 90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO 89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Viral. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.

Pour la mise en #uvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif.

Les résultats donnés ci-après démontrent en effet les propriétés particulièrement intéressantes des adénovirus pour l'expression in vivo d'une protéine ayant une activité de transport de cholestérol. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute

efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale.

Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux contenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et la séquence codant pour la protéine ABC1, pour une implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont notamment les cellules PA317 (US4,861,719), PsiCrip (WO 90/02806) et GP+envAm-12 (US 5,278,056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant pour une protéine ABC1 selon l'invention. Par exemple des cellules souches totipotente, précurseurs des lignées cellulaires sanguines, peuvent être prélevées et isolées chez le sujet. Ces cellules mises en culture peuvent être alors transfectées par le vecteur rétroviral contenant la séquence codant pour la protéine ABC1 sous le contrôle de son propre promoteur. Ces cellules sont alors réintroduites chez le sujet. La différentiation de ces cellules sera à l'origine de cellules sanguines exprimant la protéine ABC1, notamment à l'origine des monocytes qui, transformés en macrophages, participent à l'élimination du cholestérol de la paroi artérielle. Ces macrophages exprimant la protéine ABC1 auront une capacité accrue à métaboliser le cholestérol en excès et le mettront à disposition à la surface cellulaire pour son élimination par les accepteurs primaires du cholestérol membranaire.

Selon un autre mode de réalisation, les vecteurs selon l'invention comprennent la séquence codant pour la protéine ABC1 qui est placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur comprenant une séquence allant du nucléotide +108 au nucléotide -2228, par rapport au site d'initiation de transcription de la séquence SEQ ID No. 1.

Encore selon un autre mode de réalisation, les vecteurs selon l'invention comprennent une séquence codant pour la protéine ABC1 qui est placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur comprenant le promoteur core et les 200 pb du promoteur du gène ABC1.

Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour la protéine ABC1 est placée sous le contrôle d'un acide régulateur selon l'invention comprenant les éléments régulateurs permettant son expression dans les cellules infectées, et tout particulièrement les éléments régulateurs de type PPAR.

Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des pathologies liées au transport du cholestérol.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection intraveineuse, telle que par exemple dans la veine porte du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la veine porte du patient est avantageuse car elle permet de cibler l'infection au niveau du foie et ainsi, de concentrer l'effet thérapeutique au niveau de cet organe.

Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de

préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.

Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation.

A cet égard, un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectées par ces virus. Il peut s'agir en particulier de cellules d'origine sanguine (cellules souches totipotentes ou précurseurs), fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules musculaires lisses et endothéliales, cellules gliales, etc.

Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham (Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255). Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les virus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).

Les cellules en culture sont ensuite infectées par les virus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire une protéine ABC1 biologiquement active. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques

connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infections et éventuellement le nombre de cycles d'infections réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro. Pour l'infection par des rétrovirus, il est également possible de co-cultiver les cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus recombinants selon l'invention. Ceci permet de s'affranchir de la purification des rétrovirus.

Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules de mammifères infectées par un ou plusieurs virus recombinants défectifs telles que décrites ci-dessus ou des cellules productrices de virus recombinants, et une matrice extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 105 à 1010 cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108.

Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.

Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente

invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférentiellement, on utilise du collagène de type I.

Comme indiqué ci avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entraînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou biocompatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique.

La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies liées au transport du cholestérol, en particulier l'obésité, l'hypertriglycéridémie, ou, dans le domaine des affections cardio-vasculaires, l'infarctus du myocarde, l'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque et les accidents cérébro-vasculaires.

En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.

CELLULES HOTES RECOMBINANTES
L'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante comprenant l'un quelconque des acides nucléiques de l'invention de séquence SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8, et plus particulièrement un acide nucléique de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID N 5.

Selon un autre aspect, l'invention est également relative à une cellule hôte recombinante comprenant un vecteur recombinant tel que cidessus décrit.

Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont par exemple les suivantes : a) cellules hôtes procaryotes : souchesd'Escherichia coli (souche DH5-a), de Bacillus subtilis, de Salmonella typhimurium, ou encore des souches d'espèces telles que Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococus ; b) cellules hôtes eucaryotes: cellules HeLa (ATCC N CCL2), cellules Cv 1 (ATCC N CCL70), cellules COS (ATCC N CRL 1650), cellules Sf-9 (ATCC N CRL 1711), cellules CHO (ATCC N CCL-61) ou encore cellules 3T3 (ATCC N CRL-6361), ou encore le cellules de la lignée Hepa1-6 référencées à l'American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, Etats-Unis d'Amérique). c) les cellules en culture primaire provenant d'un individu chez lequel l'expression d'un acide nucléique d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention est recherchée. d) Les cellules à multiplication indéfinie (lignées cellulaires) obtenues à partir des cellules en culture primaire du c) ci-dessus, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

PROCEDES DE CRIBLAGE
Procédé de criblage in vitro.

L'invention fournit des procédés pour traiter un sujet affecté d'une pathologie liée au niveau d'expression de la protéine ABC1. En particulier, une telle méthode de traitement consiste à administrer au sujet un composé

modulant l'expression du gène ABC1, qui peut être identifié selon divers procédés de criblage in vitro tels que définis ci-après.

Une première méthode consiste à identifier des composés modulant l'expression du gène ABC1. Selon une telle méthode, des cellules exprimant le gène ABC1 sont incubées avec une substance ou molécule candidate à tester et le niveau d'expression de l'ARN messager de ABC1 ou encore le niveau de production de la protéine ABC1 est ensuite déterminé.

Les niveaux d'ARN messager de ABC1 peuvent être déterminés par hybridation sur gel de type Northern, bien connu de l'homme du métier.

Les niveaux d'ARN messager de ABC1 peuvent également être déterminés par des procédés mettant en oeuvre la PCR ou encore la technique décrite par WEBB et HURSKAINEN (1996, Journal of Biomolecular Screening, vol.

1 : 119).

Les niveaux de production de la protéine ABC1 peuvent être déterminés par immunoprécipitation ou immunochimie en utilisant un anticorps qui reconnaît spécifiquement la protéine ABC1.

Selon une autre méthode de criblage d'une molécule ou substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, une construction nucléotidique telle que définie ci-dessus, comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention ainsi qu'un polynucléotide rapporteur placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur, est utilisée, ledit acide nucléique régulateur comprenant au moins un promoteur de base et au moins un élément régulateur de l'une des séquences SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, ou un acide nucléique régulateur comprenant une région allant du nucléotide +108 au nucléotide -2228 par rapport au point +1 dans la séquence SEQ ID NO: 1, ou encore le core promoteur et les 200pb proximales du promoteur du gène ABC1. Le polynucléotide rapporteur peut être un gène codant pour une protéine détectable, tel qu'un gène codant pour une luciférase.

Selon un tel procédé de criblage, les cellules sont transfectées avec la construction polynucléotidique contenant l'acide nucléique régulateur

selon l'invention et le polynucléotide rapporteur, de manière stable ou transitoire.

Les cellules transformées sont ensuite incubées en présence ou en l'absence de la molécule ou de la substance candidate à tester pendant un temps suffisant, puis le niveau d'expression du gène rapporteur est déterminé. Les composés qui induisent un changement statistiquement significatif de l'expression du gène rapporteur (soit une augmentation, soit au contraire une diminution de l'expression du gène rapporteur ) sont ensuite identifiés et, le cas échéant, sélectionnés.

Ainsi, l'invention a encore pour objet un procédé pour le criblage in vitro d'une molécule ou d'une substance modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, notamment modulant la transcription du polynucléotide rapporteur constitutif d'une construction polynucléotidique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à : a) mettre en culture une cellule hôte recombinante comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention; b) incuber la cellule hôte recombinante avec la substance ou molécule à tester; c) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt ; d) comparer les résultats obtenus à l'étape c) avec les résultats obtenus lorsque la cellule hôte recombinante est mise en culture en l'absence de la molécule ou substance candidate à tester.

L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour le criblage in vitro d'une molécule ou d'une substance candidate capable de moduler l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comprenant :

a) une cellule hôte transformée avec une construction polynucléotidique telle que définie ci-dessus, comprenant un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention; et b) le cas échéant, des moyens de détection de l'expression du polynucléotide rapporteur d'intérêt.

De préférence, le polynucléotide rapporteur d'intérêt est la séquence codante d'une luciférase. Dans ce cas, l'acide nucléique régulateur selon l'invention est inséré dans un vecteur, en amont de la séquence codant pour la luciférase. Il peut s'agir par exemple du vecteur pGL3-basic (pGL3-b) commercialisé par la Société PROMEGA (Madison, Wisconsin, Etats-Unis).

Dans ce cas, le vecteur recombinant comprenant la séquence codante de la luciférase placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention est transfecté dans des cellules de carcinome hépatocellulaire, telles que les cellules de la lignée HepG2, dont l'activité luciférase est ensuite déterminée après mise en culture en présence ou non de la substance ou de la molécule candidate à tester.

On peut dans ce cas utiliser comme témoins des vecteurs pGL3-b contenant soit le promoteur du cytomégalovirus (CMV), le promoteur ApoAl ou encore aucun promoteur. Pour le test d'activité luciférase, les cellules transfectées sont lavées avec un tampon PBS et lysées avec 500 l de tampon de lyse (50 mM tris, 150 mM NaCI, 0,02% d'azide de sodium, 1 % de NP-40,100 g/ml de AEBSF et 5 g/ml de leupeptine).

50 l du lysat cellulaire obtenu sont ensuite ajoutés à 100 l du substrat de la luciférase (Promega) et les mesures d'activité sont réalisées sur un lecteur spectrophotométrique de microplaque, 5 minutes après l'addition du lysat cellulaire.

Les données sont exprimées en unités relatives d'activité luciférase.

Les constructions polynucléotidiques produisant de hauts niveaux d'activité luciférase dans les cellules transfectées sont celles qui contiennent un acide nucléique régulateur selon l'invention compris dans la séquence SEQ ID N 1 qui est capable de stimuler la transcription.

Pour les mesures des niveaux d'expression d'ARN messager dans un procédé de criblage selon l'invention, on prépare tout d'abord des sondes spécifiques de l'ARN messager du polynucléotide rapporteur d'intérêt, par exemple à l'aide du kit multiprime labeling kit (commercialisé par la Société Amersham Life Sciences, Cleveland, Ohio, Etats-Unis).

PROCEDE DE CRIBLAGE IN VIVO.

Selon un autre aspect de l'invention, des compositions modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peuvent être identifiées in vivo, dans des animaux transgéniques non humains.

Selon une telle méthode, un animal transgénique non humain, par exemple une souris, est traité avec une molécule ou une substance candidate à tester, par exemple une substance ou molécule candidate auparavant sélectionnée par un procédé de criblage in vitro tel que défini cidessus.

Après une durée déterminée, le niveau d'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention est déterminé et comparé à l'activité d'un animal transgénique non humain identique, par exemple une souris transgénique identique, qui n'a pas reçu la molécule ou la substance candidate.

L'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention fonctionnel dans l'animal transgénique peut être déterminée par diverses méthodes, par exemple la mesure des niveaux d'ARN messager correspondant aux polynucléotides rapporteurs d'intérêt placés sous le contrôle dudit acide nucléique régulateur par hybridation de type Northern, ou encore par hybridation in situ.

Selon une alternative, l'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention peut être déterminée en mesurant les niveaux d'expression de protéine codée par les polynucléotides rapporteurs d'intérêt, par exemple par immunohistochimie, dans le cas où le polynucléotide rapporteur d'intérêt comprend un cadre de lecture ouvert codant pour une protéine détectable par une telle technique.

Pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, on préférera des mammifères non humains tels que des souris, des rats ou des cobayes ou des lapins qui ont leur génome modifié par l'insertion d'une construction polynucléotidique comprenant un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.

Les animaux transgéniques selon l'invention comprennent le transgène, c'est-à-dire la construction polynucléotidique précitée, dans une pluralité de leurs cellules somatiques et/ou germinales.

La construction d'animaux transgéniques selon l'invention peut être réalisée selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra en particulier se référer à la production d'animaux transgéniques, et particulièrement à la production de souris transgéniques, telles que décrites dans les brevets US N 4,873,191 (délivré le 10 Octobre 1989), US N 5,464,764 (délivré le 7 Novembre 1995) et US 5,789,215 (délivré le 4 Août 199 8) le contenu de ces documents étant ici incorporé par référence.

En bref, une construction polynucléotidique comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle de ce dernier est insérée dans une lignée de cellules souches de type ES. L'insertion de la construction polynucléotidique est réalisée de préférence par électroporation, telle que décrite par Thomas et al. (1987, Cell, Vol.51:503-512).

Les cellules ayant subi l'étape d'électroporation sont ensuite criblées pour la présence de la construction polynucléotidique (par exemple par sélection à l'aide de marqueurs, ou encore par PCR ou par analyse sur gel d'électrophorèse d'ADN de type Southern) afin de sélectionner les cellules positives ayant intégré la construction polynucléotidique exogène dans leur génome, le cas échéant à la suite d'un événement de recombinaison homologue. Une telle technique est par exemple décrite par MANSOUR et al. (1988, Nature, Vo1.336: 348-352).

Ensuite, les cellules sélectionnées positivement sont isolées, clonées et injectées dans des blastocystes de souris de 3,5 jours, comme cela est décrit par BRADLEY (1987, Production and Analysis of Chimaeric mice. In: E. J. ROBERTSON (Ed., teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. IRL press, Oxford, page 113). Des blastocystes sont ensuite introduits dans un animal hôte femelle et le développement de l'embryon est poursuivi jusqu'au terme.

Selon une alternative, des cellules de type ES sélectionnées positivement sont mises en contact avec des embryons de 2,5 jours à un stade 8-16 cellules (morulae) comme décrit par WOOD et al. (1993, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, vo1.90: 4582-4585) ou par NAGY et al. (1993, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90 : 8424-8428), les cellules ES étant internalisées afin de coloniser extensivement le blastocyste, y compris les cellules donnant naissance à la lignée germinale.

Les descendants sont ensuite testés afin de déterminer ceux qui ont intégré la construction polynucléotidique (le transgène).

L'invention a donc également pour objet un animal transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou germinales ont été transformées par un acide nucléique ou une construction polynucléotidique selon l'invention.

L'invention a également trait à des cellules hôtes recombinantes obtenues à partir d'un animal transgénique tel que décrit ci-dessus.

Des lignées de cellules recombinantes provenant d'un animal transgénique selon l'invention peuvent être établies en culture à long terme à partir de n'importe quel tissu d'un tel animal transgénique, par exemple par transfection des cultures de cellules primaires avec des vecteurs exprimant des oncogènes tels que le grand antigène T de SV40, tel que décrit par exemple par CHOU (1989, Mol. Endocrinol. Vol.3: 1511-1514) et SCHAY et al. (1991, Biochem. Biophys. Acta, vol. 1072 : 1-7).

L'invention est également relative à un procédé pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comportant les étapes consistant à : a) administrer la substance ou la molécule candidate à un animal transgénique tel que défini ci-dessus; b) détecter le niveau d'expression d'un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur; c) comparer les résultats obtenus au b) avec les résultats obtenus chez un animal transgénique n'ayant pas reçu la substance ou la molécule cand idate.

L'invention se rapporte aussi à un kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comprenant : a) un animal transgénique tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, les moyens de détection du niveau d'expression du polynucléotide rapporteur d'intérêt.

COMPOSES ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES
L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques destinées à la prévention ou au traitement d'un déficit dans le métabolisme du cholestérol tel que l'athérosclérose, particulièrement dans le transport du

cholestérol, et plus particulièrement encore dans le transport inverse du cholestérol.

En premier lieu, l'invention a également pour objet une substance ou une molécule candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.

De manière tout à fait préférée, l'invention concerne également une substance ou une molécule candidate caractérisée en ce qu'elle augmente l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, et tout particulièrement d'un acide nucléique régulateur comprenant la séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 3, ou un acide nucléique régulateur comprenant une région allant du nucléotide +108 au nucléotide -2228 par rapport au point +1 dans la séquence SEQ ID NO: 1, ou encore le core promoteur et les 200pb proximales du promoteur du gène ABC1.

Préférentiellement, une telle substance ou molécule capable de moduler l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention a été sélectionnée selon l'un des procédés de criblage in vitro ou in vivo défini cidessus.

Ainsi, un sujet affecté dans le métabolisme du cholestérol, et tout particulièrement un sujet affecté par la maladie de Tangier, est traité par l'administration à ce sujet d'une quantité efficace d'un composé modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.

Ainsi, un patient ayant une faible activité du promoteur ABC1 peut être traité avec une molécule ou une substance précitée afin d'augmenter l'activité du promoteur ABC1.

De manière alternative, un patient ayant une activité du promoteur ABC1 anormalement haute peut être traité avec un composé capable de diminuer ou de bloquer l'activité du promoteur ABC1.

Un tel composé peut être un composé qui module l'interaction d'au moins un facteur de transcription avec le promoteur ABC1 ou un élément régulateur d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.

Par exemple, le composé peut inhiber l'interaction de l'un des facteurs de transcription listés dans le tableau 1 avec un acide nucléique régulateur selon l'invention.

Le composé peut également être un composé qui module l'activité d'un facteur de transcription se fixant au promoteur de ABC1 ou encore d'un élément régulateur présent sur ce dernier.

Un composé d'intérêt thérapeutique selon l'invention peut également être un composé qui module l'interaction d'un premier facteur de transcription avec un second facteur de transcription.

Comme détaillé dans l'analyse des différents facteurs de transcription susceptibles de se fixer à la séquence SEQ ID N 3, certains facteurs de transcription sont actifs seulement s'ils sont associés avec un autre facteur de transcription.

Un composé d'intérêt thérapeutique selon l'invention est préférentiellement choisi parmi les acides nucléiques, les peptides et les petites molécules. Par exemple, un tel composé peut être un acide nucléique antisens qui se fixe spécifiquement sur une région du promoteur ABC1 ou sur un élément régulateur d'un acide nucléique régulateur d'ABC1 et inhibant ou diminuant l'activité du promoteur.

Ce composé d'intérêt thérapeutique peut également être un acide nucléique antisens qui interagit spécifiquement avec un gène codant pour un facteur de transcription modulant l'activité du promoteur ABC1, de telle manière que l'interaction de l'acide nucléique antisens avec le gène codant pour le facteur de transcription se fixant sur le promoteur ABC1 diminue la production de ce facteur de transcription, résultant en une augmentation ou une diminution de l'activité du promoteur ABC1, selon que le facteur de transcription augmente ou au contraire réduit l'activité du promoteur ABC1.

La toxicité et l'efficacité thérapeutique des composés thérapeutiques selon l'invention peuvent être déterminées selon les protocoles pharmaceutiques standard dans des cellules en culture ou chez des animaux expérimentaux, par exemple pour déterminer la dose létale

LD50 (c'est-à-dire la dose létale pour 50% de la population testée) ainsi que la dose efficace ED50 (c'est-à-dire la dose thérapeutiquement efficace dans 50% de la population testée).

Pour tous les composés d'intérêt thérapeutique selon l'invention, la dose thérapeutiquement efficace peut être estimée initialement à partir de tests réalisés dans des cultures cellulaires in vitro.

L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance ou molécule d'intérêt thérapeutique selon l'invention.

De telles compositions pharmaceutiques peuvent être formulées de manière classique en utilisant un ou plusieurs vecteurs ou excipients physiologiquement acceptables.

Ainsi, les composés d'intérêt thérapeutique selon l'invention, ainsi que leurs sels et solvates physiologiquement acceptables, peuvent être formulés pour une administration par injection, inhalation ou encore par administration orale, buccale, parentérale ou rectale.

Des techniques de préparation de compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être aisément retrouvées par l'homme du métier, par exemple dans l'ouvrage Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mead Publishing Co., Easton, PA, Etats-Unis.

Pour une administration systémique, on préférera l'injection, y compris les injections intramusculaires, intraveineuses, intrapéritonéales et sous-cutanées. Dans ce cas, les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées sous forme de solutions liquides, de préférence dans des solutions ou tampons physiologiquement compatibles.

PROCEDE DE DETECTION D'UNE ALTERATION DE LA TRANSCRIPTION DU GENE ABC1 HUMAIN
L'invention a en outre pour objet des procédés pour déterminer si un sujet présente un risque pour le développement d'une pathologie liée à

un déficit dans le métabolisme du cholestérol tel que l'athérosclérose, particulièrement dans le transport du cholestérol, et plus particulièrement encore dans le transport inverse du cholestérol, tel qu'un risque de développement de la maladie de Tangier.

De telles méthodes comprennent la détection, dans des cellules d'un échantillon biologique provenant du sujet à tester, de la présence ou de l'absence d'une altération génétique caractérisée par une altération dans l'expression d'un gène dont l'expression est régulée par le promoteur de ABC1.

A titre illustratif, de telles altérations génétiques peuvent être détectées afin de déterminer l'existence d'une délétion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence d'un acide nucléique régulateur d'ABC1 de séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2, de l'addition d'un ou plusieurs nucléotides ou encore de la substitution d'un ou plusieurs nucléotiques dans ladite séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2.

Selon un mode particulier de réalisation d'un procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABC1 chez un sujet, l'altération génétique est identifiée selon une méthode comprenant le séquençage de tout ou partie de la séquence SEQ ID N 1, ou alternativement de tout ou partie d'au moins la séquence SEQ ID N 2.

Des amorces de séquençage peuvent être construites afin d'hybrider avec une région déterminée de la séquence SEQ ID N 1. De telles amorces de séquençage sont construites préférentiellement de manière à amplifier des fragments d'environ 250 à environ 300 nucléotides de la séquence SEQ ID N 1 ou d'une séquence complémentaire.

Les fragments amplifiés, par exemple par la méthode PCR, sont ensuite séquences et la séquence obtenue est comparée à la séquence de référence SEQ ID N 1 afin de déterminer si une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions de nucléotides sont retrouvées dans la séquence amplifiée à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique provenant du sujet testé.

L'invention concerne donc encore un procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABC1 chez un sujet, comportant les étapes suivantes : a) séquençage d'un fragment d'acide nucléique amplifiable à l'aide d'au moins une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2 selon l'invention; b) aligner la séquence obtenue en a) avec la séquence SEQ ID N 1 ou la SEQ ID N 2; c) déterminer la présence d'une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions d'au moins un nucléotide dans la séquence du fragment d'acide nucléique, par rapport à la séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2 de référence.

En outre, font également partie de l'invention des sondes oligonucléotidiques hybridant avec une région de la séquence SEQ ID N 1 ou de la séquence SEQ ID N 2 dans laquelle une altération dans la séquence a été déterminée lors de la mise en oeuvre du procédé de détection décrit ci-dessus.

De manière alternative, font aussi partie de l'invention des sondes oligonucléotidiques hybridant spécifiquement avec une région correspondante de la séquence SEQ ID N 1ou de la séquence SEQ ID N 2, pour laquelle une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions d'au moins un nucléotide a été déterminée chez un sujet.

De telles sondes oligonucléotidiques constituent des moyens de détection d'altérations dans la séquence régulatrice du gène ABC1 et donc également des moyens de détection d'une prédisposition au développement d'une pathologie liée à un déficit dans le métabolisme du cholestérol, telle que l'athérosclérose ou encore la maladie de Tangier.

L'invention a donc encore pour objet un kit ou nécessaire de détection d'une altération de la transcription du gène ABC1 chez un sujet, comprenant :

a) une ou plusieurs amorces hybridant avec une région de la séquence SEQ ID N 1 ou de la séquence SEQ ID N 2 ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification.

L'invention a encore pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABC1 chez un sujet, comprenant : a) une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques telles que définies ci-dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation.

Les fragments d'acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID N 1-8 sont donc utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique régulatrice du gène ABC1 ou encore d'un fragment ou d'un variant (contenant une mutation ou un polymorphisme) de cette dernière dans un échantillon.

Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 8 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 1-8, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur de 10,12, 15,18 ou 20 à 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000,1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un acide nucléique de séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 1-8.

Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15,18, 20,25, 35,40, 50,100, 200,500, 1000,1500 nucléotides consécutifs

d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N 1-8, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-avant, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID NO 1-8 ou avec une séquence complémentaire de ces derniers.

Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène ABC1 sont représentés ci-dessous.

Il s'agit par exemple du couple d'amorces représenté par l'amorce de séquence SEQ ID N 12 : 5'- TTG CCG TCG ACT GTT TTG GGT AGT TT-3' et l'amorce de séquence SEQ ID N 13 : 5'-GCC CTG TCG ACC GGC TCT GTT GGT G-3'.

Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EU N EP 0 707 592.

Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.

Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5bromodeoxyuridine, fluorescéine , acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.

Le marquage des sondes est réalisé de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.

Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (1988) ou Sanchez-pescador et al. (1988).

De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al. (1991) ou encore dans le brevet européen n EP-0 225 807 (CHIRON).

Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique.

Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.

Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.

En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ciavant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à:
1) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.

Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.

L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites cidessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.

Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.

Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.

Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit cidessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 1-5 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.

Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N 5,143,854, dans les demandes PCT N WO 90/150 70 et 92/10092.

Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N 5,412,087 et dans la demande PCT N WO 95/11995.

Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5, ou encore un variant de celui-ci.

Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5 ou un fragment ou un variant de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact l'échantillon, dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée, avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détecter des acides nucléiques amplifiés.

Pour mettre en #uvre le procédé d'amplification tel que défini cidessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-avant.

L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5 ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ;

b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.

Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.

L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples ci-après.

La figure 1 illustre une partie de la séquence SEQ ID N 3, et qui débute avec le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ ID N 3. La position de chacun des motifs caractéristiques de fixation a différents facteurs de transcription est représentée par des boîtes, la désignation du facteur de transcription spécifique de la séquence correspondante étant indiquée au-dessus de la séquence nucléotidique;
La figure 2A illustre de manière schématique la localisation des mutations au niveau de la région proximale du promoteur du gène ABC1;
La figure 2B illustre l'activité Luciférase dans les cellules RAW après transfection avec des constructions sauvages et mutées. Les résultats présentés montrent la moyenne de triplicatas. Les valeurs sont exprimées par rapport aux valeurs des constructions sauvages;
La figure 3 présente les résultats de la cotransfection des cellules RAW 264. 7 avec un plasmide sauvage (p200L) ou muté au niveau du site LXR (p200-LXRm) et d'un plasmide d'expression de la ss-galactosidase. Trois heures après la cotransfection, le milieu de culture est changé et remplacé par un milieu frais contenant 10% FCS. Seize heures après, les cellules sont lavées avec du PBS et remises dans un milieu DMEM contenant 0,1% de BSA, additionné de 50 g/ml de cholestérol, 2 g/ml 22 (R)-HOch, 10 M 9CRA, ou, 2g/m 22 (R)-HOch plus 10 M 9CRA pendant 24 heures. Les lysats cellulaires ont été analysés pour leur activité Luciférase et ss-

galactosidase. Les valeurs de luciférase sont normalisées par rapport aux valeurs de -galactosidase et exprimées en moyenne +/- SEM ;
La figure 4 présente les résultats de la cotransfection des cellules RAW 264. 7 avec un plasmide sauvage (p200L) ou muté au niveau du site de la boite E (p200-EBm) ou encore tronqué au niveau de la boite E (p200EBd) et d'un plasmide d'expression de la ss-galactosidase. 50 g/ml de cholestérol, 2 g/ml 22 (R)-HOch, 10 M9CRA, ou, 2 g/ml 22(R) -HOch plus 10 M 9CRA ont été ensuite ajoutés. Les lysates cellulaires ont été analysés pour leur activité Luciférase et ss-galactosidase.

La figure 5 présente les résultats obtenus par digestion d'un fragment marqué (-171 à-77 pb) d'un promoteur humain ABC1 avec différentes concentrations de DNAsel en présence (+) ou en absence (-) d'extrait nucléaire (NE). Les échelles G et G+A du séquençage Maxam et Gilbert d'un fragment marqué sont également représentées. La position relative du site d'initiation de la transcription et la localisation des sites Sp1, AP1, et EB sur le promoteur humain ABC1 sont indiqués sur la droite ;
La figure 6A illustre les sondes utilisées pour les retards sur gel . Le fragment A (100bp) qui comprend les motifs Sp1, AP1, et la boite E (EB). Le fragment EB (27pb) qui contient la boite E et le fragment EBm contenant la boite E mutée. Dans les panneaux B et C, les fragments marqués (fragments A, EB, ou EBm) utilisés pour les expériences de retard sur gel sont marqués en haut de chacun des gels. L'incubation de la sonde radiomarquée avec l'extrait nucléaire des cellules RAW est indiqué par le signe (+);
La figure 6B montre les essais de retard sur gel réalisés par incubation des extraits nucléaires des cellules RAW avec un fragment A radiomarqué (gauche), un fragment EB radiomarqué (milieu), ou un fragment radiomarqué EBm (droite) en présence ou en absence de compétiteurs spécifiques (fragments A, EB, ou EBm non marqués);

La figure 6C montre des analyses de retard sur gel des fragments A et EB avec des anticorps spécifiques des extrémités N et C terminales des facteurs USF1 et USF2. Les flèches indiquent la position du complexe formé par la sonde et la protéine, et les flèches suivies d'un astérisque indiquent la position du complexe avec l'anticorps retardé.

EXEMPLES: EXEMPLE 1 : Distributiontissulaire des transcrits du gène ABC1 selon l'invention
Le profil d'expression des polynucléotides selon la présente invention est déterminé selon les protocoles d'analyse de Northern blot et de transcription inverse couplée à la PCR décrits notamment par Sambrook et al (ref. CSH Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). " Molecular Cloning : A Laboratory Manual, " 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).

Par exemple, dans le cas d'une analyse par transcription inverse, un couple d'amorces synthétisées à partir de l'ADNc complet du gène humain ABC1 de séquence SEQ ID NO 10 est utilisé pour détecter l'ADNc correspondant.

La réaction de polymérase en chaîne (PCR) est réalisée sur des matrices d'ADNc correspondant à des ARNm polyA+ (Clontech) rétrotranscrits. La transcription inverse en ADNc est réalisée avec l'enzyme SUPERSCRIPT Il (GibcoBRL, Life Technologies) selon les conditions décrites par le fabricant.

La réaction de polymérase en chaîne est réalisée selon des conditions standard, dans 20 l de mélange réactionnel avec 25 ng de la préparation d'ADNc. Le mélange réactionnel est composé de 400 M de chacun des dNTP, de 2 unités de Thermus aquaticus (Taq) ADN polymérase (Ampli Taq Gold ; Perkin Elmer), de 0,5 M de chaque amorce, de 2,5 mM

MgCI2, et de tampon PCR. Trente quatre cycles de PCR ( dénaturation 30 s à 94 C, hybridation de 30 s décomposé comme suit lors des 34 cycles : 64 C 2 cycles, 61 C 2 cycles, 58 C 2 cycles et 55 C 28 cycles et une élongation d'une minute par kilobase à 72 C) sont réalisés après une première étape de dénaturation à 94 C durant 10 min dans un appareil thermocycler Perkin Elmer 9700. Les réactions de PCR sont visualisées sur gel d'agarose par électrophorèse. Les fragments d'ADNc obtenus peuvent être utilisés comme sondes pour une analyse par Northern blot et peuvent également être utilisés pour la détermination exacte de la séquence polynucléotidique.

Dans le cas d'une analyse par Northern Blot, une sonde d'ADNc produite comme décrit ci-dessus est marquée au 32P grâce au système de marquage d'ADN High Prime (Boehringer) selon les instructions indiquées par le fabricant. Après marquage, la sonde est purifiée sur une microcolonne de Sephadex G50 (Pharmacia) selon les instructions indiquées par le fabricant. La sonde marquée et purifiée est alors utilisée pour la détection de l'expression des ARNm dans différents tissus.

Le Northern blot contenant des échantillons d'ARN de différents tissus humains ((Multiple Tissue Northern , MTN, Clontech) Blot 2, référence 77759-1) est hybridé avec la sonde marquée.

. Le protocole suivi pour les hybridations et lavages peut être soit directement celui décrit par le fabricant (Manuel d'utilisation PT1200-1) soit une adaptation de ce protocole en utilisant les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (1999). On pourra ainsi faire varier par exemple les températures de préhybridation et d'hybridation en présence de formamide.

Par exemple on pourra utiliser le protocole suivant : 1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION: - Mélanger : 40 l ADN sperme de saumon (10mg/ml)

+ 40 l ADN placentaire humain (10mg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange.

- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.

- Ajouter le mélange des deux ADN dénaturés.

- Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.

2- Compétition de la sonde marquée : - Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 l ADN Cot I, selon la quantité de séquences répétées.

- Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C.

- Incuber à 65 C pendant 2 à 5 heures.

3- HYBRIDATION: - Oter le mix de pré-hybridation.

- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot @ dénaturée.

- Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation.

4-Lavages: - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.

- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1% à 65 C.

- 2 fois 15 minutes à 65 C SSC 1X et SDS 0,1% à 65 C.

Après hybridation et lavage, le blot est analysé après une nuit d'exposition au contact d'un écran au phosphore révélé à l'aide du Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

EXEMPLE 2 : Analyse du profil d'expression -génique pour la maladie de Tanaier
La vérification de l'altération du niveau d'expression du gène ABC1 entraînant le phénotype cellulaire de Tangier peut-être déterminé par hybridation de ces séquences avec des sondes correspondant aux ARNm provenant de fibroblastes de sujets atteints ou non de la maladie, selon les méthodes décrites ci-dessous : 1. Préparation des ARN totaux, des ARNm poly(A)+ et de sondes de cDNA
Les ARN totaux sont obtenus à partir de cultures cellulaires des fibroblastes de sujets normaux ou bien atteints de la maladie de Tangier par la méthode à l'isothiocyanate de guanidine(Chomczynski & Sacchi, 1987).

Les ARNm poly(A)+ sont obtenus par chromatographie d'affinité sur colonnes d'oligo(dT)-cellulose (Sambrook et al., 1989) et les cDNA utilisés comme sondes sont obtenus par RT-PCR (DeRisi et al., 1997) avec des

oligonucléotides marqués avec un produit fluorescent (Amersham Pharmacia Biotech ; CyDyeTM).

2. Hydridation et détection des niveaux d'expressions
Les membranes de verre contenant les séquences selon la présente invention correspondant au gène Tangier sont hydridées avec les sondes de cDNA, obtenues à partir des fibroblastes (Lyer et al., 1999).

L'utilisation du système Amersham/molecular Dynamics (Avalanche MicroscannerTM) permet la quantification des expressions des produits de séquences sur le type cellulaire sain ou affecté.

EXEMPLE 3 : Utilisation de macrophages THP-1 exprimant l'IL-1béta pour le criblage de molécules activant ou inhibant l'expression du gène ABC1.

Le principe de ce test est que toute substance modulant l'activité de synthèse de la protéine ABC1 a des répercussions sur la synthèse d'IL- 1 beta. a) Les cellules macrophagiques de la lignées THP-1, cellules humaines monocytic leukemia, sont un modèle de macrophages différenciés. Les cellules sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de sérum de veau foetal dans des plaques multipuits à la densité de 2 105 cellules par puits. b) Pour l'essai proprement dit, les cellules sont ensuite lavées et placés dans un milieu RPMI 1640 contenant 1 mg/ml d'albumine humaine purifiée fraction IV. c) Les produits sont ajoutés dans le milieu extracellulaire.

Simultanément, les cellules sont alors activées par ajout de lipopolysaccharide (LPS) durant 3 heures à 1 g/ml suivit par une incubation de 30 minutes en présence de ATP à 5 mmol/L.

d) Les concentrations en IL-1bêta et en contrôle l'IL-1 alpha, le tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) et l'IL-6 sont déterminées par des kits ELISA selon les instructions des fabricants (R&D Sytem ; IL-1 bêta humain Chemiluminescent ELISA référence QLBOO). Les variations en ARNm de l'IL-1 bêta qui n'est pas censé être affecté sont évaluées par la technique de Northern blot avec la sonde correspondante.

EXEMPLE 4: Expression d'un gène d'intérêt sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène ABC1 humain selon l'invention.

4. 1 Matériels et Méthodes 4.1.1 Construction des plasmides d'expression contenant un acide nucléique régulateur du gène ABC1humain.

La région de l'acide régulateur du gène ABC1 humain allant du nucléotide en position-995 jusqu'au nucléotide en position +120, par rapport au site d'initiation de la transcription, a été amplifiée par la technique PCR à l'aide du couple d'amorces suivant : Amorce aller S995 (SEQ ID N 12), de séquence 5'-TTG CCG TCG ACT GTT TTG GGT AGT TT-3' ; et Amorce retour +220R (SEQ ID N 13), de séquence 5'-GCC CTG TCG ACC GGC TCT GTT GGT-3', A partir d'ADN génomique humain présent dans un vecteur BAC d'une collection de vecteurs BAC humains.

Le fragment d'ADN amplifié est digéré par l'endonucléase de restriction Sal 1, puis inséré dans le vecteur PXP1 décrit par Nordeen et al. (1988, BioTechniques, 6: 454-457), au niveau du site de restriction Sal 1 de ce vecteur.

L'insert a ensuite été séquence.

4.1.2. Culture cellulaire et transfection Des cellules de la lignée Hepa1-6 (ATCC, Rockville, MD, USA) ont été mises en culture dans le milieu E-MEM (Minimum Essential Medium with Earle's Salts) additionné de 10% (v/v) de sérum de veau foetal (BioWhittaker, Walkersville, MD).

Approximativement 1,5 x 105 cellules ont été distribuées dans chacun des puits d'une plaque de culture de 12 puits (2,5 cm), et ont été cultivées jusqu'à environ 50-70% de confluence, puis co-transformées avec 1 g du plasmide Sal-Lucif et 0,5 g du vecteur témoin pBetagal (CloneTech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA) en utilisant le nécessaire Superfectin Reagent Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). Deux heures après l'addition de l'ADN, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu complet AMEM (Minimum Esential Medium Eagle's Alpha Modification).

Après une durée de vingt heures, les cellules sont placées dans du milieu frais de type DMEM (Dulbecco's Minimum Essential Medium) additionné de 2 g/ml de glutamine, 100 unités/ml de streptomycine et de 0,1% de sérumalbumine bovine (BSA, Fraction V), en présence ou non de 50 g/ml de cholestérol (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, MO, USA).

Les cellules sont récupérées 16 heures après le dernier changement de milieu en utilisant une solution de lyse (Lysis Solution) provenant du nécessaire Tropix Luciferase Assay Kit (Tropix Inc., Bedford, MA, USA).

Le lysat cellulaire est divisé en fractions aliquotes qui sont conservées à - 70 C.

Des fractions aliquotes fraîchement décongelées sont utilisées pour quantifier les protéines en utilisant le nécessaire MicroBCA Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) ainsi que pour quantifier la production de luciférase et de beta-galactosidase en utilisant respectivement les nécessaires Tropix Luciferase Assay Kit et Galacto-Light Plus Kit. Les tests sont réalisés selon les recommandations du fabricant.

4. 2 Résultats Les résultats sont représentés sur le Tableau 2 ci-dessous :

Tableau 2 : Production de luciférase par les cellules transfectées avec un vecteur contenant le gène de la luciférase placé sous le contrôle d'un acide régulateur du gène ABC1 humain selon l'invention, en présence ou en l'absence de cholestérol.

Conditions <SEP> de <SEP> Activité <SEP> Luciférase <SEP> Activité <SEP> Activité <SEP> Augmentation
<tb> culture <SEP> ss-galactosidase <SEP> normalisée <SEP> de <SEP> l'activité
<tb> Sans <SEP> 215 <SEP> 523 <SEP> +/- <SEP> 20 <SEP> 018 <SEP> 29 <SEP> 548 <SEP> +/-1342 <SEP> 7,29 <SEP>
<tb> Cholestérol
<tb> En <SEP> présence <SEP> de <SEP> 500 <SEP> 126 <SEP> +/- <SEP> 100 <SEP> 069 <SEP> 37 <SEP> 741 <SEP> +/- <SEP> 2813 <SEP> 13,25 <SEP> 1,82 <SEP>
<tb> cholestérol
<tb>
Les résultats ci-dessus montrent la capacité d'un acide régulateur du gène humain ABC1 selon l'invention à diriger l'expression d'une séquence codante placée sous son contrôle.

En outre, l'acide nucléique régulateur mis en #uvre, qui s'étend du nucléotide en position-995 au nucléotide en position +120, par rapport au site d'initiation de la transcription, et qui contient l'ensemble des sites PPARs identifiés, est régulé par le cholestérol.

EXEMPLE 5 : Caractérisation des motifs de fixation des facteurs de transcription au niveau du promoteur proximal du gène ABC1 humain.

5. 1 Matériels et Méthodes 5.1.1 Construction des plasmides comprenant le gène rapporteur de la Luciférase.

Les plasmides comprenant les fragments mutés SP1, AP1, E-box, LXR (MSP1; MAP1; MLXR ;MEbox), et les fragments dans lesquels la boite E a été supprimée (DEbox), ont été construits par mutagenèse dirigée par PCR en utilisant le plasmide PXP1 de-995 à +120 comme matrice (Previato et al., JBC, 1991,266: 18958-63). Les amorces qui sont listés ci-dessous ont été utilisées pour amplifier un fragment allant de-200 à +44pb du promoteur

humain du gène ABC1. Les lettres en majuscule représentent la séquence sauvage, alors que les lettres en minuscule représentent la séquence mutante (M).

MDistal SP1 F (SEQ ID NO: 14) 5'TCGCCCGTTTAgGcttgGGcgCCCGGCTC3' MDistal SP1 R: 5'GAGCCGGGcgCCcaagCcTAAACGGGCGA3' Mproximal SP1 F: (SEQ ID NO: 15) 5'CAGAGGCCGGGAgGcttgGGcgGGAGGGA3' Mproximal SP1 R: 5'TCCCTCCcgCCcaagCcTCCCGGCCTCTG3' MAP1 F: (SEQ ID NO: 16) 5'CGTGCTTTCTGCTGAGgatgcGAACTAC3' MAP1 R: 5'GTAGTTCgcatcCTCAGCAGAAAGCACG3' MEBoxF : (SEQ ID NO: 17) 5'CGGCTCCtcacggCTTTCTGCTGAGT3' MEBoxR : 5'ACTCAGCAGAAAGccgtgaGGAGCCG3' DEboxF : (SEQ ID NO: 18) 5'GCCTCCTTTCTGCTGAGTGACTGA3' DEboxR: 5'GAAAGGAGCCGGGGCCCGCCCCA3' MLXRF : (SEQ ID NO: 19) 5'CTTTGtgtGATAGTAAActaCTGCGCTCGGTGCA MLXRR 5'TGCACCGAGCGCAGtagTTACTATCacaCAAAG S224-Hindlll: (SEQ ID NO: 20) 5'ACTCCCAAGCTTTGTCGTGG3' 44-Hindlll: 5'GAGAAGCTTCGGCTCGGCTCTG3'
S224-Hindlll et 44-Hindlll sont les amorces en amont et en aval utilisées pour la PCR. Les sites Hindlll sont soulignés. Les fragments obtenus qui s'étendent de-200 à +44pb sur le gène ABC1 sont ligaturés dans le site Hindlll dans le plasmide PXP1 contenant le gène rapporteur de la Luciférase (Nordeen et al., Biotechniques, 1988,6:454-457). Toutes les constructions ont été confirmées par séquençage.

5.1.2 Culture cellulaire et transfection.

* Les lignées cellulaires murines de macrophage RAW 264. 7 et les cellules embryonnaires de reins 293 (American Type Culture Collection,
Rockville, MD) ont été cultivées dans un milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum foetal de veau (FCS). Des cellules à une concentration d'environ 1,5x105 ont été étalées sur des boites de 12 puits (Costar, Corning, NY), cultivées jusqu'à une confluence de 50-70%, et cotransfectées avec 1,5 g de plasmide Luciférase, et 0,5ug de vecteur p-

galactosidase (pCMVp; Clontech, Palo Alto, CA) en utilisant le Kit Superfectin (Qiagen, Valencia, VA). Trois heures après l'addition d'ADN, du milieu à 10% FCS a été rajouté aux cellules. Seize heures plus tard, les cellules sont lavées avec du tampon PBS et du milieu DMEM contenant 0.1 % de sérum albumine bovine (BSA) et soit 50 g/ml de cholesterol, 2pg/ml de 22-(R)-hydroxycholesterol (22(R)-Hch), 10 M d'acide 9-cis rétinoïque (9CRA), 10-100nM estradiol (Sigma, St Louis, MO), 10-100nM d'insuline (Sigma) ou 0,1% d'éthanol pendant 24 heures. Après récolte, 10 l d'extraits cellulaires sont utilisés pour réaliser les essais de Luciférase et de ssgalactosidase en utilisant respectivement le système d'essai Luciférase de Promega (Promega, Madison, WI) ou les kits Tropix Galacto-Light Plus (Tropix, Bedford MA). L'activité Luciférase est normalisée par rapport à l'activité de ss-galactosidase.

5. .3 Essais de retard sur gel.

Trois fragments d'ADN double brin du promoteur du gène ABC1 (fragment A qui s'étend de -171/-71pb; le fragment EB allant de -156/-130pb; et le fragment EBm allant de -156/-130pb) ont été marqués à leurs extrémités avec a32P-dATP en utilisant la polynucléotide kinase T4 (Lofstrand, Gaitherburg MD). Les extraits nucléaires sont isolés à partir des cellules RAW 264. 7 et HepG2 non stimulées, ainsi qu'à partir des cellules RAW 264. 7 après stimulation avec les mêmes concentrations de cholestérol et 22(R)-Hch (Paragon Bioservices Inc., Baltimore, MD). Un ng (10 000 cpm) d'une sonde marquée a été ajoutée à un extrait nucléaire de 2,5 g dans 20 l d'un tampon TRIS 20mM pour le retard sur gel (pH 7,9) contenant 60mM KCI, 0,2mM EDTA, 0,5mM DTT, 0,25mM PMS, 1,3 mM MgCl, 10% de glycérol, 3% de Ficoll, et 3 g d'un poly(dldC) (Previato et al., J Biol Chem, 1991,266:18958-18963) et incubé pendant 10 minutes sur glace suivie d'une incubation à température ambiante pendant 10 minutes. Le mélange

ainsi incubé est mis sur un gel de polyacrylamide à 6% dans un tampon TBE 0,25X, et migré par electrophorèse à 100V pendant 90 minutes, puis autoradiographié. Pour les essais de compétition, les extraits nucléaires sont préincubés pendant 10 minutes sur glace dans un mélange réactionnel de 20 l en présence ou en absence d'un excès de 100-200 fois d'un ADN double brin compétiteur pour Sp1 (-173/-155 pb), AP1 (-135/-155 pb), LXR (- 54/-69pb), et la boite E (-158/-136 pb) avant ajout de la sonde. Pour les essais de retard sur gel, les extraits nucléaires sont préincubés avec des anticorps dirigés contre les différentes protéines susceptibles de se fixer sur la boite E, tels que Mad1, Mad2, Mad3, Max, c-Myc, MyoD, USF1, et USF2, ainsi que Sp1, c-Fos, c-Jun, JunB, et JunD (Santa Cruz , Biotechnology, Santa Cruz, CA) sur de la glace pendant 30 minutes avant ajout de la sonde.

5.1.4 Essais de protection à la DNAse I.

Des fragments A marqués à l'extrémité sont digérés avec AspHl. Le fragment 94pb est purifié sur un gel TBE contenant 10% d'acrylamide (Novex) et ajouté à un extrait cellulaire RAW (5,2 g/ l de protéine) dans le tampon de retard sur gel (Exemple 5. 1.3) et incubé sur glace pendant 10 minutes. Un l de sonde (10 000 cpm) est ajouté au mélange sur glace pendant encore 10 minutes. Après 10 minutes à température ambiante, 20 l d'un tampon de digestion de la DNAsel (10mM Tris-HCI pH 8,5mM CaCl2, 5mM MgCl2) a été ajouté, 15 secondes après la DNAsel est ajoutée et incubée pendant 1min 45 secondes. Le tampon stop de la DNAse @ (10mM Tris-HCI pH8. 0, 0,6M d'acétate de sodium pH 7,0,5% SDS, 100mM EDTA) est ensuite ajouté. 2,Ou! de protéase K à 20mg/ml sont ajoutés et les échantillons sont mis à incuber à 37 C pendant 30 minutes. 10 l de 3M NaOAc et l d'ARNt (10mg/ml) sont ajoutés. Des extractions au phénol/chloroforme sont réalisées sur les échantillons et la phase aqueuse est précipitée dans 2,5 volumes d'éthanol à 100%. Après lavage à l'éthanol à 70%, les culots sont dissous dans le tampon du gel de séquençage, chauffés, et enfin mis à migrer sur le gel de séquençage à 8%. L'ADN nu est

digéré avec la DNAse 1 comme précédemment décrit, à l'exception du fait que l'on omet d'ajouter l'extrait nucléaire et de faire le traitement à la protéinase K. Le séquençage Maxam-Gilbert est ensuite réalisé comme décrit dans Current Protocols in Molecular Biology (Aubusel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994, 2:12.1-12.11).

5.1.5 Analyse par Western.

Les extraits cellulaires (35pg de protéine par piste) à partir des cellules RAW stimulées avec du cholestérol ou du 22-R-hydroxycholestérol sont chargés sur des gels en gradient NuPage Bis-Tris 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) et mis à migrer. Les protéines sont transférées sur des membranes Immobilon-P PVDF (Millipore Corp, Bedford, MA). Des anticorps (2mg/ml solution stock) (Santa Cruz , Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) et sont utilisés selon la description de la société Santa Cruz. Les anticorps anti-USF1 C20X (catalogue numéro sc-229X) est utilisé à la dilution de 1/600 et anti-USF2 C20X (catalogue numéro sc862X) et N18X (catalogue numéro sc861X) ont été utilisés à la dilution 1/1000.

5.2.1 Analyse des motifs de fixation sur le promoteur proximal du gène humain ABC1.

La détermination du rôle de certains des sites de liaison des facteurs de transcription tels que décrits ci-dessus sur le promoteur du gène ABC1 humain, à savoir, Sp1 (à-100pb, et à-166 pb), AP1 (à-131pb), LXR (à-69 pb) et la boite E (à-147 pb) est réalisée à l'aide des constructions contenant le gène rapporteur de la Luciférase sous le contrôle d'une séquence de-200pb du promoteur du gène ABC1, soit sauvage (p200-L) soit muté qui ont été produit selon l'exemple 5. 1.1. La figure 2A montre la localisation des mutations introduites dans la région du promoteur du gène ABC1.

L'effet des points de mutation sur l'activité de transcription du gène ABC1 dans des cellules non stimulées RAW est montré à la Figure 2B. La

mutation du site distal Sp1, du site AP1, et du site proximal Sp1 n'a qu'un faible effet sur l'activité du promoteur. Au contraire, la mutation de la boite E résulte en une augmentation forte et significative de l'activité du promoteur et la mutation de l'élément LXR résulte en une diminution forte significative de l'activité de promoteur. Ces résultats semblent indiquer la fixation d'un répresseur transcriptionnel sur la boite E du promoteur humain ABC1, et la fixation d'un activateur transcriptionnel sur le site LXR.

5. 2.2 Mutation de l'élément LXR aboutit à la réduction de la transcription du promoteur du gène ABC1 humain
La figure 3 montre que l'élément LXR est impliqué dans la réponse aux oxystérols du promoteur humain du gène ABC1. La mutation de l'élément LXR à-69 pb résulte en une diminution significative de la transcription dans les cellules non stimulées ainsi que dans les cellules stimulées par l'acide cis-rétinoique (CRA) et par le 22 (R)-hydroxycholestérol (220H). La mutation de l'élément LXR résulte en une diminution significative de la transcription des cellules stimulées par le cholestérol, qui s'explique par la conversion du cholestérol en oxystérols.

5. 2.3 La mutation de la boite E résulte en une augmentation de la transcription du gène humain ABC1
La figure 4 démontre que la mutation ou la suppression de la boite E résulte en une augmentation d'un facteur 3 environ, de la transcription du gène ABC1 dans des cellules non stimulées RAW et dans les cellules RAW stimulées avec du cholestérol (c), de l'acide cis rétinoique (CRA), et de l'oxystérol (220H) d'un facteur 40. De plus, la mutation ou la suppression de la boite E dans le promoteur proximal du gène ABC1 n'a aucun effet sur la stimulation par CRA ou 220H. Des résultats similaires sont obtenus avec des cellules 293 stimulées ou non. Ceci semble indiquer que l'activation via l'élément LXR de la transcription du gène ABC1 par CRA et 220H ne

nécessite pas la présence d'une boite E intacte, et confirme l'activité de répresseur de la boite E au niveau du gène ABC1.

5. 2.4 Fixation des facteurs de transcription sur la boite E du promoteur du gène humain ABC1
L'analyse d'empreinte à la DNAsel du promoteur proximal ABC1 montre la protection de la boite E en présence des extraits nucléaires RAW (Figure 5), indiquant la fixation de protéines dans cette région. Ceci est cohérent avec les effets transcriptionnels qui sont observés en mutant indépendamment les motifs Sp1 et AP1 (Figure 2B), puisque les empreintes à la DNAsel ne montre aucune protection de ces sites de liaison sur le promoteur du gène ABC1.

La fixation des facteurs de transcription nucléaires sur le motif de la boite E est montrée en réalisant une analyse de retard sur gel avec le promoteur ABC1 (Figure 6). La sonde utilisée dans le figure 6B (gauche) est un fragment double brin de 100pb allant de-171 à -71 pb sur le promoteur ABC1 (Fragment A). La figure 6B montre une expérience de retard sur gel réalisée après incubation d'une sonde marquée avec un extrait nucléaire isolé des cellules non stimulées RAW. Le retard est aboli lorsque soit le fragment A non marqué (A) ou un oligonucléotide double brin couvrant la boite E (EB) sont utilisés. La compétition avec un fragment de 27pb codant pour un boite E mutée (EBm) n'abolit pas le retard sur gel. La compétition avec des fragments d'ADN double brin couvrant soit les motifs proximal ou distal Sp1 ou les sites de liaison AP1 n'abolit pas le retard sur gel. Des résultats similaires sont observés lorsque des extraits cellulaires des cellules 293 non stimulées sont utilisés.

L'analyse de retard sur gel du promoteur ABC1 est également réalisée en utilisant une sonde double brin de 27pb couvant la boite E (Figure 6A ; EB ; ou une sonde alternative contenant la séquence de la boite E mutée telle que décrite précédemment (fragment EBm) . L'incubation de la sonde sauvage E-box avec un extrait nucléaire de

cellules non stimulées RAW résulte en un retard sur gel, indiquant que la fixation d'une protéine sur cette sonde (Figure 6B, milieu). L'ajout d'une molécule compétiteur de type sauvage non marquée supprime la fixation.

Par contre, la compétition avec un fragment muté de la boite E (EBm) n'affecte pas de manière significative la liaison avec la boite E sauvage. De plus, l'utilisation de la boite E mutée comme sonde cible pour la fixation des extraits cellulaires ne résulte pas en la formation d'une bande de retard sur gel (Figure 6B, droite). Ceci démontre donc bien la fixation spécifique d'une protéine sur le motif de la boite E du promoteur du gène ABC1 humain.

5. 2.5 Fixation du facteur USF sur la boite E du promoteur du gène ABC1
Au niveau du promoteur ABC1, la boite E est entourée par deux C, et présente donc la séquence CCACGTGC, qui correspond au motif consensus pour le facteur de transcription USF. Afin d'établir que le facteur USF est bien un facteur de transcription qui se lie sur la boite E au niveau du promoteur du gène ABC1 humain, des essais de retard sur gel sont réalisés à l'aide d'anticorps spécifiques de USF (Figure 6C). En utilisant un fragment de 100pb comme sonde (Figure 6C, panneau de gauche), des retards sur gel de la boite E en présence de protéines d'extrait nucléaire des cellules RAW ont été mis en évidence. Les anticorps anti-USF dirigés contre les extrémités C et N terminales des facteurs USF 1 et USF 2 ont causé un retard sur gel supplémentaire de la sonde retardée sur gel, confirmant ainsi que les protéines de liaison à la boite E correspondaient bien aux facteurs USF1 et USF2. Des anticorps dirigés contre d'autres protéines de liaison à la boite E telles que Mad1, Mad2, Mad3, Max, c-Myc, et MyoD, ainsi que Sp1, c-Jun, JunB, et JunD ne permettaient pas d'obtenir ce retard sur gel supplémentaire.

Des résultats similaires sont obtenus en préincubant un fragment double brin de 27pb couvrant la boite E (EB) avec des anticorps anti-USF (Figure 6C ; de droite). Comme pour l'expérience de retard sur gel d'un fragment de 100pb, les anticorps spécifiques d'autres membres de la

famille des facteurs de transcription Helix-Loop-Helix qui sont connus comme se liant également avec le motif de la boite E n'ont pas réussi à altérer le retard sur gel obtenu avec la sonde EB de 27pb. Aucune différence n'a été trouvée dans les profils de retard sur gel obtenus avec des extraits nucléaires isolés à partir des cellules non stimulées RAW et des cellules RAW stimulées avec du cholestérol ou des oxystérols mis à incuber avec la sonde EB.

Ces résultats identifient bien les facteurs USF1 et USF2 comme des facteurs de transcription qui se lient à la boite E présente sur le promoteur proximal du gène humain ABC1.

5. 2.6 Les facteurs USF1 et USF2 sont exprimés dans les cellules RAW.

La présence de USF dans les cellules RAW a été établi par des analyses d'hybridation Western blot en utilisant des anticorps spécifiques des extrémités C et N terminales des facteurs USF1 et USF2. Deux bandes principales immunoréactives à environ 43 et 44KDa ont été identifiées, l'expression desquelles n'est pas altérée par l'ajout de cholestérol ou d'oxystérols. L'expression d'une isoforme mini-USF de 18KDa dépourvue du domaine d'activation transcriptionnel C-terminal (Liu et al., JBC, 1999, 274 :35037-35045; Sirito et al., Nucl.Acids.Res., 1994,22:427-433) n'est détectée ni dans les cellules RAW non stimulées ni dans les cellules RAW incubées pendant 24 heures avec du cholestérol ou des oxystérols.

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Claims

REVENDICATIONS

1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

2. Acide nucléique selon la revendication 1, comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

3. Acide nucléique selon la revendication 1, comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N 3, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

4. Acide nucléique selon la revendication 1, comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N 4, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

5. Acide nucléique selon la revendication 1, comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N 5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

6. Acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5.

7. Acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5.

8. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7, capable de moduler la transcription d'un polynucléotide placé sous son contrôle.

9. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide comprenant une séquence allant du nucléotide en position-1 au nucléotide -200 par rapport au premier nucléotide transcrit, localisé en position 2894 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1.

10. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide comprenant une séquence allant du nucléotide en position-1 au nucléotide -300 par rapport au premier nucléotide transcrit, localisé en position 2894 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1.

11. Acide nucléique selon la revendication 8, comprenant un polynucléotide allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position - 600 par rapport au premier nucléotide transcrit, localisé en position 2894 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1.

12. Acide nucléique selon la revendication 8, comprenant un polynucléotide allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position -2894 par rapport au premier nucléotide transcrit, localisé en position 2894 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1.

13. Acide nucléique selon la revendication 8, comprenant un polynucléotide allant du nucléotide en position +120 au nucléotide en position-995 par rapport au premier nucléotide transcrit, localisé en position 2894 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1.

14. Acide nucléique selon la revendication 8, comprenant un polynucléotide allant du nucléotide en position +108 au nucléotide en position-2228 par rapport au premier nucléotide transcrit, localisé en position 2894 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1.

15. Acide nucléique selon la revendication 8, capable d'activer la transcription d'un polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.

16. Acide nucléique selon la revendication 8, capable d'inhiber la transcription d'un polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.

17. Acide nucléique comprenant : a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 16 ; b) un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt.

18. Acide nucléique selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'acide nucléique d'intérêt est un oligonucléotide de type sens ou antisens.

19. Vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 18.

20. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 18 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 19.

21. Mammifère transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou les cellules germinales ont été transformées par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 18 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 19.

22. Procédé pour le criblage d'une substance ou d'une molécule modulant la transcription du polynucléotide constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mettre en culture une cellule hôte transformée selon la revendication 20; b) incuber la cellule hôte transformée en présence de la substance ou molécule candidate ; c) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt; d) comparer les résultats de détection obtenus à l'étape c) avec les résultats de détection obtenus par mise en culture de la cellule hôte transformée en l'absence de la molécule ou substance candidate.

23. Kit ou nécessaire pour le criblage in vitro d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polypeptide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 17, comprenant : a) une cellule hôte transformée selon la revendication 20: b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection de la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 17.

24. Procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule modulant la transcription d'un polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide

nucléique selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) administrer la substance ou molécule candidate à un mammifère transgénique non humain selon la revendication 21; b) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt chez le mammifère transgénique tel que traité à l'étape a); c) comparer les résultats de détection de l'étape b) aux résultats observés chez un mammifère transgénique non humain selon la revendication 21 n'ayant pas reçu l'administration de la substance ou molécule candidate.

25. Kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 1 à 7, comprenant: a) un mammifère transgénique non humain selon la revendication 21; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection de la transcription dudit polynucléotide d'intérêt.

26. Substance ou molécule modulant la transcription d'un polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 17.

27. Substance ou molécule selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée selon le procédé de la revendication 22 ou de la revendication 24.

28. Composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, une substance ou une molécule selon l'une des revendications 26 ou 27.

29. Composition pharmaceutique selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement de l'hypercholestéromie ou de l'athérosclérose.

30. Substance ou molécule selon l'une des revendications 26 ou 27, en tant que principe actif d'un médicament.

31. Procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABC1 chez un sujet, comprenant les étapes suivantes: a) extraire l'ARN messager total à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester; b) quantifier l'ARN messager de ABC1 présent dans ledit matériel biologique : c) comparer la quantité d'ARN messager de ABC1 obtenue à l'étape b) avec la quantité d'ARN messager de ABC1 attendue chez un sujet normal.

32. Procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABC1 chez un sujet, comprenant les étapes suivantes: a) séquencer, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, un polynucléotide localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABC1; b) aligner la séquence nucléotidique obtenue en a) avec la séquence SEQ ID N 1; c) déterminer les différences nucléotidiques entre le polynucléotide séquence provenant du matériel biologique du sujet à tester et la séquence SEQ ID N 1 de référence.

33. Kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABC1 chez un sujet, comprenant les moyens nécessaires à quantifier l'ARN messager de ABC1 dans un matériel biologique provenant dudit sujet à tester.

34. Kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABC1 chez un sujet, comprenant les moyens nécessaires au séquençage d'un polynucléotide localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABC1 chez le sujet à tester.

35. Procédé de criblage d'une molécule ou substance modulant la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 17, comprenant les étapes suivantes:

a) incuber un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 17 ou un vecteur recombinant selon la revendication 19 avec une molécule ou substance candidate à tester; b) détecter le complexe formé entre la molécule ou substance candidate et la molécule ou la substance candidate.

36. Kit ou nécessaire pour le criblage d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 17 comprenant : a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 18 ou un vecteur recombinant selon la revendication 19; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe formé entre la molécule ou la substance candidate et ledit acide nucléique.