FR2822165A1

FR2822165A1 - Acide nucleique regulateur du gene abca7, molecules modulant son activite et applications therapeutiques

Info

Publication number: FR2822165A1
Application number: FR0013649A
Authority: FR
Inventors: Patrice Denefle; Montus Marie Francoise Rosier; Catherine Prades; Reguigne Isabelle Arnould; Y Fortea Jose Osorio; Nicolas Duverger; Giovanna Chimini
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2000-10-24
Publication date: 2002-09-20
Anticipated expiration: 2020-10-24
Also published as: FR2822165B1

Abstract

La présente invention concerne un acide nucléique capable de réguler la transcription du gène ABCA7, qui code pour une protéine transporteur susceptible de jouer un rôle dans le métabolisme des lipides et/ ou dans les processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.Par ailleurs, de par la position du gène sur le chromosome 19 en q13, ABCA7 est potentiellement impliqué dans d'autres pathologies liées génétiquement à ce locus.La présente invention est également relative à des constructions nucléotidiques comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène ABCA7.L'invention a également trait à des vecteurs recombinants, des cellules hôtes transformées et des mammifères transgéniques non humains comprenant un acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 ou une construction nucléotidique précitée, ainsi que des procédés pour le criblage de molécules ou de substances capables de moduler l'activité de l'acide nucléique régulateur du gène ABCA7.

Description

ACIDE NUCLEIQUE REGULATEUR DU GENE ABCA7. MOLECULES MODULANT
SON ACTIVITE ET APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
La présente invention concerne un acide nucléique capable de réguler la transcription du gène ABCA7, qui est un gène susceptible d'intervenir dans le métabolisme des lipides au niveau des tissus hématopoïétiques, ainsi que dans les mécanismes de signalisation cellulaire liés à la réaction immunitaire et à l'inflammation.

La présente invention décrit aussi des polypeptides et des polynucléotides dont une altération de la séquence ou de l'expression est potentiellement impliquée dans des maladies associées au locus génétique q13 du chromosome 19.

La présente invention est également relative à des constructions nucléotidiques comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ou produisant un acide nucléique d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène humain ou murin ABCA7.

L'invention a également trait à des vecteurs recombinants, des cellules hôtes transformées, et des mammifères transgéniques non humains, comprenant un acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 humain et de souris ou une construction nucléotidique précitée, ainsi que des procédés pour le criblage de molécules ou de substances capables de moduler l'activité de l'acide nucléique régulateur du gène ABCA7.

L'invention est en outre relative à des procédés permettant de détecter une altération de la transcription du gène ABCA7 et ainsi de diagnostiquer un éventuel dysfonctionnement dans le métabolisme lipidique au niveau des tissus hématopoïétiques et dans les mécanismes de signalisation cellulaire de l'immunité.

Elle a également pour objet des substances ou molécules modulant l'activité de l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 ainsi que des compositions pharmaceutiques contenant de telles substances ou de telles molécules.

Les protéines transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) constituent une superfamille extrêmement conservées au cours de l'évolution, de la bactérie à l'homme. Ces protéines sont impliquées dans le transport membranaire de divers substrats, par exemple des ions, des acides aminés, des peptides, des sucres, des

vitamines ou encore des hormones stéroïdiennes (Higgins et ai., Annu Rev. Ceil Biot, 8, (1992) 67-113).

La caractérisation de la séquence complète en acides aminés de certains transporteurs ABC a permis de définir une structure générale commune, comprenant notamment, deux repliements de liaison aux nucléotides (Nucleotide Binding Fold ou NBF) avec des motifs de type Walker A et B, ainsi que deux domaines transmembranaires, chacun des domaines transmembranaires étant constitué de six hélices (Klein et a !., 66, 1461 (1999), 237-262). La spécificité des transporteurs ABC pour les différentes molécules transportées semble être déterminée par la structure des domaines transmembranaires, alors que l'énergie nécessaire à l'activité de transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du repliement NBF (Dean et al., Curr. Opin. Genet. Dev, 5 (1995) 779-785).

Plusieurs protéines transporteurs ABC ont été identifiées chez l'homme et un certain nombre d'entre elles ont été associées à diverses maladies.

Par exemple, la mucoviscidose est provoquée par des mutations dans le gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), également désigné ABCC7.

Par ailleurs, certains phénotypes de résistance multiple aux médicaments dans les cellules tumorales ont été associés à des mutations dans les gènes codant des protéines MDR (multi-drug resistance) également désignés ABCB, qui ont également une structure de transporteur ABC.

D'autres transporteurs ABC ont été associés à des affections neuronales et tumorales (brevet US N'5, 858,719) ou sont encore potentiellement impliqués dans des maladies provoquées par une altération de l'homéostasie des métaux, notamment la protéine ABC-3.

De même, un autre ABC transporteur, désigné PFIC2 ou ABCB11, semble être impliqué dans une forme de cholestasie intrahépatique familiale progressive, cette protéine étant potentiellement responsable, chez l'homme, de l'exportation des sels biliaires.

Une sous-famille A des transporteurs ABC désignée ABCA a été également identifiée. Elle se caractérise par la présence d'un segment hautement hydrophobe (HH1 : highly hydrophobic) entre les deux domaines transmembranaires, liés aux deux motifs NBF (Broccardo et al., BBA 1461 (1999) 395-404). Quatre membres de

cette sous famille ont été jusqu'à présent caractérisés. Il s'agit des transporteurs ABCA1 et ABCA2, tous deux localisés sur le chromosome 9, respectivement aux locus 9q22-9q31 et 9q34, ainsi que le transporteur ABCA3 localisé sur le chromosome 16p13. 3, et enfin le transporteur ABCA4 ou ABCR localisé sur le chromosome 1 p22 (Broccardo et al., 1999). Les membres de cette sous famille sont également fortement conservés au cours de l'évolution des eucaryotes multicellulaires. A titre d'exemples les transporteurs ABCA1 et ABCA4 qui sont les mieux connus présentent une identité respectivement de 95% et de 88% avec leurs orthologues murins. Les membres de cette sous famille sont en outre fortement apparentés, puisque par exemple les transporteurs ABCA1 et ABCA4 présentent une identité de séquence protéique de 50. 9%, ainsi qu'une organisation génomique très similaire (Allikmets et al., Nat. Genet. (1997) 15,236-246 ; Broccardo et al., Biochim. Biophys. Acta (1999) 1461,395-404 ; Luciani et al., Genomics (1994)

21 (1), 150-9 ; Remaley et al., Proc. Naht/. Acad. Sci. USA (1999) 96 (22), 12685-90).

Par ailleurs, les membres de la sous-famille A semblent présenter une spécialisation fonctionnelle similaire au niveau du transport des lipides et des phospholipides membranaires. Il a en effet été montré que la perte de la fonction de ces transporteurs affecte le renouvellement des phospholipides de la bicouche des membranes cellulaires. Dans le cas de ABCA4, on constate dans un premier temps un renouvellement anormal des phosphatidyléthanolamine (PE) dans la partie externe de la membrane des cellules à bâtonnets, qui conduit par une succession d'évènements, à une perte totale de l'acuité visuelle (Weng et al., Cell (1999) 98 (1), 13-23. Dans le cas de ABCA1, on constate une distribution anormale des phospholipides membranaires au sein des couches de la membrane plasmique, qui résulte plus précisément en la présence en plus grande quantité de

phosphatidylsérine dans la couche externe, et en une perturbation de la concentration de Ca2+.

Les transporteurs ABCA1 et ABCA4 ont été particulièrement étudiés. Le gène ABCA1 semble en effet être impliqué dans les pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme du cholestérol induisant des maladies comme l'athérosclérose, ou des déficiences familiales en HDL (FHD) comme la maladie de Tangier (FR 99/7684000 ; Rust et al., Nat. Genet., 22 (1999) 352-355 ; Brooks-Wilson et al., Nat. Genet., 22 (1999) 336-345 ; Bodzioch et al., Nat. Genet. 22 (1999) 347-

351 ; Orso et al., Nat. Genet, 24 (2000) 192-196). La maladie de Tangier semblerait être liée à un déficit cellulaire dans la translocation du cholestérol cellulaire qui entraîne une dégradation des HDLs, et par là même une perturbation du métabolisme lipoprotéique. Ainsi, il semblerait que les particules HDL qui n'incorporent pas de cholestérol à partir des cellules périphériques, ne sont pas métabolisées correctement, mais sont au contraire éliminées rapidement de l'organisme. La concentration plasmatique en HDL de ces patients est donc extrêmement réduite et les HDLs n'assurent plus le retour du cholestérol vers le foie. Ce cholestérol s'accumule dans ces cellules périphériques et provoque des manifestations cliniques caractéristiques telles que la formation d'amygdales orangées. De plus, d'autres perturbations lipoprotéiques comme une surproduction de triglycérides ainsi qu'une synthèse et un catabolisme intracellulaire accrus des phospholipides sont observées.

Le transporteur ABCA4 a par ailleurs été associé aux maladies dégénératives et inflammatoires occulaires telles que la maladie récessive de

Stargardt (Allikmets et al., 1997) et la dégénérescence de la région maculaire de la rétine liée à l'âge (AMD) (Allikmets et aL, Nat. Genet. 15 (1997) 236-246 ; Allikmets et al., Science, 277 (1997) 1805-1807 ; Cremers et al., Hum. Mol. Genet. (1998), 7 (3), 355-62 ; Martinez-Mir et al., Nat. Genet. 18 (1998) 11-12 ; Weng et aL, Cell (1999) 98 (1), 13-23).

Chez l'homme, un ADNc comprenant la totalité de la phase de lecture ouverte d'un nouveau membre de la sous famille A des transporteurs ABC ( ATP- Binding Cassette ) a été récemment cloné à partir d'ARN de macrophages humains, et est désigné ABCA7 (Kaminski et al., BBR, 273 (2000), 532-538).

La caractérisation de la séquence complète en acides aminés de ABCA7 indique que le produit protéique présente la structure générale caractéristique des transporteurs ABCA, en ce qu'elle comporte la structure symétrique comprenant les deux domaines transmembranaires et deux motifs NBF. En plus de ces motifs

caractéristiques, la protéine ABCA7 présente d'autres motifs qui ont été récemment identifiés comme étant caractéristiques des transporteurs ABCA, à savoir la région HH1 et la région hot spot (Broccardo et al., Biochim. Biophys. Acta (1999) 1461, 395-404).

Comme les autres membres de la sous famille A des transporteurs ABC, la séquence de la protéine ABCA7 est hautement conservée chez la souris et chez l'homme, avec une identité inter-espèce de 79%. La protéine ABCA7 présente de plus une organisation intron-exon caractéristique des membres de la sous famille ABCA, ainsi qu'une forte homologe de séquence notamment avec les transporteurs humains ABCA1 et ABCA4, respectivement de 54% et de 49%.

Par ailleurs, la protéine transporteur ABCA7 semble présenter un profil de régulation dépendant des flux de stérol, similaire à celui des autres membres de la sous famille A, et notamment du transporteur ABCA1 (Langman et al., BBR Com ; 257 (1999), 29-33 ; Laucken et al., PNAS, 97 (2000) 817-822). Il a été en effet observé par Kaminski et al. (supra) une augmentation de l'expression de ABCA7 après incubation des macrophages humains en présence de lipoprotéines de faible densité acétylées (AcLDL) qui induisent une charge de stérol, ainsi qu'une diminution de l'expression en présence de l'accepteur de cholestérol HDL3 qui provoque une diminution de la charge en stérol.

D'autre part, ABCA7 présente comme les autres membres ABCA une certaine spécialisation de son expression tissulaire, le messager de ABCA7 étant présent de manière prédominante dans les tissus hématopoïétiques constitués par

les lymphocytes, les granulocytes, le thymus, la rate, la moelle osseuse, ou les tissus foetaux, alors que l'expression de ABCA1 est prédominante dans les macrophages et le placenta, et que celle de ABCA4 est restreinte dans la rétine (Rust et al., Nat.

Genet, 22, (1999) 352-355).

L'ensemble des données précédemment exposées relatives à l'identité des séquences protéiques, au mécanisme de régulation et la spécificité de l'expression suggère que le gène ABCA7 constitue un autre transporteur de la sous famille A, et que celui-ci présente une fonction similaire ou même redondante à celle des autres transporteurs et notamment à celle du transporteur ABCA1. Ce transporteur interviendrait donc vraisemblablement en tant que médiateur dans le métabolisme des lipides, et il est très possible qu'il soit, au même titre que le transporteur ABCA1, responsable de certains dysfonctionnements ou déficiences métaboliques. Par ailleurs, la spécialisation de l'expression du transporteur ABCA7 indique vraisemblablement que ce dernier joue un rôle dans le transport transmembranaire (export) des lipides dans les tissus hématopoïétiques, et possiblement dans les

mécanismes de signalisation Iymphocytaires de l'immunité, par exemple dans le cas de la pathogenèse de l'athérosclérose comme l'indiquent Kaminski et al. (Supra).

Bien que l'expression du gène ABCA7 humain semble être régulée selon le type de cellule ou encore la situation métabolique d'un type cellulaire donné, la ou les séquences permettant de réguler ce gène n'étaient pas connues.

Or, il existe un besoin dans l'état de la technique d'identifier ces séquences régulatrices pour les raisons suivantes : a) Ces séquences sont susceptibles d'être mutées chez des patients atteints d'une pathologie liée à un déficit dans le transport des lipides, possibles substrats de la protéine ABCA7 ou chez les patients susceptibles de développer de telles pathologies.

La caractérisation des séquences régulatrices du gène ABCA7 humain permettrait de détecter des mutations chez des patients, en particulier de diagnostiquer les individus appartenant à des groupes familiaux à risques. En outre, l'isolement de ces séquences régulatrices rendrait possible la complémentation de la séquence mutée par une séquence fonctionnelle susceptible de pallier les dysfonctionnements métaboliques induits par la ou les mutations diagnostiquées, grâce à la construction de moyens thérapeutiques ciblés, tels que des moyens destinés à la thérapie génique. b) La caractérisation des séquences régulatrices du gène ABCA7 mettrait à la disposition de l'homme du métier des moyens aptes à permettre la construction par génie génétique puis l'expression de gènes déterminés dans les types cellulaires dans lesquels le gène ABCA7 est préférentiellement exprimé. c) Par ailleurs, certaines parties des séquences régulatrices du gène ABCA7 pourraient constituer des séquences promotrices constitutives à fort niveau d'expression, de nature à permettre la construction de moyens nouveaux pour l'expression de séquences déterminées dans les cellules, complétant un ensemble de moyens déjà existants.

Force est de constater que, malgré les efforts entrepris, les séquences régulatrices du gène ABCA7 étaient restées jusqu'à ce jour totalement inconnues.

Les inventeurs ont désormais isolé puis analysé un ADN génomique humain de 33,5kb comprenant les 46 exons du cadre ouvert de lecture du gène ABCA7 ainsi que la région non transcrite d'environ 1, 1 kb localisée du côté 5'de

l'exon 1, en amont du site +1 de transcription, et comprenant des signaux de régulation du gène ABCA7 humain.

Les inventeurs ont également isolé puis analysé un ADN génomique murin de 20Kb comprenant les 45 exons du cadre ouvert de lecture du gène ABCA7 ainsi que la région non transcrite d'environ 1,2Kb chez la souris localisée du côté 5'de l'exon 1, en amont du site +1 de transcription, et comprenant des signaux de régulation du gène ABCA7 murin. DEFINITION GENERALES
Le terme"isolé"au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).

Par exemple un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme"isolé".

Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur eVou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.

Le terme"purifié"ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.

Un polynucléotide est à l'état"purifié"après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3

et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.

Aux fins de la présente description, l'expression"séquence nudéotidique" peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression"séquence nucléotidique"englobe le matériel de génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.

Les termes"acide nucléique","polynucléotide","oligonucléotide"ou encore"séquence nucléotidique"englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc

ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.

Le terme"nucléotide"désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04 064.

Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant"complémentaire"d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ouAetU), ou Cet G.

Par"variant"d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucléotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagenèse.

En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquences d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.

Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi produire des substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre, de telles modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d'aminoacides.

De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent pour

des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la

capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial.

Certains acides nucléiques variants coderont ainsi pour des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question. La connaissance de ces variants par rapport à la maladie étudiée est fondamentale puisqu'elle permet de comprendre la cause moléculaire de la pathologie.

On entendra par"fragment"un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à l'acide nucléique de référence.

Un tel"fragment"d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucléotide plus grand duquel il est constitutif.

De tels fragments comprennent, ou alternativement consistent en, des oligonucléotides de longueur allant de 20 à 25,30, 40,50, 70,80, 100,200, 500, 1000 ou 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.

Par"fragment biologiquement actif"d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention, on entend un acide nucléique capable de moduler la transcription d'une séquence d'ADN placée sous son contrôle. Un tel fragment biologiquement actif comprend un promoteur de base et/ou un élément régulateur, tels que définis dans la présente description.

Par"acide nucléique régulateur"selon l'invention, on entend un acide nucléique qui active et/ou régule l'expression d'une séquence d'ADN sélectionnée et placée sous son contrôle.

Par"promoteur", on entend une séquence d'ADN reconnue par les protéines de la cellule impliquées dans l'initiation de la transcription d'un gène. Le promoteur de base est l'acide nucléique régulateur minimal capable d'initier la transcription d'une séquence d'ADN déterminée qui est placée sous son contrôle. En général, le promoteur de base consiste en une région d'ADN génomique en amont du site d'initiation de la transcription où se trouve très souvent une séquence CAAT (où se fixe un ou plusieurs facteurs protéiques de transcription) ainsi que, sauf dans de rares cas comme dans certains gènes domestiques, la séquence TATA ou "TATA box"ou une boîte apparentée. C'est au niveau de cette boite que se fixe

une ARN polymérase ainsi qu'un ou plusieurs facteurs de transcription, tels que les protéines se fixant sur la boîte"TATA" (TATA box Binding Proteins ou TBPs).

Une séquence nucléotidique est placée sous le contrôle"d'un acide nucléique régulateur lorsque cet acide nucléique régulateur est localisé, par rapport à la séquence nucléotidique, de telle manière à contrôler l'initiation de la transcription de la séquence nucléotidique par une ARN polymérase.

Par"élément régulateur"ou"séquence régulatrice"au sens de l'invention, on entend un acide nucléique comprenant des éléments capables de moduler la transcription initiée par un promoteur de base, tels que des sites de fixation de divers facteurs de transcription, des séquences"enhancer" d'augmentation de la transcription ou des séquences"silencer"d'inhibition de la transcription.

Par séquence"enhancer", on entend une séquence d'ADN incluse dans un acide nucléique régulateur capable d'augmenter ou de stimuler la transcription initiée par un promoteur de base.

Par séquence"silencer", on entend une séquence d'ADN incluse dans un acide régulateur capable de diminuer ou d'inhiber la transcription initiée par un promoteur de base.

Des éléments régulateurs peuvent être présents en dehors de la séquence localisée du côté 5'du site d'initiation de la transcription, par exemple dans les introns et les exons, y compris dans les séquences codantes.

Le promoteur de base et l'élément régulateur peuvent être"spécifiques d'un ou plusieurs tissus", s'ils permettent la transcription d'une séquence d'ADN déterminée, placée sous leur contrôle, préférentiellement dans certaines cellules (par exemple les cellules spécifiques d'un tissu), c'est à dire soit exclusivement dans les cellules de certains tissus, soit à des niveaux de transcription différents selon les tissus.

Par"facteur de transcription", on entend des protéines qui interagissent

préférentiellement avec des éléments régulateurs d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, et qui stimulent ou au contraire répriment la transcription. Certains facteurs de transcription sont actifs sous forme de monomères, d'autres étant actifs sous la forme d'homo-ou d'hétérodimères.

Le terme"modulation"vise soit une régulation positive (augmentation, stimulation) de la transcription, soit une régulation négative (diminution, inhibition, blocage) de la transcription.

Le"pourcentage d'identité"entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.

La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des "gaps") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.

Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux

séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.

L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.

À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4. 9 de mars 1996, BLAST 2.0. 4 de février 1998 et BLAST 2.0. 6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (Altschul et al, J. Mol. Bist., (1990) 215 : 403-410 ; Altschul et al, Nucleic Acids Res. (1997) 25 : 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence"requête"de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. (Supra). La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.

Par"conditions d'hybridation de forte stringence"au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes : 1-Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION :

- Mélanger : 40 l ADN sperme de saumon (1 Omg/ml) + 40 l ADN placentaire humain (10mg/ml)

- Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange. - Oter le tampon SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.

- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.

- Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.

2-Compétition de la sonde marquée :

- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 pl ADN Cot 1, selon la quantité d'hybridations non spécifiques.

- Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C.

- Incuber à 65 C pendant 2 à 5 heures.

3-Hybridation : - Oter le mix de pré hybridation. - Mélanger 40 ul ADN sperme de saumon + 40 l ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace. - Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot 1 dénaturée. - Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation.

4-Lavaqes : - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.

- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0, 1%.

- 2 fois 15 minutes SSC 0, 1X et SDS 0, 1% à 65 C.

Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.

Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.

Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.

Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) (Nucleic acid Hybridization iapractical Approach, Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de F. AUSUBEL et al (1999) (Currents Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y).

Par"transformation"au sens de l'invention, on entend l'introduction d'un acide nucléique (ou d'un vecteur recombinant) dans une cellule hôte. Le terme " transformation)) englobe également une situation dans laquelle le génotype d'une cellule a été modifié par un acide nucléique exogène, et que cette cellule ainsi transformée exprime ledit acide nucléique exogène, par exemple sous la forme d'un polypeptide recombinant ou encore sous la forme d'un acide nucléique sens ou antisens.

Par"animal transgénique"au sens de l'invention, on entend un animal non humain, de préférence un mammifère, dans lequel une ou plusieurs cellules contiennent un acide nucléique hétérologue introduit grâce à l'intervention humaine, tel que par des techniques de transgénèse bien connues de l'homme du métier. L'acide nucléique hétérologue est introduit directement ou indirectement dans la

cellule ou le précurseur de la cellule, par manipulation génétique telle que microinjection ou infection par un virus recombinant. L'acide nucléique hétérologue peut

être intégré dans le chromosome, ou peut se présenter sous la forme d'ADN se répliquant de manière extra-chromosomique. ACIDE NUCLEIQUE REGULATEUR DU GENE ABCA7
A partir de banques de vecteurs de type BAC préparées à partir de matériel génomique humain et murin, les inventeurs ont réussi à isoler un acide nucléique régulateur des gènes ABCA7 humain et murin.

Les inventeurs ont déterminé par une analyse comparative des séquences génomiques humaines et murines, un acide nucléique régulateur comprenant particulièrement deux modules de régulation conservés chez l'homme et la souris.

Les inventeurs ont donc déterminé que l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7, lorsqu'il est défini de la manière la plus large, est constitué d'un polynucléotide comprenant, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3' : - une région non transcrite d'environ 1,2 kb localisée en amont du site

d'initiation de la transcription du gène ABCA7, et - la séquence partielle du premier exon du gène ABCA7.

Dans sa définition la plus générale, l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 comprend l'ensemble des régions nucléotidiques telles que définies ci-dessus et est identifié dans la séquence SEQ ID N 1 selon l'invention.

Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID Nol, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

La région d'environ 1, 1 Kb localisée en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7, et comprenant le promoteur de base et de multiples éléments régulateurs de la transcription est comprise également dans la séquence identifiée comme la SEQ ID ? 2 selon l'invention.

Plus précisément, le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ ID ? 2 est le nucléotide en position-1111, par rapport au site d'initiation de la transcription du gène ABCA7.

Selon un second aspect, l'invention est relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la

séquence nucléotidique SEQ ID NO2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

Comme déjà précisé ci-dessus, l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 de séquence SEQ ID N 1 comprend, outre une région 5'régulatrice non transcrite, également la partie 5'du premier exon du gène ABCA7 humain.

La séquence partielle du premier exon du gène ABCA7 est définie comme la séquence SEQ ID ? 3.

Selon un troisième aspect, l'invention est relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de séquence nucléotidique SEQ ID ? 3 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

De préférence, un acide nucléique selon l'invention sera sous une forme isolée eVou purifiée.

Fait également partie de l'invention tout fragment"biotogiquement actif" d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini ci-dessus.

En particulier, cet acide nucléique peut être d'origine murine, et est constitué d'un polynucléotide de séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 comprenant de l'extrémité 5'vers 3' :

- une région non transcrite d'environ 1, 2 Kb localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7 murin, et - la séquence partielle du premier exon du gène ABCA7.

La région d'environ 1,2Kb localisée en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7, et comprenant le promoteur de base et de multiples éléments régulateurs de la transcription est comprise également dans la séquence identifiée comme la SEQ ID NO : 5 selon l'invention.

L'invention englobe également un acide nucléique caractérisé en ce qu'il hybride, dans des conditions de forte stringence, avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention.

L'invention concerne aussi un acide nucléique ayant au moins 80%, avantageusement 90%, de préférence 95% et de manière tout à fait préférée 98%

d'identité en nucléotides avec un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des

séquences nucléotidiques SEQ ID D ? 1 à SEQ ID ? 5.

ANALYSE DETAILLEE DES SEQUENCES SEQ ID ? : 2 ET SEQ ID ? : 5 Selon une caractéristique principale, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N02, compris dans l'acide nucléique régulateur du gène humain ABCA7 de séquence SEQ ID NO1, comprend les éléments constitutifs d'un promoteur de base, respectivement une boîte"TATA"dégénérée (TTAAG) localisée 30pb en amont du point d'initiation de la transcription. De même, une boite"TATA"dégénérée (TTAAA) a été localisée 30pb en amont du point d'initiation de la transcription, sur

l'acide nucléique murin de séquence SEQ ID NO : 5, compris dans l'acide nucléique régulateur du gène murin ABCA7 de séquence SEQ ID NO : 4. Les boites"TATA" sur les promoteurs des gènes humain et murin ABCA7 ainsi que la position des points d'initiation de la transcription sont représentés sur la Figure 1.

Les séquences régulatrices SEQ ID N 2 et SEO ID N 5 comprennent également de nombreux sites de fixation de divers facteurs de transcription susceptibles de réguler positivement ou négativement l'activité du promoteur de base.

Ainsi, les différentes séquences caractéristiques des sites de fixation de

divers facteurs de transcription dans les séquences SEQ ID D ? 2 et SEQ ID ? 5 ont été identifiées par les inventeurs de la manière détaillée ci-après.

Les séquences SEQ ID N02 et SEQ ID D ? 5 ont été utilisées comme séquences de référence et traitées selon les algorithmes des logiciels Matlnspector (Quandt et al., Nue ! Acid Res (1995) 23 (23), 4878-4884) et comparées aux données répertoriées dans plusieurs bases de données telles que Transfac et la présence ainsi que la localisation des différentes sites caractéristiques des séquences SEO ID N 2 et 5, et particulièrement les sites de liaison des facteurs de transcription ont été déterminés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.

Plus particulièrement, une analyse détaillée a été réalisée en utilisant les logiciels NNPP (Reese et al. J. Comput Biol. (1997) 4 (3) 311-23), TSSG, et TSSW (Soloryev et al., I., Ismb (1995), 5,294-302), sur les 1,1 kb et 1,2Kb en amont du site

d'initiation respectivement des séquences SEQ ID N 2 et 5, a permis d'identifier 193 et 233 sites putatifs de liaison aux facteurs de transcription, chez l'homme et la souris lors de la première étape de la recherche. Ceux-ci sont répertoriés dans les tableaux 1 et 2. Après compilation et filtrage comme décrit ci-dessus, et comparaison des séquences régulatrices humaine et murine, deux modules communs aux séquences régulatrices humaine et murine ont été déterminés, et 5 et 3 sites de fixation possibles de facteurs de transcription différents ont été retenus respectivement dans les modules 1 et 2 sur les séquences humaine et murine. La position avec les scores de filtration des sites de fixation aux facteurs de transcription identifiés dans les 1111 pb de la séquence SEQ ID ? 2 selon

l'invention, ainsi que dans les 1220 pb de la séquence SEQ ID NO : 5 selon l'invention, sont présentés dans le tableau 3. Les différents sites de fixation ont été aussi schématiquement représentés dans la figure 1.

Les positions des nucléotides de début de chacun des sites de fixation aux facteurs de transcription sont désignées en référence à la numérotation des nucléotides des séquences SEQ D ? 2 et NO : 5 par rapport au point +1 d'initiation de la transcription, contenu dans les séquences SEQ ID NO1 et NO4, telle que représentée sur la figure 1.

La Figure 2 représente la séquence SEQ ID NO : 1, qui contient la séquence SEQ ID N 2. Le premier nucléotide en position 5'de la séquence de la Figure 2 est également le premier nucléotide en position 5'de l'une des séquences nucléiques SEQ ID N 1 et SEQ ID NO 2. Sur la Figure 2, les sites de fixation aux facteurs de transcription sont illustrés en caractères gras qui délimitent leurs positions respectives, et leurs désignations respectives sont indiquées au-dessus de chacune des boîtes correspondantes. La numérotation des nucléotides de la séquence représentée à la figure 2 a été effectuée par rapport au site d'initiation de la transcription, numéroté"+1", le nucléotide en 5'du nucléotide +1 étant lui-même numéroté"-1".

La Figure 3 représente la séquence SEQ ID NO : 4, qui contient la

séquence SEQ ID N 5. Le premier nucléotide en position 5'de la séquence de la figure 3 est également le premier nucléotide en position 5'de l'une des séquences nucléiques SEQ ID N 4 et SEQ ! D ? 5. Sur la figure 3, les sites de fixation aux facteurs de transcription sont illustrés en caractères gras qui délimitent leurs positions respectives, et leurs désignations respectives sont indiquées au-dessus de

chacune des boîtes correspondantes. La numérotation des nucléotides de la séquence représentée à la figure 3 a été effectuée par rapport au site d'initiation de la transcription, numéroté"+1", le nucléotide en 5'du nucléotide +1 étant lui-même numéroté"-1".

L'analyse génomique des acides nucléiques régulateurs des séquences humaine et murine SEQ ID NO : 2 et 5, a révélé deux modules de régulation qui sont notés module 1 et module 2, et sont particulièrement conservés chez l'homme et la souris. Ces deux modules de régulation comprennent des sites de fixation de facteur de transcription ubiquitaires, tels que NF1, NFY et AP4, ainsi que des sites de fixation de facteurs de transcription spécifiques du foie tels que CEBP et HNF3B.

Ceci est compatible avec les données expérimentales d'expression, présentées dans l'Exemple 3 ci-après, et fournies par Kaminski et al. (Supra), qui montrent une expression du gène ABCA7 dans les tissus fcataux hépatiques humains.

Les deux modules de régulation conservés chez la souris et l'homme comprennent également des sites de fixation de facteurs de transcription tels que GFI1 et NFkappaB (NFkB), qui sont essentiellement présents dans les organes lymphatiques.

La description des caractéristiques des sites de fixation à chacun des facteurs de transcription désignés dans les figures 2 et 3 ainsi que dans le tableau 3 peut être aisément retrouvée par l'homme du métier. Une courte description de certains d'entre eux en est faite ci-après.

Facteur NF1 :
Les caractéristiques de fixation du facteur NF1 peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline : 88319941, 91219459,86140112, 87237877,90174951, 89282387,90151633, 892618136, 86274639,87064414, 89263791. Le facteur NF1 reconnaît la séquence palindromique suivante :"TGGCANNNTGCCA (NNTTGGCNNNNNNNNCCNN)"qui est présente dans des promoteurs viraux et cellulaires et au niveau de l'origine de réplication des adénovirus de type 2. Ces protéines sont capables d'activer la transcription et la réplication. Elles se fixent à l'ADN sous la forme d'un homodimère.

Facteur NFY :

Le facteur NFY est notamment décrit dans l'entrée n P25. 208 de la base de données Swissprot. C'est un facteur qui reconnaît un motif"CCAAT"dans les séquences promotrices telles que celles du gène codant pour le collagène de type 1, de l'albumine et de la p-actine. Il s'agit d'un stimulateur de la transcription.

Facteur AP4 :
L'homme du métier pourra se référer avantageusement aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline : 2123466, 2833704,8530024. Le facteur AP4 a un domaine de liaison à l'ADN du type"helix loop helix" (bHLH) ainsi que deux domaines de dimérisation. Le site consensus du facteur AP4 est le suivant (CWCAGCTGGN)), et celui-ci se chevauche généralement avec un site de fixation du facteur AP1.

CEBP
Les caractéristiques de liaison au facteur CEBP peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline : 93315489, 91248826,94193722, 93211931,92390404, 90258863,94088523, 90269225 et 96133958. Il s'agit d'un activateur de la transcription important dans la régulation de gènes impliqués dans les réponses immunes et inflammatoires. Il se fixe spécifiquement à un élément de réponse à IL-1 dans le gène de l'IL-B. Il joue vraisemblablement un rôle dans la régulation de la phase aiguë de l'inflammation et dans l'hémopoïése. Le site de reconnaissance consensus est le suivant :"T (T/G) NNGNAA (T/G)".

Facteur HNF3B : L'homme du métier pourra se référer avantageusement à l'article de OVERDIER et al. (1994, Mol. Cetl Biol. vol. 14 : 2755-2766), ainsi qu'aux entrées suivantes de la base de données Medline : 91352065,91032994, 92345837,89160814, 91187609, 91160974,91029477, 94301798 et 94218249. Ce facteur de transcription agit comme activateur de nombreux gènes du foie tels que des gènes AFT, de l'albumine, de la tyrosine aminotransférase et interagit avec des régions régulatrices agissant en cis de ces gènes.

GFI1 Les caractéristiques de liaison au facteur GFI1 peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline : 10762661, 9931446,9571157, 9285685,9070650, et 7789186. Le gène GFI1 code pour une protéine en doigt de zinc impliquée dans la régulation transcriptionnelle et plus particulièrement dans la voie de signalisation de l'interleukine 2. Le site de reconnaissance consensus est le suivant : NNNNNNAAATCANNGNNNNNNN"
Facteur NFkappa-B :
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline : 95369245, 91204058,94280766, 89345587,93024383, 88248039,94173892, 91088538, 91239561,91218850, 92390404,90156535, 93377072,92097536, 93309429, 93267517,92037544, 914266911,91105848 et 95073993. Le facteur NFkappa-B est un hétérodimère constitué d'une première sous-unité de 50 kDa et d'une seconde sous-unité de 65 kDa. Deux hétérodimères peuvent former un tétramère labile. Sa fixation à l'ADN dépend de la présence de zinc (Zn++). Il peut être induit par de nombreux agents tels que le TNF, la PKA ou encore la PKC. C'est un régulateur clef de gènes impliqués dans des réponses à l'infection, à l'inflammation, ainsi qu'au stress.

Une caractéristique essentielle de l'acide nucléique régulateur selon l'invention, et plus particulièrement de la séquence localisée en amont du site d'initiation de la transcription comprise à la fois dans la séquence SEQ ID D ? 2 et dans la séquence SEQ ID ? 5 est la présence de motifs caractéristiques de sites putatifs de liaison à des facteurs de transcription impliqués dans l'expression génique des lymphocytes T, tels que les facteurs de transcription CEBP, NFKB, et GFI1.

GFI1 est un proto-oncogène qui code pour une protéine nucléaire en doigt de zinc impliquée dans la voie de signalisation par les cytokines et dans l'amplification clonale des cellules T (Zweidler-McKay, et al., Mol. Cel/. Biol. (1996), 16 (8), 4024-4034). Le facteur de transcription GFI1 qui agit comme un répresseur

transcriptionnel des gènes qui inhibent l'activation des cellules T et l'oncogénèse. Il est spécifiquement présent dans le thymus, la rate et les lymphocytes T.

Les facteurs de transcription CEBP et NFkappaB qui sont exprimés dans le thymus, la rate et les lymphocytes T, sont bien connus de l'homme du métier et agissent en coopération dans la médiation de l'induction de l'expression des gènes des lymphocytes T (Runch et al., 1994) et des cellules HepB3 (Shimizu et al., Gene, (1994) 149,305-310).

Les positions des nucléotides de début, par rapport au site d'initiation de la transcription qui sont à-498 et-469 pour les sites CEBP, et à-260 pour le site NFkB, sur le module régulateur humain, et à-787 et-760, pour les sites CEBP, et à - 301 pour le site NFKB, montrent que les deux sites de régulation sont plus éloignés dans le promoteur de souris. Toutefois, il est vraisemblable que les deux sites se rapprochent dans une structure tridimensionnelle afin de permettre la coactivation par les deux facteurs CEBP et NFkB.

La présence de ces sites potentiels de fixation au CEBP et au NFkB de manière conservée chez l'homme et la souris sur les acides nucléiques régulateurs selon l'invention est compatible avec l'observation selon laquelle l'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 humaine est prédominante dans les tissus hématopoïétiques et les lymphocytes T, et interviendrait très probablement dans la médiation cellulaire de l'immunité, notamment dans la pathogenèse de l'athérosclérose (Kaminski et al. Supra).

Comme déjà mentionné précédemment, l'invention concerne un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 ou 2, et SEQ ID D ? 4 ou 5, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.

Sont englobés dans la définition ci-dessus les acides nucléiques

comprenant un ou plusieurs fragments"biologiquement actifs"de l'une des séquences SEQ ID N 1 ou 2, et SEO ID ? 4 ou 5. L'homme du métier peut aisément obtenir des fragments biologiquement actifs de ces séquences, en se référant notamment au tableau 3 ci-dessus ainsi qu'aux figures 2 et 3 dans lesquels les différents motifs caractéristiques de la séquence régulatrice du gène ABCA7 sont présentés. L'homme du métier pourra ainsi obtenir de tels fragments biologiquement actifs par synthèse chimique totale ou partielle des polynucléotides correspondants ou encore en faisant agir des endonucléases de restriction afin d'obtenir des

fragments d'ADN recherchés, les sites de restriction présents sur les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID ? 5 pouvant être aisément retrouvés à partir de l'information de séquence, à l'aide de logiciels courants de cartographie de restriction tel que GCG version 9.1 module map.

L'obtention de fragments d'acides nucléiques déterminés à l'aide d'endonucléases de restriction est par exemple décrite dans l'ouvrage de SAMBROOK et al., (Molecular cloning : a laboratory manual, 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New York (1989).

L'invention est donc également relative à un acide nucléique tel que défini ci-dessus, capable de moduler la transcription d'un polynucléotide placé sous son contrôle.

Selon un premier mode de réalisation préféré, un fragment biologiquement actif d'un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention comprend un premier module conservé (module 2) qui comprend le promoteur de base (boîte TATA) allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position-390, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 1112 de la séquence nucléotidique SEQ ID ? 1, ou le

nucléotide en position 1221 de la séquence nucléotidique SE ID NO : 4.

Selon un second mode de réalisation, un fragment biologiquement actif d'un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention comprend les modules 1 et 2 conservés (figure 1) du nucléotide en position-1 au nucléotide en

position-860, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 1112 de la séquence nucléotidique SEQ ID Nc'l, ou le nucléotide en position 1221 de la séquence nucléotidique SE ID NO : 4.

Selon un troisième mode de réalisation, un tel fragment biologiquement actif d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention comprend, outre le promoteur de base (core promoter) et les éléments régulateurs proximaux, également d'autres éléments régulateurs tels que les différents sites GFI1, HNF3B, CEBPB, NF1 et s'étend du nucléotide en position-1 au nucléotide en position-1111, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 1112 de la séquence nucléotidique SEQ ID Nol, et au nucléotide en position-1220, par rapport au site d'initiation de la transcription, le

premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 1221 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 4.

ANALYSE DE L'EXON 1
Le demandeur a également identifié les séquences nucléotidiques localisées en aval du site d'initiation de la transcription et correspondant à l'extrémité 5'de l'exon 1, des gènes humain et murin codant pour la protéine ABCA7.

Plus précisément, l'extrémité 5'de l'exon 1, d'une taille de 1210 nucléotides, débute au nucléotide en position 1112 de la séquence SEQ ID N 1 et se termine au nucléotide en position 2322 de la séquence SEQ ID N 1. L'extrémité 5'de l'exon 1 est identifiée comme la séquence SEQ ID ? 3 et la séquence complète de l'exon 1 est identifiée comme la séquence SEQ ID ? 6.

L'exon 1 contient le début de la phase ouverte de lecture du gène ABCA7 humain, le nucléotide A du codon ATG étant localisé en position 1208 des séquences SEQ ID N 3 et 6. L'exon 1 code pour le polypeptide de séquence SEQ ID NO 7.

L'exon 1 est susceptible de contenir des éléments de régulation de l'expression du gène ABCA7, notamment des éléments de type enhancer amplificateur et/ou des éléments de type silencer ou répresseur.

En conséquence, un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention peut également contenir, outre des fragments biologiquement actifs de la séquence SEO NF1, également des fragments nucléotidiques, voire la totalité des séquences SEQ ID N 2 à SEQ ID N 3 et 6.

Les séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ D ? 3, et 6, ainsi que leurs fragments, peuvent être notamment utilisés comme sondes ou amorces nucléotidiques pour détecter la présence d'au moins une copie du gène ABCA7 dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein de la séquence régulatrice du gène ABCA7.

L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini ci-dessus, en particulier provenant de l'une des séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 3 et 6.

L'invention concerne également un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec l'un quelconque des acides nucléiques selon

l'invention, en particulier un acide nucléique provenant d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID D ? 1 à SEQ ID D ? 3 et 6.

L'invention a également trait à un acide nucléique tel que défini ci-dessus et caractérisé en outre en ce qu'il est capable de moduler la transcription d'un polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.

Selon un premier aspect, un tel acide nucléique est capable d'activer la transcription du polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.

Selon un second aspect, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être caractérisé en ce qu'il est capable d'inhiber la transcription du polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de celui-ci.

Préférentiellement, un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention, lorsqu'il est localisé convenablement par rapport à un polynucléotide d'intérêt dont l'expression est recherchée, va permettre la transcription dudit polynucléotide d'intérêt, soit de manière constitutive, soit de manière inductible.

Le caractère inductible de la transcription initiée par un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être conféré par un ou plusieurs des éléments régulateurs qu'il contient, par exemple la présence d'un ou plusieurs sites tels que précédemment définis dans la séquence SEQ ID D ? 1 ou SEQ ! D ? 2.

De plus, une expression spécifique de tissu du polynucléotide d'intérêt peut être recherchée en plaçant ce polynucléotide d'intérêt sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention capable, par exemple, d'initier la transcription de ce polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans certaines catégories de cellules, par exemple des cellules du tissu hématopoïétique, telles les leucocytes

périphériques, les cellules du thymus, les cellules de la rate, et la moelle osseuse.

De manière préférée, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs éléments régulateurs"discrets", tels que des éléments enhancers et silencers. En particulier, un tel acide nucléique régulateur peut comprendre un ou plusieurs sites de fixation potentiels aux facteurs de transcription tels que définis dans la figure 2.

Un acide régulateur selon l'invention englobe également une séquence ne comprenant pas le promoteur de base, c'est-à-dire la séquence allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position-25, par rapport au site d'initiation de la transcription.

Un tel acide nucléique régulateur comprendra alors préférentiellement un promoteur de base dit"hétérologue", c'est-à-dire un polynucléotide comprenant une boîte"TATA"et une"homéo-boîte"ne provenant pas de l'acide nucléique régulateur du gène ABCA7.

Fait également partie de l'invention, un acide nucléique régulateur de la transcription comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N 1 qui a été modifié, par exemple par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides. De telles modifications peuvent moduler l'activité transcriptionnelle en provoquant une augmentation ou au contraire une diminution de l'activité du promoteur ou de l'élément régulateur.

Une telle modification peut également affecter la spécificité tissulaire du promoteur ou de l'élément régulateur. Ainsi, par exemple, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être modifié afin de stimuler la transcription dans seulement l'un des tissus dans lequel il est naturellement exprimé.

Un acide régulateur de la transcription selon l'invention peut également être modifié et être rendu inductible par un composé particulier, par exemple en créant dans la séquence un site inductible par un composé thérapeutique donné.

Les modifications dans une séquence comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID ? 1 et comprenant le promoteur ou un élément régulateur peuvent être réalisées avec des méthodes bien connues de l'homme du métier, telle que la mutagenèse. L'activité du promoteur ou de l'élément régulateur modifié peut ensuite être testée, par exemple par clonage du promoteur modifié en amont d'un gène rapporteur, en transfectant la construction d'ADN résultante dans une cellule hôte et en mesurant le niveau d'expression du gène rapporteur dans la cellule hôte transfectée. L'activité du promoteur modifié peut également être analysée in vivo dans des animaux transgéniques. Il est également possible de construire des banques de fragments modifiés qui peuvent être criblées en utilisant des tests fonctionnels dans lesquels, par exemple, seuls les promoteurs ou les éléments régulateurs ayant l'activité désirée seront sélectionnés.

De tels essais peuvent être basés, par exemple sur l'utilisation de gènes rapporteurs conférant une résistance à des composés déterminés, par exemple à des antibiotiques. La sélection de cellules ayant une construction acide nucléique régulateur/gène rapporteur et contenant un promoteur ou un élément régulateur ayant la modification recherchée peut alors être isolée par culture des cellules hôtes

transformées avec une telle construction en présence du composé déterminé, par exemple de l'antibiotique déterminé.

Le gène rapporteur peut également coder pour toute protéine facilement détectable, par exemple une protéine optiquement détectable telle que la luciférase.

En conséquence, l'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant : (a) un acide nucléique régulateur de la transcription telle que définie cidessus ; et (b) un polynucléotide d'intérêt codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt.

Selon un premier aspect, le polynucléotide d'intérêt dont la transcription est recherchée code pour une protéine ou un peptide. La protéine peut être de toute nature, par exemple une protéine d'intérêt thérapeutique, y compris des cytokines, des protéines de structure, des récepteurs ou encore des facteurs de transcription.

Par exemple, dans le cas où une transcription spécifiquement dans certains tissus est recherchée, comme par exemple dans des cellules du tissu hématopoïétique, c'est à dire de la rate, de la moelle osseuse, ou dans les leucocytes périphériques, l'acide nucléique régulateur de la transcription comprendra avantageusement un acide nucléique allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position-1111,

par rapport au site d'initiation de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 ou 2, et allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position-1220 SEQ ID ? 4 ou 5.

Dans ce cas, le polynucléotide d'intérêt codera pour un gène impliqué dans la lutte contre l'inflammation, tel qu'un récepteur aux cytokines ou encore pour une superoxyde dismutase. Si un effet antitumoral est recherché, on cherchera alors à stimuler le nombre et l'activation de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'un antigène tumoral donné.

Dans un autre mode de réalisation, un acide nucléique régulateur selon l'invention sera utilisé en combinaison avec un polynucléotide d'intérêt codant pour la protéine ABCA7.

Egalement, le polynucléotide d'intérêt peut également peut être un oligonucléotide de type sens.

Comme déjà mentionné, le polynucléotide d'intérêt peut également produire un acide nucléique, tel qu'un acide nucléique antisens spécifique d'un gène dont on cherche à inhiber la traduction.

Selon un autre aspect, le polynucléotide d'intérêt dont la transcription est régulée par l'acide nucléique régulateur est un gène rapporteur, tel que tout gène codant pour une protéine détectable.

Parmi les gènes rapporteurs préférés, on peut citer notamment le gène de la luciférase, de la ss-galactosidase (LacZ), de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) ou encore tout gène codant pour une protéine conférant une résistance à un composé particulier, particulièrement à un antibiotique.

VECTEURS RECOMBINANTS
Par"vecteur"au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.

Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon

l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique régulateur selon l'invention qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.

Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique régulateur conforme à l'invention, des séquences dont l'expression est recherchée dans une cellule hôte ou dans un organisme multicellulaire déterminé.

Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants : (1) un acide nucléique régulateur selon l'invention ; (2) un polynucléotide d'intérêt comprenant une séquence codante comprise dans l'acide nucléique à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits au (1) ; et (3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.

En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection.

A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.

Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris.

De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996 ; lmmunology in

Current Protocols in Molecular Biology).

Lorsque l'expression de la séquence génomique du gène ABCA7 sera désirée, on aura préférentiellement recours à des vecteurs capables d'inclure de grandes séquences d'insertion. Dans ce mode de réalisation particulier, on utilisera de préférence des vecteurs de bactériophages, tels que les vecteurs de bactériophage P1 comme le vecteur p158 ou encore le vecteur p158/neo8 décrits par Sternberg (Trends Genet., (1992) 8 : 1-16 ; Mamm. Genome (1994) 5 : 397-404).

Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, ETATSUNIS).

On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).

Il peut s'agir aussi du vecteur recombinant PXP1 décrit par Nordeen SK et al. (BioTechniques, (1988) 6 : 454-457).

Il peut s'agir également de vecteurs de type Baculovirus tels que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivées de Spodoptera frugiperda.

Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5.

Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adénoassociés sont par exemple décrits par Flotte et al., Am. J. Respir., Ce/l Mo/. Bio/.

(1992) 7 : 349-356 ; Samulski et al., J. Vitro/. (1989) 63 : 3822-3828 ; MacLaughlin et al., Am. J. Hum. Genet. (1996) 59 : 561-569).

Pour permettre l'expression d'un polynucléotide d'intérêt sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, la construction polynucléotidique comprenant la séquence régulatrice et la séquence codante doit être introduite dans une cellule hôte. L'introduction d'une telle construction polynucléotidique selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires. On peut aussi réaliser

l'introduction des polynucléotides selon l'invention in vivo ou ex vivo, pour la prévention ou le traitement de maladies liées à un déficit dans le transport en protéine ABCA7.

Pour introduire les polynucléotides ou les vecteurs dans une cellule hôte, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à différentes techniques, comme la technique de précipitation au phosphate de calcium (Graham et al.,

Virology (1973) 52 : 456-457 ; Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7 : 2745-2752), le DEAE Dextran (Gopal et al., Mol. Cell. Diol, (1985) 5 : 1188-1190), t'étectroporation (Tur-Kaspa et al., Mol Cel. Biol, (1986) 6 : 716-718. ; Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984), 81 (22), 7161-5), la microinjection directe (Harland et al., J Zell diol (1985) 101 : 1094-1095), les liposomes chargés en ADN (Nicolau et al., Methods Enzymol (1987) 149 : 157-76 ; Fraley et al., Proc. Na. Acad. Sci. USA (1979) 76 : 3348-3352).

Une fois que le polynucléotide a été introduit dans la cellule hôte, il peut être intégré de manière stable dans le génome de la cellule. L'intégration peut être réalisée à un endroit précis du génome, par recombinaison homologue, ou peut être intégré au hasard. Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide peut être maintenu de manière stable dans la cellule hôte sous la forme d'un fragment d'épisome, l'épisome comprenant des séquences permettant le maintien et la réplication de ce dernier, soit de manière indépendante, soit de manière synchronisée avec le cycle cellulaire.

Selon un mode de réalisation particulier, une méthode pour introduire un polynucléotide selon l'invention dans une cellule hôte, en particulier une cellule hôte provenant d'un mammifère, in vivo, comprend une étape au cours de laquelle on introduit une préparation comprenant un vecteur d'expression pharmaceutiquement compatible et un polynucléotide"nu"selon l'invention, placé sous le contrôle de

séquences de régulation appropriées, par injection locale au niveau du tissus choisi,

par exemple un tissu musculaire lisse, le polynucléotide"nu"étant absorbé par les cellules de ce tissu.

Des compositions pour l'utilisation in vitro et in vivo comprenant des polynucléotides"nus"sont par exemples décrites dans la demande PCT ? WO 95/11307 ainsi que dans les articles de Tacson et al. (Nature Med. (1996) 2 (8), 888- 892) et de Huygen et al., (Nat. Med. (1996) 2 (8), 893-898).

Selon un mode de réalisation spécifique de l'invention, il est fourni une composition pour la production in vivo d'une protéine d'intérêt. Cette composition comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide d'intérêt placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice selon l'invention, en solution dans un vecteur

physiologiquement acceptable.

La quantité de vecteur qui est injectée à l'organisme hôte choisi varie selon le site de l'injection. A titre indicatif, il peut être injecté entre environ 0, 1 et environ 100 ug de la construction polynucléotidique séquence régulatrice/séquence codante dans le corps d'un animal.

Lorsque l'acide nucléique régulateur selon l'invention est localisé, sur la construction polynucléotidique (ou vecteur), de telle manière à contrôler la transcription d'une séquence comprenant un cadre de lecture ouvert codant la protéine ABCA7, le vecteur est injecté de préférence dans le corps d'un patient susceptible de développer une maladie liée à un déficit en protéine ABCA7.

En conséquence, l'invention concerne également une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement de la protéine ABCA7, comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et un polynucléotide d'intérêt codant pour la protéine ABCA7, en

association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

Avantageusement, une telle composition comprendra l'acide nucléique régulateur défini par l'une des séquences SEQ ID D ? 1 ou 2, et SEQ ID D ? 4 ou 5, ou un fragment biologiquement actif de cet acide nucléique régulateur.

L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement dans le métabolisme des lipides, comprenant un vecteur recombinant tel que défini ci-

dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation, comprenant un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

L'invention est également relative à l'utilisation d'une construction polynucléotidique conforme à l'invention et comprenant un acide nucléique régulateur du gène ABCA7 ainsi qu'une séquence codant pour la protéine ABCA7, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du métabolisme des lipides ou d'un problème d'origine immunologique ou encore d'origine inflammatoire.

L'invention a également trait à l'utilisation d'un vecteur recombinant selon l'invention, comprenant, outre un acide nucléique régulateur de l'invention, un acide nucléique codant pour la protéine ABCA7, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.

Vecteurs utiles dans des procédés de thérapie génique somatique et compositions contenant de tels vecteurs

La présente invention concerne aussi une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement et/ou la prévention des pathologies liées au métabolisme des lipides ainsi que pour le traitement et/ou la prévention des pathologies liées au dysfonctionnement des mécanismes de médiation Iymphocytaire de l'inflammation.

Elle propose une solution avantageuse aux inconvénients de l'art antérieur, en démontrant la possibilité de traiter les pathologies, notamment des pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme des lipides dans les tissus myélolymphatiques, par la thérapie génique, par le transfert et l'expression in vivo d'une construction polynucléotidique comprenant, outre un acide nucléique régulateur selon l'invention, une séquence codant pour une protéine ABCA7 qui est fortement présumée comme étant impliquée dans le transport et/ou le métabolisme des lipides.

L'invention offre ainsi un moyen simple permettant un traitement spécifique et

efficace des sujets affectés d'un dysfonctionnement des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.

La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc. ) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891}, d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J. Bioi. Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines population cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc.), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.

La présente invention est donc également relative à une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées au transport des lipides, consistant à transférer et à exprimer in vivo des gènes codant pour ABCA7 placés

sous le contrôle d'un acide régulateur selon l'invention. Il est particulièrement avantageux de construire des virus recombinants contenant une séquence d'ADN comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence codant pour une protéine ABCA7 impliquée dans le métabolisme de lipides, d'administrer ces virus recombinants in vivo, et que cette administration permette une expression stable et efficace d'une protéine ABCA7 biologiquement active in vivo, et sans effet cytopathologique.

Les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression du gène ABCA7. En particulier, l'utilisation d'adénovirus recombinants comme vecteurs permet d'obtenir des niveaux d'expression suffisamment élevés du gène d'intérêt pour produire l'effet thérapeutique recherché.

D'autres vecteurs viraux, tels que les rétrovirus ou les virus adéno-associés (AAV), permettant une expression stable du gène sont aussi revendiqués.

La présente invention offre ainsi une nouvelle approche pour le traitement et la prévention des pathologies liées à des dysfonctionnements dans le métabolisme des lipides et dans les voies de signalisation de l'inflammation par les lymphocytes.

L'invention a donc aussi pour objet un virus recombinant défectif comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence nucléique codant pour une protéine ABCA7 impliquée dans le métabolisme des lipides ou dans les processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.

L'invention a également trait à l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des dysfonctionnements de la signalisation de l'inflammation par les lymphocytes.

La présente invention concerne également l'utilisation de cellules modifiées génétiquement ex vivo par un virus tel que décrit ci-dessus, ou de cellules productrices de tels virus, implantées dans l'organisme, permettant une expression in vivo prolongée et efficace d'une protéine ABCA7 biologiquement active.

La présente invention montre qu'il est possible d'incorporer une séquence d'ADN codant pour ABCA7 dans le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini ci-dessus dans un vecteur viral, et que ces vecteurs permettent d'exprimer efficacement une forme mature, biologiquement active. Plus particulièrement, l'invention montre que l'expression in vivo de ABCA7 peut être obtenue par administration directe d'un adénovirus ou par implantation d'une cellule productrice ou génétiquement modifiée par un adénovirus ou par un rétrovirus incorporant un tel ADN.

La présente invention est particulièrement avantageuse, car elle permet d'induire une expression contrôlée et sans effet nocif de ABCA7 dans des organes qui ne sont pas normalement concernés par l'expression de cette protéine. En particulier, une libération significative de la protéine ABCA7 est obtenue par implantation de cellules productrices de vecteurs de l'invention, ou infectées ex vivo par des vecteurs de l'invention.

L'activité de médiateur dans le métabolisme des lipides produit dans le cadre de la présente invention peut être du type ABCA7 humaine ou animale. La séquence nucléique utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN

génomique (ADNg), un ARN (dans le cas des rétrovirus) ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semi-synthétiques.

De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, l'utilisation d'un ADNg permet une meilleure expression dans les cellules humaines. Pour permettre leur incorporation dans un vecteur viral selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mutagenèse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer

nécessaires, pour obtenir des expressions importantes. Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une séquence nucléique codant pour une protéine ABCA7 humaine. Par ailleurs, il est également possible d'utiliser une construction codant pour un dérivé de ces protéines ABCA7. Un dérivé de ces protéines ABCA7 comprend par exemple toute séquence obtenue par mutation, délétion et/ou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un produit conservant l'activité de médiateur du métabolisme des lipides. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après). L'activité biologique des dérivés ainsi obtenus peut ensuite être aisément déterminée, comme indiqué notamment dans les exemples décrivant la mesure de l'efflux de lipides à partir des cellules. Les dérivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.

Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement ayant de nouvelles propriétés biologiques. Les dérivés incluent également les séquences d'ADN modifiées permettant une expression améliorée in vivo.

Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un virus recombinant défectif comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence d'ADNc codant pour une protéine ABCA7 impliquée dans le transport et le métabolisme du cholestérol. Dans un autre mode de

réalisation préféré de l'invention, la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg. La séquence d'ADNc codant pour la protéine ABCA7, et utilisable dans un vecteur

selon l'invention est avantageusement la séquence SEQ ID ? 8.

Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus, des virus adéno-associés (AAV), des virus de l'herpès (HSV) ou des rétrovirus. Il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus, pour une administration directe ou pour la modification ex vivo de cellules destinées à être implantées, ou un rétrovirus, pour l'implantation de cellules productrices.

Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence nucléique codant pour la protéine ABCA7. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virale.

S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO 94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mast, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche

Manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.

Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour la protéine ABCA7 placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention. Avantageusement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est rendue non fonctionnelle. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de

l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) et L5 (WO 95/02697).

Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4 et la séquence codant pour ABCA7 est insérée au niveau de la région E1 inactivée. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans la région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour ABCA7 (Demande de brevet Français FR 94 13355).

Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene (1991) 101 : 195, EP 185 573 ; Graham, EMBO J. (1984) 3 : 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour la protéine ABCA7. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Viral. (1977) 36 : 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n WO 94/26914 et WO 95/02697.

Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.

Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de

manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux ; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.

L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088 ; WO 93/09239 ; US 4,797, 368, US 5,139, 941, EP 488 528). Ces documents décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep eVou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Toutefois, aucun de ces documents ne décrit ni ne suggère l'utilisation d'un AAV recombinant pour le transfert et l'expression in vivo ou ex vivo d'une protéine ABCA7, ni les avantages d'un tel transfert. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans une lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour la protéine ABCA7 bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.

Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., (New Biologist 3 (1991) 203) ; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. (Genet.

Eng. 7 (1985) 235) ; McCormick, (BioTechnology 3 (1985) 689), etc.

En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide

nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus" ; encore désigné MoMLV), ! e MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus") ; le SNV ("spleen necrosis virus") ; le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.

Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour la protéine ABCA7 placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide.

Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US 4,861, 719) ; la lignée PsiCRIP (WO 90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO 89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant

une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.

Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. Les résultats donnés ciaprès démontrent en effet les propriétés particulièrement intéressantes des adénovirus pour l'expression in vivo d'une protéine ayant une activité de médiateur du métabolisme des lipides. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale.

Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux contenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et la séquence codant pour la protéine ABCA7, pour une implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont

notamment les cellules PA317 (US4,861, 719), PsiCrip (WO 90/02806) et
GP+envAm-12 (US 5,278, 056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant pour une protéine ABCA7 selon l'invention. Par exemple des cellules souches totipotentes, précurseurs des lignées cellulaires sanguines, peuvent être prélevées et isolées chez le sujet. Ces cellules mises en culture peuvent être alors transfectées par le vecteur retroviral contenant la séquence codant pour la protéine ABCA7 sous le contrôle de son propre promoteur.

Ces cellules sont alors réintroduites chez le sujet. La différentiation de ces cellules sera à l'origine de cellules du tissu hématopoïétique exprimant la protéine ABCA7, notamment des lymphocytes T qui, participent à la signalisation de l'inflammation.

Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour la protéine ABCA7 est placée sous le contrôle d'un acide régulateur selon l'invention comprenant les éléments régulateurs permettant son expression dans les cellules infectées, et tout particulièrement les éléments régulateurs de type NFkappaB, CEBP, et GFI1.

* Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des pathologies liées au métabolisme des lipides ou encore au dysfonctionnement lié aux processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intra-occulaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection intraveineuse, telle que par exemple dans la veine porte du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la veine porte du patient est avantageuse car elle permet de cibler l'infection au niveau du foie et ainsi, de concentrer l'effet thérapeutique au niveau de cet organe.

Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.

Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation.

A cet égard, un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectées par ces virus. Il peut s'agir en particulier de cellules d'origine sanguine (cellules souches totipotentes ou précurseurs), fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules musculaires lisses et endothéliales, cellules gliales, etc.

Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires.

Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham (Methods Ceil Biol (1980) 21a : 255). Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les virus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).

Les cellules en culture sont ensuite infectées par les virus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire une protéine ABCA7 biologiquement active. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du

métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infections et éventuellement le nombre de cycles d'infections réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro. Pour l'infection par des rétrovirus, il est également possible de co-cultiver les cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus recombinants selon l'invention.

Ceci permet de s'affranchir de la purification des rétrovirus.

Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules de mammifères infectées par un ou plusieurs virus recombinants défectifs telles que décrites ci-dessus ou des cellules productrices de virus recombinants, et une matrice

extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 105 à 1010 cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108.

Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.

Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférentiellement, on utilise du collagène de type 1.

Comme indiqué ci avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage

désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique eVou physique entraînant l'adhésion eVou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non

toxique et/ou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique.

La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies liées au transport du cholestérol, en particulier l'obésité, l'hypertriglycéridémie, ou, dans le domaine des affections cardiovasculaires, l'infarctus du myocarde, l'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque et les accidents cérébro-vasculaires.

En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc.), les chevaux, les poissons, etc.

CELLULES HOTES RECOMBINANTES
L'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante comprenant l'un quelconque des acides nucléiques de l'invention de séquence SEQ ID ? 1 à SEQ

ID NO6, et plus particulièrement un acide nucléique de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID D ? 3.

Selon un autre aspect, l'invention est également relative à une cellule hôte recombinante comprenant un vecteur recombinant tel que ci-dessus décrit.

Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont par exemple les suivantes : a) cellules hôtes procaryotes : souches d'Escherichia coli (souche DH5-a), de Bacillus subtilis, de Salmonella typhimurium, ou encore des souches d'espèces telles que Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococus ; b) cellules hôtes eucaryotes : cellules HeLa (ATCC N CCL2), cellules Cv 1 (ATCC NOCCL70), cellules COS (ATCC NOCRL 1650), cellules Sf-9 (ATCC NOCRL 1711), cellules CHO (ATCC N CCL-61) ou encore cellules 3T3 (ATCC N CRL-6361), ou encore les cellules de la lignée Hepa1-6 référencées à l'American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, Etats-Unis d'Amérique). c) les cellules en culture primaire provenant d'un individu chez lequel l'expression d'un acide nucléique d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention est recherchée.

d) Les cellules à multiplication indéfinie (lignées cellulaires) obtenues à partir des cellules en culture primaire du c) ci-dessus, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. PROCEDES DE CRIBLAGE Procédé de criblaae in vitro.

L'invention fournit des procédés pour traiter un sujet affecté d'une pathologie liée au niveau d'expression de la protéine ABCA7. En particulier, une telle méthode de traitement consiste à administrer au sujet un composé modulant l'expression du gène ABCA7, qui peut être identifié selon divers procédés de criblage in vitro tels que définis ci-après.

Une première méthode consiste à identifier des composés modulant l'expression du gène ABCA7. Selon une telle méthode, des cellules exprimant le gène ABCA7 sont incubées avec une substance ou molécule candidate à tester et le niveau d'expression de l'ARN messager de ABCA7 ou encore le niveau de production de la protéine ABCA7 est ensuite déterminé.

Les niveaux d'ARN messager de ABCA7 peuvent être déterminés par hybridation sur gel de type Northern, bien connu de l'homme du métier. Les niveaux d'ARN messager de ABCA7 peuvent également être déterminés par des procédés mettant en oeuvre la PCR ou encore la technique décrite par WEBB et al. (Journal of Biomolecular Screening (1996), vol. 1 : 119).

Les niveaux de production de la protéine ABCA7 peuvent être déterminés par immunoprécipitation ou immunochimie en utilisant un anticorps qui reconnaît spécifiquement la protéine ABCA7.

Selon une autre méthode de criblage d'une molécule ou substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, une

construction nucléotidique telle que définie ci-dessus, comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention ainsi qu'un polynucléotide rapporteur placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur, est utilisée, ledit acide nucléique régulateur comprenant au moins un promoteur de base et au moins un élément

régulateur de l'une des séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 3. Le polynucléotide rapporteur peut être un gène codant pour une protéine détectable, tel qu'un gène codant pour une luciférase.

Selon un tel procédé de criblage, les cellules sont transfectées avec la construction polynucléotidique contenant l'acide nucléique régulateur selon l'invention et le polynucléotide rapporteur, de manière stable ou transitoire.

Les cellules transformées sont ensuite incubées en présence ou en l'absence de la molécule ou de la substance candidate à tester pendant un temps suffisant, puis le niveau d'expression du gène rapporteur est déterminé. Les composés qui induisent un changement statistiquement significatif de l'expression du gène rapporteur (soit une augmentation, soit au contraire une diminution de l'expression du gène rapporteur) sont ensuite identifiés et, le cas échéant, sélectionnés.

Ainsi t'invention a encore pour objet un procédé pour le criblage in vitro d'une molécule ou d'une substance modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, notamment modulant la transcription du polynucléotide rapporteur constitutif d'une construction polynucléotidique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à : a) mettre en culture une cellule hôte recombinante comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention ; b) incuber la cellule hôte recombinante avec la substance ou molécule à tester ; c) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt ; d) comparer les résultats obtenus à l'étape c) avec les résultats obtenus lorsque la cellule hôte recombinante est mise en culture en l'absence de la molécule ou substance candidate à tester.

L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour le criblage in vitro d'une molécule ou d'une substance candidate capable de moduler l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comprenant : a) une cellule hôte transformée avec une construction polynucléotidique telle que définie ci-dessus, comprenant un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention ; et

b) le cas échéant, des moyens de détection de l'expression du polynucléotide rapporteur d'intérêt.

De préférence, le polynucléotide rapporteur d'intérêt est la séquence codante d'une luciférase. Dans ce cas, l'acide nucléique régulateur selon l'invention est inséré dans un vecteur, en amont de la séquence codant pour la luciférase. Il peut s'agir par exemple du vecteur pGL3-basic (pGL3-b) commercialisé par la Société PROMEGA (Madison, Wisconsin, Etats-Unis).

Dans ce cas, le vecteur recombinant comprenant la séquence codante de la luciférase placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention est transfecté dans les cellules hôtes recombinantes dont l'activité luciférase est ensuite déterminée après mise en culture en présence ou non de la substance ou de la molécule candidate à tester.

On peut dans ce cas utiliser comme témoins des vecteurs pGL3-b contenant soit le promoteur du cytomégalovirus (CMV), le promoteur ApoAI ou encore aucun promoteur. Pour le test d'activité luciférase, les cellules transfectées

sont lavées avec un tampon PBS et Iysées avec 500 al de tampon de lyse (50 mM tris, 150 mM NaCI, 0, 02% d'azide de sodium, 1% de NP-40, 100 ug/mt de AEBSF et 5 ug/ml de leupeptine).

50 pl du Iysat cellulaire obtenu sont ensuite ajoutés à 100 um du substrat de la luciférase (Promega) et les mesures d'activité sont réalisées sur un lecteur spectrophotométrique de microplaque, 5 minutes après l'addition du Iysat cellulaire.

Les données sont exprimées en unités relatives d'activité luciférase. Les constructions polynucléotidiques produisant de hauts niveaux d'activité luciférase dans les cellules transfectées sont celles qui contiennent un acide nucléique régulateur selon l'invention compris dans la séquence SEQ ID N 1 qui est capable de stimuler la transcription.

Pour les mesures des niveaux d'expression d'ARN messager dans un procédé de criblage selon l'invention, on prépare tout d'abord des sondes spécifiques de l'ARN messager du polynucléotide rapporteur d'intérêt, par exemple à l'aide du kit multiprime labeling kit (commercialisé par la Société Amersham Life Sciences, Cleveland, Ohio, Etats-Unis). PROCEDE DE CRIBLAGE IN VIVO

Selon un autre aspect de l'invention, des compositions modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peuvent être identifiées in vivo, dans des animaux transgéniques non humains.

Selon une telle méthode, un animal transgénique non humain, par exemple une souris, est traité avec une molécule ou une substance candidate à tester, par exemple une substance ou molécule candidate auparavant sélectionnée par un procédé de criblage in vitro tel que défini ci-dessus.

Après une durée déterminée, le niveau d'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention est déterminé et comparé à l'activité d'un animal transgénique non humain identique, par exemple une souris transgénique identique, qui n'a pas reçu la molécule ou la substance candidate.

L'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention fonctionnel dans l'animal transgénique peut être déterminée par diverses méthodes, par exemple la mesure des niveaux d'ARN messager correspondant aux polynucléotides rapporteurs d'intérêt placés sous le contrôle dudit acide nucléique régulateur par hybridation de type Northern, ou encore par hybridation in situ. ou encore par imagerie biophotonique non invasive (Xenogen Corporation).

Selon une alternative, l'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention peut être déterminée en mesurant les niveaux d'expression de protéine codée par les polynucléotides rapporteurs d'intérêt, par exemple par immunohistochimie, dans le cas où le polynucléotide rapporteur d'intérêt comprend un cadre de lecture ouvert codant pour une protéine détectable par une telle technique.

Pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, on préférera des mammifères non humains tels que des souris, des rats ou des cobayes ou des lapins qui ont leur génome modifié par l'insertion d'une construction polynucléotidique comprenant un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.

Les animaux transgéniques selon l'invention comprennent le transgène, c'est-à-dire la construction polynucléotidique précitée, dans une pluralité de leurs cellules somatiques et/ou germinales.

La construction d'animaux transgéniques selon l'invention peut être réalisée selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. L'homme du

métier pourra en particulier se référer à la production d'animaux transgéniques, et particulièrement à la production de souris transgéniques, telles que décrites dans les brevets US N'4, 873,191 (délivré le 10 Octobre 1989), US NO5, 464,764 (délivré le 7 Novembre 1995) et US 5,789, 215 (délivré le 4 Août 1998) le contenu de ces documents étant ici incorporé par référence.

En bref, une construction polynucléotidique comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle de ce dernier est insérée dans une lignée de cellules souches de type ES. L'insertion de la construction polynucléotidique est réalisée de préférence par électroporation, telle que décrite par Thomas et al. (1987, Cell, Vol. 51 : 503-512).

Les cellules ayant subi l'étape d'électroporation sont ensuite criblées pour la présence de la construction polynucléotidique (par exemple par sélection à l'aide de marqueurs, ou encore par PCR ou par analyse sur gel d'électrophorèse d'ADN de type Southern) afin de sélectionner les cellules positives ayant intégré la construction polynucléotidique exogène dans leur génome, le cas échéant à la suite d'un événement de recombinaison homologue. Une telle technique est par exemple décrite par MANSOUR et al. (Nature (1988) 336 : 348-352).

Ensuite, les cellules sélectionnées positivement sont isolées, clonées et injectées dans des blastocystes de souris de 3,5 jours, comme cela est décrit par BRADLEY (1987, Production and Analysis of Chimaeric mice. tn : E. J. ROBERTSON (Ed., teratocarcinomas and embryonic stem cells : A practical approach. IRL press, Oxford, page 113). Des blastocystes sont ensuite introduits dans un animal hôte femelle et le développement de l'embryon est poursuivi jusqu'au terme.

Selon une alternative, des cellules de type ES sélectionnées positivement sont mises en contact avec des embryons de 2,5 jours à un stade 8-16 cellules (morulae) comme décrit par WOOD et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90 : 4582-4585) ou par NAGY et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90 : 8424- 8428), les cellules ES étant internalisées afin de coloniser extensivement le blastocyste, y compris les cellules donnant naissance à la lignée germinale.

Les descendants sont ensuite testés afin de déterminer ceux qui ont intégré la construction polynucléotidique (le transgène).

L'invention a donc également pour objet un animal transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou germinales ont été transformées par un acide nucléique ou une construction polynucléotidique selon l'invention.

L'invention a également trait à des cellules hôtes recombinantes obtenues à partir d'un animal transgénique tel que décrit ci-dessus. Des lignées de cellules recombinantes provenant d'un animal transgénique selon l'invention peuvent être

établies en culture à long terme à partir de n'importe quel tissu d'un tel animal transgénique, par exemple par transfection des cultures de cellules primaires avec des vecteurs exprimant des oncogènes tels que le grand antigène T de SV40, tel que décrit par exemple par CHOU (1989, Mol. Endocrinol. Volt. 3 : 1511-1514) et SCHAY et al. (1991, Biochem. Biophys. Acta, vol. 1072 : 1-7).

L'invention est également relative à un procédé pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comportant les étapes consistant à (a) administrer la substance ou la molécule candidate à un animal transgénique tel que défini ci-dessus, (b) détecter le niveau d'expression d'un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur, (c) comparer les résultats obtenus au (b) avec les résultats obtenus chez un animal transgénique n'ayant pas reçu la substance ou la molécule candidate.

L'invention est en outre relative à un procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule modulant la transcription d'un polynucléotide d'intérêt constitutif d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (a) administrer la substance ou molécule candidate à un mammifère transgénique non humain tel que défini ci-dessus, (b) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt chez le mammifère transgénique tel que traité à l'étape (a), et (c) comparer les résultats de détection de l'étape (b) avec les résultats observés chez un mammifère transgénique non humain n'ayant pas reçu la substance ou molécule candidate.

L'invention se rapporte aussi à un kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comprenant (a) un animal transgénique tel que défini cidessus, (b) le cas échéant, les moyens de détection du niveau d'expression du polynucléotide rapporteur d'intérêt.

COMPOSES ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES
L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques destinées à la prévention ou au traitement d'un déficit dans le métabolisme des lipides, ou d'un dysfonctionnement dans les processus impliquant le système immunitaire et

l'inflammation. En premier lieu, l'invention a également pour objet une substance ou une molécule candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention. De manière tout à fait préférée, l'invention concerne également une substance ou une molécule candidate caractérisée en ce qu'elle augmente l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, et tout particulièrement d'un acide nucléique régulateur comprenant la séquence SEO ID Nol, 2,4 ou 5.

Préférentiellement, une telle substance ou molécule capable de moduler l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention a été sélectionnée selon l'un des procédés de criblage in vitro ou in vivo défini ci-dessus. Ainsi, un sujet affecté dans le métabolisme des lipides ou dans la signalisation de l'immunité est traité par l'administration à ce sujet d'une quantité efficace d'un composé modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention. Ainsi, un patient ayant une faible activité du promoteur ABCA7 peut être traité avec une molécule ou une substance précitée afin d'augmenter l'activité du promoteur ABCA7.

De manière alternative, un patient ayant une activité du promoteur ABCA7 anormalement haute peut être traité avec un composé capable de diminuer ou de bloquer l'activité du promoteur ABCA7. Ainsi, la présente invention se rapporte également à une substance ou molécule utilisée en tant que principe actif d'un médicament. Un tel composé peut être un composé qui module l'interaction d'au moins un facteur de transcription avec le promoteur ABCA7 ou un élément régulateur

d'un acide nucléique régulateur selon l'invention. Par exemple, le composé peut inhiber l'interaction de l'un des facteurs de transcription listés dans le tableau 1 avec un acide nucléique régulateur selon l'invention.

Le composé peut également être un composé qui module l'activité d'un facteur de transcription se fixant au promoteur de ABCA7 ou encore d'un élément régulateur présent sur ce dernier. Un composé d'intérêt thérapeutique selon l'invention peut également être un composé qui module l'interaction d'un premier facteur de transcription avec un second facteur de transcription. Comme détaillé dans l'analyse des différents facteurs de transcription susceptibles de se fixer à la séquence SEQ ID Nol, 2,4, ou 5 certains facteurs de transcription sont actifs seulement s'ils sont associés avec un autre facteur de transcription.

Un composé d'intérêt thérapeutique selon l'invention est préférentiellement choisi parmi les acides nucléiques, les peptides et les petites molécules. Par exemple, un tel composé peut être un acide nucléique antisens qui se fixe

spécifiquement sur une région du promoteur ABCA7 ou sur un élément régulateur d'un acide nucléique régulateur d'ABCA7 et inhibant ou diminuant l'activité du promoteur.

Ce composé d'intérêt thérapeutique peut également être un acide nucléique antisens qui interagit spécifiquement avec un gène codant pour un facteur de transcription modulant l'activité du promoteur ABCA7, de telle manière que

l'interaction de l'acide nucléique antisens avec le gène codant pour le facteur de transcription se fixant sur le promoteur ABCA7 diminue la production de ce facteur de transcription, résultant en une augmentation ou une diminution de l'activité du promoteur ABCA7, selon que le facteur de transcription augmente ou au contraire réduit l'activité du promoteur ABCA7.

La toxicité et l'efficacité thérapeutique des composés thérapeutiques selon l'invention peuvent être déterminées selon les protocoles pharmaceutiques standard dans des cellules en culture ou chez des animaux expérimentaux, par exemple pour

déterminer la dose létale LDso (c'est-à-dire la dose létale pour 50% de la population testée) ainsi que la dose efficace EDso (c'est-à-dire la dose thérapeutiquement efficace dans 50% de la population testée). Pour tous les composés d'intérêt thérapeutique selon l'invention, la dose thérapeutiquement efficace peut être estimée initialement à partir de tests réalisés dans des cultures cellulaires in vitro.

L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance ou molécule d'intérêt thérapeutique seton t'invention. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont plus particulièrement destinées au traitement et/ou à la prévention des déficiences dans le métabolisme des lipides, ou dans les mécanismes impliquant le système immunitaire et l'inflammation. De telles compositions pharmaceutiques peuvent être formulées de manière classique en utilisant un ou plusieurs vecteurs ou excipients physiologiquement acceptables.

Ainsi, les composés d'intérêt thérapeutique selon l'invention, ainsi que leurs sels et solvates physiologiquement acceptables, peuvent être formulés pour une administration par injection, inhalation ou encore par administration orale, buccale, parentérale ou rectale. Des techniques de préparation de compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être aisément retrouvées par l'homme du métier, par exemple dans l'ouvrage Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mead Publishing Co., Easton, PA, Etats-Unis.

Pour une administration systémique, on préférera l'injection, y compris les injections intramusculaires, intraveineuses, intrapéritonéales et sous-cutanées. Dans ce cas, les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées sous forme de solutions liquides, de préférence dans des solutions ou tampons

physiologiquement compatibles. PROCEDE DE DETECTION D'UNE ALTERATION DE LA TRANSCRIPTION DU GENE ABCA7 HUMAIN
L'invention a en outre pour objet des procédés pour déterminer si un sujet présente un risque pour le développement d'une pathologie liée à un déficit dans le métabolisme des lipides, ou dans les processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.

De telles méthodes comprennent la détection, dans des cellules d'un échantillon biologique provenant du sujet à tester, de la présence ou de l'absence d'une altération génétique caractérisée par une altération dans l'expression d'un gène dont l'expression est régulée par le promoteur de ABCA7.

A titre illustratif, de telles altérations génétiques peuvent être détectées afin de déterminer l'existence d'une délétion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence d'un acide nucléique régulateur d'ABCA7, de l'addition d'un ou plusieurs nucléotides ou encore de la substitution d'un ou plusieurs nucléotidiques dans ladite séquence SEQ ID ? 1, 2,3 ou 6.

Selon un mode particulier de réalisation d'un procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, l'altération génétique est

identifiée selon une méthode comprenant le séquençage de tout ou partie de la séquence SEQ ID NO1, ou alternativement de tout ou partie d'au moins la séquence SEQ ID D ? 2.

Des amorces de séquençage peuvent être construites afin d'hybrider avec une région déterminée de la séquence SEQ ID ? 1. De telles amorces de séquençage sont construites préférentiellement de manière à amplifier des fragments d'environ 300 à environ 500 nucléotides de la séquence SEQ ID D ? 1 ou d'une séquence complémentaire.

Les fragments amplifiés, par exemple par la méthode PCR, sont ensuite

séquencés et la séquence obtenue est comparée à la séquence de référence SEQ ID D ? 1 afin de déterminer si une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions de nucléotides sont retrouvées dans la séquence amplifiée à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique provenant du sujet testé.

L'invention concerne donc encore un procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comportant les étapes suivantes : a) séquençage d'un fragment d'acide nucléique amplifiable à l'aide d'au moins une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID

N 2 selon l'invention ; b) aligner la séquence obtenue en a) avec la séquence SEQ ID ? 1 ou la SEQ ID D ? 2 ; c) déterminer la présence d'une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions d'au moins un nucléotide dans la séquence du fragment d'acide nucléique, par rapport à la séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID ? 2 de référence.

En outre, font également partie de l'invention des sondes oligonucléotidiques hybridant avec une région de la séquence SEQ ID D ? 1 ou de la séquence SEQ ID ? 2 dans laquelle une altération dans la séquence a été déterminée lors de la mise en oeuvre du procédé de détection décrit ci-dessus.

De manière alternative, font aussi partie de l'invention des sondes oligonucléotidiques hybridant spécifiquement avec une région correspondante de la séquence SEQ ID N 1 ou de la séquence SEQ ID N 2, pour laquelle une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions d'au moins un nucléotide a été déterminée chez un sujet.

De telles sondes oligonucléotidiques constituent des moyens de détection d'altérations dans la séquence régulatrice du gène ABCA7 et donc également des moyens de détection d'une prédisposition au développement d'une pathologie liée à un déficit dans le métabolisme des lipides ou à dysfonctionnement au niveau des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.

L'invention a donc encore pour objet un kit ou nécessaire de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant : a) une ou plusieurs amorces hybridant avec une région de la séquence SEQ ID N'l ou de la séquence SEQ ID ? 2 ;

b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification.

L'invention a encore pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant : a) une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques telles que définies cidessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation.

Les fragments d'acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des

séquences nucléotidiques SEQ ID NO 1-6 sont donc utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique régulatrice du gène ABCA7 ou encore d'un fragment ou d'un variant (contenant une mutation ou un polymorphisme) de cette dernière dans un échantillon.

Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 8 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 1-5, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur de 10,12, 15,18 ou 20 à 25,35, 40,50, 70,80, 100,200, 500, 1000,1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un acide nucléique de séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 1-5.

Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12,15, 18,20, 25,35, 40,50, 100,200, 500,1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID NO1-5, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-avant, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID NO 1-5,6 ou 8 ou avec une séquence complémentaire de ces derniers.

Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène ABCA7 sont représentés ci-dessous.

Il s'agit par exemple du couple d'amorces représenté par l'amorce de séquence SEQ ID ? 9 : AGCCAGCAACGCAATCCTCC et l'amorce de séquence SEQ ID ? 10 : CGCACCATGTCAATGAGCCC.

Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al., (Methods Enzymol (1979) 68 : 90-98) ou de Brown et al. (Methods Enzymol (1979) 68 : 109-151), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al.

(Tetrahedron Lett (1980) 22 : 1859-1862) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EP 0 707 592.

Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.

Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.

Le marquage des sondes est réalisé de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5'ou 3'ou encore par nick translation".

Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n FR 78 109 75 ou

encore dans les articles de Urdea et al. (Nucleic Acid Res (1988) 11 : 4937-4957) ou Sanchez-pescador et al. (J Clin Mircrobiol (1988) 26 (10) 1934-1938).

De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al. (Mol. Cell. Biol., (1991) 6 : 716-718), ou encore dans le brevet européen nO EP-0 225 807 (CHIRON).

Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou bien de type northern à l'ARN.

Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.

Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.

En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ci-avant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à :
1) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.

Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.

L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites ci-dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.

Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.

Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.

Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 1-5,6 et 8 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.

Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les"puces à ADN". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US ? 5,143, 854, dans les demandes PCT ? WO 90/150 70 et 92/10092.

Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N'5, 412,087 et dans la demande PCT N WO 95/11995.

Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5, ou encore un variant de celui-ci.

Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5 ou un fragment ou un variant de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact l'échantillon, dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée, avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3'de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détecter des acides nucléiques amplifiés.

Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-avant.

L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5 ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3'de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.

Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.

L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples ci-après.

La figure 1 est une représentation schématique des sites de facteurs de transcription retrouvés chez l'homme et la souris au sein de la région promotrice des gènes ABCA7.

La figure 2 illustre la séquence SEQ ID N 1 et la position de chacun des motifs caractéristiques de fixation à différents facteurs de transcription est

représentée en caractères gras, la désignation du facteur de transcription spécifique de la séquence correspondante étant indiquée au-dessus de la séquence nucléotidique.

La figure 3 illustre la séquence SEQ ID N 4 et la position de chacun des motifs caractéristiques de fixation à différents facteurs de transcription est

La figure 4 illustre le pattern d'expression du gène ABCA7 humain sur des northern blots de différents tissus adultes et fcataux (Clontech) hybridés avec un amplimère réalisé avec les amorces SEQ ID ? 9 et 10 (tableau 4).

La figure 5 illustre le pattern d'expression du gène ABCA7 murin sur un northern blot de différents tissus adultes hybridés avec un amplimère réalisé avec des amorces spécifiques du transcrit murin. EXEMPLES : EXEMPLE 1 : Détermination de l'extrémité 5'du cDNA de ABCA7 Une amplification de l'extrémité du mRNA par RT-PCR (RACE) a été

réalisée en utilisant le kit d'amplification SMART RACE cDNA (Clontech, Palo Alto, CA). Des ARNm (polyA) extraits à partir des tissus humains de la rate ont été utilisés comme matrice pour produire une banque de cDNA 5'SMART selon les instructions du constructeur. Les amorces de première amplification et les amorces internes ont été choisies à partir de la séquence cDNA. Les amplifications réalisées avec les amorces internes d'amplification PCR ont été clonés. Des clones spécifiques ont été

ensuite amplifiés en utilisant des amorces dont les séquences sont respectivement (CAGGAAACAGCTATGAC) et (GCCAGTGTGATGGATAT) et séquencés sur les deux brins. Enfin les primers ABCA7 L1 GCGGAAAGCAGGTGTTGTTCAC (SEO ID N : 11) et ABCA7L2 CGATGGCAGTGGCTTGTTTGG (SEQ ID NO : 12) ont été utlisés pour identifier l'extrémité du cDNA de ABCA7 humain. EXEMPLE 2 : Analvse du promoteur des gènes ABCA7 humain et murin
Le site d'initiation de la transcription a été situé sur les promoteurs des gènes humain et murin de ABCA7 en utilisant les trois logiciels suivants : TSSG et TSSW (Solovyev et al., lsmb (1997) 5,294-302) et NNPP (Reese MG, et al., 1999). Une prévision des sites de fixation des facteurs de transcription humains et murins a été effectuée en utilisant le programme de recherche de motifs Matlnspector (Quandt et al., Nucl Acid Research (1995) 23 (23) 4878-84). Le calcul des scores pour chaque site de fixation des facteurs de transcription est effectué en utilisant la formule suivante : (Of-Tf)/ (Tf) 1/2, dans laquelle Of est la fréquence d'observation d'un motif et Tf est la fréquence calculée d'un motif consensus. Afin de séparer les motifs qui ne sont pas considérés comme pertinents, une première étape de filtration a été réalisé en ajustant le score similarité de la matrice du programme Matlnspector au dessus de 0,85 et le score similarité du core au dessus de 0,99. Enfin, une analyse comparative des promoteurs inter-espèces a été réalisée selon ce qui est décrit par Werner T (Models for prediction and recognition of eukaryotic promoters, Mammalian Genome (1999) 10 : 168-175) afin de définir des modules de transcription comprenant des sites ayant un motif similaire et présents à la fois sur les séquences humaine et murine de la séquence en amont du gène ABCA7. EXEMPLE 3 : Expression préférentielle des genes ABCA7 humain et murin dans les tissus hématopoïétiques
Le profil d'expression des polynucléotides selon la présente invention est déterminé selon les protocoles d'analyse de northern blot et de transcription inverse couplée à la PCR décrits notamment par Sambrook et al (ref. CSH Sambrook, J.,

Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989)."Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).

Par exemple, dans le cas d'une analyse par transcription inverse, un couple d'amorces synthétisées à partir de chacun des ADNc complets des gènes humain et murin ABCA7 pour détecter les ADNc correspondants. Les séquences de ces amorces sont présentés dans le tableau 4.

La réaction de polymérase en chaîne (PCR) est réalisée sur des matrices d'ADNc correspondant à des ARNm polyA+ rétrotranscrits. La transcription inverse en ADNc est réalisée avec l'enzyme SUPERSCRIPT Il (GibcoBRL, Life Technologies) selon les conditions décrites par le fabricant.

La réaction de polymérase en chaîne est réalisée selon des conditions standard, dans 20 pl de mélange réactionnel avec 25 ng de la préparation d'ADNc.

Le mélange réactionnel est composé de 400 uM de chacun des dNTP, de 2 unités de Thermus aquaticus (Taq) ADN polymérase (Ampli Taq Gold ; Perkin Elmer), de 0, 5 uM de chaque amorce, de 2, 5 mM Mg12, et de tampon PCR. Trente cycles de PCR (dénaturation 30 s à 94 C, hybridation de 30 s décomposé comme suit lors des 30 cycles : 64 C 2 cycles, 61 OC 2 cycles, 58 C 2 cycles et 55 C 28 cycles et une élongation d'une minute par kilobase à 72 C) sont réalisés après une première étape de dénaturation à 94 C durant 10 min dans un appareil thermocycler Perkin Elmer 9700. Les réactions de PCR sont visualisées sur gel d'agarose par électrophorèse. Les fragments d'ADNc obtenus peuvent être utilisés comme sondes pour une analyse par Northern blot et peuvent également être utilisés pour la détermination exacte de la séquence polynucléotidique.

Dans le cas d'une analyse par Northern Biot, une sonde d'ADNc produite comme décrit ci-dessus est marquée au 32p grâce au système de marquage d'ADN High Prime (Boehringer) selon les instructions indiquées par le fabricant. Après marquage, la sonde est purifiée sur une microcolonne de Sephadex G50 (Pharmacia) selon les instructions indiquées par le fabricant. La sonde marquée et purifiée est alors utilisée pour la détection de l'expression des ARNm dans différents tissus.

Le northern blot contenant des échantillons d'ARN de différents tissus humains (Multiple Tissue northern ou MTN ; références (Human Il, 7759-1, Human 7760-1, and Human Fetal Il 7756-1, Clontech) est hybridé avec la sonde spécifique marquée désignée de ABCA7 (2637-4881 pb).

Le protocole suivi pour les hybridations et lavages peut être soit directement celui décrit par le fabricant (Manuel d'utilisation PT1200-1) soit une adaptation de ce protocole en utilisant les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par

exemple dans F. Ausubel et al (Currents Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscíence NY (1989). On pourra ainsi faire varier par exemple les températures de préhybridation et d'hybridation en présence de formamide.

Par exemple on pourra utiliser le protocole suivant : 1-Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION :

- Mélanger : 40pol ADN sperme de saumon (1 Omg/ml) + 40 pl ADN placentaire humain (10mg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange.

- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.

- Ajouter le mélange des deux ADN dénaturés.

- Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.

2- Comoétition de la sonde marquée :

- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 pl ADN Cot 1, selon la quantité de séquences répétées.

- Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C.

- Incuber à 65 C pendant 2 à 5 heures. 3-HYBRIDATION :

- Oter le mélange de pré-hybridation.

- Mélanger 40 pl ADN sperme de saumon + 40 pl ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace.

- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mélange formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot 1 dénaturée.

- Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation. 4-Lavages :

- Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer. - 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1%.

- 2 fois 15 minutes SSC 0, 1X et SDS 0, 1% à 65 C.

Après hybridation et lavage, le blot est analysé après une nuit d'exposition au contact d'un écran au phosphore révélé à l'aide du Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Les résultats présentés à la figure 5 montrent que le gène ABCA7 de souris est exprimé dans les tissus adultes. Une quantité plus élevée d'ARNm ABCA7 murin est détectée dans les tissus hématopoïétiques tels que la rate et le thymus, ce qui est cohérent avec l'expression de ABCA7 qui a été observée dans les lignées myélomonocytaires et Iymphocytaires. Aucune expression du gène ABCA7 n'a été détectée dans les lignées cellulaires fibroblastiques.

La figure 4 montre un pattern d'expression similaire du gène ABCA7 humain avec toutefois un fort signal d'hybridation dans le foie foetal. EXEMPLE 4 : Analvse du profil d'expression qénique pour les

dvsfonctionnements dans le métabolisme des lipides, ou dans la signalisation de l'inflammation

La vérification de l'altération du niveau d'expression du gène ABCA7 peut- être déterminé par hybridation de ces séquences avec des sondes correspondant aux ARNm provenant de tissus hématopoïétiques de sujets atteints ou non, selon les méthodes décrites ci-dessous :

1. Préparation des ARN totaux, des ARNm polv (A) + et de sondes de cDNA
Les ARN totaux sont obtenus à partir de tissus hématopoïétiques de sujets normaux ou bien atteints par la méthode à l'isothiocyanate de guanidine (Chomczynski et al., Anal Biochem (1987) 162 : 156-159). Les ARNm poly (A) + sont obtenus par chromatographie d'affinité sur colonnes d'oligo (dT)-cellulose (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning : a laboratory manual. 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New York) et les cDNA utilisés comme sondes sont obtenus par RT-PCR (DeRisi et al., Science (1997) 278 : 680-686) avec des oligonucléotides marqués avec un produit fluorescent (Amersham Pharmacia Biotech ; CyDye TM). 2. Hvdridation et détection des niveaux d'expressions
Les lames de verre contenant les séquences selon la présente invention correspondant au gène ABCA7 sont hydridées avec les sondes nucléotidiques préparées à partir de l'ARN messager de la cellule à analyse. L'utilisation du système Amersham/molecular Dynamics (Avalanche Microscanner) permet la quantification différentielle des expressions des produits de séquences sur le type cellulaire sain ou affecté. EXEMPLE 5 : Test destiné au criblaae de molécules activant ou inhibant l'expression du aène ABCA7.

Le test de criblage permet d'identifier une substance susceptible de moduler l'activité de synthèse de la protéine ABCA7.

5.1 Construction des plasmides d'expression contenant un acide nucléique régulateur du gène ABCA7 humain.

La région de l'acide régulateur du gène ABCA7 humain allant du nucléotide en position-1111 jusqu'au nucléotide en position-1, par rapport au site d'initiation de la transcription, peut être amplifiée par la technique PCR à l'aide du couple d'amorces spécifiques de la région décrite ci-dessus à partir d'ADN génomique humain présent dans un vecteur BAC d'une collection de vecteurs BAC humains.

Le fragment d'ADN amplifié est digéré par l'endonucléase de restriction Sal

1, puis inséré dans le vecteur PXP1 décrit par Nordeen et al. (Bio Techniques, (1988) 6 : 454-457), au niveau du site de restriction Sal 1 de ce vecteur. L'insert a ensuite été séquencé.

5.2 Culture cellulaire et transfection
Des cellules de la lignée CHO ou HELA (ATCC, Rockville, MD, USA) ont été mises en culture dans le milieu E-MEM (Minimun Essential Medium with Earle's Salts) additionné de 10% (v/v) de sérum de veau foetal (BioWhittaker, Walkersville, MD). Approximativement 1,5 X 105 cellules ont été distribuées dans chacun des puits d'une plaque de culture de 12 puits (2,5 cm), et ont été cultivées jusqu'à environ 50- 70% de confluence, puis co-transformées avec 1 ig du plasmide Sal-Lucif et 0,5 f. lg

du vecteur témoin pBetagal (CloneTech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA) en utilisant le nécessaire Superfectin Reagent Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

Deux heures après l'addition de l'ADN, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu complet AMEM (Minimum Esential Medium Eagle's Alpha Modification). Après une durée de vingt heures, les cellules sont placées dans du milieu frais de type DMEM (Dulbecco's Minimum Essential Medium) additionné de 2 g/ml de glutamin, 100 unités/ml de streptomycine et de 0,1% de sérumalbumine bovine (BSA, Fraction V), en présence ou non de molécules à différentes concentrations.

Les cellules sont récupérées 16 heures après le dernier changement de milieu en utilisant une solution de lyse (Lysis Solution) provenant du nécessaire Tropix Luciferase Assay Kit (Tropix Inc., Bedford, MA, USA). Le Iysat cellulaire est divisé en fractions aliquotes qui sont utilisées pour quantifier les protéines en utilisant le nécessaire MicroBCA Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) ainsi que pour quantifier la

production de luciférase et de béta-galactosidase en utilisant respectivement les nécessaires Tropix Luciferase Assay Kit et Galacto-Light Plus Kit. Les tests sont réalisés selon les recommandations du fabricant. Les molécules actives sur le promoteur ABCA7 sont ensuite sélectionnées en fonction du ratio activité luciférase/activité beta-galactosidase.

Tableau 1 : Sites, scores, consensus, et positions par rapport au point d'initiation de la transcription (TSS) prédits par les logiciels NNPP, TSSG et TSSW chez l'Homme

<tb>
<tb> Filtration <SEP> Site <SEP> Consensus <SEP> Séquence <SEP> Z <SEP> score <SEP> Position/TSS <SEP> (pb) <SEP> Similarité <SEP> ducore <SEP> Similarité <SEP> de <SEP> la
<tb> matrice
<tb> Gift101 <SEP> NNNNNNAAATCANNGNNNN <SEP> gccactatAATCggagactctaga <SEP> 3. <SEP> 669729-569 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> NNNN
<tb> HNF3B01 <SEP> NNNTRTTTRYTY <SEP> gaaTGTTggccc <SEP> 3. <SEP> 978804-547 <SEP> 0.99 <SEP> 0.85
<tb> Analyse <SEP> CEBPB01 <SEP> RNRTKNNGMAAKNN <SEP> cgttcgtGGAAtga <SEP> 1. <SEP> 857489498 <SEP> 087 <SEP> 0. <SEP> 85
<tb> Comparative <SEP> CEBPB~01 <SEP> RNRTKNNGMAAKNN <SEP> atctagtGGAAccc <SEP> 1.857489 <SEP> -469 <SEP> 0.87 <SEP> 0. <SEP> 85
<tb> entre <SEP> espèces <SEP> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> gccTGGCcagccccgggg <SEP> 1.651312 <SEP> -402 <SEP> 1 <SEP> 00 <SEP> 0.86
<tb> AP4~Q6 <SEP> CWCAGCTGGN <SEP> tgCAGCcggt <SEP> 12. <SEP> 133646 <SEP> -340 <SEP> 1.00 <SEP> 0.85
<tb> NFKAPPAB~01 <SEP> GGGAMTTYCC <SEP> GGGAcctgcc <SEP> 9. <SEP> 285691 <SEP> -260 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> NFY~Q6 <SEP> TRRCCAATSRN <SEP> cgcCCAAIagc <SEP> 6. <SEP> 200634 <SEP> -106 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> AHRARNT~01 <SEP> KNNKNNTYGCGTGCMS <SEP> cgatgagggCGTGctt <SEP> 10. <SEP> 450429 <SEP> -1065 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> CDPCR3HD~01 <SEP> NATYGATSSS <SEP> ggGATCaagg <SEP> 2. <SEP> 474120 <SEP> -1004 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> score <SEP> Z <SEP> > = <SEP> 1,96 <SEP> IK1~01 <SEP> NNNTGGGAATRCC <SEP> caagGGGAaaatg <SEP> 14.484154 <SEP> -999 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> NFY~Q6 <SEP> TRRCCAATSRN <SEP> accaTTGGgag <SEP> 6. <SEP> 200634 <SEP> -978 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> LYF101TTTGGGAGRattGGGAgg7. <SEP> 2085949751'0001
<tb> BARBIE <SEP> E~01 <SEP> ATNNAAAGCNGRNGG <SEP> agcaAAAGctgaagc <SEP> 32.363969 <SEP> -963 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> E47~02 <SEP> NNNMRCAGGTGTTMNN <SEP> agccaCAGGtgagtct <SEP> 15. <SEP> 631450 <SEP> -951 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> MYOD~01 <SEP> SRACAGGTGKYG <SEP> ccaCAGGtgagt <SEP> 32. <SEP> 908282 <SEP> -949 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> LMO2COM~01 <SEP> SNNCAGGTGNNN <SEP> ccaCAGGtgagt <SEP> 2. <SEP> 232288-949 <SEP> 100 <SEP> 0. <SEP> 95
<tb> TH1E47~01 <SEP> NNNNGNRTCTGGMWTT <SEP> aggtgagtCTGGgtgg <SEP> 16. <SEP> 677521 <SEP> -945 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> GF) <SEP> NNNNNNAAATCANNGNNNN <SEP> ggtggaatgaatGATTtgaaggg <SEP> 3. <SEP> 669729-934 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 92
<tb> NNNN <SEP> c
<tb> NRF201 <SEP> ACCGGAAGNS <SEP> ggcTTCCtgg <SEP> 6. <SEP> 109080-883 <SEP> 100 <SEP> 0.85
<tb> NFKB~Q6 <SEP> NGGGGAMTTTCCNN <SEP> gaggcagtTCCCtc <SEP> 26. <SEP> 126380-861 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 88
<tb> CREL~01 <SEP> SGGRNWTTCC <SEP> aggcagTTCC <SEP> 2. <SEP> 943267 <SEP> -860 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> NFKAPPAB~01 <SEP> GGGAMTTYCC <SEP> ggcagtTCCC <SEP> 9. <SEP> 285691 <SEP> -859 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> IK1~01 <SEP> NNNTGGGAATRCC <SEP> gcagtTCCCtcaa <SEP> 14. <SEP> 484154 <SEP> -858 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> STAT~01 <SEP> TTCCCRKAA <SEP> TTCCctcaa <SEP> 6. <SEP> 281497 <SEP> -854 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> BARBIE <SEP> E~01 <SEP> ATNNAAAGCNGRNGG <SEP> ccatgcgCTTTggct <SEP> 32.363969 <SEP> -838 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> USF~Q6 <SEP> GYCACGTGNC <SEP> gtctCGTGgc <SEP> 5. <SEP> 390268 <SEP> -802 <SEP> 1.00 <SEP> 0.94
<tb> AP2~Q6 <SEP> MKCCCSCNGGCG <SEP> tcCCCGttggcg <SEP> 7. <SEP> 064136-777 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 86
<tb> VMYB~01 <SEP> AAYAACGGNN <SEP> cccCGTTggc <SEP> 4. <SEP> 360548 <SEP> -776 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb>

Filtration Site Consensus Séquence Z score Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice TATA01 STATAAAWRNNNNNN aactcctaTTTAtcc 7. 166360-765 1. 00 0. 87 GATACNGATAAGNMNNcctatTTATCc2. 004465t0'93 GATAI 03 NNNNNGATAANNGN GATA103NNNNNGATAANNGNctattTATCctcaa 2. 776354-7601. 00 0 94 VMYB 01. 94 VMYB01AAYAACGGNNcccAACGgca 4. 360548-743 1. 00 0. 91 AP2~Q6 MKCCCSCNGGCG ctgccgCGGGag 7. 064136-723 1. 00 0. 87 AHRARNT01 KNNKNNTYGCGTGCMS cccCACGcctctcact 10. 450429-707 1 00 0. 85 BARBIE~01 ATNNAAAGCNGRNGG cttcAAAGctgtgga 32. 363969-680 1. 00 0. 88 AP4~Q6CWCAGCTGGN caaaGCTGtg 12. 1336461677 1. 00 0. 87 AHRARNT 01 N-AHRARNT01 KNNKNNTYGCGTGCMS ccaCACGctcccattt 10. 450429-664 1. 0007 HFH101NAWTGTTTATWTaagaGTTTattt51. 8120656291'0008 IK1 01. 88 IK1~01 KiroiNNNTGGGAATRCCgagtGGGAaacgg 14. 484154-603 1. 00 0. 89 VMYB 01 VMYB~01AAYAACGGNN ggaAACGggt4. 3605485981'00 089 CREL~01 SGGRNWTTCC cgggttTTCC 6. 194143-593 1. 00098 NFKAPPAB65 01 GGGRATTTCC-0. 98 NFKAPPAB6501GGGRATTTCCcgggttTTCC 28. 3154151593 1. 0005 GF1101 NNNNNNAAATCANNGNNNN ttcctcaaAATCagggtagccact3. 669729-587 1. 00 0. 95 NNNN STAT 01 TTCCCRKAA TTCCtcaaa 6281497-587 1. 00 0. 88 TTCCtcaaa 1. 00 0. 88 STAT 01-----TCCCRKÂA STAT01TTCCCRKAAttcgtGGAA6. 2814974961'0002 BARBIE~01 ATNNAAAGCNGRNGG acccctaCTTTacag32 3639691459 1. 00 0. 85 9 59 1. 00 THli47 01--KNNNGNR TH1E4701NNNNGNRTCTGGMWTT agtcCCAGagtctgga 16. 677521-432 1. 00 0. 88 -43, 21 1. 00 TH1E4701 NNNNGNRTCTGGMWTT cccagagtCTGGacta 16. 677521-429 1'000. 90 9 1 1 00 gai AP4Q6CWCAGCTGGN gaCAGCgggg 12. 133646'-385 10000 AP4 Q6 CWCAGCTGGN 496 1. 00 Kl-01 NNNTGGGAATRCC cagaGGGAactcc 14. 484154-374'1. 00090 tccl tcc, CHOP01 NNRTGCAATMCCC tccTGCAattcgg 22. 328386-364 1. 00 0. 87 lcag AP4Q6CWCAGCTGGNcggaGCTGcg24. 429942 354M08 AP4 Q5 NNCAGCTGNN AP4Q5NNCAGCTGNNcggaGCTGcg 3. 791000-354ï'00 0. 92 CHOP 01 NNRTGCHOP01NNRTGCAATMCCC cggtatTGCAgcc 22. 328386 -346 1. 00 093 HLF 01 RTTACRYAAT 1. 00 HLF01RTTACRYAATGTTAtacaac 12. 981423-332 1. 000. 85 ) NNNTGGGAATRCC"ctcgtTCCCggag 14. 484154-285 1. 00 0. 88 1. 0 1. 00 1. 00 0. 88 SP1Q6 NGGGGGCGGGGYN ggagGGCGgcctg 11. 1191442761. 000'86 1. 000 0. 86 N f NFKBQ6NGGGGAMTTTCCNNctGGGAcctgccgg 26. 126380-262 1. 0007 ~262 A AP44 Q6 p-1 AP4Q6CWCAGCTGGN cgCAGCtccg24. 429942146 1. 00 0. 88 p A p-45 QQ 6 AP4Q5 NNCAGCTGNNcgCAGCtccg 3. 791000-146 1. 00 0. 92 A ATF-101 CNSTGACTNNNYC-ATF01 CNSTGACGTNNNYC gagTGACgggcagg8. 675151-121 1. 00 0. 86 Pl j Q 1 Fj~ AP1FJQ2RSTGACTNMNWagTGACgggca"5. 9055041201'0001 ~~IP 1 5. 905504-120 1. 00

Filtration Site Consensus Séquence Z score Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice AP1Q2 RSTGACTNMNW agTGACgggca 5. 905504-120 1. 00 089 CAAT~01 NNNRRCCAATSA gtcgcCCAAtag 4. 415584-108 1. 00 0. 86 AHRARNT01 KNNKNNTYGCGTGCMS caatagcagCGTGcag10. 450429'02T550*90 10. 450429-102 1. 00 0. 90 AHRARNT01 KNNKNNTYGCGTGCMS aggcaggggCGTGccc 10. 450429-86 1. 00 092 KGNNKNNTYGCGTGCMS NRGIGGGCGGGGCNK RGGGGCGGGGCNK GC01NRGGGGCGGGGCNKaaggGGCGgcgcgc15. 933816281'00092 NGC N 3 GGGCGGGGYN GGGGGCGGGGYN SP1~Q6 NGGGGGCGGGGYN aaggGGCGgcgcg 11. 119144-28 1'00 0. 93 C. g CWCAGCTGGN NCAGC N AP4~Q6 CWCAGCTGGN gcctGCTGct 12. 13364691'00086 TGG Spi Q6-9 1. 00 0. 86 SP1~Q6NGGGGGCGGGGYN gctgGGCGgaggg11. 119144-2 1. 00 090 GC 01 GC~01 NRGGGGCGGGGCNKgctgGGCGgaggga15. 933816-2 1. 00 0. 87 - NNNTGGGAATRCC cggaGGGAaggcg 14. 484154 4 1. 00 0. 87 AP4 Q6 AP4Q6CWCAGCTGGNaagaGCTGcg12. 133646191'00089 jK101NNNTGGGAATRCCgagaGGGAagaag14. 484154561'000'87 IK1 01 NNNTG 0. 87 IK1 01NNNTGGGAATRCC caagtTCCCtggg 14. 484154 110 1. 000. 87 NNNTGGGAATRCC NNNTGGGMTRCC ccctGGGAattag 14. 484154 116 1. 00 0. 92 01 TST101 NNKGAWTWANANTNN tgggAATTagggggt 6. 882911 119 1. 00 0. 87 NKX25~02 CWTMTTG gaATTAgg 5. 675005 1221'000'91 AP1~Q2RSTGACTNMNW tcTGACctcct 5. 905504 1401'000'86 AP1FJ~Q2 RSTGACTNMNWtcTGACctcct 5. 905504 1401'00 0'90 tcTGACctcct 905504 1-40- () 0RORA1~01NWAWNNAGGTCANctGACCtccttcc15. 3612411411'00 0'94 RORA2~01NWAWNTAGGTCAN ctGACCtccttcc33. 905118 141 1. 00 0. 85 AWNTAGGTCAN NRF201ACCGGAAGNStccTTCCggt61090801471'000'96 tccTTFCggt-- 109080 - 147 1. 00 0. 96 ATF01 CNSTGACGTNNNYC tgtTGACgacggct 8. 6751511601'000'91 gct 160 1. 00 0. 91 CREB-Q4-T--161 CREBQ4NSTGACGTMANNgtTGACgacggc5. 5439141611'000'87 AP1 Q2 i. 00 AP1~Q2 RSTGACTNMNW gtTGACgacgg 5. 905504 1611. 00089 AP1FJQ2RSTGACTNMNW gtTGACgacgg 5. 905504 1611'000'90 GF) 101NNNNNNAAATCANNGNNNN gaattgatcactGATTctcaaggg36697291741'00092 NNNN L ; L) P ( ; R3HD 01 NATYGATSSS CDPCR3HD01 NATYGATSSS aattGATCac 2. 474120 175 1. 00 0. 97 TH1E4701NNNNGNRTCTGGMWTTtcggacatCTGGgacc16. 6775212031'000'89 203 1. 00 0. 89 TAL1ALPHAE47NNNAACAGATGKTNNNtcggacaTCTGggacc43. 1621082031'00086 01 TAL1BETAE47~0 NNNAACAGATGKTNNN tcggacaTCTGggacc 43. 162108 203 1. 00 0. 87 1 E4702 NNNMRCAGGTGTTMNN tcacacaCCTGcagcc 15. 631450 239 1. 00 0. 90 - MNN tcacacaCCTGcagcc 090 090 E4701 NSNGCAGGTGKNCNN tcacacacCTGCagc 6. 708124239 1'00097 0 LM02COM01SNNCAGGTGNNNacacaCCTGcag'*2. 2322882411000*97 acacaCCfGcag 2. 2322-88 241 UU E-97 1. 00 1 0 97E]

Filtration Site Consensus Séquence Z score Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice MYOD01 SRACAGGTGKYG acacaCCTGcag 32. 908282 241 1. 00 0. 87 VMYB~01AAYAACGGNNgccCGTTaga 4. 360548 259 1. 00 0. 92 SRY~02 NWWAACAAWANN tcttACAAatgg8. 473458 293 1. 00 0. 86 TH1 E47~01 NNNNGNRTCTGGMWTT tcccCCAGatcctaag 16. 677521 320 1. 00 0. 88 6, 67752 320 16-677521 320 1. 00 E4BP401 NRTTAYGTAAYN cttgatGTAAag 12. 6785343411. 00 0. 86 2'678534 12. 678534 1 1. 00 341 1 VBP01GTTACRTNANttgatGTAAa 5. 053244"3421'0002 5 52 lil . 053244 34. 00 5053244. 0 () C iÉL 01 SGGR-342 1. 00 0. 92 ag acc 29432637 GGAAag acc 2. 943267 352 CREL SGGRNWTTCCGGAAagaacc 2. 943267352 1. 00 085 3 52 1. 00 ctggcGT g 5'0 VBP01GTTACRTNAN ctggcGTAAg 5. 053244 362 1. 000. 86 53244 ctggcGT Ag 5. 053244 362 1 () 0 00 TH1E4701 NNNNGNRTCTGGMWTTgtaagggtCTGGgtct 16. 677521 367 100 0. 92 gtaagggtCTGGgtct 16. 677521 gtaagggtCTGGgtct 6. 6775Îl AP1FJQ2RSTGACTNMNWgcctgGTCAcc9. 018855KM1'00092 gcctgGTCAce gcctgGTCAce AP1~Q2RSTGACTNMNW gcctgGTCAcc 9. 018855KM1'00089 gcctgGTCACC gcctgGTCAcc AP1 Q4-398 0. 89 gcctgGTCAcc gcctgGTCAcc 148586 AP1Q4RSTGACTMANNgcctgGTCAcc13. 148586KM1'0006 ERQ6NNARGNNANNNTGACCYNNcctgGTCAcctttagcaac 11. 677290 399 1. 00 0. 88 ELK101NNNACMGGAAGTNCNNagcaacTTCCtgcccc'15. 164525 412 1. z APLFJ Q2-0. 86 AP1FJQ2RSTGACTNMNWcctctGTCAgc 9. 018855 4261. 00 0. 93 AP1 Q2 AP1~Q2 RSTGACTNMNW cctctGTCAgc 9. 018855 426 1. 00 0. 92 AP1Q4RSTGACTMANN cctctGTCAgc'13. 148586 426 1. 0009 - : : : RESGACTMANN 13148586 42-6 1. 00-0. 89NNNNNN TCANNGNNNN ctg NN TCANNGNNNN ctg GF) 101NNNNNNAAATCANNGNNNN ctgtcagcgtcaGATTctccatct 3. 669729 4291'00OEte NNNN N NNNN NNN NSTGACGT CNSTGACGTNNNYC NNNYC ATF 01 CNSTGACGTNNNYC tgtcagcGTCAgat 8. 675151 430 1. 00 0. 90 CREB Q4 GTM CREBQ4NSTGACGTMANN gtcagcGTCAga 11. 262690 431 1. 00 0. 88 CREBQ2NSTGACGTAANN gtcagcGTCAga'17. 782892 431 1. z AP1 FJ Q2 0. 86 AP1FJQ2RSTGACTNMNW tcagcGTCAga 5. 905504 432 1. 00 0. 90 AP1---. 00 0. 90 AP1~Q2 RSTGACTNMNW tcagcGTCAga 5. 905504 432 1. 00 0. 88 TAL1BETAE470 NNNAACAGATGKTNNN ttctccaTCTGtgtca 64. 766306443 1'0008 1 TAL1BETAITF2~0 NNNAACAGATGKTNNN ttctccaTCTGtgtca 64. 766306 443 1. 00 0. 87 1 TAL1ALPHAE47 NNNAACAGATGKTNNN ttctccaTCTGtgtca 64. 766306 443 1. 00 0. 89 01 AP1FJQ2 RSTGACTNMNW tctgtGTCAga 9. 018855 450 1 00 0. 93 c AP1~Q4 RSTGACTMANN tctgtGTCAga 13. 148586 450 1. 00 0. 88 MI WCT c AP1Q2RSTGACTNMNWtctgtGTCAga"'9. 018855' 450 1. 00 0. 91 RSTGACTNMNW 450 1. 00-0. 91TSSS CDPCR3HD01NATYGATSSSaataGATCag2. 4741204801'0005 ss > E gg Tc 0*9 GFil 01 NNNNNNAAA 1-1. 00 095 GF) 101NNNNNNAAATCANNGNNNN agatcaggAATCgctgactccag3. 6697294831'00089 NNNN Q NNNN q 0. 89 :

Filtration Site Consensus Séquence Z score Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice AP1~Q2 RSTGACTNMNW gcTGACtccag 9. 018855 495 1. 00 0. 94 AP1FJQ2RSTGACTNMNWgcTGACtccag9. 01885549550'94 AP1Q4RSTGACTMANNgcTGACtccag13. 148586495T550) GATA103NNNNNGATAANNGNgtctcTATCccagc2. 776354508Ï'OO59 qGN gt ct YNNNN (. 3) ATrAANINGN gtctcTATCcce APLFJ Q2 2. 776354 508 1. 00 0. 89 RSTGCTNMN R GA TNMNW W ST c ccTGACtcttt AP1FJ~Q2 RSTGACTNMNW ccTGACtcttt9. 018855 529 1. 00 0. 92 RSTGACTNMNW RSTG. ACTNMN ccTGACtcttt AP1Q2 RSTGACTNMNW ccTGACtcttt 9. 018855 529 1. 00 0. 91 N N G ATNNAAAGCNGRNGGcctga CNGR ctc-TTctct BARBtE01ATNNAAAGCNGRNGGcctgactCTTTctct32. 363969529ï'OO086 ,, tgactCTr t (T rT.

AP1~Q4 RSTGACTMANN ccTGACtcttt 13. 148586 529 1. 00 0. 88 0. 88 TH1 E4701NNNNGNRTCTGGMWTT ctctttctCTGGctcc 16. 677521 534 1. 00 0. 85 CP201GCNMNAMCMAGCTGGctcccgc3. 245733542ï'OO090 AP2 Q6 cgc 3. 245733 542 i-oo--0. 90AP2~Q6 MKCCCSCNGGCG ctCCCGcggtcc 7. 064136 546 1. 00088 GFh NNNNNNAAATCANNGNNNN gtccctctgagcGATTaatgctac3. 669729554Ï'OO085 NNNN AP4Q6 CWCAGCTGGN cagaGCTGgg 12. 133646 590 1. 00 087 AP4~01 WGARYCAGCTGYGGNCNK gtgcctccaGCTGggcaa 178. 524329 603 1.O 0. 86 RFX1~01 NNGTNRCNNRGYAACNN ctccagctggGCAActg7. 226828 607 1. O0. 89 TNRCNNRGYAA ciccagetggGCAActg AP4 Q6-GN tccaGCTGgg CWCAGCTG GCTGgg NGgg tcc-g AP4Q6CWCAGCTGGNtccaGCTGgg18. 281794608ï'OO07 NNCAGCTG t tccaGCTGgg ccaGCTGgg AP4Q5NNCAGCTGNN tccaGCTGgg 2. 628244 608 1. 00 0. 96 NN CWC AGCTG G AP4~Q6 CWCAGCTGGN tcCAGCtggg 18. 281794608 ' 00 0. 93 tcCAGCtggg tcCAGCtggg NNC AGCTGNN r.

AP4~Q5 NNCAGCTGNN tcCAGCtggg 2. 628244608Ï'OO04 1. 00 0. 94 E4701NSNGCAGGTGKNCNNctgggcaaCTGCctg"6. 708124 613 1. 00C87 . 00 SRESPI 02 KATCACCCCAC 0. 87 SREBP102KATCACCCCAC gtgggGTGAta 30. 499284 682 1. 00 1. 00 GATA1~03 NNNNNGATAANNGN ggggtGATAgtcca2. 776354 684 o 0. 91 OLF1~01 NNCNANTCCCYNGRGARNN agcactTCCCctgggcgtgtga 64. 601270 697 1. 00 0. 89 KGN IK101 NNNTGGGAATRCC gcactTCCCctgg 14. 484154 698 1. 00 0. 87 cacTTCCcct NRF201ACCGGAAGNScacTTCCcct6. 109080699Ï'OO05 AHRARNT01 KNNKNNTYGCGTGCMS tcccctgggCGTGtga 10. 450429703 1. 00 0. 85 NFY~Q6 TRRCCAATSRN ctgCCAAtatt6. 200634 730 1. 00 0. 87 CDP 01 CCAA 1 AA 1 L ; LIÂ 1 iCDP01CCAATAATCGATccAATAttcgtt 147. 430729 733 1.O 0. 86 GATA~CNGATAAGNMNN tgctgTTATCt 2. 004465 744 1. 00 0. 93 GATA1~03NNNNNGATAANNGN gctgtTATCttcgg 2. 776354 745 1. 00 0. 98 GFt101NNNNNNAAATCANNGNNNN gggaaaggAATCcttgcctgggct3. 66972970Ï'OO0'89 NNNN CP2~01 GCNMNAMCMAG CTGGgctgggc 3. 245733 787 1. 00 0. 90 RORA1~01 NWAWNNAGGTCAN ggctgggGGTCag 7. 616064 807 1. 0005

Filtration Site Consensus Séquence Z score Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice AP1Q2 RSTGACTNMNW tggggGTCAgg 5. 905504 810 1. 00 0. 88 APLFJ Q2 AP1FJQ2RSTGACTNMNW'tggggGTCAgg5. 9055048101'0001 NRF201ACCGGAAGNScctGGAAgag6. 109080822000'86 E47~02 NNNMRCAGGTGTTMNN gcttcCAGGtgaggct 15. 631450 832 1.5 0. 86 ATF01 CNSTGACGTNNNYCtggTGACgaaagcg8. 6751518601*0002 CRÉ-B 04-8675151 860 1. 00 0. 92 CREB~Q4 NSTGACGTMANN ggTGACgaaagc16. 981467 861 1. 00 0. 94 AP1Q2RSTGACTNMNWggTGACgaaag9018855861Ï'00092 CREB~Q2 NSTGACGTAANN ggTGACgaaagc 26. 730221861 1. 00 0. 95 AP1 FJ Q2 861 1. 00 095 AP1FJQ2RSTGACTNMNW ggTGACgaaag 9. 018855 861 1. 00 095 CREBP1~Q2 NSTGACGTMASN ggTGACgaaagc 22. 127714861 1. 00 0. 89 AP1~Q4RSTGACTMANN ggTGACgaaag 13. 148586 861 1. 00 0. 91 CREB01TGACGTMATGACgaaa417620386310006 AP401 WGARYCAGCTGYGGNCNK aagtccccaGCTGtcagc 178. 5243299171. 00 08 AP4Q6CWCAGCTGGNcccaGCTGtc18. 2817949221'0007 AP4Q6CWCAGCTGGNccCAGCtgtc18. 2817949221'0004 AP4 Q5 AP4Q5NNCAGCTGNNcccaGCTGtc2. 6282449221'0008 AP4Q5NNCAGCTGNNccCAGCtgtc2. 6282449221'0006 - 2. 628244 AP1FJQ2RSTGACTNMNWcagctGTCAgc5. 905504KM1'0001 AP1Q2RSTGACTNMNWcagctGTCAgc5. 905504KM1'000'89 GF) 101NNNNNNAAATCANNGNNNN tggcagccAATCagatgcgagga3. 669729955 1 00 0. 90 NNNN c CAAT01 NNNRRCCAATSA ggcagCCAAtca 4415584 956 1. 00 0. 98 56 1 () 0 1 00 NFYCNCTGATTGGYTASYggcagCCAATcaga69. 8367039561'000'96 95 cgccAATcaga 69-836703 9 agCCAA caga 69836703 56 0 95 6 1. 00 NFYQ6TRRCCAATSRNcagCCAAtcag6. 2006349581'000'96 tc 9 1 0 cagCCAA g'200634 958 096 9 5 8 1. 00 . 00 096 ! cA Tagt 6. 0 AP4~Q6 CWCAGCTGGN gacgGCTGcg 12. 133646976 1. 00OM a GGCTG 12 33646 976 gc cg. 1 1 00 gacgGCTGcg 12. 133646 976 1. 00 086 l 00 lO 86 AP2~Q6 MKCCCSCNGGCG cggctgCGGGtt 7. 064136 978 1. 00 0. 91 cggctgCGGGtt 7064 36 1. 00 0. 9 1 . 00 0. 91 cccaTTGGttt nn : tA NFY~Q6 TRRCCAATSRN cccaTTGGttt6 200634 995 1. 00 0. 95 1. 0 1 . 00 0. 95 0 0. 95 CAAT01NNNRRCCAATSAccaTTGGtttac4. 4155849961'0001 1. 00 1. 00 0 . 91 0. 91 TATA01STATAAAWRNNNNNNggagcctcTTTAtcg 7. 16636010251'0006 GATA C NGATAAGNMNN cctctTTATCg-GATA~C NGATAAGNMNNcctctTTATCg2. 004465 1029 1. 00 0. 92 GATA103NNNNNGATAANNGN etcttTATCgagtg"2. 776354 103000093 AP1Q2 RSTGACTNMNW agTGACtactg 9. 018855 1040 1. 00 0. 93 AP1Q4RSTGACTMANN'agTGACtactg"3. 148586'10401'0003 CT R TNMNW APLFJ Q2 12 STGACÉ agTGACtactg 0. 93 STGAI AP1FJQ2 RSTGACTNMNW agTGACtactg 9. 018855 1040 1. 000'94 GFIL 01 INNNNN TC GF) 1 01NNNNNNAAATCANNGNNNN ctcgctctAATCagagcttccagg3. 66972910561'000'94 '---------------'----------'------NMtW------'---------------'--------'-----------'----------'-----------'

Filtration Site Consensus Séquence Z score Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice NNNN STAT101NNNSANTTCCGGGAANTGN cagagcttccaGGAAccctgc 155. 0941751067T) 05 SN SN STAT01 TTCCCRKAA TTCCaggaa 6. 281497 1073 1. 00 0. 95 STAT01TTCCCRKAA ttccaGGAA6. 2614977573000'97 ttcc, 3GGAA 6281497 GATA103NNNNNGATAANNGNtgtggGATAaagga2. 77635410901'00095 tgt GATAaa a 2776354 g TAaagga 2. 776354 gg ggC' agg GATACNGATAAGNMNNgGATAAaggaa2 00446510941'00094 T gg 9GAIrAA aa 2 004465 BARBIE~01 ATNNAAAGCNGRNGG tcagAAAGgggcagg32. 363969 1111 1. 00 0. 86 tc AAAGG gcagg 32363969 cagl Gg gcagg 32. 363969 NFKB~Q6NGGGGAMTTTCCNN caGGGAgttgcccg 26. 126380 1122 1. 00 0. 88 NFKAPPAB01 GGGAMTTYCC GGGAgttgcc 9. 285691 1124 1. 00 0. 93 AP2 Q6 MKCCCSCNGGCG AP2~Q6 MKCCCSCNGGCG tgCCCGcagccg 7. 064136 1130 1. 00 0. 90 AP4~Q6 CWCAGCTGGN cgCAGCcgca 12. 133646 11341'00 0'86 xbpl 01 NNGNTGACGTGKNNNWT XBP101NNGNTGACGTGKNNNWTgcaccgcACGTcttcag21. 302338 1141 1. 00 0. 85 VMYB~01AAYAACGGNNgacCGTTgtc 4. 360548 1161 1. 00 0. 93 gacc 3TTgtc ERQ6NNARGNNANNNTGACCYNN gaccgttgtccTGACctct11. 6772901'f611'00086 AP1FJ~Q2 RSTGACTNMNWccTGACctctc 2. 792153 1170 1. 00 0. 90 ctGACEtctctgtRORA1~01 NWAWNNAGGTCANctGACCtctctgt 7. 616064 1171 1. 00 0. 92 NF1~Q6 NNTTGGCNNNNNNCCNNN aagagaaggtgGCCAaga 1. 651312-1093 1'00094 DELTAEF101 NNNCACCTNAN agaAGGTggcc 0. 830664-10901. 00 0. 93 CMYB~01NNNNNNGNCNGTTGNN ggccaagagaGTTGgcgt 0. 187475-1083 1. 00 0. 85 NF1~ NF1~Q6 NNTTGGCNNNNNNCCNNN agtTGGCgtcgatgaggg 1. 651312-1074 1. 00 0. 91 , g tc Similarité core > = 0, 99 MZF1J NGNGGGGA tgtGGGGa-0. 225601-1035 1. 00 0. 99 Similarité matrice > = 0, 85 IK2~01 NNNYGGGAWNNN tgtgGGGAgaga-1. 019855-103500 0. 88 GGAWNNN--i---- . 00 MZF101NGNGGGGA ttgGGGGa-0. 225601"'-1016 1. 00096 In2-01 NNNYGGGAWNNN ttggGGGAtggg-1. 019855-1016 1. 00 089 () 19855 1. 00 0. 89 MZF1 01 NGNGGGGÀMZF101NGNGGGGA tggGGGGa-0. 225601-1008 1. 00 0. 98 1-C --i 09 IK2~01NNNYGGGAWNNNtgggGGGAtcaa-1. 019855-1008 1. 000. 89 00 098 NNN tgggGGGÂtcaa-. 89 l- () 0 089 MZP101NGNGGGGAcaaGGGGa-0. 225601999iToO095 00 0 1. c 1. 00 0. 95 In2-01 NNNYGGGAWNNN caagGGGAaaat-1. 019855-999 1. 00 0. 91 1 00q G 00 o 0. 91 0. 91 DELTAEF1 01 NNNCACCTNANDELTAEF101NNNCACCTNANgtccACCTcac0. 8306649871'00096 ) NNNYGGGAWNNN cattGGGAggag-1. 019855-976 1. 00 0. 93 AP4~Q5 NNCAGCTGNN aaaaGCTGaa 0. 302731-960 1. 00088 MYOD~Q6 NNCANCTGNY cacaGGTGag 0. 740149-948 1. 00 0. 91 DELTAEF101 NNNCACCTNANcacAGGTgagt 0. 830664-948 1. 00 0. 97 ) 01 NNNYGGGAWNNN ggccGGGActtg-1. 019855-913 1. 00 0. 90

<tb>
<tb> Filtration <SEP> Site <SEP> Consensus <SEP> Séquence <SEP> Z <SEP> score <SEP> Position/TSS <SEP> (pb) <SEP> Similarité <SEP> ducore <SEP> Similarité <SEP> de <SEP> la
<tb> matrice
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> tagaGGGAgagg-1. <SEP> 019855-898 <SEP> 1.00 <SEP> 0. <SEP> 88
<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> tgggcttcctgGCCAttt <SEP> 1. <SEP> 651312 <SEP> -885 <SEP> 1.00 <SEP> 0.86
<tb> I <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> cagtTCCCtcaa-1. <SEP> 019855-857 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 91
<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> cttTGGCtgcactctacc <SEP> 1. <SEP> 651312 <SEP> -831 <SEP> 1.00 <SEP> 0.93
<tb> DELTAEF1~01 <SEP> NNNCACCTNAN <SEP> ctctACCTtac <SEP> 0. <SEP> 830664 <SEP> -820 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> NMYC~01 <SEP> NNNCACGTGNNN <SEP> agtctCGTGgcc <SEP> 0. <SEP> 303606 <SEP> -803 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> CMYB~01 <SEP> NNNNNNGNCNGTTGNN <SEP> atgtctccccGTTGgcga <SEP> 0. <SEP> 187475 <SEP> -782 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> tgtcTCCCcgtt <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -781 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> MZF101NGNGGGGAtCCCCgtt-0. <SEP> 225601771'0006
<tb> VMYB02NSYAACGGN'ccCGTTggc <SEP> 0. <SEP> 327098-775 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 096
<tb> NF1Q6NNTTGGCNNNNNNCCNNNcgtTGGCgaactcctatt <SEP> 1. <SEP> 651312 <SEP> -773 <SEP> 1.00 <SEP> 0.94
<tb> GATA1~04 <SEP> NNCWGATARNNNN <SEP> ctattTATCctca <SEP> 1. <SEP> 128924 <SEP> -760 <SEP> 1.00 <SEP> 0.92
<tb> GATA1~02 <SEP> NNNNNGATANKGNN <SEP> ctattTATCctcaa <SEP> 1. <SEP> 132907 <SEP> -760 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> LMO2COM~02 <SEP> NMGATANSG <SEP> attTATCct <SEP> 0. <SEP> 679593 <SEP> -758 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> CMYB~01 <SEP> NNNNNNGNCNGTTGNN <SEP> gcccCAACggcaatgcca <SEP> 0. <SEP> 187475 <SEP> -745 <SEP> 1.00 <SEP> 0.94
<tb> VMYB~02 <SEP> NSYAACGGN <SEP> cccAACGgc <SEP> 0. <SEP> 327098 <SEP> -743 <SEP> 1.00 <SEP> 0.99
<tb> DELTAEF101NNNCACCTNANtgccACCTcct <SEP> 0. <SEP> 830664-732 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 93
<tb> In2~0 <SEP> K2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> ccgcGGGAgccg <SEP> -1.019855 <SEP> -720 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gcgTCCCcacg <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -712 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> tCCCCacg <SEP> 0. <SEP> 667940 <SEP> -708 <SEP> 1.00 <SEP> 0.99
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> actcTCCCcagc <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -694 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> MZF101NGNGGGGAtCCCCagc0. <SEP> 66794016901'0007
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> ccCAGCgcct <SEP> 0. <SEP> 302731 <SEP> -688 <SEP> 1.00 <SEP> 0.86
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> caaaGCTGtg <SEP> 1. <SEP> 465487 <SEP> -677 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> acgcTCCCattt <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -660 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> AP4Q5NNCAGCTGNNttCAGCttca <SEP> 0. <SEP> 302731 <SEP> -650 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> DELTAEF1~01 <SEP> NNNCACCTNAN <SEP> cttcACCTcca <SEP> 0. <SEP> 830664 <SEP> -645 <SEP> 1.00 <SEP> 0.95
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gagtGGGAaacg <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -603 <SEP> 1.00 <SEP> 0.96
<tb> VMYB~02 <SEP> NSYAACGGN <SEP> ggaAACGgg <SEP> 0. <SEP> 327098 <SEP> -598 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> S8~01 <SEP> NNNNNYAATTN <SEP> actaTAATcggagact <SEP> -0. <SEP> 676808 <SEP> -566 <SEP> 1.00 <SEP> 0.86
<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> tgtTGGCcccctccccct <SEP> 1. <SEP> 651312 <SEP> -544 <SEP> 1.00 <SEP> 0.95
<tb> IK2~01 <SEP> K2 <SEP> 01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> ccccTCCCcctc <SEP> -1.019855 <SEP> -537 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> tCCCCctc <SEP> -0. <SEP> 225601 <SEP> -533 <SEP> 1.00 <SEP> 0.96
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gtagTCCCagag <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -434 <SEP> 1.00 <SEP> 0.96
<tb>

<tb>
<tb> Filtration <SEP> Site <SEP> Consensus <SEP> Séquence <SEP> Z <SEP> score <SEP> Position/TSS <SEP> (pb) <SEP> Similarité <SEP> ducore <SEP> Similarité <SEP> de <SEP> la
<tb> matrice
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> tagaGGGAgcct <SEP> -1.019855 <SEP> -410 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> gagggagcctgGCCAgcc <SEP> 1. <SEP> 651312 <SEP> -408 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> cccGGGGa <SEP> -0. <SEP> 225601 <SEP> -391 <SEP> 1.00 <SEP> 0.95
<tb> IK2 <SEP> 01 <SEP> NNNYGGGAWNNNcccgGGGAcaqc-1. <SEP> 019855-391 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 89
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> gaCAGCgggg <SEP> 1. <SEP> 465487 <SEP> -385 <SEP> 1.00 <SEP> 0.92
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> agcgGGGAcaga <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -382 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> agcGGGGa <SEP> -0. <SEP> 225601 <SEP> -382 <SEP> 1.00 <SEP> 0.99
<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> cagaGGGAactc <SEP> -1.019855 <SEP> -374 <SEP> 1.00 <SEP> 0.94
<tb> CEBPB~01 <SEP> RNRTKNNGMAAKNN <SEP> aactcctGCAAttc <SEP> 1. <SEP> 857489 <SEP> -367 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> tgCAGCcggt <SEP> 1. <SEP> 465487 <SEP> -340 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> ARNT~01 <SEP> NNNNCACGTGNNNNN <SEP> tatacaaCGTGgggag <SEP> 0. <SEP> 305357 <SEP> -330 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> cgtGGGGa <SEP> 0. <SEP> 667940 <SEP> -323 <SEP> 1.00 <SEP> 0.99
<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> cgtgGGGAggca-1. <SEP> 019855-323 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 88
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> tggcTCCCcaaa <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -308 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> MZF101NGNGGGGAtCCCCaaa-0. <SEP> 22560113041'000'96
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> gaCAGCgcag <SEP> 0. <SEP> 302731 <SEP> -296 <SEP> 1.00 <SEP> 0.86
<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> tcgtTCCCggag-1. <SEP> 019855-284 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 94
<tb> CETS1P5401 <SEP> NCMGGAWGYN <SEP> ccCGGAgggc <SEP> 1.032772 <SEP> -279 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gcctGGGAcctg-1. <SEP> 019855-264 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 92
<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> ccgggcactccGCCAccc <SEP> 1. <SEP> 651312 <SEP> -252 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> CEBPB~01 <SEP> RNRTKNNGMAAKNN <SEP> tgatgcaGCAAgag <SEP> 1. <SEP> 857489 <SEP> -229 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gcggTCCCttta <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -211 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gtgaTCCCgtct <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -172 <SEP> 1.00 <SEP> 0.93
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> ctccTCCCttgg <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> -162 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> cctTGGCccgcgcagctc <SEP> 1. <SEP> 651312 <SEP> -156 <SEP> 1.00 <SEP> 0.92
<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> cgacggagcagGCCAgtg <SEP> 1. <SEP> 651312 <SEP> -138 <SEP> 1.00 <SEP> 0.86
<tb> CREB~02 <SEP> NNGTGACGYNN <SEP> tgagTGACgggc <SEP> 0. <SEP> 972541 <SEP> -122 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> cggcGCTGct <SEP> 0. <SEP> 302731 <SEP> -70 <SEP> 1.00 <SEP> 0.86
<tb> DELTAEF1~01 <SEP> NNNCACCTNAN <SEP> tgctACCTgcg <SEP> 0. <SEP> 830664 <SEP> -64 <SEP> 1.00 <SEP> 0.85
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> ctCAGCgcac <SEP> 0. <SEP> 302731 <SEP> -45 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> NKX25~01 <SEP> TYAAGTG <SEP> cACTTgg <SEP> 1. <SEP> 905547 <SEP> -38 <SEP> 1.00 <SEP> 0.93
<tb> NF1Q6NNTTGGCNNNNNNCCNNNactTGGCttaaggggcgg1. <SEP> 651312371'00092
<tb> IK2-01 <SEP> K2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gcgcTCCCtgcc <SEP> -1.019855 <SEP> -18 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> gcctGCTGct <SEP> 1. <SEP> 465487 <SEP> -9 <SEP> 1.00 <SEP> 0.92
<tb>

<tb>
<tb> Filtration <SEP> Site <SEP> Consensus <SEP> Séquence <SEP> Z <SEP> score <SEP> Position/TSS <SEP> (pb) <SEP> Similarité <SEP> ducore <SEP> Similarité <SEP> de <SEP> la
<tb> matrice
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> tgctGCTGgg <SEP> 0. <SEP> 302731-6 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> cggaGGGAaggc-1. <SEP> 0198554 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 093
<tb> AP4Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> aagaGCTGcg <SEP> 1.465487 <SEP> 19 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 93
<tb> DELTAEF1~01 <SEP> NNNCACCTNAN <SEP> ggaAGGTgaga <SEP> 0. <SEP> 830664 <SEP> 37 <SEP> 1.00 <SEP> 0.97
<tb> ) <SEP> K2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gagaGGGAagaa <SEP> -1.019855 <SEP> 56 <SEP> 1.00 <SEP> 0.93
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<tb> IK2 <SEP> 01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gggaGGGAtgca-1. <SEP> 019855 <SEP> 100 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 91
<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> aagtTCCCtggg-1. <SEP> 019855 <SEP> i11 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 091
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<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> atctGGGAccct-1. <SEP> 019855 <SEP> 209 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 93
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<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> taagTCCCgctt <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> 332 <SEP> 1.00 <SEP> 0 <SEP> 91
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<tb> IK2 <SEP> K2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gcggTCCCtctg <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> 551 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 91
<tb>

<tb>
<tb> Filtration <SEP> Site <SEP> Consensus <SEP> Séquence <SEP> Z <SEP> score <SEP> Position/TSS <SEP> (pb) <SEP> Similarité <SEP> ducore <SEP> Similarité <SEP> de <SEP> la
<tb> matrice
<tb> S801 <SEP> NNNNNYAATTN <SEP> tctgagcgATTAatgc-0. <SEP> 676808 <SEP> 559 <SEP> 1.00 <SEP> 0.86
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<tb> CMYB~01 <SEP> NNNNNNGNCNGTTGNN <SEP> tgggCAACtgcctgtctc <SEP> 0. <SEP> 187475 <SEP> 614 <SEP> 1.00 <SEP> 0.94
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<tb> LM02COM02 <SEP> NMGATANSG <SEP> gtGATAgtc <SEP> 0. <SEP> 679593 <SEP> 687 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 92
<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> cactTCCCctgg-1. <SEP> 019855 <SEP> 699 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 089
<tb> NKX25~01 <SEP> TYAAGTG <SEP> cACTTcc <SEP> 1. <SEP> 905547 <SEP> 699 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
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<tb> LMO2COM~02 <SEP> NMGATANSG <SEP> tgtTATCtt <SEP> 0 <SEP> 679593 <SEP> 747 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0 <SEP> 94
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> tgaGGGGa <SEP> -0. <SEP> 225601 <SEP> 766 <SEP> 1.00 <SEP> 0.97
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<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> gcctgggctggGCCAggc <SEP> 1. <SEP> 651312 <SEP> 785 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 85
<tb> LMO2COM~01 <SEP> SNNCAGGTGNNN <SEP> ttcCAGGtgagg <SEP> 0. <SEP> 773414 <SEP> 834 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 94
<tb> DELTAEF1~01 <SEP> NNNCACCTNAN <SEP> tccAGGTgagg <SEP> 0. <SEP> 830664 <SEP> 835 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 98
<tb> MYOD~Q6 <SEP> NNCANCTGNY <SEP> tccaGGTGag <SEP> 0. <SEP> 740149 <SEP> 835 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> CREB~02 <SEP> NNGNTGACGYNN <SEP> ctggTGACgaaa <SEP> 0. <SEP> 972541 <SEP> 859 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 94
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> tcggTCCCtgga <SEP> -1. <SEP> 019855 <SEP> 886 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
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<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> gtCAGCcctg <SEP> 0. <SEP> 302731 <SEP> 929 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 86
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<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> tccTGGCagccaatcaga <SEP> 1. <SEP> 651312 <SEP> 952 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> gacgGCTGcg <SEP> 1. <SEP> 465487 <SEP> 976 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gcgcTCCCattg-1. <SEP> 019855 <SEP> 990 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 94
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<tb> LMO2COM~02 <SEP> NMGATANSG <SEP> cttTATCga <SEP> 0. <SEP> 679593 <SEP> 1032 <SEP> 1.00 <SEP> 0.95
<tb>

Filtration Site Consensus Séquence Z score Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice S801 NNNNNYAATTN gctcTAATcagagctt-0. 676808 1059 1. 00 0. 85 AP4~Q5NNCAGCTGNN ctgcGCTGtg 0. 302731 1084 OO0. 87 IK2-01 0. 87 IK201 NNNYGGGAWNNN ctgtGGGAtaaa-1. 019855 1089 1. 000. 95 GATA102NNNNNGATANKGNNtgtggGATAaagga1. 13290710901'000. 93 GATA104 NNCWGATARNNNN gtggGATAaagga1. 128924 1091 1. 000. 93 LM02COM~02 NMGATANSGggGATAaag 0. 67959310931'00093 ggGATAaag 0679593 1 inoli CMYB~01 NNNNNNGNCNGTTGNN ggggcagggaGTTGcccg0. 187475 1118 1'00 086 IK2 01 1. 00 0. 86 IK2~01 NNNYGGGAWNNN ggcaGGGAgttg-1. 019855 1120 1. 00 0. 89 AP4Q5NNCAGCTGNNcgCAGCcgca 1. 465487 1134 1.o 0. 90 ARNT01NNNNNCACGTGNNNNNcaccgCACGtcttcag0. 30535711421'000'86 CMYB 01 NNN-NNGCMYB~01 NNNNNNGNCNGTTGNN cagcccgaccGTTGtcct 0. 187475 1155 1. 00 0. 93 VMYB02NSYAACGGNacCGTTgtc0. 32709811621'00097 IK2 01 N JNYGG 3AWNN-N tctgTCCCgtcc--IK2~01 K201NNNYGGGAWNNNtctgTCCCgtec-1. 01985511791'00091 ) NNNYGGGAWNNN cccgTCCCctgc-1. 0198551184 1'00087 MZF1 01 1. 00 0. 87 MZF101NGNGGGGAtCCCCtgc-0. 22560111881'00095 HNF3B~01 NNNTRTTTRYTY ctcTGTTtgtac 3. 978804-11060. 99 0. 84 0, 99 0* 84 . 99 0. 84 CDPCR3HD~01 NATYGATSSS cgtcGATGag 2. 474120-1068 0. 93 0. 85 0 93 0* 85 . 93 0. 8 GYCACGTGNC 5 39026 USFQ6GYCACGTGNCgcCACAggtg 5. 390268-950 0. 86 0. 87 t gcCAC'4 5. 390268 g g g 8. 86 0. 87 0"86 0, 87 aucune E47~01 NSNGCAGGTGKNCNN gccACAGgtgagtct 6. 708124-9500'83 0. 86 a tg N gccACAGÇ % 6. 7081024 (Paramètres par USF Q6-0. 86 . 86 1831 o caca G a (). 960075 n R, , g (Paramètres par USF~Q6 GYCACGTGNC cacaGGTGag 10. 960075 -948 0. 82 0. 87 c c T acAGGN A G GN Ga. 301857 défaut de Matinspector) USF~C NCACGTGN acAGGTGa 0. 301857-9470. 86 0. 92 0301857 N caNgTTCCc tct 10960 75 CETS1P54~01 NCMGGAWGYN ggctTCCTgg 1. 032772-883 0. 93 0. 95 NCMGGAWGYN ggctTCC 032772 1 NI'T gg 1. 032772 - ? Jtj'j 0. 93 CAAT 01-0. 93 O95 NNNRRCC TSA e36, j 0 93 cctggCC) &commat;Tttg CAAT~01 NNNRRCCAATSA cctggCCATttg 4. 415584-878 0. 86 0. 86 -878 0. 86 RNRTKNNGMAAKNN 0, 86 CEBPB01RNRTKNNGMAAKNNcagTTCCctcaaat1 8574891857087086 tcaaat 1. 857489-857 0. 87 0. 86 KCCCSCNGG G. 87 m C 857 0. 87 AP2~Q6 MKCCCSCNGGCGgcCCCCcatgcg7. 064136843098086 > gcCCCCca tgcg 7. 064136-843 0. 98 0. 86 3 0 3 0. 98 NCACGTGN t rr,-r,. 98 USFC NCACGTGNtCTCGTgg0. 301857-801081 086 CETSlP54 01-NCMGGAWGYN-0. 86 ccTGGAtgtc 1. 032772 CETS1P5401NCMGGAWGYNccTGGAtgtc1. 032772-787 0. 85092 . 032772 CETS1P5401NCMGGAWGYNcaccTCCTgc 1. 032772-7290. 93 0. 92 CETSIPS4 01----FCMGGA-0. 92 CETS1P54~01 NCMGGAWGYN caccTCCAgc 1. 032772-642 0. 85 0. 89 CETS1P5401 NCMGGAWGYN ttctTCCAga 1. 032772-611 0. 85090 -611 CEBPB 01 RNRTKNNGMAAKNNCEBPB01RNRTKNNGMAAKNNggtTTTCctcaaaa1. 857489591099088 CEBPB01RNRTKNNGMAAKNN gttTTCCtcaaaat1. 857489590087090 -. 857489GC 01 857489-590 0. 87 0. 90 N-RG-GGG GcToiNRGGGGCGGGGCNKggccccCTCCccct15. 933816540088091 spl-Q6 NGGGGGCGGGYN----. 91 SP1Q6NGGGGGCGGGGYNgccccCTCCccct11. 1191441539084093

Filtration Site Consensus Séquence Z score PositionlTSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice CETS1P54~01 NCMGGAWGYN ccccTCCTgc 1. 032772-531 0. 93 0. 87 AP2~Q6 m 0. 93 n P7 AP2Q6MKCCCSCNGGCGagCCCCggggac7. 064136-3940. 980. 86 AP2-Q6 AP2Q6MKCCCSCNGGCGagccccGGGGac7. 0641361394098088 RFX102NNGTNRCNNNRGYAACNN cggggacagagGGAActc 7. 228454-380 0. 88 0. 90 NFKAPPAB65~01 GGGRATTTCC GGGAactcct 14. 122479-3700. 83 089 CETS1P54~01NCMGGAWGYN gaacTCCTgc 2. 674616-368 0. 93 0. 85 VMYB01AAYAACGGNNgccGGTTata4. 36054833601086 TATA~01 STATAAAWRNNNNNN ttaTACAacgtgggg7. 166360-3310. 80 086 0. 86 LYF1~01 TTTGGGAGR ctCCCCaaa7. 208594-305 0. 82 085 CEBPB~01 RNRTKNNGMAAKNN cctttaaGAAAcc 1. 857489-205 0. 99 0. 89 PADSC NGTGGTCTC tGTGATccc 4. 266174"-173 0. 900. 86 CAAT 01 CAAT~01 NNNRRCCAATSA gcaggCCAGtga 4. 415584-131 0. 85 0. 90 USFQ6GYCACGTGNCggccAGTGag5. 390268128086089 API C ÎT-GAAP1CNTGASTCANgTGAGTGAc1. 751881123085087 AP1CNTGASTCAN gTGAGTGAc 1. 751881-123 0. 86 0. 86 NFKAPPAB01GGGAMTTYCC GGGGcgtgcc 9. 285691-81 0. 90 0. 87 USFQ6GYCACGTGNC cgCACTtggc 5. 390268-40 0. 86 0. 89 USFC NCACGTGN gCACTTgg 0. 301857-39 0. 84 0. 91 CETS1P5401NCMGGAWGYNccTGGAaggt 1. 032772 34 0. 85 0. 88 RFX10NNGTNRCNNRGYAACNNaagTTCCctgggaatta7. 226828iTi088089 0. 88 0. 89 CLOX01NNTATCGATTANYNWtgaATTGatcactga81. 978936173087089 CDP02NWNATCGATTANYNNtgaATTGatcactga37. 3467241730'85089 LMO2COM~01 SNNCAGGTGNNN ggacaTCTGgga 0. 773414 205 0. 820. 90 g ; acaTCTGgga MYOD~Q6 NNCANCTGNY gaCATCtggg -0. 175805 206 0. 92 0. 89 USF~C NCACGTGN aCACCTgc 0. 301857 243 0. 86 0. 92 AP2Q6MKCCCSCNGGCGagCCCCctgccc7. 064136251OM088 CMYB01NNNNNNGNCNGTTGNNccccctgcccGTTAgaac0. 187475253084085 CETS1P5401NCMGGAWGYNgaacTCCTgc2. 674616267093085 AP2~Q6 MKCCCSCNGGCGctCCCCcttgcc 7. 064136 278 0. 98 0. 86 CEBPB01RNRTKNNGMAAKNNaaatggaGAAActg1. 857489299099092 VMYB01AAYAACGGNNagaAACTgag4. 360548305088087 CEBPB~01 RNRTKNNGMAAKNN gcttgatGTAAagg 1. 857489 340 0. 93 0. 89 ~BPB CEBPBJJ1RNRTKNNGMAAKNNatgtaaaGGAAaga1. 857489345087086 ECEBPB 0. 87 0. 86 CEBPB 01RNRTKNNGMAAKNN ccctggcGTAAggg. 1. 857489360093088 0. 93 0. 88

Filtration Site Consensus Séquence Z score Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice CETS1P5401 NCMGGAWGYN aactTCCTgc 1. 032772 415 0. 93 0. 96 LM02COM~01 SNNCAGGTGNNN ctccaTCTGtgt 0. 773414445 0. 82 0. 90 MYODQ6NNCANCTGNYtcCATCtgtg-0. 175805446092091 AP1~C NTGASTCAN cTGTGTCAg 1. 751881 451 0. 86 0. 86 CLOX01NNTATCGATTANYNWaaaATAGatcaggaa81. 9789364780810. 85 CDP02NWNATCGATTANYNNaaaATAGatcaggaa37. 346724478081088 CETS1P5401NCMGGAWGYNtcAGGAatcg1. 032772486093088 GATA~C NGATAAGNMNN agtctCTATCc2 004465 507089 0. 92 GC~01 NRGGGGCGGGGCNK tgtgGGCAgagctg 15. 933816 584 0. 81 0. 86 CETS1P5401NCMGGAWGYNtgccTCCAgc1. 0327726040*850'89 LM02COM01 SNNCAGGTGNNN ctccaGCTGggc0. 773414 607 0. 88 0. 94 C LM02COM Oi-S4NCAG3 GNNN LM02COM01SNNCAGGTGNNNctcCAGCtgggc0. 773414607080'93 MYODQ6NNCANCTGNY tcCAGCtggg1. 656102KM0'920'90 MYOD Q6. 90 OCT1 Simil. 86 MYOD Q6NNCANCTGNY tccaGCTGgg1. 656102KM092 0. 90 LMO2COM~01 SNNCAGGTGNNN gggcaACTGcct 0. 773414 615 0. 80 0. 91 VMYB~01AAYAACGGNN ggcAACTgcc 4. 360548 616 0. 88 0. 86 VMYE c My E VMYB~02 NSYAACGGNggcAACTgc 0. 327098 616 0. 82 0. 89 yo MYOD MYODQ6NNCANCTGNYggCAACtgcc-0. 175805616087097 G ATAD GATA~C NGATAAGNMNN tGATAGtccag 2. 004465 688 0. 89 0. 88 AP2 AP2 AP2~Q6 MKCCCSCNGGCG ttCCCCtgggcg 7. 064136 702 098088 USF USF~Q6GYCACGTGNC ggcgTGTGaa 5. 390268 710 0. 86 0. 87 CHOP 01 FNRTG CHOP01NNRTGCAATMCCCgtgTGAAatgtcc22. 328386713080086 CETS1P5401NCMGGAWGYNaatgTCCAgc1. 032772719085086 OCT1~02 NNGAATATKCANNNN gccaatATTCgttgc11. 885447 732 0. 98 0. 91 CDPCR301CACCRATANNTATNGCAATattcgttgctg92. 378088734097086 VMYB 01 AAYAACG-NN-734 0. 97 0. 86 VMYB01AAYAACGGNNtgcTGTTatc4. 360548744082089 STAT 01 TTCCCSTAT01TTCCCRKAAttcggAGAA 6. 281497 754 0. 81 0. 88 CETSi-P54 01 N-M-GGAWGCETS1P5401NCMGGAWGYNgcAGGAggct1. 032772801093090 AP2Q6MKCCCSCNGGCG aggctgGGGGtc'"'7. 064136 806"0. 98085 CETS1P54~01 NCMGGAWGYN tcAGGAcctg 1. 032772 816 0. 93 087 CETSlP54 Oi-NCMGGAWGYN CETS1P54~01 NCMGGAWGYN ccTGGAagag 1. 032772 822 0. 85 0. 89 ctTCCAgg-i. 03CETS1P5401NCMGGAWGYNggctTCCAgg1. 032772831085092 USFQ6GYCACGTGNCtccaGGTGag10. 960075835082086 USF C NCACGTGNUSFCNCACGTGNccAGGTGa0. 301857836086092

Filtration Site Consensus Séquence Z score Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice SP1Q6 NGGGGGCGGGGYN ttggGGTGgagcc 11. 119144 847 082 0. 87 GC 01 NRGGGGC3GGGC-NK---15-GcTûlNRGGGGCGGGGCNKttggGGTGgagcct15. 9338168470'87091 USF 06 0. 91 USFQ6GYCACGTGNC gcctGGTGac 5. 390268 8570820'90 CEBPB 01-090 NR KNNGMAAKNN tggtga GAAA cg CEBPB~01 RNRTKNNGMAAKNN tggtgacGAAAgcg1. 857489 8600. 99 0. 91 ICGAA NR KNNGMAAKNN tggtga A MYOD~01 SRACAGGTGKYG ccccaGCTGtca32. 908282 921083086 AGGTGKYG GGT a RA AGGTGKYG aG G c cccc&commat; GCT Gt s c cccc CT t g . 908282 921 0. 0. 86 S T CA SNNC AGGTGN NN cccc&commat; SNNCAGGTGNNN ccccaGCTGtc LM02COM01SNNCAGGTGNNNccccaGCTGtca2. 232288921088092 iGCTGt ( a NNCAGGTGNNN AG 0. 92 SNNC GG NNN TG cccc LM02COM01SNNCAGGTGNNNcccCAGCtgtca0. 7734149210'880'93 s T cccc ctgtc c c CT y AGCtgt : MYOD Q6 0. 93 NNCANCTGNY ccC NN ANC GN AGCtqtc ccc tc MYOD~Q6 NNCANCTGNY ccCAGCtgtc 1. 656102 922 0. 920. 98 MYOD~Q6 NNCANCTGNY cccaGCTGtc 1. 6561029220. 92 0. 89 0 9 LM02COM~01 SNNCAGGTGNNN aatCAGAtgcga 0. 773414 963O 0. 89 0 9 MYOD~Q6 NNCANCTGNY atcaGATGcg-0. 175805 964 5 92 0. 94 094 CEBPB 01 CEBPB01RNRTKNNGMAAKNNggtTTACtccaccc1. 857489) 5*95M GCToiNRGGGGCGGGGCNKttactcCACCcctg15. 933816 10040'870'87 spi Q6 816 1 Ô04 0. 87 0. 87 NGGGGCGG-GGyN -11SP1Q6NGGGGGCGGGGYNtactcCACCcctg 11. 119144 10050'820'85 USF Q6 (-YCACG-. 82 0. 85 USFQ6GYCACGTGNC atcgAGTGac5. 390268 1036 00 88 HNF3B 01 NNNTR : i-TiRy-Ty 0. 88 HNF3B~01 NNNTRTTTRYTY tacTGTTtgcct 3. 978804 1046 0. 99 0. 92 CETSlP54 01 NCMGGAW'CETS1P5401NCMGGAWGYN agctTCCAgg 1. 032772 10700'850. 92 - 0. 85 0. 92 CETS1P5401 NCMGGAWGYNccAGGAaccc 1. 0327721075 0. 93 0. 89 CEBPB01RNRTKNNGMAAKNNggataaaGGAAtga 1. 85748910940'8089 CEBPB01RNRTKNNGMAAKNNaggttcaGAAAggg1. 85748911070'990'94 aggttcaGAAAggg 1 eC c GCT01 NRGGGGCGGGGCNK aaggGGCAgggagt 15. 933816 1116 0. 81 0. 85 01 N-F-IB C NGGGA5M-CCA NFKBCNGGGACTTTCCAaGGGAGttgccc 42. 313772 1123 0'880'90

Tableau 2 : Sites, scores, consensus, et positions par rapport au point d'initiation de la transcription (TSS) prédits par les toqiciets NNPP. TSSG et TSSW chez la souris

Filtration Site Consensus Séquence score Z Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice GF11101 NNN ttgcctacAATCcaggcaactatt 2. 393233-842 1. 00 0*88 NOMNNNAAATCANNGNNNNNNNN Analyse HNF3B01 NNNTRTTTRYTY aacTATTgattc 2. 929849-825 1. 00 0'85 comparative CEBPB01RNRTKNNGMAAKNNtgattctGAAAttg1. 4608361787099094 entre espèces CEBPB-01-787 0. 99 0. 94 entre espèces CEBPB01RNRTKNNGMAAKNN atgTTGCtaaaatg 1. 460836-760 1. 00 0. 91 NF1~Q6NNTTGGCNNNNNNCCNNN ttcTGGCtggtggcagga 2. 199282-688 1. 00 0. 88 AP4Q6CWCAGCTGGNcaCAGCagtg14. 1143963861'00087 NFKAPPAB01 GGGAGCTGCC gggaGCTGcc 11. 12-301 1. 00 0. 88 NFY~Q6 TRRCCAATSRN cctCCAAtggc 5187369156 1. 00 0. 89 HFH2 01 NAWTGTTTRTTT aaaaaAACAaaa 56. 365713-1211 1. 00 0. 94 SRY02 NWWAACAAWANN aaaaACAAaaac 7. 964442-1209 1. 00 0. 94 score Z > = 1, 96 HFH201NAWTGTTTRTTTacaaaAACAaaa 56. 365713-1205 1. 000. 87 SRY02NWWAACAAWANNaaaaACAAaaca3. 860390-12031'00095 HFH2 01 NA 0. 95 HPH201NAWTGTTTRTTTaacaaAACAaaa28. 165126-12001'000'89 SRY02NWWAACAAWANNcaaaACAAaaac3. 860390-11981'00094 HFH201NAWTGTTTRTTTacaaaAACAaaa56. 365713-1194 1. 00 0. 87 SRY~02 NWWAACAAWANN aaaaACAAaaac 7. 964442-1192 1. 00 0. 94 HFH2~01 NAWTGTTTRTTT acaaaAACAata28. 165126-1188 1. 00 0. 91 HPH101NAWTGTTTATWTacaaAAACaata28. 079407-1188 1. 00 0. 87 SRY 02 SRY02NWWAACAAWANN aaaaACAAtaaa 3. 860390-1186 1. 00 0. 98 TATA01STATAAAWRNNNNNNcaaTAAAaacctctg3. 965815-11811'000'89 NF1~Q6NNTTGGCNNNNNNCCNNN gttTGGCcgtgatggagg2. 199282-11401'00 0. 93 CHOP 01. 199282-1140 1. 00 0. 93 CHOP01NNRTGCAATMCCCaggTGCAagccct20. 432681-11041'000'85 SRY02 NWWAACAAWANN ctgcACAAaagt 3. 860390-1093 1. 00 0. 85 LYF101TTTGGGAGR"'ttaGGGAga'7. 842719'-10821'000'90 E2F02TTTSGCGC"gcgaGAAA'3. 546279-10711. 000'91 GATA103 NNNNNGATAANNGNtgtgaGATAgatcg 2. 031644-1042 1. 00 0. 88 CDPCR3HD01 NATYGATSSSgataGATCgg 2. 349950-1037 1. 00 0. 97 gataGAfCgg NFE201TGCTGASTCAY ggCTGAgtctc 21. 950203 -10091'00 0. 87 CHOP 01. 87 0 CHOP01 NNRTGCAATMCCC atcTGCAaaaccc 20. 432681-969 1'00086 NF1~Q6 NNTTGGCNNNNNNCCNNN aactcacgcttGCCAggg2. 19928219381'000'85 e.-938 0. 85

Filtration Site Consensus Séquence score Z Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice SRY02 NWWAACAAWANN tgctTTGTgaaa 3. 860390 -897 1. 00 0. 85 HFH1 01-897 1. 00 0. 85 HFH101 NAWTGTTTATWT aaatAAACcagt 28. 079407-888 1. 00 0. 86 POLYCCAATAAANCCNYYYKCTNaAATAAAccagttttttt 177. 269419-888 1. 00 0. 88 IHRE-01 CAGTTTCWCTTTYCC caGTTTtttttttcc 384. 173196-8801'00 0. 86 TALI BETAE47 01 NNNAACAGATGKTN 1. 0 TAL1BETAE47~01 NNNAACAGATGKTNNN ggagacaTCTGagaat 15. 998313 -859 1. 00 0. 85 -859 10 0 0 GF) NNNNNNAAATCANNGNNNNNNNN catctgagAATCttgcctacaatc 2. 39323318541'00086 ! Li-9323 -859 00 - 3-854 1. 00 0. 86 00 0 SRY~02 NWWAACAAWANN gcctACAAtcca 3. 860390-840 1. 00 0. 85 0 0 RFX101 NNGTNRCNNRGYAACNN tacaatccagGCAActa 7. 172878-8371'00087 ! 11. 00 00 GF1101NNNNNNAAATCANNGNNNNNNNN caggcaactattGATTctaatctt 2. 393233830 1. 00 0. 89 1. 00 1 *00 GF1101 NNNNNNAAATCANNGNNNNNNNN ttgattctAATCttaggatattgg 2. 393233-820 1. 00 0. 89 3-820 GATA1 03 NNNNNGATAANNGN cttagGATAttggg 2. 031644 -809 1. 00 0. 90 -809 809 798M 1 nnÊ NFYQ6TRRCCAATSRN'gataTTGGgct 5. 187369-804 M) 0'88 -804 -804 GF) NNNNNNNAAATCANNGNNNNNNNN gggctgccacctGATTctgaaatt 2. 393233-798 1. 000. 89 98 E47 02 E4702NNNMRCAGGTGTTMNNgctgccaCCTGattct15. 4326407961'00088 LM02COM01SNNCAGGTGNNNtgccaCCTGatt3. 041567794iToo0'93 tgccaCCTGatt MYOD~01 SRACAGGTGKYG tgccaCCTGatt 40. 698075-794 1. 000. 92 SRY 02 NWWAACAAWANNSRY02NWWAACAAWANNgaaaTTGTctag 3. 860390-780 1. 00 0. 87 TH1 E47 01NNNNGNRTCTGGMWTT gtacaattCTGGctgg16. 434630694 1. 00 0. 85 0, 85 CP2 01GCNMNAMCMAG CTGGctggtgg3. 137246-686 1. 00 0. 88 1 1. 00 0*88 GATA1~03NNNNNGATAANNGNcacagGATAcaaag 2. 031644-665 1. 00 0. 88 0. 88 1. 00 1 0"88 0 1. 00 0. 87 SRY02 NWWAACAAWANN ggatACAAagac 3. 860390-661 1. 00 0. 85 1. 00 0. 85 NRF201ACCGGAAGNSaccTTCCgac6. 7018506401'000'87 l.-OO ERQ6NNARGNNANNNTGACCYNNaaatggtcctcTGACctcc10. 3740541573100089 . 374054 1. 00 AP1 FJ Q2 RSTGACTNMNW AP1FJQ2RSTGACTNMNW tcTGACctcca 5. 142253-564 1. 00 0. 90 AP1Q2RSTGACTNMNWtcTGACctcca5. 142253"-5641'00086 RORA101NWAWNNAGGTCANctGACCtccacag5. 4379135631'00093 GATA103 NNNNNGATAANNGN ccacaGATAtgcca 2. 031644-556 1. 00 0. 87 OCT106 CWNAWTKWSATRYN agatatgccATGCa 8. 438364"-552 1. 00085 OCT C CT ataag OCTCCTNATTTGCATAYataagCAAATtaa 70. 26588-5201. 00088 NKX2502 CWTAATTG aaATTAat 983418-514 1. 00 0. 86 TST1 01 NNKGAWTWANANTNN aattAATTaaattta 4. 120840-513 1. 000. 87 NKX25 02 NKX2502CWTAATTGatTAATta 3. 983418-512 1. 00 0. 87 NKX2502CWTAATTGtaATTAaa3. 983418) 01'00087 SRY02 NWWAACAAWANN aaaaACAAaggt 3. 860390-4991. 00 0. 93

Filtration Site Consensus Séquence score Z Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice NF1~Q6 NNTTGGCNNNNNNCCNNN tggTGGCacacgccttta 2. 199282-481 1. 00 0. 85 0. 85 AHRARNT01KNNKNNTYGCGTGCMSgcaCACGcctttaatc14. 600483"476*000'86 GF) 101NNNNNNAAATCANNGNNNNNNNN acgcctttAATCccagcactcagg 2. 39323314721'0001 2-472 39323E3 1. ( GF) NNNNNNAAATCANNGNNNNNNNN ggtctaagcagtGATTtccaggcc 2. 393233-413 1'000. 97 3 -413 239 : 32133 1-C NKX2502CWTAATTG"aaATTAaa3. 98341813631'00086 3-98 18-363 18 LYFl-01 TTTGGGAGR-363 0. 86 LYF101TTTGGGAGRttgGGGAga7. 842719*3330009 NF1Q6NNTTGGCNNNNNNCCNNNtgtggggagctGCCAttt2. 19928213051'00088 TTG G NNNNN c cc tg TT tgg NCCNNN tgtggg' NFl-Q6 NNTTGGCNNNNNNCCNNN tgtggggagctGCCAttt--27li992-82-305 1. 00 U-88- 'CAttt gi : 1 NGGGGAMT NGGGGAMT CCNNTT TTCCNN tgGG NFKB~Q6 NGGGGAMTTTCCNNtgGGGAgctgccat 30. 067903-303 1. 000. 87 tgGGGA tgcca tgG GAgctgccat cat gc t E NFKAPPAB01GGGAMTTYCCGGGAgctgcc10. 36118713011'00088 GGGAMTTYCC tgcGGGAMTTYCC GGGAgc > GAgctgc c . 36, 187 C c Q. 361187-301 1. 00 0. 88 NRGNNANNNTGACCYNN gaactca ( NNARGNNANNN GA NN gaa ca a GACccgt ERQ6 NNARGNNANNNTGACCYNN gaactcacaggTGACccgt 10. 374054-279 1'000. 86 ca T ccy ct c 2 gT cccgtA ? gTG : KI KI t&commat;A c > r&commat;Ar&commat;f&commat; m1 KK E47 02 0. 86 NNIHA Il N MRCAGGTGTTM ccg E47û2NNNMRCAGGTGTTMNNactcaCAGGtgacccg15. 43264012771'000'90 LM02COM01 SNNCAGGTGNNN tcaCAGGtgacc3. 041567275 1. 00 0. 94 MYOD01SRACAGGTGKYGtcaCAGGtgacc40. 69807512751'000'89 SREBP101 NATCACGTGAY cacagGTGAcc15. 35563041'000. 86 AP1 Q4 15. 355630-274 1. 00 0. 6 AP1~Q4 RSTGACTMANN ggTGACccgtt 11. 246163 -270 1. 00 0. 86 AP1~Q2 RSTGACT YMNW-RSTGACTNMNW ggT ST CT m w gg R GA N N GA cgtt TGACccgtt 7. 895015-2-70 i-oo 0ST CT M W gg AP1Q2RSTGACTNMNW ggTGACccgtt 7. 895015"-2701'000'91 AP1FJ~Q2 RSTGACTNMNW ggTGACccgtt 7. 895015'-270 1'00 0. 93 TGACccgtt R GA N N GA VMYB 01. 895015 0. 93 AAYAACGGNN ac AAYAACGGNN accCGTTg tgâaacc tt Tgtc VMYB01AAYAACGGNN accCGTTgtc 3. 427439-2661. 00 0. 93 CCGTG C tCCAa a c NN GGCNNNNNNCCNNN gtccca TT c gtcr NN GGCNNNNNN CNNN agtgaaGCCAaac NF1Q6NNTTGGCNNNNNNCCNNNgtcccagtgaaGCCAaac2. 1992822421'000'90 N T TCTC G GG NGTGGTCTC trtff"PADSC NGTGGTCTC tGTGGTccc 5. 230232"-1691'000'89 GC 01 1. 00 0. 89 GC~01 NRGGGGCGGGGCNK tggtccCGCCtcct 35. 805311-167 M087 spl Q6 i. 00 0. 87 ggtccCGCCtcct SP1Q6NGGGGGCGGGGYNggtccCGCCtcct 25. 529462-1661. 000. 88 NF1~Q6 NNTTGGCNNNNNNCCNNNcaaTGGCaaagtcgcctg2. 199282-152 1. 00 0. 85 E4702 NNNMRCAGGTGTTMNN agtagCAGGtgcaata 15. 432640-1341'000 92 E4701 NSNGCAGGTGKNCNN gtaGCAGgtgcaata 9. 748242-133 1. 00 0. 88 L. M02COM01SNNCAGGTGNNNtagCAGGtgcaa3. 0415671321'000'96 MYOD01SRACAGGTGKYG tagCAGGtgcaa'40. 698075"-132 1. 000'86 CHOP-01 NN aggTGèA-atatcc--7 ()- . 4326gl CHOP01NNRTGCAATMCCCaggTGCAatatcc20. 4326811281'00096 CAAT01NNNRRCCAATSA aatatCCAAtag 3. 434507-l221'000'90 NFYQ6TRRCCAATSRNtatCCAAtagt 5. 1873691201'00092 oi-5. 187369-120 1. 00 0. 92 GC01 NRGGGGCGGGGCNK agggGGCGgggctg 35. 805311-103 1. 00 1. 00 SP1Q6NGGGGGCGGGGYN agggGGCGgggct 25. 529462-103 1. 00099 . 529462 . 529462-103 1. 0 0. 99 BARB) ATNNAAAGCNGRNGGagcgAAAGtggatgg 29. 452018 6 1'00 0. 91 NKX2501TYAAGTGgaAAGTg 3. 534570 91'00088

Filtration Site Consensus Séquence score Z Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice VMYB01 AAYAACGGNN cagAACGgtg 3. 427439 34 1. 00 0. 90 GF) NNNNNNNAAATCANNGNNNNNNNN ggtgagaaAATCcccgagagggtg 2. 393233 401. 00090 NFKBQ6NGGGGAMTTTCCNNtgagaaaaTCCCcg30. 06790342Too0. 86 ZID01 NGGCTCYATCAYC gaaggtgGAGCct 41. 225196 64 1. 00 091 TH1E4701NNNNGNRTCTGGMWTTctggagatCTGGggat16. 434630751'00088 SREBP102KATCACCCCAC"gtgggGTGAgg27. 710802941'00094 gtgggGTGAgg 27. 710802 94 1. 00 0. 94 NFE201 TGCTGASTCAY ggCTGAgccac 21. 950203 108 1. 00 0. 87 USF Q6 GYCACGTGNC gcCACGttcc 6. 857788 114 1. 00 0. 87 Kl-01 NNNTGGGAATRCC cacgtTCCCtgat 14. 853568 116 1. 00 0. 88 GATA103NNNNNGATAANNGNtccctGATAatttg2. 031644 ? 211'00093 NKX25 02 CWÀATTG--NKX2502 CWTAATTG gaTAATtt 3. 983418 1261'00086 E4702NNNMRCAGGTGTTMNNggttcCAGGtgcctac15. 4326401361'00087 LMO2COM~01 SNNCAGGTGNNN ttcCAGGtgcct3. 041567 1381'000. 96 MYOD 01 SRACAGGTGKYG MYOD01SRACAGGTGKYGttcCAGGtgcct40. 6980751381'00086 GATA1~03 NNNNNGATAANNGN ttcctTATCcttcc 2. 031644 164 1'00095 1644 164 NRF201 ACCGGAAGNS tccTTCCggg 6. 701850 171 1. 000. 91 STAF~02 MNTTCCCAKMATKCMWNGCNN cttccggggagtgTGGGaaaa 341. 255924 1731. 000. 86 IKl-01 K101NNNTGGGAATRCC gtgtGGGAaaaat 14. 853568 1831. 00 092 LYF101TTTGGGAGRtgtGGGAaa7. 8427191841*00086 AP4Q6CWCAGCTGGNcaCAGCggtc14. 1143962'101'00090 AP1~Q2 RSTGACTNMNW cagcgGTCAtc5. 142253 2121. 00088 AP1FJQ2RSTGACTNMNWcagcgGTCAtc5. 1422532121'00090 TAL1BETAE4701NNNAACAGATGKTNNNgcggtcaTCTGgtcac48. 1194672141'0009 TAL1ALPHAE47 0NNNAACAGATGKTNNN gcggtcaTCTGgtcac 48. 119467 214 1'00088 1 TAL1 BETAtTF2~0 NNNAACAGATGKTNNN gcggtcaTCTGgtcac 48. 119467 214 1. 00 0. 88 1 TH1E4701 NNNNGNRTCTGGMWTT gcggtcatCTGGtcac 16. 434630 214 1. 00 0. 86 AP1FJQ2 RSTGACTNMNW atctgGTCAcc 7. 895015 220"'1. 00 0. 93 AP1Q4 RSTGACTMANN atctgGTCAcc11. 246163 2201. 00 0. 86 AP1 Q2 RSTGACTNMNW atctgGTCAcc 7. 895015 220 1. 00 0. 90 ERQ6NNARGNNANNNTGACCYNN tctgGTCAcctcgagggac 10. 374054 221 1. 00 0. 86 NF1Q6NNTTGGCNNNNNNCCNNNgagggacctctGCCAacc2. 199282 233 1. 00095 NKX2501TYAAGTGcACTTtc3. 534570267100088 AP1FJ Q2 RSTGACTNMNW ggcctGTCAcc5. 142253 281 1. 00 0. 91

<tb>
<tb> Filtration <SEP> Site <SEP> Consensus <SEP> Séquence <SEP> score <SEP> Z <SEP> Position/TSS <SEP> (pb) <SEP> Similarité <SEP> ducore <SEP> Similarité <SEP> de <SEP> la
<tb> matrice
<tb> AP1Q2 <SEP> RSTGACTNMNW <SEP> ggcctGTCAcc <SEP> 5.142253 <SEP> 281 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> SREBP1~02 <SEP> KATCACCCCAC <SEP> tgTCACccccc <SEP> 27. <SEP> 710802 <SEP> 285 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 87
<tb> TH1 <SEP> E4701 <SEP> NNNNGNRTCTGGMWTT <SEP> ccccCCAGatctcaaa <SEP> 16. <SEP> 434630 <SEP> 297 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 86
<tb> IRF101 <SEP> SNAAAGYGAAACC <SEP> aaTTTCactttat <SEP> 81. <SEP> 006772 <SEP> 311 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 87
<tb> # <SEP> GAAAGYGAAASY <SEP> aaTTTCactttat <SEP> 59. <SEP> 661305 <SEP> 311 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 85
<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> gagtggaagccGCCAatt <SEP> 2. <SEP> 199282 <SEP> 341 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 93
<tb> NFYQ6TRRCCAATSRNccgCCAAtttc5. <SEP> 1873693501'00089
<tb> OCT1~Q6 <SEP> NNNNATGCAAATNAN <SEP> ccaATTTccatgtag <SEP> 11. <SEP> 430842 <SEP> 353 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> OCT1~06 <SEP> CWNAWTKWSATRYN <SEP> ccaatttccATGTa <SEP> 8. <SEP> 438364 <SEP> 353 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 92
<tb> OCT1~07 <SEP> TNTATGNTAATT <SEP> AATTtccatgta <SEP> 27. <SEP> 046261 <SEP> 355 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 88
<tb> CEBP~C <SEP> NGWNTKNKGYAAKNNAYA <SEP> aaactttgGCAATttccc <SEP> 23. <SEP> 615437 <SEP> 374 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 86
<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> cttTGGCaatttccctct <SEP> 2. <SEP> 199282 <SEP> 377 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 95
<tb> NFKAPPAB6501GGGRATTTCCggcaatTTCC30. <SEP> 6691843811'0006
<tb> CREL-01 <SEP> SGGRNWTTCC <SEP> ggcaatTTCC <SEP> 7. <SEP> 203414 <SEP> 381 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 86
<tb> NFKAPPAB~01 <SEP> GGGAMTTYCC <SEP> gcaattTCCC <SEP> 10. <SEP> 361187 <SEP> 382 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 85
<tb> IK1 <SEP> K1~01 <SEP> NNNTGGGAATRCC <SEP> caattTCCCtctc <SEP> 14.853568 <SEP> 383 <SEP> 1.00 <SEP> 0.86
<tb> AP1~Q4 <SEP> RSTGACTMANN <SEP> tctctGTCAgc <SEP> 11. <SEP> 246163 <SEP> 392 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 90
<tb> AP1FJ~Q2 <SEP> RSTGACTNMNW <SEP> tctctGTCAgc <SEP> 7. <SEP> 895015 <SEP> 392 <SEP> 1.00 <SEP> 0.95
<tb> AP1~Q2 <SEP> RSTGACTNMNW <SEP> tctctGTCAgc <SEP> 7. <SEP> 895015 <SEP> 392 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 95
<tb> ISRE~01 <SEP> CAGTTTCWCTTTYCC <SEP> caGTTTccctatcgg <SEP> 384. <SEP> 173196 <SEP> 405 <SEP> 1.00 <SEP> 0.85
<tb> IK1~01 <SEP> NNNTGGGAATRCC <SEP> cagttTCCCtatc <SEP> 14. <SEP> 853568 <SEP> 405 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> GATA~03 <SEP> NNNNNGATAANNGN <SEP> ttcccTATCggtat <SEP> 2. <SEP> 031644 <SEP> 409 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> GATA1~03 <SEP> NNNNNGATAANNGN <SEP> atcggTATCatgaa <SEP> 2. <SEP> 031644 <SEP> 415 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> NF1~Q6 <SEP> NNTTGGCNNNNNNCCNNN <SEP> tcatgaagcagGCCAcag <SEP> 2. <SEP> 199282 <SEP> 422 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 86
<tb> TATA~03 <SEP> STATAAAWRNNNNNN <SEP> aaaTAAAataacgaa <SEP> 3. <SEP> 965815 <SEP> 458 <SEP> 1.00 <SEP> 0.85
<tb> GF) <SEP> NNNNNNAAATCANNGNNNNNNNN <SEP> aataacgaAATCaggaatggcgtg <SEP> 2. <SEP> 393233 <SEP> 464 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 92
<tb> VMYB~01 <SEP> AAYAACGGNN <SEP> aatAACGaaa <SEP> 3. <SEP> 427439 <SEP> 464 <SEP> 1.00 <SEP> 0.85
<tb> AHRARNT~01 <SEP> KNNKNNTYGCGTGCMS <SEP> caggaatggCGTGctc <SEP> 14. <SEP> 600483 <SEP> 475 <SEP> 1.00 <SEP> 0.93
<tb> AP1 <SEP> Q4 <SEP> RSTGACTMANN <SEP> ccTGACtcctc <SEP> 11. <SEP> 246163 <SEP> 503 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 89
<tb> AP1~Q2 <SEP> RSTGACTNMNW <SEP> ccTGACtcctc <SEP> 7. <SEP> 895015 <SEP> 503 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 90
<tb> AP1FJ~Q2 <SEP> RSTGACTNMNW <SEP> ccTGACtcctc <SEP> 7. <SEP> 895015 <SEP> 503 <SEP> 1.00 <SEP> 0.93
<tb> BARBIE~01 <SEP> ATNNAAAGCNGRNGG <SEP> taccctcCTTTtgac <SEP> 29. <SEP> 452018 <SEP> 532 <SEP> 1.00 <SEP> 0.86
<tb> AP1FJ~Q2 <SEP> RSTGACTNMNW <SEP> ttTGACtccgg <SEP> 7. <SEP> 895015 <SEP> 541 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> AP1~Q2 <SEP> RSTGACTNMNW <SEP> ttTGACtccgg <SEP> 7. <SEP> 895015 <SEP> 541 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb>

Filtration Site Consensus Séquence score Z Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice AP1Q4 RSTGACTMANN ttTGACtccgg 11. 246163 541 1. 00 088 GC01NRGGGGCGGGGCNK ggagGGCGggccct35. 8053115501'000'91 SPI~Q6 NG 50 1. 00 0. 91 SP1Q6 NGGGGGCGGGGYN ggagGGCGggccc 25. 529462 550 1. 00 0. 93 TH1E4701NNNNGNRTCTGGMWTT cttcttctCTGGtttc 16. 434630 5651'000'86 AHRARNT01KNNKNNTYGCGTGCMS"ccttgggagCGTGac ! 14. 600483"580T5506 LYF101TTTGGGAGRcttGGGAgc7. 8427195811'000. 86 API FJ Q2 cttGGGAgc 7. 842719 581 1. 00 0. 86 AP1FJQ2RSTGACTNMNWcgTGACtttgc 7. 895015 589 1. 000. 92 AP1~Q2 RSTGACTNMNW cgTGACtttgc 7. 895015 589 1'000. 89 - 0. 89 AP1Q4RSTGACTMANNcgTGACtttgc11. 246163589ToO09 ) NNNTGGGAATRCC tcagtTCCCatct14. 853568 613 1. 00 0. 88 E47~01NSNGCAGGTGKNCNNaaggccagCTGCaaa 9. 748242 6381'000. 89 AP4Q6CWCAGCTGGNgcCAGCtgca21. 2417466411'000'91 AP4Q5NNCAGCTGNNgcCAGCtgca3. 0807786411'0004 AP4Q6CWCAGCTGGNgccaGCTGca21. 2417466411'000'94 AP4Q5NNCAGCTGNN'"gccaGCTGca 3. 080778 641 1. 00 0. 95 OCT1~Q6 NNNNATGCAAATNAN ccagctgcAAATgac 11. 430842 642 1. 000. 88 AP1Q2RSTGACTNMNW aaTGACacaga'7. 8950156511'00094 AP1FJQ2RSTGACTNMNWaaTGACacaga7. 8950156511'000'94 AP1Q4RSTGACTMANNaaTGACacaga11. 2461636511'000'91 11. 246163 651 1. 00 0. 91 E47~02 NNNMRCAGGTGTTMNN ggggccaCCTGgggcg 15. 432640 677 1.00088 LM02COM01SNNCAGGTGNNNggccaCCTGggg3. 041567691'000'98 3. 04156Î 679 MYOD01 SRACAGGTGKYGggccaCCTGggg 40. 698075 679 1. 00 0. 89 VMYB 01 i.-ooVMYB01AAYAACGGNNgcgAACGgaa3. 4274396901'000'91 3. 427439 69-0 THlE47 01 NNNNGNRTCTGGMWT : F i-0 o-0. 91 TH1E4701NNNNGNRTCTGGMWTTaccccggtCTGGtatg 16434630 7051'00090 AP1FJQ2RSTGACTNMNW gcTGACcgtgg5. 1422537231'000'89 AP1Q2RSTGACTNMNWgcTGACcgtgg51422537231'0008 APl-Q2 RSTÂCTNMNW--0. 89 1"00 89 ZID 01 gcTGACcgtgg-51422-53 723 0. 88 1. 00 0. 88 ZtD01NGGCTCYATCAYCgaccgtgGAGCcc41. 2251967261'00089 1. 00 0. 89 BARB) ATNNAAAGCNGRNGG ccccaagCTTTaaac 29. 452018 750 1. 00 0. 92 1. 00 9 . 92 Ëo 9 GC~01 NRGGGGCGGGGCNK aagctcCGCCccct35. 805311 767 1'000'97 SPI Q6 NGGG 0. 97 SP1 Q6NGGGGGCGGGGYN agctcCGCCccct 25. 529462 7681. 00 0. 95 CREL01SGGRNWTTCCagggtcTTCC3. 4678587931'000'92 . 92 TH1E4701NNNNGNRTCTGGMWTTtcttCCAGaccccagc 16. 434630 7971. 00094 CDP-02 NWNATCGATTANYN 0. 94 CDP02 NWNATCGATTANYNN gccttcatCGATagc 24. 1239808111*00 0'91 ili CLOX01NNTATCGATTANYNWgccttcatCGATagc 50. 240668 811 1. 00 0. 90

Filtration Site Consensus Séquence score Z Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice GATA103 NNNNNGATAANNGN tcatcGATAgccct 2031644 815 1. 00 0. 88 NF1Q6"NNTTGGCNNNNNNCCNNNtagcccttccaGCCAatc 2. 199282 8221'00093 N tagcccttcca. 00 0. 93 NRF2~01 ACCGGAAGNS cccTTCCagc 6. 701850 825 1. 00 M GFI1~01NNNNNNAAATCANNGNNNNNNNN ttccagccAATCagctacgaggac 2. 3932338281'00088 8 3233 828 1. 00 0. 88 828 0. 88 NFY~C NCTGATTGGYTASY tccagCCAATcagc 65. 593286 829 1. 00 0. 96 9 829 0. 96 CAAT~01 NNNRRCCAATSAtccagCCAAtca 3. 434507 829 1. 00 0. 99 8 29 0. 99 8319 NFY~Q6 TRRCCAATSRN cagCCAAtcag5. 187369 831 1. 00 0. 96 AP4Q6CWCAGCTGGNgacgGCTGcg14. 1143968491'00086 Kl-01 NNNTGGGAATRCC cgggtTCCCattg 14. 853568 862 1. 00 0. 91 NFYQ6TRRCCAATSRN cccaTTGGtca'5. 187369868"005*95 CAAT01 NNNRRCCAATSA ccaTTGGtcact 3. 434507 869 1. 00 0. 91 AP1FJQ2 RSTGACTNMNW cattgGTCAct 7. 895015 870 1. 00 0. 94 AP1Q4RSTGACTMANNcattgGTCAct11. 246163 870 1. 00 091 AP1~Q2 RSTGACTNMNW cattgGTCAct 7. 895015 870 1. 00 0. 91 OLF101 NNCNANTCCCYNGRGARNNKGN gtcactTCCCtagtgaatttct 77. 977123 875 1'000 86 IK1 01 NNNTGGGAATRCC tcactTCCCtagt 14. 853568 876 1'00087 . 853568 876 100 0. 87 SRY02NWWAACAAWANN tgccTTGTttgc"3. 860390 905 1'00ohm GFI1~01NNNNNNAAATCANNGNNNNNNNN ctctttgcgggaGATTtattgagg 2. 393233 921 1. 00 0. 88 TATA01 STATAAAWRNNNNNN gcgggagaTTTAttg 3. 9658159271'00OM 927 1. 00 085 AP2~Q6 MKCCCSCNGGCG gaCCCGcagaca 12. 284970 978 1. 00 0. 86 TH1E4701 NNNNGNRTCTGGMWTT acatttgtCTGGagcc 16. 434630 987 1. 00 0. 89 NF1~Q6 NNTTGGCNNNNNNCCNNN atttgtctggaGCCAcac 2. 199282 98900 0'86 AP4~Q6 CWCAGCTGGN caCAGCtcac 14. 114396 1004 1. 00 0. 88 AP4~Q6 CWCAGCTGGN ctccGCTGtt 14. 114396 1040 1. 00 0. 85 TH1 E4701 NNNNGNRTCTGGMWTT cggtCCAGagtcatca 16. 434630 1052 1. 00 0'86 VMAF01 NNNTGCTGACTCAGCANNN cggtccagaGTCAtcatgg 168. 513881 1052 1 00 0. 87 AP1~Q2 RSTGACTNMNW ccagaGTCAtc 7. 895015 1056 1. 00 0. 93 AP1Q4RSTGACTMANNccagaGTCAtc 11. 246163 1056 1. 00 0. 90 AP1FJQ2RSTGACTNMNWccagaGTCAtc7. 89501510561'000'92 Similarité core > = 0, 99 SOX5~01 NNAACAATNN aaaaCAATaa 0. 681190-1185 1. 00 0. 99 Similarité matrice > = 0, 85 AP4Q5NNCAGCTGNNgggcGCTGtc0. 508566-11221'00085 DELTAEF101 NNNCACCTNAN gcaAGGTgcaa 0. 538360-1107 1. 00 0. 96 IK2~01 K201NNNYGGGAWNNN gttaGGGAgaag-0. 854442-1083 1. 000. 91 CMYB01 NNNNNNGNCNGTTGNN aacagacacaGTTGaatg0. 594660-1065 1. 000. 92

Filtration Slte Filtration Site Consensus Séquence score Z Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice GATA102 NNNNNGATANKGNN tgtgaGATAgatcg 0. 930257-1042 1. 00 0. 91 GATAI 04 0. 930257-1042 1. 00 GATA104NNCWGATARNNNNgtgaGATAgatcg0. 653180-10411'00094 LM02COM02NMGATANSGgaGATAgat0. 569272-10391'00091 IK2-01 NNNYGGGAWNNN agtcTCCCtcac-0-854442-1004 1. 00 0. 89 AP4Q5''NNCAGCTGNN acCAGCttcc 0. 508566"9941'00086 IK2~01 NNNYGGGAWNNNcatcTCCCtcta-0. 854442-909 1. 00 0. 88 SOX501NNAACAATNNcctaCAATcc0. 681190"839Too06 GATA102NNNNNGATANKGNNcttagGATAttggg0. 930257M91'00093 GATAL 04 cttagGATAttggg 0. 930257-809 1. 00 0. 9 GATA104NNCWGATARNNNNttagGATAttggg0. 65318018081'00089 LM02COM02NMGATANSGagGATAttg0. 5692728061*00092 DELTAEF101NNNCACCTNAN tgccACCTgat 0. 538360**'tni55' MYODQ6NNCANCTGNYgcCACCtgat0. 78106117931'000'95 SOX501NNAACAATNNaaATTGtcta0. 68119019iToo086 SOX501NNAACAATNNggtaCAATtc0. 6811906951'000'86 GATA102NNNNNGATANKGNNcacagGATAcaaag 0. 930257-665 1. 00 0. 89 GATA104NNCWGATARNNNN acagGATAcaaag 0. 6531806641'000'88 LM02COM02NMGATANSGagGATAcaa0. 5692721662iToO0'88 CEBPB01RNRTKNNGMAAKNNaccttgtGCAAacc1. 4608366511'00oi4 DELTAEF101NNNCACCTNAN tccgACCTaaa 0. 538360-6361'0007 tccgACCTaaa 0. 538360-636 1. 00 0. 87 CEBPB01 RNRTKNNGMAAKNN tctTTGCctgaggt 1. 460836-620 1. 000. 87 tK201NNNYGGGAWNNNgaggTCCCacat-0. 85444211'000'95 DELTAEF101 NNNCACCTNAN tctgACCTcca 0. 538360-564 1. 00 0. 85 GATAi-02 ccacaGATAtgcca GATA102NNNNNGATANKGNNccacaGATAtgcca 0. 930257-556 1.0003 GATA104NNCWGATARNNNNcacaGATAtgcca0. 653180 5551'00094 LMO2COM~02 NMGATANSG caGATAtgc 0. 569272-553 1. 000. 96 S801NNNNNYAATTNacccTAATaagcaaat-1. 397287 5261'00086 S8~01 NNNNNYAATTN ataagcaaATTAatta-1. 397287-520 1'00095 S8J) NNNNNYAATTN gcaaattaATTAaatt-1. 397287-5161. 00 0. 97 S801 NNNNNYAATTN aaatTAATtaaattta-1. 397287514M) 099 IK2~01 NNNYGGGAWNNN ttaaTCCCagca-0. 8544424661'00095 AP4Q5NNCAGCTGNNccCAGCactc0. 5085664611'00085 AP4Q5 NNCAGCTGNN caCAGCagtg1. 7946721386 1 00 093 372 38E S8~01 NNNNNYAATTNctctcaaaATTAaaaa-1 3972873691'00093 MZF101NGNGGGGActtGGGGa 0. 43716213341'00096

<tb>
<tb> Filtration <SEP> Site <SEP> Consensus <SEP> Séquence <SEP> score <SEP> Z <SEP> Position/TSS <SEP> (pb) <SEP> Similarité <SEP> ducore <SEP> Similarité <SEP> de <SEP> la
<tb> matrice
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> cttgGGGAgagg-0. <SEP> 854442-334 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> tgtgGGGAgctg <SEP> -0. <SEP> 854442 <SEP> -305 <SEP> 1.00 <SEP> 0.87
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> tgtGGGGa <SEP> 0. <SEP> 437162 <SEP> -305 <SEP> 1.00 <SEP> 0.99
<tb> AP4Q5NNCAGCTGNNgggaGCTGcc1. <SEP> 79467213011'00091
<tb> MYOD~Q6 <SEP> NNCANCTGNY <SEP> cacaGGTGac <SEP> 0. <SEP> 781061 <SEP> -274 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> DELTAEF1~01 <SEP> NNNCACCTNAN <SEP> cacAGGTgacc <SEP> 0. <SEP> 538360 <SEP> -274 <SEP> 1.00 <SEP> 0.95
<tb> CMYB~01 <SEP> NNNNNNGNCNGTTGNN <SEP> caggtgacccGTTGtccc <SEP> 0. <SEP> 594660 <SEP> -272 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> VMYB~02 <SEP> NSYAACGGN <SEP> ccCGTTgtc <SEP> 0. <SEP> 465812 <SEP> -265 <SEP> 1.00 <SEP> 0.95
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gttgTCCCcctc <SEP> -0. <SEP> 854442 <SEP> -262 <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> tCCCCctc <SEP> 0. <SEP> 437162 <SEP> -258 <SEP> 1.00 <SEP> 0.96
<tb> IK2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> cgtgTCCCagtg <SEP> -0. <SEP> 854442 <SEP> -245 <SEP> 1.00 <SEP> 0.93
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> tgCAGCagga <SEP> 0. <SEP> 508566 <SEP> -221 <SEP> 1.00 <SEP> 0.90
<tb> CMYB01NNNNNNGNCNGTTGNNcaggaatcctGTTGtccc0. <SEP> 5946606iToo089
<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gttgTCCCttta-0. <SEP> 854442-206 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 91
<tb> AP4Q5NNCAGCTGNNgcggGCTGtg0. <SEP> 508566751'000'86
<tb> in2-01 <SEP> K2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gtggTCCCgcct <SEP> -0.854442 <SEP> -168 <SEP> 1.00 <SEP> 0.92
<tb> DELTAEF1~01 <SEP> NNNCACCTNAN <SEP> agcAGGTgcaa <SEP> 0. <SEP> 538360 <SEP> -131 <SEP> 1.00 <SEP> 0.95
<tb> MYOD~Q6 <SEP> NNCANCTGNY <SEP> agcaGGTGca <SEP> -0. <SEP> 147777 <SEP> -131 <SEP> 1.00 <SEP> 0.96
<tb> GATA1~02 <SEP> NNNNNGATANKGNN <SEP> tgcaaTATCcaata <SEP> -0. <SEP> 046677 <SEP> -125 <SEP> 1.00 <SEP> 0.92
<tb> GATA104 <SEP> NNCWGATARNNNN <SEP> tgcaaTATCcaat <SEP> 0. <SEP> 653180-125 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 87
<tb> LMO2COM~02 <SEP> MNGATANSG <SEP> caaTATCca <SEP> 0. <SEP> 569297 <SEP> -123 <SEP> 1.00 <SEP> 0.92
<tb> NKX25~01 <SEP> TYAAGTG <SEP> cACTTaa <SEP> 1. <SEP> 519193 <SEP> -33 <SEP> 1.00 <SEP> 0.98
<tb> IK2 <SEP> K2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> gcgcTCCCccgc <SEP> -0.854442 <SEP> -19 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> tCCCCcgc <SEP> 0. <SEP> 437162 <SEP> -15 <SEP> 1.00 <SEP> 0.96
<tb> VMYB~02 <SEP> NSYAACGGN <SEP> cagAACGgt <SEP> 0. <SEP> 465812 <SEP> 34 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0.92
<tb> # <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> aaaaTCCCcgag-0. <SEP> 854442 <SEP> 46 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 90
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> tCCCCgag <SEP> 1. <SEP> 679353 <SEP> 50 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 95
<tb> DELTAEF1~01 <SEP> NNNCACCTNAN <SEP> ggaAGGTggag <SEP> 0. <SEP> 538360 <SEP> 63 <SEP> 1.00 <SEP> 0.95
<tb> IK2 <SEP> K2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> tctgGGGAtgct <SEP> -0.854442 <SEP> 82 <SEP> 1.00 <SEP> 0.89
<tb> MZF1~01 <SEP> NGNGGGGA <SEP> tctGGGGa <SEP> 0. <SEP> 437162 <SEP> 82 <SEP> 1.00 <SEP> 0.96
<tb> AP4~Q5 <SEP> NNCAGCTGNN <SEP> gtggGCTGag <SEP> 0. <SEP> 508566 <SEP> 105 <SEP> 1.00 <SEP> 0.86
<tb> ARNT~01 <SEP> NNNNNCACGTGNNNNN <SEP> tgagcCACGttccctg <SEP> 0. <SEP> 511281 <SEP> 111 <SEP> 1.00 <SEP> 0.88
<tb> IK2~01 <SEP> K2~01 <SEP> NNNYGGGAWNNN <SEP> acgtTCCCtgat <SEP> -0.854442 <SEP> 117 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> 0. <SEP> 92
<tb> GATA1~02 <SEP> NNNNNGATANKGNN <SEP> tccctGATAatttg <SEP> 1.00 <SEP> 0.91
<tb>

Filtration Slte Filtration Site Consensus Séquence score Z Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice GATA104 NNCWGATARNNNN ccctGATAatttg 0. 653180 122 1. 00 0. 95 S8 01-ecctGATAattig 0. 653180 122 1. 00 0. 95 S801NNNNNYAATTNctgaTAATttggggtt-1. 3972871241'00095 LM02COM02NMGATANSGctGATAatt0. 5692721241'00091 GATA C 0. 569272 124 1. 00 091 GATACNGATAAGNMNN tGATAAtttgg1. 4110971251'0 090 MYODQ6NNCANCTGNYtccaGGTGcc-0. 1477771391'00091 DELTAEF101NNNCACCTNANtccAGGTgcct0. 538360139Ï'OO095 IK201NNNYGGGAWNNNactcTCCCttgc-0. 8544421501'00088 NNNYGGGAWNNN actcTCCCttgc-0. 8 442 irn 1. 00 0. 88 GATA NGATAAGNMNNcttccTTATCc1. 4110971631'00097 GATA1. 04- 163 1. 00 0. 97 GATA1~04 NNCWGATARNNNN ttcctTATCcttc0. 653180 164 1. 00 0. 94 GATA102NNNNNGATANKGNNttcctTATCcttcc0. 9302571641'00095 LM02COM02NMGATANSGcctTATCct0. 5692721661'00096 CETS1P5401 NCMGGAWGYNtcctTCCGgg1. 2444871711'00094 IK2 01 1. 244487 171 1. 00 MZF1 K201NNNYGGGAWNNNtccgGGGAgtgt-0. 854442Ï75*000*86 MZF101NGNGGGGAtccGGGGa 0437162 151'00095 ! K201NNNYGGGAWNNNgtgtGGGAaaaa-0. 8544421831'00097 AP4Q5NNCAGCTGNNcaCAGCggtc1. 7946722101'00092 DELTAEF1 01 NNNCACCTNANggtcACCTcga0. 5383602241'00094 C'CTcga 0. 538360 224 1. 00 0.

IK2~01 NNNYGGGAWNNN tcgaGGGAcctc-0. 854442 2311. 00 0. 90 CMYB~01 NNNNNNGNCNGTTGNN ctgcCAACctacacctcc0. 594660 2421'00085 DELTAEF101 NNNCACCTNAN ctacACCTcca0. 538360 250 1. 00 0. 94 In2-01 NNNYGGGAWNNN agtgTCCCactt-0. 854442 2601. 000. 93 MZF101NGNGGGGAcCCCCacc0. 4371622911'00085 NKX2501TYAAGTGcACTTta 1. 519193'316"1'00094 cAC'ta 1. 5191-93 316 1. 00 r ) NNNYGGGAWNNNaaagTCCCcgag-0. 854442 3321. 00088 MZF101NGNGGGGA'* tCCCCgag'1. 679353 336'1. 00095 CEBPB 01 1. 00 0. 95 - RNRTKNNGMAAKNN aactttgg AAttt-CEBPB01RNRTKNNGMAAKNNaactttgGCAAttt 1. 460836 375100096 aattTCC5-tctc----UIK2 01. 854442-784-î. 00NNNYGGGW-N-NN 0. 92 ) K201NNNYGGGAWNNNaattTCCCtctc-0. 854442 384 1. 00092 1-vv U-94 ) K201NNNYGGGAWNNNagttTCCCtatc-0. 854442 4061'00094 1. 00 GATA104NNCWGATARNNNNttcccTATCggta 0. 653180 409 0. 93 GATA102NNNNNGATANKGNNttcccTATCggtat0. 930257 409 1. 0009 1. 00 LM02COM 02 NMÎÀTANSG-0. 97 LMO2COM~02 NMGATANSG cccTATCgg 0. 569272 411 1. 000. 99 1. 00 GATA1~02 NNNNNGATANKGNN atcggTATCatgaa0. 930257 4151'00092 1. 00 GATAI 04 NNC 0. 92 ÉROOMO. 96 GATA104NNCWGATARNNNNatcggTATCatga0. 653180 415 1. 00 091 LM02COM02NMGATANSGcggTATCat 0. 569272" 417 * 1. 00096 1. 00 i 417 1. 00

Filtration Site Consensus Séquence score Z Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice CETS1P5401 NCMGGAWGYN cagtTCCGgg 1. 244487 445 1. 00 0. 92 MZF101NGNGGGGAcggGGGGa0. 437162451M098 IK2 01. 00 NNNYGGG ; W-NNN- 442 4-51 1 ÔO IK2~01 K201NNNYGGGAWNNNcgggGGGAaata-0. 8544424511'00091 NNNYGGGAWNNN K201NNNYGGGAWNNNcctgTCCCtgac-0. 8544424971'00090 CETS1P5401NCMGGAWGYNtgacTCCGga1. 244487543100087 CETS1P5401NCMGGAWGYNtcCGGAgggc1. 2444875471'00090 ) K201NNNYGGGAWNNNccttGGGAgcgt-0. 854442' ? 01'00092 IK2 01 NNNT-IK2~01 K201NNNYGGGAWNNNcagtTCCCatct-0. 8544426141'00094 CETS1P5401NCMGGAWGYNagacTCCGgg1. 2444876591'00086 DELTAEF101NNNCACCTNANggccACCTggg0. 538360679M0'95 myoD-Q6 NNCANCTGNYMYOD~Q6 NNCANCTGNY gcCACCtggg 0. 781061 680 1. 000. 91 VMYB02NSYAACGGN gcgAACGga 0. 465812 690 1. 00 0. 93 GATA1~02NNNNNGATANKGNN tcatcGATAgccct 0. 930257 8151. 000. 91 GATA104NNCWGATARNNNNcatcGATAgccct0. 653180865S LMO2COM~02 NMGATANSG tcGATAgcc 0. 569272'818 1. 00095 AP4Q5NNCAGCTGNN atCAGCtacg 0. 508566 837 1. 00 0. 89 AP4~Q5 NNCAGCTGNN gacgGCTGcg1. 794672 849 1. 00 0. 91 - NNNYGGGAWNNN gggtTCCCattg-0. 854442 863 31 00 0. 97 In2-01 NNNYGGGAWNNN cactTCCCtagt-0. 854442 877 1. 000. 92 NKX25 01 TYAAGTG 0. 92 NKX2501TYAAGTG cACTTcc 1. 519193 877 1. 00 0. 88 IK2 01 NNNYGGGAWNNN ) K201NNNYGGGAWNNNttgcGGGAgatt-0. 8544429251'000*89 AP4Q5NNCAGCTGNNctCAGCccga0. 5085669451'000'87 AP4Q5NNCAGCTGNNcaCAGCtcac1. 79467210041'000'92 . 794672 1004 1. 00 0. 92 AP4~Q5NNCAGCTGNN ctccGCTGtt1. 79467210401'00091 1. 794672 1040 1. 00 0. 91 CETS1P54~01 NCMGGAWGYN tgttTCCGgt 1. 244487 1046 M) 0. 95 HFH2~01 NAWTGTTTRTTT aaacaAAAAaaa 56. 365713-1219 0. 82 0. 89 HNF3B01 NNNTRTTTRYTY aaacaAAAAaaa 6. 168471-1219 0. 85 0. 90 aucune HFH2~01 NAWTGTTTRTTT aaaaaAAAAaac 28. 165126-1215 0. 82 0. 88 (Paramètres par défaut HNF3B~01 NNNTRTTTRYTYaaaaaAACAaaa 6. 168471-1211 0. 99 0. 88 Matinspector) HNF3B01NNNTRTTTRYTYaaacaAAAAcaa9. 407093-1207085089 HNF3B01 NNNTRTTTRYTY aaacaAAAAcaa 9. 407093-1196 0. 85 0. 89 HNF3B01 NNNTRTTTRYTY aaacaAAAAcaa 9. 407093-1190085 089 HFH201NAWTGTTTRTTTaaaacAATAaaa28. 165126-1185090085 TATA C 1 i 1 TATA~C NCTATAAAAR acAATAAAAa8. 111772-1182 0. 89 0. 93

Filtration Site Consensus Séquence score Z Position/TSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice VMYB01 AAYAACGGNN ctcTGTTtct 3. 427439-1171 0. 82 0. 85 VMYB 01-1171 0. 82 0. 85 VMYB01AAYAACGGNNagaAACAgac3. 427439-10680. 820. 86 LM02COM~01 SNNCAGGTGNNN acaCAGTtgaat 1. 242813-1060 080 0. 87 MYODQ6NNCANCTGNYcacaGTTGaa-0. 147777-1059087089 -1059 0-87 D. 89 OCT106CWNAWTKWSATRYNcacagttgaATGAa8. 438364-1059083086 VMYB~02 NSYAACGGN acAGTTgaa 0. 465812-1058 0. 82 088 GATACNGATAAGNMNNaGATAGatcgg1. 411097-1038089090 CEBPB~01 RNRTKNNGMAAKNN gggtggaGAAAgag 1. 460836-1022 0. 99 0. 93 LM02COM01 SNNCAGGTGNNN atgcaTCTGcaa1. 242813-973 0. 82 091 MYODQ6 NNCANCTGNY tgCATCtgca-0. 147777972 092 0. 91 972 AP1 C NTGASTCAN cTAACTCAc 1. 430304-940 0. 86 0. 87 AP1CNTGASTCANcTAACTCAc1. 4303049400850'87 - 0. 87 PADSC NGTGGTCTCgGTGATcta 5. 230232-922 0'90 0. 89 gGTGATcta 22 CEBP~C NGWNTKNKGYAAKNNAYA tgctttgtGAAATaaacc 23615437* 8970 89 0. 89 CEBPB01 RNRTKNNGMAAKNN gctttgtGAAAtaa 1. 460836-896 0. 99 0. 95 VMYB~01AAYAACGGNN accAGTTttt3. 427439-8820'880'88 . 349950-1022 HFH2 01. 8 0. 88 HFH201NAWTGTTTRTTTcagTTTTttttt28. 16512618800'82086 CETSlP54 01CETS1P5401 NCMGGAWGYN ttttTCCAga 1. 244487872 0. 850. 86 LM02COM01SNNCAGGTGNNNagacaTCTGaga1. 2428138570'820'89 MYODQ6 NNCANCTGNY gaCATCtgag-0. 147777-856 0. 92 0. 89 SRY 02 5 89 SRY02NWWAACAAWANNactaTTGAttct 3. 860390-824 0. 81 0. 85 CDPCR3HD01NATYGATSSStattGATTct2. 34995018220'890'93 . 349950-822-0. 89 0. 93 OCT1~02 NNGAATATKCANNNN tcttaGGATattggg 8. 039815-810C 86 0. 86 GATA C GATACNGATAAGNMNN gGATATtgggc 1. 411097-0. 87 0. 86 USFQ6GYCACGTGNCgcCACCtgat'13. 858419"-793'0. 820'89 USF C-58419-793 0. 82 3. 89 USFCNCACGTGN cCACCTga 0. 507662-792 0. 86 0. 93 USF~Q6 GYCACGTGNC ggctGGTGgc 6. 857788-684 0. 82 0. 87 CETS1P5401 NCMGGAWGYN gcAGGAgatg 1. 244487-676 0. 93 0. 88 USF~Q6 GYCACGTGNC-USFQ6GYCACGTGNC ggCACAggat 6. 857788-667 0. 86 0. 85 CETSlP54 01CETS1P5401NCMGGAWGYN acAGGAtaca 1. 244487-6640. 93 0. 91 GATAC NGATAAGNMNN gGATACaaaga 1. 4110971661 088 0. 89 CETS1P54 01 NCMGGAWGYN ccAGGAaatg 1. 244487"-578 0. 93 0. 92 GATA C NGATAAGNMNNaGATATgccat1. 411097552087094 OCT1~06 CWNAWTKWSATRYNgATATgccatgcat 8. 438364-551 094 085 OcTi-06 gATATgccatgcat- 8. 438364-551 0. 94

<tb>
<tb> Filtration <SEP> Site <SEP> Consensus <SEP> Séquence <SEP> score <SEP> Z <SEP> Position/TSS <SEP> (pb) <SEP> Similarité <SEP> ducore <SEP> Similarité <SEP> de <SEP> la
<tb> matrice
<tb> LM02COM01 <SEP> SNNCAGGTGNNN <SEP> atgCATGtgtcc <SEP> 1.242813 <SEP> -539 <SEP> 0.82 <SEP> 0.89
<tb> USF~Q6 <SEP> GYCACGTGNC <SEP> tgcaTGTGtc <SEP> 6. <SEP> 857788 <SEP> -538 <SEP> 0.86 <SEP> 0.86
<tb> USF~C <SEP> NCACGTGN <SEP> gcATGTGt <SEP> 0. <SEP> 507662 <SEP> -537 <SEP> 0.88 <SEP> 0.93
<tb> "SFCNCACGTGN <SEP> gCATGTgt"0. <SEP> 507662-537082085
<tb> OCT1~06 <SEP> CWNAWTKWSATRYN <SEP> attaattaaATTTa <SEP> 8. <SEP> 438364 <SEP> -512 <SEP> 0.89 <SEP> 0.90
<tb> TATA~C <SEP> NCTATAAAAR <SEP> aaTTTAAAAa <SEP> 8. <SEP> 111772 <SEP> -504 <SEP> 0.93 <SEP> 0.87
<tb> MYCMAX~02 <SEP> NANCACGTGNNW <SEP> ttactTGTGgtg <SEP> 3. <SEP> 484391-488 <SEP> 090086
<tb> USF~Q6 <SEP> GYCACGTGNC <SEP> ggCACAcgcc <SEP> 6. <SEP> 857788 <SEP> -477 <SEP> 0.86 <SEP> 0.86
<tb> CETS1P54~01 <SEP> NCMGGAWGYN <SEP> tcAGGAggca <SEP> 1. <SEP> 244487 <SEP> -453 <SEP> 0.93 <SEP> 0.91
<tb> PADS~C <SEP> NGTGGTCTC <SEP> aGTGATttc <SEP> 5. <SEP> 230232 <SEP> -404 <SEP> 0.90 <SEP> 0.91
<tb> CETS1P54~01 <SEP> NCMGGAWGYN <SEP> gattTCCAgg <SEP> 1. <SEP> 244487 <SEP> -401 <SEP> 0.85 <SEP> 0.89
<tb> CAAT~01 <SEP> NNNRRCCAATSA <SEP> gtgagCCACtct <SEP> 3. <SEP> 434507 <SEP> -377 <SEP> 0.83 <SEP> 0.85
<tb> NFY~Q6 <SEP> TRRCCAATSRN <SEP> gagCCACtctc <SEP> 5. <SEP> 187369-375 <SEP> (0'85
<tb> TATA~C <SEP> NCTATAAAAR <SEP> ttTTTAAAAa <SEP> 16. <SEP> 345002-350 <SEP> 0. <SEP> 93 <SEP> 0. <SEP> 88
<tb> TATA~C <SEP> NCTATAAAAR <SEP> tTTTTAAAaa <SEP> 16. <SEP> 345002 <SEP> -350 <SEP> 0.93 <SEP> 0.88
<tb> AP2~Q6 <SEP> MKCCCSCNGGCG <SEP> gtccttGGGGag <SEP> 12. <SEP> 284970-337 <SEP> 0. <SEP> 98 <SEP> 0. <SEP> 85
<tb> CETS1P54~01 <SEP> NCMGGAWGYN <SEP> acAGGAatgt <SEP> 1. <SEP> 244487 <SEP> -320 <SEP> 0.93 <SEP> 0.85
<tb> OCT1~06 <SEP> CWNAWTKWSATRYN <SEP> gCCATttcaagatg <SEP> 8. <SEP> 438364 <SEP> -294 <SEP> 0.83 <SEP> 0.86
<tb> CEBPB01 <SEP> RNRTKNNGMAAKNN <SEP> ccaTTTCaagatgt <SEP> 1. <SEP> 460836 <SEP> -293 <SEP> 0.99 <SEP> 0.92
<tb> E47~01 <SEP> NSNGCAGGTGKNCNN <SEP> ctcACAGgtgacccg <SEP> 9. <SEP> 748242 <SEP> -276 <SEP> 0.83 <SEP> 0.85
<tb> USF~Q6 <SEP> GYCACGTGNC <SEP> ctCACAggtg <SEP> 6. <SEP> 857788-276086086
<tb> USF~Q6 <SEP> GYCACGTGNC <SEP> cacaGGTGac <SEP> 13. <SEP> 858419 <SEP> -274 <SEP> 0.82 <SEP> 0.89
<tb> USF~C <SEP> NCACGTGN <SEP> acAGGTGa <SEP> 0. <SEP> 507662 <SEP> -273 <SEP> 0.86 <SEP> 0.92
<tb> ARP101TGACCYTTGANCCYWtgacccGTTGtccccc123. <SEP> 9798551268083087
<tb> CETS1P54~01 <SEP> NCMGGAWGYN <SEP> gcAGGAatcc <SEP> 1. <SEP> 244487 <SEP> -217 <SEP> 0.93 <SEP> 0.88
<tb> CETS1P54~01 <SEP> NCMGGAWGYN <SEP> ggaaTCCTgt <SEP> 1. <SEP> 244487 <SEP> -214 <SEP> 0.93 <SEP> 0.88
<tb> VMYB01AAYAACGGNN <SEP> tccTGTTgtc <SEP> 3. <SEP> 427439-210 <SEP> 082 <SEP> 0. <SEP> 86
<tb> CEBPB~01 <SEP> RNRTKNNGMAAKNN <SEP> cctttaaGAAAccc <SEP> 1. <SEP> 460836 <SEP> -200 <SEP> 0.99 <SEP> 0.89
<tb> USF~C <SEP> NCACGTGN <SEP> gcAGGTGc <SEP> 0. <SEP> 507662 <SEP> -130 <SEP> 0.86 <SEP> 0.92
<tb> GATA~C <SEP> NGATAAGNMNN <SEP> gtgcaATATCc <SEP> 1. <SEP> 411097 <SEP> -126 <SEP> 0.87 <SEP> 0.89
<tb> OCT1 <SEP> 02 <SEP> NNGAATATKCANNNN <SEP> tgcaatATCCaatag <SEP> 8. <SEP> 039815-125086092
<tb> NFKB~C <SEP> NGGGACTTTCCA <SEP> gagaaaATCCCc <SEP> 42. <SEP> 843021 <SEP> 43 <SEP> 0.93 <SEP> 0.86
<tb> NFKAPPAB~01 <SEP> GGGAMTTYCC <SEP> gaaaatCCCC <SEP> 10. <SEP> 361187 <SEP> 45 <SEP> 0.90 <SEP> 0.86
<tb> CETS1P5401NCMGGAWGYNccTGGAgatc1. <SEP> 24448774085085
<tb>

Filtration Site Consensus Séquence score Z PositionlTSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice RFX101 NNGTNRCNNRGYAACNN acgTTCCctgataattt 7. 172878 117 0. 88 0. 85 CETS1P5401 NCMGGAWGYN gggtTCCAgg1. 244487135 0. 85 0. 86 USF C. 244487 1-35 Ô. 85 0. 86 USFCNCACGTGN ccAGGTGc 0. 5076621400'86 0. 92 CEBPB 01 0. 92 CEBPB01RNRTKNNGMAAKNN gagtgtgGGAAaaa1. 460836 181 0. 87 0. 88 LM02COM 01LMO2COM~01 SNNCAGGTGNNN ggtcaTCTGgtc 1. 242813 216 0. 82 0. 88 MYOD~Q6 NNCANCTGNY gtCATCtggt-0. 147777 217 0. 92 0. 93 CETS-) NCMGGAWGYN caccTCCAgt1. 244487 2530'850. 91 USFQ6GYCACGTGNCctccAGTGtc6. 8577882560'860'86 CEBPB01RNRTKNNGMAAKNNcacTTTCcaaatga1. 4608362670990'93 SRF Q6. 99 Ô. 93 SRFQ6 GNCCAWATAWGGMN ttCCAAatgaggcc 30. 107806 2710'970'91 GC~01 NRGGGGCGGGGCNK acccccCACCcccc 35. 805311 289 0'87 0. 91 SP1~Q6 NGGGGGCGGGGYN cccccCACCcccc 25529462 290 0. 82 0. 92 OCT106 CWNAWTKWSATRYNcAAATttcacttta 8. 438364 309 0. 89 0. 85 CEBP13 OÎ-RNRTKi-NGMAAKN-N --jCEBPB 01RNRTKNNGMAAKNNactttatGAAAgaa 1. 460836 317 0. 99 0. 94 OCT105MKNATTTGCATAYYccaatttCCATgta49. 3649423530'850'86 CEBPB01RNRTKNNGMAAKNNcagTTTCcctatcg1. 4608364050990'87 --i. 46 (0) 8-3r, 405 0. 99 0. 87 GATA~C NGATAAGNMNN tttccCTATCg 1. 411097 408 0. 89 0. 93 GATAC NGATAAGNMNN tatcgGTATCa 1. 411097 4 4 0. 88 0. 89 USFQ6GYCACGTGNCgcCACAggca6. 8577884330860'85 AP2~Q6 MKCCCSCNGGCGttccggGGGGaa 12. 284970 448 0. 980. 85 OCT106CWNAWTKWSATRYNgAAATaaaataacg8. 4383644570'890'86 CEBPB01 RNRTKNNGMAAKNN aaataacGAAAtca 1. 460836 463 0. 99 0. 91 GAAAtca. 99 AP2 Q6 MKCCCSC 5-91AP2Q6MKCCCSCNGGCGctccggAGGGcg12. 2849705460'8601 RFX102NNGTNRCNNNRGYAACNNtggTTTCcttgggagcgt7. 174515574cT880'89 RFX101 NNGTNRCNNRGYAACNN tggTTTCcttgggagcg 7. 172878 5740. 88 0. 88 LM02COM 01 0. 88 LM02COM01SNNCAGGTGNNN ggcCAGCtgcaa 1. 242813 640 0. 88 0. 94 LM02COM01 SNNCAGGTGNNN ggccaGCTGcaa 1. 242813 640 0. 880. 91 MYOD Q6. 91 MYOD~Q6 NNCANCTGNY gccaGCTGca 1. 709898 641 0. 92 0. 97 MYOD Q6 MYOD~Q6 NNCANCTGNY gcCAGCtgca1. 709898641 0. 92 0. 90 AP1CNTGASTCANaTGACACAg1. 4303046M0'8605 USF Q6 GYCACGTGNC ctCACCgggg 6. 857788 670 0. 82 0. 85 USF Q6 GYCACGTGNC gcCACCtggg 13. 858419 680 0. 82 0. 89 USFC NCACGTGN cCACCTgg 0. 507662 681 0. 86 0. 92 RFX1~02 NNGTNRCNNNRGYAACNN ctggggcgaacGGAAccg 7. 174515 685 0. 88 0. 89

Filtration Site Consensus Séquence score Z PositionlTSS (pb) Similarité ducore Similarité de la matrice AP2~Q6 MKCCCSCNGGCG agCCCCgagccc 12. 284970 734 0. 98 0. 85 OCT1~Q6NNNNATGCAAATNANaagaatgcAAACagg11. 430842 7810. 800. 88 HNF3B 01 0. 80 0. 88 HNF3B01NNNTRTTTRYTY atgcaAACAggg 2. 929849 785 0. 99 0. 92 0 0 2 0. 99 0. 92 CETS1P5401NCMGGAWGYN gtctTCCAga 1. 244487 796 0. 85 0. 89 --Ï. 3-49950 CDPCR3HD01 NATYGATSSS ttCATCgata2. 349950 8140. 93 0. 93 CDPCR3HD01NATYGATSSScatcGATAgc 34995086CUM0'95 GATA C NGATAAGNMNN cG-ATAGccctt-8'q CETSiPS4 01 1. 411097 819 0. 89 0. 88 CETS1P5401NCMGGAWGYNccctTCCAgc1. 2444878250850'89 y y 825 0. 85 0. 89 H T T T HNF3B01NNNTRTTTRYTY cctTGTTtgccg 2. 929849 907 0. 99 0. 88 CETS1P5401NCMGGAWGYNtttgTCCTgt1. 24448710270'93 (U ! 6 TSIPU 0 CM W y 907 0 LCETSIPS4 ~olL N-GGA-G N 1. 99 CMGGAWGYN tttgTCTgt--1. 2444-87 1027 0 . 93

Tableau 3

Promoter Site TranscriptionFactor CooeSimitan MatnxSimitanty Zscore Pasiti OtVTSS (bp) motifconsensus A GFt-01 1, 00 0. 88 4, 43-569GCCACTATAATCGGAGCTCTAGA NNNNNNMTCNNGNNNNNNW A GFI-01 0, 88 5 xgtionnSS (bp) mouf consensus --LOO- 4, 43-569 GCCACTATAATCGGAGACTCTAGA NNNNNNAAAT 0 88"4, 4w3 B HNF3B 03 0, 99 0, 85 4, 37-547G. ATGTTGGCCCNNrTRmRYÏY ABCA7 C CEBP 01 0, 87 0, 85 2, 13-498CGTTCGTGG4ATG4 RNRTKNNGM\AKNN Human D CEBP01 0, 87 0, 85 2, 13-469 ATCrAGTGGACCC RNF ? n < NNGM4AKW E NF1Q6 1, 00 0, 86 2, 00-402GCCTGGCCAGCCCCGGGG NGGCNNNNNCCNNN F AP4Q5 1, 00 0. 90 1, 68-340TGCAGCCGGTNNCGCTGNN G NFKAPfB01 1. 00 0. 90 9, 96-260GGGCCTGCCGGGMnYCC H NFYQ6 1, 00 0. 89 2, 00-106CGCCCMTAGCTRRCCAATSRN H-260 333'TGOC NFY Q6 1, 00 0, 89 2 ÔO-106 1, 00 TiUTS5F A GF)-01 1, 00 0. 88 2. 96-842'n'GCCTACAATCCAGGCACTA'n' NNNTC < \NNGNNNMNN B HNF3603 0, 99 0, 85 3, 25-825AACTATTGTTCNNr'RrTTRYTY -- FINF3B 03-. 2199 0, 85 3, 25-825 AACTATTGATTC / ! tBCA7 C CEBPJ31 0. 99 0. 94 1, 72-787 TG4TTCTGAMTTG RNRTKNNGM4AKNN Meuse D CEBP 01 1, 00 0, 91 1, 72-760 3 RNRTIBAKNN E-760 ATGRTGCTAAAATG 1. 00 Q88 Z61-688 E NF1Q6 1, 00 0, 88 2, 61-688TTCTGGCrGGrGGrGGCGGA NGGChMMtCCNW F AP4Q5 1, 00 0. 93 2.

* 03-386CACAGCAGTGWCGCTGNN G NFKAPRAB 01 1, 00 0, 88 11, 12-301GGGAGCTGCCGGGCMTïYCC 1 m NFY QB 1, 00 0, 89 GGGWIIYCC 1 H NFYQ6 1, 00 0, 89 5. 63-156CCToeATGGCTRROCMTSRN

Tableau 4

Olisonucleotides specifiques du 2ène ABC-A7 humain.

Nom <SEP> Séquence <SEP> (5'-3') <SEP> Orientation
<tb> ABCA7~U2 <SEP> CTTCAGCCCGACCGTTG <SEP> Sense
<tb> ABCA7 <SEP> AJ <SEP> AGAATTTCATGTATCGCC <SEP> Sense
<tb> AB <SEP> CA <SEP> 7 <SEP> L2 <SEP> CGATGGCAGTGGCTTGTTTGG <SEP> Antìsense
<tb> ABCA7~L1 <SEP> GCGGAAAGCAGGTGTTGTTCAC <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~AL <SEP> CTGGAGTTGCTGTCAGAG <SEP> Sense
<tb> ABCA7AK'GGGTAAAAGGTGTATCTGG <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~AN <SEP> TCACGAGGACCAATAAGATC <SEP> Sense
<tb> ABCA7~AM <SEP> TGTCAGTGTCACGGAGTAG <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~AP <SEP> CCTGGAAGCTGTGTGC <SEP> Sense
<tb> ABCA7 <SEP> AO <SEP> ACGGAGACGCCAGGAC <SEP> Antisense
<tb> AB <SEP> CA <SEP> 7 <SEP> AR <SEP> GTCCTGGCGTCTCCGTTC <SEP> Sense
<tb> ABCA7~AQ <SEP> CTCGTCCAGGATAACAAC <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~AT <SEP> GTGCTGCCCTACACGG <SEP> Sense
<tb> AB <SEP> CA <SEP> 7 <SEP> AS <SEP> CAGTGCCCAGCCCTGTAC <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~AV <SEP> ACCCCAGAGTCTCCATCC <SEP> Sense
<tb> AB <SEP> CA <SEP> 7 <SEP> AU <SEP> GAGAAGCCTCCGTATCTGAC <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~AX <SEP> CTGCTCTCCTGCTGTTGC <SEP> Sense
<tb> ABCA7 <SEP> AW <SEP> GCACCATGTCAATGAGCC <SEP> Antisense
<tb> ABCA7AZ <SEP> CCTCAGCATGGGATACTG <SEP> Sense
<tb> ABCA7~AY <SEP> GCTTGCGTTTGTTCCCTC <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~BA <SEP> ACCACGGCTTCTCTCC <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~Q <SEP> AGCCAGCAACGCAATCCTCC <SEP> Sense
<tb> ABCA7~R <SEP> CGCACCATGTCAATGAGCCC <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~L3 <SEP> TGAAGACGTGCGGTGCG <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~L4 <SEP> TGTCTCCGGCGATACATGAAATTC <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~L5 <SEP> ACCTCAGACCCAGACCCTTACGC <SEP> Antisense
<tb> ABCA7~U4 <SEP> GGAATGAGGTTCAGAAAGGG <SEP> Sense
<tb> ABCA7~U5 <SEP> ATGCAAGTTCCCTGGGAGTTAG <SEP> Sense
<tb> ABCA7~U6 <SEP> CTCCTTCCGGTGAATGTTGACG <SEP> Sense
<tb>

Claims

REVENDICATIONS

1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO1-5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

2. Acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon la revendication 1.

3. Acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2.

4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, capable de moduler la transcription d'un polynucléotide placé sous son contrôle.

5. Acide nucléique selon la revendication 4, comprenant un polynucléotide allant du nucléotide en position-1 au nucléotide en position-1111 par rapport au premier nucléotide transcrit, localisé en position 1112 de la séquence nucléotidique SEQ ID Nol.

6. Acide nucléique selon la revendication 4, capable d'activer la transcription d'un polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.

7. Acide nucléique selon la revendication 4, capable d'inhiber la transcription d'un polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.

8. Acide nucléique comprenant : a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7 ; et b) un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt.

9. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'acide nucléique d'intérêt est un oligonucléotide de type sens ou antisens.

10. Vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.

11. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 10.

12. Mammifère transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou les cellules germinales ont été transformées par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 10.

13. Procédé pour le criblage d'une substance ou d'une molécule modulant la transcription du polynucléotide constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mettre en culture une cellule hôte transformée selon la revendication 11 ; b) incuber la cellule hôte transformée en présence de la substance ou molécule candidate ; c) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt ; d) comparer les résultats de détection obtenus à l'étape c) avec les résultats de détection obtenus par mise en culture de la cellule hôte transformée en l'absence de la molécule ou substance candidate.

14. Kit ou nécessaire pour le criblage in vitro d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polypeptide d'intérêt codé par un polynucléotide constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, comprenant : a) une cellule hôte transformée selon la revendication 11 : b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection de la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8.

15. Procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule modulant la transcription d'un polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) administrer la substance ou molécule candidate à un mammifère transgénique non humain selon la revendication 12 ;

b) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt chez le mammifère transgénique tel que traité à l'étape a) ; c) comparer les résultats de détection de l'étape b) aux résultats observés chez un mammifère transgénique non humain selon la revendication 12 n'ayant pas reçu l'administration de la substance ou molécule candidate.

16. Kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, comprenant : a) un mammifère transgénique non humain selon la revendication 12 ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection de la transcription dudit polynucléotide d'intérêt.

17. Procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant les étapes suivantes : a) extraire l'ARN messager total à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester ; b) quantifier l'ARN messager de ABCA7 présent dans ledit matériel biologique :

c) comparer la quantité d'ARN messager de ABCA7 obtenue à l'étape b) avec la quantité d'ARN messager de ABCA7 attendue chez un sujet normal.

18. Procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant les étapes suivantes : a) séquencer, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, un polynucléotide localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7 ; b) aligner la séquence nucléotidique obtenue en a) avec la séquence SEQ ID N'l ; c) déterminer les différences nucléotidiques entre le polynucléotide séquencé provenant du matériel biologique du sujet à tester et la séquence SEO ID N 1 de référence.

19. Kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant une ou plusieurs sondes hybridant avec une région de la séquence SEQ ID ? : 1 ou de la séquence SEO ID ? : 2 pour la quantification de l'ARN messager de ABCA7 dans un matériel biologique provenant dudit sujet à tester.

20. Kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant une ou plusieurs amorces de séquençage capables de s'hybrider avec une région de la séquence SEQ ID ? : 1 pour le séquençage d'un polynucléotide localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7 chez le sujet à tester.

21. Procédé de criblage d'une molécule ou substance modulant la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, comprenant les étapes suivantes : a) incuber un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou un vecteur recombinant selon la revendication 10 avec une molécule ou substance candidate à tester ; b) détecter le complexe formé entre la molécule ou substance candidate et la molécule ou la substance candidate.

22. Kit ou nécessaire pour le criblage d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8 comprenant :

a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou un vecteur recombinant selon la revendication 10 ; b) le cas échéant, un réactif pour la détection des complexes formés.