KR20020097242A - 에이비씨1 유전자에 대한 조절 핵산, 이의 활성을변형시키는 분자 및 치료 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아테롬성동맥경화증 같은 질환을 유발하는, 콜레스테롤 대사의 기능장애와 연관된 병리에 대한 원인 유전자인 ABC1 유전자의 전사를 조절할 수 있는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산의 조절하에 놓인, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 핵산을 포함하는 뉴클레오타이드 작제물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, ABC1 유전자 또는 전술한 뉴클레오타이드 작제물의 전사를 조절하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 형질전환 숙주세포 및 비-인간 트랜스제닉 포유동물, 및 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산의 활성을 변형시킬 수 있는 분자 또는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

에이비씨1 유전자에 대한 조절 핵산, 이의 활성을 변형시키는 분자 및 치료 용도{REGULATORY NUCLEIC ACID FOR THE ABC1 GENE, MOLECULES MODIFYING ITS ACTIVITY AND THERAPEUTIC USES}

고밀도 지방단백질(HDL)은 혈장내에서 순환하는 지방단백질의 주요 4가지 종류 중 하나이다.

이들 지방단백질은 예를 들면 지질 운반, 담즙산 형성, 스테로이드 생산과정 또는 세포 증식과 같은 다양한 대사 경로 및 혈장 단백질 분해효소 시스템을 방해하는 데 관여한다.

HDL은 완전히 유리된 콜레스테롤 수용체이고, 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질(CETP), 지방단백질 리파제(LPL), 간 리파제(HL) 및 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT)와 병행하여 담즙산 형성시 신체에서 콜레스테롤을 제거하기 위한 콜레스테롤 역수송, 즉, 말초 세포내 과량의 콜레스테롤을 간으로 운반하는 데 중요한 역할을 한다.

HDL은 일반적으로 말초 조직에서 간으로 콜레스테롤을 수송하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 증명되어 왔다.

탠지어병, HDL 결핍 및 LCAT 결핍을 포함하는 HDL 결핍과 연관된 각종 질환이 기술되었다.

탠지어병에 관여하는 결핍은 HDL의 분해를 유도하는 세포 콜레스테롤의 전좌에서의 세포 결함과 연관된다.

탠지어병에서, 이 세포 결함은 지방단백질 대사의 방해를 유도한다. 탠지어병에서의 HDL 입자는 말초 세포로부터 콜레스테롤을 취하지 않으며, 올바로 대사될수도 없고, 신속하게 신체에서 제거된다. 이러한 환자내 혈장 HDL 농도는 이에 따라 극히 감소하며, HDL은 더 이상 간으로의 콜레스테롤의 회귀에 기여하지 않는다. 이러한 말초 세포에 콜레스테롤이 축적되면 오렌지색 편도선의 형성과 같은 특징적인 임상적 표시를 유발한다. 또한, 트리글리세라이드의 과잉생산과 인지질의 합성 증가 및 세포내 이화작용과 같은 다른 지방단백질 붕괴가 일반적으로 관찰된다.

상기 기술된 것의 증후인 탠지어병은, 일반적으로 관상동맥 질환에 걸린 환자에서 검출되는 HDL의 대사에 관련된 잘 알려진 증상으로 분류된다.

HDL 콜레스테롤의 감소된 수준은 관상동맥 질환을 검출하는 데 유용한 위험 인자인 것으로 다수 연구가 증명하여 왔다.

이와 같은 맥락에서, HDL 결핍과 연관된 증후군은 지난 십 년간 관심이 증대되어 왔는데, 이는 아테롬성동맥경화증에서의 HDL 역할 이해를 증가시킬 수 있게 하기 때문이다.

apo A-1 유전자내 몇몇 돌연변이가 특징분석 되었다. 이러한 돌연변이는 드물고 apo A-1의 생산 부재를 유도할 수 있다.

지방단백질 리파제(LPL)를 암호화하는 유전자 또는 이의 활성자 apoC-Ⅱ의 돌연변이는 중증의 과트리글리세라이드혈증과, 실질적으로는 HDL-c의 감소된 수준과 관련된다.

레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT) 효소를 암호화하는 유전자의 돌연변이가 또한 중증 HDL 결핍과 관련된다.

또한, 콜레스테롤의 역수송 기능장애는, 저장된 콜레스테롤을 세포내 소포로부터 HDL에 의해 수용되는 막 표면으로 운반하기 위한 단계 중 적어도 하나에 영향을 주는 생리학적 결핍에 의해 유도될 수 있다.

최근에 와서, 전 게놈에 걸쳐 분포되며, 평균 10.3 cM 서로 떨어진 343 마이크로 부수체 마커의 각종 대립유전자형을 분리하는 연구가 수행되었다.

11대에 걸쳐 잘 특징분석된 가족에 대해 연관 연구를 수행하였으며, 이 가족 중 다수 구성원이 탠지어병에 걸렸고, 이 가족은 5 쌍의 근친 결혼을 포함한다.

이 연구는 질병과 통계학적으로 연관된 인간 9번 염색체의 9q31 좌위에 위치한 영역을 동정할 수 있게 하였다(Rust S. 등, Nature Genetics Vol.20, 1998년 9월, 96-98 페이지).

그러나, Rust 등의 연구는 폭넓은 영역의 게놈내 단지 탠지어병에 관련될 것 같은 손상만을 특징분석할 뿐이다. 이 연구는 해당 9q31-34 영역이 EST를 함유하나, 공지의 유전자는 함유하지 않는 것으로 단순히 기재하였다.

인간 염색체내 9q31 좌위에 있는 1 cM를 지나는 영역은 일반적으로 가족성 HDL 결핍과 관련 있음을 보여 주었다(Rust 등, 1999)

또한, 9q31 좌위의 1 cM 영역에 정확히 위치하는 ABC1 트랜스포터 계열의 단백질을 암호화하는 유전자는, 콜레스테롤의 역수송 결핍과 관련된 병리에 수반되는 것으로 나타났다.

예를 들면, 탠지어병을 앓는 환자에서와 같이, 콜레스테롤의 역수송이 병에 걸린 환자에서는 ABC-1 트랜스포터를 암호화하는 유전자가 돌연변이된 것으로 나타났다.

ABC("ATP-결합 카세트") 트랜스포터 단백질은 박테리아에서부터 인간에 이르기까지, 진화하는 동안에 매우 보존된 단백질 계열을 구성한다.

ABC 트랜스포터 단백질은 예를 들면, 이온, 아미노산, 펩타이드, 당, 비타민 또는 스테로이드 호르몬과 같은 각종 기질의 막 수송에 관여한다.

일부 ABC 트랜스포터의 완전한 아미노산 서열의 특징분석은, 이러한 단백질이 공통되는 일반적 구조, 예를 들면, A형 워커(Walker)와 B형 워커의 잔기를 갖는 2개의 뉴클레오타이드-결합 폴드(뉴클레오타이드 결합 폴드 또는 NBF) 및 6개의 나선으로 구성된 막 횡단 도메인으로 구성되는 2개의 막 횡단 도메인을 가짐을 결정지을 수 있게 하였다. 각종 수송되는 분자에 대한 ABC 트랜스포터의 특이성은 막 횡단 도메인의 구조에 의해 결정되는 것으로 보이고, 반면 수송 활성에 요구되는 에너지는 NBF 폴드에서 ATP가 분해됨으로써 제공된다.

인간에게서 동정된 몇개의 ABC 트랜스포터는 다양한 질환과 관련되어 있다.

예를 들면, 낭포성 섬유증은 CFTLR(낭포성 섬유증 막 횡단 컨덕턴스 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)) 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된다.

또한, 암 세포내 일부 다중-내약성 표현형은, ABC 트랜스포터 구조를 갖는 MDR(다중-내약성) 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이와 연관 있다.

다른 ABC 트랜스포터, 예를 들면, ABC-3 단백질은 뉴런 및 암 질병(미국 특허 제5,858,719호)과 관련되며, 또는 금속의 항상성 손상에 의해 유발되는 질환에 잠재적으로 관련된다.

마찬가지로, PFIC2로 언급되는 다른 ABC 트랜스포터는 가족성 간내 담즙분비정지의 진행형에 관여하는 것으로 보이는데, 이 단백질은 인간에서는 담즙염의 수송을 잠재적으로 담당한다.

1994년에, 신규의 마우스 ABC 트랜스포터를 암호화하는 cDNA가 동정되었으며, 이를 ABC1로 언급하였다(Luciani 등, 1994). 이 단백질은 매우 소수성인 세그먼트와 2개의 NBF 잔기에 연결된 2개의 막 횡단 도메인을 포함하는 대칭 구조를 가진다는 점에서 ABC 트랜스포터의 특징을 가진다.

인간에서, 인간 ABC1 트랜스포터의 전체 개방 판독 프레임을 포함하는 부분적 cDNA가 동정되었다(Langmann 등, 1999).

인간 ABC1 단백질을 암호화하는 유전자가 각종 조직, 더욱 구체적으로는 태반, 간, 폐, 부신 및 태아 조직에서 매우 높은 수준으로 발현됨이 증명되어 왔다.

이들 저자는 또한 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 시험관내에서 단핵구의 마크로파지로의 분화 동안에 유도됨을 증명하였다. 또한, ABC1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현은, 인간 마크로파지를 아실화 저밀도 지방단백질(AcLDL)의 존재하에 배양하였을 때 증가된다.

1999년 Rust S. 등, 1999년 Brooks-Wilson A. 등, 1999년 Bodzioch 등, 1999년 Ramaley A.등, 및 1999년 Marcil M. 등의 연구는 탠지어병 및 HDL 결핍(FDH; 가족성 HDL 결핍)을 앓고 있는 환자가 돌연변이된 ABC1 유전자를 가짐을 증명하였다. ABC1 유전자의 다양한 영역에 분포된 몇 개 돌연변이가 다양한 환자의 게놈, 예를 들면, 관상동맥 질환과 관련된 중증형 질환을 앓고 있는 환자에서 동정되었다. 또한, 경증 질환을 앓고 있는 환자에서는 ABC1 유전자의 엑손 및 인트론 모두에서 다양한 다형성이 발견되었는데, 이는 이러한 환자가 "야생형" 대립유전자와는 구별되는 유전자의 특이한 대립유전자를 가짐을 시사한다.

인간 ABC1 유전자의 발현이 세포 유형에 따라, 또는 소정의 세포 유형의 대사 상황에 따라 조절되는 것으로 보이긴 하나, 이 유전자를 조절할 수 있게 하는 서열은 알려지지 않았다.

따라서, 이러한 업계의 형편에서, 조절 서열을 동정하기 위한 요구가 존재하며, 이것의 두 가지 주요 이유는 하기와 같다:

a) 이러한 서열은 콜레스테롤 수송의 결핍과 연관된 병리를 앓는 환자, 예를 들면, 탠지어병을 앓는 환자 또는 이러한 병리 발병이 쉬운 환자에서 돌변변이되기 쉽다.

인간 ABC1 유전자의 조절 서열의 특징 규명은 일단, 환자내 돌연변이를 검출하게 하고, 예를 들면 또한 위험에 처한 가족군에 속한 개인을 진단할 수 있게 한다. 또한, 이러한 조절 서열의 분리는 유전자 치료와 같은 수단인, 표적 치료 수단의 작제를 통해, 진단된 돌연변이에 의해 유도되는 대사 기능장애를 극복할 수 있는 기능성 서열로 돌연변이 서열을 상보할 수 있게 한다.

b) ABC1 유전자의 조절 서열의 특징분석은 유전공학에 의해 당업자의 뜻대로 작제물을 만들수 있게 한 다음, ABC1 유전자가 발현되는 세포 유형에서 소정의 유전자를 발현시킬 수 있게 한다.

c) 또한, ABC1 유전자의 조절 서열의 일부는, 고 발현수준 구성 프로모터 서열을 구성할 수 있는데, 이는 이미 존재하는 수단의 세트를 완성하며 세포에서의 주어진 서열의 발현을 위한 신규 수단의 작제를 가능하게 한다.

현재까지는, 이러한 노력에도 불구하고, ABC1 유전자의 조절 서열은 완전히 미지의 상태로 남아있다.

본 발명자는 ABC1 유전자의 두 제 1 엑손(각각 엑손 1A 및 엑손 1B), 및 엑손 1A의 5'쪽에 위치하고, ABC1 유전자의 조절 시그널을 포함하는 대략 2.9 kb의 비전사 영역을 포함하는 게놈 DNA를 분리한 다음 서열분석했다.

본 발명은 아테롬성동맥경화증과 같은 질환을 유발하는, 콜레스테롤 대사의 기능장애와 연관된 병리에 대한 원인 유전자인 ABC1 유전자의 전사를 조절할 수 있는 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 또한 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산의 조절하에 배치된, 당해 폴리펩타이드 또는 당해 핵산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 포함하는 뉴클레오타이드 작제물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 ABC1 유전자의 전사를 조절하는 핵산 또는 상기 언급된 뉴클레오타이드 작제물을 포함하는 재조합 벡터, 형질전환된 숙주세포 및 비-인간 트랜스제닉 포유동물, 및 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산의 활성을 변형시킬 수 있는 분자 또는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 위험에 처한 개체에서 ABC1 유전자 전사에 있어서의 결함 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명의 주제는 또한 ABC1 유전자의 전사를 조절하는 핵산의 활성을 변형시키는 물질 또는 분자, 및 이러한 물질 또는 분자를 함유하는 약학 조성물에 관한것이다.

도 1:서열번호 3의 서열 중 일부를 나타내는데, 이는 서열번호 3 서열의 위치 1의 뉴클레오타이드에서 시작한다. 각종 전사 인자에 대한 특징적인 결합 잔기 각각의 위치를 박스로 나타내었고, 상응하는 서열에 특이적인 전사 벡터의 명칭을 뉴클레오타이드 서열 위에 표시하였다.

도 2a:인간 ABC1 유전자의 -200 bp 프로모터 영역으로 도입된 점 돌연변이의 위치를 나타내는 개략도이다.

도 2b:야생형 및 돌연변이형 작제물로 형질감염시킨 후, RAW 세포에서의 루시퍼라제 활성을 나타낸다. 제시된 데이터는 독립적인 3 형질감염 연구의 평균을 나타낸다. 수치는 야생형 작제물에 대해 상대적으로 표현하였다.

도 3:RAW 264.7 세포를 야생형 작제물(p200-L) 또는 돌연변이형 LXR 작제물(p200-LXRm)과 β-갈락토시다제 발현 플라스미드로 함께 형질감염시켰다. 형질감염 3시간 후, 세포에 10% FCS를 함유하는 신선한 배지를 다시 공급했다. 16시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 0.1% BSA를 함유하는 DMEM 배지로 교체한 다음, 24시간 동안, 50 ㎍/㎖ 콜레스테롤, 2 ㎍/㎖ 22(R)-HOch, 10 uM 9CRA 또는, 2 ㎍/㎖ 22(R)-HOch + 10 uM 9CRA를 첨가했다. 세포 용해물을 루시퍼라제 및 β-갈락토시다제 활성에 대해 분석하였다. 루시퍼라제 값은 β-갈락토시다제에 대해 정규화하고, 평균 ±SEM으로 표현하였다.

도 4:RAW 264.7 세포를 야생형 작제물(p200-L), 돌연변이형 E-box 작제물(p200-EBm) 또는 결실형 E-box 작제물(p200-EBd)과 β-갈락토시다제 활성 플라스미드로 형질감염시켰다. 50 ㎍/㎖ 콜레스테롤, 2 ㎍/㎖ 22(R)-HOch, 10 uM 9CRA 또는, 2 ㎍/㎖ 22(R)-HOch + 10 uM 9CRA를 첨가하였다. 세포 용해물을 루시퍼라제 및 β-갈락토시다제 활성에 대해 분석하였다. 루시퍼라제 값을 β-갈락토시다제에 대해 정규화하고, 평균 ±SEM으로 표현하였다.

도 5:인간 ABC1 프로모터의 방사능 표지 단편(-171 내지 -77 bp)을 RAW 세포 핵 추출물(NE)의 유(+)무(-)하에 DNase I의 상이한 농도로 분해시켰다. 방사능 표지 단편의 Maxam 및 Gilbert 서열로부터 G와 G+A 래더가 제시된다. 전사 개시 부위 및 Sp1의 위치, hABC1 프로모터내 AP1 및 EB 모티프에 관련된 뉴클레오타이드 위치가 오른쪽에 표시되어 있다.

도 6a:겔 쉬프트 분석에 사용되는 탐침을 나타낸다. 단편 A(100 bp)는 Sp1 과 AP1 및 E-box에 대한 결합 모티프를 포함한다. 단편 EB(27 bp)는 E-box를 함유하고, 단편 EBm(비도시)은 돌연변이된 E-box를 함유한다. B 및 C 패널에서는, 겔 쉬프트 연구에 사용되는 표지 단편(단편 A, EB 또는 EBm)이 각 겔의 꼭대기에 제시된다. RAW 세포 핵 추출물(NE)과 방사능 표지 탐침을 배양한 것은 (+)로 나타내었다.

도 6b:특이적 경쟁자(비표지 단편 A, EB 또는 EBm)의 유무하에 방사능 표지 단편 A(왼쪽), EB(중간) 또는 EBm(오른쪽)와 RAW 세포 핵 추출물(NE)을 배양함으로써 수행한 겔-쉬프트 분석을 보인다.

도 6c:단편 A 또는 EB를 USF1 및 USF2의 아미노(N) 또는 카복실(C) 말단에 특이적인 항체로 수퍼쉬프트 분석한 것을 나타낸다. 화살표는 단백질과 복합체를 이룬 탐침의 위치를 나타내며, 별표를 한 화살표는 항체로 수퍼쉬프팅된 복합체의 위치를 나타낸다.

일반적 정의

본 발명의 목적상, 용어 "분리된"은 본래 환경(천연적으로 위치한 환경)으로부터 추출된 생물학적 물질(핵산 또는 단백질)을 언급한다.

예를 들면, 식물이나 동물에 천연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오타이드는 분리된 것이 아니다. 식물이나 동물의 게놈에 천연적으로 삽입된 것 중 인접한 핵산으로부터 분리된 동일 폴리뉴클레오타이드는 "분리된" 것으로 간주된다.

이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함될 수 있고/또는 이러한 폴리뉴클레오타이드는 조성물에 포함될 수 있으며, 또한 벡터 또는 조성물이 천연 환경으로 구성되지 않기 때문에 분리된 상태로 남아있을 수도 있다.

용어 "정제된"은 다른 화합물의 존재를 배제하나, 완전히 정제된 형태로 물질이 존재하는 것을 요구하지는 않는다. 즉, 이는 상대적인 정의이다.

폴리뉴클레오타이드는 출발 물질의 정제 후에, 또는 천연 물질의 정제 후에, "정제된" 상태이며, 여기에서 불순물은 정제 전의 불순물의 양보다 적어도 1 오더정도 적은 양으로 정제된 후에 존재한다. 일 양태에서, 불순물은 정제 전의 불순물의 양보다 2 또는 3 오더 정도 적은 양으로 정제 후에 존재한다. 다른 양태에서, 불순물은 정제 전의 불순물의 양보다 4 또는 5 오더 정도 적은 양으로 정제 후에 존재한다.

본 명세서의 목적상, "뉴클레오타이드 서열"이라는 표현은 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산을 구분하지 않고 언급하는 데 사용할 수 있다. "뉴클레오타이드 서열"이라는 표현은 유전 물질 그 자체를 포함하며, 이에 따라 이의 서열과 관련되는 정보에 한정되지는 않는다.

용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 단일 사슬형 또는 2 사슬형을 구분하지 않고, RNA, DNA, 또는 cDNA 서열, 또는 일 이상의 뉴클레오타이드의 DNA/RNA 하이브리드 서열을 포함한다.

용어 "뉴클레오타이드"는 천연 뉴클레오타이드(A, T, G, C) 및 (1) 퓨린 유사체, (2) 피리미딘 유사체 또는 (3) 유사한 당과 같은 적어도 1 이상의 변형을 포함하는 변형 뉴클레오타이드를 모두 언급하며, 이러한 변형 뉴클레오타이드의 예는 PCT 출원 번호 WO/95/04 064에 기술되어 있다.

본 발명의 목적상, 제 1 폴리뉴클레오타이드는, 제 1 뉴클레오타이드의 각 염기가, 방향이 반대인 제 2 폴리뉴클레오타이드의 상보적 염기와 짝을 이룰 때 제2 폴리뉴클레오타이드와 "상보적인" 것으로 간주된다. 상보적 염기는 A와 T(또는 A와 U), 또는 C와 G이다.

본 발명에 따른 핵산의 "변이체"는 레퍼런스 폴리뉴클레오타이드의 관점에서 1 이상의 염기가 상이한 핵산을 의미하고자 할 것이다. 변이체 핵산은 천연적으로 발견되는 대립유전자 변이체와 같은 천연 기원일 수 있거나, 또는 예를 들면 돌연변이 유발 기술에 의해 수득된 비천연 변이체일 수도 있다.

일반적으로, 레퍼런스 핵산과 변이체 핵산 간의 차이는 적고, 레퍼런스 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 변이체 핵산의 뉴클레오타이드 서열은 매우 유사하며, 다수 영역에서는 동일하다. 변이체 핵산에 존재하는 뉴클레오타이드 변형은 사일런트일 수 있으며, 이는 이러한 변형이 상기 변이체 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열을 바꾸지 않음을 의미한다.

그러나, 변이체 핵산내 뉴클레오타이드 변화는, 레퍼런스 핵산에 의해 암호화된 펩타이드의 관점에서, 또한 변이체 핵산에 의해 암호화된 폴리뉴클레오타이드내 치환, 첨가, 결실을 초래할 수 있다. 암호화 영역에서의 첨가, 뉴클레오타이드 변형은 아미노산 서열에 있어서 보존적 또는 비보존적일 수 있는 치환을 일으킬 수 있으며.

예를 들면, 본 발명에 따르는 변이체 핵산은 다소 레퍼런스 핵산의 폴리펩타이드와 동일한 기능을 또는 생물학적 활성을 보존하는 폴리펩타이드를 암호화하거나, 또는 초기 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대한 항체에 의해 능력이 인지될 수 있다.

일부 변이체 핵산은 이에 따라 폴리펩타이드의 돌연변이형을 암호화할 것이며, 이의 체계적인 연구는 해당 단백질에 대한 구조-활성 관계를 추론할 수 있게 할 것이다. 연구된 질환에 관한 이러한 변이체 지식은, 병리의 분자적 원인을 이해할 수 있게 하기 때문에 기본이 된다.

본 발명에 따르는 레퍼런스 핵산의 "단편"은 레퍼런스 핵산의 뉴클레오타이드 서열보다 짧은 길이이며, 레퍼런스 핵산의 뉴클레오타이드 서열의 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 의미하고자 한다. 본 발명에 따르는 핵산의 이러한 "단편"은, 필요한 경우 레퍼런스 핵산과 상이한 제 2 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열에 포함될 수 있다. "단편"과 제 2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 생성되는 뉴클레오타이드는 레퍼런스 핵산의 뉴클레오타이드 서열보다 긴, 동일한 길이의, 또는 짧은 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 이러한 단편은 본 발명에 따르는 핵산의 20 내지 25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 또는 1500개 연속 뉴클레오타이드 범위 길이의 올리고뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 이들로 구성된다.

본 발명에 따르는 전사를 조절하는 핵산의 "생물학적으로 활성인 단편"은 이의 조절하에 배치된 DNA 서열의 전사를 변형시킬 수 있는 핵산을 의미하고자 한다. 이러한 생물학적으로 활성인 단편은 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 기본 프로모터 및/또는 조절 요소를 포함한다.

본 발명에 따르는 "조절 핵산"은 선택되어 이의 조절하에 배치된 DNA 서열의 발현을 활성화 및/또는 조절할 수 있는 핵산을 의미하고자 한다.

"프로모터"는 유전자의 전사를 개시하는 데 관여하는 세포의 단백질에 의해 인지되는 DNA 서열을 의미하고자 한다. 기본 프로모터는 이의 조절하에 배치된 소정의 DNA 서열의 전사를 개시할 수 있는 최소한의 조절 핵산이다. 일반적으로, 기본 프로모터는 전사 개시 부위의 게놈 DNA의 상류 영역을 구성하며, 여기에서 CAAT(1 이상의 전사 인자 단백질이 결합하는) 서열, 및 특정 하우스키핑 유전자와 같은 드문 경우를 제외하고는, TATA 서열 또는 "TATA 박스", 또는 관련 박스가 종종 발견된다. RNA 폴리머라제 및 "TATA" 박스 결합 단백질(또는 TBP)과 같은 1 이상의 전사 인자가 이 박스에 결합한다.

뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열의 관점에서, RNA 폴리머라제로 뉴클레오타이드 서열 전사의 개시를 조절하기 위한 방식으로 이 조절 핵산이 위치하였을 때 조절 핵산의 "조절하에 배치된다".

본 발명의 목적상, "조절 요소" 및 "조절 서열"은 다양한 전사 인자에 대한 결합 부위, 전사를 증가시키기 위한 "인핸서" 서열 또는 전사를 억제하기 위한 "사일런서" 서열과 같은, 기본 프로모터에 의해 개시된 전사를 변형시킬 수 있는 요소를 포함하는 핵산을 의미하고자 한다.

"인핸서" 서열은 조절 핵산내 포함되는 DNA 서열을 의미하고자 하며, 이는 기본 프로모터에 의해 개시되는 전사를 증가시키거나 자극할 수 있다.

"사일런서" 서열은 조절 핵산내 포함되는 DNA 서열을 의미하고자 하며, 이는 기본 프로모터에 의해 개시되는 전사를 감소시키거나 억제할 수 있다.

조절 요소는 전사 개시 부위의 5' 말단에 위치하는 서열의 외부에, 예를 들면, 암호화 서열에 포함되는 인트론 및 엑손에 존재할 수 있다.

용어 "기본 프로모터" 및 "조절 요소"는 이들이 이들의 조절하에 배치된 소정의 DNA 서열의 전사를 특정 세포내에서(예를 들면, 조직 특이성 세포와 같은), 즉, 특정 조직의 세포에서 예외적으로 또는 조직에 따라 상이한 전사 수준으로 허용하는 경우, "1 이상의 조직에 대해 특이적"일 수 있다.

"전사 인자"는 본 발명에 따른 조절 핵산의 조절 요소와 우선적으로 상호작용하는 단백질을 의미하고자 하며, 이는 전사를 자극하거나 또는, 정 반대로 억제한다. 일부 전사 인자는 단량체 형태에서 활성이며, 호모다이머 또는 헤테로다이머 형태에서 활성인 것도 있다.

용어 "변형"은 전사의 양성 조절(증가, 자극), 또는 전사의 음성 조절(감소, 억제, 방지)에 관한 것이다.

본 발명의 목적상, 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 두 서열 간 "동일성의 %"는 비교창을 통해 최적으로 배열된 두 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.

비교창에서의 뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드의 일부는 이에 따라 두 서열의 최적의 배치를 수득하도록 하는 방식으로 레퍼런스 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않는)의 관점에서 첨가 또는 결실(예를 들면 "갭")을 포함할 수 있다.

비교된 두 서열(핵산 또는 펩타이드)에 대해 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 관찰되는 위치의 수를 측정하고, 비교창내 위치의 총수를 두 염기 또는 아미노산 잔기 간의 동일성이 존재하는 위치의 수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 %를 수득함으로써 %를 계산한다.

비교를 위한 최적의 서열 배열은 company Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG), 575 Science Doctor, Madison, Wisconsin으로부터 패키지형의 공지 알고리듬의 도움하에 컴퓨터를 사용하여 수행할 수 있다.

설명하기 위해서, BLAST 소프트웨어(1996년 3월의 BLAST 1.4.9 버전, 1998년 2월의 BLAST 2.0.4 버전 및 1998년 9월의 BLAST 2.0.6 버전)의 도움으로, 예외적으로 디폴트 파라미터(S.F. Altschul 등, J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, S.F. Altschul 등, Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402)를 사용하여 서열 동일성의 %를 산출해낼 수 있을 것이다. BLAST는 Altschul 등의 알고리듬의 도움하에, 레퍼런스 "리퀘스트" 서열과 유사/상동한 서열을 검색한다. 사용되는 리퀘스트 서열 및 데이터베이스는 임의 조합이 가능한 펩타이드 또는 핵산형일 수 있다.

본 발명의 목적상, "고 엄격 하이브리드화 조건"은 하기 조건을 의미하고자 한다:

1- 막 경쟁 및 예비하이브리드화:

-혼합: 40 ㎕ 연어 정충 DNA(10 mg/㎖)

+ 40 ㎕ 인간 태반 DNA(10 mg/㎖)

-5분간 96℃에서 변성시킨 다음, 얼음에 혼합물 침지.

-2X SSC 완충제를 제거하고, 4 ㎖의 포름아미드 혼합물을 막을 함유하는 하이브리드화 튜브에 붓는다.

-두 변성된 DNA의 혼합물 첨가.

-42℃에서 5 내지 6시간 동안 회전시키며 배양.

2- 표지된 탐침 경쟁:

-10 내지 50 ㎕ Cot I DNA를 비특이적 하이브리드화의 양에 따라 표지되고 정제된 탐침에 첨가.

-7 내지 10분 동안 95℃에서 변성.

-65℃에서 2 내지 5시간 동안 배양.

3- 하이브리드화:

-예비하이브리드화 믹스 제거.

-40 ㎕ 연어 정충 DNA + 40 ㎕ 인간 태반 DNA를 혼합하고, 5분간 96℃에서 변성시킨 다음, 얼음에 침지.

-4 ㎖의 포름아미드 혼합물, 두 DNA의 혼합물 및 변성된 표지 탐침/Cot I DNA를 하이브리드화 튜브에 첨가.

-42℃에서 15 내지 20시간 동안 회전시키며 배양.

4- 세척:

-실온에서 2X SSC로 1회 세척하여 세정.

-실온에서 5분간 2회 2X SSC로 세척한 다음, 65℃에서 0.1% SDS로 세척.

-65℃에서 15분간 2회 1X SSC로 세척한 다음, 65℃에서 0.1% SDS로 세척.

Saranwrap으로 막을 싼 다음, 노출.

상기 기술된 하이브리드화 조건은, 고 엄격 조건하에서, 20 내지 수백 뉴클레오타이드까지 다양한 길이의 핵산 분자를 하이브리드화하는 데 사용한다.

상기 기술된 하이브리드화 조건은, 당업자에게 알려진 기술에 따라서, 하이브리드화를 원하는 핵산 길이의 함수로서 또는 선택된 표지의 유형의 함수로서 변용될 수 있다.

적당한 하이브리드화 조건은 예를 들면, Hames와 Higgins의 연구(1985) 또는 F. Ausubel 등(1999)의 연구에 내재된 교시에 따라 적용될 수 있다.

본 발명의 목적상, "형질전환"은 숙주세포로의 핵산 (또는 재조합 벡터)의 도입을 의미하고자 한다. 용어 "형질전환"은 또한, 세포의 유전자형이, 예를 들면, 재조합 폴리펩타이드형 또는 센스 또는 안티센스 핵산형인 외생성 핵산에 의해 변형되고, 이에 따라 형질전환된 이 세포가 외생성 핵산을 발현하는 상황을 포함한다.

본 발명의 목적상, "트랜스제닉 동물"은 1 이상의 세포가 당업자에게 잘 알려진 트랜스제닉 기술과 같이 인간에 의해 도입된 이종 핵산을 함유하는, 포유동물과 같은 비-인간 동물을 의미하고자 한다. 이종 핵산은 재조합 바이러스로 미세주사하거나 또는 감염시키는 것과 같은 유전자 조작에 의해 세포 또는 세포의 전구체에 직접적으로 또는 간접적으로 도입된다. 이종 핵산은 염색체에 통합될 수 있거나, 염색체 외적으로 복제하는 DNA 형태일 수 있다.

ABC1 유전자에 대한 조절 핵산

본 발명자는 인간 게놈 물질로부터 제조된 BAC형 벡터 라이브러리로부터 인간 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산을 분리하는 데 성공했다.

수행된 서열 분석에 따라, 가장 광범위한 방식으로 정의할 때, 본 발명자는ABC1 유전자의 전사를 조절하는 핵산이 5' 말단에서 3'말단 쪽으로 하기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어짐을 증명하였다:

ABC1 유전자 전사 개시 부위의 상류에 위치한 대략 2.9 kb의 비전사 영역;

ABC1 유전자의 제 1 엑손의 뉴클레오타이드 서열(또한 엑손 1A로 언급);

ABC1 유전자의 제 1 인트론의 부분적 뉴클레오타이드 서열(또한 인트론 1A로 언급); 및

인간 ABC1 유전자의 제 2 엑손의 뉴클레오타이드 서열(또한 엑손 1B로 언급);

ABC1 유전자의 제 2 인트론의 부분적 뉴클레오타이드 서열(또한 인트론 1B로 언급).

포괄적으로 정의하면, ABC1 유전자의 전사를 조절하는 핵산은 상기 정의한 뉴클레오타이드 영역 전체를 포함하며, 또한 이는 본 발명에 따른 서열번호 1의 서열과 동일하다.

우선적으로, ABC1 유전자의 전사 인자를 조절하는 핵산은 ABC1 유전자의 전사 개시 부위의 관점에서 뉴클레오타이드 -2228 내지 뉴클레오타이드 +108를 포함하는 뉴클레오타이드 영역 전체, 즉 서열번호 1 서열의 뉴클레오타이드 654 내지 3001으로 이루어진 영역을 포함한다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 주제는, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산, 또는 이의 상보 서열의 핵산으로 이루어진다.

ABC1 유전자의 전사 개시 부위의 상류에 위치하고, 전사를 위한 기본 프로모터 및 다중 조절 요소를 포함하는 대략 2.9 kb의 영역이 또한 본 발명에 따른 서열번호 3과 동일한 서열에 포함된다.

더욱 정확하게는, 서열번호 3의 서열 중 위치 1의 뉴클레오타이드는 ABC1 유전자의 전사 개시 부위의 관점에서 위치 -2893의 뉴클레오타이드이다.

두 번째 측면에 따라, 본 발명은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 핵산 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산, 또는 상보 서열의 핵산에 관한 것이다.

이미 상기에서 규정하였듯이, 5' 비전사 조절 영역 외에도, 서열번호 1 서열 의 ABC1 유전자의 전사를 조절하는 핵산은 또한 인간 ABC1 유전자의 제 1 엑손 및 제 1 인트론의 5' 부분을 포함한다.

ABC1 유전자의 제 1 엑손(또한 엑손 1A로 언급)은 서열번호 4의 서열로서 정의된다.

인트론 1a의 서열이 부분적으로 특징분석되었다. 인트론 1a의 5' 말단은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로서 정의된다. 인트론 1a의 3' 말단은 서열번호 7의 서열로서 정의된다.

인간 ABC1 유전자의 제 2 엑손(또한 엑손 1B로 언급)은 서열번호 5의 서열로서 정의된다.

세 번째 측면에 따라, 본 발명은 서열번호 3 내지 7의 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산, 또는 상보 서열의 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 일부 양태에서, 본 발명에 따르는 핵산은 분리형 및/또는 정제형일 것이다.

임의의 "생물학적으로 활성"인 상기 정의된 핵산의 단편 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 정의한 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 고 엄격 조건하에서, 본 발명에 따른 임의의 일 핵산과 하이브리드화하는 핵산을 포함한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산과 적어도 80%, 예를 들면, 90%, 95%, 또는 98%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.

서열번호 3 서열의 상세 분석

서열번호 1 서열의 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산에 포함되는 서열번호 3 서열의 핵산은 각각 도 1에 나타낸 "TATA" 박스 및 호메오박스인, 기본 프로모터의 구성 요소를 포함한다.

서열번호 3의 조절 서열은 또한 기본 프로모터의 활성을 양으로 또는 음으로 조절할 수 있는 다양한 전사 인자에 대한 다수의 결합 부위를 포함한다.

따라서, 본 발명자는 서열번호 3의 서열내 다양한 전사 인자에 대한 결합 부위의 특징을 이루는 각종 서열을 하기 설명된 방법으로 동정하였다.

서열번호 3의 서열을 레퍼런스 서열로서 사용하고, BLAST 2, 2.10 버전 소프트웨어의 알고리듬에 따라 처리하며, 몇몇 데이터베이스내 정리된 데이터와 비교한 다음, 서열번호 3 서열의 각종 특징 부위의 존재 및 위치, 예를 들면, 전사 인자에 대한 결합 부위를 당업자에 익히 공지된 방법으로 결정했다.

또한, 개시 부위의 1.3 kb 상류에서 상세 분석을 수행하였는데, 여기에서 전사 인자에 대한 결합 부위에 상응하는 총 1900 서열을 검색 제 1 단계 동안에 동정하였다. 상기 기술한 바와 같이 비교 및 필터링 한 후에, 27개의 상이한 전사 인자에 대해 특이적인 단 79개의 결합 부위가 남아있었다. 이러한 부위를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1은 본 발명에 따른 서열번호 3의 서열 중 3' 부분내 1318 nt에서 동정된 전사 인자에 대한 결합 부위를 나타낸다.

전사 인자에 대한 결합 부위의 각 시작 및 끝 뉴클레오타이드의 위치를, 도 1에서 나타낸 바와 같이 서열번호 3 서열의 뉴클레오타이드의 번호매김의 관점에서(+ 스트랜드) 또는 서열번호 3 서열의 상보 서열에 대한 뉴클레오타이드 번호매김의 관점에서(- 스트랜드) 언급하였다.

도 1은 서열번호 3의 서열 중 일부를 나타낸다. 도 1의 서열내 5' 부분에서 첫 번째 뉴클레오타이드는 또한 서열번호 1과 서열번호 3의 일 이상의 핵산 서열 중 5' 부분에서의 첫 번째 뉴클레오타이드이다. 도면에서, 전사 인자에 대한 결합 부위를 각각의 시작과 끝 위치를 한정하는 박스로 나타냈으며, 이들의 각각의 명칭은 각각의 상응하는 박스 위에 표시하였다. 도 1에 나타낸 서열의 뉴클레오타이드의 번호매김은 전사 개시 부위의 관점에서, 전사 개시 부위를 "+1"로, 뉴클레오타이드 +1에 대해 뉴클레오타이드 5'를 "-1"로 수행하였다.

도 1 및 표 1과 관련한 각 전사 인자에 대한 결합 부위의 특징의 설명을 당업자는 쉽게 발견할 수 있다. 이들 중 일부의 간단한 설명은 하기와 같다.

CAC 인자:CAC 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 예를 들면, Schuele 등의 논문(1988, Nature, Vol. 332: 87-90), EMBL 데이터베이스의 목록 번호 T00077, Mantovani 등의 논문(1988, Nucleic Acids Research Vol. 16: 4299-4313), Catala 등의 논문(1989, Nucleic Acid Research, Vol. 17: 3811-3827) 및 Wang 등의 논문(1993, Mol. Cell Biol., Vol, 13: 5691-5701)에서 찾아볼 수 있다. β-글로빈 유전자의 프로모터 및 감마-글로빈 유전자를 포함하는 몇몇 유전자의 조절 영역 상에서 이 인자의 결합이 나타났다. 이 인자는 글루코코르티코이드 수용체와 협력하여 작용하는 것으로 보인다.

C/EBP 인자:

C/EBP-α

C/EBP-α인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 예를 들면, Medline 데이터베이스내 하기 목록에 상응하는 논문에서 찾아볼 수 있다: 892020040, 94023981, 96194262, 96003748. 이 인자는 유전자의 발현 증가와 p21의 해독후 안정화 때문에 p21(WAF-1)의 수준을 증가시켜 세포 증식을 억제한다.

C/EBP-β

C/EBP-β인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 예를 들면, Medline 데이터베이스내 하기 목록에서 찾아볼 수 있다: 93315489, 91248826, 94193722, 93211931, 92390404, 90258863, 94088523, 90269225 및 96133958. 이는 면역 반응과 염증 반응에 관여하는 조절 유전자에 관여하는 전사 인자이다. 이는 IL-6 유전자내 IL-1 반응 요소에 특이적으로 결합한다. 이는 급성 염증과 조혈을 조절하는 역할을 하는 것으로 생각된다. 컨센서스 인지 부위는 하기와 같다: "T(T/G)NNGNAA(T/G)".

c-Myb 인자:

c-Myb 인자에 대한 결합 부위의 특징 분석은 Medline 데이터베이스내 하기 목록에서 찾아볼 수 있다: 91122626, 87092302, 93131991, 86261774, 92049347, 90044066, 90265605, 93101590, 94316485 및 90090611. 이 인자는 "YAAC(G/T)G" 서열을 특이적으로 인식한다. 이는 조혈 세포 전구체의 증식 및 분화를 조절하는 역할을 한다.

CP2 인자:

CP2 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 예를 들면, Kim 등의 논문(1990)인 Mol Cell Biol, Vol, 10: 5958-5966 및 Lim 등의 논문(1992)인 J. Biol. Chem. Vol. 268: 18008-18017에서 찾아볼 수 있다.

CTF 인자:

CTF 인자에 대한 결합 특징은 예를 들면, Medline 데이터베이스내 하기 목록에서 찾아볼 수 있다: 88319941, 91219459, 86140112, 87237877, 90174951,89282387, 90151633, 892618136, 86274639, 87064414, 89263791. CTF/NF-1 인자는 "TGGCANNNTGCCA" 회문 서열을 인지하는데, 이 서열은 바이러스 및 세포 프로모터 와 제 2형 아데노바이러스의 복제 기원에 존재한다. 이러한 단백질은 전사와 복제를 활성화할 수 있다. 이들은 호모다이머의 형태로 DNA에 결합한다.

E2A 인자:

E2A 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 예를 들면, Medline 데이터베이스내 하기 목록에 상응하는 문헌에서 찾아볼 수 있다: 91160969, 91331308, 91115096, 91117219, 90346284, 89168418, 90150281. 이 인자는 KAPPA 임뮤노글로불린 유전자 중 인핸서 요소의 KAPPA-E2 부위에 결합한다. 이는 ASH1 단백질과 헤테로다이머를 형성한다. 이는 나선-루프-나선형의 전사 인자 계열에 속한다.

GRα인자:

GRα인자에 대한 결합 부위의 특징 분석은 예를 들면, Medline 데이터베이스의 하기 목록에서 찾아볼 수 있다: 88264449, 93024441, 89091080, 90319784, 92020837, 90381775, 86298392, 91131612, 86092211, 86092206. 이는 진핵생물 유전자의 발현을 조절하는 데 관여하고 표적 기관의 증식과 분화에 영향을 주는 글루코코르티코이드 수용체이다. 이 인자는 "GRE"형의 표적 부위에 결합한다. 이는 3개의 도메인으로 이루어지며 호르몬 핵 수용체의 NR3 서브패밀리에 속한다.

LXR 인자:

LXR(간 X 수용체) 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 Apfel 등(Moll. Cell. Biol., 1994), Song 등(Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1994) 및 Willy등(Genes Dev., 1995)에 의해 기술되었다. 옥시스테롤은 LXR 요소의 생리학적 리간드이다(Janowski 등, Proc. Natl. Acda. Sci USA, 1999). 다른 수용체와 마찬가지로, LXL은 RXR(레티노이드 X 수용체)과 헤테로다이머를 이룬다. LXR 반응 요소는 본원에서 위치 -1729/-1714 및 -69/-55에서 동정되었다(도 1).

NF-EIC 인자:

NF-EIC 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 예를 들면, Medline 데이터베이스내 하기 목록에서 찾아볼 수 있다: 91266910, 91216113, 91334450, 91203899, 91029498 및 910655813. 이것은 T 세포 수용체의 α유전자와 β유전자의 인핸서 요소에 결합하는 전사 활성자다. 이는 컨센서스 서열 "AGATAG"에 결합한다. 이는 GATA형의 전사 인자 계열에 속한다.

HNF5 인자:

당업자는 이 전사 인자에 대해 예를 들면, Grange 등의 논문(1991, Nucleic Acids Res. Vol. 19: 131-139)을 참조할 수 있다.

HNF3B 인자:

당업자는 Overdier 등의 논문(1994, Mol. Cell Biol. Vol. 14: 2755-2766)을 유리하게 참조할 수 있다.

Nfkappa-B 인자:

당업자는 유리하게는 Medline 데이터베이스내 하기 목록에 사응하는 논문을 참조할 수 있다: 95369245, 91204058, 94280766, 89345587, 93024383, 88248039, 94173892, 91088538, 91239561, 91218850, 92390404, 90156535, 93377072,92097536, 93309429, 93267517, 92037544, 914266911, 91105848 및 95073993. Nfkappa-B 인자는 50-kDa 제 1 서브유닛과 65-kDa 제 2 서브유닛으로 구성되는 헤테로다이머이다. 두 헤테로다이머는 테트라머를 형성하기 쉽다. DNA와의 결합은 아연(Zn⁺⁺)의 존재에 달려있다. 이는 TNF, PKA 또는 PKC와 같은 다수 제제에 의해 유도될 수 있다. 이는 일반적으로는 감염, 염증 및 스트레스에 대한 반응에 관여하는 유전자의 조절자이다.

NFY 인자:

NFY 인자는 예를 들면, Swissprot 데이터베이스의 목록 번호 P25.208에 기술되어 있다. 이는 알부민과 β-액틴의 제 1형 콜라겐을 암호화하는 유전자의 그것과 같은 프로모터 서열에서 "CCAAT" 잔기를 인지하는 인자이다.

PEA3 인자:

당업자는 Medline 데이터베이스의 하기 목록에 상응하는 논문을 유리하게 참조할 수 있다: 90059931, 90309995, 90291989, 93181246 및 90384794. 이 전사 인자는 "AGGAAG"PEA3 잔기에 결합하며, 배 발생 동안에 조절 역할을 할 수 있다.

PEBP2 인자:

당업자는 Medline 데이터베이스내 하기 목록에 상응하는 논문을 유리하게 참조할 수 있다: 95199266, 94217721, 97188387, 97325753 및 95347606. 이 인자는 다수의 인핸서 및 프로모터 요소내 "PYGTYGGT" 부위에 결합한다.

TFⅡD 인자:

당업자는 하기 논문을 유리하게 참조할 수 있다: Fikes 등(1990, Nature, Vol. 346: 291-294), GILL 등(1992, Cell, Vol. 65: 333-340), Hoffmann 등(1990, Genes Dev. Vol. 4: 1141-1148). 이 인자는 RNA 폴리머라제 Ⅱ에 의해 전사되는 진핵생물 유전자를 활성화하는 데 중요한 역할을 한다. 이 인자는 전사 개시 부위에 근접 위치한 TATA 프로모터 요소에 특이적으로 결합한다.

T3R 인자:

당업자는 Medline 데이터베이스내 하기 목록에 상응하는 논문을 유리하게 참조할 수 있다: 92017776, 90242396, 87093752, 91212192. 이 인자는 트리아이오도티로신에 강한 친화성을 가진다. 이것은 3개의 도메인으로 구성되며, 호르몬 핵 수용체 계열에 속한다.

SIF 인자:

당업자는 Wagner 등의 논문(1990, EMBO J., Vol. 9: 4477-4784)을 참조할 수 있다. 이 인자는 c-fos 유전자의 발현을 활성화한다.

RAR 인자:

당업자는 Medline 데이터베이스내 하기 목록에 상응하는 논문을 유리하게 참조할 수 있다: 91216109, 92017791, 92127595, 91219411, 92103690, 93321869, 91092269, 91029504, 90242395, 91029504. 이 인자는 레틴산 수용체이다. 이 인자는 유전자 발현을 직접 조절함으로써 세포 기능을 조절한다. 이는 호르몬 핵 수용체 계열에 속한다.

PU 인자:

당업자는 Medline 데이터베이스내 하기 목록에 상응하는 논문을 유리하게 참조할 수 있다; 92107189, 93165739, 95317607, 92318913, 92275360, 93028372, 93206099, 90199884, 87257848 및 93275657. 이 인자는 "GAGGAA" 서열과 같이 퓨린-풍부 DNA 서열인 PU 박스에 결합하며, 이것은 림프구 세포에 특이적인 인핸서 요소로서 작용할 수 있다.

이는 마크로파지 또는 B 세포의 활성화 또는 분화에 특이적으로 관여할 수 있는 전사 활성화 인자이다.

AP1 부위:

AP1 전사 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 Medline 데이터베이스내 하기 목록에 상응하는 각종 논문에서 찾아볼 수 있다: 89125693, 89252809, 90318391, 91175677, 911458338, 89313776, 88217909, 911662, 91121514, 89017284, 88070595, 90097934, 88189275, 87301729, 88151062, 90291989, 91330875, 89051877 및 912119459. 이 인자는 "TGA(C/G)TCA"형의 인핸서 요소에 결합한다.

AP2 인자:

AP2 전사 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 예를 들면, Medline 데이터베이스내 하기 목록에 상응하는 문헌에서 찾아볼 수 있다: 90127451, 90174951 및 91009310.

이 인자는 특정 유전자의 전사를 자극하기 위하여 인핸서형 요소에 결합한다. 예를 들면, AP2 인자는 컨센서스 서열 "CCCCAGGC"에 결합한다.

CCAAT 인자:

CCAAT 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 Lum 등의 논문(1990, Mol Cell Biol. Vol. 10: 6709-6717) 및 EMBL 데이터베이스의 목록 번호 T00086에서 찾아볼 수 있다. 이 인자는 예를 들면, 인간 hsp70 유전자 프로모터 전사의 자극자인 것으로 보여진다.

GATA-1 인자:

GATA-1 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 예를 들면, Medline 데이터베이스내 하기 목록에서 찾아볼 수 있다: 91340773, 91093039, 91266910, 90114418, 89385992, 91268074, 89118131, 91224987, 89218991 및 91081330. 이는 적혈구 발생에서의 "스위치" 인자로 알려져 있다. 이는 적혈구 세포에서 발현된 글로빈 유전자 및 타 유전자의 조절 영역내 컨센서스 서열 "(A/T)GATA(A/G)"에 결합한다.

MyoD-Myf-3 인자:

MyoD-Myf-3 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 예를 들면, Rosenthal 등의 논문(1990, Nucleic Acids Res., Vol. 18: 6239)에서 찾아볼 수 있다. 이 전사 인자는 섬유아세포를 근원세포로 분화시키는 것을 유도하며, 근육 특이성 프로모터를 활성화하고 이와 상호작용하며, 단백질 꼬임에 의해 억제된다.

MYC/MAX 인자:

Nyc/MAC 인자에 대한 결합 부위의 특징분석은 예를 들면, Medline 데이터베이스내 하기 목록에서 찾아볼 수 있다: 94040733, 93101610, 92229468, 92112037, 93145325, 93026389, 93157390, 92366516, 93145324 및 91173288. 이 전사 인자는DNA에 비특이적으로 결합하기도 하고, CAC[GA]TG 서열을 인식함으로써 DNA에 특이적으로 결합하기도 한다. 이 인자는 성장과 관련된 유전자의 전사를 활성화하는 것으로 보인다.

HNF3 인자:

당업자는 Medline 데이터베이스내 하기 목록을 유리하게 참조할 수 있다: 91352065, 91032994, 92345837, 89160814, 91187609, 91160974, 91029477, 94301798 및 94218249. 이 전사 인자는 간의 다양한 유전자, 예를 들면, ATF, 알부민 및 티로신 아미노트랜스퍼라제 유전자의 활성자이며, 이러한 유전자에 관해 시스(cis)로 작용하는 조절 영역과 상호작용한다.

SRY 인자:

당업자는 Medline 데이터베이스내 하기 목록에 상응하는 논문을 유리하게 참조할 수 있다; 92132550, 95292338, 95112822, 93049201. 이 인자는 예를 들면, 수컷의 성 결정 개시를 담당한다.

Sp1 인자:

당업자는 Medline 데이터베이스내 하기 목록에 상응하는 논문을 유리하게 참조할 수 있다: 852707437, 89091123, 89039842, 89384647, 85061571, 88111565, 91224491, 91095025, 91357479, 91139365. 이 인자는 기능성 인지 부위를 함유하는 유전자로부터 메신저 RNA의 합성을 활성화하며; 세로토닌 수용체 유전자의 프로모터의 G/C 염기-풍부 잔기와 상호작용할 수 있다.

USF 인자:

USF 인자는 E-box 모티프(CACGTG)와 결합하고, 그 중에서도 특히 Myc, Mad1, Max, MyoD를 포함하는 전사 인자의 나선-루프-나선 계열에 속한다(Littlewood 등, Oxford University Press, New York, 1pp. 1998). 이것은 전사 인자로서 잘 확립된 역할을 가지긴 하지만(Ghosh 등, Oncogene, 1997, 14: 589-594), 일부 프로모터에서는, USF가 전사 억제자로서 작용할 수 있는 능력을 가지는 것이 자명하다. USF1은 USF를 발현하지 않는 입 반대쪽 외배엽을 제외한 모든 세포형에서 리테키누스 픽투스(Lytechinus pictus)의 LpS1 유전자의 발생 억제를 위해 중요한 것으로 증명되었다(Seid 등, J. Mol Biol, 1996, 264:7-19). USF1은 Xenopus MyoD 유전자의 자가활성화를 억제하며, Xenopus MyoD 유전자의 산물은 E-box에 결합하고(Lun 등, Cell Growth Differ., 1997, 8: 275-282) 또한 E-box 유사 모티프를 함유하는 제노바이오틱-반응 요소(XRE)에 결합하기 위한 자극성 AhR.Arnt 복합체와 경쟁함으로써 CYP1A1 유전자의 전사를 억제한다(Takahashi 등, J. Biol Chem, 1997, 272: 30025-30031). Carter 등은 USF1내 강력 활성화 도메인의 부재는 임뮤노글로불린 중쇄(IgH) 유전자의 전사 억제를 유도함을 증명하였다(Carter 등, Mol Cell Biol, 1997, 17: 18-23). E-box 활성을 없애는 USF2의 끝이 잘리고 스플라이싱된 변이체는 주 조직적합성 복합체 클래스 I(Howcroft 등, Mol Cell Biol(1999) 19: 4788-4797), ATPA(Breen 등, J Biol Chem, 1997, 272: 10528-10542) 및 프로스타글란딘 G/H 합성효소-2 유전자를 억제한다. Harris 등(J Biol Chem, 2000, 275: 28539-28548)은 FGF-BP 프로모터상의 AP-1과 E-box 간의 밀접한 근접성이 USF1, USF2 및AP-1 결합 단백질 간의 상호작용을 통해 전사 억제를 촉진하는 증거를 제공하였다. 뿐만 아니라, 인간 USF의 과잉발현은 쥐 테트라카시노마 F9 세포에서 AP-1 의존형 전사를 감소시키고(Pognonec 등, Oncogene, 1997, 14: 2091-2098), AP-1 인자, Fra2 및 CREB로 이루어지는 복합체에 대한 USF의 결합은 치킨 alphaA-결정질 유전자를 억제한다(Cvekl 등, 1994, Mol Cell Biol, 147363-7376). USF1과 USF2 호모다이머는 리보좀 RNA 유전자의 전사를 억제한다(Sirito 등, Gen Expr, 1992, 2: 231-240). USF 결합 모티프는 또한Protease Nexin-1(Erno 등, Mol Cell Neurosci, 1996, 8: 28-37)과 HLA-B(Gobin 등, J Immunol, 1999, 163: 1428-1434) 유전자의 프로모터에서 음성 조절 요소로서 작용함이 증명되어 왔다. 흥미롭게도, ABC1 처럼 지질 대사에 관여하는 아포지방단백질 CⅢ 또한, USF2에 의해 억제된다(Navantkasattusas 등, Mol Cell biol, 1994, 14: 7331-7339). 마지막으로, USF는 MCL-2v 유전자 및 리보좀 RNA 유전자 전사를 양으로 및 음으로 조절할 수 있다. 몇 가지 연구는, USF가 또한 TAF_Ⅱ55(Chiang 등, Science, 1995, 267: 531-536)와 같은 기본 인자 또는 USA(Meisterernst 등, Cell, 1991, 66: 981-993), PC5(Halle 등, J Biol Chem, 1995, 270: 21037-21311), c-Myc, Max(Harris 등), CREB 및 JunD(Cvekl 등)과 같은 유도 인자와 협동하는, 구족적으로 결합된 단백질로서 작용하여 전사 유도 또는 억제를 매개할 수 있음을 지적하였다. 따라서, USF는 유전자 전사를 활성화 또는 억제하는 기능을 할 수 있다.

어떠한 이론에도 구속되기를 원하지 않고, 본 출원인은 USF가 예를 들면, E-box에 결합하는 것에 대해, 전사 인자 활성자와 경쟁함으로써 유전자 전사를 억제할 수 있을거라 생각하였다(상기 인용된 Lun 등; Takagashi 등). 그러나, 본 출원인은 실시예 5에서, EBm(돌연변이된 E-box)와 EBdel(결실된 E-box) 작제물의 RAW 세포내 형질감염은 E-box가 매개하는 유전자 억제와 일치하는, ABC1 프로모터 활성을 감소시키기 보다는 증가시킴을 유도함을 증명하였다. 또한 상이한 E-box 결합 활성자에 특이적인 항체를 사용하는 겔 쉬프트 분석은 실패하였으며, E-box 모티프에 대한 결합을 증명하였다. 웨스턴 블롯 분석도 실시하였는데, 끝이 잘리고 스플라이싱된 USF2의 변이체는 전사활성화 도메인이 결여되었고(Liu 등, Sirito 등, Howcroft 등), 유전자 억제를 유도함이 증명되었다. 이러한 조건하에서는, 이러한 USF 변이체는 RAW 세포 또는 293 세포 핵 추출물에서 검출되지 않았다.

USF가 또한 DNA와 결합하는 전사 활성자와 특이적인 단백질-단백질 상호작용을 통해 억제자로 작용할 수 있기 때문에 E-box와 구별된다(상기 인용한 Harris 등, Pognonec 등, Cvekl 등). 전술하였듯이, 인간 ABC1 프로모터에서, E-box 모티프는 두 Sp1 부위 및 AP1 모티프에 의해 플랭킹되어 있다. Sp1과 AP1에 결합하는 전사 인자는 apoA-Ⅱ(Ribeiro 등, J Biol Chem, 265: 1216-1225), apoC-Ⅲ(Ogami 등, J. Biol Chem, 1990, 265: 9808-9815), 치킨 vitellogenin Ⅱ(Seal 등, Mol Cell Biol, 1991, 11: 2704-2717), 지방산 합성효소(Casado 등, J Biol Chem, 1999, 274: 2009-2013) 및 LDL 수용체(Sanchez 등, J Biol Chem, 1995, 270: 1161-1169)와 LDL 수용체 관련 단백질(LRP)(Gaeta 등, BBA, 1994, 1219: 307-313)을 포함하는 지질 대사에 관여하는 다른 유전자의 전사 조절에 영향을 줄 수 있음이 잘알려져 있다.

본 발명에 따른 조절 핵산의 바람직한 특징, 및 서열번호 1과 서열 번호 3의 서열에 포함되는 전사 개시 부위의 상류에 위치한 서열의 특징은, PPAR 단백질에 대한 추정 결합 부위의 특징인 8개 잔기의 존재이다. PPAR(또한, 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체)은 α,δ(β) 및 γ형일 수 있으며, 핵 수용체 유전자 계열의 서브패밀리를 형성한다. 모든 PPAR은 지방산과 이의 유도체에 의해 활성화된다. 예를 들면, α형 PPAR은 저지혈증 피브레이트에 결합하는 반면에, 항당뇨병성 글리타존은 감마형 PPAR에 대한 리간드이다. α형 PPAR의 활성화는 지질 산화의 자극, 지방단백질 대사의 결함 및 혈관 염증의 억제와 같은 다면 발현 효과를 유도한다. PPARα의 활성자는 간 흡수를 증가시키고, 지방산 수송 단백질과 아실-CoA 합성효소의 발현을 자극함으로써 유리 지방산의 에스테르화를 증가시킨다. 골격근과 심장에서, PPARα는 근육-특이성 카르니틴 팔미토일 트랜스퍼라제 I를 자극시켜, 지방산의 미토콘드리아 흡수 및 산화를 증가시킨다. 트리글리세라이드-풍부 지방단백질의 대사에 대한 피브레이트의 효과는 지방단백질 리파제의 자극 때문이고(이러한 자극은 PPARα에 좌우된다), 또한 아포지방단백질 C-Ⅲ의 억제 때문이며, HDL 형태의 혈장 콜레스테롤 증가는 아포지방단백질 A-I과 아포지방단백질 A-Ⅱ의 과잉발현에 좌우된다.

PPARα는 또한 아테롬성동맥경화증성 유착에서 발현된다. PPARα는 마크로파지내 유도성 질산 옥사이드를 억제하고, IL-1-유도성 사이클로옥시게나제-2와 IL-6 발현, 및 트롬빈-유도성 엔도텔린-1 발현을 방해하는데, 이는 핵 인자 NF-KAPPA B와 활성화 단백질-1의 시그널 경로 중 핵 인자의 음성 전사 조절의 결과이다.

PPARα의 활성화는 또한 단핵구 유래 마크로파지에서의 아폽토시스를 유도하는데, 아마도 NFKAPPA B의 활성을 억제함에 의한 것 같다. 따라서, PPARα활성자의 혈장 지질 프로파일에 대한 다면발현 효과는 아테롬성동맥경화증의 발병 억제에 확실히 참여한다. 피브레이트와 같은 PPARα활성자는 이들의 정상지혈증 활성 때문에 아테롬성동맥경화증의 발병을 억제한다.

본 발명에 따른 조절 핵산 상의 8개의 잠재적 PPAR 결합 부위(전사 개시 부위의 관점에서 시작 및 끝 뉴클레오타이드 위치는 각 부위에 대해: -1280-1276/-1270-1264, -889-883/-878-872, -584-578/-575-569 및 -366-360/-358-352[또한 도 1])의 존재는 시험관내에서 단핵구에서 마크로파지로 분화하는 동안에 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 유도되는 것에 따르는 관찰에 모순되지 않는다. 또한, 피브레이트에 의해 ABC1 유전자를 조절하는 전술한 관찰과도 모순되지 않는다. 이는 또한 인간 마크로파지가 아실화 저밀도 지방단백질(AcLDL)의 존재하에 배양될 때 ABC1 유전자의 발현이 증가되는 것을 증명하는 시험 결과와도 모순되지 않는다.

어떠한 이론에도 구속되지 않기를 원하며, 본 출원인은 본 발명에 따라 동정된 PPAR 결합 부위가, 서열번호 1 서열의 조절 핵산 상에서 ABC1 유전자의 조직 특이성 조절 및 세포 대사 상황의 특이적 조절에 고도로 관여하며, 또한 그 결과로, 적어도 4개, 예를 들면, (서열번호 1의 서열의) 적어도 5, 6, 7 또는 모든 8개의 PPAR 결합 부위(도 1)와 기본 프로모터 요소를 포함하는 조절 서열은, 간, 폐, 부신, 단핵구/마크로파지, 태반 또는 태아 조직에서 발현을 원하는 폴리뉴클레오타이드 또는, 콜레스테롤 대사와 관련하여 예를 들면, 세포 환경내 아실화 저밀도 지방단백질(AcLDL)의 존재와 같은 세포의 특이한 자극에 반응하여 발현을 원하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 조절 서열로서 유용하다고 생각한다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따르면 상기 정의한, 전술한 PPAR 부위 모두를 포함하는 인간 ABC1에 대한 조절 핵산이, 이의 조절하에 배치된 암호화 서열의 발현을 세포 환경내 콜레스테롤의 존재에 의존하는 방식으로 조절할 수 있음이 증명되었다. 결과는 하기 실시예 4에 제시된다.

상기 언급하였듯이, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 서열, 및 상보 서열의 핵산에 관한 것이다.

서열번호 1 및 서열번호 2의 서열의 1 이상의 "생물학적으로 활성인" 단편을 포함하는 핵산이 상기 정의에 포함된다. 당업자는 예를 들면, ABC1 유전자에 대한 조절 서열의 특징인 각종 잔기를 제시하는, 하기 표 1과 도 1을 참조하여 이러한 서열의 생물학적으로 활성인 단편을 쉽게 수득할 수 있다. 당업자는 이에 따라, 상응하는 폴리뉴클레오타이드 전체 또는 일부를 화학적으로 합성함으로써, 또는 원하는 DNA 단편, 서열 정보로부터 쉽게 찾을 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 1에 존재하는 제한 부위를 수득하기 위해 GCG 버전 9.1 모듈 맵과 같은 일반적인 제한 맵핑 소프트웨어의 도움으로 제한 엔도뉴클레아제를 사용함으로써 이러한 생물학적으로 활성인 단편을 수득할 수 있다.

제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 결정된 핵산 단편의 제조는 예를 들면, Sambrook 등(1989)의 연구에 기술되어 있다.

본 발명은 이에 따라 또한, 상기 정의된 핵산의 조절하에 배치된 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조절할 수 있는 핵산에 관한 것이다.

첫 번째 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 전사-조절 핵산의 생물학적으로 활성인 단편은, 서열번호 1에서의 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894 뉴클레오타이드에서 맨 처음으로 뉴클레오타이드가 전사된다고 할 때, 전사 개시 부위의 관점에서 위치 -1에서의 뉴클레오타이드부터 위치 -300에서의 뉴클레오타이드 범위의 기본 프로모터(TATA 박스 및 호메오박스)를 포함한다.

두 번째 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 전사-조절 핵산의 생물학적으로 활성인 단편은, 서열번호 1에서의 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894 뉴클레오타이드에서 맨 처음으로 뉴클레오타이드가 전사된다고 할 때, 전사 개시 부위의 관점에서 위치 -1에서의 뉴클레오타이드부터 위치 -600에서의 뉴클레오타이드 범위의 기본 프로모터와 근위 조절 인자를 포함한다.

세 번째 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 전사-조절 핵산의 생물학적으로 활성인 단편은, 기본 프로모터(코어 프로모터) 외에도 전사 인자, 즉, Sp1, AP1, LXR 및 E-box에 대한 결합 부위가 풍부한 ABC1 유전자 프로모터의 근위 200 bp를 포함하며, 이는 인간 ABC1 유전자 발현을 조절하는 데 관여할 것이다.

네 번째 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 전사-조절 핵산의 생물학적으로 활성인 단편은 또한 기본 프로모터(코어 프로모터)와 근위 조절 요소 외에도, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894 뉴클레오타이드에서 맨 처음으로 뉴클레오타이드가 전사된다고 할 때, 전사 개시 부위의 관점에서, 위치 -1에서의 뉴클레오타이드부터 위치 -2894에서의 뉴클레오타이드까지 뻗어있는 다양한 PPARα부위와 같은 다른 조절 서열을 포함한다.

다섯 번째 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 전사-조절 핵산의 생물학적으로 활성인 단편은 또한, 기본 프로모터(코어 프로모터) 및 근위 조절 요소 외에도, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894 뉴클레오타이드에서 맨 처음으로 뉴클레오타이드가 전사된다고 할 때, 전사 개시 부위의 관점에서, 위치 +120에서의 뉴클레오타이드부터 위치 -995에서의 뉴클레오타이드까지 뻗어있는 다양한 PPARα부위와 같은 다른 조절 요소를 포함한다.

여섯 번째 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 전사-조절 핵산의 생물학적으로 활성인 단편은 상기와 같은 서열번호 1의 서열 중 전사 개시 부위의 관점에서, 위치 +108에서의 뉴클레오타이드부터 위치 -2228에서의 뉴클레오타이드 범위의 영역을 포함한다.

엑손 1A와 1B 및 인트론 1A와 1B

본 출원인은 또한 ABC1 단백질을 암호화하는 인간 유전자의 전사 개시 부위의 하류에 위치한 뉴클레오타이드 서열과, 각각 상응하는 5' 말단에서 3' 말단까지, 엑손 1A, 인트론 1A, 엑손 1B 및 인트론 1B까지 동정하였다.

더욱 정확하게는, 221 뉴클레오타이드 길이인 엑손 1A는 서열번호 1 서열의 위치 2894에서의 뉴클레오타이드에서 시작하며, 서열번호 1 서열의 위치 3114에서의 뉴클레오타이드에서 끝난다. 엑손 1A는 서열번호 4로서 동정하였다.

109 뉴클레오타이드 길이인 엑손 1B는 서열번호 2 서열의 위치 100에서의 뉴클레오타이드에서 시작하고, 위치 258에서 끝난다. 엑손 1B는 서열번호 5로서 동정하였다.

인트론 1A는 부분적으로 서열분석 되었다. 인트론 1A의 5' 말단은 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 3115에서의 뉴클레오타이드에서 시작하며, 위치 3231에서의 뉴클레오타이드에서 끝나고, 또한 서열번호 6의 서열로서 정의된다. 인트론 1A의 3' 말단은 서열번호 2 뉴클레오타이드 서열의 위치 1에서의 뉴클레오타이드에서 시작하고, 위치 99에서의 뉴클레오타이드에서 끝나며, 서열번호 7의 서열로서 동정된다.

인트론 1B는 부분적으로 서열분석 되었다. 인트론 1B의 5' 말단은 서열번호 2 서열의 위치 259에서의 뉴클레오타이드에서 시작하고, 위치 357에서의 뉴클레오타이드에서 끝난다. 이 서열은 또한 서열번호 8의 서열로서 동정되었다.

엑손 1B는 인간 ABC1 유전자의 개방 판독 프레임의 개시부를 함유하며, ATG 코돈의 뉴클레오타이드 A가 서열번호 5 서열의 위치 94에서의 시작 위치에 위치한다. 엑손 1B는 서열번호 9 서열의 폴리펩타이드를 암호화한다.

엑손 1A와 1B, 및 인트론 1A와 1B는 ABC1 유전자의 발현을 조절할 수 있는 요소를 함유하는데, 예를 들면, 인핸서형의 요소 및/또는 사일런서형의 요소이다.

결과적으로, 본 발명에 따르는 전사-조절 핵산은 서열번호 1의 생물학적으로 활성인 단편 외에, 또한 뉴클레오타이드 단편, 또는 심지어는 서열번호 2 내지 서열번호 8의 서열 모두를 함유할 수 있다.

서열번호 1 내지 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 및 이들의 단편은 예를 들면, 샘플형의 ABC1 유전자의 적어도 1 카피의 존재를 검출하기 위한, 또는 ABC1 유전자의 조절 서열내 소정의 표적 서열을 증폭시키기 위한 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머로서 사용될 수 있다.

이에 따라 본 발명의 개체는 상기 정의된, 예를 들면, 서열번호 1 내지 서열번호 8의 서열 중 하나로부터 기원하는 핵산과 적어도 80%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산이다.

본 발명은 또한 고 엄격 조건하에 본 발명에 따르는 임의의 일 핵산, 예를 들면, 서열번호 1 내지 서열번호 8의 서열로부터 선택된 서열에서 기원하는 핵산과 하이브리드화하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 정의되고, 또한 이의 조절하에 배치된 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시킬 수 있는 것으로 추가로 특징지을 수 있는 핵산에 관한 것이다.

첫 번째 측면에 따르면, 이러한 핵산은 이의 조절하에 배치된 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 활성화할 수 있다.

두 번째 측면에 따르면, 본 발명에 따르는 조절 핵산은 이의 조절하에 배치된 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 억제할 수 있는 것으로 특징지을 수 있다.

예를 들면, 본 발명에 따르는 전사-조절 핵산은, 발현을 원하는 당해 폴리뉴클레오타이드에 대하여 적절히 위치하였을 때, 구조적으로 또는 유도적으로 당해폴리뉴클레오타이드의 전사를 허용할 것이다.

본 발명에 따르는 조절 핵산에 의해 개시되는 전사의 유도성은 예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 3 서열의 적어도 4 PPARα부위, 또는 적어도 5, 6, 7 PPARα부위 또는 8 PPARα부위와 같은 1 이상의 PPARα부위의 존재를 함유하는 하나 이상의 조절 요소에 의해 부여될 수 있다.

또한, 당해 폴리뉴클레오타이드의 조직 특이성 발현은, 예를 들면 간, 태반 세포 또는 마크로파지로부터의 세포와 같은 특정 범위의 세포에서 특이적으로 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 개시할 수 있는, 본 발명에 따르는 조절 핵산의 조절 하에 당해 폴리뉴클레오타이드를 배치함으로써 탐구할 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따르는 조절 핵산은 예를 들면, 인핸서 및 사일런서 요소와 같은 하나 이상의 "불연속" 조절 요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 조절 핵산은 도 1에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 잠재적인 전사 인자 결합 부위를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르는 조절 핵산은 또한 기본 프로모터, 즉, 전사 개시 부위의 관점에서 위치 -1에서의 뉴클레오타이드부터 위치 -300에서의 뉴클레오타이드까지 범위의 서열을 포함하지 않는 서열을 포함할 수 있다.

따라서 이러한 조절 핵산은 일반적으로 소위 "이종" 기본 프로모터, 즉, ABC1 유전자에 대한 조절 핵산으로부터 기원하지 않는 "TATA" 박스와 "호메오박스"를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 것이다.

예를 들면, 1 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 변형된서열번호 1의 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 전사-조절 핵산 또한 본 발명의 일부를 구성한다. 이러한 변형은 프로모터의 활성 또는 조절 요소의 활성을 증가시키거나 또는 반대로 감소시키는 것을 유발하여 전사 활성을 변형시킬 수 있다.

이러한 변형은 또한 프로모터 또는 조절 요소의 조직 특이성에 영향을 준다. 따라서, 예를 들면, 본 발명에 따르는 조절 핵산은 천연적으로 발현되는 조직 중 하나에서만 전사를 자극하기 위해 변형될 수 있다.

본 발명에 따르는 전사-조절 핵산은 또한 특이적 화합물, 예를 들면 주어진 치료 화합물에 의해 유도되는 부위를 서열에 생성시킴으로써 변형될 수 있고 유도될 수도 있다.

서열번호 1의 서열의 전체 또는 일부를 포함하고, 프로모터 또는 조절 요소를 포함하는 서열내 변형은 돌연변이 유발과 같은, 당업자에 익히 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 이어서, 변형 프로모터 또는 조절 요소의 활성을 예를 들면, 리포터 유전자의 상류에 변형된 프로모터를 클로닝하고, 생성되는 DNA 작제물을 숙주세포에 형질감염시킨 다음, 형질감염된 숙주세포내 리포터 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 시험할 수 있다. 변형된 프로모터 활성은 또한 트랜스제닉 동물에서 생체내 분석할 수 있다. 또한 변형된 단편의 라이브러리를 작제하는 것도 가능한데, 이는 예를 들면, 목적한 활성을 갖는 프로모터 또는 조절 요소만을 선별할 기능성 시험을 이용하여 스크리닝된다.

이러한 분석은 소정의 화합물, 예를 들면 항생물질에 대한 내성을 부여할 리포터 유전자의 사용을 기초로 할 수 있다. 조절 핵산/리포터 유전자 작제물을 갖고, 원하는 대로 변형된 프로모터 또는 조절 요소를 함유하는 세포를 선별한 다음, 이러한 작제물을 갖는 형질전환된 숙주세포를 소정의 화합물, 예를 들면, 소정의 항생물질의 존재하에 배양함으로써 분리할 수 있다.

리포터 유전자는 또한, 예를 들면 루시퍼라제와 같은 광학적으로 검출가능한 단백질처럼 임의의 쉽게 검출가능한 단백질을 암호화할 수 있다.

결과적으로, 본 발명의 개체는 또한 하기를 포함하는 핵산이다:

a) 상기 정의된 전사-조절 핵산; 및

b) 당해 폴리펩타이드 또는 핵산을 암호화하는 당해 폴리뉴클레오타이드.

첫 번째 측면에 따르면, 전사를 원하는 당해 폴리뉴클레오타이드는 단백질 또는 펩타이드를 암호화한다. 단백질은 예를 들면, 사이토카인, 구조 단백질, 수용체 또는 전사 인자를 포함하는 당해 치료 단백질과 같은 임의의 천연 단백질일 수 있다. 예를 들면 특정 조직, 예를 들면, 간, 마크로파지 또는 태반 세포에서 특이적으로 전사를 원하는 경우, 전사-조절 핵산은 서열번호 1 또는 서열번호 3 서열의 전사 개시 부위의 관점에서 위치 -1에서의 뉴클레오타이드부터 위치-1318에서의 뉴클레오타이드 범위의 핵산을 유리하게 포함할 것이다.

이러한 경우에, 당해 폴리뉴클레오타이드는 사이토카인 수용체, 또는 수퍼옥사이드 디스뮤타제와 같은 염증과 싸우는 데 관여하는 유전자를 암호화할 것이다. 항암 효과를 원하는 경우, 자극 횟수 및 소정의 암 항원에 대해 특이적인 세포독성 T 림프구의 활성화가 탐색될 것이다.

대안적으로는, 조절 핵산은 유리하게는 서열번호 1의 서열 중 전사 개시 부위의 관점에서, 위치 +108에서의 뉴클레오타이드부터 위치 -2228에서의 뉴클레오타이드 범위의 핵산을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명에 따르는 조절 핵산은 ABC1 단백질을 암호화하는 당해 폴리뉴클레오타이드와 병행하여 사용될 수 있다.

이미 언급한대로, 당해 폴리뉴클레오타이드는 또한 해독되면 바람직한 유전자의 억제에 특이적인 안티센스 핵산과 같은 핵산을 암호화할 수 있다.

다른 측면에 따르면, 조절 핵산에 의해 전사가 조절되는 당해 폴리뉴클레오타이드는, 검출가능한 단백질을 암호화하는 임의의 유전자와 같은 리포터 유전자이다.

예시한 리포터 유전자로서, 예를 들면, 루시퍼라제, β-갈락토시다제(Lacz) 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 유전자, 또는 항생물질과 같은 특정 화합물에 대해 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 임의의 유전자를 언급할 수 있다.

재조합 벡터

본 발명의 목적상, "벡터"는 일본쇄 또는 이본쇄 형태인 선형 또는 원형 RNA 또는 DNA 분자를 의미하고자 할 것이다.

첫 번째 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 재조합 벡터는 본 발명에 따르는 조절 핵산을 증폭시키는 데 사용되며, 이 조절 핵산은 원하는 숙주세포의 형질전환 또는 형질감염 후에 벡터에 삽입된다.

두 번째 양태에 따르면, 이들은 본 발명에 따르는 조절 핵산 외에도, 숙주세포 또는 소정의 다세포 유기체내에서 발현을 원하는 서열을 포함하는 발현 벡터이다.

유리한 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 재조합 벡터는 예를 들면, 하기 요소를 포함한다:

(1) 본 발명에 따르는 조절 핵산;

(2) 벡터로 삽입될 핵산에 포함되는 암호화 서열을 포함하는 당해 폴리뉴클레오타이드(여기에서 암호화 서열은 (1)에서 기술된 조절 시그널과 프레임내에 배치된다);

(3) 적당한 전사 개시 및 종결 서열.

또한, 본 발명에 따르는 재조합 벡터는 증폭 또는 발현을 원하는 숙주세포에 하나 이상의 복제 기원, 마커 또는 선별 마커를 포함할 수 있다.

실례로서, 박테리아 프로모터는 lacI 또는 LacZ, T3 또는 T7 박테리오파지 RNA 폴리머라제 프로모터, 또는 람다 파지 PR 또는 PL 프로모터일 수 있다.

진핵 세포에 대한 프로모터는 HSV 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터와 쥐 메탈로티오닌-L 프로모터를 포함할 수 있다.

일반적으로, 적당한 프로모터의 선택을 위해 당업자는 유리하게는 전술한 Sambrook 등(1989)의 연구 또는 Fuller 등(1996)이 설명한 기술을 참조할 수 있다.

ABC1 유전자의 게놈 서열의 발현을 원하는 경우, 예를 들면 큰 삽입 서열을 포함할 수 있는 벡터가 사용될 것이다. 이러한 특정 양태에서, 벡터 p158과 유사한 P1 박테리오파지 벡터 또는 Sternberg(1992, 1994)에 의해 기술된 p158/neo8과 같은 벡터가 예를 들면 사용될 것이다.

본 발명에 따르는 박테리아 벡터는 예를 들면, 벡터 pBR322(ATCC37017) 또는 pAA2233(Phamacia, Uppsala, Sweden)과 pGEMI(Promega Biotech, Madison, WI, USA)와 같은 벡터일 수 있다.

벡터 pQE70, pQE60, pQE9(Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(stratagene)과 같은 다른 시판 벡터도 언급될 수도 있다.

또한 이는 Nordeen SK 등(1988, BioTechniques, 6: 454-457)이 기술한 재조합 벡터 PXP1일 수 있다.

이들은 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)에서 유래하는 Sf9 계통의 세포를 형질감염하는 데 사용되는 벡터 pVL1392/1393(Pharmingen)과 같은 배큘로바이러스형의 벡터일 수도 있다.

이들은 또한, 제 2 또는 제 5형 인간 아데노 바이러스와 같은 아데노바이러스 벡터일 수도 있다.

본 발명에 따르는 재조합 벡터는 또한 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-수반 벡터(AAV)일 수 있다. 이러한 아데노-수반 벡터는 예를 들면, Flotte 등(1992), Samulski 등(1989), McLaughlin BA 등(1996)이 기술하였다.

본 발명에 따르는 조절 핵산의 조절하에 당해 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하기 위하여, 조절 서열과 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 숙주세포에 도입할 수 있다. 본 발명에 따르는 이러한 폴리뉴클레오타이드 작제물의 숙주세포로의 도입은, 세포를 형질전환 또는 형질감염하기 위한 당업자에게 익히 공지된 기술에 따라, 1차 배양균 또는 세포주 형태로 시험관 내에서 수행할 수 있다. 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드의 도입은 또한, 콜레스테롤 역수송의 결핍과 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위하여, 생체내, 또는 생체외에서 수행할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 숙주세포에 도입하기 위하여, 당업자는 칼슘 포스페이트 침전법(Graham 등, 1973, Chen 등, 1987), DEAE 덱스트란법(Gopal, 1985), 전기천공법(Tur-Kaspa, 1896; Potter 등, 1984), 직접 미세주사(Harland 등, 1985) 또는 DNA-로딩 리포좀법(Nicolau 등, 1982, Fraley 등, 1979)과 같은 각종 기술을 유리하게 참조할 수 있다.

일단 폴리뉴클레오타이드가 숙주세포로 도입되면, 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있다. 게놈내 특정 장소에서 상동성 재조합에 의해 통합되거나, 또는 무작위로 통합될 수 있다. 일부 양태에서는, 폴리뉴클레오타이드는 에피좀 단편의 형태로 숙주세포에서 안정하게 유지될 수 있는데, 에피좀은 나중에 세포 주기와 독립적으로 또는 세포 주기와 동시에 유지되거나 복제되게 하는 서열을 포함한다.

일 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 포유동물에서 기원하는 숙주세포와 같은 숙주세포로 생체내에서 도입하는 한 방법은, 본 발명에 따르는 약학적으로 적합한 벡터 및 본 발명에 따른 적당한 조절 서열의 조절하에 배치된 "네이키드" 폴리뉴클레오타이드를 예를 들면, 평활근 조직과 같은 선택된 조직으로 국소 주사함으로써 도입하는 것을 포함하는 제조법을 포함하며, "네이키드"폴리뉴클레오타이드는 이러한 조직의 세포에 의해 흡수된다.

"네이키드" 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 시험관내 및 생체내에서의 사용을 위한 조성물은 예를 들면, PCT 출원 번호 WO 95/11307(Pasteur Institute, Inserm, University of Ottawa)의 논문 및 Tacson 등의 논문(1996)과 Huygen 등의 논문(1996)에 기술되어 있다.

본 발명의 일 특정 양태에 따르면, 조성물은 당해 단백질을 제조하기 위해 생체내에 제공된다. 이 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 벡터 용액에 본 발명에 따르는 조절 서열의 조절하에 배치된 당해 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

선택된 숙주 유기체에 주사되는 벡터의 양은 주입되는 부위에 따라 다양하다. 표시하기 위해서, 대략 0.1 내지 대략 100 ug의 조절 서열/암호화 서열 폴리뉴클레오타이드 작제물을 동물의 신체로 주입할 수 있다.

ABC1 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임을 포함하는 서열의 전사를 조절하기 위하여, 폴리뉴클레오타이드 작제물(또는 벡터) 상에 본 발명에 따르는 조절 핵산이 위치하였을 때, 벡터를 콜레스테롤 역수송 결핍과 관련된 질환을 발병시킬 가능성이 있는 환자, 또는 이미 이 질환이 발병된 환자, 예를 들면, 탠지어병에 대한 소인을 가진 환자, 또는 이미 이 병이 발병된 환자의 신체로 주입할 수 있다.

결과적으로, 본 발명은 콜레스테롤 역수송 이상에 걸린 개체를 예방하거나, 또는 치료하기 위한, 하나 이상의 생리학적으로 적합한 부형제와 배합된, 본 발명에 따른 조절 서열 및 ABC1 단백질을 암호화하는 당해 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

유리하게는, 이러한 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열에 의해 정의된 조절 서열, 또는 이 조절 핵산의 생물학적으로 활성인 단편을 포함할 것이다.

본 발명의 주제는 또한 1 이상의 생리학적으로 적합한 부형제와 함께 상기 정의된 재조합 벡터를 포함하는 콜레스테롤 역수송 이상에 걸린 개체의 예방용 또는 치료용 약학 조성물이다.

본 발명은 또한 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방용, 예를 들면, 콜레스테롤 역수송 이상에 걸린 개체의 치료용 의약품을 제조하기 위한, ABC1 유전자에 대한 조절 핵산 및 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 작제물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방용, 예를 들면, 콜레스테롤 역수송 이상에 걸린 개체의 치료용 의약품을 제조하기 위한, 본 발명의 조절 핵산 외에, ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명에 따르는 재조합 벡터의 용도에 관한 것이다.

체세포 유전자 요법에 유용한 벡터 및 이러한 벡터를 함유하는 조성물

본 발명은 또한 콜레스테롤 수송과 연관된 병리 치료를 위한 새로운 치료적 접근에 관한 것이다. 본 발명은 유전자 요법에 의해, 본 발명에 따르는 조절 서열 외에, 콜레스테롤 수송 및 대사에 관여하는 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 생체내에 전달하고 발현시킴으로써 예를 들면, 콜레스테롤 수송과 연관된 병리의 치료 가능성을 증명함으로써 선행 기술의 결점에대한 유리한 해결책을 제안하였다. 본 발명은 또한 예를 들면, 아테롬성동맥경화증과 같은 관련 병리의 특이적이고 효과적인 치료를 허용하는 간단한 수단을 제공한다.

유전자 요법은 결손 또는 비정상(돌연변이, 이상 발현 등)을 바로잡거나, 또는 유전 정보를 감염된 세포 또는 기관으로 도입함으로써 당해 치료 단백질의 발현을 달성하는 것으로 이루어진다. 이러한 유전 정보는 생체외에서, 기관으로부터 추출된 세포로 도입된 다음, 이 변형 세포를 다시 체내로 도입할 수 있거나, 또는 적당한 조직에 생체내에서 직접 도입할 수 있다. 후자의 경우, 다양한 기술이 존재하는데, 다양한 형질감염 기술로는, DNA와 DEAE-덱스트란의 복합체(Pagano 등, J. Virol. 1(1967) 891), DNA와 핵 단백질의 복합체(Kaneda 등, Science 243(1989)375) 및 DNA와 지질의 복합체(Felgner 등, PNAS 84 (1987)7413), 리포좀의 사용(Fraley 등, J. Biol. Chem. 255(1980) 10431) 등이 있다. 좀더 최근에 와서는, 유전자 전달을 위한 바이러스 또는 벡터의 사용이 이러한 생리학적 형질감염 기술에 대안으로 가능한 것으로서 대두되었다. 이러한 관점에서, 특정 세포 집단을 감염시킬 수 있는 능력에 대해 다양한 바이러스가 시험되어 왔다. 예를 들면, 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS 등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노바이러스가 있다.

따라서 본 발명은 또한 콜레스테롤 수송과 연관된 병리의 치료를 위한 새로운 치료적 접근에 관한 것이며, 이는 본 발명에 따른 조절 핵산의 조절하에 배치된 ABC1을 암호화하는 유전자를 생체내에 전달하고, 발현시키는 것으로 이루어진다.본 출원인은 본 발명에 따른 조절 핵산과 콜레스테롤 대사에 관여하는 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 재조합 바이러스를 제조할 수 있고, 이 재조합 바이러스를 생체내에 적용할 수 있으며, 이 적용은 생물학적으로 활성인 ABC1 단백질의 생체내 발현을 세포 병리 효과 없이 안정하고 효과적으로 허용함을 유리하게 증명하였다.

아데노바이러스는 ABC1 유전자를 전달하고 발현하는 데 효율적인 벡터를 구성한다. 예를 들면, 벡터로서 재조합 아데노바이러스의 사용은 원하는 치료 효과를 산출하기에 충분히 높은 당해 유전자의 발현 수준을 수득할 수 있게 한다. 유전자를 안정하게 발현하게 하는 레트로바이러스 또는 아데노-수반 바이러스(AAV)와 같은 다른 바이러스 벡터 또한 청구된다.

본 발명은 따라서 콜레스테롤 수송의 이상과 연관된 심혈관 및 신경학적 병리의 치료 및 예방을 위한 새로운 접근을 제공한다.

본 발명의 주제는 따라서, 본 발명에 따르는 조절 핵산과 콜레스테롤 대사에 관여하는 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 결손 재조합 바이러스이다.

본 발명은 또한 심혈관 질환의 치료용 및/또는 예방용 약학 조성물을 제조하기 위한 이러한 결손 재조합 바이러스의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 일반적으로 상기 정의된 바와 같이 바이러스로 생체외에서 유전자 변형되는 세포, 또는 이러한 바이러스에 대한 생산자 세포의 용도에 관한 것이며, 이는 체내에 이식될 수 있고, 생물학적으로 활성인 ABC1 단백질의 오래 지속되고 효과적인 생체내 발현을 가능케 한다.

본 발명은 상기 정의된 조절 핵산의 조절하에, ABC1을 암호화하는 DNA 서열을 바이러스 벡터로 도입하는 것이 가능하며, 또한 이 벡터는 생물학적으로 활성인 성숙형을 효과적으로 발현시킬 수 있음을 보였다. 예를 들면, 본 발명은 ABC1의 생체내 발현을 아데노바이러스의 직접 적용 또는 생산자 세포 또는, 아데노바이러스로 유전자 변형된 세포 또는 이러한 DNA를 혼입한 레트로바이러스로 유전자 변형된 세포의 이식에 의해 수득할 수 있음을 보였다.

본 발명은 또한 ABC1 단백질의 발현이 정상적으로 간주되지 않는 기관에서 해로운 효과 없이 조절되는 이 ABC1의 발현을 유도할 수 있기 때문에 유리하다. 예를 들면, ABC1 단백질의 현저한 방출은 본 발명의 벡터를 생산하거나, 또는 본 발명의 벡터로 생체외에서 감염된 세포의 이식에 의해 수득할 수 있다.

본 발명과 관련하여 생산되는 콜레스테롤 트랜스포터 활성은 인간 또는 동물 ABC1형일 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용되는 핵산 서열은 cDNA, 게놈 DNA(gDNA), RNA(레트로바이러스의 경우) 또는 예를 들면, 1 이상의 인트론이 삽입된 cDNA로 이루어지는 하이브리드 작제물일 수 있다. 또한 합성 또는 반합성 서열일 수도 있다. 예를 들면, cDNA 또는 gDNA가 사용된다. 예를 들면, gDNA의 사용은 인간 세포에서 더 나은 발현을 허용한다. 본 발명에 따르는 바이러스 벡터에 이들을 도입하기 위해서, 이러한 서열은 예를 들면, 적당한 제한 부위를 삽입하기 위해 부위-지향성 돌연변이 유발에 의해 유리하게 변형된다. 선행 기술에서 기술된 서열은 사실 본 발명에 따르는 용도로 작제된 것이 아니며, 실질적인 발현을 달성하기위해서는 사전 조정이 필요한 것으로 증명될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 사용이 일례이다. 또한, 이러한 ABC1 단백질의 유도체를 암호화하는 작제물을 사용하는 것도 가능하다. 이러한 ABC1 단백질의 유도체는 예를 들면, 네이티브 서열의 관점에서 돌연변이, 결실 및/또는 첨가에 의해 수득될 수 있고, 또한 콜레스테롤 트랜스포터 활성을 지니는 산물을 암호화하는 임의의 서열을 포함한다. 이러한 변형은 당업자에 공지된 기술을 이용하여 수행할 수 있다(하기 일반 분자 생물학 기술 참조). 따라서, 유도체의 생물학적 활성은, 나타낸 바와 같이, 예를 들면 세포로부터 콜레스테롤 유출의 측정을 설명하는 실시예에서 쉽게 측정될 수 있다. 본 발명의 목적상, 유도체는 이러한 서열의 단편 또는 네이티브 서열을 탐침으로서 사용하여, 핵산 라이브러리를 사용하는 하이브리드화에 의해 수득할 수 있다.

이들 유도체는 예를 들면, 자신의 결합 부위에 강한 친화성을 갖는 분자, 프로테아제에 좀더 큰 내성을 갖는 분자, 또는 좀더 큰 치료 효능 또는 적은 부작용을 가지며, 또는 임의로는 새로운 생물학적 특성을 갖는 분자이다. 유도체는 또한 생체내에서 향상된 발현을 허용하는 변형된 DNA 서열을 포함한다.

첫 번째 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 조절 서열과 콜레스테롤 수송 및 대사에 관여하는 ABC1 단백질을 암호화하는 cDNA 서열을 포함하는 결손 재조합 바이러스에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태에서, DNA 서열은 gDNA 서열이다. ABC1 단백질을 암호화하고, 본 발명에 따른 벡터에 사용될 수 있는 cDNA 유전자는 유리하게는 서열번호 10의 서열이다.

본 발명의 벡터는 다양한 유형의 바이러스로부터 제조할 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스(AAV), 허피스 바이러스(HSV) 또는 레트로바이러스에서 유래한 벡터를 사용한다. 또한, 이식을 위한 세포 또는 생산자 세포 이식을 위한 레트로바이러스를 직접 투여하거나 또는 생체외에서 변형시키기 위해 아데노바이러스를 사용하는 것이 유리하다.

본 발명에 따르는 바이러스는 결손형인데, 즉, 표적 세포에서 자가 복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명과 관련하여 사용되는 결손 바이러스의 게놈은 따라서 감염된 세포내에서 상기 바이러스의 복제를 위해 요구되는 최소한의 서열이 결여되어 있다. 이러한 영역은 제거(전부 또는 부분적으로)하거나, 비기능적으로 만들거나 또는 다른 서열로, 예를 들면, ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로 치환할 수 있다. 예를 들면, 그러나, 결손 바이러스는 바이러스 입자의 캡시드화에 요구되는 게놈내 서열을 보존한다.

아데노바이러스의 관점에서, 구조와 특성이 다소 다양한 다양한 혈청형이 특징분석 되었다. 예를 들면, 본 발명과 관련하여, 이러한 혈청형으로는, 제 2 및 제 5형 인간 아데노노바이러스(Ad 2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(출원 WO 94/26914 참조)를 사용할 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스로는, 개, 소, 쥐(예: Mav1, Beard 등, Virolory 75(1990)81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이(예: SAV) 기원을 언급할 수 있다. 예를 들면, 동물 기원의 아데노바이러스는 CAV 2 아데노바이러스[예를 들면, 맨해튼 또는 A26/61 스트레인(ATCC VR-800)]와 같은 개 아데노바이러스일 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서는, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 결손 아데노바이러스는 또한 ITR을 포함할 수 있는데, 이 ITR은 본 발명에 따른 핵산의 조절하에 배치된 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 캡시드화할 수 있게 한다. 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 아데노바이러스의 게놈내, E1 영역은 적어도 비기능이 된다. 다른 양태에서, 본 발명의 아데노바이러스의 게놈내 E1 유전자 및 적어도 하나의 E2, E4 및 L1-15는 비기능성이다. 고려하의 바이러스 유전자는 당업자에 공지된 기술로 비기능성으로 만들 수 있으며, 그러한 기술은 예를 들면, 고려하의 유전자의 하나 이상의 염기의 완전 제거, 치환, 부분 결실, 또는 첨가이다. 이러한 변형은 또한 예를 들면, 유전공학 기술 또는 돌연변이 유발제로의 처리에 의해, 시험관내(분리된 DNA 상에서) 또는 현장(in situ)에서 수득할 수 있다. 다른 영역 또한 변형될 수 있는데, 예를 들면, E3 영역(WO 95/02697), E2(WO 94/28938), E4(WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) 및 L5(WO 95/02697)이 있다. 일 양태에 따르면, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 E1 및 E4 영역의 결실을 포함하며, ABC1을 암호화하는 서열은 불활성화된 E1 영역에 삽입된다. 다른 양태에 따르면, 이는 E1 영역에서의 결실을 포함하며, 이는 ABC1을 암호화하는 서열과 E4 영역에 삽입된다(프랑스 특허 출원 FR 94 13355).

본 발명에 따르는 결손 재조합 아데노바이러스는 당업자에 공지된 임의 기술로 제조할 수 있다(Levrero 등, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). 예를 들면, 이들은 아데노바이러스와 특히, ABC1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 운반하는 플라스미드 간의 상동 재조합에 의해 제조할 수 있다. 상동 재조합은 예를 들면, 아데노바이러스와 플라스미드를 적당한 세포주 중으로 함께 형질감염시킨 후에 일어난다. 사용된 세포주는 예를 들면, (i)상기 요소에 의해 형질전환 가능해야 하고, (ii)재조합 위험을 피하기 위해 통합형에서와 같이, 결손 아데노바이러스의 게놈 부분을 상보할 수 있는 서열을 지녀야 한다. 세포주의 예로는, 예를 들면 자신의 게놈 중으로 통합된, 아데노바이러스 Ad5의 게놈의 좌측 부분(12%)을 포함하는 293 인간 배아 신장 계통(Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) 또는 예를 들면, 특허출원 No. WO 94/26914 및 WO 95/02697에 기술된 바와 같이, E1 및 E4 기능을 상보할 수 있는 계통을 들 수 있다.

이어서, 증폭된 아데노바이러스를 실시예에 설명된 바와 같이 분자 생물학의 통상적인 기술에 따라 회수하고 정제할 수 있다.

아데노-수반 바이러스(AAV)의 경우, 이들은 이들이 감염시키는 세포의 게놈 중으로 안정하고 부위-특이적인 방식으로 통합되는 비교적 소형의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 성장, 형태 또는 분화에 영향을 유도함이 없이, 세포의 광범위 스펙트럼을 감염시킬 수 있다. 더욱이, 이들은 인간의 병리에 관여되는 것으로 보이지는 않는다. AAV 게놈은 클로닝, 서열분석 및 특징규명 되었다. 이는 대략 4700 염기를 포함하고 각각의 말단에, 바이러스 복제 기원으로 작용하는 대략 145 염기의 역반복 영역(ITR)을 함유한다. 게놈의 나머지는 캡시드화 기능을 나르는 두 필수 영역으로 세분된다: 바이러스 유전자의 바이러스 복제와 발현에 관여되는 rep 유전자를 함유하는 게놈의 좌측 부분; 바이러스의 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 우측 부분.

시험관내 및 생체내에서 유전자를 전달하기 위한 AAV-유래 벡터의 사용이 문헌에 기재되어 있다(예를 들면, WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528 참조). 이들 문헌은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 당해 유전자로 대치된 다양한 AAV-유래 작제물, 및 시험관내에서(배양 세포) 또는 생체내에서(유기체에서 직접) 당해 유전자를 전달하기 위한 이들의 사용을 기술하고 있다. 그러나, 이들 서류 어느 것도 생체내 또는 생체외에서 ABC1 단백질의 전달과 발현을 위한 재조합 AAV의 사용, 또는 이러한 전달의 이점을 기술하거나 제안하고 있지 않다. 본 발명에 따른 결손 재조합 AAV는 인간 헬퍼 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스)로 감염시킨 세포 중으로, 두 AAV 역반복 영역(ITR)에 의해 경계를 이룬 ABC1 단백질 암호화 서열을 함유하는 플라스미드, 및 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 나르는 플라스미드를 공형질감염시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 생성된 재조합 AAV는 통상의 기술에 의해 정제될 수 있다.

허피스 바이러스 및 레트로바이러스의 경우, 재조합 벡터의 작제는 문헌에 광범위하게 기술되어 있다: 예를 들면, Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet, Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 등.

예를 들면, 레트로바이러스는 분열 세포를 감염시키는 통합 바이러스이다. 레트로바이러스 게놈은 두 LTR, 캡시드화 서열 및 세 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스-유래 재조합 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 완전히 또는 부분적으로 결실되고 당해 이종 핵산 서열로 대치된다.이들 벡터는 예를 들면, MoMuLV("쥐 몰로니 백혈병 바이러스"; MoMLV로도 지칭), MSV("쥐 몰로니 육종 바이러스"), HaSV("하비 육종 바이러스"), SNV("비장 괴사 바이러스"), RSV("라우스 육종 바이러스") 또는 프렌드 바이러스와 같은 다양한 종류의 레트로바이러스로부터 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 조절 핵산의 조절하에 배치된, ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해, 예를 들면, LTR, 캡시드화 서열 및 암호화 서열을 포함하는 플라스미드를 일반적으로 작제하고, 이어서 플라스미드에는 없는 레트로바이러스 기능을 트랜스로 제공할 수 있는 소위 캡시드화 세포주를 전달하는 데 사용한다. 일반적으로, 캡시드화주는 따라서 gap, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 이러한 캡시드화주, 예를 들면, 계통 PA317(US 4,861,719); 계통 PsiCRIP(WO 90/02806) 및 계통 GP+envAm-12(WO 89/07150)는 선행기술에 기술되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스는 전사 활성을 제거하기 위해 LTR에서의 변형, 및 gag 유전자 부분을 포함하는 연장된 캡시드화 서열을 포함할 수 있다(Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). 생산된 재조합 레트로바이러스는 이어서 통상의 기술에 의해 정제될 수 있다.

본 발명을 이행하기 위해, 결손 재조합 아데노바이러스를 사용하는 것이 유리하다. 하기에 주어진 결과는 사실상, 콜레스테롤 수송 활성을 지닌 단백질을 생체내에서 발현하는 데 유리한 아데노바이러스의 특성을 설명한다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 정제 물질의 생체내에서의 직접 투여 또는 세포, 예를 들면, 자기조직 세포를 생체외에서, 이들을 이식하기 위한 일환으로, 형질전환시키는데 유리하다. 또한, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 예를 들면, 소량의 바이러스 현탁액을 사용하여 감염시킬 수 있게 하는 매우 높은 감염 효율과 같은 이점도 지니고 있다.

본 발명의 또다른 양태에 따라, 본 발명에 따른 조절 핵산 및 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 레트로바이러스 벡터를 위한 생산자 계통이 생체내 이식을 위해 사용된다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 계통은 예를 들면 세포 PA317(US 4,861,719), PsiCrip(WO 90/02806) 및 GP+envAm-12(US 5,278,056)로서, 이들은 본 발명에 따른 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 레트로바이러스의 생산을 허용하도록 변형된다. 예를 들면, 혈액 세포주의 전구체인 분화 전능 줄기 세포를 개체로부터 샘플링 및 분리할 수 있다. 이들 세포는 배양된 다음 자신의 프로모터 조절하에 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 레트로바이러스 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 이들 세포는 이어서 개체 중으로 재도입된다. 이들 세포의 분화는 ABC1 단백질을 발현하는 혈액 세포의 기원, 예를 들면 마크로파지 중으로 형질전환될 때, 동맥 벽으로부터 콜레스테롤 제거에 참여하는 단핵구의 기원이 될 것이다. ABC1 단백질을 발현하는 이들 마크로파지는 과잉 콜레스테롤의 증가된 대사능을 지닐 것이며, 막 콜레스테롤의 1차 수용자에 의한 이의 제거를 위해 세포 표면에서 이용 가능하게 만들 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 벡터에는, ABC1 단백질을 암호화하는 서열은 감염 세포에서의 발현을 허용하는 조절 요소 및 예를 들면, 유형 PPAR의 조절 요소를 포함하는, 본 발명에 따른 조절 핵산의 조절하에 배치된다.

또다른 양태에서, 본 발명의 벡터는 서열번호 1의 서열에 기재된 바와 같이 전사 개시 부위에 대하여, 위치 +108의 뉴클레오타이드에서부터 위치 -2228의 뉴클레오타이드에 이르는 영역을 포함하는 조절 핵산의 조절하에 배치되는 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다.

또한, 또다른 양태에서, 본 발명의 벡터는 코어 프로모터 서열 및 ABC1 유전자 프로모터의 근위 200 bp를 포함하는 조절 핵산의 조절하에 배치되는 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 또한 콜레스테롤 수송과 연관된 병리의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물 제조를 위한 전술한 바이러스의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 전술한 하나 이상의 결손 재조합 바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이들 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 투여 등의 일환으로 조제될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 주사 제형, 예를 들면 환자의 문맥 중으로의 정맥내 주사를 위한 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 예를 들면, 등장성, 멸균 용액 또는 사례에 따라 멸균수 또는 생리식염수의 첨가시, 주사액의 구성을 허용하는 동결건조 조성물일 수 있다. 환자의 문맥 중으로의 직접 주사가 유리한데 이유는 간에서의 감염을 표적화하여, 이 장기에 치료 효과를 집중시킬 수 있기 때문이다.

주사용으로 사용된 결손 재조합 바이러스의 용량은 다양한 파라미터의 함수로서, 및 예를 들면 바이러스 벡터, 사용되는 투여방법, 관련 병리 또는 원하는 치료 지속기간의 함수로서 조정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 10⁴내지 10¹⁴pfu/㎖, 및 10⁶내지 10¹⁰pfu/㎖의 용량 형태로 조제되고 투여된다. pfu("플라크 형성 단위")라는 용어는 바이러스 용액의 감염력에 상응하며, 적당한 세포 배양균을 감염시키고 감염 세포의 플라크 수를 일반적으로 48시간 후에 측정함으로써 측정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가 측정 기술은 문헌에 잘 문서화 되어 있다.

레트로바이러스의 경우, 본 발명에 따른 조성물은 이식의 견지에서 생산자 세포를 직접 포함할 수 있다.

이러한 견지에서, 본 발명의 또다른 양태는 전술한 하나 이상의 결손 재조합 바이러스로 감염된 포유동물 세포에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은 이들 바이러스에 의해 감염된 인간 세포 집단에 관한 것이다. 이들은 예를 들면, 혈액 기원의 세포(분화 전능 줄기 세포 또는 전구체), 섬유아세포, 근원세포, 간세포, 케라틴 생성세포, 평활근 세포, 내피 세포, 신경교 세포 등일 수 있다.

본 발명에 따른 세포는 1차 배양균으로부터 유도될 수 있다. 이들 1차 배양균은 당업자에 공지된 임의 기술에 의해 샘플링될 수 있고 증식을 허용하는 조건하에 배양에 들어간다. 섬유아세포의 경우, 이들은 예를 들면, Ham[Methods Cell. Biol. 21a(1980) 255]에 의해 기재된 기술에 따라, 생검으로부터 용이하게 수득될 수 있다. 이들 세포는 바이러스로의 감염에 직접 사용되거나 예를 들면, 나중에 사용하기 위한 일환으로, 자기조직 뱅크를 설정하기 위해 동결에 의해 저장될 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 예를 들면, 예비-설정된 뱅크로부터 수득된 2차 배양균일 수도 있다(예를 들면, EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).

이어서, 배양 세포를 재조합 바이러스로 감염시켜 이들에 생물학적으로 활성인 ABC1 단백질 생성능을 부여한다. 감염은 당업자에 공지된 기술에 따라 시험관내에서 수행된다. 예를 들면, 사용되는 세포 유형 및 세포당 원하는 바이러스 카피수에 따라, 당업자는 감염 중복도, 및 임의로는 수행되는 감염 사이클의 수를 조정할 수 있다. 세포를 생체내에서 투여하고자 하는 경우에 방법은 적당한 멸균 조건하에서 수행되어야 함이 명백히 이해된다. 세포의 감염에 사용되는 재조합 바이러스의 용량은 원하는 목적에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 생체내 투여를 위한 전술한 조건은 시험관내 감염에 적용될 수 있다. 레트로바이러스로의 감염의 경우에, 감염을 바라는 세포를 본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스를 위한 생산자 세포와 함께 배양하는 것도 가능하다. 이는 레트로바이러스 정제를 필요 없게 만들 수 있다.

본 발명의 또다른 주제는 전술한 바와 같은 하나 이상의 결손 재조합 바이러스 또는 재조합 바이러스 생산자 세포로 감염된 포유동물 세포, 및 세포외 매트릭스를 포함하는 임플랜트에 관한 것이다. 본 발명의 일 양태로서, 본 발명에 따른 임플랜트는 10⁵내지 10¹⁰세포를 포함한다. 예를 들면, 이들은 10⁶내지 10⁸세포를 포함한다.

또한, 본 발명의 임플랜트에서, 세포외 매트릭스는 겔화 화합물 및 임의로는세포의 고정을 위한 지지체를 포함할 수 있다.

다양한 유형의 겔화제가 본 발명에 따른 임플랜트 제조에 사용될 수 있다. 겔화제는 겔의 구성을 갖는 매트릭스에 세포를 매설하기 위해, 및 필요시 지지체 상에 세포의 고정을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 예를 들면, 콜라겐, 젤라틴, 글리코사미노글리칸, 피브로넥틴, 렉틴 등과 같은 다양한 세포 부착제가 겔화제로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 양태로서, 콜라겐이 겔화제로 선택된다. 콜라겐은 인간, 소 또는 쥐 기원의 콜라겐일 수 있다. 예를 들면, 1형 콜라겐이 사용된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 세포의 고정을 위한 지지체를 유리하게 포함할 수 있다. "고정"이란 용어는 지지체 상에 세포의 부착 및/또는 결합을 이끄는 생물학적 및/또는 화학적 및/또는 물리적 상호작용의 임의 형태를 말한다. 더욱이, 세포는 사용된 지지체를 피복하거나, 이 지지체 내부로 침투하거나, 또는 양자 모두일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 무독성 및/또는 생체 적합성 고형 지지체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 섬유 또는 생물학적 기원의 지지체가 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 비만, 고 트리글리세라이드혈증 같은 콜레스테롤 수송과 연관된 병리의 치료 또는 예방을 위한, 또는 심혈관 질병, 심근경색, 앙기나, 급사, 심부전 및 뇌혈관 우발증후 분야에서 효과적인 수단을 제공한다.

또한, 이러한 치료는 인간 및 양, 소, 가정의 동물(개, 고양이 등), 말, 어류 등과 같은 동물 모두에 관련될 수 있다.

재조합 숙주세포

본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 서열 중에서 선택되는 본 발명의 핵산 중 적어도 하나, 예를 들면 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5 중에서 선택된 서열의 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.

또다른 양태에 따라, 본 발명은 또한 전술한 바와 같은 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명에 따른 숙주세포는 예를 들면, 다음과 같다:

a)원핵생물 숙주세포: 이.콜라이(균주 DH5-α), 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 티피무리움 균주, 또는 슈도모나스, 스트렙토마이시즈 및 스태필로코커스와 같은 종으로부터의 균주;

b)진핵생물 숙주세포: 헬라 세포(ATCC No. CCL2), Cv 1 세포(ATCC No. CCL70), COS 세포(ATCC No. CRL 1650), Sf-9 세포(ATCC No. CRL 1711), CHO 세포(ATCC No. CCL-61) 또는 3T3 세포(ATCC No. CRL-6361), 또는 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션(ATCC, 미국 메릴랜드 록빌 소재)에서 언급된 계통 Hepa1-6의 세포.

c)본 발명에 따른 조절 핵산의 조절하에 놓인, 당해 핵산의 발현을 원하는 개체로부터 기원하는 1차 배양균 중의 세포.

d)당업자에 익히 공지된 기술에 따라, 상기 c)에서 1차 배양균 중의 세포로부터 수득한 무한 증식 세포(세포주).

스크리닝 방법

시험관내 스크리닝 방법

본 발명은 ABC1 단백질의 발현 수준과 관련된 병리에 걸린 개체의 치료방법을 제공한다. 예를 들면, 이러한 치료법은 ABC1 유전자의 발현을 변형시키고, 후술되는 다양한 시험관내 스크리닝 방법에 따라 확인될 수 있는 화합물을 개체에 투여하는 것으로 이루어진다.

제 1 방법은 ABC1 유전자의 발현을 변형시키는 화합물의 확인에 있다. 이러한 방법에 따라, ABC1 유전자 발현 세포를 시험될 후보 물질이나 분자와 배양한 다음, ABC1 메신저 RNA의 발현 수준, 또는 ABC1 단백질의 생산 수준을 측정한다.

ABC1 메신저 RNA의 수준은 당업자에 익히 공지되어 있는 노던형 겔 하이브리드화로 측정될 수 있다. ABC1 메신저 RNA의 수준은 PCR을 이용하는 방법 또는 WEBB 및 HURSKAINEN(1996, Journal of Biomolecular Screening, vol. 1:119)에 의해 기재된 기술에 의해 측정될 수 있다.

ABC1 단백질의 생산 수준은 ABC1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여, 면역침전 또는 면역화학에 의해 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 변형시키는 후보 분자 또는 물질의 또다른 스크리닝 방법에 따라, 본 발명에 따른 조절 핵산 및 조절 핵산의 조절하에 놓인 리포터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 상기 정의한 뉴클레오타이드 작제물이 사용되고, 조절 핵산은 적어도 하나의 기본 프로모터 및 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 중 하나로부터의 적어도 하나의 조절 요소, 서열번호 1 서열의 뉴클레오타이드 -2228 내지 +108 범위의 영역을 포함하는 조절 핵산, 또는 코어 프로모터 및 ABC1 유전자 프로모터의 근위 200 pb를 포함한다. 리포터 폴리뉴클레오타이드는 루시퍼라제 암호화 유전자와 같이 검출 가능한 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다.

이러한 스크리닝 방법에 따라, 세포를 본 발명에 따른 조절 핵산과 리포터 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 작제물로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염시킨다.

이어서, 형질전환된 세포를 시험될 후보 분자 또는 물질의 존재하에 또는 부재하에, 충분한 시간 동안 배양한 다음, 리포터 유전자의 발현 수준을 측정한다. 리포터 유전자의 발현에 있어 통계학적으로 유의성 있는 변화를 유도하는(리포터 유전자의 발현의 증가, 또는 반대로 감소) 화합물이 확인되고, 경우에 따라 선별된다.

따라서, 본 발명의 주제는 또한,

a)본 발명에 따른 조절 핵산의 조절하에 놓인 당해 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 숙주세포를 배양하고;

b)재조합 숙주세포를 시험될 물질이나 분자와 배양하며;

c)당해 폴리뉴클레오타이드의 발현을 검출하며;

d)결과를 재조합 숙주세포가 시험될 후보 분자나 물질의 부재하에 배양될 때 수득되는 결과와 비교하는 단계를 포함함을 특징으로 하는,

본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 변형시키는, 예를 들면 본 발명에 따른폴리뉴클레오타이드 작제물의 성분인 리포터 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 분자 또는 물질의 시험관내 스크리닝 방법이다.

본 발명은 또한,

a)본 발명에 따른 조절 핵산의 조절하에 놓인 당해 리포터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 정의한 폴리뉴클레오타이드 작제물로 형질감염된 숙주세포; 및

b)임의로, 당해 리포터 폴리뉴클레오타이드의 발현 검출 수단을 포함하는,

본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 변형시킬 수 잇는 후보 분자 또는 물질의 시험관내 스크리닝용 키트 또는 팩에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 당해 리포터 폴리뉴클레오타이드는 루시퍼라제 암호화 서열이다. 이러한 양태에서, 본 발명에 따른 조절 핵산은 벡터에, 루시퍼라제 암호화 서열의 상류에 삽입된다. 조절 서열은 예를 들면, PROMEGA사(미국 위스컨신 매디슨 소재)가 판매하는 벡터 pGL3-베이식 (pGL3-b)일 수 있다.

이러한 양태에서, 본 발명에 따른 조절 핵산의 조절하에 놓인, 루시퍼라제 암호화 서열을 포함하는 재조합 벡터를 HepG2 계통의 세포와 같은 간세포 암종 세포 중으로 형질감염시키고, 이의 루시퍼라제 활성을 시험될 후보 물질이나 분자의 존재 또는 부재하에 배양한 후 측정한다.

이러한 양태에서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, ApoAI 프로모터를 함유하거나 어떠한 프로모터도 함유하지 않는 pGL3-b 벡터를 대조군으로 사용할 수 있다. 루시퍼라제 활성 분석을 위해, 형질감염된 세포를 PBS 완충제로 세척하고500 ㎕의 용해 완충제(50 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.02%의 나트륨 아자이드, 1%의 NP-40, 100 ㎍/㎖의 AEBSF 및 5 ㎍/㎖의 류펩틴)로 용해시킨다.

이어서, 수득된 세포 용해물 50 ㎕를 루시퍼라제 기질(Promega) 100 ㎕에 가하고 분광광도 마이크로플레이트 판독기상에서, 세포 용해물 첨가 5분 후에 활성 측정을 수행한다.

데이터는 루시퍼라제 활성의 상대 단위로 표현된다. 형질감염된 세포내 루시퍼라제 활성의 고수준을 생성하는 폴리뉴클레오타이드 작제물은 전사를 자극할 수 있는 서열번호 1의 서열에 포함된, 본 발명에 따른 조절 핵산을 함유하는 것들이다.

본 발명에 따른 스크리닝 방법에서 메신저 RNA의 발현 수준의 측정을 위해, 우선 당해 리포터 폴리뉴클레오타이드의 메신저 RNA에 특이적인 탐침을 예를 들면, 키트 멀티프라임 라벨링 키트(Amersham Life Sciences 판매, 미국 오하이오 클리브랜드 소재)를 사용하여 제조한다.

생체내 스크리닝 방법

본 발명의 또다른 일면에 따라, 본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 변형시키는 조성물을 비-인간 트랜스제닉 동물내 생체내에서 확인할 수 있다.

이러한 방법에 따라, 비-인간 트랜스제닉 동물, 예를 들면 마우스를 시험될 후보 분자나 물질, 예를 들면 상기 정의한 바와 같은 시험관내 스크리닝 방법에 의해 사전에 선별해낸 후보 물질 또는 분자로 처리한다.

주어진 지속기간 후에, 본 발명에 따른 조절 핵산의 활성 수준을 측정한 다음 후보 분자나 물질을 투여받지 않은 동일한 비-인간 트랜스제닉 동물, 예를 들면 동일한 트랜스제닉 마우스의 활성과 비교한다.

트랜스제닉 동물에서 기능성인 본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 다양한 방법에 의해, 예를 들면 노던형 하이브리드화에 의해 또는 현장 하이브리드화에 의해, 조절 핵산의 조절하에 놓인 당해 리포터 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 메신저 RNA의 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다.

일 대안에 따르면, 당해 폴리뉴클레오타이드 리포터가 면역조직화학에 의해 검출 가능한 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임을 포함할 때, 본 발명에 따른 조절 핵산의 활성은 예를 들면, 면역조직화학에 의해 당해 리포터 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 변형시키는 후보 물질이나 분자를 생체내에서 스크리닝하는 방법을 실행하기 위해, 마우스, 래트 또는 기니 피그 또는 토끼와 같은 비-인간 포유동물이 사용될 수 있으며, 이의 게놈은 본 발명에 따른 조절 핵산의 조절하에 놓인 당해 리포터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 삽입시킴으로써 변형된다.

본 발명에 따른 트랜스제닉 동물은 트랜스진, 즉 전술한 폴리뉴클레오타이드 작제물을 복수의 그들 체세포 및/또는 생식세포에 포함한다.

본 발명에 따른 트랜스제닉 동물의 작제는 당업자에 익히 공지된 통상의 기술에 따라 수행될 수 있다. 당업자는 내용이 본원에서 참조로 인용되는 특허 US No. 4,873,191(1989년 10월 10일 허여), US No. 5,464,764(1995년 11월 7일 허여)및 US 5,789,215(1998년 8월 4일 허여)에 기술된 바와 같이, 예를 들면 트랜스제닉 마우스의 생산과 같은 트랜스제닉 동물의 생산을 언급할 수 있다.

간단히 말해서, 후자의 조절하에 놓인, 본 발명에 따른 조절 핵산 및 당해 리포터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 ES 타입의 줄기 세포주 중으로 삽입시킨다. 폴리뉴클레오타이드 작제물의 삽입은 예를 들면, Thomas 등(1987, Cell, Vol. 51:503-512)에 기술된 바와 같이, 전기천공에 의해 수행된다.

이어서, 전기천공을 거친 세포는 외생성 폴리뉴클레오타이드 작제물을 게놈 중으로 통합시킨 양성 세포를 선별하기 위해, 폴리뉴클레오타이드 작제물의 존재에 대해 스크리닝되고(예를 들면, 마커 보조에 의한 선별에 의해, 또는 PCR에 의해, 또는 전기영동 겔상 DNA의 서던형 분석에 의해), 경우에 따라 상동 재조합 이벤트가 따른다. 이러한 기술은 예를 들면, Mansour 등(1988, Nature, Vol. 336:348-352)에 의해 설명되어 있다.

이어서, Bradley(1987, Production and Analysis of Chimaeric mice. In: E.J. Robertson(Ed., Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. IRL Press, Oxford, page 113)에 의해 기술된 바와 같이, 양성적으로 선별된 세포를 분리하고 클로닝한 다음 생후 3.5일된 마우스 포배에 주입한다. 이어서, 포배를 숙주동물 암컷에 도입시킨 다음, 배의 발생을 산월까지 모니터한다.

일 대안에 따라, ES형의 양성적으로 선별된 세포를 Wood 등(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90:4582-4585)에 의해 또는 Nagy 등(1993, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90;8424-8428)에 의해 기술된 바와 같이 8 세포기 내지 16 세포기(상실배)에서 생후 2.5일된 배와 접촉시키며, ES 세포는 생식세포 계통을 생성하는 세포를 포함한, 포배를 광범위하게 콜로니화하도록 내화된다.

이어서, 후손을 시험하여 폴리뉴클레오타이드 작제물(트랜스진)이 통합된 것들을 결정한다.

따라서, 본 발명의 주제는 체세포 및/또는 생식세포가 본 발명에 따른 핵산이나 폴리뉴클레오타이드 작제물로 형질전환된 비-인간 트랜스제닉 동물이다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같이 트랜스제닉 동물로부터 수득된 재조합 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명에 따른 트랜스제닉 동물로부터 기원하는 재조합 세포주는 예를 들면, Chou(1989, Mol. Endocrinol. Vol. 3:1511-1514) 및 Schay 등(1991, Biochem. Biophys. Acta. Vol. 1072:1-7)에 의해 기재된 바와 같이, SV40의 대형 T 항원과 같은 종양유전자 발현 벡터로 1차 세포 배양균을 형질감염시킴으로써, 그러한 트랜스제닉 동물로부터의 조직으로부터 개시하는 장기 배양에 설정될 수 있다.

본 발명은 또한,

a)후보 기질 또는 분자를 전술한 바와 같이 트랜스제닉 동물에 투여하고;

b)조절 핵산의 조절하에 놓인 당해 리포터 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준을 검출한 다음;

c)단계 b)에서 수득한 결과를 후보 물질 또는 분자를 투여받지 않은 트랜스제닉 동물에서 수득한 결과와 비교하는 단계를 포함하는,

본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 변형시키는 후보 분자 또는 물질의 생체내 선별방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한,

a)상기 정의한 트랜스제닉 동물;

b)임의로, 당해 리포터 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준 검출 수단을 포함하는, 본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 변형시키는 후보 분자 또는 물질의 생체내 스크리닝용 키트 또는 팩에 관한 것이다.

약학 조성물 및 화합물

본 발명은 또한, 예를 들면 콜레스테롤 수송에서, 및 콜레스테롤의 역수송에서 아테롬성동맥경화증과 같은 콜레스테롤 대사 결핍증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

첫째로, 본 발명의 주제는 또한, 본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 변형시키는 후보 물질 또는 분자이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 조절 핵산, 및 예를 들면 서열번호 1 또는 서열번호 3의 서열, 서열번호 1 서열의 뉴클레오타이드 -2228 내지 + 108 범위의 서열을 포함하는 영역, 또는 ABC1 유전자 프로모터의 코어 프로모터 및 근위 200 pb를 포함하는 영역을 포함하는 조절 핵산의 활성을 증가시킴을 특징으로 하는 후보 물질 또는 분자에 관한 것이다.

예를 들면, 본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 변형시킬 수 있는 그러한 물질이나 분자는 전술한 시험관내 또는 생체내 스크리닝 방법 중 하나에 따라 선별된다.

따라서, 콜레스테롤 대사가 영향 받은 개체, 예를 들면 탠지어병에 걸린 개체는 이 개체에 본 발명에 따른 조절 핵산의 활성을 변형시키는 화합물의 유효량을 투여함으로써 치료된다.

따라서, ABC1 프로모터의 활성이 약한 환자는 ABC1 프로모터의 활성을 증가시키기 위해 전술한 분자 또는 물질로 처리될 수 있다.

이와 달리, ABC1 프로모터의 활성이 비정상적으로 높은 환자는 ABC1 프로모터의 활성을 감소시키거나 차단할 수 있는 화합물로 처리될 수 있다.

이러한 화합물은 적어도 하나의 전사 인자와 ABC1 프로모터 또는 본 발명에 따른 조절 핵산의 조절 요소의 상호작용을 변형시키는 화합물일 수 있다.

예를 들면, 화합물은 표 1에 수록된 전사 인자 중 하나와 본 발명에 따른 조절 핵산의 상호작용을 억제할 수 있다.

화합물은 또한, ABC1 프로모터에 결합하는 전사 인자, 또는 후자에 존재하는 조절 요소의 활성을 변형시키는 화합물일 수 있다.

본 발명에 따른 치료 목적의 화합물은 또한, 제 1 전사 인자와 제 2 전사 이자의 상호작용을 변형시키는 화합물일 수 있다.

서열번호 3의 서열에 결합할 수 있는 다양한 전사 인자의 분석에서 상세하게 기술되는 바와 같이, 일부 전사 인자는 이들이 다른 전사 인자와 회합될 경우에만 활성을 띤다.

본 발명에 따른 치료용 화합물은 예를 들면, 핵산, 펩타이드 및 소형 분자로부터 선택된다. 예를 들면, 이러한 화합물은 ABC1 프로모터의 영역에 또는 ABC1의 조절 핵산의 조절 요소에 특이적으로 결합하고 프로모터의 활성을 억제하거나 감소시키는 안티센스 핵산일 수 있다.

치료용 화합물은 또한, 안티센스 핵산과 ABC1 프로모터에 결합하는 전사 인자를 암호화하는 유전자의 상호작용이 이러한 전사 인자의 생산을 감소시켜, 전사 인자가 ABC1 프로모터의 활성을 증가시키느냐, 또는 반대로 감소시키느냐에 따라, ABC1 프로모터의 활성을 증가시키거나 감소시키도록, ABC1 프로모터의 활성을 변형시키는 전사 인자를 암호화하는 유전자와 특이적으로 상호작용하는 안티센스 핵산일 수 있다.

본 발명에 따른 치료 화합물의 독성과 치료 효능은 표준 약학 프로토콜에 따라, 예를 들면, 배양균내 또는 실험 동물내 세포에서 측정하여 치사량 LD₅₀(즉, 시험된 집단의 50%에 치사적인 투여량) 및 유효 용량 ED₅₀(즉, 시험 집단의 50%에서 치료가 효과적인 용량)을 결정한다.

본 발명에 따른 치료용 화합물 모두에 대해, 유효 치료량은 시험관내 세포 배양액에서 수행된 시험으로부터 초기에 평가될 수 있다.

본 발명의 주제는 또한, 치료 유효량의 본 발명에 따른 치료용 물질 또는 분자를 포함하는 약학 조성물이다.

이러한 약학 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 벡터 또는 부형제를 사용하여 통상적으로 제형될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 치료 목적의 화합물 및 이의 생리학적으로 허용되는 염과 용매화물은 주사나 흡입에 의해, 또는 경구, 구강, 비경구 또는 직장 투여에 의한 투여용으로 조제될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 제조를 위한 기술은 당업자에 의해, 예를 들면 Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mead Publishing Co., Easton, PA, USA에서 쉽게 찾아볼 수 있다.

전신 투여의 경우, 근육내, 정맥내, 복막내 및 피하 주사를 포함한 주사가 이용될 수 있다. 이 경우에, 본 발명에 따른 약학 조성물은 예를 들면, 생리적으로 적합한 용액 또는 완충제 중의 액체 용액 형태로 조제될 수 있다.

인간 ABC1 유전자의 전사 손상 검출 방법

본 발명의 주제는 또한, 개체가 탠지어병의 발병 위험과 같이, 예를 들면 콜레스테롤 수송에서, 및 콜레스테롤의 역수송에서, 아테롬성동맥경화증 같은 콜레스테롤 대사 결핍증과 연관된 병리의 발병 위험을 제시하는지 여부를 측정하는 방법이다.

이러한 방법은 시험될 개체로부터 기원하는 생물학적 샘플로부터의 세포에서, 발현이 ABC1 프로모터에 의해 조절되는 유전자의 발현 손상을 특징으로 하는 유전자 변화의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함한다.

실례로서, 이러한 유전자 변화는 서열번호 1 또는 서열번호 2 서열의 ABC1에 대한 조절 핵산의 서열에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환을 측정하기 위해 검출될 수 있다.

개체내 ABC1 유전자의 전사 손상을 검출하는 방법의 일 양태에 따라, 유전자 변화는 서열번호 1의 서열의 전부 또는 일부, 또는 이와 달리 적어도 서열번호 2의 서열의 전부 또는 일부를 서열분석하는 단계를 포함하는 방법에 따라 확인된다.

서열분석 프라이머는 서열번호 1의 서열의 주어진 영역과 하이브리드화하도록 작제될 수 있다. 이러한 서열분석 프라이머는 예를 들면, 서열번호 1의 서열 또는 상보 서열의 대략 250 내지 대략 300 뉴클레오타이드의 단편을 증폭시키도록 작제된다.

이어서, 예를 들면, PCR 방법에 의해 증폭된 단편을 서열분석한 다음, 수득된 서열을 서열번호 1의 레퍼런스 서열과 비교하여 뉴클레오타이드의 하나 이상의 결실, 첨가 또는 치환이 시험된 개체로부터 기원하는 생물학적 샘플에 함유된 DNA로부터 증폭된 서열에서 발견되는지 여부를 측정한다.

따라서, 본 발명은 또한,

a)본 발명에 따른 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열과 하이브리드화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 프라이머의 도움하에 증폭될 수 있는 핵산 단편을 서열분석하고;

b)단계 a)에서 수득한 서열을 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열과 정렬시킨 다음;

c)서열번호 1 또는 서열번호 2의 레퍼런스 서열에 대하여, 핵산 단편의 서열내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 하나 이상의 결실, 첨가 또는 치환의 존재를측정하는 단계를 포함하는,

개체내 ABC1 유전자의 전사의 손상 검출 방법에 관한 것이다.

전술한 검출 방법의 실행 동안 서열내 변화가 측정된 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 2의 서열의 영역과 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 탐침도 본 발명의 일부를 형성한다.

이와 달리, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 하나 이상의 결실, 첨가 또는 치환이 개체에서 측정된, 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 2의 서열의 상응하는 영역과 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 탐침도 본 발명의 일부를 형성한다.

이러한 올리고뉴클레오타이드 탐침은 ABC1 유전자에 대한 조절 서열에서의 변화 검출 수단 및 따라서 또한 아테롬성동맥경화증 또는 탠지어병과 같은 콜레스테롤 대사 결핍증과 연관된 병리의 발병 성향 검출 수단을 구성한다.

따라서, 본 발명의 주제는 또한

a)서열번호 1의 서열 또는 서열번호 2의 서열의 영역과 하이브리드화하는 하나 이상의 프라이머;

b)임의로, 증폭 반응을 수행하는 데 필요한 수단을 포함하는, 개체내 ABC1 유전자의 전사 손상 검출용 키트 또는 팩이다.

본 발명의 주제는 또한,

a)상기 정의한 바와 같은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 탐침;

b)임의로, 하이브리드화 반응을 수행하는 데 요구되는 시약을 포함하는,

개체내 ABC1 유전자의 전사 손상 검출용 키트 또는 팩이다.

따라서, 서열번호 1 내지 8의 뉴클레오타이드 서열의 임의 하나로부터 유래한 핵산 단편은 ABC1 유전자의 조절 뉴클레오타이드 서열 또는 단편 또는 후자의 변이체(돌연변이 또는 다형현상 함유)의 적어도 하나의 카피의 샘플내 존재를 검출하는 데 유용하다.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 서열번호 1 내지 8의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 핵산, 또는 상보 서열의 핵산의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.

예를 들면, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 서열 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열의 핵산과 같은 본 발명에 따른 핵산의 10, 12, 15, 18, 20 내지 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 또는 1500개의 연속 뉴클레오타이드에서 선택된 길이를 갖게 된다.

또한, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 본 발명에 따른 핵산, 또는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 서열 중에서 선택된 핵산, 또는 상보 서열의 핵산의 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 및 1500개의 연속 뉴클레오타이드에서 선택된 길이를 갖는 단편으로 이루어지고/이루어지거나 이를 포함할 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 및 프라이머의 정의는 상기에서 정의된 고 엄격 하이브리드화 조건하에서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 서열에서 선택된 핵산 또는 이들 서열의 상보 서열과 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.

ABC1 유전자의 다양한 영역의 증폭을 위한 프라이머 및 프라이머 쌍의 예는 후술된다.

예를 들면, 서열번호 12 서열의 프라이머: 5′-TTG CCG TCG ACT GTT TTG GGT AGT TT-3′및 서열번호 13 서열의 프라이머: 5′-GCC CTG TCG ACC GGC TCT GTT GGT G-3′으로 대표되는 프라이머 쌍이다.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머 또는 탐침은 클로닝 및 제한 효소 작용에 의한 방법을 포함하여 당업자에 익히 공지된 임의 적당한 방법에 의해, 또는 Narang 등(1979)의 또는 Brown 등(1979)의 포스포디에스테르법, Beaucage 등(1980)의 디에틸포스포라미다이트법 또는 EU 특허 No. EP 0 707 592에 기재된 고체 지지체상 기술과 같은 기술에 따른 직접 화학 합성에 의해 제조될 수 있다.

전술한 올리고뉴클레오타이드 탐침 및 프라이머를 포함한 본 발명에 따른 핵산 각각은 필요에 따라, 검출 가능한 표지물 혼입에 의해, 분광, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단에 의해 표지될 수 있다.

예를 들면, 이러한 표지물은 방사능 동위원소(32P, 33P, 3H, 35S), 형광 분자(5-브로모데옥시우리딘, 플루오레신, 아세틸아미노플루오렌, 디곡시게닌) 또는 바이오틴 같은 리간드를 포함할 수 있다.

탐침의 표지는 예를 들면, 표지된 분자를 프라이머 연장에 의해, 또는 5′또는 3′말단에의 첨가에 의해 폴리뉴클레오타이드 중으로의 혼입에 의해 수행된다.

핵산 단편의 비-방사능 표지의 예는 예를 들면, 프랑스 특허 No. FR 78 109 75에 또는 Urdea 등(1988) 또는 Sanchez-pescador 등(1988)에 의해 기재되어 있다.

유리하게는, 본 발명에 따른 탐침은 Urdea 등(1991)에 의해, 또는 유럽 특허 No. EP-0 225 807(Chiron)에 기재된 탐침과 같이, 시그널의 증폭을 가능케 하는 유형의 구조적 특성을 지닐 수 있다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 탐침은 예를 들면, 게놈 DNA에 대한 서던형 하이브리드화에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 탐침은 또한 PCR 증폭 산물의 검출이나 미스매치의 검출에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 당업자에 익히 공지되어 있으며, 마이크로적정판, 폴리스티렌 베드, 마그네틱 베드, 니트로셀룰로스 밴드 또는 라텍스 입자와 같은 마이크로입자의 웰의 표면을 포함한다.

결과적으로, 본 발명은 또한

1)본 발명에 따른 하나 이상의 뉴클레오타이드 탐침을 시험될 샘플과 접촉되게한 다음;

2)가능하게는 탐침과 샘플에 존재하는 핵산 간에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플내 전술한 바와 같은 핵산의 존재 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 검출 방법의 일 양태에 따라, 올리고뉴클레오타이드 탐침을 지지체 상에 고정시킨다.

또다른 일면에 따라, 올리고뉴클레오타이드 탐침은 검출 가능한 표지를 포함한다.

본 발명은 또한,

a)전술한 바와 같은 하나 이상의 뉴클레오타이드 탐침;

b)임의로, 하이브리드화 반응에 요구되는 시약을 포함하는, 샘플내 본 발명에 따른 핵산의 존재 검출용 팩 또는 키트에 관한 것이다.

제 1 면에 따라, 검출 팩 또는 키트는 탐침이 지지체 상에 고정됨을 특징으로 한다.

제 2 면에 따라, 검출 팩 또는 키트는 올리고뉴클레오타이드 탐침이 검출 가능한 표지를 포함함을 특징으로 한다.

전술한 검출 키트의 일 양태에 따라, 이러한 키트는 본 발명에 따른 복수의 올리고뉴클레오타이드 탐침을 포함할 것이며, 이는 당해 표적 서열의 검출에, 또는 이와 달리 예를 들면 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로부터 선택된 서열의 핵산 또는 상보 서열의 핵산의 본 발명에 따른 핵산의 암호화 영역 또는 비-암호화 영역에서의 돌연변이 검출에 사용될 수 있다.

따라서, 지지체 상에 고정되는 본 발명에 따른 탐침은 ″DNA 칩″과 같은 매트릭스에 정렬될 수 있다. 이러한 정렬된 매트릭스는 예를 들면, US 특허 No. 5,143,854에 및 PCT 출원 No. WO 90/150 70 및 92/10092에 기재되어 있다.

올리고뉴클레오타이드 탐침이 고밀도로 고정되는 지지 매트릭스는 예를 들면, US 특허 No. 5,412,087 및 PCT 출원 No. WO 95/11995에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머는 본 발명에 따른 핵산 중 임의 하나, 및 예를 들면 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5에서 선택된 서열의 핵산, 또는 이러한 핵산의 변이체의 전부 또는 일부를 증폭하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 또다른 주제는

a)표적 핵산의 존재가 추정되는 샘플을 증폭 반응에 요구되는 시약의 존재하에, 증폭시키고자 하는 표적 핵산의 영역의 5′사이드 및 3′사이드 각각에 하이브리드화 위치가 위치되는 뉴클레오타이드 프라이머의 쌍과 접촉시킨 다음;

b)증폭된 핵산을 검출하는 단계를 포함하는,

샘플에 함유된, 본 발명에 따른 핵산, 및 예를 들면 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5에서 선택된 핵산 서열, 또는 이러한 핵산의 단편이나 변이체의 증폭 방법에 관한 것이다.

전술한 바와 같은 증폭 방법을 실행하기 위해, 전술한 뉴클레오타이드 프라이머 중 임의 하나가 유리하게 사용될 것이다.

본 발명의 주제는 또한,

a)증폭시키고자 하는 표적 핵산의 5′사이드 및 3′사이드 각각에 하이브리드화 위치가 위치되는, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머의 쌍;

b)임의로, 증폭 반응에 요구되는 시약을 포함하는,

본 발명에 따른 핵산, 및 예를 들면 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5에서 수득된 핵산 서열의 전부 또는 일부의 증폭용 팩 또는 키트이다.

이러한 증폭 팩 또는 키트는 유리하게는 전술한 바와 같은 뉴클레오타이드 프라이머의 적어도 한 쌍을 포함한다.

하기 실시예는 범위의 제한 없이 본 발명을 설명하고자 한다.

실시예 1: 본 발명에 따른 ABC1 유전자 전사체의 조직 분포

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 발현 프로필은 예를 들면, Sambrook 등(ref. CSH Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T.(1989). "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.)에 의해 기재된 역전사-커플링 PCR 및 노던 블롯 분석 프로토콜에 따라 측정된다.

예를 들면, 역전사에 의한 분석의 경우에, 서열번호 10의 서열의 인간 ABC1 유전자 완전-길이 cDNA로부터 합성된 프라이머 쌍을 상응하는 cDNA의 검출에 사용한다.

폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 역전사 polyA⁺mRNA(Clontech)에 상응하는 cDNA의 매트릭스 상에서 수행된다. cDNA로의 역전사는 제조업자에 의해 기술된 조

건에 따라, 효소 Superscript II(GibcoBRL, Life Technologies)로 수행된다.

폴리머라제 연쇄 반응은 표준 조건에 따라, 20 ㎕의 반응 혼합물 중에서, 25 ng의 cDNA 제제로 수행된다. 반응 혼합물은 400 μM의 각 dNTP, 2 단위의 Thermus aquaticus(Taq) DNA 폴리머라제(Taq) DNA 폴리머라제(Ampli Taq Gold; Perkin Elmer), 0.5 μM의 각 프라이머, 2.5 mM MgCl₂및 PCR 완충제로 이루어진다. 34 사이클의 PCR(94℃에서 30초간 변성, 30초간 하이브리드화, 34 사이클 동안 다음과 같이 파괴: 64℃ 2 사이클, 61℃ 2 사이클, 58℃ 2 사이클 및 55℃ 28 사이클, 및 72℃에서 킬로베이스당 1분의 신장)을 10분간 94℃에서의 1차 변성 후, Perkin Elmer 9700 써머사이클로 머신에서 수행한다. PCR 반응을 전기영동에 의해 아가로스 겔상에서 가시화한다. 수득된 cDNA 단편을 노던 블롯 분석을 위한 탐침으로서 사용할 수 있고 또한 폴리뉴클레오타이드 서열을 정확히 결정하는 데 사용할 수 있다.

노던 블롯에 의한 분석의 경우에, 전술한 바와 같이 생성된 cDNA 탐침을 제조업자에 의해 표시된 지시에 따라, High Prime DNA 표지 시스템(Boehringer)을 사용하여,³²P로 표지한다. 표지 후, 탐침을 제조업자에 의해 표시된 지시에 따라, Sephadex G50 마이크로칼럼(Pharmacia) 상에서 정제한다. 이어서, 표지되고 정제된 탐침을 다양한 조직에서 mRNA의 발현 검출에 사용한다.

다양한 인간 조직으로부터의 RNA의 샘플을 함유한 노던 블롯((다중 조직 노던, MTN, Clontech) Blot 2, 참조 77759-1)을 표지된 탐침과 하이브리드화시킨다.

하이브리드화 및 세척을 위해 따르는 프로토콜은 바로 제조업자에 의해 기재된 것이거나(지시 매뉴얼 PT1200-1), 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 F. Ausubel 등(1999)에 기재되어 있는 방법을 사용하는 이 프로토콜의 변용이다. 따라서, 예를 들면, 포름아미드의 존재하에 예비하이브리드화 및 하이브리드화의 온도는 변화될 수 있다.

예를 들면, 하기 프로토콜이 사용된다:

1 - 막 경쟁 및 예비하이브리드화 :

- 혼합: 40 ㎕ 연어 정충 DNA(10 mg/㎖) + 40 ㎕ 인간 태반 DNA(10 mg/㎖).

- 96℃에서 5분간 변성, 이어서 혼합물을 얼음에 침지.

- 2X SSC 완충제 제거 및 포름아미드 믹스 4 ㎖를 막을 함유하는 하이브리드화 튜브에 부음.

- 두 변성 DNA의 혼합물 첨가.

- 회전하에, 42℃에서 5 내지 6시간 배양.

2 - 표지된 탐침 경쟁:

- 반복 서열의 양에 따라, 표지되고 정제된 탐침에 10 내지 50 ㎕ Cot I DNA를 첨가.

- 95℃에서 7 내지 10분간 변성.

- 65℃에서 2 내지 5시간 동안 배양.

3- 하이브리드화;

- 예비하이브리드화 믹스 제거.

- 40 ㎕ 연어 정충 DNA + 40 ㎕ 인간 태반 DNA 첨가; 96℃에서 5분간 변성, 이어서 얼음에 침지.

- 포름아미드 믹스 4 ㎖, 두 DNA의 혼합물 및 변성되고 표지된 탐침/Cot I DNA를 하이브리드화 튜브에 첨가.

- 회전하에, 42℃에서 15 내지 20시간 동안 배양.

4- 세척:

- 세정하기 위해 2X SSC 중 실온에서 1회 세척.

- 실온에서, 2회 5분간, 65℃에서 2X SSC 및 0.1% SDS.

- 65℃에서 2회 15분간, 65℃에서 1X SSC 및 0.1% SDS.

하이브리드화 및 세척 후, 블롯을 인 스크린과 접촉시켜 밤새 노출 후 분석하며, Storm(Molecular Dynamics, 미국 캘리포니아 서니베일 소재)의 도움으로 드러나게 한다.

실시예 2: 탠지어병에 대한 유전자 발현의 프로필 분석

후술되는 방법에 따라, 이들 서열을 가능하게는 질환을 앓고 있는 개체로부터의 섬유아세포로부터 기원하는 mRNA에 상응하는 탐침과 하이브리드화시킴으로써 측정된 탠지어 세포 표현형을 이끄는 ABC1 유전자의 발현 수준 손상의 증명:

1. 전체 RNA, poly(A) ⁺ mRNA 및 cDNA 탐침의 제조

구아니딘 이소티오시아네이트법(Chomczynski & Sacchi, 1987)에 의해, 탠지어병을 앓고 있거나 정상인 개체로부터의 섬유아세포의 세포 배양균으로부터 전체RNA를 수득한다. poly(A)⁺mRNA는 셀룰로스-올리고(dT) 칼럼(Sambrook et al., 1989) 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 수득되며 탐침으로 사용되는 cDNA는 형광 산물(Amersham Pharmacia Biotech; CyDye^TM)로 표지한 올리고뉴클레오타이드로 RT-PCR(DeRisi et al., 1997)에 의해 수득된다.

2. 하이브리드화 및 발현 수준의 검출

탠지어 유전자에 상응하는 본 발명에 따른 서열을 함유하는 유리 섬유 막을 섬유아세포로부터 수득한 cDNA 탐침과 하이브리드화시킨다(Lyer et al., 1999). Amersham/Molecular Dynamics 시스템(Avalanche Microscanner^TM)의 사용은 건강하거나 병에 걸린 세포형에서 서열 산물의 발현의 정량을 허용한다.

실시예 3: ABC1 유전자의 발현을 활성화하거나 억제하는 분자의 스크리닝을 위한 IL-1베타-발현 THP-1 마크로파지의 사용

이러한 분석의 원리는 ABC1 단백질의 합성 활성을 변형시키는 임의 물질이 IL-1베타의 합성에 영향을 미친다는 것이다.

a)인간 단핵구 백혈병 세포인 THP-1 계통의 마크로파지 세포가 분화된 마크로파지의 모델이다. 이들 세포는 멀티웰 플레이트 중, 웰당 2 x 10⁵세포의 밀도로, 10% 태 송아지 혈청으로 보충한 RPMI 1640 배지에서 배양한다.

b)분석 자체를 위하여, 이어서 세포를 세척하여 1 mg/㎖의 정제된 인간 알부민 분획 IV를 함유하는 RPMI 1640 배지에 둔다.

c)산물을 세포외 배지에 가한다. 동시에, 이어서 세포를 3시간 동안 1 ㎍/㎖에서 리포폴리사카라이드(LPS)를 첨가한 다음, 이어서 5 mmol/L의 ATP 존재하에 30분간 배양하여 활성화시킨다.

d)IL-1베타 및 대조군 IL-1알파, 종양 괴사 인자 알파(TNF알파) 및 IL-6의 농도를 제조업자의 지시에 따라 ELISA 키트로 측정한다(R&D System; 인간 IL-1베타 화학발광 ELISA 레퍼런스 QLB00). 영향 받은 걸로 생각되지 않은 IL-1베타 mRNA에서의 변형을 상응하는 탐침을 사용하여, 노던 블롯 기술에 의해 평가한다.

실시예 4: 본 발명에 따른 인간 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산의 조절하에서 당해 유전자의 발현

4.1 재료 및 방법

4.1.1 인간 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산을 함유하는 발현 플라스미드의 작제

위치 -995의 뉴클레오타이드에서 위치 +120의 뉴클레오타이드까지 범위의 인간 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산의 영역을 하기 프라이머 쌍의 도움하에, PCR 기술로 증폭시킨다.

서열 5′-TTG CCG TCG ACT GTT TTG GGT AGT TT-3′의 순방향 프라이머 S995(서열번호 12); 및

서열 5′-GCC CTG TCG ACC GGC TCT GTT GGT-3′의 역방향 프라이머 +220R(서열번호 13).

인간 BAC 벡터의 컬렉션으로부터의 BAC 벡터에 존재하는 인간 게놈 DNA로부터.

증폭된 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Sal 1으로 분해시킨 다음, Nordeen 등(1988, BioTechniques, 6: 454-457)에 의해 기재된 벡터 PXP1 중으로, 이 벡터의 Sal 1 제한 부위에 삽입시킨다.

이어서, 삽입체를 서열분석한다.

4.1.2. 세포 배양 및 형질감염

Hepa1-6 계통(ATCC, 미국 메릴랜드 록빌 소재)을 배지 E-MEM(Earle 염을 지닌 최소 필수 배지)에서 배양하며, 여기에 10% 태 송아지 혈청(BioWhittaker, 미국 메릴랜드 워커스빌 소재)을 가한다.

대략 1.5 x 10⁵세포를 12-웰(2.5 cm) 배양판의 웰 각각에 분배한 다음 대략 50 내지 70% 유착까지 배양하고, 이어서 Superfectin Reagent Kit 팩(QIAGEN Inc., 미국 캘리포니아 발렌시아 소재)을 사용하여 1 ㎍의 플라스미드 Sal-Lucif 및 0.5 ㎍의 대조 벡터 pBetagel(CloneTech Laboratories Inc., 미국 캘리포니아 팔로 알토 소재)로 공형질감염시킨다. DNA를 가한지 2시간 후, 배양 배지를 제거하고, 완전 AMEM(최소 필수 배지 이글 알파 변형) 배지로 대치한다.

20시간 지속 후, 세포를 DMEM(둘베코 최소 필수 배지)와 같은 신선한 배지에 넣고, 여기에 50 ㎍/㎖의 콜레스테롤(Sigma Chemical Co., 미국 미주리 세인트 루이스 소재)의 존재하에 또는 부재하에, 2 ㎍/㎖의 글루타민, 100 단위/㎖의 스트렙토마이신 및 0.1%의 소 혈청 알부민(BSA, 분획 V)을 가한다.

Tropix Luciferase Assay Kit 팩(Tropix Inc., 미국 매사추세츠 베드포드 소재)으로부터 용해 완충제를 사용하여 배지를 최종 교환 16시간 후 회수한다.

세포 용해물을 -70℃에서 보관되는 분취량 분획으로 나눈다.

새로 해동시킨 분취량 분획으로 MicroBCA Kit 팩(Pierce, 미국 일리노이 록포드 소재)을 사용하여 단백질을 정량하고, 또한 각각 Tropix Luciferase Assay Kit 및 Galacto-Light Plus Kit 팩을 사용하여, 루시퍼라제 및 베타-갈락토시다제 생산을 정량한다. 분석은 제조업자의 권장에 따라 수행된다.

4.2 결과

결과를 하기 표 2에 나타내었다:

콜레스테롤의 존재 또는 부재하에, 본 발명에 따른 인간 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산의 조절하에 놓인 루시퍼라제 유전자를 함유하는 벡터로 형질감염된 세포에 의한 루시퍼라제 생성

배양 조건	루시퍼라제 활성	β-갈락토시다제 활성	정규화한 활성	활성의 증가
콜레스테롤 없음	215 523 +/-20 018	29 548 +/-1342	7.29	-
콜레스테롤 존재하	500 126 +/-100 069	37 741 +/-2813	13.25	1.82

상기의 결과는 본 발명에 따른 인간 ABC1 유전자에 대한 조절 핵산의 이의 조절하에 놓인 암호화 서열의 발현 지시능을 보여준다.

또한, 사용된 조절 핵산은 전사 개시 부위에 대하여, 위치 -995의 뉴클레오타이드에서 위치 +120의 뉴클레오타이드까지 뻗어있고, 확인된 모든 PPAR 부위를 함유하고 있으며 콜레스테롤에 의해 조절된다.

실시예 5: 근위 인간 ABC1 유전자 프로모터내 전사 인자 결합 모티프의 특징규명

5.1 재료 및 방법

5.1.1 루시퍼라제 분석을 위한 리포터 플라스미드의 작제

중첩 PCR법 및 주형으로 PXP1 -995 내지 +120 bp 작제물(Previato et al., JBC, 1991, 266:18958-63)을 사용하여 부위-지향성 돌연변이유발에 의해 돌연변이체 SP1, AP1, E-box, LXR 및 결실된 E-box 단편을 함유하는 플라스미드를 작제한다. 하기에 수록된 프라이머를 사용하여 인간 ABC1 프로모터의 -200 내지 +44 bp를 증폭시킨다. 대문자는 야생형 서열을 나타내는 반면에 소문자는 돌연변이체 서열을 나타낸다.

MDistal SP1F(서열번호 14) 5′TCGCCCGTTTAgGcttgGGcgCCCGGCTC3′

MDistal SP1R: 5′GAGCCGGGcgCCcaagCcTAAACGGGCGA3′

MProximal SP1F:(서열번호 15) 5′CAGAGGCCGGGAgGcttgGGcgGGAGGGA3′

MProximal SP1R: 5′TCCCTCCcgCCcaagCcTCCCGGCCTCTG3′

MAP1F:(서열번호 16) 5′CGTGCTTTCTGCTGAGgatgcGAACTAC3′

MAP1R: 5′GTAGTTCgcatcCTCAGCAGAAAGCACG3′

MEBoxF:(서열번호 17) 5′CGGCTCCtcacggCTTTCTGCTGAGT3′

MEBoxR: 5′ACTCAGCAGAAAGccgtgaGGAGCCG3′

DEboxF:(서열번호 18) 5′GCCTCCTTTCTGCTGAGTGACTGA3′

DEboxR: 5′GAAAGGAGCCGGGGCCCGCCCCA3′

MLXRF:(서열번호 19) 5′CTTTGtgtGATAGTAAActaCTGCGCTCGGTGCA

MLXRR 5′TGCACCGAGCGCAGtagTTACTATCacaCAAAG

S224-HindIII:(서열번호 20) 5′ACTCCCAAGCTTTGTCGTGG3′

44-HindIII: 5′GAGAAGCTTCGGCTCGGCTCTG3′

S224-HindIII 및 44-HindIII는 중첩 PCR을 위해 사용된 업스트림 및 다운스트림 프라이머이다. HindIII 부위는 밑줄 그어졌다. 인간 ABC1 유전자의 -200 내지 +44를 스패닝하는 생성되는 단편을 PXP1 루시퍼라제 리포터 플라스미드(Nordeen et al., Biotechniques, 1988, 6:454-457)의 HindIII 부위에 연결시킨다. 모든 작제물을 서열분석에 의해 확인한다.

5.1.2. 세포 배양 및 형질감염

쥐 마크로파지 RAW 264.7 세포 및 인간 배아 신장 293 세포(American Type Culture Collection, 미국 메릴랜드 록빌 소재)를 10% 태 송아지 혈청(FCS)이 들은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 성장시킨다. 대략 1.5 x 10⁵세포를 12-웰 플레이트(Costar, 미국 뉴욕 코닝 소재)에 플레이팅하고, 50 내지 70% 유착율로 생장시킨 다음 Superfectin Reagent Kit(Qiagen, 미국 캘리포니아 발렌시아 소재)를 사용하여 1.5 ㎍의 ABC1 프로모터-루시퍼라제 플라스미드 및 0.5 ㎍의 β-갈락토시다제벡터(pCMVβ; Clontech, 미국 캘리포니아 팔로 알토 소재)로 공형질감염시킨다. DNA 첨가 3시간 후, 세포에 10% FCS를 함유하는 신선한 배지로 재공급한다. 16시간 후에 세포를 포스페이트-완충 생리식염수(PBS)로 세척하고 0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 50 ㎍/㎖의 콜레스테롤, 2 ㎍/㎖ 22-(R)-하이드록시콜레스테롤(22(R)-Hch), 10 μM 9-시스-레티논산(9CRA), 10-100 nM 에스트라디올(Sigma, 미국 미주리 세인트 루이스 소재), 10-100 nM 레귤러 인슐린(Sigma) 또는 0.1% 에탄올을 함유하는 DMEM으로 24시간 동안 재공급한다. 수거 후, 10 ㎕의 세포 추출물을 각각 Promega 이중 루시퍼라제 분석 시스템(Promega, 미국 위스컨신 매디슨 소재) 또는 Tropix Galacto-Light Plus Kits(Tropix, 미국 매사추세츠 베드포드 소재)의 사용에 의한 루시퍼라제 및 β-갈락토시다제 분석에 사용하였다. 상대적인 광 단위로 나타낸 루시퍼라제 활성의 비를 β-갈락토시다제 활성으로 나누어 정규화된 루시퍼라제 값을 구한다.

5.1.3. 겔 이동성 쉬프트 분석

세 이본쇄 인간 ABC1 프로모터 단편(-171 내지 -71 bp를 스패닝하는 단편 A; -156 내지 -130 bp를 스패닝하는 단편 EB 및 -156 내지 -130 bp를 스패닝하는 단편 EB)을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Lofstrand, 미국 메릴랜드 게이더스버그 소재)를 사용하여_α ³²P-dATP로 말단-표지한다. 비자극 RAW 264.7 세포와 HepG2 세포 및 상기에 나타낸 동일한 농도의 콜레스테롤 및 22(R)-Hch(Paragon Bioservices Inc. 미국 메릴랜드 볼티모어 소재)로 자극 후 RAW 264.7 세포로부터 핵 추출물을분리해낸다. 1 ng(10,000 cpm)의 방사능표지 탐침을 기술된 바와 같이(Previato et al., J Biol Chem, 1991, 266:18958-18963) 60 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.25 mM PMS, 1.3 mM MgCl, 10% 글리세롤, 3% Ficoll 및 3 ㎍의 이본쇄 poly(dldC)를 함유하는 20 ㎕의 20 mM TRIS 겔 쉬프트 완충제(pH 7.9) 중의 2.5 ㎍ 핵 추출물에 가한 다음 얼음 위에서 10분간에 이어서 실온에서 10분간 배양한다. 배양된 혼합물을 0.25 x TBE 완충제 중의 6% 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고 100 V에서 90분간 전기영동한 다음 방사선 촬영한다. 경쟁 분석을 위해, 핵 추출물을 탐침의 첨가 전에 Sp1(-173 내지 -155 bp), AP1(-135 내지 -155 bp), LXR(-54 내지 -69 bp) 및 E-box(-158 내지 -136 bp)에 대한 100 내지 200배 과량의 이본쇄 DNA 경쟁자의 존재 또는 부재하에 20 ㎕ 반응 혼합물 중의 얼음 위에서 10분간 예비 배양시킨다. 수퍼쉬프트 분석을 위해, 핵 추출물을 Mad1, Mad2, Mad3, Max, c-Myc, MyoD, USF1과 USF2 및 Sp1, c-Fos, c-Jun, JunB 및 JunD(Santa Cruz Biotechnology, 미국 캘리포니아 산타크루즈 소재)를 포함한 상이한 E-box 결합 단백질에 대한 항체와 얼음 위에서 30분간 탐침 첨가 전에 예비 배양시킨다.

5.1.4. DNAse I 보호 분석

말단-표지 단편 A를 AspHI로 분해시킨다. 94 bp 단편을 10% 아크릴아미드 TBE 겔(Novex)로부터 겔 정제하고 겔 쉬프트 완충제(실시예 5.1.3) 중의 14 ㎕의 RAW 세포 핵 추출물(5.2 ㎍/㎕ 단백질)에 가하고 10분간 얼음 위에서 배양한다. 1 ㎕의 탐침(10,000 cpm)을 가하고 혼합물을 다시 10분간 얼음 위에서 배양한다. 실온에서 10분 후, 20 ㎕ DNase I 분해 완충제(10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 5 mM CaCl₂, 5.0 mM MgCl₂)를 가한 다음, 15초 후 DNase I를 가하고 1분 45초간 배양한다. 이어서, DNase I 정지 완충제(10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 0.6 M 나트륨 아세테이트 pH 7.0, 0.5% SDS, 100 mM EDTA)를 가한다. 2.0 ㎕의 프로테아제 K(20 mg/㎖)를 가하고 샘플을 37℃에서 30분간 배양한다. 10 ㎕의 3 M NaOAc 및 4.0 ㎕ tRNA(10 mg/㎖)를 가한다. 샘플을 페놀/클로로포름 추출하고 수성 상을 100% 에탄올 2.5 부피로 침전시킨다. 70% 에탄올 세척 후, 펠릿을 서열분석 겔 로딩 완충제에 용해시키고, 가열한 다음 8% 서열분석 겔상에서 러닝시킨다. 네이키드 DNA를 전술한 바와 같이 DNase I으로 분해시키되, 단 핵 추출물 첨가 및 프로테아제 K 처리는 생략된다. Maxam-Gilbert 서열분석은 Current Protocols in Molecular Biology(Aubusel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994, 2: 12, 1-12,11)에 기재된 바와 같이 수행된다.

5.1.5 웨스턴 분석

콜레스테롤 또는 22-R-하이드록시콜레스테롤로 자극된 세포로부터의 RAW 세포 핵 추출물(35 ㎍ 단백질/레인)을 NuPage Bis-Tris 4-12% 구배 겔(Invitrogen, 미국 캘리포니아 칼스배드 소재) 상에 로딩한 다음 제조업자의 사양서에 따라 러닝시킨다. 단백질을 Immobilon-P PVDF 막(Millipore Corp. 미국 매사추세츠 베드포드 소재)에 옮긴다. 항체(2 mg/㎖ 스톡)를 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(미국 캘리포니아 산타크루즈 소재)로부터 입수하고 제조업자의 사양서에 따라 사용한다. 안티-USF1 C20X(카탈로그 넘버 sc-229X) 항체를 1/600의 희석비로 사용하고 안티-USF2 항체 C20X(카탈로그 넘버 sc862X) 및 N18X(카탈로그 넘버 sc861X)를 1/1000의 희석비로 사용한다.

5.2.1 근위 인간 ABC1 유전자 프로모터내 결합 모티프의 분석

인간 ABC1 유전자 프로모터의 이 영역내 전술한 전사 인자 결합 모티프 중 일부, Sp1(-100 및 -166 bp), AP1(-131 bp), LXR(-69 bp) 및 E-box(-147 bp)의 역할을 조사하기 위하여, 야생형(p200-L) 또는 돌연변이형의 -200 bp 인간 ABC1 프로모터의 조절하에 있는 루시퍼라제 리포터 작제물을 실시예 5.1.1에 따라 생성시킨다. 도 2a는 인간 ABC1 유전자의 -200 bp 프로모터 영역 중으로 도입된 점 돌연변이의 위치를 보여준다.

비자극 RAW 세포 중의 인간 ABC1 유전자의 전사 활성에 대한 이들 점 돌연변이의 효과는 도 2b에서 설명된다. 원위 Sp1 부위, AP1 부위 및 근위 Sp1 부위의 돌연변이는 프로모터 활성에 미미한 효과를 미칠 뿐이다. 이와는 반대로, E-box의 돌연변이는 프로모터 활성의 강력하고 의미있는 증가를 일으키며 LXR 요소의 돌연변이는 프로모터 활성의 강력하고 의미있는 감소를 일으킨다. 이들 결과는 인간 ABC1 E-box에 대한 전사 억제자의 결합 및 LXR 요소에 대한 전사 활성자의 결합과 일치한다.

5.2.2 LXR 요소의 돌연변이는 hABC1 유전자의 전사를 감소시킨다

도 3은 LXR 요소가 옥시스테롤에 반응하는 인간 ABC1 프로모터 모티프로서 연루됨을 보여준다. -69 bp에서 LXR 요소의 돌연변이는 비자극 세포 및 시스-레티논산(CRA)과 22(R)-하이드록시콜레스테롤(22OH)에 의해 자극된 세포에 대해 전사의 상당한 감소를 초래하였다. LXR 요소의 돌연변이는 또한, 아마도 콜레스테롤의 옥시스테롤로의 세포내 전환에 기인하여, 콜레스테롤-자극 세포에 대해 전사의 상당한 감소를 초래하였다. 따라서, LXR 요소는 콜레스테롤 및 시스-레티논산 및 하이드록시스테롤에 대한 감응성을 중개한다.

5.2.3 E-box의 돌연변이는 인간 ABC1 유전자의 전사를 증가시킨다

도 4는 E-box 모티프의 돌연변이 또는 결실이 비자극 RAW 세포에서 대략 3배까지 및 또한 콜레스테롤(c), 시스-레티논산(CRA) 및 옥시스테롤(22OH)로 자극된 RAW 세포에서 40배까지 인간 ABC1 유전자의 전사를 증가시킴을 증명한다. 더욱이, 근위 인간 ABC1 프로모터에서 E-box의 돌연변이 또는 결실은 CRA 또는 옥시스테롤의 자극 효과에 영향을 주지 않았다. 유사한 발견이 비자극 및 자극된 인간 배아 신장 293 세포에 대해서 증명되었다. 이러한 결과는 CRA 및 옥시스테롤에 의한 ABC1 유전자 전사의 LXR-매개 활성화가 온전한 E-box 모티프를 요하지 않으며 인간 ABC1 유전자에서 E-box에 전사 억제자의 결합과 일치함을 나타낸다.

5.2.4 핵 전사 인자는 인간 ABC1 유전자 프로모터에서 E-box와 결합한다

ABC1 근위 프로모터의 DNase I 풋프린트 분석은 RAW 핵 추출물(도 5)의 존재하에 E-box의 보호를 밝혀주었으며 이는 이 영역에의 단백질 결합을 표시한다. AP1 및 Sp1 모티프를 독립적으로 돌연변이시킴으로써 관찰된 전사 효과의 부족과 일치되게(도 2b), 인간 ABC1 프로모터내 이러한 잠재적 결합 부위의 어떠한 보호도 풋프린트 분석에 의해 자명하지 않았다(도 5).

E-box 모티프에 대한 핵 전사 인자의 결합을 추가 증명하기 위해, 본 출원인은 인간 ABC1 프로모터의 겔-쉬프트 분석을 수행하였다(도 6). 도 6b(좌측)에서 사용한 탐침은 ABC1 프로모터의 -171 내지 -71를 스패닝하는 100 bp 이본쇄 단편(단편 A로 명명)이다. 방사능 표지된 탐침과 비자극 RAW 세포로부터 분리된 핵 추출물과의 배양은 겔 쉬프트를 초래한다(도 6b). 쉬프트는 비표지 단편 A(A) 또는 E-box(EB)를 스패닝하는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드가 경쟁자로서 사용될 때 완전히 파괴되었다. 스크램블링된 E-box(EBm)를 암호화하는 27 bp 단편과의 경쟁은 겔 쉬프트 밴드를 파괴하지 않았다. 근위 또는 원위 Sp1 모티프 또는 AP1 결합 부위를 스패닝하는 이본쇄 DNA 단편에 의한 경쟁은 겔 쉬프트 밴드를 파괴하지 않았다. 이와 유사한 결과가 비자극 293 세포로부터의 핵 추출물이 사용될 때 관찰된다.

인간 ABC1 프로모터의 겔-쉬프트 분석도 E-box를 스패닝하는 27 bp 이본쇄 탐침(도 6a; 단편 EB; 우측 패널) 또는 전술한 바와 같은 스크램블링 돌연변이체 E-box 서열을 함유하는 대안의 탐침(단편 EBm)을 사용하여 수행한다. 야생형 E-box 탐침과 비자극 RAW 세포 핵 추출물의 배양은 겔 쉬프트를 초래하며, 이는 단백질이 이 탐침에 결합됨을 표시한다(도 6b; 중앙 패널). 비표지 야생형 경쟁자(EB)의 첨가는 결합을 제거한다. 이와 반대로, 돌연변이체 E-box 단편(EBm)과의 경쟁은 야생형 E-box에의 결합에 현저하게 영향을 주지 않았다. 더욱이, 세포 핵 추출물의 결합을 위한 표적 탐침으로서 돌연변이체 E-box의 사용은 겔 쉬프트 밴드의 형성을 초래하지 않았다(도 6b; 우측 패널). 이는 인간 ABC1 유전자의 야생형 E-box 모티프에 단백질의 특이적 결합을 분명히 증명한다.

5.2.5 USF는 hABC1 유전자 프로모터내 E-box에 결합한다

인간 ABC1 프로모터에서, E-box는 두 C에 의해 플랭킹되어, CCACGTGC의 서열을 이끌게 된다. 이는 전사 인자 USF에 대한 컨센서스 모티프에 대한 완전한 매치이다. USF가 사실상 hABC1 유전자 프로모터에서 E-box에 결합하는 전사 인자임을 확립하기 위하여, USF-특이성 항체를 이용하는 겔 쉬프트 분석을 수행한다(도 6c). 탐침으로서 100-bp 단편을 사용하여(도 6c, 좌측 패널), E-box가 RAW 세포 핵 추출물에서 일부 단백질을 겔-쉬프트함이 증명되었다. USF1 또는 USF2의 아미노(N) 또는 카복시(C) 말단에 대한 안티-USF 항체의 첨가는 겔-쉬프트된 탐침의 수퍼쉬프트를 초래하였고, 이는 USF1 및 USF2로서 E-box 결합 단백질의 동일성을 확인시켜 준다. Mad1, MaD2, Mad3, Max, c-Myc와 MyoD 및 Sp1, c-Jun, JunB 및 JunD를 포함한 다른 E-box 결합 단백질에 대한 항체는 DNA-단백질 겔 쉬프트 밴드와 경쟁하거나 수퍼쉬프트하지 않았다.

E-box(EB)를 스패닝하는 27 bp 이본쇄 단편을 안티-USF 항체와 예비 배양함으로써 유사한 결과가 수득되었다(도 6c; 우측 패널). 100 bp 겔 쉬프트 단편으로 할 때처럼, E-box 모티프와 결합하는 것으로도 알려진 전사 인자의 나선-루프-나선 계통의 다른 멤버에 특이적인 항체는 27 bp EB 탐침으로 수득된 겔 쉬프트 밴드를 변화시키지 않았다. 비자극 RAW 세포 및 콜레스테롤이나 옥시스테롤로 자극된 RAW 세포로부터 추출된 핵 추출물이 EB 탐침과 배양될 때 수득된 겔 쉬프트 밴딩 패턴에 어떠한 차이도 발견되지 않았다.

이러한 병합 데이터는 근위 ABC1 프로모터내 E-box와 결합하는 전사 인자로서 USF1 및 USF2를 확인시켜 주며 ABC1 유전자 발현의 공지 활성자에 의해 이들의 결합이 조절되지 않음을 나타낸다.

5.2.6 USF1 및 USF2는 RAW 세포에서 발현된다

RAW 세포 핵 추출물내 USF의 존재는 USF1(N- 및 C-말단) 및 USF-2(N- 및 C-말단)에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 하이브리드화 분석의 수행에 의해 확립된다. 크기가 대략 43 및 44 KDa인 두 주된 면역반응 밴드가 확인되며 RAW 세포에서 이들의 발현은 콜레스테롤 또는 옥시스테롤로의 자극에 의해 변화되지 않았다. 중요하게는, 카복시-말단 전사 활성화 도메인이 부족한 18 kDa 미니-USF 이소형(Liu et al., JBC, 1999, 274; 35037-35045; Sirito et al., Nucl Acids Res. 1994, 22:427-433)의 발현은 비자극 RAW 세포 또는 콜레스테롤이나 옥시스테롤과 24시간 배양한 RAW 세포에서 검출되지 않았다.

본 명세서에서 언급된 모든 논문, 특허, 및 특허출원은 본원에서 참조로 인용된다.

참조문헌

Claims (56)

1. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산, 또는 상보 서열의 분리된 핵산.
2. 제 1 항에 있어서, 서열번호 2 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산, 또는 상보 서열의 분리된 핵산.
3. 제 1 항에 있어서, 서열번호 3 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산, 또는 상보 서열의 분리된 핵산.
4. 제 1 항에 있어서, 서열번호 4 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산, 또는 상보 서열의 분리된 핵산.
5. 제 1 항에 있어서, 서열번호 5 서열의 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산, 또는 상보 서열의 분리된 핵산.
6. 제 1 항에 있어서, 핵산이 이의 조절하에 놓인 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 분리된 핵산.
7. 제 6 항에 있어서, 분리된 핵산이 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대하여, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -200의 뉴클레오타이드에 이르는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드인 분리된 핵산.
8. 제 6 항에 있어서, 분리된 핵산이 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대하여, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -300의 뉴클레오타이드에 이르는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드인 분리된 핵산.
9. 제 6 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대하여, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -600의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
10. 제 6 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대하여, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -2894의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
11. 제 6 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대하여, 위치 +120의 뉴클레오타이드에서 위치 -995의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
12. 제 6 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대하여, 위치 +108의 뉴클레오타이드에서 위치 -2228의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
13. 제 6 항에 있어서, 분리된 핵산이 이의 조절하에 놓인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 활성화시키는 분리된 핵산.
14. 제 6 항에 있어서, 분리된 핵산이 이의 조절하에 놓인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 억제하는 분리된 핵산.
15. 제 1 항에 따른 분리된 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 분리된 핵산.
16. 제 15 항에 있어서, 분리된 핵산이 이의 조절하에 놓인 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 분리된 핵산.
17. 제 15 항에 있어서, 분리된 핵산이 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -300의 뉴클레오타이드에 이르는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드인 분리된 핵산.
18. 제 15 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -600의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
19. 제 15 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -200의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
20. 제 15 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -2894의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
21. 제 15 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 +120의 뉴클레오타이드에서 위치 -995의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
22. 제 15 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 +108의 뉴클레오타이드에서 위치 -2228의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
23. 고 엄격 하이브리드화 조건하에서, 제 1 항에 따른 분리된 핵산과 하이브리드화하는 분리된 핵산.
24. 제 23 항에 있어서, 분리된 핵산이 이의 조절하에 놓인 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 분리된 핵산.
25. 제 24 항에 있어서, 분리된 핵산이 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -300의 뉴클레오타이드에 이르는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드인 분리된 핵산.
26. 제 24 항에 있어서, 분리된 핵산이 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -200의 뉴클레오타이드에 이르는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드인 분리된 핵산.
27. 제 24 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -600의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
28. 제 24 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 -1의 뉴클레오타이드에서 위치 -2894의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
29. 제 24 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 +120의 뉴클레오타이드에서 위치 -995의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
30. 제 24 항에 있어서, 서열번호 1 뉴클레오타이드 서열의 위치 2894에 위치되는, 전사된 제 1 뉴클레오타이드에 대해, 위치 +108의 뉴클레오타이드에서 위치 -2228의 뉴클레오타이드에 이르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.
31. 제 24 항에 있어서, 분리된 핵산이 이의 조절하에 놓인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 활성화시키는 분리된 핵산.
32. 제 24 항에 있어서, 분리된 핵산이 이의 조절하에 놓인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 억제하는 분리된 핵산.
33. 당해 폴리펩타이드 및 당해 핵산 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 제 1 항 내지 32 항 중 어느 한 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 분리된 핵산.
34. 제 33 항에 있어서, 적어도 하나의 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 센스 올리고뉴클레오타이드 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택된 적어도 하나의 당해 핵산을 암호화하는 분리된 핵산.
35. 제 1 항 내지 34 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
36. 제 35 항에 있어서, 벡터가 재조합 클로닝 벡터 및 재조합 발현 벡터 중에서 선택되는 재조합 벡터.
37. 제 1 항 내지 34 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 핵산으로 형질전환된 숙주세포.
38. 제 35 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
39. 체세포 및 생식세포 중에서 선택된 포유동물 세포의 적어도 하나가 제 1 항 내지 34 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 핵산으로 형질전환된 비-인간 트랜스제닉 포유동물.
40. 체세포 및 생식세포 중에서 선택된 포유동물 세포의 적어도 하나가 제 35 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 비-인간 트랜스제닉 포유동물.
41. a)제 37 항 또는 제 38 항에 따라 형질전환된 숙주세포를 배양하고;

    b)후보 물질 또는 분자의 존재하에 형질전환 숙주세포를 배양하며;

    c)당해 폴리뉴클레오타이드의 발현을 검출한 다음;

    d)단계 c)에서 수득한 검출 결과를 후보 분자 또는 물질의 부재하에서 형질전환 숙주세포를 배양하여 수득된 검출 결과와 비교하는 단계를 포함하는,

    제 33 항에 따른 분리된 핵산의 성분인 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 물질 또는 분자의 스크리닝 방법.
42. a)제 37 항 또는 38 항에 따라 형질전환된 숙주세포;

    b)임의로, 제 30 항에 따른 분리된 핵산의 성분인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사 검출에 요구되는 수단을 포함하는,

    제 33 항에 따른 분리된 핵산의 성분인 당해 폴리펩타이드의 전사를 변형시키는 후보 분자 또는 물질의 시험관내 스크리닝용 키트.
43. a)물질 또는 분자를 제 39 항 또는 40 항에 따른 비-인간 트랜스제닉 포유동물에 투여하고;

    b)단계 a)에서 처리된 트랜스제닉 포유동물에서 당해 폴리뉴클레오타이드의 발현을 검출하며;

    c)단계 b)에서의 검출 결과를 후보 물질 또는 분자의 투여를 받지 않은 제 39 항 또는 40 항에 따른 비-인간 트랜스제닉 포유동물에서 관찰된 결과와 비교하는 단계를 포함하는,

    제 33 항에 따른 분리된 핵산의 성분인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 물질 또는 분자의 시험관내 스크리닝 방법.
44. a)제 39 항 또는 40 항에 따른 비-인간 트랜스제닉 포유동물;

    b)임의로, 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사 검출에 요구되는 수단을 포함하는,

    제 1 항, 15 항 및 23 항 중 어느 한 항에 따른 분리된 핵산의 성분인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 적어도 하나의 후보 분자 또는 물질의 생체내 스크리닝용 키트 또는 팩.
45. 제 33 항에 따른 분리된 핵산의 성분인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 물질.
46. 제 45 항에 있어서, 물질이 제 33 항에 따른 분리된 핵산의 성분인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 적어도 하나의 분자를 포함하는 물질.
47. 제 45 항에 있어서, 물질이 제 41 항의 방법 또는 제 43 항의 방법에 따라 선택되는 물질.
48. 제 45 항 내지 47 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 물질 또는 분자를 활성 성분으로 포함하는 약학 조성물.
49. 제 48 항에 있어서, 조성물이 과콜레스테린혈증 및 아테롬성동맥경화증 중에서 선택된 질병의 치료에 사용되는 약학 조성물.
50. 제 45 항 내지 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 의약품의 활성 성분으로서의 물질.
51. a)시험될 개체로부터 기원하는 생물학적 물질로부터 전체 메신저 RNA를 추출하고;

    b)생물학적 물질에 존재하는 ABC1 메신저 RNA를 정량한 다음;

    c)단계 b)에서 수득한 ABC1 메신저 RNA의 양을 정상 개체에서 기대된 ABC1 메신저 RNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 개체내 ABC1 유전자의 전사 손상 검출방법.
52. a)개체로부터 기원하는 생물학적 물질을 출발물질로 하여, ABC1 유전자의 전사 개시 부위의 상류에 위치된 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하고;

    b)단계 a)에서 수득된 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 1의 서열과 정렬시킨 다음;

    c)시험될 개체의 생물학적 물질로부터 기원하는 서열분석된 폴리뉴클레오타이드와 서열번호 1의 레퍼런스 서열 간의 뉴클레오타이드 차이를 측정하는 단계를 포함하는, 개체내 ABC1 유전자의 전사 손상 검출방법.
53. 개체로부터 기원하는 생물학적 물질내 ABC1 메신저 RNA의 정량에 요구되는 수단을 포함하는, 개체내 ABC1 유전자의 전사 손상 검출용 키트.
54. 개체내 ABC1 유전자의 전사 개시 부위의 상류에 위치된 폴리뉴클레오타이드의 서열분석에 요구되는 수단을 포함하는, 개체내 ABC1 유전자의 전사 손상 검출용 키트.
55. a)제 1 항 내지 34 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 핵산, 또는 제 35 항에 따른 재조합 벡터를 시험될 후보 분자 또는 물질과 배양한 다음;

    b)후보 분자 또는 물질과 후보 분자 또는 물질 간에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는,

    제33 항에 따른 분리된 핵산의 성분인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 분자 또는 물질의 스크리닝 방법.
56. a)제 1 항 내지 34 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 핵산 또는 제 35 항에 따른 재조합 벡터;

    b)임의로, 후보 분자 또는 물질과 분리된 핵산 간에 형성된 복합체의 검출에 요구되는 수단을 포함하는,

    제 33 항에 따른 분리된 핵산의 성분인 당해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 변형시키는 후보 분자 또는 물질의 스크리닝용 키트 또는 팩.