CA2426294A1

CA2426294A1 - Acide nucleique regulateur du gene abca7, molecules modulant son activite et applications therapeutiques

Info

Publication number: CA2426294A1
Application number: CA002426294A
Authority: CA
Inventors: Patrice Denefle; Marie-Francoise Rosier; Catherine Prades; Isabelle Arnould-Reguigne; Jose Osorio Y Fortea; Nicolas Duverger; Giovanna Chimini
Original assignee: Individual
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Aventis Pharma SA
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2001-10-17
Publication date: 2002-05-02
Also published as: EP1334186A2; WO2002034903A2; WO2002034903A3; AU2002210661A1; JP2004512045A

Abstract

La présente invention concerne un acide nucléique capable de réguler la transcription de gène ABCA7, qui code pour une protéine transporteur susceptible de jouer un rôle dans le métabolisme des lipides et/ou dans les processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation. Par ailleurs, de par la position du gène sur le chromosome 19 en q13, ABCA7 est potentiellement impliqué dans d'autres pathologies liées génétiquement à ce locus. La présente invention est également relative à des constructions nucléotidiques comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène ABCA7. L'invention a également trait à des vecteurs recombinants, des cellules hôtes transformées et des mammifères transgénique s non humains comprenant un acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 ou une construction nucléotidique précitée, ainsi que des procédé s pour le criblage de molécules ou de substances capables de moduler l'activit é de l'acide nucléique régulateur de gène ABCA7.

Description

SON ACTIVITE ET APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
La présente invention concerne un acide nucléique capable de réguler la s transcription du gène ABCA7, qui est un gène susceptible d'intervenir dans le métabolisme des lipides au niveau des tissus hématopoïétiques, ainsi que dans les mécanismes de signalisation cellulaire fiés à la réaction immunitaire et à
l'inflammation.
La présente invention décrit aussi des polypeptides et des polynucléotides dont une altération de la séquence ou de l'expression est potentiellement impliquée ~o dans des maladies associées au locus génétique q13 du chromosome 19.
La présente invention est également relative à des constructions nucléotidiques comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ou produisant un acide nucléique d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène humain ou murin ABCA7.
?s L'invention a également trait à des vecteurs recombinants, des cellules hôtes transformées, et des mammifères transgéniques non humains, comprenant un acide nucléiqüé régulateur de la transcription du gène ABCA7 humain et de souris ou une construction nucléotidique précitée, ainsi que des procédés pour le criblage de molécules ou de substances capables de moduler l'activité de l'acide nucléique ao régulateur du gène ABCA7.
L'invention est en outre relative à des procédés permettant de détecter une altération de la transcription du gène ABCA7 et ainsi de diagnostiquer un éventuel dysfonctionnement dans le métabolisme lipidique au niveau des tissus hématopoïétiques et dans tes mécanismes de signalisation cellulaire de l'immunité.
2s Elle a également pour objet des substances ou molécules modulant l'activité
de l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 ainsi que des compositions pharmaceutiques contenant de telles substances ou de telles molécules.
Les protéines transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) constituent une superfamille extrêmement conservées au cours de l'évolution, de la bactérie à
30 l'homme. Ces protéines sont impliquées dans le transport membranaire de divers substrats, par exemple des ions, des acides aminés, des peptides, des sucres, des vitamines ou encore des hormones stéroïdiennes (Higgins et al., Annu Rev.Cell Biol, 8, (1992) 67-113).

2 La caractérisation de la séquence complète en acides aminés de certains transporteurs ABC a permis de définir une structure générale commune, comprenant notamment, deux repliements de liaison aux nucléotides (Nucleotide Binding Fold ou NBF) avec des motifs de type Walker A et B, ainsi que deux domaines s transmembranaires, chacun des domaines transmembranaires étant constitué de six hélices (Klein et al., BBA, 1461 (1999), 237-262). La spécificité des transporteurs ABC
pour les différentes molécules transportées semble être déterminée par la structure des domaines transmembranaires, alors que l'énergie nécessaire à l'activité de transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du repliement NBF (Dean et al., io Curr.Opin.Genet.Dev, 5 (1995) 779-785).
Plusieurs protéines transporteurs ABC ont été identifiëes chez l'homme et un certain nombre d'entre elles ont été associées à diverses maladies.
Par exemple, la mucoviscidose est provoquée par des mutations dans le gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), également désigné
is ABCC7.
Par ailleurs, certains phénotypes de résistance multiple aux médicaments dans les cellules tumorales ont été associés à dés mutatioris dans les gènes codant ' ~.-des protéines MDR (multi-drug resistance) également désignés ABCB, qui ont également une structure de transporteur ABC.
2o D'autres transporteurs ABC ont été associés à des affections neuronales et tumorales (brevet US N°5,858,719) ou sont encore potentiellement impliqués dans des maladies provoquées par une altération de l'homéostasie des métaux, notamment la protéine ABC-3.
De même, un autre ABC transporteur, désigné PFIC2 ou ABCB11, semble 2s être impliqué dans une forme de cholestasie intrahépatique familiale progressive, cette protéine étant potentiellement responsable, chez l'homme, de l'exportation des sels biliaires.
Une sous-famille A des transporteurs ABC désignée ABCA a été également identifiée. Elle se caractérise par la présence d'un segment hautement hydrophobe 30 (HH1 : highly hydrophobic) entre les deux domaines transmembranaires, liés aux deux motifs NBF (Broccardo et al., BBA 1461 (1999) 395-404). Quatre membres de cette sous famille ont été jusqu'à présent caractérisés. II s'agit des transporteurs ABCA1 et ABCA2, tous deux localisés sur le chromosome 9, respectivement aux locus 9q22-9q31

3 PCT/FRO1/03219 et 9q34, ainsi que le transporteur ABCA3 localisé sur le chromosome 16p13.3, et enfin le transporteur ABCA4 ou ABCR localisé sur le chromosome 1 p22 (Broccardo et al., 1999). Les membres de cette sous famille sont également fortement conservés au cours de l'évolution des eucaryotes multicellulaires. A titre d'exemples les transporteurs s ABCA1 et ABCA4 qui sont les mieux connus présentent une identité
respectivement de 95% et de 88% avec leurs orthologues murins. Les membres de cette sous famille sont en outre fortement apparentés, puisque par exemple les transporteurs ABCA1 et ABCA4 présentent une identité de séquence protéique de 50.9%, ainsi qu'une organisation génomique très similaire (Allikmets et al., Nat. Genet. (1997) 15, 236-Io 246 ; Broccardo et al., Biochim. Biophys. Acta (1999) 1461, 395-404 ;
Luciani et al., Genomics (1994) 21(1), 150-9 ; Remaley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1999) 96(22), 12685-90).
Par ailleurs, les membres de la sous-famille A semblent présenter une spécialisation fonctionnelle similaire au niveau du transport des lipides et des is phospholipides membranaires. II a en effet été montré que la perte de la fonction de ces transporteurs affecte le renouvellement des phospholipides dé la bicouche des mémbranes cellulaires. Dans le câs de ABCA4, on constate dans un premier temps un renouvellement anormal des phosphatidyléthanolamine (PE) dans la partie externe de la membrane des cellules à bâtonnets, qui conduit par une succession d'évènements, à
2o une perte totale de l'acuitë visuelle (Weng et al., Cell (1999) 98(1 ), 13-23. Dans le cas de ABCA1, on constate une distribution anormale des phospholipides membranaires au sein des couches de la membrane plasmique, qui résulte plus précisément en la présence en plus grande quantité de phosphatidylsérine dans la couche externe, et en une perturbation de la concentration de Ca2+.
2s Les transporteurs ABCA1 et ABCA4 ont été particulièrement étudiés. Le gène ABCA1 semble en effet être impliqué dans les pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme du cholestérol induisant des maladies comme l'athérosclérose, ou des déficiences familiales en HDL (FHD). comme la maladie de Tangier (FR 99/7684000 ; Rust et al., Nat.Genet., 22 (1999) 352-355; Brooks-Wilson et 3o al., Nat. Genet., 22 (1999) 336-345; Bodzioch et al., Nat.Genet. 22 (1999) 347-351 ;
Orso et al., Nat.Genet, 24 (2000) 192-196). La maladie de Tangier semblerait être liée à un déficit cellulaire dans la translocation du cholestérol cellulaire qui entraîne une dégradation des HDLs, et par là même une perturbation du métabolisme lipoprotéique.

4 Ainsi, il semblerait que les particules HDL qui n'incorporent pas de cholestérol à partir des cellules périphériques, ne sont pas métabolisées correctement, mais sont au contraire éliminées rapidement de l'organisme. La concentration plasmatique en HDL
de ces patients est donc extrêmement réduite et les HDLs n'assurent plus le retour du s cholestérol vers le foie. Ce cholestérol s'accumule dans ces cellules périphériques et provoque des manifestations cliniques caractéristiques telles que la formation d'amygdales orangées. De plus, d'autres perturbations lipoprotéiques comme une surproduction de triglycérides ainsi qu'une synthèse et un catabolisme intracellulaire accrus des phospholipides sont observées.
io Le transporteur ABCA4 a par ailleurs été associé aux maladies dégénératives et inflammatoires occulaires telles que la maladie récessive de Stargardt (Allikmets et al., 1997) et la dégénérescence de la région maculaire de la rétine liée à
l'âge (AMD) (Alükmets et al., Nat.Genet. 15 (1997) 236-246 ; Allikmets et al., Science, 277 (1997) 1805-1807 ; Cremers et al., Hum. Mol. Genet. (1998), 7(3), 355-62 ; Martinez-Mir et al., ~s Nat. Genet. 18 (i998) 11-12; Weng et al., Cell (1999) 98(1), 13-23).
Chez l'homme, un ADNc comprenant la totalité de la phase de lecture ouverte d'un nouveau mërnbre de la sous famille A des trânsporteurs ABC (« ATP-Binding Cassette») a été récemment cloné à partir d'ARN de macrophages humains, et est désigné ABCA7 (Kaminski et al., BBR, 273(2000), 532-538).
ao La caractérisation de la séquence complète en acides aminés de ABCA7 indique que le produit protëique présente la structure générale caractéristique des transporteurs ABCA, en ce qu'elle comporte la structure symétrique comprenant les deux domaines transmembranaires et deux motifs NBF. En plus de ces motifs caractéristiques, la protéine ABCA7 présente d'autres motifs qui ont été
récemment 7G i/'i~Yififint~ n~mm~, n+"r.+ ~........t.'...:mt~..__ _~__ ~____ . m..~.. .
. . _ Par ailleurs, la protéine transporteur ABCA7 semble présenter un profil de régulation dépendant des flux de stérol, similaire à celui des autres membres de la sous famille A, et notamment du transporteur ABCA1 (Langman et al., BBR Com ;
257(1999), 29-33 ; Laucken et al., PNAS, 97(2000) 817-822). 1h a été en effet observé
s par Kaminski et ai. (supra) une augmentation de l'expression de ABCA7 après incubation des macrophages humains en présence de lipoprotéines de faible densité
acétylées (AcLDL) qui induisent une charge de stérol, ainsi qu'une diminution de l'expression en présence de l'accepteur de cholestérol HDL3 qui provoque une diminution de la charge en stérol.
io D'autre part, ABCA7 présente comme les autres membres ABCA une certaine spécialisation de son expression tissulaire, le messager de ABCA7 étant présent de manière prédominante dans les tissus hématopoïétiques constitués par les lymphocytes, les granulocytes, le thymus, la rate, la moelle osseuse, ou les tissus foetaux, alors que l'expression de ABCA1 est prédominante dans les macrophages et is le placenta, et que celle de ABCA4 est restreinte dans la rétine (Rust et al., Nat. Genet, 22, (1999) 352-355).
L'ensembles des dorïnées précédemment exposées relatives à l'identité des séquences protéiques, au mécanisme de régulation et la spécificité de l'expression suggère que le gène ABCA7 constitue un autre transporteur de la sous famille A, et 2o que celui-ci présente une fonction similaire ou même redondante à celle des autres transporteurs et notamment à celle du transporteur ABCA1. Ce transporteur interviendrait donc vraisemblablement en tant que médiateur dans le métabolisme des lipides, et il est très possible qu'il soit, au même titre que le transporteur ABCA1, responsable de certains dysfonctionnements ou déficiences métaboliques. Par ailleurs, 2s la spécialisation de l'expression du transporteur ABCA7 indique vraisemblablement que ce dernier joue un rôle dans le transport transmembranaire (export) des lipides dans les tissus hématopoïétiques, et possiblement dans les mécanismes de signalisation lymphocytaires de l'immunité, par exemple dans le cas de la pathogenèse de l'athérosclérose comme l'indiquent Kaminski et al. (Supra).
3o Bien que l'expression du gène ABCA7 humain semble être régulée selon le type de cellule ou encore la situation métabolique d'un type cellulaire donné, la ou les séquences permettant de réguler ce gène n'étaient pas connues.

Or, il existe un besoin dans l'état de la technique d'identifier ces séquences régulatrices pour les raisons suivantes:
a) Ces séquences sont susceptibles d'être mutées chez des patients atteints d'une pathologie liée à un déficit dans le transport des lipides, possibles substrats de la s protéine ABCA7 ou chez les patients susceptibles de développer de telles pathologies.
La caractérisation des séquences régulatrices du gène ABCA7 humain permettrait de détecter des mutations chez des patients, en particulier de diagnostiquer les individus appartenant à des groupes familiaux à risques. En outre, l'isolement de ces séquences régulatrices rendrait possible la complémentation de la séquence mutée 1o par une séquence fonctionnelle susceptible de pallier les dysfonctionnements métaboliques induits par ta ou les mutations diagnostiquées, grâce à la construction de moyens thérapeutiques ciblés, tels que des moyens destinés à la thérapie génique.
b) La caractérisation des séquences régulatrices du gène ABCA7 mettrait à la disposition de l'homme du métier des moyens aptes à permettre la construction par is génie génétique puis l'expression de gènes déterminés dans les types cellulaires dans lesquels le gène ABCA7 est préférentiellement exprimé.
- - - - c) Par ailleurs; certainés parties des séquences régulatrices du gène pourraient constituer des séquences promotrices constitutives à fort niveau d'expression, de nature à permettre la construction de moyens nouveaux pour Zo l'expression de séquences déterminées dans les cellules, complétant un ensemble de moyens déjà existants.
Force est de constater que, malgré les efforts entrepris, les séquences régulatrices du gène ABCA7 étaient restées jusqu'à ce jour totalement inconnues.
Les inventeurs ont désormais isolé puis analysé un ADN génomique humain 2s de 33,5kb comprenant les 46 exons du cadre ouvert de lecture du gène ABCA7 ainsi que la région non transcrite d'environ 1,1 kb localisée du côté 5' de l'exon 1, en amont du~ site +1 de transcription, et comprenant des signaux de régulation du gène humain.
Les inventeurs ont également isolé puis analysé un ADN génomique marin de 30 20Kb comprenant les 45 exons du cadre ouvert de lecture du gène ABCA7 ainsi que la région non transcrite d'environ 1,2Kb chez la souris localisée du côté 5' de l'exon 1, en amont du site +1 de transcription, et comprenant des signaux de régulation du gène ABCA7 marin.

DEFINITIONS GENERALES
s Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Par exemple un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques io adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à
l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement is naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de purété absolué, éxclusive de la prësencé d'autres composés. 1¿ s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléatide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ 20 ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique "
peut être employée pour désigner indifféremment un pofynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel de génétique lui-2s même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus_ d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.
3o Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1 ) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04 064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré
comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du s premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A
et U), ou CetG.
Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucléotide de io référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagenèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de is l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'ellës n'altèrent pas les séquences d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.
Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant 2o peuvent aussi produire des substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé
par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nuclëique de référence. En outre, de telles modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la sëquence d'aminoacides.
2s De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent pour des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité
biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à
être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial.
3o Certains acides nucléiques variants coderont ainsi pour des formes mutées des polypeptides dont l'ëtude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question. La connaissance de ces variants par rapport à la maladie étudiée est fondamentale puisqu'elle permet de comprendre la cause moléculaire de la pathologie.
On entendra par " fragment " un acide nucléique de référence selon l'invention, une . séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à
l'acide s nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à l'acide nucléique de référence.
Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucléotide plus grand duquel il est constitutif.
De tels fragments comprennent, ou alternativement consistent en, des 1o oligonucléotides de longueur allant de 20 à 25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 ou 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Par " fragment biologiquement actif " d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention, on entend un acide nucléique capable de moduler la transcription d'une séquence d'ADN placée sous son contrôle. Un tel fragment biologiquement actif 1s comprend un promoteur de base etlou un élément régulateur, tels que définis dans la présente description.
Par " âcide nucléique régulateur " selon l'invention, on entend un acide nucléique qui active et/ou régule l'expression d'une séquence d'ADN
sélectionnée et placée sous son contrôle.
2o Par " promoteur ", on entend une séquence d'ADN reconnue par les protéines de la cellule impliquées dans l'initiation de la transcription d'un gène. Le promoteur de base est l'acide nucléique régulateur minimal capable d'initier la transcription d'une séquence d'ADN déterminée qui est placée sous son contrôle. En général, le promoteur de base consiste en une région d'ADN génomique en amont du site 2s d'initiation de la transcription où se trouve très souvent une séquence CHAT (où se fixe un ou plusieurs facteurs protéiques de transcription) ainsi que, sauf dans de rares cas comme dans certains gènes domestiques, la séquence TATA ou " TATA box " ou une boîte apparentée. C'est au niveau de cette boite que se fixe une ARN
polymérase ainsi qu'un ou plusieurs facteurs de transcription, tels que les protéines se fixant sur la boîte 30 " TATA " (TATA box Binding Proteins ou TBPs).
Une séquence nucléotidique est " placée sous le contrôle " d'un acide nucléique régulateur lorsque cet acide nucléique régulateur est localisé, par rapport à la séquence nucléotidique, de telle manière à contrôler l'initiation de la transcription de la séquence nucléotidique par une ARN polymérase.
Par " élément régulateur " ou " séquence régulatrice " au sens de l'invention, on entend un acide nucléique comprenant des éléments capables de moduler la s transcription initiée par un promoteur de base, tels que des sites de fixation de divers facteurs de transcription, des séquences " enhancer " d'augmentation de la transcription ou des séquences " silencer " d'inhibition de la transcription.
Par séquence " enhancer ", on entend une séquence d'ADN incluse dans un acide nucléique régulateur capable d'augmenter ou de stimuler la transcription initiée io par un promoteur de base.
Par séquence " silencer ", on entend une séquence d'ADN incluse dans un acide régulateur capable de diminuer ou d'inhiber la transcription initiée par un promoteur de base.
Des éléments régulateurs peuvent être présents en dehors de la séquence is localisée du côté 5' du site d'initiation de la transcription, par exemple dans les introns et les exons, y compris dans les séquences codantes.
Le promoteur de base et l'élément régulateur peuvent être " spécifiques d'un ou plusieurs tissus ", s'ils permettent la transcription d'une séquence d'ADN
déterminée, placée sous leur contrôle, préférentiellement dans certaines cellules (par 2o exemple les cellules spécifiques d'un tissu), c'est à dire soit exclusivement dans les cellules de certains tissus, soit à des niveaux de transcription différents selon les tissus.
Par " facteur de transcription ", on entend des protéines qui interagissent préférentiellement avec des éléments régulateurs d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, et qui stimulent ou au contraire réprïment la transcription.
Certains facteurs 2s de transcription sont actifs sous forme de monomères, d'autres étant actifs sous la forme d'homo- ou d'hétérodimères.
Le terme " modulation " vise soit une régulation positive (augmentation, stimulation) de ia transcription, soit une régulation négative (diminution, inhibition, blocage) de la transcription.
3o Le " pourcentage d'identitë " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.

La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
s Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant ie nombre de positions auquel ü y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat io par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identitë de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER
GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison, WISCONSIN.
Is Ä titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué
à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4.9 de mars 1996, BLAST 2Ø4 de février 1998 et BLAST 2Ø6 de sèptembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètrës par défaut (Altschul et al, J. Mol. Biol., (1990) 215 : 403-410 ; Altschul et al, Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402). Blast recherche des séquences 2o similaires/homologues à une séquence " requête " de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. (Supra). La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.
Par " conditions d'hybridation de forte stringence " au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes 1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION
- Mélanger : 40N1 ADN sperme de saumon (l0mg/ml) + 40 p1 ADN placentaire humain (l0mg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace le mélange.

- Oter le tampon SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.
s - Incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde marguée io - Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 p1 ADN Cot I, selon la quantité
d'hybridations non spécifiques.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95°C.
is - incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures.
3- Hybridâtion:
- Oter le mix de pré hybridation.
- Mélanger 40 pi ADN sperme de saumon + 40 p1 ADN placentaire humain ;
dénaturer

5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace.
- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN
2s et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation.
4- Lavages - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1 %.
- 2 fois 15 minutes SSC 0,1X et SDS 0,1% à 65°C.

Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une s longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.
II va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.
io Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) (Nucleic acid Hybridization iapractical Approach, Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de F. AUSUBEL et al (1999) (Currents Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y).
is Par "transformation " au sens de l'invention, on entend l'ïntroduction d'un acide nucléique (ou d'un vecteur recombinant) dans une cellule hôte. Le terme " transformation » engiobé également une situati4ndans laquellé le génotype d'une cellule a été modifié par un acide nucléique exogène, et que cette cellule ainsi transformée exprime ledit acide nuclëique exogëne, par exemple sous la forme d'un 2o polypeptide recombinant ou encore sous la forme d'un acide nucléique sens ou antisens.
Par " animal transgénique " au sens de l'invention, on entend un animal non humain, de préférence un mammifère, dans lequel une ou plusieurs cellules contiennent un acide nucléique hétérologue introduit grâce à l'intervention humaine, tel ~s que par des techniques de transgénèse bien connues de l'homme du métier.
L'acide nucléique hétérologue est introduit directement ou indirectement dans la cellule ou le précurseur de la cellule, par manipulation génétique telle que micro-injection ou infection par un virus recombinant. L'acide nucléique hétérologue peut être intégré
dans le chromosome, ou peut se présenter sous la forme d'ADN se répliquant de 3o manière extra-chromosomique.

A partir de banques de vecteurs de type BAC préparées à partir de matériel génomique humain et marin, les inventeurs ont réussi à isoler un acide nucléique régulateur des gènes ABCA7 humain et marin.
Les inventeurs ont déterminé par une analyse comparative des séquences s génomiques humaines et marines, un acide nucléique régulateur comprenant particulièrement deux modules de régulation conservés chez l'homme et la souris. Les inventeurs ont donc déterminé pue l'acide nucléique régulateur de la transcrïption du gène ABCA7, lorsqu'il est défini de la manière la plus large, est constitué
d'un polynucléotide comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3':
io - une région non transcrite d'environ 1,2 kb localisée en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7, et - la séquence partielle du premier exon du gène ABCA7.
Dans sa définition la plus générale, l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 comprend l'ensemble des régions nucléotidiques telles is que définies ci-dessus et est identifié dans la séquence SEQ ID N°1 selon l'invention.
Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide- ayànt au moins 20 nucléotidës consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
2o La région d'environ l,iKb localisée en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7, et comprenant le promoteur de base et de multiples éléments régulateurs de la transcription est comprise également dans la séquence identifiée comme la SEQ ID N°2 selon l'invention.
Plus précisément, le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ ID
N°2 est 2s le nucléotide en position -1111, par rapport au site d'initiation de la transcription du gène ABCA7.
Selon un second aspect, l'invention est relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 , ou un acide nucléique de séquence 3o complémentaire.
Comme déjà précisé ci-dessus, l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 de séquence SEQ ID N°1 comprend, outre une région 5' régulatrice non transcrite, également la partie 5' du premier exon du gène ABCA7 humain.

La séquence partielle du premier exon du gène ABCA7 est définie comme la séquence SEQ ID N°3.
Selon un troisième aspect, l'invention est relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de séquence s nucléotidique SEQ ID N° 3 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
De préférence, un acide nucléique selon l'invention sera sous une forme isolée et/ou purifiée.
Fait également partie de l'invention tout fragment " biologiquement actif "
d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
io Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
En particulier, cet acide nucléique peut être d'origine murine, et est constitué
d'un polynucléotide de séquence nuciéotidique SEO ID NO: 4 comprenant de is l'extrémité 5' vers 3' - une région non transcrite d'environ 1,2 Kb localisé en amont du site d'initiation de la trânscription du gène ABCä7 murin, et - la sëquence partielle du premier exon du gène ABCA7.
La région d'environ 1,2Kb localisée en amont du site d'initiation de la 2o transcription du gène ABCA7, et comprenant le promoteur de base et de multiples éléments régulateurs de la transcription est comprise également dans la séquence identifiée comme la SEQ ID NO :5 selon l'invention.
L'invention englobe également un acide nucléique caractérisé en ce qu'il hybride, dans des conditions de forte stringence, avec l'un quelconque des acides 2s nucléiques selon l'invention.
L'invention concerne aussi un acide nucléique ayant au moins 80%, avantageusement 90%, de préférence 95% et de manière tout à fait préférée 98%
d'identité en nucléotides avec un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences 3o nucléotidiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°5.
ANALYSE DETAILLEE DES SEQUENCES SEQ ID N° :2 ET SEQ ID N°
:5 Selon une caractéristique principale, l'acide nucléique de séquence SEQ ID
N°2, compris dans l'acide nucléique régulateur du gène humain ABCA7 de séquence SEQ ID N°1, comprend les éléments constitutifs d'un promoteur de base, respectivement une boîte " TATA " dégénérée (TTAAG) localisée 30pb en amont du s point d'initiation de la transcription. De même, une boite " TATA "
dégénérée (TTAAA) a été localisée 30pb en amont du point d'initiation de la transcription, sur l'acide nucléique marin de séquence SEQ ID NO : 5, compris dans l'acide nucléique régulateur du gène marin ABCA7 de séquence SEQ ID NO :4. Les boites " TATA " sur les promoteurs des gènes humain et marin ABCA7 ainsi que la position des points io d'initiation de la transcription sont représentés sur la Figure 1.
Les séquences régulatrices SEQ !D N°2 et SEQ ID N°5 comprennent également de nombreux sites de fixation de divers facteurs de transcription susceptibles de réguler positivement ou négativement l'activité du promoteur de base.
Ainsi, les différentes séquences caractéristiques des sites de fixation de divers is facteurs de transcription dans les séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID
N°5 ont été
identifiées par les inventeurs de la manière détaillée ci-après.
Les séquencès SEQ ID N°2 et SEQ ID N°5 ont été utilisées comme séquences de référence et traitées selon les algorithmes des logiciels Matlnspector (Quandt et al., Nucl Acid Res (1995) 23(23), 4878-4884) et comparées aux données 2o répertoriées dans plusieurs bases de données telles que Transfac et la présence ainsi que la localisation des différentes sites caractéristiques des séquences SEQ
ID N°2 et 5, et particulièrement les sites de liaison des facteurs de transcription ont été
déterminés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.
Plus particulièrement, une analyse détaillée a été réalisée en utilisant les 2s logiciels NNPP (Reese et al. J. Comput Biol. (1997) 4(3) 311-23), TSSG, et TSSW
(Soloryev et al., Ismb (1995), 5, 294-302), sur les 1,1 kb et l,2Kb en amont du site d'initiation respectivement des séquences SEQ ID N°2 et 5, a permis d'identifier 193 et 233 sites putatifs de liaison aux facteurs de transcription, chez l'homme et la souris lors de la première étape de la recherche. Ceux-ci sont répertoriés dans les tableaux 1 et 2.
3o Après compilation et filtrage comme décrit ci-dessus, et comparaison des séquences régulatrices humaine et marine, deux modules communs aux séquences régulatrices humaine et marine ont été déterminés, et 5 et 3 sites de fixation possibles de facteurs de transcription différents ont été retenus respectivement dans les modules 1 et 2 sur les séquences humaine et murine. La position avec les scores de filtration des sites de fixation aux facteurs de transcription identifiés dans les 1111 pb de la séquence SEQ
ID N°2 selon l'invention, ainsi que dans les 1220 pb de la séquence SEQ
ID NO : 5 selon l'invention, sont présentés dans le tableau 3. Les différents sites de fixation ont s été aussi schématiquement représentés dans la figure 1.
Les positions des nucléotides de début de chacun des sites de fixation aux facteurs de transcription sont désignées en référence à la numérotation des nucléotides des séquences SEQ ID N°2 et NO :5 par rapport au point +1 d'initiation de la transcription, contenu dans les séquences SEQ ID N°1 et N°4, telle que représentée io sur la figure 1.
La Figure 2 représente la séquence SEQ ID NO : 1, qui contient la séquence SEQ ID N°2. Le premier nucléotide en position 5' de la séquence de la Figure 2 est également le premier nucléotide en position 5' de l'une des séquences nucléiques SEQ
ID N°1 et SEQ ID N° 2. Sur la Figure 2, les sites de fixation aux facteurs de 1s transcription sont illustrés en caractères gras qui délimitent leurs positions respectives, et leurs désignations respectives sont indiquées au-dessus de chacune des boîtes correspondantes. La numérôtation des nucléotides de la séquence représentée à
la figure 2 a été effectuée par rapport au site d'initiation de la transcription, numéroté
" +1 ", le nuclëotide en 5' du nucléotide +1 étant lui-même numéroté "-1 ".
2o La Figure 3 représente la séquence SEQ ID NO : 4, qui contient la séquence SEQ ID N°5. Le premier nucléotide en position 5' de ia séquence de la figure 3 est également le premier nucléotide en position 5' de l'une des séquences nucléiques SEQ
ID N°4 et SEQ ID N° 5. Sur la figure 3, les sites de fixation aux facteurs de transcription sont illustrés en caractères gras qui dëlimitent leurs positions respectives, et leurs 2s désignations respectives sont indiquées au-dessus de chacune des boîtes correspondantes. La numérotation des nucléotides de la séquence représentée à
la figure 3 a été effectuée par rapport au site d'initiation de la transcription, numéroté
" +1 ", le nucléotide en 5' du nucléotide +1 étant lui-même numéroté "-1 ".
L'analyse génomique des acides nucléiques régulateurs des séquences 3o humaine et murine SEQ ID NO :2 et 5, a révélé deux modules de régulation qui sont notés module 1 et module 2, et sont particulièrement conservés chez l'homme et la souris. Ces deux modules de régulation comprennent des sites de fixation de facteur de transcription ubiquitaires, tels que NF1, NFY et AP4, ainsi que des sites de fixation de facteurs de transcription spécifiques du foie tels que CEBP et HNF3B. Ceci est compatible avec les données expérimentales d'expression, présentées dans l'Exemple 3 ci-après, et fournies par Kaminski et al. (Supra), qui montrent une expression du gène ABCA7 dans les tissus fcetaux hépatiques humains.
s Les deux modules de régulation conservés chez la souris et l'homme comprennent également des sites de fixation de facteurs de transcription tels que GFI1 et NFkappaB (NFkB), qui sont essentiellement présents dans les oraanes lymphatiques.
La description des caractéristiques des sites de fixation à chacun des facteurs !o de transcription désignés dans (es figures 2 et 3 ainsi que dans le tableau 3 peut être aisément retrouvée par l'homme du métier. Une courte description de certains d'entre eux en est faite ci-après.
Facteur NFi !s Les caractéristiques de fixation du facteur NF1 peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline: 88319941, 91219459, 86140112, 87237877, 90174951, 89282387, 90151633,- 892618136;
86274639, 87064414, 89263791. Le facteur NF1 reconnaît la séquence palindromique suivante: " TGGCANNNTGCCA (NNTTGGCNNNNNNNNCCNN) " qui est présente 2o dans des promoteurs viraux et cellulaires et au niveau de !'origine de réplication des adénovirus de type 2. Ces protéines sont capables d'activer la transcription et la réplication. Elles se fixent à l'ADN sous la forme d'un homodimère.
Facteur NFY
2s Le facteur NFY est notamment décrit dans l'entrée n°P25.208 de la base de données Swissprot. C'est un facteur qui reconnaît un motif " CCAAT " dans les séquences promotrices telles que celles du gène codant pour le collagène de type 1, de l'albumine et de la (3-actine. II s'agit d'un stimulateur de la transcription.
Facteur AP4:
L'homme du métier pourra se référer avantageusement aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline : 2123466, 2833704, 8530024. Le facteur AP4 a un domaine de liaison à l'ADN du type "helix loop helix" (bHLH) ainsi que deux domaines de dimérisation. Le site consensus du facteur AP4 est le suivant « CWCAGCTGGN », et celui-ci se chevauche généralement avec un site de fixation du facteur AP1.
s CEBP
Les caractéristiques de liaison au facteur CEBP peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline: 93315489, 91248826, 94193722, 93211931, 92390404, 90258863, 94088523, 90269225 et l0 96133958. II s'agit d'un activateur de la transcription important dans la régulation de gènes impliqués dans les réponses immunes et inflammatoires. II se fixe spécifiquement à un élément de réponse à IL-1 dans le gène de 1'1L-6. II joue vraisemblablement un rôle dans la régulation de la phase aiguë de l'inflammation et dans l'hémopoïése. Le site de reconnaissance consensus est le suivant: "
T(T/G) is NNGNAA(T/G) ".
Facteur HNF3B:
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à l'article de OVERDIER et al.
(1994, Mol. Cell Biol. vo1.14: 2755-2766), ainsi qu'aux entrées suivantes de la base de 2o données Medline: 91352065, 91032994, 92345837, 89160814, 91187609, 91160974, 91029477, 94301798 et 94218249. Ce facteur de transcription agit comme activateur de nombreux gènes du foie tels que des gènes AFT, de l'albumine, de la tyrosine aminotransférase et interagit avec des régions régulatrices agissant en eis de ces gènes.

Les caractéristiques de liaïson au facteur GFI1 peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline : 10762661, 9931446, 9571157, 9285685, 9070650, et 7789186. Le gène GF11 code pour une 3o protéine en doigt de zinc impliquée dans la régulation transcriptionnelle et plus particulièrement dans la voie de signalisation de l'interleukine 2. Le site de reconnaissance consensus est le suivant : « NNNNNNAAATCANNGNNNNNNN »

Facteur NFkappa_B:
L'homme du métier pourra avantageusement se rëférer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 95369245, 91204058, 94280766, 89345587, 93024383, 88248039, 94173892, 91088538, s 91239561, 91218850, 92390404, 90156535, 93377072, 92097536, 93309429, 93267517, 92037544, 914266911, 91105848 et 95073993. Le facteur NFkappa-B est un hétérodimère constitué d'une première sous-unité de 50 kDa et d'une seconde sous-unité de 65 kDa. Deux hétérodimères peuvent former un tétramère labile.
Sa fixation à l'ADN dépend de la présence de zinc (Zn++). II peut être induit par de io nombreux agents tels que le TNF, la PKA ou encore la PKC. C'est un régulateur clef de gènes impliqués dans des réponses à l'infection, à l'inflammation, ainsi qu'au stress.
Une caractéristique essentielle de l'acide nucléique régulateur selon l'invention, et plus particulièrement de la séquence localisée en amont du site d'initiation de la transcription comprise à la fois dans fa séquence SEQ ID
N°2 et dans is la séquence SEQ ID N°5 est la présence de motifs caractéristiques de sites putatifs de liaison à des facteurs de transcription impliqués dans l'expression génique des lymphocytes T, tels que les facteurs dë transcription CEBP, NFKB, et GFl1.
GF11 est un proto-oncogène qui code pour une protéine nucléaire en doigt de zinc impliquée dans la voie de signalisation par les cytokines et dans l'amplification 2o clonale des cellules T (Zweidler-McKay, et al., Mol. Cell. Biol. (1996), 16(8), 4024 4034). Le facteur de transcription GF11 qui agit comme un répresseur transcriptionnel des gènes qui inhibent l'activation des cellules T et l'oncogénèse. II est spécifiquement présent dans le thymus, la rate et les lymphocytes T.
Les facteurs de transcription CEBP et NFkappaB qui sont exprimés dans le 2s thymus, la rate et les lymphocytes T, sont bien connus de l'homme du métier et agissent en coopération dans la médiation de l'induction de l'expression des gènes des lymphocytes T (Runch et al., 1994) et des cellules HepB3 (Shimizu et al., Gene, (1994) 149, 305-310).
Les positions des nucléotides de début, par rapport au site d'initiation de la 3o transcription qui sont à -498 et -469 pour les sites CEBP , et à -260 pour le site NFkB, sur le module régulateur humain, et à -787 et -760, pour les sites CEBP, et à -301 pour le site NFKB, montrent que les deux sites de régulation sont plus éloignés dans le promoteur de souris. Toutefois, il est vraisemblable que les deux sites se rapprochent dans une structure tridimensionnelle afin de permettre la coactivation par les deux facteurs CEBP et NFkB.
La présence de ces sites potentiels de fixation au CEBP et au NFkB de manière conservée chez l'homme et la souris sur les acides nucléiques régulateurs s selon l'invention est compatible avec l'observation selon laquelle l'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 humaine est prédominante dans les tissus hématopoïétiques et les lymphocytes T, et interviendrait très probablement dans la médiation cellulaire de l'immunité, notamment dans la pathogenèse de l'athérosclérose (Kaminski et al. Supra).
io Comme déjà mentionné précédemment, l'invention concerne un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 ou 2, et SEQ ID
N°4 ou 5, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Sont englobés dans la définition ci-dessus les acides nucléiques comprenant 1s un ou plusieurs fragments " biologiquement actifs " de l'une des sëquences SEQ ID N°1 ou 2, et SEQ ID N°4 ou 5. L'homme du métier peut aisément obtenir des fragments biologiquement actifs dé ces séquences, en se référant notâmment au tableau 3 ci-dessus ainsi qu'aux figures 2 et 3 dans lesquels les différents motifs caractéristiques de la séquence régulatrice du gène ABCA7 sont présentés. L'homme du métier pourra.
2o ainsi obtenir de tels fragments biologiquement actifs par synthèse chimique totale ou partielle des polynucléotides correspondants ou encore en faisant agir des endonucléases de restriction afin d'obtenir des fragments d'ADN recherchés, les sites de restriction présents sur les séquences SEQ iD N°1 à SEQ ID
N°5 pouvant étre aisément retrouvés à partir de l'information de séquence, à l'aide de logiciels courants 2s de cartographie de restriction tel que GCG version 9.1 module map.
L'obtention de fragments d'acides nucléiques déterminés à l'aide d'endonucléases de restriction est par exemple décrite dans l'ouvrage de SAMBROOK
et al., (Molecular cloning: a laboratory manual, 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New York (1989).
3o L'invention est donc également relative à un acide nucléique te! que défini ci-dessus, capable de moduler la transcription d'un polynucléotide placé sous son contrôle.

Selon un premier mode de réalisation préféré, un fragment biologiquement actif d'un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention comprend un premier module conservé (module 2) qui comprend le promoteur de base (boîte TATA) allant du nucléotide en position -1 au nucléotide en position -390, par rapport au site s d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 1112 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou le nucléotide en position 1221 de la séquence nucléotidique SE ID NO :4.
Selon un second mode de réalisation, un fragment biologiquement actif d'un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention comprend les modules 1 io et 2 conservés (figure 1 ) du nucléotide en position -1 au nucléotide en position -860, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 1112 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou le nucléotide en position 1221 de la séquence nucléotidique SE ID NO :4.
Selon un troisième mode de réalisation, un tel fragment biologiquement actif ~s d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention comprend, outre le promoteur de base (cote promoter) et les éléments régulateurs proximaux, également d'autres - éléments régulàteurs tels~que lès différents sitès GF11, HNF3B, CEBPB, NF1 et s'étend du nucléotide en position -1 au nucléotide en position -1111, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en 2o position 1112 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, et au nucléotide en position -1220, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucléotide transcrit étant le nucléotide en position 1221 de la séquence nucléotidique SEQ ID
N°4.
ANALYSE DE L'EXON 'i 2s Le demandeur a également identifié les séquences nucléotidiques localisées en aval du site d'initiation de la transcription et correspondant à
l'extrémité 5' de l'exon 1, des gènes humain et mutin codant pour la protéine ABCA7.
Plus précisément, l'extrémité 5' de l'exon 1, d'une taille de 1210 nucléotides, débute au nucléotide en position 1112 de la séquence SEQ ID N°1 et se termine au 3o nucléotide en position 2322 de la séquence SEQ ID N°1. L'extrémité
5' de l'exon 1 est identifiëe comme la séquence SEQ ID N°3 et la séquence complète de l'exon 1 est identifiée comme la séquence SEQ ID N°6.

L'exon 1 contient le début de la phase ouverte de lecture du gène ABCA7 humain, le nucléotide A du codon ATG étant localisé en position 1208 des séquences SEQ ID N° 3 et 6. L'exon 1 code pour le polypeptide de séquence SEQ
ID N° 7.
L'exon 1 est susceptible de contenir des éléments de régulation de s l'expression du gène ABCA7, notamment des éléments de type enhancer amplificateur et/ou des éléments de type silencer ou répresseur.
En conséquence, un acide nucléique régulateur de la transcription selon !'invention peut également contenir, outre des fragments biologiquement actifs de !a séquence SEQ ID N°1, également des fragments nucléotidiques, voire la totalité des !o séquences SEQ ID N°2 à SEQ ID N°3 et 6.
Les séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°3, et 6, ainsi que leurs fragments, peuvent être notamment utilisés comme sondes ou amorces nucléotidiques pour détecter la présence d'au moins une copie du gène ABCA7 dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein de la séquence !s régulatrice du gène ABCA7.
L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique ayant au moins 80%
d'identité en nuciéotides avec ûn~âcide nucléique tel que définï ci-dessus, en particulier provenant de l'une des séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°3 et 6.
L'invention concerne également un acide nucléique hybridant, dans des 2o conditions de forte stringence, avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, en particulier un acide nucléique provenant d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°3 et 6.
L'invention a également trait à un acide nucléique tel que défini ci-dessus et caractérisé en outre en ce qu'il est capable de moduler la transcription d'un 2s polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.
Selon un premier aspect, un tel acide nucléique est capable d'activer la transcription du poiynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.
Selon un second aspect, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être caractérisé en ce qu'il est capable d'inhiber la transcription du polynucléotide 3o d'intérêt placé sous le contrôle de celui-ci.
Préférentiellement, un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention, lorsqu'il est localisé convenablement par rapport à un polynucléotide d'intérêt dont l'expression est recherchée, va permettre la transcription dudit polynucléotide d'intérêt, soit de manière constitutive, soit de manière inductible.
Le caractère inductible de la transcription initiée par un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être conféré par un ou plusieurs des éléments s régulateurs qu'il contient, par exemple ia présence d'un ou plusieurs sites tels que précédemment définis dans la séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N° 2.
De plus, une expression spécifique de tissu du polynucléotide d'intérêt peut être recherchée en plaçant ce polynucléotide d'intérêt sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'inventïon capable, par exemple, d'initier la transcription de io ce polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans certaines catégories de cellules, par exemple des cellules du tissu hématopoïétique, telles les leucocytes périphériques, les cellules du thymus, les cellules de la rate, et la moelle osseuse.
De manière préférée, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs éléments régulateurs " discrets", tels que des éléments 1s enhancers et silencers. En particulier, un tel acide nucléique régulateur peut comprendre un ou plusieurs sites de fixation potentiels aux facteurs de transcription tels que définis dans 1â figure 2.
Un acide régulateur selon l'invention englobe également une séquence ne comprenant pas le promoteur de base, c'est-à-dire la séquence allant du nucléotide en 2o position -1 au nucléotide en position -25, par rapport au site d'initiation de la transcription.
Un te( acide nucléique régulateur comprendra alors préférentiellement un promoteur de base dit " hétérologue " , c'est-à-dire un poiynucléotide comprenant une boîte " TATA " et une " homéo-boîte " ne provenant pas de l'acide nucléique régulateur Zs du gène ABCA7.
Fait également partie de l'invention, un acide nucléique régulateur de la transcription comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N°1 qui a été modifié, par exemple par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides. De telles modifications peuvent moduler l'activité transcriptionnelle en provoquant une ~o augmentation ou au contraire une diminution de l'activité du promoteur ou de l'élément régulateur.
Une telle modification peut également affecter la spécificité tissulaire du promoteur ou de l'élément régulateur. Ainsi, par exemple, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être modifié afin de stimuler la transcription dans seulement l'un des tissus dans lequel il est naturellement exprimé.
Un acide régulateur de la transcription selon l'invention peut également être modifié et être rendu inductible par un composé particulier, par exemple en créant dans s la séquence un site inductible par un composé thërapeutique donné.
Les modifications dans une séquence comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N°1 et comprenant le promoteur ou un élément régulateur peuvent être réalisées avec des méthodes bien connues de l'homme du métier, telle que la mutagenèse. L'activité du promoteur ou de l'élément régulateur modifié peut ensuite ~o être testée, par exemple par clonage du promoteur modifié en amont d'un gène rapporteur, en transfectant la construction d'ADN résultante dans une cellule hôte et en mesurant le niveau d'expression du gène rapporteur dans la cellule hôte transfectée.
L'activité du promoteur modifié peut également être analysée in vivo dans des animaux transgéniques. II est également possible de construire des banques de fragments is modifiés qui peuvent être criblées en utilisant des tests fonctionnels dans lesquels, par exemple, seuls les promoteurs ou les éléments régulateurs ayant l'activité
désirée serônt sélectionnés.
De tels essais peuvent être basés, par exemple sur l'utilisation de gènes rapporteurs conférant une résistance à des composés déterminés, par exemple à
des 2o antibiotiques. La sélection de cellules ayant une construction acide nucléique régulateur/gène rapporteur et contenant un promoteur ou un élément régulateur ayant la modification recherchée peut alors être isolée par culture des cellules hôtes transformées avec une telle construction en présence du composé déterminé, par exemple de l'antibiotique déterminé.
as Le gène rapporteur peut également coder pour toute protéine facilement détectable, par exemple une protéine optiquement détectable telle que la luciférase.
En conséquence, l'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant:
a) un acide nucléique régulateur de la transcription telle que définie ci-dessus;
3o et b) un polynucléotide d'intérêt codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt.

Selon un premier aspect, le polynucléotide d'intérêt dont la transcription est recherchée code pour une protéine ou un peptide. La protéine peut être de toute nature, par exemple une protéine d'intérêt thérapeutique, y compris des cytokines, des protéines de structure, des récepteurs ou encore des facteurs de transcription. Par s exemple, dans le cas où une transcription spécifiquement dans certains tissus est recherchée, comme par exemple dans des cellules du tissu hématopoïétique, c'est à
dire de la rate, de la moelle osseuse, ou dans les leucocytes périphériques, l'acide nucléique régulateur de la transcription comprendra avantageusement un acide nucléique allant du nucléotide en position -1 au nucléotide en position -1111, par ~o rapport au site d'initiation de la transcription de la séquence SEQ ID
N°1 ou 2, et allant du nucléotide en position -1 au nucléotide en position -1220 SEQ ID N°4 ou 5.
Dans ce cas, le polynucléotide d'intérêt codera pour un gène impliqué dans la lutte contre l'inflammation, tel qu'un récepteur aux cytokines ou encore pour une superoxyde dismutase. Si un effet antitumoral est recherché, on cherchera alors à
is stimuler le nombre et l'activation de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'un antigène tumoral donné.
Dans un autre mode de réalisatiôn, ün acide nûcléique régulateur selon l'invention sera utilisé en combïnaison avec un polynucléotide d'intérêt codant pour la protëine ABCA7.
2o Egalement, le polynucléotide d'intérêt peut également peut être un oligonucléotide de type sens.
Comme déjà mentionné, le polynucléotide d'intérêt peut également produire un acide nucléique, tel qu'un acide nucléique antisens spécifique d'un gène dont on cherche à inhiber la traduction.
Selon un autre aspect, le polynucléotide d'intérêt dont la transcription est régulée par l'acide nucléique régulateur est un gène rapporteur, tel que tout gène codant pour une protéine détectable.
Parmi les gènes rapporteurs préférés , on peut citer notamment le gène de la luciférase, de la ~i-galactosidase (LacZ), de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) ou encore tout gène codant pour une protéine conférant une résistance à
un composé particulier, particulièrement à un antibiotique.

VECTEURS RECOMBINANTS
Par " vecteur " au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.
s Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique régulateur selon l'invention qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique régulateur conforme à l'invention, des séquences 1o dont l'expression est recherchée dans une cellule hôte ou dans un organisme multicellulaire déterminé.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants (1 ) un acide nucléique régulateur selon l'invention;
~s (2) un polynucléotide d'intérêt comprenant une séquence codante comprise dans l'acide nucléique à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phasè avec les signaux de régulation décrits au (1 ) ; et (3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, (es vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou 2o plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection.
A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN pofymérase du bactériophage T3 ou T7, les 2s promoteurs PR, ou PL du phage lambda.
Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métaliothionéine-L
de souris.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se rëférer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996; Immunology in Current Protocols in Molecular Biology).

Lorsque l'expression de la séquence génomique du gène ABCA7 sera désirée, on aura préférentiellement recours à des vecteurs capables d'inclure de grandes séquences d'insertion. Dans ce mode de réalisation particulier, on utilisera de préférence des vecteurs de bactériophages, tels que ies vecteurs de bactériophage P1 s comme le vecteur p158 ou encore le vecteur p158/neo8 décrits par Sternberg (Trends Genet., (1992) 8 : 1-16; Mamm. Genome (1994) 5 : 397-404).
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322(ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsaia, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, ETATS-UNIS).
io On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNHBA, pNHl6A, pNHl8A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stratagene).
II peut s'agir aussi du vecteur recombinant PXP1 décrit par Nordeen SK et al.
(BioTechniques, (1988) 6 : 454-457).
is II peut s'agir également de vecteurs de type Baculovirus tels que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC
N°CRL 1711 ) dérivées de Spodopiera frugiperda.
I1 peut encore s'agir de vecteurs adënoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5.
2o Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno-associés sont par exemple décrits par Flotte et al., Am. J. Respir., Cell Mol. Biol. (1992) 7 :
349-356 ;
Samulski et al., J. Virol. (1989) 63 : 3822-3828 ; MacLaughlin et al., Am. J.
Hum.
Genet. (1996) 59 : 561-569).
2s Pour permettre l'expression d'un polynucléotide d'intérêt sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, la construction polynucléotidique comprenant la séquence régulatrice et la séquence codante doit être introduite dans une cellule hôte. L'introduction d'une telle construction polynucléotidique selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien 3o connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires. On peut aussi réaliser l'introduction des polynucléotides selon l'invention in vivo ou ex vivo, pour la prévention ou le traitement de maladies liées à un déficit dans le transport en protéine ABCA7.
Pour introduire les polynucléotides ou les vecteurs dans une cellule hôte, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à différentes techniques, s comme la technique de précipitation au phosphate de calcium (Graham et al., Virology (1973) 52 : 456-457 ; Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7: 2745-2752), le DEAE
Dextran (Gopal et al., Mol. Cell. Biol., (1985) 5 : 1188-1190), l'électroporation (Tur-Kaspa et al., Mol Cel. Biol, (1986) 6 : 716-718.; Potter et al., Proc. NatL
Acad. Sci. USA
(1984), 81(22), 7161-5), la microinjection directe (Harland et al., J Cell8iol (1985) 101 io 1094-1095), les liposomes chargés en ADN (Nicolau et al., Methods Enzymol (1987) 149 : 157-76 ; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76 : 3348-3352).
Une fois que le polynucléotide a ëté introduit dans la cellule hôte, il peut être intégré de manière stable dans le génome de la cellule. L'intégration peut être réalisée à un endroit précis du génome, par recombinaison homologue, ou peut être intégré au is hasard. Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide peut être maintenu de manière stable dans la cellule hôte sous la forme d'un fragment d'épisome, l'épisome comprenant des séquences permettant le maintien et la réplication de ce dernier, soit de manière indépendante, soit de manière synchronisée avec le cycle cellulaire.
Selon un mode de réalisation parüculier, une méthode pour introduire un 2o polynucléotide selon l'invention dans une cellule hôte, en particulier une cellule hôte provenant d'un mammifère, in vivo, comprend une étape au cours de laquelle on introduit une préparation comprenant un vecteur d'expression pharmaceutiquement compatible et un polynucléotide " nu " selon l'invention, placé sous le contrôle de séquences de régulation appropriées, par injection locale au niveau du tissus choisi, as par exemple un tissu musculaire lisse, le polynucléotide " nu " étant absorbé par les cellules de ce tissu.
Des compositions pour l'utilisation in vitro et in vivo comprenant des polynucléotides " nus " sont par exemples décrites dans la demande PCT
N° WO
95/11307 ainsi que dans les articles de Tacson et al. (Nature Med. (1996) 2(8), 888-30 892) et de Huygen et al., (Nat Med. (1996) 2(8), 893-898).
Selon un mode de réalisation spécifique de l'invention, il est fourni une composition pour la production in vivo d'une protéine d'intérêt. Cette composition comprend un polynucléotide codant pour le poiypeptide d'intérêt placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice selon l'invention, en solution dans un vecteur physiologiquement acceptable.
La quantité de vecteur qui est injectée à l'organisme hôte choisi varie selon le s site de l'injection. A titre indicatif, il peut être injecté entre environ 0,1 et environ 100 ~g de la construction polynucléotidique séquence régulatrice/séquence codante dans le corps d'un animal.
Lorsque l'acide nucléique régulateur selon l'invention est localisé, sur la construction polynucléotidique (ou vecteur), de telle manière à contrôler la transcription io d'une séquence comprenant un cadre de lecture ouvert codant la protéine ABCA7, le vecteur est injecté de préférence dans le corps d'un patient susceptible de développer une maladie liée à un déficit en protéine ABCA7.
En conséquence, l'invention concerne également une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un is dysfonctionnement de la protéine ABCA7, comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et un polynucléotide d'intérêt codant pour la protéine ABCA7, en w association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Avantageusement, une telle composition comprendra l'acide nucléique régulateur défini par l'une des séquences SEQ ID N°1 ou 2, et SEQ ID
N°4 ou 5, ou un a.o fragment biologiquement actif de cet acide nucléique régulateur.
L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement dans le métabolisme des lipides, comprenant un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
2s L'invention a ëgalement pour objet une composition pharmaceutique destinée à
la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation, comprenant un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
so L'invention est également relative à l'utilisation d'une construction polynucléotidique conforme à l'invention et comprenant un acide nucléique régulateur du gène ABCA7 ainsi qu'une séquence codant pour la protéine ABCA7, pour la fabrication d'un médïcament destiné à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du métabolisme des lipides ou d'un problème d'origine immunologique ou encore d'origine inflammatoire.
L'invention a également trait à l'utilisation d'un vecteur recombinant selon l'invention, comprenant, outre un acide nucléique régulateur de l'invention, un acide s nucléique codant pour la protéine ABCA7, pour la fabrication d'un médicament destiné
à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
Vecteurs utiles dans des procédés de thérapie génique somatique et 1o compositions contenant de tels vecteurs La présente invention concerne aussi une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement et/ou la prévention des pathologies liées au métabolisme des lipides ainsi que pour le traitement et/ou la prévention des pathologies liées au dysfonctionnement des mécanismes de médiation lymphocytaire de l'inflammation.
Elle is propose une solution avantageuse aux inconvénients de l'art antérieur, en démontrant la possibilité de traiter les pathologies, notamment des pathologies . liées à
un dysfonctionnement du métabolisme des lipides dans les tissus myélo-lymphatiques, par la thërapie génique, par le transfert et l'expression in vivo d'une construction polynucléotidique comprenant, outre un acide nucléique régulateur selon l'invention, 2o une séquence codant pour une protéine ABCA7 qui est fortement présumée comme étant impliquée dans le transport et/ou le métabolisme des lipides.
L'invention offre ainsi un moyen simple permettant . un traitement spécifique et efficace des sujets affectés d'un dysfonctionnement des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
2s La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc.) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit 3o directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891 ), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de üposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431 ), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à
s ces techniques physiques de transfection. A cet ëgard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc.), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
La présente invention est donc également relative à une nouvelle approche 1o thérapeutique pour le traitement des pathologies liées au transport des lipides, consistant à transférer et à exprimer in vivo des gènes codant pour ABCA7 placës sous le contrôle d'un acide régulateur selon l'invention. II est particulièrement avantageux de construire des virus recombinants contenant une séquence d'ADN comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence codant pour une protéine is ABCA7 impliquée dans le métabolisme de lipides, d'administrer ces virus recombinants in vivo, et que cette administratïon permette une expression stable. et efficace d'une protéine ABCA7 biologiquement active in vivo, et sans effet cytopathologique.
Les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et !'expression du gène ABCA7. En particulier, l'utilisation d'adénovirus ao recombinants comme vecteurs permet d'obtenir des niveaux d'expression suffisamment élevés du gène d'intérêt pour produire l'effet thérapeutique recherché.
D'autres vecteurs viraux, tels que les rétrovirus ou les virus adéno-associés (AAV), permettant une expression stable du gène sont aussi revendiqués.
La présente invention offre ainsi une nouvelle approche pour le traitement et la 2s prévention des pathologies liées à des dysfonctionnements dans le métabolisme des lipides et dans les voies de signalisation de l'inflammation par les lymphocytes.
L'invention a donc aussi pour objet un virus recombinant défectif comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence nucléique codant pour une protéine ABCA7 impliquée dans le métabolisme des lipides ou dans les processus 3o impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
L'invention a également trait à l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des dysfonctionnements de la signalisation de l'inflammation par les lymphocytes.
La présente invention concerne également l'utilisation de cellules modifiées génétiquement ex vivo par un virus tel que décrit ci-dessus, ou de cellules productrices s de tels virus, implantées dans l'organisme, permettant une expression in vivo prolongée et efficace d'une protéine ABCA7 biologiquement active.
La présente invention montre qu'il est possible d'incorporer une séquence d'ADN codant pour ABCA7 dans le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini ci-dessus dans un vecteur viral, et que ces vecteurs permettent d'exprimer Io efficacement une forme mature, biologiquement active. Plus aarticulièrement_ l'invention montre que l'expression in vivo de ABCA7 peut être obtenue par administration directe d'un adénovirus ou par implantation d'une cellule productrice ou génétiquement modifiée par un adénovirus ou par un rétrovirus incorporant un tel ADN.
La présente invention est particulièrement avantageuse, car elle permet is d'induire une expression contrôlée et sans effet nocif de ABCA7 dans des organes qui ne sont pas normalement concernés par l'expression de cette protéine. En particulier, une- libération significative de la protéine ABCA7 est obtenue par implantation de cellules productrices de vecteurs de l'invention, ou infectées ex vivo par des vecteurs de l'invention.
2o L'activité de médiateur dans le métabolisme des lipides produit dans le cadre de la présente invention peut être du type ABCA7 humaine ou animale. La séquence nucléique utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN
génomique (ADNg), un ARN (dans le cas des rétrovirus) ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs 2s introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, l'utilisation d'un ADNg permet une meilleure expression dans les cellules humaines.
Pour permettre leur incorporation dans un vecteur viral selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mutagenèse dirigée, en particulier 3o pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des expressions importantes. Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une séquence nucléique codant pour une protéine ABCA7 humaine. Par ailleurs, il est également possible d'utiliser une construction codant pour un dérivé de ces protéines ABCA7. Un dérivé de ces, protéines ABCA7 comprend par exempte toute séquence obtenue par mutation, délétion et/ou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un s produit conservant l'activité de médiateur du métabolisme des linid modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après). L'activité
biologique des dérivés ainsi obtenus peut ensuite être aisément déterminée, comme indiqué
notamment dans les exemples décrivant la mesure de l'efflux de lipides à
partir des io cellules. Les dérivés au sens de l'invention peuvent ëgalement être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.
Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des molécules présentant une plus grande résistance aux ~s protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement ayant de nouvelles propriétés biologiques.
Les dérivés incluent également- les séquences d'ADN modifiées permettant une -M-expression amêliorée in vivo.
Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un virus 2o recombinant défectif comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence d'ADNc codant pour une protéine ABCA7 impliquée dans ie transport et le métabolisme du cholestérol. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg. La séquence d'ADNc codant pour la protéine ABCA7, et utilisable dans un vecteur selon l'invention est avantageusement la 2s séquence SEQ ID N°8.
Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivës des adénovirus, des virus adéno-associés (AAV), des virus de l'herpès (HSV) ou des rétrovirus. II est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus, pour une administration directe ou 3o pour la modification ex vivo de cellules destinées à être implantées, ou un rétrovirus, pour l'implantation de cellules productrices.
Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de ia présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence s nucléique codant pour la protéine ABCA7. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces io sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO 94126914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81 ), ovine, porcine, aviaire ou is encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche Manhattan ou A26/61 ' (ATCC VR-800) par exemplej. De préférence, on utilise dans le cadre ~de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant 20 l'encapsidation et la séquence codant pour la protéine ABCA7 placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention. Avantageusement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est rendue non fonctionnelle.
Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut 2s être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents 3o mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W0 95/02697), E2 (W0 94/28938), E4 (W0 94128152, WO 94/12649, WO
95/02697) et L5 (W0 95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4 et la séquence codant pour ABCA7 est insérée au niveau de la région E1 inactivée.
Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans la région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour ABCA7 (Demande de brevet Français FR 94 13355).
s Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene (1991 ) 101:
195, EP 185 573; Graham, EMBO J. (1984) 3: 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour la protéine ABCA7. La recombinaison io homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ü), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut is mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J.
Gen. Virol.
(1977) 36 :59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du ~~ génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capâbles de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n°

et WO 95/02697.
~o Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de 2s cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. II comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome 3o est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.

L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et ~n vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO
93109239; US
4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Ces documents décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés s et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt.
Toutefois, aucun de ces documents ne décrit ni ne suggère l'utilisation d'un AAV
recombinant pour le transfert et l'expression in vivo ou ex vivo d'une protéine ABCA7, ni les avantages d'un tel transfert. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent io être préparés par co-transfection, dans une lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour la protéine ABCA7 bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV.
Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
is Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et ai.; (New Biologist 3 (1991 ) 203); EP 453242, EP 178220, Bernstein et al.
(Genet. Eng. ~ .
7 (1985) 235); McCormick, (BioTechnology 3 (1985) 689), etc.
En particulier, tes rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en 2o division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés â partir de 2s différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant 3o pour la protéine ABCA7 placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US
4,861,719); la lignée PsiCRIP (W0 90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (W0 s 89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
io Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. Les résultats donnés ci-après démontrent en effet les propriétés particulièrement intéressantes des adénovirus pour l'expression in vivo d'une protéine ayant une activité de médiateur du métabolisme des lipides. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux is pour une administration directe in vivo d'une suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation.
De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en oûtre des âvantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale.
2o Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux contenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et la séquence codant pour la protéine ABCA7, pour une implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont notamment les cellules PA317 (US4,861,719), PsiCrip (W0 90102806) et GP+envAm-12 (US
2s 5,278,056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant pour une protéine ABCA7 selon l'invention. Par exemple des cellules souches totipotentes, précurseurs des lignées cellulaires sanguines, peuvent être prélevées et isolées chez le sujet. Ces cellules mises en culture peuvent être alors transfectées par le vecteur rétroviral contenant la séquence codant pour la 3o protéine ABCA7 sous le contrôle de son propre promoteur. Ces cellules sont alors réintroduites chez le sujet. La différentiation de ces cellules sera à
l'origine de cellules du tissu hématopoïétique exprimant la protéine ABCA7, notamment des lymphocytes T
qui, participent à la signalisation de l'inflammation.

Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour la protéine ABCA7 est placée sous le contrôle d'un acide régulateur selon l'invention comprenant les éléments régulateurs permettant son expression dans les cellules infectées, et tout particulièrement les éléments régulateurs de type NFkappaB, CEBP, s et GFI1.
Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des pathologies liées au métabolisme des lipides ou encore au dysfonctionnement fié aux processus impliquant 1o le système immunitaire et l'inflammation.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, Is intramusculaire, sous-cutanée, intra-occulaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement-~acceptable pour une formulation injectablé, notamment pour une injection intraveineuse, telle que par exemple dans la veine porte du patient.
II peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, 2o notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la veine porte du patient est avantageuse car elle permet de cibler l'infection au niveau du foie et ainsi, de concentrer l'effet thérapeutique au niveau de cet organe.
Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être 2s adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrës sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming 3o unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.

Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus.
s Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectées par ces virus. II peut s'agir en particulier de cellules d'origine sanguine (cellules souches totipotentes ou précurseurs), fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules musculaires lisses et endothéliales, cellules gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires.
Celles lo ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à
partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham (Methods Cell Biol (1980) 21a: 255). Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les virus, is ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultûres secondaires, obténùes par exemple à partir de banqûes préétablies (voir par exemple EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
Les cellules en culture sont ensuite infectées par les virus recombinants, pour zo leur conférer la capacité de produire une protéine ABCA7 biologiquement active.
L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicitë d'infections et éventuellement le nombre de cycles d'infections réalisé. II est bien entendu que ces étapes doivent être 2s effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptëes par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro. Pour l'infection par des rétrovirus, il est également 3o possible de co-cultiver les cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus recombinants selon l'invention. Ceci permet de s'affranchir de la purification des rétrovirus.

Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules de mammifères infectées par un ou plusieurs virus recombinants défectifs telles que décrites ci-dessus ou des cellules productrices de virus recombinants, et une matrice extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 105 à
s 1010 cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gëlifiants io peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, .la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le is cadre de la présente invention du collagène. I! peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou marine. Plus préférentiellement, on utilise du collagène de type f.
Comme indiqué ci avant; ~ les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique etlou chimique et/ou physique entraînant 20 l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique.
2s La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies liées au transport du cholestérol, en particulier l'obésité, l'hypertriglycéridémie, ou, dans le domaine des affections cardio-vasculaires, l'infarctus du myocârde, l'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque et les accidents cérébro-vasculaires.
3o En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc.), les chevaux, les poissons, etc.

CELLULES HOTES RECOMBlNANTES
L'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante comprenant l'un quelconque des acides nucléiques de l'invention de séquence SEQ ID N° 1 à SEQ ID
s N°6, et plus particulièrement un acide nucléique de séquence SEQ ID
NO 1 à SEQ ID
N°3.
Selon un autre aspect, l'invention est également relative à une cellule hôte recombinante comprenant un vecteur recombinant tel que ci-dessus décrit.
Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont par exemple les suivantes io a) cellules hôtes procaryotes: souches d'Escherichia coli (souche DH5-a), de Bacillus subtilis, de Salmonella typhimurium, ou encore des souches d'espèces telles que Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococus ;
b) cellules hôtes eucaryotes: cellules HeLa (ATCC N°CCL2), cellules Cv (ATCC N°CCL70), cellules COS (ATCC N°CRL 1650), cellules Sf-9 (ATCC N°CRL
1s 1711 ), cellules CHO (ATCC N°CCL-61 ) ou encore cellules 3T3 (ATCC
N°CRL-6361 ), ou encore les cellules de la lignée Hepa1-6 référencées à l'American Type Culture Collection (ATCC, Rdckvüle, MD, Etats-Unis d'Amérique).
c) les cellules en culture primaire provenant d'un individu chez lequel l'expression d'un acide nucléique d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique 2o régulateur selon l'invention est recherchée.
d) Les cellules à multiplication indéfinie (lignées cellulaires) obtenues à
partir des cellules en culture primaire du c) ci-dessus, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
~s PROCEDES DE CRIBLAGE
Procédé de criblage in vitro.
3o L'invention fournit des procédés pour traiter un sujet affecté d'une pathologie liée au niveau d'expression de la protéine ABCA7. En particulier, une telle méthode de traitement consiste à administrer au sujet un composé modulant l'expression du gène ABCA7, qui peut être identifié selon divers procédés de criblage in vitro tels que définis ci-après.
Une première méthode consiste à identifier des composés modulant l'expression du gène ABCA7. Selon une telle méthode, des cellules exprimant le gène s ABCA7 sont incubées avec une substance ou molécule candidate à tester et le niveau d'expression de l'ARN messager de ABCA7 ou encore le niveau de production de la protéine ABCA7 est ensuite déterminé.
Les niveaux d'ARN messager de ABCA7 peuvent être déterminés par hybridation sur gel de type Northern, bien connu de l'homme du mëtier. Les niveaux 1o d'ARN messager de ABCA7 peuvent également être déterminés par des procédés mettant en oeuvre la PCR ou encore la technique décrite par WEBB et al.
(Journal of Biomolecular Screening (1996), vol. 1: 119).
Les niveaux de production de la protéine ABCA7 peuvent être déterminés par immunoprécipitation ou immunochimie en utilisant un anticorps qui reconnaît 1s spécifiquement la protéine ABCA7.
Selon une autre méthode de criblage d'une molécule ou substance candidate modulant l'activité d'un acide ~ nucléique régulateur selon l'invéntion, une construction nucléotidique telle que définie ci-dessus, comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention ainsi qu'un polynucléotide rapporteur placé sous le contrôle de l'acide ao nucléique régulateur, est utilisée, ledit acide nucléique régulateur comprenant au moins un promoteur de base et au moins un élément régulateur de l'une des séquences SEQ
ID N°1 à SEQ ID N°3. Le polynucléotide rapporteur peut être un gène codant pour une protéine détectable, tel qu'un gène codant pour une luciférase.
Selon un tel procédé de criblage, les cellules sont transfectées avec la 2s construction polynucléotidique contenant l'acide nucléique régulateur selon l'invention et le polynucléotide rapporteur, de manière stable ou transitoire.
Les cellules transformées sont ensuite incubées en présence ou en l'absence de la molécule ou de la substance candidate à tester pendant un temps suffisant, puis le niveau d'expression du gène rapporteur est déterminé. Les composés qui induisent 3o un changement statistiquement significatif de l'expression du gène rapporteur (soit une augmentation, soit au contraire une diminution de l'expression du gène rapporteur) sont ensuite identifiés et, ie cas échéant, sélectionnés.

Ainsi, l'invention a encore pour objet un procédé pour le criblage in vitro d'une molécule ou d'une substance modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, notamment modulant la transcription du polynucléotide rapporteur constitutif d'une construction polynucléotidique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte s les étapes consistant à
a) mettre en culture une cellule hôte recombinante comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention;
b) incuber ia cellule hôte recombinante avec la substance ou molécule à
io tester;
c) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt;
d) comparer les résultats obtenus à l'étape c) avec les résultats obtenus lorsque la cellule hôte recombinante est mise en culture en l'absence de la molécule ou substance candidate à tester.
is L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour le criblage in vitro d'une molécule ou d'une substance candidate capable de moduler l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comprènant:
a) une cellule hôte transformée avec une construction polynucléotidique telle que définie ci-dessus, comprenant un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé
sous le 2o contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention; et b) le cas échéant, des moyens de détection de l'expression du polynucléotide rapporteur d'intérêt.
De préférence, le polynucléotide rapporteur d'intérêt est la séquence codante d'une luciférase. Dans ce cas, l'acide nucléique régulateur selon l'invention est inséré
Zs dans un vecteur, en amont de la séquence codant pour la luciférase. II peut s'agir par exemple du vécteur pGL3-basic (pGL3-b) commercialisé par la Société PROMEGA
(Madison, Wisconsin, Etats-Unis).
Dans ce cas, le vecteur reçombinant comprenant la sëquence codante de la luciférase placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention est 3o transfecté dans les cellules hôtes recombinantes dont !'activité luciférase est ensuite déterminée après mise en culture en présence ou non de la substance ou de la molécule candidate à tester.

On peut dans ce cas utiliser comme témoins des vecteurs pGL3-b contenant soit le promoteur du cytomégalovirus (CMV), le promoteur ApoAl ou encore aucun promoteur. Pour le test d'activité luciférase, les cellules transfectées sont lavées avec un tampon PBS et lysées avec 500 NI de tampon de lyse (50 mM tris, 150 mM
NaCI, s 0,02% d'azide de sodium, 1 % de NP-40, 100 Ng/ml de AEBSF et 5 Ng/ml de leupeptine).
p1 du lysat cellulaire obtenu sont ensuite ajoutés à 100 NI du substrat de la luciférase (Promega) et les mesures d'activité sont réalisées sur un lecteur spectrophotométrique de microplaque, 5 minutes après l'addition du lysat cellulaire.
io Les données sont exprimées en unités relatives d'activité luciférase. Les constructions polynucléotidiques produisant de hauts niveaux d'activité
luciférase dans les cellules transfectées sont celles qui contiennent un acide nucléique régulateur selon l'invention compris dans la séquence SEQ ID N°1 qui est capable de stimuler la transcription.
is Pour les mesures des niveaux d'expression d'ARN messager dans un procédé
de criblage selon l'invention, on prépare tout d'abord des sondes spécifiques de l'ARN
messager du polynucléotidé ràpporteur d'intérêt, par exemple à l'aidé dû kit multiprime labeling kit (commercialisé par la Société Amersham Life Sciences, Cleveland, Ohio, Etats-Unis).
PROCEDE DE CRIBLAGE IN VIVO
Selon un autre aspect de l'invention, des compositions modulant l'activité
d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peuvent être identifiées in vivo, dans des animaux transgéniques non humains.
2s Selon une telle méthode, un animal transgénique non humain, par exemple une souris, est traité avec une molécule ou une substance candidate à tester, par exemple une substance ou molécule candidate auparavant sélectionnée par un procédé de criblage in vitro tel que défini ci-dessus.
Après une durée déterminée, le niveau d'activité de l'acide nucléique 3o régulateur selon l'invention est déterminë et comparé à l'activité d'un animal transgénique non humain identique, par exemple une souris transgénique identique, qui n'a pas reçu la molécule ou la substance candidate.

L'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention fonctionnel dans l'animal transgénique peut être déterminée par diverses méthodes, par exemple la mesure des niveaux d'ARN messager correspondant aux polynucléotides rapporteurs d'intérêt placés sous le contrôle dudit acide nucléique régulateur par hybridation de s type Northern, ou encore par hybridation in situ. ou encore par imagerie biophotonique non .invasive (Xenogen Corporation).
Selon une alternative, l'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention peut être déterminée en mesurant les niveaux d'expression de protéine codée par les polynuc(éotides rapporteurs d'intérêt, par exemple par immunohistochimie, dans le cas 1o où le polynucléotide rapporteur d'intérêt comprend un cadre de lecture ouvert codant pour une protéine détectable par une telle technique.
Pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, on préférera des mammifères non humains tels que des souris, des rats ou des is cobayes ou des lapins qui ont leur génome modifié par l'insertion d'une construction poiynucléotidique comprenant un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.
Les animaux transgéniques selon l'invention comprennent le transgène, c'est à-dire la construction polynucléotidique précitée; dans une pluralité de leurs cellules 2o somatiques et/ou germinales.
La construction d'animaux transgéniques selon l'invention peut être réalisëe selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra en particulier se référer à la production d'animaux transgéniques, et particulièrement à la production de souris transgéniques, telles que décrites dans les 2s brevets US N°4,873,191 (délivré le 10 Octobre 1989), US
N°5,464,764 (délivré le 7 Novembre 1995) et US 5,789,215 (délivré le 4 Août 1998) le contenu de ces documents étant ici incorporé par référence.
En bref, une construction polynucléotidique comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé
sous le 3o contrôle de ce dernier est insérée dans une lignée de cellules souches de type ES.
L'insertion de la construction polynucléotidique est réalisée de préférence par électroporation, telle que décrite par Thomas et al. (1987, Cell, Vo1.51:503-512).

Les cellules ayant subi l'étape d'électroporation sont ensuite criblées pour la présence de la construction polynucléotidique (par exemple par sélection à
l'aide de marqueurs, ou encore par PCR ou par analyse sur gel d'électrophorèse d'ADN de type Southern) afin de sélectionner les cellules positives ayant intégré la construction s polynucléotidique exogène dans leur génome, le cas échéant à la suite d'un événement de recombinaison homologue. Une telle technique est par exemple décrite par MANSOUR et al. (Nature (1988) 336: 348-352).
,:
Ensuite, les cellules sélectionnées positivement sont isolées, clonées et injectées dans des blastocystes de souris de 3,5 jours, comme cela est décrit par io BRADLEY (1987, Production and Analysis of Chimaeric mice. In: E. J.
ROBERTSON
(Ed., teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. IRL
press, Oxford, page 113). Des blastocystes sont ensuite introduits dans un animal hôte femelle et le développement de l'embryon est poursuivi jusqu'au terme.
Selon une alternative, des cellules de type ES sélectionnées positivement sont 1s mises en contact avec des embryons de 2,5 jours à un stade 8-16 cellules (morulae) comme décrit par WOOD et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vo1.90: 4582-4585)_ ou par NAGY et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90: 8424-8428), les cellules ES étant internalisées afin de coloniser extensivement le blastocyste, y compris les cellules donnant naissance à la lignée germinale.
2o Les descendants sont ensuite testés afin de déterminer ceux qui ont intégré
la construction polynucléotidique (le transgène).
L'invention a donc également pour objet un animal transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou germinales ont été transformées par un acide nucléique ou une construction polynucléotidique selon l'invention.
2s L'invention a également trait à des cellules hôtes recombinantes obtenues à
partir d'un animal transgénique tel que décrit ci-dessus. Des lignées de cellules recombinantes provenant d'un animal transgénique selon l'invention peuvent être établies en culture à long terme à partir de n'importe quel tissu d'un tel animal transgénique, par exemple par transfection des cultures de cellules primaires avec des 3o vecteurs exprimant des oncogènes tels que le grand antigène T de SV40, tel que décrit par exemple par CHOU (1989, Mol. Endocrinol. Vol.3: 1511-1514) et SCHAY et al.
(1991, Biochem. Biophys. Acta, vol. 1072: 1-7).

L'invention est également relative à un procédé pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comportant les étapes consistant à a) administrer la substance ou la molécule candidate à un animal transgénique tel que défini ci-dessus ;
s b) détecter le niveau d'expression d'un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur ; c) comparer les résultats obtenus au b) avec les résultats obtenus chez un animal transgénique n'ayant pas reçu la substance ou la molécule candidate.
L'invention est en outre relative à un procédé de criblage in vivo d'une io substance ou molécule modulant la transcription d'un polynucléotide d'intérêt constitutif d'un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (a) administrer la substance ou molécule candidate à un mammifère transgénique non humain tel que défïni ci-dessus; (b) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt chez le mammifère transgénique tel que traité à
l'étape a); et is (c) comparer les résultats de détection de l'étape (b) aux résultats observés chez un mammifère transgénique non humain tel que défini ci-dessus n'ayant pas reçu l'âdministration de la substance ou molécule candidate.
L'invention se rapporte aussi à un kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique 2o régulateur selon l'invention, comprenant (a) un animal transgénique tel que défini ci-dessus ; (b) le cas échéant, les moyens de détection du niveau d'expression du polynucléotide rapporteur d'intérêt.
COMPOSES ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES
L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques destinées à la Zs prévention ou au traitement d'un déficit dans le métabolisme des lipides, ou d'un dysfonctionnement dans les processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
En premier lieu, l'invention a également pour objet une substance ou une molécule candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.
3o De manière tout à fait préférée, !'invention concerne également une substance ou une molécule candidate caractérisée en ce qu'elle augmente l'activité
d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, et tout particulièrement d'un acide nucléique régulateur comprenant la séquence SEQ ID N°1, 2, 4 ou 5.

Préférentiellement, une telle substance ou molécule capable de moduler l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention a été
sélectionnée selon l'un des procédés de criblage in vitro ou in vivo défini ci-dessus.
Ainsi, un sujet affecté dans le métabolisme des lipides ou dans la signalisation s de l'immunité est traité par l'administration à ce sujet d'une quantité
efficace d'un composé modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.
Ainsi, un patient ayant une faible activité du promoteur ABCA7 peut être traité
avec une molécule ou une substance précitée afin d'augmenter l'activité du promoteur ABCA7.
io De manière alternative, un patient ayant une activité du promoteur ABCA7 anormalement hauté peut être traité avec un composé capable de diminuer ou de bloquer l'activité du promoteur ABCA7.
Ainsi, la présente invention se rapporte également à une substance ou molécule utilisée en tant que principe actif d'un médicament.
is Un tel composé peut être un composé qui module l'interaction d'au moins un facteur de transcription avec le promoteur ABCA7 ou un élément régulateur d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.
Par exemple, le composé peut inhiber l'interaction de l'un des facteurs de transcription listés dans le tableau 1 avec un acide nucléique régulateur selon 20 l'invention.
Le composé peut également être un composé qui module l'activité d'un facteur de transcription se fixant au promoteur de ABCA7 ou encore d'un élément régulateur présent sur ce dernier.
Un composé d'intérêt thérapeutique selon l'invention peut également être un 2s composé qui module l'interaction d'un premier facteur de transcription avec un second facteur de transcription.
Comme détaillé dans l'analyse des différents facteurs de transcription susceptibles de se fixer à la séquence SEQ ID N°1, 2, 4, ou 5 certains facteurs de transcription sont actifs seulement s'ils sont associés avec un autre facteur de ~o transcription.
Un composé d'intérêt thérapeutique selon l'invention est préférentiellement choisi parmi les acides nucléiques, les peptides et les petites molécules.
Par exemple, un tel composé peut être un acide nucléique antisens qui se fixe spécifiquement sur une région du promoteur ABCA7 ou sur un élément régulateur d'un acide nucléique rëgulateur d'ABCA7 et inhibant ou diminuant l'activité du promoteur.
Ce composé d'intérêt thérapeutique peut également étre un acide nucléique antisens qui interagit spécifiquement avec un gène codant pour un facteur de s transcription modulant l'activité du promoteur ABCA7, de telle manière que l'interaction de l'acide nucléique antisens avec le gène codant pour le facteur de transcription se fixant sur le promoteur ABCA7 diminue la production de ce facteur de transcription, résultant en une augmentation ou une diminution de l'activité du promoteur ABCA7, selon que le facteur de transcription augmente ou au contraire réduit l'activité du 1o promoteur ABCA7.
La toxicité et l'efficacité thérapeutique des composés thérapeutiques selon l'invention peuvent être déterminées selon les protocoles pharmaceutiques standard dans des cellules en culture ou chez des animaux expérimentaux, par exemple pour dëtermïner la dose létale LDSO (c'est-à-dire la dose létale pour 50% de la population is testée) ainsi que ia dose efficace ED5o (c'est-à-dire la dose thérapeutiquement efficace dans 50% de la population testée).
Pour tous les composés .d'intérêt thërapeutique selon l'invention, la dose thérapeutiquement efficace peut être estimée initialement à partir de tests réalisés dans des cultures cellulaires in vitro.
ao L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance ou molécule d'intérêt thérapeutique selon l'invention.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont plus particulièrement destinées au traitement et/ou à la prévention des déficiences dans le métabolisme des 2s lipides, ou dans les mécanismes impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
De telles compositions pharmaceutiques peuvent être formulées de manière classique en utilisant un ou plusieurs vecteurs ou excipients physiologiquement acceptables.
Ainsi, les composés d'intérêt thérapeutique selon l'invention, ainsi que leurs 3o sels et solvates physiologiquement acceptables, peuvent être formulés pour une administration par injection, inhalation ou encore par administration orale, buccale, parentérale ou rectale. Des techniques de préparation de compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être aisément retrouvées par l'homme du métier, par exemple dans l'ouvrage Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mead Publishing Co., Easton, PA, Etats-Unis.
Pour une administration systémique, on préférera l'injection, y compris les injections intramusculaires, intraveineuses, intrapéritonéales et sous-cutanées. Dans ce s cas, les compositions pharmaceutiques selon !'invention peuvent être formulées sous forme de solutions liquides, de préférence dans des solutions ou tampons physiologiquement compatibles.
PROCEDE DE DETECTION D'UNE ALTERATION DE LA TRANSCRIPTION DU
1o GENE ABCA7 HUMAIN
L'invention a en outre pour objet des procédés pour déterminer si un sujet présente un risque pour le développement d'une pathologie liée à un déficit dans le métabolisme des lipides, ou dans les processus impliquant le système immunitaire et is l'inflammation.
De telles méthodes comprennent la détection, dans des cellules d'un_ échantillon biologique provenant du sujet à tester, de la présence ou de l'absence d'une altération génétique caractérisée par une altération dans l'expression d'un gène dont l'expression est régulée par le promoteur de ABCA7.
2o A titre illustratif, de telles altérations génétiques peuvent être détectées afin de déterminer l'existence d'une délétion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence d'un acide nucléique régulateur d'ABCA7, de l'addition d'un ou plusieurs nucléotides ou encore de la substitution d'un ou plusieurs nucléotidiques dans ladite séquence SEQ ID
N°1,2,3ou6.
as Selon un mode particulier de réalisation d'un procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, l'altération génétique est identifiée selon une méthode comprenant le séquençage de tout ou partie de la séquence SEQ ID N°1, ou alternativement de tout ou partie d'au moins la séquence SEQ ID N°2.
3o Des amorces de séquençage peuvent être construites afin d'hybrider avec une région déterminée de la séquence SEQ ID N°1. De telles amorces de séquençage sont construites préférentiellement de manière à amplifier des fragments d'environ 300 à environ 500 nucléotides de la séquence SEQ ID N°1 ou d'une séquence complémentaire.
Les fragments amplifiés, par exemple par la méthode PCR, sont ensuite séquencés et la séquence obtenue est comparée à la séquence de référence SEQ
ID
s N°1 afin de déterminer si une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions de nucléotides sont retrouvées dans la séquence amplifiée à partir de l'ADN
contenu dans l'échantillon biologique provenant du sujet testé.
L'invention concerne donc encore un procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comportant les étapes suivantes io a) séquençage d'un fragment d'acide nucléique amplifiable à l'aide d'au moins une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence SEQ ID N°1 ou SEQ
ID N°2 selon l'invention;
b) aligner la séquence obtenue en a) avec la séquence SEQ ID N°1 ou la SEQ
ID N°2;
is c) déterminer la présence d'une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions d'au moins un nucléotide dans la séquence du fragment d'acide nucléique, par rapport à ia séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N° 2 de référence.
L'invention concerne également un kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant une ou 2o plusieurs amorces de séquençage capables de s'hybrider avec une région de la séquence SEQ ID No : 1, et ainsi de permettre le séquençage d'un polynucléotide localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7 chez le sujet à
tester.
En outre, font également partie de l'invention des sondes oligonucléotidiques 2s hybridant avec une région de la séquence SEQ ID N°1 ou de la séquence SEQ ID N° 2 dans laquelle une altération dans la séquence a été déterminée lors de la mise en oeuvre du procédé de détection décrit ci-dessus.
De manière alternative, font aussi partie de l'invention des sondes oligonucléotidiques hybridant spécifiquement avec une région correspondante de la 3o séquence SEQ ID N°1 ou de la séquence SEQ iD N°2, pour laquelle une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions d'au moins un nucléotide a été
déterminée chez un sujet.

De telles sondes oligonucléotidiques constituent des moyens de détection d'altérations dans la séquence régulatrice du gène ABCA7 et donc également des moyens de détection d'une prédisposition au développement d'une pathologie liée à un déficit dans le métabolisme des lipides ou à dysfonctionnement au niveau des s processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
L'invention a donc encore pour objet un kit ou nécessaire de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant:
a) une ou plusieurs amorces hybridant avec une région de la séquence SEQ
ID N°1 ou de la séquence SEQ ID N°2 ;
io b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification.
L'invention a encore pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant a) une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques telles que définies ci-dessus;
is b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation.
L'invention â également pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant une ou plusieurs sondes hybridant avec une région de la séquence SEQ ID No : 1 ou de la 2o séquence SEQ ID No : 2 permettant de quantifier l'ARN messager de ABCA7 dans un matériel biologique provenant dudit sujet à tester.
Les fragments d'acides nucléiques dérivés de rune quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 1-6 sont donc utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique régulatrice du gène 2s ABCA7 ou encore d'un fragment ou d'un variant (contenant une mutation ou un polymorphisme) de cette dernière dans un échantillon.
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 8 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué
des séquences SEQ ID NO 1-5, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
3o De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur de 10, 12, 15, i 8 ou 20 à 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un acide nucléique de séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID

5.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15, 18, 20, 25, 35, s 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ
ID N°1-5, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de io forte stringence définies ci-avant, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID NO 1-5, 6 ou 8 ou avec une séquence complémentaire de ces derniers.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène ABCA7 sont représentés ci-dessous.
II s'agit par exemple du couple d'amorces représenté par l'amorce de is séquence SEQ ID N°9 : AGCCAGCAACGCAATCCTCC et l'amorce de séquence SEQ
ID N°10: CGCACCATGTCAATGAGCCC.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des Zo techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al., (Methods Enzymol (1979) 68:90-98) ou de Brown et al. (Methods Enzymol (1979) 68:109-151 ), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett (1980) 22:
1859-1862) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EP

592.
2s Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs 30 (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotïne.

Le marquage des sondes est réalisé de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3' ou encore par « nick translation ».
Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques s sont décrits notamment dans le brevet français n° FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (Nucleic Acid Res (1988) 11: 4937 4957) ou Sanchez-pescador et al. (J Clin Mircrobiol (1988) 26(10) 1934-1938).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à perméttre une amplification du signal, telles 1o que les sondes décrites par Urdea et al. (Mol. Cell. BioG, (1991 ) 6 : 716-718), ou encore dans le brevet européen n° EP-0 225 807 (CHIRON).
Les sondes oligonuciéotides selon l'inventïon peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou bien de type northern à l'ARN.
is Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, 2o des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ci-avant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à
2s 1 ) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe ëventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon 30 l'invention, la ou les sondes oligonuclëotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oügonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.

L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nuclëique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites ci-dessus ;
s b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la rëaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
io Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à
l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides is nucléiques de séquences SEQ ID NO 1-5, 6 et 8 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N° 5,143,854, dans les demandes PCT
2o N° WO 90/150 70 et 92/10092.
Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été
immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US
N°5,412,087 et dans la demande PCT N°WO 95111995.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour 2s amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5, ou encore un variant de celui-ci.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de 3o séquences SEQ ID NO 1-5 ou un fragment ou un variant de celui-ci~contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes consistant à
a) mettre en contact l'échantillon, dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée, avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détecter des acides nucléiques amplifiés.
s Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-avant.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide 1o nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5 ledit nécessaire ou kit comprenant a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
is Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples ci-après.
La figure 1 est une représentation schématique des sites de facteurs de 2o transcription retrouvés chez l'homme et la souris au sein de la région promotrice des gènes ABCA7.
La figure 2 illustre la séquence SEQ ID N°1 et la position de chacun des motifs caractéristiques de fixation à différents facteurs de transcription est représentée en caractères gras, la désignation du facteur de transcription spécifique de la séquence 2s correspondante étant indiquée au-dessus de la séquence nucléotidique.
La figure 3 illustre la séquence SEQ ID N°4 et la position de chacun des motifs caractéristiques de fixation à différents facteurs de transcription est représentée en caractères gras, la désignation du facteur de transcription spécifique de la séquence.
correspondante étant indiquée au-dessus de la séquence nucléotidique.
3o La figure 4 illustre le pattern d'expression du gène ABCA7 humain sur des northern blots de différents tissus adultes et foetaux (Clontech) hybridés avec un amplimère réalisé avec les amorces SEQ ID N°9 et 10 (tableau 4).

La figure 5 illustre le pattern d'expression du gène ABCA7 murin sur un northern blot de différents tissus adultes hybridés avec un amplimère réalisé
avec des amorces spécifiques du transcrit murin.
La figure 6 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine s ABCA7 sur une coupe transversale d'artère enflammée, par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7.
La figure 7 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 sur une section de bronches d'une patiente asthmatique, par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7.
io La figure 8 représente le profil d'expression du gène codanf pour la protéine ABCA7 sur une section de colon d'un patient atteint de la maladie de Crohn, par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7.
La figure 9 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 sur une section de ganglion lymphatique, par hybridation in situ avec une sonde es antisens ABCA7.
La figure 10 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 d'une section de synovie d'une patiente atteinte d'arthrite rhumato'ide, par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7.
La figure 11 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine 2o ABCA7 sur une section de peau d'une patiente atteinte de psoriasis par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7.
EXEMPLES:
2s EXEMPLE 1 : Détermination de l'extrémité 5' du cDNA de ABCA7 Une amplification de l'extrémité du mRNA par RT-PCR (RACE) a été réalisée en utilisant le kit d'amplification SMART RACE cDNA (Clontech, Palo Alto, CA).
Des ARNm (polyA) extraits à partir des tissus humains de la rate ont été utilisés comme 3o matrice pour produire une banque de cDNA 5' SMART selon les instructions du constructeur. Les amorces de première amplification et les amorces internes ont été
choisies à partir de la séquence cDNA. Les amplifications réalisées avec les amorces internes d'amplification PCR ont été clonés. Des clones spécifiques ont été
ensuite amplifiés en utilisant des amorces dont les séquences sont respectivement (CAGGAAACAGCTATGAC) et (GCCAGTGTGATGGATAT) et séquencés sur les deux brins. Enfin les primers ABCA7 L1 GCGGAAAGCAGGTGTTGTTCAC (SEQ ID N° :i 1) et ABCA7L2 CGATGGCAGTGGCTTGTTTGG (SEQ ID N° :12) ont été utlisés pour s identifier l'extrémité du cDNA de ABCA7 humain.
EXEMPLE 2 : Analyse du promoteur des gènes ABCA7 humain et marin Le site d'initiation de la transcription a été situé sur les promoteurs des gènes io humain et marin de ABCA7 en utilisant les trois logiciels suivants: TSSG et TSSW
(Solovyev et al., Ismb (1997) 5, 294-302) et NNPP (Reese MG, et al., 1999).
Une prévision des sites de fixation des facteurs de transcription humains et marins a été
effectuée en utilisant le programme de recherche de motifs Matlnspector (Quandt et al., Nucl Acid Research (1995) 23(23) 4878-84). Le calcul des scores pour chaque site de 1s fixation des facteurs de transcription est effectué en utilisant la formule suivante : (Of-Tf)/(Tf)'~2, dans laquelle Of est la fréquence d'observation d'un motif et Tf est la fréquence calculée d'un motif consensus. Afin de séparer les motifs qui ne sont pas considérés comme pertinents, une première étape de filtration a été réalisé en ajustant le score « similarité de !a matrice >= du programme Matlnspector au dessus de 0,85 et Go le score « similarité du core » au dessus de 0,99. Enfin, une analyse comparative des promoteurs inter-espèces a ëté réalïsée selon ce qui est décrit par Werner T
(Models for prediction and recognition of eukaryotic promoters, Mammalian Genome (1999) 10:
168-175) afin de définir des modules de transcription comprenant des sites ayant un motif similaire et présents à la fois sur les séquences humaine et marine de la 2s séquence en amont du gène ABCA7.
EXEMPLE 3: Expression loréférentielle des Gènes ABCA7 humain et marin dans les tissus hématopoïétiques Le profil d'expression des polynucléotides selon la présente invention est déterminé selon les protocoles d'analyse de northern blot et de transcription inverse couplée à la PCR décrits notamment par Sambrook et al (ref. CSN Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). " Molecular Cloning : A Laboratory Manual, " 2"d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).
Par exemple, dans le cas d'une analyse par transcription inverse, un couple d'amorces synthétisées à partir de chacun des ADNc complets des gènes humain et s murin ABCA7 pour détecter les ADNc correspondants. Les séquences de ces amorces sont présentés dans le tableau 4.
La réaction de polymérase en chaîne (PCR) est réalisée sur des matrices d'ADNc correspondant à des ARNm polyA+ rétrotranscrits. La transcription inverse en ADNc est réalisée avec l'enzyme SUPERSCRIPT I( (GibcoBRL, Life Technologies) io selon les conditions décrites par le fabricant.
La réaction de polymérase en chaîne est réalisée selon des conditions standard, dans 20 p1 de mélange réactionnel avec 25 ng de la préparation d'ADNc. Le mélange réactionnel est composé de 400 pM de chacun des dNTP, de 2 unités de Thermus aquaticus (Taq) ADN polymérase (Ampli Taq Gold ; Perkin Elmer), de 0,5 pM
is de chaque amorce, de 2,5 mM MgCl2, et de tampon PCR. Trente cycles de PCR
dénaturation 30 s à 94 °C, hybridation de 30 s décomposé comme suit lors des 30 cycles : 64°C 2 cycles, 61 °C 2 cycles, 58°C 2 cycles et 55°C 28 cycles et une élongation d'une minute par kilobase à 72°C) sont réalisés après une première étape de dénaturation à 94°C durant 10 min dans un appareil thermocycler Perkin Elmer 20 9700. Les réactions de PCR sont visualisées sur gel d'agarose par électrophorèse. Les fragments d'ADNc obtenus peuvent être utilisés comme sondes pour une analyse par Northern blot et peuvent également être utilisés pour la détermination exacte de la séquence polynucléotidique.
Dans le cas d'une analyse par Northern Blot, une sonde d'ADNc produite 2s comme décrit ci-dessus est marquée au 32P grâce au système de marquage d'ADN
High Prime (Boehringer) selon les instructions indiquées par le fabricant.
Après marquage, la sonde est purifiée sur une microcolonne de Sephadex G50 (Pharmacia) selon les instructions indiquées par le fabricant. La sonde marquée et purifiée est alors utilisée pour la détection de l'expression des ARNm dans différents tissus.
3o Le northern blot contenant des échantillons d'ARN de différents tissus humains (Multiple Tissue northern ou MTN ; références (Human II, 7759-1, Human 7760-1, and Human Fetal II 7756-1, Clontech) est hybridé avec la sonde spécifique marquée désignée de ABCA7 (2637-4881 pb).

Le protocole suivi pour les hybridations et lavages peut étre soit directement celui décrit par le fabricant (Manuel .d'utilisation PT1200-1 ) soit une adaptation de ce protocole en utilisant les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (Currents Protocols in Molecular Biology, Green s Publishing Associates and Vl~iley Interscience NY (1989). On pourra ainsi faire varier par exemple les températures de préhybridation et d'hybridation en présence de formamide.
Par exemple on pourra utiliser le protocole suivant io i- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION
- Mélanger : 40N1 ADN sperme de saumon (l0mg/ml) + 40 ~I ADN placentaire humain (l0mglml) Is - Dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace le mélange.
- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
20 - Ajouter le mélange des deux ADN dénaturés.
- incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde marquée :
- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 NI ADN Cot I, selon la quantité de séquences répétées.
Dénaturer 7 à 10 mn à 95°C.
- Incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures.

- Oter le mélange de pré-hybridation.
- Mélanger 40 p1 ADN sperme de saumon + 40 NI ADN placentaire humain ;
dénaturer s 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace.
- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mélange formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.
io - Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation.
4- Lavages - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.
1s - 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1 %.
- 2 fois 15 minutes SSC 0,1X et SDS 0,1% à 65°C.
Après hybridation et lavage, le blot est analysé après une nuit d'exposition au ao contact d'un écran au phosphore révëlé à l'aide du Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Les résultats présentés à la figure 5 montrent que le gène ABCA7 de souris est exprimé dans les tissus adultes. Une quantité plus élevée d'ARNm ABCA7 mutin est détectée dans les tissus hématopoïétiques tels que la rate et le thymus, ce qui est 2s cohérent avec l'expression de ABCA7 qui a été observée dans les lignées myélomonocytaires et lymphocytaires. Aucune expression du gène ABCA7 n'a été
détectée dans les lignées cellulaires fibroblastiques.
La figure 4 montre un pattern d'expression similaire du gène ABCA7 humain avec toutefois un fort signal d'hybridation dans le foie foetal.
EXEMPLE 4: Analyse du profil d'expression aéniaue pour les dysfonctionnements dans le métabolisme des lipides, ou dans la signalisation de l'inflammation La vérification de l'altération du niveau d'expression du gène ABCA7 peut-être déterminé par hybridation de ces séquences avec des sondes correspondant aux ARNm provenant de tissus hématopoïétiques de sujets atteints ou non, selon les s méthodes décrites ci-dessous 1. Préparation des ARN totaux, des ARNm poly(A)+ et de sondes de cDNA
Les ARN totaux sont obtenus à partir de tissus hématopoïétiques de sujets io normaux ou bien atteints par la méthode à l'isothiocyanate de guanidine (Chomczynski et al., Anal Biochem (1987) 162:156-159). Les ARNm poly(A)+ sont obtenus par chromatographie d'affinité sur colonnes d'oligo(dT)-cellulose (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratôry manual. 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New York)et les cDNA utilisés comme sondes sont obtenus par RT-PCR
is (DeRisi et al., Science (1997) 278: 680-686) avec des oligonucléotides marqués avec un produit fluorescent (Amersham Pharmacia Biotech ; CyDyeTM).
2. Hydridation et détection des niveaux d'expressions 2o Les lames de verre contenant les séquences selon la présente invention correspondant au gène ABCA7 sont hydridées avec les sondes nucléotidiques préparées à partir de l'ARN messager de la cellule à analyser. L'utilisation du système Amersham/molecular Dynamics (Avalanche MicroscannerT"") permet la quantification différentielle des expressions des produits de séquences sur le type cellulaire sain ou 2s affecté.
EXEMPLE 5: Test destiné au criblage de molécules activant ou inhibant l'expression du Gène ABCA7.
3o Le test de criblage permet d'identifier une substance susceptible de moduler l'activité de synthèse de la protéine ABCA7.

5.1 Construction des plasmides d'expression contenant un acide nucléique régulateur du gène ABCA7 humain.
La région de l'acide régulateur du gène ABCA7 humain allant du nucléotide en position -1111 jusqu'au nucléotide en position -1, par rapport au site d'initiation de la s transcription, peut être amplifiée par la technique PCR à l'aide du couple d'amorces spécifiques de la région décrite ci-dessus à partir d'ADN génomique humain présent dans un vecteur BAC d'une collection de vecteurs BAC humains.
Le fragment d'ADN amplifié est digéré par l'endonucléase de restriction Sal 1, puis insëré dans le vecteur PXP1 décrit par Nordeen et al. (Bio Techniques, (1988) 6 io 454-457), au niveau du site de restriction Sal 1 de ce vecteur. L'insert a ensuite été
séquencé.
5.2 Culture cellulaire et transfection Des cellules de la lignée CHO ou HELA (ATCC, Rockville, MD, USA) ont été
is mises en culture dans le milieu E-MEM (Minimun Essential Medium with Earle's Salts) additionné de 10% (v/v) de sérum de veau foetal (BioWhittaker, Walkersville, MD).
Approximâtivement 1,5 X 105 cëllules ont été distribuées dans chacun des puits d'une plaque de culture de 12 puits (2,5 cm), et ont été cultivées jusqu'à environ 50-70% de confluence, puis co-transformées avec 1 ~,g du plasmide Sal-Lucif et 0,5 ~,g du vecteur 2o témoin pBetagal (CIoneTech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA) en utilisant le nécessaire Superfectin Reagent Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). Deux heures après l'addition de l'ADN, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu complet AMEM (Minimum Esential Medium Eagle's Alpha Modification), Après une durée de vingt heures, les cellules sont placées dans du milieu frais de type DMEM
as (Dulbecco's Minimum Essential Medium) additionné de 2 ~,g/ml de glutamine, unités/ml de streptomycine et de 0,1 % de sérumalbumine bovine (BSA, Fraction V), en présence ou non de molécules à différentes concentrations.
Les cellules sont récupérées 16 heures après le dernier changement de milieu en utilisant une solution de lyse (Lysis Solution) provenant du nécessaire Tropix 3o Luciferase Assay Kit (Tropix Inc., Bedford, MA, USA). Le lysat cellulaire est divisé en fractions aliquotes qui sont utilisées pour quantifier les protéines en utilisant le nécessaire MicroBCA Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) ainsi que pour quantifier la production de luciférase et de béta-galactosidase en utilisant respectivement les nécessaires Tropix Luciferase Assay Kit et Galacto-Light Plus Kit. Les tests sont réalisés selon les recommandations du fabricant. Les molécules actives sur le promoteur ABCA7 sont ensuite sélectionnées en fonction du ratio « activité
luciférase/activité beta-galactosidase.
s EXEMPLE 6 : Ex_periences d'hybridation in situ.
Des échantillons de tissus concernés dans la paraffine ont été hybridés avec des sondes ARN complémentaires marquëes radioactives. Plus précisément, un io fragment du gène ABCA7 correspondant à la séquence nucléotidique allant du nuclëotide 594 au nucléotide 1055 de la séquence GenBank désignée NM-019112 a été sous clonée dans la plasmide pCRll (Invitrogen).
Des sondes ARN antisens marquées à l'Uridine triphosphate 35S ont été
ensuite générées avec les ARN polymerases SP6 et T7, puis hybridées aux différentes 1s sections tissulaires.
Les différentes sections de tissus ont été digérées avec la protéinase K et hybridées avec les sondes prëcédemment décrites à une concentration égale à
environ 3,5xi 0' dpm/ml pendant 18 heures à 65°C. Les lames ont été ensuite traitées avec de l'ARNase A et lavées dans du SSC, 0,1X à 70°C pendant 2 heures, et ont été
2o recouvertes d'une émulsion photographique Kodak NTB-2, exposées pendant 7 jours à
4°C, puis révélées en utilisant une solution Kodak D-19.
Elles ont été enfin colorées à l'hématoxyline et l'éosine (H&E) et les images ont été réalisées en utilisant une caméra photo digitale DVC couplée à un microscope Nikon.
2s La figure 6 est une coupe de l'artère d'un homme de 92 ans ayant subi une amputation au-dessous du genou, et présentant de l'artériosclérose ainsi qu'une inflammation aiguë. On observe un faible marquage spécifique des macrophages dans les.thrombus et dans le site d'infiltration inflammatoire dans la tunique adventice.
La figure 7 qui est une section de bronches prélevées lors de l'autopsie d'une 3o femme asthmatique âgée de 63 ans, montre un faible marquage des lymphocytes et des macrophages dans l'infiltrat inflammatoire sous-muqueux.
La figure 8 est une section de colon prélevé au cours de l'opération d'une femme de 81 ans présentant un diagnostic clinique de la maladie de Crohn. On observe un marquage des macrophages et d'une sous-famille de lymphocytes dans la lamina propria.
La figure 9 correspond à une coupe d'un ganglion lymphatique prélevé au cours de l'opération d'un homme âgé de 48 ans. Dans le centre germinatif réactif, les s cellules ganglionnaires sont faiblement marquées, et des macrophages isolés sont également marqués dans le ganglion lymphatique.
La figure 10 qui représente une coupe de la synoviale d'une femme de 25 ans présentant un diagnostic clinique d'arthrite rhumatoïde, montre un fort marquage des histiocytes sous synoviaux et des macrophages.
io La figure 11 qui représente une section de peau obtenue suite à la biopsie d'une femme de 55 ans atteinte de psoriasis, montre un marquage moyen des macrophages dans l'infiltrat inflammatoire périvasculaire. Des lymphocytes isolés périvasculaires sont également marqués.

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~~z°~°~zv zu.û i °~d zUU ~
a m U n u.m-. c.9 = a m U n m u. t9 z Tableau 4 Oliaonucleotides specifiaues du cène A.BC-A7 humain.
~orn S uence (5'-3') Orientation ABCA7 CTTCAGCCCC-ACCC-TTG Sense ABCA7 AGAATTTCATGTATCGCC Sense AJ

ABCA7 CGATGGCAGTGGCTTGTTTGG Antisense ABCA7_L1 GCGGAAAGCAGGTGTTGTTCACAnsense A~ CTGGAGTTGCTGTCAGAG Sense _ GGGTAAAAGGTGTATCTGG Antisense ABC~17_AK-ABCA7_AN TCACGAGGACCAATAAGATC Sense ABCA7 fiGTCAGTGTCACGGAGTAG Antisense AM

ABCA7 CCTGGAAGCTGTGTGC Sense AP

ABCA7_AO ACGGAGACGCCAGGAC Antisense ABCA7 GTCCTGGCGTCTCCGTTC Sense AR

AQ CTCGTCCAGGATAACAAC Antisense _ GTGCTGCCCTACACGG Sense AT

_ CAGTGCCCAGCCCTGTAC Antisense AS

_ ACCCCAGAGTCTCCATCC Sense AV

_ GAGAAGCCTCCGTATCTGAC Antisense AU

_ CTGCTCTCCTGCTGTTGC Sense A~

_ GCACCATGfiCAATGAGCC Antisense AVd _ CCTCAGCATGGGATACTG Sense AZ

ABCA7 GCTTGCGTTTGTTCCCTC Antisense AY

BA ACCACGGCTTCTCTCC Antisense _ AGCCAGCAACGCAATCCTCC Sense ABCAi Q

ABCA7 CGCACCATGTCAATGAGCCC .Antisense R

ABCA7~I13TGAAGACGTGCGGTGCG ,Antisense AgCA7~L~ TGTCTCCGGCGATACATGAAATTCAntisense ABCA7'I,5ACCTCAGACCCAGACCCTTACGCAntisense U4 GGAATGAGGTTCAGAAAGGG Sense ABCA7' _ ATGCAAGTTCCCTGGGAGTTAGSense ABCA7_U5 ABCA7 CTCCTTCCGGTGAATGTTGACGSense LISTE DE SEQL'ENCES
<110> AVENTIS PHARMA SA r INSERM
<120> ACIDE NtJCLET_QUE RÉGULATEUR DU GENS ABCA7, MOLECTJ-LES
MODULANT SON ACTIVITÉ ET APPLICATIONS THÉRAPEUTIQUES
<130> promoteur ABCA7 <140>
<141>
<160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2322 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 1 aaaacctctg tttgtacgaa gagaaggtgg ccaagagagt tggcgtcgat gagggcgtgc 60 tttgctttga tgcttttgtg gggagagagg aggtcttggg ggatgggggg atcaagggga 120 aaatgtccac ctcaccattg ggaggaggag caaaagctga agccacaggt gagtctgggt 180 ggaatgaatg atttgaaggg ccgggacttg gggtagaggg agaggctggg cttcctggcc 240 atttggagaa gaggcagttc cctcaaatgc cccccatgcg ctttggctgc actctacctt 300 acagcgcaag tctcgtggcc tcagcctgga tgtctccccg ttggcgaact cctatttatc 360 ctcaaagccc caacggcaat gccacctcct gccgcgggag ccgtccccac gcctctcact 420 ctccccagcg ccttcaaagc tgtggaccca cacgctccca tttcagçttc acctccagcc 480 tgaagagttt atttcaactc ttcttccaga gtgggaaacg ggttttcctc aaaatcaggg 540 tagccactat aatcggagac tctagaatgt tggccccctc cccctcctgc catcctctgc 600 agaagccgag gagcgttcgt ggaatgaatg aatgaacgaa tgatctagtg gaacccctac 660 , tttacagacg gacgagtgta gtcccagagt ctggactaaa ctagagggag cctggccagc 720 cccggggaca gcggggacag agggaactcc tgcaattcgg,agctgcggta ttgcagccgg 780 ttatacaacg tggggaggca gcctggctcc ccaaagacag cgcagcctcg ttcccggagg 840 gcggcctgcc tgggacctgc cgggcactcc gccaccctac ggtgatgcag caagagccgc 900 gcggtccctt taagaaaccc ggctaggcga ggcccttctg tgatcccgtc tcctcccttg 960 gcccgcgcag ctccgacgga gcaggccagt gagtgacggg.caggtcgccc aatagcagcg 1020 tgcagaggca ggggcgtgcc ccggcgctgc tacctgcgcg-ggcaagctca gcgcacttgg 1080 cttaaggggc ggcgcgctcc ctgcctgctg ctgggcggag ggaaggcggc aagagctgcg 1140 gagcccctgg aaggtgagaa ggactcggag agggaagaag gcccgagact cgagaatgcg 1200 gggttggggc cgggagggat gcaagttccc tgggaattag-ggggtccagc ctctgacctc 1260 cttccggtga atgttgacga cggctgaatt gatcactgat tctcaagggg ggcatcggac 1320 atctgggacc cttaagaggg cctttgccga tcacacacct geagccccct gcccgttaga 1380 actcctgcac tcccccttgc cccgtcttac aa~tggagaa actgagccca ctcccccaga 1440 tcctaagtcc cgcttgatgt aaaggaaaga accctggcgt aagggtctgg~gtctgaggtc 1500 ccagttccgg cctggtcacc tttagcaact tcctgcccct ctgtcagcgt cagattctcc 1560 atctgtgtca gaggtggacc ggcccaagga aaatag~tca ggaatcgctg actccaggag 1620 tctctatccc agcccctt~cg cctgactctt tctctggctc~ccgcggtccc tctgagcg'at 1680 taatgctaca taaggtgtgg gcagagctgg ggtcgtgcct ccagctgggc aactgcctgt 1740 ctctctgggt gcctgggttt gctttcttgg gcctcggttt ccacttctgt agagtggggt 1800 gatagtccag cacttcccct gggcgtgtga aatgtccagc actgccaata ttcgttgctg 1860 ttatcttcgg agaacagtga ggggaaagga atccttgcct gggctgggcc aggcaggagg 1920 ctgggggtca ggacctggaa gaggcttcca ggtgaggctt ggggtggagc ctggtgacga 198C
aagcgttaag cccaaactcg gtccctggag gattagagga tgatctttaa gtccccagct 2040 gtcagccctg ctcagagcga cagtcctggc agccaatcag atgcgaggac ggctgcgggt 2100 tgcgctccca ttggtttact ccacccctgg ggtagcggag cctctttatc gagtgactac 2160 tgtttgcctc gctctaatca gagcttccag gaaccctgcg ctgtgggata aaggaatgag 2220 gttcagaaag gggcagggag ttgcccgcag ccgcaccgca cgtcttcagc ccgaccgttg 2280 tcctgacctc tctgtcccgt cccctgccca gtctcaccat gg 2322 <210> 2 <211> 1111 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 2 aaaacctctg tttgtacgaa gagaaggtgg ccaagagagt tggcgtcgat gagggcgtgc 60 tttgctttga tgcttttgtg gggagagagg aggtcttggg ggatgggggg atcaagggga 120 aaatgtccac ctcaccattg ggaggaggag caaaagctga agccacaggt gagtctgggt 180 ggaatgaatg atttgaaggg ccgggacttg gggtâgaggg agaggctggg cttcctggcc 240 atttggagaa gaggcagttc cctcaaatgc cccccatgcg ctttggctgc actctacctt 300 acagcgcaag tctcgtggcc tcagcctgga tgtctccccg ttggcgaact cctatttatc 360 ctcaaagccc caacggcaat gccacctcct gccgcgggag ccgtccccac gcctctcact 420 ctccccagcg ccttcaaagc tgtggaccca cacgctccca tttcagcttc acctccagcc 480 tgaagagttt atttcaactc ttcttccaga gtgggaaacg ggttttcctc aaaatcaggg 540 tagccactat aatcggagac tctagaatgt tggccccctc cccctcctgc catcctçtgc 600 agaagccgag gagcgttcgt ggaatgaatg aatgaacgaa tgatctagtg gaacccctac 660 tttacagacg gacgagtgta gtcccagagt ctggactaaa ctagagggag cctggccagc 720 cccggggaca gcggggacag agggaactcc tgcaattcgg agctgcggta ttgcagccgg 780 ttatacaacg tggggaggca gcctggctcc ccaaagacag cgcagcctcg ttcccggagg 840 gcggcctgcc tgggacctgc cgggcactcc gccaccctac ggtgatgcag caagagccgc 900 gcggtccctt taagaaaccc ggctaggcga ggcccttctg tgatcccgtc tcctcccttg 960 gcccgcgcag ctccgacgga gcaggccagt gagtgacggg caggtcgccc aatagcagcg 1020 tgcagaggca ggggcgtgcc ccggcgctgc tacctgcgcg ggcaagctca gcgcacttgg 1080 cttaaggggc ggcgcgctcc ctgcctgctg c. 1111 <210> 3 <211> 1211 <212> ADN
<213>.Homo sapiens <400> 3 tgggcggagg gaaggcggca agagctgcgg agcccctgga aggtgagaag gactcggaga 60 gggaagaagg cccgagactc gagaatgcgg ggttggggcc gggagggatg caagttccct 120 gggaattagg gggtccagcc tctgacctcc ttccggtgaa tgttgacgac ggctgaattg 180 atcactgatt ctcaaggggg gcatcggaca tctgggaccc ttaagagggc ctttgccgat 240 cacacacctg cagccccctg cccgttagaa ctcctgcact cccccttgcc ccgtcttaca 300 aatggagaaa ctgagcccac tcccccagat~cctaagtccc gcttgatgta aaggaaagaa 360 ccctggcgta agggtctggg tctgaggtcc cagttccggc ctggtcacct ttagcaactt 420 cctgcccctc tgtcagcgtc agattctcca tctgtgtcag aggtggaccg gcccaaggaa 480 aatagatcag gaatcgctga ctccaggagt ctctatccca gccccttcgc ctgactcttt 540 ctctggctcc cgcggtccct ctgagcgatt aatgctacat aaggtgtggg cagagctggg 600 gtcgtgcctc cagctgggca actgcctgtc tctctgggtg cctgggtttg ctttcttggg 660 cctcggtttc cacttctgta gagtggggtg atagtccagc acttcccctg ggcgtgtgaa 720 atgtccagca ctgccaatat tcgttgctgt tatcttcgga gaacagtgag gggaaaggaa 780 tccttgcctg ggctgggcca ggcaggaggc tgggggtcag gacctggaag aggcttccag 840 gtgaggcttg gggtggagcc tggtgacgaa agcgttaagc ccaaactcgg tccctggagg 900 attagaggat gatctttaag tccccagctg tcagccctgc tcagagcgac agtcctggca 960 gccaatcaga tgcgaggacg gctgcgggtt gcgctcccat tggtttactc cacccctggg 1020 gtagcggagc ctctttatcg agtgactact gtttgcctcg ctctaatcag agcttccagg 1080 aaccctgcgc tgtgggataa aggaatgagg ttcagâaagg ggcagggagt tgcccgcagc 1140 cgcaccgcac gtcttcagcc~cgaccgttgt cctgacctct.ctgtcccgtc ccctgcccag 1200 tcteaccatg g <210>4 <211>2291 <212>A17N

<213>Mus musculus <400> 4 aaaacaaaaa aaaaaacaaa aacaaaacaa aaacaaaaac aataaaaacc tctgtttcta 60 agagtaaagt acattcctga gtttggccgt gatggagggg gcgctgtcta gaagcaaggt 120 gcaagccctg cacaaaagtt agggagaagg cgagaaacag acacagttga atgaatgatg 180 _ tgagatagat cggggctagg gtggagaaag aggctgagtc tccctcacca gcttccttcg 240 aactcctatg catctgcaaa accccaactt ctaaggcccc ctaactcacg cttgccaggg 300 tgatctacac ccatctccct ctatgctttg tgaaataaac cagttttttt tttccagagt 360 aggagacatc tgagaatctt gcctacaatc caggcaacta ttgattctaa tcttaggata 420 ttgggctgcc acctgattct gaaattgtct agaccagagg atgttgctaa aatgaatgtg 480 caggtccttg aagctctact ttggagatga gctcacagag gctgtggtac aattctggct 540 ggtggcagga gatggcacag gatacaaaga ccttgtgcaa accttccgac ctaaacttgg 600 tctttgcctg aggtcccaca tcatggtagg caagaataga ctccaggaaa tggtcctctg 660, acctccacag atatgccatg catgcatgtg tcctacccta ataagcaaat taattaaatt 720 taaaaacaaa ggttacttgt ggtggcacac gcctttaatc ccagcactca ggaggcagag~780 gcaggcggat ctctgtgaga ccagcctggt ctaagcagtg atttccaggc ctaccacagc~840 agtgtgagcc actctcaaaa ttaaaaagta tttttaaaaa ggagtccttg gggagaggag 900 acaggaatgt cttgctgtgg ggagctgcca tttcaagatg tgaactcaca ggtgacccgt 960 tgtccccctc tttgtcgtgt cccagtgaag ccaaactgat gcagcaggaa tcctgttgtc 1020 cctttaagaâ acccggctcg gagaggcggg ctgtggtccc gcctcctcca atggcaaagt 10'80 cgcctgagta gcaggtgcaa tatccaatag tagcgttagg gggcggggct gggtgctcct 1140 tagggcaccg ggttgcgaag ggcgtcgtcc gcaattgagc ggggctccac ttaaaggggc 1200 cgcgctcccc cgccgaggcc gagaggagcg aaagtggatg gagtttgggg gcctcagaac 1250 ggtgagaaaa tccccgagag ggtggaaggt ggagcctgga gatctgggga tgctgtgggg 1320 tgagggtggg ctgagccacg ttccctgata atttggggtt ccaggtgcct actctccctt 1380 gcccttcctt atccttccgg ggagtgtggg aaaaatggac caccgatcct cacagcggtc 1440 atctggtcac ctcgagggac ctctgccaac ctacacctcc agtgtcccac tttccaaatg 1500 aggcctgtca ccccccaccc cccagatctc aaatttcact ttatgaaaga aaaaagtccc 1560 cgagtggaag ccgccaattt ccatgtagat ggttaaactt tggcaâtttc cctctctgtc 1620 agcctcagtt tccctatcgg tatcatgaag caggccacag gcatacagtt ccggggggaa 1680 ataaaataac gaaatcagga atggcgtgct caaggagcct gtccctgact cctcctagcc 1740 ggcggtcttc tgtaccctcc ttttgactcc ggagggcggg ccctccttct tctctggttt 1800 ccttgggagc gtgactttgc ccctttttga gcctcagttc ccatctctta aaaaatagaa 1860 ggccagctgc aaatgacaca gactccgggt ctcaccgggg gccacctggg gcgaacggaa 1920 ccgagacccc ggtctggtat gaggctgacc gtggagçccc gagccccaag ccccaagctt 1980 taaacccaag ctccgccccc taagaatgca aacagggtct tccagacccc agccttcatc 2040 gatagccctt ccagccaatc agctacgagg acggctgcgc gccgggttcc cattggtcac 2100 ttccctagtg aatttctttc tatggtgcct tgtttgccgg gctctttgcg ggagatttat 2160 tgaggctcag cccgatgttc ggaaggatga ggatcâgaga cccgcagaca tttgtctgga 2220 gccacacagc tcactctcag ccttttcttt gtcctgtcct ctccgctgtt tccggtcçag 2280 agtcatcatg g <210>5 <211>1220 <212>ADN

<213>Mus musculus <400> 5 aaaacaaaaa aaaaaacaaa aacaaaacaa aaacaaaaac aataaaaacc tctgtttcta 60 agagtaaagt acattcctga gtttggccgt gatggagggg gcgctgtcta gaagcaaggt 120 gcaagccctg cacaaaagtt agggagaagg cgagaaacag acacagttga atgaatgatg 180 tgagatagat cggggctagg gtggagaaag aggctgagtc tccctcacca gcttccttcg 240 aactcctatg catctgcaaa accccaactt ctaaggcccc ctaactcacg cttgccaggg 300 tgatctacac ccatctccct ctatgctttg tgaaataaac cagttttttt tttccagagt 360 aggagacatc tgagaatctt gcctacaatc caggcaacta ttgat~tctaa tcttaggata 420 ttgggctgcc acctgattct gaaattgtct agaccagagg atgttgctaa aatgaatgtg 480 caggtccttg aagctctact ttggagatga gctcacagag gctgtggtac aattctggct 540 ggtggcagga gatggcacag gatacaaaga ccttgtgcaa accttccgac ctaaacttgg 600 tctttgcctg aggtcccaca tcatggtagg caagaataga ctccaggaaa tggtcctctg 660 acctccacag atatgccatg catgcatgtg tcctacecta ataagcaaat taattaaatt 720 taaaaacaaa ggttacttgt ggtggcacac gcctttaatc ccagcactca ggaggcagag 780 gcaggcggat ctctgtgaga ccagcctggt ctaagcagtg atttccaggç ctaccacagc 840 agtgtgagçc actctcaaaa ttaaaaagta tttttaaaaa ggagtccttg gggagaggag 900 acaggaatgt cttgctgtgg ggagctgcca tttcaagatg tgaactcaca ggtgacccgt 960 tgtccccctc tttgtcgtgt cccagtgaag ccaaactgat gcagcaggaa tcctgttgtc 1020 cctttaagaa acccggctcg gagaggcggg ctgtggtccc gcctcctcca atggcaaagt 1080 cgcctgagta ~gcaggtgcaa tatccaatag tagcgttagg gggcggggct gggtgctcct 1140 tagggcaccg ggttgcgaag ggcgtcgtcc gcaattgagc ggggctccac ttaaaggggc 1200 cgcgctcccc cgccgaggcc : 1220 <210>6 ' <211>1273 <212>ADN

<213>Homo sapiens <400> 6 tgggcggagg gaaggcggca agagctgcgg agcccctgga aggtgagaag gactcggaga 60 gggaagaagg cccgagactc gagaatgcgg ggttggggcc gggagggatg caagttccct 120 gggaattagg gggtccagcc tctgacctcc ttccggtgaa tgttgacgac ggctgaattg 180 atcactgatt ctcaaggggg gcatcggaca tctgggaccc ttaagagggc ctttgccgat 240 cacacacctg cagccccctg cccgttagaa ctcctgcact cccccttgcc ccgtcttaca 300 aatggagaaa ctgagcccac tcccccagat cctaagtccc gcttgatgta aaggaaagaa 360 ccctggcgta agggtctggg tctgaggtcc cagttccggc ctggtcacct ttagcaactt 420 cctgçccctc tgtcagcgtc agattctcca tctgtgtcag aggtggaccg gcccaaggaa 480 aatagatcag gaatcgctga ctccaggagt ctctatccca gccccttcgc ctgactcttt 540 ctctggctc'c cgcggtccct ctgagcgatt aatgctacat aaggtgtggg cagagctggg 600 gtcgtgcctc cagctgggca actgcctgtc tctctgggtg cctgggtttg ct.ttcttggg 660 cctcggtttc cacttctgta gagtggggtg atagtccagc acttcccctg ggcgtgtgaa 720 atgtccagca ctgccaatat tcgttgctgt tatcttcgga gaacagtgag gggaaaggaa 780 tccttgcctg ggctgggcca ggcaggaggc tgggggtcag gacctggaag aggcttccag 840 gtgaggcttg gggtggagcc tggtgacgaa agcgttaagc ccaaactcgg tccctggagg 900 attagaggat gatctttaag tccccagctg tcagccctgc tcagagcgac agtcctggca 960 gccaatcaga tgcgaggacg gctgcgggtt gcgctcccat tggtttactc cacccctggg 1020 gtagcggagc ctctttatcg agtgactact gtttgcctcg ctctaatcag agcttccagg 1080 aaccctgcgc tgtgggataa aggaatgagg ttcagaaagg ggcagggagt tgcccgcagc 1140 cgcaccgcac gtcttcagcc cgaccgttgt cctgacctct ctgtcccgtc ccctgcccag 1200 tctcaccatg gccttctgga cacagctgat gctgctgctc tggaagaatt tcatgtatcg 1260 ccggagacag ccg <210> 7 <211> 22 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 7 Met A1a Phe Trp Thr Gln Leu Met Leu Leu Leu Trp Lys Asn Phe Met 1 . 5 10 15 Tyr Arg Arg Arg Gln Pro <210> 8 <211> 7795 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 8 tgggcggagg gaaggcggca agagctgcgg agcccctgga aggtgagaag gactcggaga 60 gggaagaagg cccgagactc gagaatgcgg ggttggggcc gggagggatg caagttccct 120 gggaattagg gggtccagcc tctgacctcc ttccggtgaa tgttgacgac ggctgaattg 180 atcactgatt ctcaaggggg gcatcggaca tctgggaccc ttaagagggc ctt.tgccgat 240 Cacacacctg cagccccctg cccgttagaa ctcctgcact cccccttgcc ccgtcttaca 3,00 aatggagaàa ctgagcccac tcccccagat cctaagtccc gcttgatgta aaggaaagaa 360 ccctggcgta agggtctggg tctgaggtcc cagttccggc ctggtcacct ttâgcaactt 420 cctgcccctc tgtcagcgtc agattctcca tctgtgtcag aggtggaccg gcccaaggaa 480 aatagatc.ag gaatcgctga~ctccaggagt ctctatccca gccccttcgc ctgactcttt 540 ctctggctcc cgcggtccct ctgagcgatt aatgctacat aaggtgtggg cagagctggg 600 gtcgtgcctc cagctgggca actgcctgtc tctctgggtg cctgggtttg ctttcttggg 660 çctcggtttc cacttctgta gagtggggtg atagtccagc acttcccctg ggcgtgtgaa 720 atgtccagca ctgccaatat tcgttgçtgt tatcttcgga gaacagtgag gggaaaggaa 780 tccttgcctg ggctgggcca ggcaggaggc tgggggtcag gacctggaag 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cccaccacct 4200 ggatgaggca gagctgctgg gagaccgtgt ggccgtggtg gcaggtggcc gcttgtgctg 4260 'ctgtggctcc ccactcttcc tgcgccgtca cctgggctcc ggctactacc tgacgctggt 4320 gaaggcccgc ctgcccctga ccaccaatga gaaggctgac actgacatgg agggcagtgt 4380 ggacaccagg caggaaaaga agaatggcag ccagggcagc agagtcggca ctcctcagct 4440 gctggccctg gtacagcact gggtgcccgg ggcacggctg gtggaggagc tgccacacga 4500 gctggtgctg gtgctgccct acacgggtgc ccatgacggc agcttcgcca cactcttccg 4560 agagctagac acgcggctgg cggagctgag gctcactggc tacgggatct ccgacaccag 4620 cctcgaggag accttcctga aggtggtgga ggagtgtgct gcggacacag atatggagga 4680 tggcagctgc gggcagcacc tatgcacagg cattgctggc ctagacgtaa ccctacggct x740 ,caagatgccg ccacaggaga cagcgctgga gaacggggaa ccagctgggt cagccccaga 4800 gactgaccag ggctctgggc cagacgccgt gggccgggta cagggctggg cactgacccg 4860 ccagcagctc caggccctgc ttctcaagcg ctttctgctt gcccgccgca g~cgccgcgg 4920 cctgttcgcc cagatcgtgc.tgcctgccct ctttgtgggc ctggccctcg tgttcagcct x980 catcgtgcct cctttcgggc actacccggc tctgcggctc agtcccacca tgtacggtgc 5040

8 tcaggtgtcc ttcttcagtg aggacgcccc aggggaccct ggacgtgccc ggctgctcga 5100 ggcgctgctg caggaggcag gactggagga gcccccagtg cagcatagct cccacaggtt 5160 ctcggcacca gaagttcctg ctgaagtggc caaggtcttg gccagtggca actggacccc 5220 agagtctcca tccccagcct gccagtgtag ccggcccggt gcccggcgcc tgctgcccga 5280 ctgcccggct gcagctggtg gtccccctcc gccccaggca gtgaccggct ctggggaagt 5340 ggttcagaac ctgacaggcc ggaacctgtc tgacttcctg gtcaagacct acccgcgcct 5400 ggtgcgccag ggcctgaaga ctaagaagtg ggtgaatgag gtcagatacg gaggcttctc 5460 gctggggggc cgagacccag gcctgccctc gggccaagag ttgggccgct cagtggagga 5520 gttgtgggcg ctgctgagtc ccctgcctgg cggggccctc gaccgtgtcc tgaaaaacct 5580 cacagcctgg gctcacagcc tggatgctca ggacagtctc aagatctggt tcaacaacaa 5640 aggctggcac tccatggtgg cctttgtcaa ccgagccagc.aacgcaatcc tccgtgctca 5700 cctgccccca ggcccggccc gccacgccca cagcatcacc acactcaacc aecccttgaa 5760 cctcaccaag gagcagctgt ctgaggctgc actgatggcc tcctcggtgg acgtcctcgt 5820 ctccatctgt gtggtctttg ccatgtcctt tgtcccggcc agcttcactc ttgtcctcat 5880 tgaggagcga gtcacccgag ccaagcacct gcagctcatg gggggcctgt cccccaccct 5940 ctactggctt ggcaactttc tctgggacat gtgtaactac ttggtgccag catgcatcgt 6000 ggtgctcatc.tttctggcct tccagcagag ggcatatgtg gcccctgcca acctgcctgc 6060 tctcctgctg ttgctactac tgtatggctg gtcgatcaca ccgctcatgt acccagcctc 6120 cttcttcttc tccgtgccca gcacâgccta tgtggtgctc acctgcataa acctctttat 6180 tggcatcaat ggaagcatgg ccacctttgt gcttgagctc ttctctgatc agaagctgca 6240 ggaggtgagc cggatcttga aacaggtctt ccttatcttc ccccacttct gcttgggccg 6300 ggggctcatt gacatggtgc ggaaccaggc catggctgat gcctttgagc gcttgggaga 6360 caggcagttc cagtcacccc tgcgctggga ggtggtcggc aagaacctct tggccatggt 6420 gatacagggg cccctcttcc ttctcttcac actactgctg cagcaccgaa gccaactcct 6480 gccacagccc agggtgaggt ctctgccact cctgggagag gaggacgagg atgtagcccg 6540 tgaacgggag cgggtggtcc aaggagccac ccagggggat gtgttggtgc tgaggaactt 6600 gaccaaggta taccgtgggc agaggatgcc agctgttgac cgcttgtgcc tggggattcc 6660 ccctggtgag tgttttgggc tgctgggtgt gaatggagca gggaagacgt ccacgtttcg 6720 catggtgacg ggggacacat tggccagcag gggcgaggct gtgctggcag gccacagcgt 6780 ggcccgggaa cccagtgctg cgcacctcag catgggatac tgccctcaat ccgatgccat 6840 ctttgagctg ctgacgggcc gcgagcacct ggagctgctt gcgcgcctgc gcggtgtccc 6900 ggaggcccag gttgcccaga.ccgctggctc gggcctggcg cgtctgggac tctcatggta 6960 cgcagaccgg cctgcaggca cctacagcgg agggaacaaa cgcaagctgg cgacggccct 7020 ggcgctggtt ggggacccag ccgtggtgtt tctggacgag ccgaccacag gcatggaccc 7080 cagcgcgcgg cgcttccttt ggaacagcct tttggccgtg gtgcgggagg gccgttcagt 7140 gatgctcacc tcccatagca tggaggagtg tgaagcgctc tgctcgcgcc tagccatcat 7200 ggtgaatggg cggttccgct gcctgggcag cccgcaacat ctcaagggca gattcgcggc 7260 gggtcacaca ctgaccctgc gggtgcccgc cgcaaggtcc cagccggcag cggccttcgt 7320 ggcggccgag ttccctgggt cggagctgcg cgaggcacat ggaggccgcc tgcgcttcca 7380 gctgccgccg ggagggcgct gcgccctggc gcgcgtcttt ggagagctgg cggtgcacgg 7440 cgcagagcac ggcgtggagg acttttccgt gagccagacg atgctggagg aggtattctt 7500 gtacttctcc aaggaccagg ggaaggacga ggacaecgaa gagcagaagg aggcaggagt 7560 gggagtggac cccgcgccag gcctgcagca ccccaaacgc.gtcagccagt tcctcgatga.7620 ccctagcact gccgagactg tgctctgagc ctccctcccc tgcggggçcg cggggaggcc 7680 ctgggaatgg caagggcaag gtagagtgcc taggagccct ggactcaggc tggcagaggg 77x0 gctggtgccc tggagaaaat aaagagaagg ctggagagaa gccgtggtgg tgaaa 7795

9 <210> 9 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence aryficielle <220>
<223> Dèscriptioi~. de la séquence artificielle: AMORCE
<ap0> 9 agccagcaac gcaatcctcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artifïcielle <220>
<223> Description de la sêquence artificielle: AMORCE
<400> 10 cgcaccatgt caatgagccc 20 <210> 11 <211> 22 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <400> 11 gcggaaagca ggtgttgttc ac <210> 12 <21.1> 21 <212> ADN
<213> Séquer_ce artificïelle <400> 12 cgatggcagt ggcttgtttg g 21

Claims

REVENDICATIONS

1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N o1-5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

2. Acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon la revendication 1.

3. Acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2.

4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, capable de moduler la transcription d'un polynucléotide placé sous son contrôle.

5. Acide nucléique selon la revendication 4, comprenant un polynucléotide allant du nucléotide en position -1 au nucléotide en position -1111 par rapport au premier nucléotide transcrit, localisé en position 1112 de la séquence nucléotidique SEQ ID N o1.

6. Acide nucléique selon la revendication 4, capable d'activer la transcription d'un polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.

7. Acide nucléique selon la revendication 4, capable d'inhiber la transcription d'un polynucléotide d'intérét placé sous son contrôle.

8. Acide nucléique comprenant:
a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7; et b) un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt.

9. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'acide nucléique d'intérêt est un oligonucléotide de type sens ou antisens.

10. Vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.

11. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 10.

12. Mammifère transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou les cellules germinales ont été transformées par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 10.

13. Procédé pour le criblage d'une substance ou d'une molécule modulant la transcription du polynucléotide constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes:
a) mettre en culture une cellule hôte transformée selon la revendication 11;
b) incuber la cellule hôte transformée en présence de la substance ou molécule candidate;
c) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt;
d) comparer les résultats de détection obtenus à l'étape c) avec les résultats de détection obtenus par mise en culture de la cellule hôte transformée en l'absence de la molécule ou substance candidate.

14. Kit ou nécessaire pour le criblage in vitro d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polypeptide d'intérêt codé par un polynucléotide constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, comprenant a) une cellule hôte transformée selon la revendication 11:
b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection de la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8.

15. Procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule modulant la transcription d'un polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) administrer la substance ou molécule candidate à un mammifère transgénique non humain selon la revendication 12;

b) détecter !'expression du polynucléotide d'intérêt chez le mammifère transgénique tel que traité à l'étape a);
c) comparer les résultats de détection de l'étape b) aux résultats observés chez un mammifère transgénique non humain selon la revendication 12 n'ayant pas reçu l'administration de. la substance ou molécule candidate.

16. Kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, comprenant:
a) un mammifère transgénique non humain selon la revendication 12;
b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection de la transcription dudit polynucléotide d'intérêt.

17. Substance ou molécule modulant la transcription d'un polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8.

18. Substance ou molécule selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée selon le procédé de la revendication 13 ou de la revendication 15.

19. Composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, une substance ou une molécule selon l'une des revendications 17 ou 18.

20. Composition pharmaceutique selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement et/ou à la prévention des déficiences dans le métabolisme des lipides, ou dans les mécanismes impliquant le système immunitaire et l'inflammation.

21. Substance ou molécule selon l'une des revendications 17 ou 18, en tant que principe actif d'un médicament.

22. Procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant les étapes suivantes:

a) extraire l'ARN messager total à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester;

b) quantifier l'ARN messager de ABCA7 présent dans ledit matériel biologique:

c) comparer la quantité d'ARN messager de ABCA7 obtenue à l'étape b) avec la quantité d'ARN messager de ABCA7 attendue chez un sujet normal.

23. Procédé de défection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant les étapes suivantes:

a) séquencer, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, un polynucléotide localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7;

b) aligner la séquence nucléotidique obtenue en a) avec la séquence SEQ
ID N o1;

c) déterminer les différences nucléotidiques entre le polynucléotide séquencé provenant du matériel biologique du sujet à tester et la séquence SEQ
ID
N o1 de référence.

24. Kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant les moyens nécessaires à quantifier l'ARN messager de ABCA7 dans un matériel biologique provenant dudit sujet à
tester.

25. Kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant les moyens nécessaires au séquençage d'un polynucléotide localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7 chez le sujet à tester.

26. Procédé de criblage d'une molécule ou substance modulant la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, comprenant les étapes suivantes:

a) incuber un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou un vecteur recombinant selon la revendication 10 avec une molécule ou substance candidate à tester;

b) détecter le complexe formé entre la molécule ou substance candidate et la molécule ou la substance candidate.

27. Kit ou nécessaire pour le criblage d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polynucléotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8 comprenant:

a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou un vecteur recombinant selon la revendication 10;

b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe formé entre la molécule ou la substance candidate et ledit acide nucléique.