EP1334186A2 - Acide nucleique regulateur du gene abca7, molecules modulant son activite et applications therapeutiques - Google Patents

Acide nucleique regulateur du gene abca7, molecules modulant son activite et applications therapeutiques

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Publication number
EP1334186A2
EP1334186A2 EP01978557A EP01978557A EP1334186A2 EP 1334186 A2 EP1334186 A2 EP 1334186A2 EP 01978557 A EP01978557 A EP 01978557A EP 01978557 A EP01978557 A EP 01978557A EP 1334186 A2 EP1334186 A2 EP 1334186A2
Authority
EP
European Patent Office
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nucleic acid
transcription
abca7
polynucleotide
gene
Prior art date
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Ceased
Application number
EP01978557A
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German (de)
English (en)
Inventor
Patrice Denefle
Marie-Françoise ROSIER
Catherine Prades
Isabelle Arnould-Reguigne
José OSORIO Y FORTEA
Nicolas Duverger
Giovanna Chimini
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Aventis Pharma SA
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Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0013649A external-priority patent/FR2822165B1/fr
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Aventis Pharma SA filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of EP1334186A2 publication Critical patent/EP1334186A2/fr
Ceased legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid capable of regulating the transcription of the ABCA7 gene, which is a gene capable of integrating into lipid metabolism in the hematopoietic tissues, as well as in the cellular signaling mechanisms linked to the immune reaction. and inflammation.
  • the present invention also describes polypeptides and polynucleotides whose alteration of the sequence or expression is potentially implicated in diseases associated with the genetic locus q13 of chromosome 19.
  • the present invention also relates to nucleotide constructs comprising a polynucleotide coding for a polypeptide or producing a nucleic acid of interest, placed under the control of a nucleic acid regulating the human or murine gene ABCA7.
  • the invention also relates to recombinant vectors, transformed host cells, and non-human transgenic mammals, comprising a nucleic acid regulating the transcription of the human and mouse ABCA7 gene or a abovementioned nucleotide construct, as well as methods for the production. screening of molecules or substances capable of modulating the activity of the nucleic acid regulating the ABCA7 gene.
  • the invention further relates to methods for detecting an alteration in the transcription of the ABCA7 gene and thus for diagnosing a possible dysfunction in lipid metabolism in hematopoietic tissues and in cellular signaling mechanisms of immunity. It also relates to substances or molecules modulating the activity of the nucleic acid regulating the transcription of the ABCA7 gene as well as pharmaceutical compositions containing such substances or such molecules.
  • ABC transporter proteins (ATP-Binding Cassette) constitute a superfamily which is extremely conserved during evolution, from bacteria to humans. These proteins are involved in the membrane transport of various substrates, for example ions, amino acids, peptides, sugars, vitamins or even steroid hormones (Higgins et al., Annu Rev. Cell Biol, 8, (1992 ) 67-1 13).
  • ABC transporter proteins have been identified in humans and a number of them have been associated with various diseases.
  • cystic fibrosis is caused by mutations in the CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) gene, also known as ABCC7.
  • CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
  • ABC transporter PFIC2 or ABCB11
  • PFIC2 PFIC2
  • ABCB11 another ABC transporter, designated PFIC2 or ABCB11, seems to be involved in a form of progressive familial intrahepatic cholestasis, this protein being potentially responsible, in humans, for the export of bile salts.
  • ABCA ABC transporters
  • the members of this subfamily are also highly conserved during the evolution of multicellular eukaryotes.
  • the ABCA1 and ABCA4 transporters which are the best known have an identity of 95% and 88% respectively with their murine orthologs.
  • the members of this subfamily are also strongly related, since for example the transporters ABCA1 and ABCA4 have a protein sequence identity of 50.9%, as well as a very similar genomic organization (Allikmets et al., Nat. Genêt. (1997) ) 15, 236-2446; Broccardo et al., Biochim. Biophys.
  • ABCA1 there is an abnormal distribution of membrane phospholipids within the layers of the plasma membrane, which results more precisely in the presence in greater amount of phosphatidylserine in the outer layer, and a disruption in the concentration of Ca 2+ .
  • the transporters ABCA1 and ABCA4 have been particularly studied.
  • ABCA1 indeed seems to be involved in pathologies linked to a dysfunction of the cholesterol metabolism inducing diseases like atherosclerosis, or family deficiencies in HDL (FHD) like Tangier disease (FR 99/7684000; Rust et al., Nat.Genet, 22 (1999) 352-355; Brooks-Wilson et al., Nat. Genêt, 22 (1999) 336-345; Bodzioch et al., Nat.Genet. 22 (1999) 347-351; Orso and al., Nat. Genet, 24 (2000) 192-196). Tangier's disease seems to be linked to a cellular deficit in the translocation of cellular cholesterol which leads to a degradation of HDLs, and thereby a disturbance of lipoprotein metabolism.
  • HDL particles which do not incorporate cholesterol from peripheral cells, are not metabolized correctly, but are instead eliminated quickly from the body.
  • the HDL plasma concentration of these patients is therefore extremely reduced and HDLs no longer ensure the return of cholesterol to the liver.
  • This cholesterol accumulates in these peripheral cells and causes characteristic clinical manifestations such as the formation of orange tonsils.
  • other lipoprotein disturbances such as overproduction of triglycerides as well as increased synthesis and intracellular catabolism of phospholipids are observed.
  • the transporter ABCA4 has also been associated with degenerative and inflammatory diseases of the eye such as recessive Stargardt's disease (Allikmets et al., 1997) and degeneration of the macular region of the retina linked to age (AMD) (Allikmets and al., Nat. Genet. 15 (1997) 236-246; Allikmets et al., Science, 277 (1997) 1805-1807; Cremers et al., Hum. Mol. Genêt. (1998), 7 (3), 355-62; Martinez-Mir et al., Nat. Genêt. 18 (1998) 1 1 -12; Weng et al., Ce // (1999) 98 (1), 13-23).
  • degenerative and inflammatory diseases of the eye such as recessive Stargardt's disease (Allikmets et al., 1997) and degeneration of the macular region of the retina linked to age (AMD) (Allikmets and al., Nat. Genet. 15 (1997) 236-246
  • ABCA7 a cDNA comprising the entire open reading phase of a new member of the A family of ABC transporters (“ATP-Binding Cassette”) has recently been cloned from RNA of human macrophages, and is designated ABCA7 (Kaminski et al., BBR, 273 (2000), 532-538).
  • the characterization of the complete amino acid sequence of ABCA7 indicates that the protein product has the general structure characteristic of ABCA transporters, in that it comprises the symmetrical structure comprising the two transmembrane domains and two NBF motifs.
  • the ABCA7 protein has other motifs which have been recently
  • the transporter protein ABCA7 seems to have a regulatory profile dependent on sterol fluxes, similar to that of the other members of the subfamily A, and in particular of the transporter ABCA1 (Langman et al., BBR Corn; 257 (1999), 29-33; Laucken et al., PNAS, 97 (2000) 817-822). I! was indeed observed by Kaminski et al. (supra) an increase in the expression of ABCA7 after incubation of human macrophages in the presence of low density acetylated lipoproteins (AcLDL) which induce a sterol load, as well as a decrease in expression in the presence of the acceptor of HDL3 cholesterol which causes a decrease in the sterol load.
  • AcLDL low density acetylated lipoproteins
  • ABCA7 presents like the other ABCA members a certain specialization of its tissue expression, the messenger of ABCA7 being present predominantly in the hematopoietic tissues constituted by lymphocytes, granulocytes, thymus, spleen, bone marrow , or fetal tissues, whereas the expression of ABCA1 is predominant in macrophages and the placenta, and that of ABCA4 is restricted in the retina (Rust et al., Nat. Genêt, 22, (1999) 352-355 ).
  • the characterization of the regulatory sequences of the human ABCA7 gene would make it possible to detect mutations in patients, in particular to diagnose individuals belonging to family groups at risk. Furthermore, the isolation of these regulatory sequences would make it possible to complement the mutated sequence with a functional sequence capable of overcoming the metabolic dysfunctions induced by the mutation or mutations diagnosed, by means of the construction of targeted therapeutic means, such as means intended to gene therapy. b) The characterization of the regulatory sequences of the ABCA7 gene would make available to those skilled in the art means capable of allowing construction by genetic engineering and then the expression of genes determined in the cell types in which the ABCA7 gene is preferentially expressed.
  • the inventors have now isolated and then analyzed a human genomic DNA of 33.5 kb comprising the 46 exons of the open reading frame of the ABCA7 gene as well as the non-transcribed region of approximately 1.1 kb located on the 5 'side of exon 1 , upstream of the +1 transcription site, and comprising regulatory signals of the human ABCA7 gene.
  • the inventors also isolated and then analyzed a murine genomic DNA of 20Kb comprising the 45 exons of the open reading frame of the ABCA7 gene as well as the non-transcribed region of approximately 1.2Kb in the mouse located on the 5 'side of exon 1 , upstream of the +1 transcription site, and comprising signals for regulating the murine ABCA7 gene.
  • isolated in the sense of the present invention designates a biological material (nucleic acid or protein) which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located).
  • a polynucleotide naturally occurring in a plant or animal is not isolated.
  • the same polynucleotide separated from adjacent nucleic acids within which it is naturally inserted into the genome of the plant or animal is considered to be "isolated”.
  • Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and nevertheless remain in an isolated state since the vector or the composition does not constitute its natural environment.
  • purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
  • a polynucleotide is in the "purified" state after purification of the starting material or of the natural material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably 4 or 5 orders of magnitude.
  • nucleotide sequence can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
  • nucleic acid includes RNA, DNA, cDNA or even RNA / DNA hybrid sequences of more than one nucleotide, in single chain form or in duplex form.
  • nucleotide designates both natural nucleotides (A, T, G, C) as well as modified nucleotides which comprise at least one modification such as (1) a purine analog, (2) a d analog '' a pyrimidine, or (3) a sugar analogous, examples of such modified nucleotides being described for example in PCT application No. WO 95/04064.
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the base complementary to the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary bases are A and T (or A and U), or
  • variant of a nucleic acid is meant a nucleic acid which differs by one or more bases with respect to the reference polynucleotide.
  • a variant nucleic acid may be of natural origin, such as an allelic variant found naturally, or may also be an unnatural variant obtained for example by mutagenesis techniques.
  • the differences between the reference nucleic acid and the variant nucleic acid are reduced so that the nucleotide sequences of the reference nucleic acid and the variant nucleic acid are very close and, in many regions , identical.
  • the nucleotide modifications present in a variant nucleic acid can be silent, which means that they do not alter the amino acid sequences encoded by said variant nucleic acid.
  • nucleotide changes in a variant nucleic acid can also produce substitutions, additions, deletions in the polypeptide encoded by the variant nucleic acid with respect to the peptides encoded by the reference nucleic acid.
  • modifications of nucleotides in coding regions can produce substitutions, conservative or non-conservative in the amino acid sequence.
  • the variant nucleic acids according to the invention code for polypeptides which retain substantially the same biological function or activity as the polypeptide of the reference nucleic acid or the ability to be recognized by antibodies directed against the polypeptides coded by the initial nucleic acid.
  • nucleic acids will thus code for mutated forms of polypeptides whose systematic study will make it possible to deduce structure activity relationships from the proteins in question. Knowledge of these variants in relation to the studied disease is fundamental since it allows to understand the molecular cause of the pathology.
  • fragment will be understood to mean a reference nucleic acid according to the invention, a nucleotide sequence of reduced length compared to the reference nucleic acid and comprising, on the common part, a nucleotide sequence identical to the nucleic acid of reference.
  • Such a “fragment” of nucleic acid according to the invention may, where appropriate, be included in a larger polynucleotide of which it is constitutive.
  • Such fragments comprise, or alternatively consist of, oligonucleotides of length ranging from 20 to 25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 or 1500 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention .
  • biologically active fragment of a transcription regulating acid according to the invention is meant a nucleic acid capable of modulating the transcription of a DNA sequence placed under its control.
  • a biologically active fragment comprises a basic promoter and / or a regulatory element, as defined in the present description.
  • regulatory nucleic acid is meant a nucleic acid which activates and / or regulates the expression of a DNA sequence selected and placed under its control.
  • promoter is meant a DNA sequence recognized by the proteins of the cell involved in the initiation of transcription of a gene.
  • the basic promoter is the minimal regulatory nucleic acid capable of initiating the transcription of a determined DNA sequence which is placed under its control.
  • the basic promoter consists of a region of genomic DNA upstream of the transcription initiation site where there is very often a CAAT sequence (where one or more protein transcription factors bind) as well as, except in rare cases such as in certain domestic genes, the sequence TATA or "TATA box” or a related box. It is at the level of this box that an RNA polymerase is fixed as well as one or more transcription factors, such as the proteins which bind to the "TATA box” (TATA box Binding Proteins or TBPs).
  • a nucleotide sequence is "placed under the control" of a regulatory nucleic acid when this regulatory nucleic acid is located, relative to the nucleotide sequence, so as to control the initiation of transcription of the nucleotide sequence by an RNA polymerase.
  • regulatory element or “regulatory sequence” within the meaning of the invention is meant a nucleic acid comprising elements capable of modulating the transcription initiated by a basic promoter, such as sites for binding of various transcription factors, “enhancer” sequences for increasing transcription or “silencer” sequences for inhibiting transcription.
  • enhancer sequence is meant a DNA sequence included in a regulatory nucleic acid capable of increasing or stimulating the transcription initiated by a basic promoter.
  • silica is meant a DNA sequence included in a regulatory acid capable of decreasing or inhibiting the transcription initiated by a basic promoter.
  • Regulatory elements may be present outside the sequence located on the 5 ′ side of the transcription initiation site, for example in introns and exons, including in coding sequences.
  • the basic promoter and the regulatory element can be "specific for one or more tissues", if they allow transcription of a determined DNA sequence, placed under their control, preferably in certain cells (for example cells specific of a tissue), that is to say either exclusively in the cells of certain tissues, or at different levels of transcription depending on the tissue.
  • transcription factor proteins which preferentially interact with regulatory elements of a regulatory nucleic acid according to the invention, and which stimulate or on the contrary suppress transcription. Certain transcription factors are active in the form of monomers, others being active in the form of homo- or heterodimers.
  • the term “modulation” is aimed either at positive regulation (increase, stimulation) of transcription, or negative regulation (decrease, inhibition, blockage) of transcription.
  • the "percentage of identity" between two nucleotide or amino acid sequences can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by 100 to obtain the percentage of sequence identity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be achieved by computer using known algorithms contained in the package of the company WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.
  • the percentage of sequence identity may be carried out using the BLAST software (BLAST versions 1.4.9 of March 1996, BLAST 2.0.4 of February 1998 and BLAST 2.0.6 of September 1998), using only the default parameters (AltschuI et al, J. Mol. BioL, (1990) 215: 403-410; AltschuI et al, Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402).
  • the query sequence and the databases used can be peptide or nucleic, any combination being possible.
  • hybridization conditions described above are suitable for hybridization under high stringency conditions, of a nucleic acid molecule of variable length from 20 nucleotides to several hundred nucleotides.
  • hybridization conditions described above can be adapted as a function of the length of the nucleic acid for which hybridization is sought or of the type of labeling chosen, according to techniques known to those skilled in the art.
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (1985) (Nucleic acid Hybridization iapractical Approach, Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) or even in the work by F. AUSUBEL et al (1999) (Currents Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY).
  • transformation within the meaning of the invention means the introduction of a nucleic acid (or a recombinant vector) into a host cell.
  • transformation also encompasses a situation " in which the genotype of a cell has been modified by an exogenous nucleic acid, and this cell thus transformed expresses said exogenous nucleic acid, for example in the form of a recombinant polypeptide or still in the form of a sense or antisense nucleic acid.
  • transgenic animal within the meaning of the invention is meant a non-human animal, preferably a mammal, in which one or more cells contain a heterologous nucleic acid introduced by human intervention, such as by transgenic techniques. well known to those skilled in the art.
  • the heterologous nucleic acid is introduced directly or indirectly into the cell or the precursor of the cell, by genetic manipulation such as micro-injection or infection with a recombinant virus.
  • the heterologous nucleic acid may be integrated into the chromosome, or may be in the form of DNA replicating extra-chromosomally.
  • NUCLEIC ACID REGULATOR OF THE ABCA7 GENE From libraries of BAC type vectors prepared from human and murine genomic material, the inventors have succeeded in isolating a nucleic acid regulating the human and murine ABCA7 genes.
  • the inventors have determined, by a comparative analysis of human and murine genomic sequences, a regulatory nucleic acid comprising in particular two regulatory modules conserved in humans and mice.
  • the inventors have therefore determined that the nucleic acid regulating the transcription of the ABCA7 gene, when it is defined in the broadest way, consists of a polynucleotide comprising, from the 5 ′ end to the 3 ′ end : a non-transcribed region of approximately 1.2 kb located upstream of the site for initiating transcription of the ABCA7 gene, and
  • a first object of the invention consists of a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 20 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the region of approximately 1.1 kb located upstream from the site of initiation of transcription of the ABCA7 gene, and comprising the basic promoter and multiple regulatory elements for transcription is also included in the sequence identified as SEQ ID N ° 2 according to the invention.
  • nucleotide at position 1 of the sequence SEQ ID No. 2 is the nucleotide at position -1111, with respect to the site of initiation of transcription of the ABCA7 gene.
  • the invention relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 20 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the nucleic acid regulating the transcription of the ABCA7 gene of sequence SEQ ID No. 1 comprises, in addition to a 5 ′ regulatory region not transcribed, also the 5 ′ part of the first exon of the human ABCA7 gene.
  • the partial sequence of the first exon of the ABCA7 gene is defined as the sequence SEQ ID No. 3.
  • the invention relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 20 consecutive nucleotides of nucleotide sequence SEQ ID No. 3 or a nucleic acid of complementary sequence.
  • nucleic acid according to the invention will be in an isolated and / or purified form.
  • nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid as defined above.
  • this nucleic acid can be of murine origin, and consists of a polynucleotide of nucleotide sequence SEQ ID NO: 4 comprising from the 5 ′ to 3 ′ end:
  • the region of approximately 1.2Kb located upstream from the site of initiation of transcription of the ABCA7 gene, and comprising the basic promoter and multiple regulatory elements for transcription is also included in the sequence identified as SEQ ID NO: 5 according to the invention.
  • the invention also encompasses a nucleic acid characterized in that it hybridizes, under conditions of high stringency, with any one of the nucleic acids according to the invention.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least 80%, advantageously 90%, preferably 95% and very preferably 98% of nucleotide identity with a nucleic acid comprising at least 20 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 5.
  • the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 2 included in the nucleic acid regulating the human gene ABCA7 of sequence SEQ ID No. 1, comprises the elements constituting a basic promoter, respectively a box Degenerated "TATA" (TTAAG) located 30 bp upstream from the point of initiation of transcription.
  • TTAAG Degenerated "TATA"
  • TTAAA degenerate "TATA" box
  • the regulatory sequences SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 5 also include numerous sites for binding various transcription factors capable of positively or negatively regulating the activity of the base promoter. Thus, the different sequences characteristic of the binding sites of various transcription factors in the sequences SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 5 were identified by the inventors in the following detail.
  • sequences SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 5 were used as reference sequences and processed according to the algorithms of the Matlnspector software (Quandt et al., Nucl Acid Res (1995) 23 (23), 4878-4884) and compared with the data indexed in several databases such as Transfac and the presence as well as the localization of the various characteristic sites of the sequences SEQ ID N ° 2 and 5, and in particular the sites of binding of the transcription factors were determined according to well methods known to those skilled in the art.
  • the positions of the start nucleotides of each of the transcription factor binding sites are designated with reference to the numbering of the nucleotides of the sequences SEQ ID No. 2 and NO: 5 with respect to the +1 point of initiation of transcription, content in the sequences SEQ ID No. 1 and No. 4, as shown in FIG. 1.
  • Figure 2 shows the sequence SEQ ID NO: 1, which contains the sequence SEQ ID No 2.
  • the first nucleotide at position 5 'of the sequence of FIG. 2 is also the first nucleotide at position 5' of one of the nucleic sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2.
  • the sites of attachment to transcription factors are illustrated in bold type which delimit their respective positions, and their respective designations are indicated above each of the corresponding boxes.
  • the nucleotides of the sequence represented in FIG. 2 have been numbered with respect to the transcription initiation site, numbered "+1", the nucleotide 5 ′ of nucleotide +1 being itself numbered "-1" .
  • Figure 3 shows the sequence SEQ ID NO: 4, which contains the sequence
  • the first nucleotide at position 5 'of the sequence of FIG. 3 is also the first nucleotide at position 5' of one of the nucleic sequences SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 5.
  • the sites of attachment to transcription factors are illustrated in bold type which delimit their respective positions, and their respective designations are indicated above each of the corresponding boxes.
  • the nucleotides of the sequence represented in FIG. 3 have been numbered with respect to the transcription initiation site, numbered "+1", the nucleotide 5 ′ of nucleotide +1 being itself numbered "-1" .
  • the two regulatory modules stored in mice and humans also include sites for binding transcription factors such as GFI1 and NFkappaB (NFkB), which are mainly present in the lymphatic organs.
  • GFI1 and NFkappaB NFkB
  • NF1 factor The binding characteristics of the NF1 factor can be found in particular in the following entries in the Medline database: 88319941, 91219459, 861401 12, 87237877, 90174951, 89282387, 90151633, " 892618136, 86274639, 87064414, 89263791.
  • factor NF1 recognizes the following palindromic sequence: "TGGCANNNTGCCA (NNTTGGCNNNNNNNCCCCN)" which is present in viral and cellular promoters and at the level of the origin of replication of adenovirus type 2. These proteins are capable of activating transcription and replication They bind to DNA in the form of a homodimer.
  • NFY factor The NFY factor is described in particular in entry No. P25.208 of the Swissprot database. It is a factor which recognizes a "CCAAT" motif in promoter sequences such as those of the gene coding for type 1 collagen, albumin and ⁇ -actin. It is a stimulator of transcription.
  • the factor AP4 has a DNA binding domain of the "helix loop helix” type (bHLH) as well as two dimerization domains.
  • the consensus site for factor AP4 is the following "CWCAGCTGGN", and this generally overlaps with a binding site for factor AP1.
  • the CEBP factor binding characteristics can be found in particular in the following entries in the Medline database: 93315489, 91248826, 94193722, 93211931, 92390404, 90258863, 94088523, 90269225 and 96133958. It is an activator of the important transcription in the regulation of genes involved in immune and inflammatory responses. It specifically binds to an IL-1 response element in the IL-6 gene. It probably plays a role in regulating the acute phase of inflammation and in hemopoiesis. The consensus recognition site is as follows: "T (T / G) NNGNAAfJVG)".
  • HNF3B factor HNF3B factor
  • OVERDIER et al. (1994, Mol. Cell Biol. VoU4: 2755-2766), as well as the following Medline database entries: 91352065, 91032994, 92345837, 89160814, 91187609, 91160974, 91029477, 94301798 and 94218249.
  • This transcription factor acts as an activator of many liver genes such as AFT genes, albumin, tyrosine aminotransferase and interacts with cis-acting regulatory regions of these genes.
  • the FM G factor binding characteristics can be found in particular in the following entries in the Medline database: 10762661, 9931446, 9571157, 9285685, 9070650, and 7789186.
  • the GFI1 gene codes for a zinc finger protein involved in the transcriptional regulation and more particularly in the interleukin 2 signaling pathway.
  • the consensus recognition site is as follows: "NNNNNNAAATCANNGNNNNNNN” NFkappa-B factor:
  • the factor NFkappa-B is a heterodimer consisting of a first 50 kDa subunit and a second 65 kDa subunit. Two heterodimers can form a labile tetramer. Its attachment to DNA depends on the presence of zinc (Zn ++ ). It can be induced by many agents such as TNF, PKA or even PKC. It is a key regulator of genes involved in responses to infection, inflammation, and stress.
  • An essential characteristic of the regulatory nucleic acid according to the invention, and more particularly of the sequence located upstream of the transcription initiation site included both in the sequence SEQ ID No. 2 and in the sequence SEQ ID N ° 5 is the presence of motifs characteristic of putative sites of binding to transcription factors involved in the gene expression of T lymphocytes, such as the transcription factors CEBP, NFKB, and GFI1
  • GFI1 is a proto-oncogene which codes for a zinc finger nuclear protein involved in the signaling pathway by cytokines and in the clonal amplification of T cells (Zweidler-McKay, et al., Mol. Cell. Biol. ( 1996), 16 (8), 4024-4034).
  • the transcription factor GFI1 which acts as a transcriptional repressor of genes which inhibit T cell activation and oncogenesis. It is specifically present in the thymus, spleen and T lymphocytes.
  • CEBP and NFkappaB transcription factors which are expressed in the thymus, spleen and T lymphocytes, are well known to those skilled in the art and act in cooperation in mediating the induction of expression of the genes of T lymphocytes. (Runch et al., 1994) and HepB3 cells (Shimizu et al., Gene, (1994) 149, 305-310).
  • the invention relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 20 consecutive nucleotides of one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 or 2, and SEQ ID No. 4 or 5, as well as an acid nucleic acid of complementary sequence.
  • nucleic acids comprising one or more "biologically active" fragments of one of the sequences SEQ ID No. 1 or 2, and SEQ ID No. 4 or 5.
  • Those skilled in the art can easily obtaining biologically active fragments of these sequences, with particular reference to Table 3 above as well as to Figures 2 and 3 in which the different motifs characteristic of the regulatory sequence of the ABCA7 gene are presented.
  • Those skilled in the art will thus be able to obtain such biologically active fragments by total or partial chemical synthesis of the corresponding polynucleotides or even by causing restriction endonucleases to act in order to obtain the desired DNA fragments, the restriction sites present on the sequences.
  • SEQ ID N ° 1 to SEQ ID N ° 5 can be easily found from the sequence information, using current restriction mapping software such as GCG version 9J module map.
  • nucleic acid fragments determined using restriction endonucleases is for example described in the work by SAMBROOK et al., (Molecular cloning: a laboratory manual, 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New York (1989)
  • the invention therefore also relates to a nucleic acid as defined above, capable of modulating the transcription of a polynucleotide placed under its control.
  • a biologically active fragment of a transcription-regulating nucleic acid comprises a first conserved module (module 2) which comprises the basic promoter (TATA box) going from the nucleotide in position - 1 at the nucleotide at position -390, relative to the site of initiation of transcription, the first nucleotide transcribed being the nucleotide at position 1 1 12 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or the nucleotide at position 1221 of the sequence nucleotide SE ID NO: 4.
  • module 2 which comprises the basic promoter (TATA box) going from the nucleotide in position - 1 at the nucleotide at position -390, relative to the site of initiation of transcription, the first nucleotide transcribed being the nucleotide at position 1 1 12 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or the nucleotide at position 1221 of the sequence nucleotide SE ID NO: 4.
  • a biologically active fragment of a transcription regulating nucleic acid comprises the conserved modules 1 and 2 (FIG. 1) from the nucleotide in position -1 to the nucleotide in position -860, relative at the transcription initiation site, the first nucleotide transcribed being the nucleotide in position 1 1 12 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or the nucleotide in position 1221 of the nucleotide sequence SE ID NO: 4.
  • such a biologically active fragment of a transcriptional acid comprises, in addition to the basic promoter (core promoter) and the proximal regulatory elements, also other regulatory elements such as different GFI1, HNF3B, CEBPB, NF1 sites and extends from the nucleotide at position -1 to the nucleotide at position -1 1 1 1, relative to the transcription initiation site, the first nucleotide transcribed being the nucleotide at position 1 1 12 of the nucleotide sequence SEQ ID N ° 1, and at the nucleotide in position - 1220, with respect to the transcription initiation site, the first nucleotide transcribed being the nucleotide in position 1221 of the nucleotide sequence SEQ ID N ° 4 .
  • EXON 1 ANALYSIS The applicant has also identified the nucleotide sequences located downstream of the transcription initiation site and corresponding to the 5 'end of the exon
  • exon 1 begins at the nucleotide at position 1121 of the sequence SEQ ID No 1 and ends at the nucleotide at position 2322 of the sequence SEQ ID # 1.
  • the 5 'end of exon 1 is identified as the sequence SEQ ID No. 3 and the complete sequence of exon 1 is identified as the sequence SEQ ID No. 6.
  • Exon 1 contains the start of the open reading phase of the human ABCA7 gene, nucleotide A of the ATG codon being located at position 1208 of the sequences SEQ ID Nos. 3 and 6.
  • Exon 1 codes for the polypeptide of sequence SEQ ID # 7.
  • Exon 1 is likely to contain elements for regulating the expression of the ABCA7 gene, in particular elements of the enhancer enhancer type and / or elements of the silencer or repressor type.
  • a transcription regulating nucleic acid according to the invention may also contain, in addition to biologically active fragments of the sequence SEQ ID No. 1, also nucleotide fragments, or even all of the sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID N ° 3 and 6.
  • nucleotide sequences SEQ ID N ° 1 to SEQ ID N ° 3, and 6, as well as their fragments can in particular be used as nucleotide probes or primers to detect the presence of at least one copy of the ABCA7 gene in a sample, or further to amplify a target sequence determined within the regulatory sequence of the ABCA7 gene.
  • a further subject of the invention is therefore a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid as defined above, in particular originating from one of the sequences SEQ ID N ° 1 to SEQ ID N ° 3 and 6.
  • the invention also relates to a nucleic acid hybridizing, under conditions of high stringency, with any of the nucleic acids according to the invention, in particular a nucleic acid originating from a sequence chosen from the sequences SEQ ID N ° 1 to SEQ ID N ° 3 and 6.
  • the invention also relates to a nucleic acid as defined above and further characterized in that it is capable of modulating the transcription of a polynucleotide of interest placed under its control.
  • such a nucleic acid is capable of activating the transcription of the polynucleotide of interest placed under its control.
  • a regulatory nucleic acid according to the invention can be characterized in that it is capable of inhibiting the transcription of the polynucleotide of interest placed under the control thereof.
  • a transcription regulating nucleic acid according to the invention when it is suitably located with respect to a polynucleotide of interest whose expression is sought, will allow the transcription of said polynucleotide of interest, either constitutively or inducibly.
  • the inducible nature of the transcription initiated by a regulatory nucleic acid according to the invention can be conferred by one or more of the regulatory elements which it contains, for example the presence of one or more sites as previously defined in the sequence SEQ ID N ° 1 or SEQ ID N ° 2.
  • tissue-specific expression of the polynucleotide of interest can be sought by placing this polynucleotide of interest under the control of a regulatory nucleic acid according to the invention capable, for example, of initiating the transcription of this polynucleotide d interest specifically in certain categories of cells, for example cells of hematopoietic tissue, such as peripheral leukocytes, thymus cells, spleen cells, and bone marrow.
  • a regulatory nucleic acid according to the invention capable, for example, of initiating the transcription of this polynucleotide d interest specifically in certain categories of cells, for example cells of hematopoietic tissue, such as peripheral leukocytes, thymus cells, spleen cells, and bone marrow.
  • a regulatory nucleic acid according to the invention may comprise one or more "discrete" regulatory elements, such as enhancer and silent elements.
  • a regulatory nucleic acid may comprise one or more sites for potential attachment to the transcription factors as defined in FIG. 2.
  • a regulatory acid according to the invention also includes a sequence not comprising the basic promoter, that is to say the sequence going from the nucleotide in position -1 to the nucleotide in position -25, with respect to the initiation site of the transcription.
  • Such a regulatory nucleic acid will then preferably comprise a basic promoter called “heterologous”, that is to say a polynucleotide comprising a "TATA” box and a “homebox” not originating from the nucleic acid regulating the gene ABCA7.
  • transcription regulating nucleic acid comprising all or part of the sequence SEQ ID No. 1 which has been modified, for example by addition, deletion or substitution of one or more nucleotides. Such modifications can modulate the transcriptional activity by causing an increase or on the contrary a decrease in the activity of the promoter or of the regulatory element.
  • Such a modification can also affect the tissue specificity of the promoter or of the regulatory element. So, for example, a nucleic acid regulator according to the invention can be modified in order to stimulate transcription in only one of the tissues in which it is naturally expressed.
  • a transcription regulating acid according to the invention can also be modified and be made inducible by a particular compound, for example by creating in the sequence a site inducible by a given therapeutic compound.
  • Modifications in a sequence comprising all or part of the sequence SEQ ID No. 1 and comprising the promoter or a regulatory element can be carried out with methods well known to those skilled in the art, such as mutagenesis.
  • the activity of the promoter or of the modified regulatory element can then be tested, for example by cloning the modified promoter upstream of a reporter gene, by transfecting the resulting DNA construct in a host cell and by measuring the level of expression of the reporter gene in the transfected host cell.
  • the activity of the modified promoter can also be analyzed in vivo in transgenic animals. It is also possible to construct libraries of modified fragments which can be screened using functional tests in which, for example, only promoters or regulatory elements having the desired activity will be selected.
  • Such tests may be based, for example, on the use of reporter genes conferring resistance to specific compounds, for example antibiotics.
  • the selection of cells having a regulatory nucleic acid / reporter gene construction and containing a promoter or a regulatory element having the desired modification can then be isolated by culturing host cells transformed with such a construction in the presence of the determined compound, for example the antibiotic determined.
  • the reporter gene can also code for any easily detectable protein, for example an optically detectable protein such as luciferase.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising: a) a transcription regulating nucleic acid as defined above; and b) a polynucleotide of interest encoding a polypeptide or a nucleic acid of interest.
  • the polynucleotide of interest whose transcription is sought encodes a protein or a peptide.
  • the protein can be of any kind, for example a protein of therapeutic interest, including cytokines, structural proteins, receptors or even transcription factors.
  • the nucleic acid transcription regulator will advantageously comprise a nucleic acid going from the nucleotide in position -1 to the nucleotide in position -1111, relative to the site of initiation of transcription of the sequence SEQ ID No. 1 or 2, and going from the nucleotide in position -1 at the nucleotide in position -1220 SEQ ID N ° 4 or 5.
  • the polynucleotide of interest will code for a gene involved in the fight against inflammation, such as a cytokine receptor or even for a superoxide dismutase. If an antitumor effect is sought, we will then seek to stimulate the number and activation of cytotoxic T lymphocytes specific for a given tumor antigen.
  • a regulatory nucleic acid according to the invention will be used in combination with a polynucleotide of interest coding for the protein ABCA7.
  • the polynucleotide of interest can also be a sense type oligonucleotide.
  • the polynucleotide of interest can also produce a nucleic acid, such as an antisense nucleic acid specific for a gene whose translation is sought to be inhibited.
  • the polynucleotide of interest whose transcription is regulated by the regulatory nucleic acid is a reporter gene, such as any gene coding for a detectable protein.
  • reporter genes there may be mentioned in particular the gene for luciferase, ⁇ -galactosidase (LacZ), chloramphenicol acetyl transferase (CAT) or any gene coding for a protein conferring resistance to a particular compound, particularly to an antibiotic.
  • LacZ ⁇ -galactosidase
  • CAT chloramphenicol acetyl transferase
  • RECOMBINANT VECTORS any gene coding for a protein conferring resistance to a particular compound, particularly to an antibiotic.
  • vector within the meaning of the present invention is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in the form of single strand or double strand.
  • a recombinant vector according to the invention is used in order to amplify the regulatory nucleic acid according to the invention which is inserted therein after transformation or transfection of the desired cellular host.
  • these are expression vectors comprising, in addition to a regulatory nucleic acid according to the invention, sequences the expression of which is sought in a host cell or in a determined multicellular organism.
  • a recombinant vector according to the invention will notably comprise the following elements:
  • a regulatory nucleic acid (1) a regulatory nucleic acid according to the invention; (2) a polynucleotide of interest comprising a coding sequence included in the nucleic acid to be inserted into such a vector, said coding sequence being placed in phase with the regulatory signals described in (1); and
  • the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of replication in cellular hosts in which their amplification or expression is sought, markers or selection markers.
  • the bacterial promoters could be the Lacl, LacZ promoters, the RNA polymerase promoters of bacteriophage T3 or T7, the PR or PL promoters of phage lambda.
  • Promoters for eukaryotic cells will include the HSV virus thymidine kinase promoter or the mouse metallothionein-L promoter.
  • bacteriophage vectors such as bacteriophage P1 vectors such as the vector p158 or even the vector p158 / neo8 described by Sternberg (Trends Genet., (1992) 8: 1-16) are preferably used. ; Mamm. Genome (1994) 5: 397-404).
  • the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the vectors pBR322 (ATCC37017) or also vectors such as pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden), and pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, USA). Mention may also be made of other commercially available vectors such as the vectors pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
  • a recombinant vector according to the invention can also be a retroviral vector or also an adeno-associated vector (AAV).
  • AAV adeno-associated vector
  • Such adeno-associated vectors are for example described by Flotte et al., Am. J. Respir., Cell Mol. Biol. (1992) 7: 349-356; Samulski et al., J. Virol. (1989) 63: 3822-3828; MacLaughlin et al., Am. J. Hum. Broom. (1996) 59: 561-569).
  • the polynucleotide construct comprising the regulatory sequence and the coding sequence must be introduced into a host cell.
  • the introduction of such a polynucleotide construct according to the invention into a host cell can be carried out in vitro, according to techniques well known to those skilled in the art to transform or transfect cells, either in primary culture or in the form cell lines.
  • a person skilled in the art may advantageously refer to various techniques, such as the calcium phosphate precipitation technique (Graham et al., Virology (1973) 52: 456-457; Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7: 2745-2752), DEAE Dextran (Gopal et al., Mol. Cell. Biol., (1985) 5: 1188-1190), electroporation (Tur-Kaspa et al., Mol Cel. Biol, (1986) 6: 716-718 .; Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the polynucleotide Once the polynucleotide has been introduced into the host cell, it can be stably integrated into the genome of the cell. Integration can be carried out at a specific location in the genome, by homologous recombination, or can be integrated at random. In certain embodiments, the polynucleotide can be stably maintained in the host cell in the form of an episome fragment, the episome comprising sequences permitting maintenance and replication thereof, either independently, either synchronized with the cell cycle.
  • a method for introducing a polynucleotide according to the invention into a host cell comprises a step during which a preparation comprising a vector is introduced of compatible pharmaceutical expression and a “naked” polynucleotide according to the invention, placed under the control of appropriate regulatory sequences, by local injection into the chosen tissue, for example a smooth muscle tissue, the “naked” polynucleotide being absorbed by cells in this tissue.
  • compositions for in vitro and in vivo use comprising "naked" polynucleotides are for example described in PCT application No. WO 95/11307 as well as in the articles by Tacson et al. (Nature Med. (1996) 2 (8), 888-892) and de Huygen et al., (Nat. Med. (1996) 2 (8), 893-898).
  • compositions for the in vivo production of a protein of interest comprising a polynucleotide coding for the polypeptide of interest placed under the control of a regulatory sequence according to the invention, in solution in a physiologically acceptable vector.
  • the amount of vector that is injected into the chosen host organism varies depending on the site of the injection. As an indication, it can be injected between approximately 0.1 and approximately 100 ⁇ g of the polynucleotide construct regulatory sequence / coding sequence into the body of an animal.
  • the vector is preferably injected in the body of a patient who is likely to develop a disease related to a protein deficiency ABCA7.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of subjects affected by a dysfunction of the ABCA7 protein, comprising a regulatory nucleic acid according to the invention and a polynucleotide of interest coding for the ABCA7 protein. , in combination with one or more physiologically compatible excipients.
  • such a composition will comprise the regulatory nucleic acid defined by one of the sequences SEQ ID No. 1 or 2, and SEQ ID No. 4 or 5, or a biologically active fragment of this regulatory nucleic acid.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of subjects affected by a dysfunction in lipid metabolism, comprising a recombinant vector as defined above, in association with one or more physiologically excipients compatible.
  • a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of subjects affected by a dysfunction of the processes involving the immune system and inflammation comprising a recombinant vector as defined above, in association with a or more physiologically compatible excipients.
  • the invention also relates to the use of a polynucleotide construct in accordance with the invention and comprising a nucleic acid regulating the ABCA7 gene as well as a sequence coding for the protein ABCA7, for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of affected subjects a dysfunction of lipid metabolism or a problem of immunological or inflammatory origin.
  • the invention also relates to the use of a recombinant vector according to the invention, comprising, in addition to a regulatory nucleic acid of the invention, a nucleic acid coding for the protein ABCA7, for the manufacture of a medicament intended for preventing or treating subjects affected by dysfunction of the processes involving the immune system and inflammation.
  • Vectors useful in somatic gene therapy methods and compositions containing such vectors are provided.
  • the present invention also relates to a new therapeutic approach for the treatment and / or prevention of pathologies linked to lipid metabolism as well as for the treatment and / or prevention of pathologies linked to dysfunction of the lymphocytic mediation mechanisms of inflammation. It offers an advantageous solution to the drawbacks of the prior art, by demonstrating the possibility of treating pathologies, in particular pathologies linked to a dysfunction of lipid metabolism in myelo-lymphatic tissues, by gene therapy, by transfer and in vivo expression of a polynucleotide construct comprising, in addition to a regulatory nucleic acid according to the invention, a sequence coding for an ABCA7 protein which is strongly presumed to be involved in the transport and / or metabolism of lipids.
  • the invention thus provides a simple means allowing a specific and effective treatment of subjects affected by a dysfunction of the processes involving the immune system and inflammation.
  • Gene therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly
  • viruses as vectors for gene transfer has emerged as a promising alternative to these physical transfection techniques.
  • retroviruses RSV, HMS, MMS, etc.
  • the HSV virus adeno-associated viruses
  • adenoviruses adenoviruses
  • the present invention therefore also relates to a new therapeutic approach for the treatment of pathologies linked to the transport of lipids, consisting in transferring and expressing in vivo genes coding for ABCA7 placed under the control of a regulatory acid according to the invention. It is particularly advantageous to construct recombinant viruses containing a DNA sequence comprising a regulatory nucleic acid according to the invention and a sequence coding for an ABCA7 protein involved in lipid metabolism, to administer these recombinant viruses in vivo, and that this administration allows stable and efficient expression of a biologically active ABCA7 protein in vivo, and without cytopathological effect.
  • Adenoviruses are particularly effective vectors for the transfer and expression of the ABCA7 gene.
  • the use of recombinant adenoviruses as vectors makes it possible to obtain sufficiently high expression levels of the gene of interest to produce the desired therapeutic effect.
  • Other viral vectors such as retroviruses or adeno-associated viruses (AAV), allowing stable expression of the gene are also claimed.
  • the present invention thus offers a new approach for the treatment and prevention of pathologies linked to dysfunctions in lipid metabolism and in the signaling pathways of inflammation by lymphocytes.
  • the invention therefore also relates to a defective recombinant virus comprising a regulatory nucleic acid according to the invention and a nucleic sequence coding for an ABCA7 protein involved in lipid metabolism or in processes involving the immune system and inflammation.
  • the invention also relates to the use of such a defective recombinant virus for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment and / or the prevention of dysfunctions in the signaling of inflammation by lymphocytes.
  • the present invention also relates to the use of cells genetically modified ex vivo by a virus as described above, or of cells producing such viruses, implanted in the organism, allowing a prolonged and efficient expression in vivo of a protein.
  • ABCA7 biologically active.
  • the present invention shows that it is possible to incorporate a DNA sequence coding for ABCA7 in the control of a regulatory nucleic acid as defined above in a viral vector, and that these vectors make it possible to efficiently express a mature, biologically active form. More particularly, the invention shows that the in vivo expression of ABCA7 can be obtained by direct administration of an adenovirus or by implantation of a producer or genetically modified cell by an adenovirus or by a retrovirus incorporating such a DNA.
  • the present invention is particularly advantageous because it makes it possible to induce a controlled expression and without harmful effect of ABCA7 in organs which are not normally concerned with the expression of this protein.
  • a significant release of the ABCA7 protein is obtained by implantation of cells producing vectors of the invention, or infected ex vivo with vectors of the invention.
  • the mediator activity in the lipid metabolism produced in the context of the present invention can be of the human or animal ABCA7 type.
  • the nucleic sequence used in the context of the present invention can be a cDNA, a genomic DNA (gDNA), a RNA (in the case of retroviruses) or a hybrid construct consisting for example of a cDNA in which one or more introns would be inserted. .
  • a cDNA or a gDNA is used.
  • the use of a gDNA allows better expression in human cells.
  • these sequences are advantageously modified, for example by site-directed mutagenesis, in particular for the insertion of suitable restriction sites.
  • the sequences described in the prior art are in fact not constructed for use according to the invention, and prior adaptations may prove to be necessary, in order to obtain important expressions.
  • a construct coding for a derivative of these ABCA7 proteins are also possible to use.
  • a derivative of these ABCA7 proteins comprises for example any sequence obtained by mutation, deletion and / or addition with respect to the native sequence, and coding for a product retaining the activity of mediator of lipid metabolism. These modifications can be carried out by techniques known to a person skilled in the art (see general molecular biology techniques below). The biological activity of the derivatives thus obtained can then be easily determined, as indicated in particular in the examples describing the measurement of the influx of lipids from the cells.
  • the derivatives within the meaning of the invention can also be obtained by hybridization from nucleic acid libraries, using as probe the native sequence or a fragment thereof.
  • derivatives are in particular molecules having a greater affinity for their binding sites, molecules exhibiting greater resistance to proteases, molecules having greater therapeutic efficacy or less side effects, or possibly having new biological properties.
  • the derivatives also include the modified DNA sequences allowing improved expression in vivo.
  • the present invention relates to a defective recombinant virus comprising a regulatory nucleic acid according to the invention and a cDNA sequence coding for an ABCA7 protein involved in the transport and metabolism of cholesterol.
  • the DNA sequence is a gDNA sequence.
  • the cDNA sequence coding for the protein ABCA7, and usable in a vector according to the invention is advantageously the sequence SEQ ID No. 8.
  • the vectors of the invention can be prepared from different types of virus.
  • vectors derived from adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), herpes viruses (HSV) or retroviruses are used. It is very particularly advantageous to use an adenovirus, for direct administration or for the ex vivo modification of cells intended to be implanted, or a retrovirus, for the implantation of producer cells.
  • the viruses according to the invention are defective, that is to say that they are unable to replicate autonomously in the target cell.
  • the genome of defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the nucleic sequence coding for the protein ABCA7.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • adenoviruses various serotypes, whose structure and properties vary somewhat, have been characterized.
  • serotypes it is preferred to use, in the context of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO 94/26914).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan or A26 / 61 strain (ATCC VR-800) for example].
  • a frame of the invention are of human origin adenovirus or canine or mixed.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise ITRs, a sequence allowing the packaging and the sequence coding for the protein ABCA7 placed under the control of a nucleic acid according to the invention.
  • the E1 region at least is made non-functional.
  • the E1 gene and at least one of the E2, E4, L1-L5 genes are non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered.
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the E1 and E4 regions and the sequence coding for ABCA7 is inserted at the level of the inactivated E1 region.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to a person skilled in the art (Levrero et al., Gene (1991) 101: 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. (1984) 3: 2917 ). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia the DNA sequence coding for the protein ABCA7.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. (1977) 36: 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome of an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the E1 and E4 functions as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO 95/02697. Then, the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the rest of the genome is divided into 2 essential regions carrying the packaging functions: the left part of the genome, which contains the rep gene involved in viral replication and the expression of viral genes; the right part of the genome, which contains the cap gene coding for the capsid proteins of the virus.
  • the use of vectors derived from AAVs for gene transfer in vitro and in vivo has been described in the literature (see in particular WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488,528).
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by co-transfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing the sequence coding for the ABCA7 protein bordered by two repeated regions inverted (ITR) from AAV, and a plasmid carrying the encapsidation genes (rep and cap genes) from AAV.
  • a human helper virus for example an adenovirus
  • ITR inverted
  • rep and cap genes encapsidation genes
  • retroviruses are integrative viruses, infecting dividing cells.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
  • the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus”), HaSV ("harvey sarcoma virus”) ; SNV ("spleen necrosis virus”); RSV ("rous sarcoma virus”) or the Friend virus.
  • MoMuLV murine moloney leukemia virus
  • MSV murine moloney sarcoma virus
  • HaSV human moloney sarcoma virus
  • SNV spleen necrosis virus
  • RSV rous sarcoma virus
  • Friend virus Friend virus
  • a plasmid comprising in particular the LTRs, the packaging sequence and said coding sequence is generally constructed and then used to transfect a cell line called packaging, capable of providing trans functions deficient retrovirals in the plasmid.
  • packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US 4,861, 719); the PsiCRIP line (WO 90/02806) and the GP + envAm-12 line (WO 89/07150).
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences, comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
  • the recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • the results given below indeed demonstrate the particularly advantageous properties of adenoviruses for the expression in vivo of a protein having an activity of mediator of lipid metabolism.
  • the adenoviral vectors according to the invention are particularly advantageous for direct administration in vivo of a purified suspension, or for the ex vivo transformation of cells, in particular autologous, with a view to their implantation.
  • the adenoviral vectors according to the invention also have significant advantages, such as in particular their very high infection efficiency, making it possible to carry out infections from small volumes of viral suspension.
  • a line producing retroviral vectors containing a regulatory nucleic acid according to the invention and the sequence coding for the protein ABCA7 is used for implantation in vivo.
  • the lines which can be used for this purpose are in particular the cells PA317 (US4,861,719), PsiCrip (WO 90/02806) and GP + envAm-12 (US 5,278,056), modified to allow the production of a retrovirus containing a nucleic sequence coding for an ABCA7 protein according to the invention.
  • a retrovirus containing a nucleic sequence coding for an ABCA7 protein for example totipotent stem cells, precursors of blood cell lines, can be removed and isolated from the subject. These cultured cells can then be transfected with the retroviral vector containing the sequence coding for the ABCA7 protein under the control of its own promoter. These cells are then reintroduced into the subject.
  • the differentiation of these cells will be at the origin of cells of the hematopoietic tissue expressing the ABCA7 protein, in particular T lymphocytes which participate in the signaling of inflammation.
  • the sequence coding for the ABCA7 protein is placed under the control of a regulatory acid according to the invention comprising the regulatory elements allowing its expression in the infected cells, and very particularly the regulatory elements of NFkappaB, CEBP, and GFH type.
  • the present invention also relates to any use of a virus as described above for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment and / or prevention of pathologies linked to lipid metabolism or else to dysfunction related to processes involving the immune system and inflammation.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant viruses as described above.
  • These pharmaceutical compositions can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the pharmaceutical compositions of the invention contain a pharmaceutically "acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for intravenous injection such as, for example into the portal vein of the patient.
  • This may be in particular isotonic sterile solutions , or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as the case may be of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes
  • Direct injection into the portal vein of the patient is advantageous because it makes it possible to target the infection in the liver and thus, to focus the therapeutic effect on this organ.
  • the doses of defective recombinant virus used for injection can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the viral vector, of the mode of administration used, of the pathology concerned or also of the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 14 pfu / ml, and preferably 10 6 to 10 10 pfu / ml.
  • the term pfu (“plaque forming unit”) corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 48 hours, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the compositions according to the invention can directly comprise the producer cells, with a view to their implantation.
  • another subject of the invention relates to any mammalian cell infected with one or more defective recombinant viruses as described above. More particularly, the invention relates to any population of human cells infected with these viruses. They may in particular be cells of blood origin (totipotent stem cells or precursors), fibroblasts, myoblasts, hepatocytes, keratinocytes, smooth and endothelial muscle cells, glial cells, etc.
  • the cells according to the invention can come from primary cultures. These can be removed by any technique known to those skilled in the art, then cultured under conditions allowing their proliferation. As regards more particularly fibroblasts, these can be easily obtained from biopsies, for example according to the technique described by Ham (Methods Cell Biol (1980) 21a: 255). These cells can be used directly for infection by viruses, or stored, for example by freezing, for the establishment of autologous libraries, for later use.
  • the cells according to the invention can also be secondary cultures, obtained for example from pre-established banks (see for example EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
  • the cultured cells are then infected with the recombinant viruses, to give them the capacity to produce a biologically active ABCA7 protein.
  • the infection is carried out in vitro according to techniques known to those skilled in the art. In particular, according to the type of cells used and the number of copies of virus per cell desired, a person skilled in the art can adapt the multiplicity of infections and possibly the number of cycles of infections carried out. It is understood that these steps must be carried out under conditions of appropriate sterility when the cells are intended for administration in vivo.
  • the doses of recombinant virus used for infection of the cells can be adapted by a person skilled in the art according to the aim sought.
  • the conditions described above for administration in vivo can be applied to infection in vitro.
  • retroviruses For infection with retroviruses, it is also possible to co-cultivate the cells which it is desired to infect with cells producing the recombinant retroviruses according to the invention. This makes it possible to dispense with the purification of retroviruses.
  • Another subject of the invention relates to an implant comprising mammalian cells infected with one or more defective recombinant viruses as described above or cells producing recombinant viruses, and an extracellular matrix.
  • the implants according to the invention comprise 10 ⁇ to 10 1 ° cells. More preferably, they include 10 6 to 10 8 .
  • the extracellular matrix comprises a gelling compound and optionally a support allowing the anchoring of the cells.
  • gelling agents are used for the inclusion of cells in a matrix having the constitution of a gel, and to promote the anchoring of the cells on the support, if necessary.
  • Different cell adhesion agents can therefore be used as gelling agents, such as in particular collagen, gelatin, glycosaminoglycans, fibronectin, lectins, etc.
  • collagen is used. It can be collagen of human, bovine or murine origin. More preferably, type I collagen is used.
  • compositions according to the invention advantageously comprise a support allowing the anchoring of the cells.
  • anchoring designates any form of biological and / or chemical and / or physical interaction resulting in the adhesion and / or fixing of the cells on the support.
  • the cells can either cover the support used, or penetrate inside this support, or both. It is preferred to use, within the framework of the invention, a solid, non-toxic and / or biocompatible support.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the present invention thus provides a very effective means for the treatment or prevention of pathologies linked to the transport of cholesterol, in particular obesity, hypertriglyceridemia, or, in the field of cardiovascular diseases, myocardial infarction, angina, sudden death, heart decompensation and stroke.
  • this treatment can concern both humans and any animal such as sheep, cattle, domestic animals (dogs, cats, etc.), horses, fish, etc.
  • the invention also relates to a recombinant host cell comprising any of the nucleic acids of the invention of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 6, and more particularly a nucleic acid of sequence SEQ ID NO 1 to SEQ ID # 3.
  • the invention also relates to a recombinant host cell comprising a recombinant vector as described above.
  • the preferred host cells according to the invention are for example the following: a) prokaryotic host cells: strains of Escherichia coli (strain DH5- ⁇ ), of
  • Bacillus subtilis from Salmonella typhimurium, or strains of species such as Pseudomonas, Streptomyces and Staphylococus; b) eukaryotic host cells: HeLa cells (ATCC No. CCL2), Cv 1 cells (ATCC No. CCL70), COS cells (ATCC No. CRL 1650), Sf-9 cells (ATCC No. CRL 1711), CHO cells ( ATCC N ° CCL-61) or 3T3 cells (ATCC N ° CRL-6361), or cells of the Hepa1-6 line referenced in the American Type Culture Collection (ATCC, R ⁇ ckville, MD, United States of America).
  • HeLa cells ATCC No. CCL2
  • Cv 1 cells ATCC No. CCL70
  • COS cells ATCC No. CRL 1650
  • Sf-9 cells ATCC No. CRL 1711
  • CHO cells ATCC N ° CCL-61
  • 3T3 cells ATCC N ° CRL-6361
  • the invention provides methods for treating a subject with a pathology related to the level of expression of the ABCA7 protein.
  • a treatment method consists in administering to the subject a compound modulating the expression of the gene.
  • ABCA7 which can be identified by various in vitro screening methods as defined below.
  • a first method consists in identifying compounds modulating the expression of the ABCA7 gene. According to such a method, cells expressing the ABCA7 gene are incubated with a candidate substance or molecule to be tested and the level of expression of the ABCA7 messenger RNA or the level of production of the ABCA7 protein is then determined.
  • the messenger RNA levels of ABCA7 can be determined by hybridization on a Northern type gel, well known to those skilled in the art.
  • the messenger RNA levels of ABCA7 can also be determined by methods using PCR or the technique described by WEBB et al. (Journal of
  • Production levels of the ABCA7 protein can be determined by immunoprecipitation or immunochemistry using an antibody that specifically recognizes the ABCA7 protein.
  • a nucleotide construct as defined above, comprising a regulatory nucleic acid according to the invention as well as a reporter polynucleotide placed under the control of the regulatory nucleic acid is used, said regulatory nucleic acid comprising at least one basic promoter and at least one regulatory element from one of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 3.
  • the reporter polynucleotide can be a gene encoding a detectable protein, such as a gene encoding a luciferase.
  • the cells are transfected with the polynucleotide construct containing the regulatory nucleic acid according to the invention and the reporter polynucleotide, in a stable or transient manner.
  • the transformed cells are then incubated in the presence or in the absence of the molecule or of the candidate substance to be tested for a sufficient time, then the level of expression of the reporter gene is determined.
  • the compounds which induce a statistically significant change in the expression of the reporter gene are then identified and, where appropriate, selected.
  • the subject of the invention is also a method for the in vitro screening of a molecule or of a substance modulating the activity of a regulatory nucleic acid according to the invention, in particular modulating the transcription of the reporter polynucleotide constituting a polynucleotide construct according to the invention, characterized in that it comprises the steps consisting in: a) culturing a recombinant host cell comprising a polynucleotide of interest placed under the control of a regulatory nucleic acid according to the invention; b) incubating the recombinant host cell with the substance or molecule to be tested; c) detecting the expression of the polynucleotide of interest; d) compare the results obtained in step c) with the results obtained when the recombinant host cell is cultured in the absence of the candidate molecule or substance to be tested.
  • the invention also relates to a kit or set for the in vitro screening of a candidate molecule or substance capable of modulating the activity of an acid nucleic regulator according to the invention, comprising: a) a host cell transformed with a polynucleotide construct as defined above, comprising a reporter polynucleotide of interest placed under the control of a regulatory nucleic acid according to the invention; and b) if appropriate, means for detecting the expression of the reporter polynucleotide of interest.
  • the reporter polynucleotide of interest is the coding sequence of a luciferase.
  • the regulatory nucleic acid according to the invention is inserted into a vector, upstream of the sequence coding for luciferase. It may for example be the vector pGL3-basic (pGL3-b) sold by the company PROMEGA
  • the recombinant vector comprising the coding sequence of luciferase placed under the control of a regulatory nucleic acid according to the invention is transfected into recombinant host cells, the luciferase activity of which is then determined after culturing in the presence or not of the candidate substance or molecule to be tested.
  • pGL3-b vectors containing either the cytomegalovirus (CMV) promoter, the ApoAl promoter or even no promoter can be used as controls.
  • the transfected cells are washed with PBS buffer and lysed with 500 ⁇ l of lysis buffer (50 mM tris, 150 mM NaCl, 0.02% sodium azide, 1% NP- 40, 100 ⁇ g / ml of AEBSF and 5 ⁇ g / ml of leupeptin).
  • lysis buffer 50 mM tris, 150 mM NaCl, 0.02% sodium azide, 1% NP- 40, 100 ⁇ g / ml of AEBSF and 5 ⁇ g / ml of leupeptin.
  • the polynucleotide constructs producing high levels of luciferase activity in the transfected cells are those which contain a regulatory nucleic acid according to the invention included in the sequence SEQ ID No. 1 which is capable of stimulating transcription.
  • first probes specific to the messenger RNA of the reporter polynucleotide are first prepared, for example using the multiprime labeling kit (sold by the Amersham Life Sciences Company, Cleveland, Ohio, United States).
  • compositions modulating the activity of a regulatory nucleic acid according to the invention can be identified in vivo, in non-human transgenic animals.
  • a non-human transgenic animal for example a mouse
  • a candidate molecule or substance to be tested for example a candidate substance or molecule previously selected by an in vitro screening method as defined above.
  • the activity level of the regulatory nucleic acid according to the invention is determined and compared with the activity of an identical non-human transgenic animal, for example an identical transgenic mouse, which has not received the candidate molecule or substance.
  • the activity of the regulatory nucleic acid according to the invention which is functional in the transgenic animal can be determined by various methods, for example the measurement of the levels of messenger RNA corresponding to the reporter polynucleotides of interest placed under the control of said nucleic acid. regulator by Northern hybridization, or by in situ hybridization, or by non-invasive biophotonic imaging (Xenogen Corporation).
  • the activity of the regulatory nucleic acid according to the invention can be determined by measuring the expression levels of protein encoded by the reporter polynucleotides of interest, for example by immunohistochemistry, in the case where the reporter polynucleotide of interest includes an open reading frame encoding a protein detectable by such a technique.
  • non-human mammals such as mice, rats or guinea pigs or rabbits which have their genome modified by the insertion of a polynucleotide construct comprising a reporter polynucleotide of interest placed under the control of a regulatory nucleic acid according to the invention.
  • transgenic animals according to the invention comprise the transgene, that is to say the abovementioned polynucleotide construct, in a plurality of their somatic and / or germ cells.
  • transgenic animals can be carried out according to conventional techniques well known to those skilled in the art.
  • a person skilled in the art may in particular refer to the production of transgenic animals, and particularly to the production of transgenic mice, as described in US patents No. 4,873,191 (issued October 10, 1989), US No. 5,464,764 ( issued November 7, 1995) and US 5,789,215 (issued August 4, 1998) the content of these documents being incorporated herein by reference.
  • a polynucleotide construct comprising a regulatory nucleic acid according to the invention and a reporter polynucleotide of interest placed under the control of the latter is inserted into an ES type stem cell line.
  • the insertion of the polynucleotide construct is preferably carried out by electroporation, as described by Thomas et al. (1987, Cell, Vol. 51: 503-512).
  • the cells which have undergone the electroporation step are then screened for the presence of the polynucleotide construct (for example by selection using markers, or by PCR or by analysis on Southern DNA-type electrophoresis gel. ) in order to select the positive cells which have integrated the exogenous polynucleotide construct into their genome, if appropriate following a homologous recombination event.
  • Such a technique is for example described by MANSOUR et al. (Nature (1988) 336: 348-352).
  • ES type cells are brought into contact with 2.5-day embryos at an 8-16 cell stage (moruiae) as described by WOOD et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90: 4582-4585) or by NAGY et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90: 8424-8428), the ES cells being internalized in order to colonize the blastocyst extensively, including the cells giving rise to the germ line. The descendants are then tested to determine those who have integrated the polynucleotide construct (the transgene).
  • the invention therefore also relates to a non-human transgenic animal whose somatic and / or germ cells have been transformed by a nucleic acid or a polynucleotide construct according to the invention.
  • the invention also relates to recombinant host cells obtained from a transgenic animal as described above.
  • Recombinant cell lines from a transgenic animal according to the invention can be established in long-term culture from any tissue of such a transgenic animal, for example by transfection of primary cell cultures with vectors expressing oncogenes such as the large T antigen of SV40, as described for example by CHOU (1989, Mol. Endocrinol. Vol. 3: 1511-1514) and SCHAY et al. (1991, Biochem. Biophys.
  • the invention also relates to a method for the in vivo screening of a molecule or of a candidate substance modulating the activity of a regulatory nucleic acid according to the invention, comprising the steps consisting in a) administering the substance or the candidate molecule for a transgenic animal as defined above; b) detecting the expression level of a reporter polynucleotide of interest placed under the control of the regulatory nucleic acid; c) compare the results obtained in b) with the results obtained in a transgenic animal which has not received the candidate substance or molecule.
  • the invention further relates to a method for in vivo screening of a substance or molecule modulating the transcription of a polynucleotide of interest constituting a nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the steps consisting in (a) administering the candidate substance or molecule to a non-human transgenic mammal as defined above; (b) detecting the expression of the polynucleotide of interest in the transgenic mammal as treated in step a); and (c) comparing the detection results of step (b) with the results observed in a non-human transgenic mammal as defined above who have not received the administration of the candidate substance or molecule.
  • the invention also relates to a kit or kit for the in vivo screening of a candidate molecule or substance modulating the activity of a regulatory nucleic acid according to the invention, comprising (a) a transgenic animal as defined above above ; (b) if appropriate, the means for detecting the level of expression of the reporter polynucleotide of interest.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions intended for the prevention or treatment of a deficit in lipid metabolism, or of a dysfunction in the processes involving the immune system and inflammation.
  • the subject of the invention is also a substance or a candidate molecule modulating the activity of a regulatory nucleic acid according to the invention.
  • the invention also relates to a candidate substance or molecule characterized in that it increases the activity of a regulatory nucleic acid according to the invention, and very particularly of a regulatory nucleic acid comprising sequence SEQ ID N ° 1, 2, 4 or 5.
  • a substance or molecule capable of modulating the activity of a regulatory nucleic acid according to the invention was selected according to one of the screening methods in vitro or in vivo defined above.
  • a subject affected in lipid metabolism or in the signaling of immunity is treated by the administration on this subject of an effective amount of a compound modulating the activity of a regulatory nucleic acid according to the invention .
  • a patient with low activity of the ABCA7 promoter can be treated with an aforementioned molecule or substance in order to increase the activity of the ABCA7 promoter.
  • a patient with abnormally high ABCA7 promoter activity may be treated with a compound capable of decreasing or blocking the activity of the ABCA7 promoter.
  • the present invention also relates to a substance or molecule used as an active principle of a medicament.
  • a compound can be a compound which modulates the interaction of at least one transcription factor with the ABCA7 promoter or a regulatory element of a regulatory nucleic acid according to the invention.
  • the compound can inhibit the interaction of one of the transcription factors listed in Table 1 with a regulatory nucleic acid according to the invention.
  • the compound can also be a compound which modulates the activity of a transcription factor which binds to the promoter of ABCA7 or of a regulatory element present on the latter.
  • a compound of therapeutic interest according to the invention can also be a compound which modulates the interaction of a first transcription factor with a second transcription factor.
  • a compound of therapeutic interest according to the invention is preferably chosen from nucleic acids, peptides and small molecules.
  • such a compound can be an antisense nucleic acid which binds specifically on a region of the ABCA7 promoter or on a regulatory element of an ABCA7 regulatory nucleic acid and inhibiting or decreasing the activity of the promoter.
  • This compound of therapeutic interest can also be an antisense nucleic acid which interacts specifically with a gene coding for a transcription factor modulating the activity of the promoter ABCA7, such that the interaction of the antisense nucleic acid with the coding gene for the transcription factor which binds to the promoter ABCA7 decreases the production of this transcription factor, resulting in an increase or a decrease in the activity of the promoter ABCA7, depending on whether the transcription factor increases or on the contrary reduces the activity of promoter ABCA7.
  • the toxicity and the therapeutic efficacy of the therapeutic compounds according to the invention can be determined according to standard pharmaceutical protocols in cells in culture or in experimental animals, for example to determine the lethal dose LD 50 (i.e. the lethal dose for 50% of the population tested) as well as the effective dose ED 5 o (that is to say the therapeutically effective dose in 50% of the population tested).
  • LD 50 i.e. the lethal dose for 50% of the population tested
  • ED 5 o that is to say the therapeutically effective dose in 50% of the population tested.
  • the therapeutically effective dose can be estimated initially from tests carried out in cell cultures in vitro.
  • a subject of the invention is also pharmaceutical compositions comprising a therapeutically effective amount of a substance or molecule of therapeutic interest according to the invention.
  • compositions according to the invention are more particularly intended for the treatment and / or prevention of deficiencies in the metabolism of lipids, or in the mechanisms involving the immune system and inflammation.
  • compositions can be formulated in conventional manner using one or more physiologically acceptable vectors or excipients.
  • the compounds of therapeutic interest according to the invention can be formulated for administration by injection, inhalation or also by oral, buccal, parenteral or rectal administration.
  • Techniques for preparing pharmaceutical compositions according to the invention can be easily found by those skilled in the art trade, for example in the book Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mead Publishing Co., Easton, PA, USA.
  • compositions according to the invention can be formulated in the form of liquid solutions, preferably in physiologically compatible solutions or buffers.
  • the invention further relates to methods for determining whether a subject presents a risk for the development of a pathology linked to a deficit in lipid metabolism, or in processes involving the immune system and inflammation.
  • Such methods include detecting, in cells of a biological sample from the test subject, the presence or absence of a genetic alteration characterized by an alteration in the expression of a gene whose expression is regulated by the promoter of ABCA7.
  • a genetic alteration characterized by an alteration in the expression of a gene whose expression is regulated by the promoter of ABCA7.
  • such genetic alterations can be detected in order to determine the existence of a deletion of one or more nucleotides in the sequence of an ABCA7 regulatory nucleic acid, of the addition of one or more nucleotides or alternatively the substitution of one or more nucleotides in said sequence SEQ ID No. 1, 2, 3 or 6.
  • the genetic alteration is identified according to a method comprising the sequencing of all or part of the sequence SEQ ID N ° 1, or alternatively of all or part of at least the sequence SEQ ID N ° 2.
  • Sequencing primers can be constructed in order to hybridize with a determined region of the sequence SEQ ID No. 1. Such sequencing primers are preferably constructed so as to amplify fragments of approximately 300 about 500 nucleotides from the sequence SEQ ID No. 1 or from a complementary sequence.
  • the amplified fragments for example by the PCR method, are then sequenced and the sequence obtained is compared with the reference sequence SEQ ID No. 1 in order to determine whether one or more deletions, additions or substitutions of nucleotides are found in the amplified sequence from the DNA contained in the biological sample from the test subject.
  • the invention therefore also relates to a method for detecting an alteration in the transcription of the ABCA7 gene in a subject, comprising the following steps: a) sequencing of an amplifiable nucleic acid fragment using at least one nucleotide primer hybridizing with the sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 according to the invention; b) align the sequence obtained in a) with the sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2; c) determining the presence of one or more deletions, additions or substitutions of at least one nucleotide in the sequence of the nucleic acid fragment, relative to the reference sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2.
  • the invention also relates to a kit or kit for the detection of an alteration in the transcription of the ABCA7 gene in a subject, comprising one or more sequencing primers capable of hybridizing with a region of the sequence SEQ ID No: 1, and thus allow the sequencing of a polynucleotide located upstream of the site of initiation of transcription of the ABCA7 gene in the test subject.
  • part of the invention also includes oligonucleotide probes hybridizing with a region of the sequence SEQ ID No. 1 or of the sequence SEQ ID No. 2 in which an alteration in the sequence was determined during implementation of the detection method described above.
  • oligonucleotide probes hybridizing specifically with a corresponding region of the sequence SEQ ID No 1 or of the sequence SEQ ID No 2, for which one or more deletions, additions or substitutions of at least one nucleotide has been determined in a subject.
  • Such oligonucleotide probes constitute means for detecting alterations in the regulatory sequence of the ABCA7 gene and therefore also means for detecting a predisposition to the development of a pathology linked to a deficit in lipid metabolism or to dysfunction at the level processes involving the immune system and inflammation.
  • a further subject of the invention is therefore a kit or kit for detecting an alteration in the transcription of the ABCA7 gene in a subject, comprising: a) one or more primers hybridizing with a region of the sequence SEQ ID No. 1 or the sequence SEQ ID No. 2; b) if necessary, the means necessary for carrying out an amplification reaction.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the detection of an alteration in the transcription of the ABCA7 gene in a subject, comprising: a) one or more oligonucleotide probes as defined above; b) where appropriate, the reagents necessary for carrying out a hybridization reaction.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the detection of an alteration in the transcription of the ABCA7 gene in a subject, comprising one or more probes hybridizing with a region of the sequence SEQ ID No: 1 or of the sequence SEQ ID No: 2 used to quantify the messenger RNA of ABCA7 in biological material originating from said test subject.
  • nucleic acid fragments derived from any one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 -6 are therefore useful for the detection of the presence of at least one copy of a nucleotide sequence regulating the ABCA7 gene or else of a fragment or variant (containing a mutation or polymorphism) of the latter in a sample.
  • nucleotide probes or primers according to the invention comprise at least 8 consecutive nucleotides of a nucleic acid chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO 1 -5, or of a nucleic acid of complementary sequence.
  • nucleotide probes or primers according to the invention will have a length of 10, 12, 15, 18 or 20 to 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 consecutive nucleotides d 'a nucleic acid according to the invention, in particular a nucleic acid of nucleotide sequence chosen from sequences SEQ ID NO 1- 5.
  • a probe or a nucleotide primer according to the invention will consist and / or include fragments with a length of 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucleotides sequences of a nucleic acid according to the invention, more particularly of a nucleic acid chosen from the sequences SEQ
  • the definition of a probe and of a nucleotide primer according to the invention therefore includes oligonucleotides which hybridize, under the conditions of high stringency hybridization defined above, with a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID NO 1 - 5, 6 or 8 or with a sequence complementary to these.
  • a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as the method to the phosphodiester of Narang et al., (Methods Enzymol (1979) 68: 90-98) or of Brown et al. (Methods Enzymol (1979) 68: 109-151), the diethylphosphoramidite method of Beaucage et al. (Tetrahedron Lett (1980) 22: 1859-1862) or the solid support technique described in patent EP 0 707 592.
  • Each of the nucleic acids according to the invention can be marked, if desired, by incorporating a marker detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
  • markers can consist of radioactive isotopes (32P, 33P, 3H, 35S), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin) or also ligands such as biotin.
  • the labeling of the probes is preferably carried out by incorporation of labeled molecules within the polynucleotides by extension of primers, or by addition on the 5 ′ or 3 ′ ends or also by “nick translation”.
  • the probes according to the invention may have structural characteristics such as to allow amplification of the signal, such as the probes described by Urdea et al. (Mol. Cell. Biol., (1991) 6: 716-718), or also in European patent n ° EP-0 225 807 (CHIRON).
  • the oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in hybridizations of the Southern type with genomic DNA or else of the northern type with RNA.
  • the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
  • Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
  • solid supports are well known to those skilled in the art and include surfaces of the wells of microtiter plates, polystyrene beds, magnetic beds, nitrocellulose strips, or even microparticles such as latex particles.
  • the present invention also relates to a method for detecting the presence of a nucleic acid as described above in a sample, said method comprising the steps consisting in: 1) bringing one or more nucleotide probes according to l invention with the test sample;
  • the oligonucleotide probe (s) are immobilized on a support.
  • the oligonucleotide probes include a detectable marker.
  • the invention further relates to a kit or kit for detecting the presence of a nucleic acid according to the invention in a sample, said kit comprising: a) one or more nucleotide probes as described above; b) where appropriate, the reagents necessary for the hybridization reaction.
  • the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
  • the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • such a kit will comprise a plurality of oligonucleotide probes in accordance with the invention which can be used to detect target sequences of interest or alternatively to detect mutations in the coding regions or the non-coding regions of the nucleic acids according to the invention, more particularly nucleic acids of sequences SEQ ID NO 1-5, 6 and 8 or the nucleic acids of complementary sequence.
  • the probes according to the invention immobilized on a support can be ordered in matrices such as "DNA chips".
  • matrices such as "DNA chips”.
  • nucleotide primers according to the invention can be used to amplify any of the nucleic acids according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID NO 1-5, or alternatively a variant of that -this.
  • Another subject of the invention relates to a method for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly a nucleic acid of sequences SEQ ID NO 1-5 or a fragment or a variant thereof contained in a sample, said method comprising the steps consisting in: a) bringing the sample, in which the presence of the target nucleic acid is suspected, into contact with a pair of nucleotide primers whose position hybridization is located respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side of the region of the target nucleic acid whose amplification is sought, in the presence of the reagents necessary for the amplification reaction; and b) detecting amplified nucleic acids.
  • amplification method as defined above, one will advantageously have recourse to any one of the nucleotide primers described above.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID NO 1-5, said kit or kit comprising a) a pair of nucleotide primers in accordance with the invention, the hybridization position of which is located respectively on the 5 'side and on the 3' side of the target nucleic acid whose amplification is sought; b) where appropriate, the reagents necessary for the amplification reaction.
  • Such an amplification kit or kit will advantageously comprise at least one pair of nucleotide primers as described above.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the sites of transcription factors found in humans and mice within the promoter region of the ABCA7 genes.
  • FIG. 2 illustrates the sequence SEQ ID No. 1 and the position of each of the characteristic motifs for attachment to different transcription factors is shown in bold type, the designation of the specific transcription factor of the corresponding sequence being indicated above the nucleotide sequence.
  • FIG. 3 illustrates the sequence SEQ ID No. 4 and the position of each of the characteristic motifs for attachment to different transcription factors is shown in bold type, the designation of the specific transcription factor of the corresponding sequence being indicated above the nucleotide sequence.
  • FIG. 4 illustrates the pattern of expression of the human ABCA7 gene on northern blots of different adult and fetal tissues (Clontech) hybridized with an amplimer produced with the primers SEQ ID Nos. 9 and 10 (table 4).
  • FIG. 5 illustrates the pattern of expression of the murine ABCA7 gene on a northern blot of different adult tissues hybridized with an amplimer produced with primers specific for the murine transcript.
  • FIG. 6 represents the expression profile of the gene coding for the protein ABCA7 on a cross section of an inflamed artery, by in situ hybridization with an antisense probe ABCA7.
  • FIG. 7 represents the expression profile of the gene coding for the protein ABCA7 on a section of the bronchi of an asthmatic patient, by in situ hybridization with an antisense probe ABCA7.
  • FIG. 8 represents the expression profile of the gene coding for the protein
  • ABCA7 on a colon section of a patient with Crohn's disease, by in situ hybridization with an ABCA7 antisense probe.
  • FIG. 9 represents the expression profile of the gene coding for the protein ABCA7 on a section of the lymph node, by in situ hybridization with an antisense probe ABCA7.
  • FIG. 10 represents the expression profile of the gene coding for the ABCA7 protein of a synovial section of a patient suffering from rheumatoid arthritis, by in situ hybridization with an ABCA7 antisense probe.
  • FIG. 11 represents the expression profile of the gene coding for the protein ABCA7 on a section of skin of a patient suffering from psoriasis by in situ hybridization with an antisense probe ABCA7.
  • RACE RT-PCR
  • MRNAs polyA
  • the first amplification primers and the internal primers were chosen from the cDNA sequence.
  • the amplifications carried out with the internal PCR amplification primers were cloned. Specific clones were then amplified using primers whose sequences are respectively (CAGGAAACAGCTATGAC) and (GCCAGTGTGATGGATAT) and sequences on both strands.
  • the transcription initiation site was located on the promoters of the human and murine genes of ABCA7 using the following three software: TSSG and TSSW (Solovyev et al., Ismb (1997) 5, 294-302) and NNPP ( Reese MG, et al., 1999).
  • a prediction of the binding sites for human and murine transcription factors was made using the Matlnspector motif search program (Quandt et al., Nucl Acid Research (1995) 23 (23) 4878-84).
  • the calculation of the scores for each transcription factor binding site is carried out using the following formula: (Of- Tf) / (Tf) 1/2 , in which Of is the frequency of observation of a pattern and Tf is the calculated frequency of a consensus pattern.
  • a first filtration step was carried out by adjusting the “matrix similarity” score of the Matlnspector program above 0.85 and the “core similarity” score above 0.99.
  • a comparative analysis of the interspecies promoters was carried out according to what is described by Werner T (Models for prediction and recognition of eukaryotic promoters, Mammalian Génome (1999) 10: 168-175) in order to define transcription modules comprising sites with a similar motif and present both on the human and murine sequences of the sequence upstream of the ABCA7 gene.
  • the expression profile of the polynucleotides according to the present invention is determined according to the northern blot analysis and reverse transcription protocols coupled to the PCR described in particular by Sambrook et al (ref. CSH Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989). "Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 2 ⁇ ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Reverse transcription into cDNA is carried out with the enzyme SUPERSCRIPT II (GibcoBRL, Life Technologies) according to the conditions described by the manufacturer.
  • the polymerase chain reaction is carried out according to standard conditions, in 20 ⁇ l of reaction mixture with 25 ng of the cDNA preparation.
  • the reaction mixture is composed of 400 ⁇ M of each of the dNTPs, of 2 units of Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase (Ampli Taq Gold; Perkin Elmer), of 0.5 ⁇ M of each primer, of 2.5 mM MgCI2, and of PCR buffer.
  • Taq Thermus aquaticus
  • PCR cycles (denaturation 30 s at 94 ° C, 30 s hybridization broken down as follows during the 30 cycles: 64 ° C 2 cycles, 61 ° C 2 cycles, 58 ° C 2 cycles and 55 ° C 28 cycles and one elongation of one minute per kilobase at 72 ° C) are carried out after a first denaturation step at 94 ° C for 10 min in a Perkin Elmer 9700 thermocycler.
  • the PCR reactions are visualized on agarose gel by electrophoresis.
  • the cDNA fragments obtained can be used as probes for analysis by Northern blot and can also be used for the exact determination of the polynucleotide sequence.
  • a cDNA probe produced as described above is labeled with 32 P using the High Prime DNA labeling system (Boehringer) according to the instructions indicated by the manufacturer. After labeling, the probe is purified on a micro-column of Sephadex G50 (Pharmacia) according to the instructions indicated by the manufacturer. The labeled and purified probe is then used for the detection of the expression of mRNAs in different tissues.
  • the blot is analyzed after a night of exposure on contact with a phosphor screen revealed using the Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
  • the results presented in FIG. 5 show that the mouse ABCA7 gene is expressed in adult tissues. A higher amount of murine ABCA7 mRNA is detected in hematopoietic tissues such as the spleen and thymus, which is consistent with the expression of ABCA7 which has been observed in myelomonocytic and lymphocytic lines. No expression of the ABCA7 gene was detected in the fibroblastic cell lines.
  • Figure 4 shows a similar expression pattern of the human ABCA7 gene with, however, a strong signal of hybridization in the fetal liver.
  • RNAs are obtained from hematopoietic tissues of normal subjects or those affected by the guanidine isothiocyanate method (Chomczynski et al., Anal Biochem (1987) 162: 156-159).
  • Poly (A) + mRNAs are obtained by affinity chromatography on oligo (dT) -cellulose columns (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2 ed.
  • cDNAs used as probes are obtained by RT-PCR (DeRisi et al., Science (1997) 278: 680-686) with oligonucleotides labeled with a fluorescent product (Amersham Pharmacia Biotech; CyDye TM).
  • the glass slides containing the sequences according to the present invention corresponding to the ABCA7 gene are hydridized with the nucleotide probes prepared from the messenger RNA of the cell to be analyzed.
  • the use of the Amersham / molecular Dynamics system (Avalanche Microscanner TM) allows the differential quantification of the expressions of the sequence products on the healthy or affected cell type.
  • EXAMPLE 5 Test intended for the screening of molecules activating or inhibiting the expression of the ABCA7 gene.
  • the screening test makes it possible to identify a substance capable of modulating the activity of synthesis of the ABCA7 protein.
  • the region of the regulatory acid of the human ABCA7 gene going from the nucleotide at position -1111 to the nucleotide at position -1, relative to the site of initiation of transcription, can be amplified by the PCR technique using the pair of primers specific for the region described above from human genomic DNA present in a BAC vector from a collection of human BAC vectors.
  • the amplified DNA fragment is digested with the restriction endonuclease Sal 1, then inserted into the vector PXP1 described by Nordeen et al. (Bio Techniques, (1988) 6: 454-457), at the Sal 1 restriction site of this vector. The insert was then sequenced.
  • E-MEM medium Minimun Essential Medium with Earle's Salts
  • 10% (v / v) fetal calf serum BioWhittaker, Walkersville, MD.
  • Approximately 1.5 X 10 5 cells were distributed into each of the wells of a 12-well culture plate (2.5 cm), and were grown to about 50-70% confluence, then co-transformed with 1 ⁇ g of the plasmid Sal-Lucif and 0.5 ⁇ g of the control vector pBetagal (CloneTech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA) using the necessary Superfectin Reagent Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). Two hours after the addition of the DNA, the culture medium is removed and replaced with complete AMEM medium (Minimum Esential Medium Eagle's Alpha Modification).
  • AMEM medium Minimum Esential Medium Eagle's Alpha Modification
  • the cells are placed in fresh medium of the DMEM type (Dulbecco's Minimum Essential Medium) supplemented with 2 ⁇ g / ml of glutamine, 100 units / ml of streptomycin and 0.1% bovine serum albumin (BSA , Fraction V), in the presence or absence of molecules at different concentrations.
  • DMEM Dulbecco's Minimum Essential Medium
  • BSA bovine serum albumin
  • the cells are recovered 16 hours after the last change of medium using a lysis solution (Lysis Solution) from the Tropix Luciferase Assay Kit (Tropix Inc., Bedford, MA, USA).
  • the cell lysate is divided into aliquots which are used to quantify the proteins using the MicroBCA Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) as well as to quantify the production of luciferase and beta-galactosidase respectively.
  • required Tropix Luciférase Assay Kit and Galacto-Light Plus Kit The tests are carried out according to the manufacturer's recommendations.
  • the molecules active on the ABCA7 promoter are then selected according to the ratio "luciferase activity / beta-galactosidase activity.
  • RNA probes Tissue samples involved in paraffin were hybridized with complementary radioactive labeled RNA probes. More specifically, a fragment of the ABCA7 gene corresponding to the nucleotide sequence going from nucleotide 594 to nucleotide 1055 of the GenBank sequence designated NM-0191 12 was subcloned in the plasmid pCRI1 (Invitrogen).
  • RNA probes labeled with Uridin triphosphate 35 S were then generated with the RNA polymerases SP6 and T7, then hybridized to the different tissue sections.
  • the different sections of tissue were digested with proteinase K and hybridized with the previously described probes at a concentration equal to approximately 3.5 ⁇ 10 7 dpm / ml for 18 hours at 65 ° C.
  • the slides were then treated with RNAase A and washed in SSC, 0.1 X at 70 ° C for 2 hours, and were covered with a Kodak NTB-2 photographic emulsion, exposed for 7 days to 4 ° C, then revealed using a Kodak D-19 solution.
  • Figure 6 is a section through the artery of a 92-year-old man who underwent an amputation below the knee, with arteriosclerosis and acute inflammation. There is a weak specific marking of the macrophages in the thrombi and in the site of inflammatory infiltration in the adventitious coat.
  • Figure 7 which is a section of bronchi taken during the autopsy of a 63 year old asthmatic woman, shows a weak marking of lymphocytes and macrophages in the inflammatory submucosal infiltrate.
  • Figure 8 is a section of colon collected during the operation of an 81-year-old woman with a clinical diagnosis of Crohn's disease. We observes a labeling of macrophages and a subfamily of lymphocytes in the lamina propria.
  • Figure 9 corresponds to a section of a lymph node removed during the operation of a 48-year-old man.
  • the ganglion cells are weakly labeled, and isolated macrophages are also labeled in the lymph node.
  • FIG. 10 which represents a section of the synovium of a 25 year old woman presenting a clinical diagnosis of rheumatoid arthritis, shows a strong marking of the sub synovial histiocytes and the macrophages.
  • FIG. 11 which represents a section of skin obtained following the biopsy of a 55 year old woman suffering from psoriasis, shows an average marking of the macrophages in the perivascular inflammatory infiltrate. Isolated perivascular lymphocytes are also labeled.
  • Table 1 Sites, scores, consensus, and positions relative to the transcription initiation point (TSS) predicted by NNPP, TSSG and TSSW software in humans
  • mice Sites, scores, consensus, and positions relative to the point of initiation of transciription (TSS) predicted by NNPP, TSSG and TSSW software in mice
  • Oligonucleotides specific for the human ABC-A7 gene are Oligonucleotides specific for the human ABC-A7 gene.

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Abstract

La présente invention concerne un acide nucléique capable de réguler la transcription de gène ABCA7, qui code pour une protéine transporteur susceptible de jouer un rôle dans le métabolisme des lipides et/ou dans les processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation. Par ailleurs, de par la position du gène sur le chromosome 19 en q13, ABCA7 est potentiellement impliqué dans d'autres pathologies liées génétiquement à ce locus. La présente invention est également relative à des constructions nucléotidiques comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène ABCA7. L'invention a également trait à des vecteurs recombinants, des cellules hôtes transformées et des mammifères transgéniques non humains comprenant un acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 ou une construction nucléotidique précitée, ainsi que des procédés pour le criblage de molécules ou de substances capables de moduler l'activité de l'acide nucléique régulateur de gène ABCA7.

Description

ACIDE NUCLEIQUE REGULATEUR DU GENE ABCA7. MOLECULES MODULANT SON ACTIVITE ET APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
La présente invention concerne un acide nucléique capable de réguler la transcription du gène ABCA7, qui est un gène susceptible d'inteπ/enir dans le métabolisme des lipides au niveau des tissus hématopoïétiques, ainsi que dans les mécanismes de signalisation cellulaire liés à la réaction immunitaire et à l'inflammation.
La présente invention décrit aussi des polypeptides et des polynucléotides dont une altération de la séquence ou de l'expression est potentiellement impliquée dans des maladies associées au locus génétique q13 du chromosome 19.
La présente invention est également relative à des constructions nucléotidiques comprenant un polynucleotide codant pour un polypeptide ou produisant un acide nucléique d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène humain ou murin ABCA7. L'invention a également trait à des vecteurs recombinants, des cellules hôtes transformées, et des mammifères transgéniques non humains, comprenant un acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 humain et de souris ou une construction nucléotidique précitée, ainsi que des procédés pour le criblage de molécules ou de substances capables de moduler l'activité de l'acide nucléique régulateur du gène ABCA7.
L'invention est en outre relative à des procédés permettant de détecter une altération de la transcription du gène ABCA7 et ainsi de diagnostiquer un éventuel dysfonctionnement dans le métabolisme lipidique au niveau des tissus hématopoïétiques et dans les mécanismes de signalisation cellulaire de l'immunité. Elle a également pour objet des substances ou molécules modulant l'activité de l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 ainsi que des compositions pharmaceutiques contenant de telles substances ou de telles molécules.
Les protéines transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) constituent une superfamille extrêmement conservées au cours de l'évolution, de la bactérie à l'homme. Ces protéines sont impliquées dans le transport membranaire de divers substrats, par exemple des ions, des acides aminés, des peptides, des sucres, des vitamines ou encore des hormones stéroïdiennes (Higgins et al., Annu Rev.Cell Biol, 8, (1992) 67-1 13). La caractérisation de la séquence complète en acides aminés de certains transporteurs ABC a permis de définir une structure générale commune, comprenant notamment, deux repliements de liaison aux nucléotides (Nucleotide Binding Fold ou NBF) avec des motifs de type Walker A et B, ainsi que deux domaines transmembranaires, chacun des domaines transmembranaires étant constitué de six hélices (Klein et al., BBA, 1461 (1999), 237-262). La spécificité des transporteurs ABC pour les différentes molécules transportées semble être déterminée par la structure des domaines transmembranaires, alors que l'énergie nécessaire à l'activité de transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du repliement NBF (Dean et al., Curr.Opin.Genet.Dev, 5 (1995) 779-785).
Plusieurs protéines transporteurs ABC ont été identifiées chez l'homme et un certain nombre d'entre elles ont été associées à diverses maladies.
Par exemple, la mucoviscidose est provoquée par des mutations dans le gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), également désigné ABCC7.
Par ailleurs, certains phénotypes de résistance multiple aux médicaments dans les cellules tumorales ont été associés à dés mutations dans" les gènes codant des protéines MDR (multi-drug résistance) également désignés ABCB, qui ont également une structure de transporteur ABC. D'autres transporteurs ABC ont été associés à des affections neuronales et tumorales (brevet US N°5,858,719) ou sont encore potentiellement impliqués dans des maladies provoquées par une altération de l'homéostasie des métaux, notamment la protéine ABC-3.
De même, un autre ABC transporteur, désigné PFIC2 ou ABCB11 , semble être impliqué dans une forme de cholestasie intrahepatique familiale progressive, cette protéine étant potentiellement responsable, chez l'homme, de l'exportation des sels biliaires.
Une sous-famille A des transporteurs ABC désignée ABCA a été également identifiée. Elle se caractérise par la présence d'un segment hautement hydrophobe (HH1 : highiy hydrophobic) entre les deux domaines transmembranaires, liés aux deux motifs NBF (Broccardo et al., BBA 1461 (1999) 395-404). Quatre membres de cette sous famille ont été jusqu'à présent caractérisés. Il s'agit des transporteurs ABCA1 et ABCA2, tous deux localisés sur le chromosome 9, respectivement aux locus 9q22-9q31 et 9q34, ainsi que le transporteur ABCA3 localisé sur le chromosome 16p13.3, et enfin le transporteur ABCA4 ou ABCR localisé sur le chromosome 1 p22 (Broccardo et al., 1999). Les membres de cette sous famille sont également fortement conservés au cours de l'évolution des eucaryotes multicellulaires. A titre d'exemples les transporteurs ABCA1 et ABCA4 qui sont les mieux connus présentent une identité respectivement de 95% et de 88% avec leurs orthologues murins. Les membres de cette sous famille sont en outre fortement apparentés, puisque par exemple les transporteurs ABCA1 et ABCA4 présentent une identité de séquence protéique de 50.9%, ainsi qu'une organisation génomique très similaire (Allikmets et al., Nat. Genêt. (1997) 15, 236- 246 ; Broccardo et al., Biochim. Biophys. Acta (1999) 1461 , 395-404 ; Luciani et al., Genomics (1994) 21 (1), 150-9 ; Remaley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96(22), 12685-90).
Par ailleurs, les membres de la sous-famille A semblent présenter une spécialisation fonctionnelle similaire au niveau du transport des lipides et des phospholipides membranaires. Il a en effet été montré que la perte de la fonction de ces transporteurs affecte le renouvellement des phospholipides de la bicouche des membranes cellulaires. Dans le cas de ABCA4, on constate dans un premier temps un renouvellement anormal des phosphatidyléthanolamine (PE) dans la partie externe de la membrane des cellules à bâtonnets, qui conduit par une succession d'événements, à une perte totale de l'acuité visuelle (Weng et al., Cell (1999) 98(1), 13-23. Dans le cas de ABCA1 , on constate une distribution anormale des phospholipides membranaires au sein des couches de la membrane plasmique, qui résulte plus précisément en la présence en plus grande quantité de phosphatidylsérine dans la couche externe, et en une perturbation de la concentration de Ca2+. Les transporteurs ABCA1 et ABCA4 ont été particulièrement étudiés. Le gène
ABCA1 semble en effet être impliqué dans les pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme du cholestérol induisant des maladies comme l'athérosclérose, ou des déficiences familiales en HDL (FHD) comme la maladie de Tangier (FR 99/7684000 ; Rust et al., Nat.Genet, 22 (1999) 352-355; Brooks-Wilson et al., Nat. Genêt, 22 (1999) 336-345; Bodzioch et al., Nat.Genet. 22 (1999) 347-351 ; Orso et al., Nat.Genet, 24 (2000) 192-196). La maladie de Tangier semblerait être liée à un déficit cellulaire dans la translocation du cholestérol cellulaire qui entraîne une dégradation des HDLs, et par là même une perturbation du métabolisme lipoprotéique. Ainsi, il semblerait que les particules HDL qui n'incorporent pas de cholestérol à partir des cellules périphériques, ne sont pas métabolisées correctement, mais sont au contraire éliminées rapidement de l'organisme. La concentration plasmatique en HDL de ces patients est donc extrêmement réduite et les HDLs n'assurent plus le retour du cholestérol vers le foie. Ce cholestérol s'accumule dans ces cellules périphériques et provoque des manifestations cliniques caractéristiques telles que la formation d'amygdales orangées. De plus, d'autres perturbations lipoprotéiques comme une surproduction de triglycérides ainsi qu'une synthèse et un catabolisme intracellulaire accrus des phospholipides sont observées. Le transporteur ABCA4 a par ailleurs été associé aux maladies dégénératives et inflammatoires occulaires telles que la maladie récessive de Stargardt (Allikmets et al., 1997) et la dégénérescence de la région maculaire de la rétine liée à l'âge (AMD) (Allikmets et al., Nat.Genet. 15 (1997) 236-246 ; Allikmets et al., Science, 277 (1997) 1805-1807 ; Cremers et al., Hum. Mol. Genêt. (1998), 7(3), 355-62 ; Martinez-Mir et al., Nat. Genêt. 18 (1998) 1 1 -12; Weng et al., Ce// (1999) 98(1), 13-23).
Chez l'homme, un ADNc comprenant la totalité de la phase de lecture ouverte d'un nouveau membre de la sous famille A des transporteurs ABC (« ATP-Binding Cassette») a été récemment clone à partir d'ARN de macrophages humains, et est désigné ABCA7 (Kaminski et al., BBR, 273(2000), 532-538). La caractérisation de la séquence complète en acides aminés de ABCA7 indique que le produit protéique présente la structure générale caractéristique des transporteurs ABCA, en ce qu'elle comporte la structure symétrique comprenant les deux domaines transmembranaires et deux motifs NBF. En plus de ces motifs caractéristiques, la protéine ABCA7 présente d'autres motifs qui ont été récemment
Par ailleurs, la protéine transporteur ABCA7 semble présenter un profil de régulation dépendant des flux de stérol, similaire à celui des autres membres de la sous famille A, et notamment du transporteur ABCA1 (Langman et al., BBR Corn ; 257(1999), 29-33 ; Laucken et al., PNAS, 97(2000) 817-822). I! a été en effet observé par Kaminski et al. (supra) une augmentation de l'expression de ABCA7 après incubation des macrophages humains en présence de lipoprotéines de faible densité acétylées (AcLDL) qui induisent une charge de stérol, ainsi qu'une diminution de l'expression en présence de l'accepteur de cholestérol HDL3 qui provoque une diminution de la charge en stérol. D'autre part, ABCA7 présente comme les autres membres ABCA une certaine spécialisation de son expression tissulaire, le messager de ABCA7 étant présent de manière prédominante dans les tissus hématopoïétiques constitués par les lymphocytes, les granulocytes, le thymus, la rate, la moelle osseuse, ou les tissus foetaux, alors que l'expression de ABCA1 est prédominante dans les macrophages et le placenta, et que celle de ABCA4 est restreinte dans la rétine (Rust et al., Nat. Genêt, 22, (1999) 352-355).
L'ensemble" des données précédemment exposées relatives à l'identité des séquences protéiques, au mécanisme de régulation et la spécificité de l'expression suggère que le gène ABCA7 constitue un autre transporteur de la sous famille A, et que celui-ci présente une fonction similaire ou même redondante à celle des autres transporteurs et notamment à celle du transporteur ABCA1. Ce transporteur interviendrait donc vraisemblablement en tant que médiateur dans le métabolisme des lipides, et il est très possible qu'il soit, au même titre que le transporteur ABCA1 , responsable de certains dysfonctionnements ou déficiences métaboliques. Par ailleurs, la spécialisation de l'expression du transporteur ABCA7 indique vraisemblablement que ce dernier joue un rôle dans le transport transmembranaire (export) des lipides dans les tissus hématopoïétiques, et possiblement dans les mécanismes de signalisation lymphocytaires de l'immunité, par exemple dans le cas de la pathogenèse de l'athérosclérose comme l'indiquent Kaminski et al. (Supra). Bien que l'expression du gène ABCA7 humain semble être régulée selon le type de cellule ou encore la situation métabolique d'un type cellulaire donné, la ou les séquences permettant de réguler ce gène n'étaient pas connues. Or, il existe un besoin dans l'état de la technique d'identifier ces séquences régulatrices pour les raisons suivantes: a) Ces séquences sont susceptibles d'être mutées chez des patients atteints d'une pathologie liée à un déficit dans le transport des lipides, possibles substrats de la protéine ABCA7 ou chez les patients susceptibles de développer de telles pathologies. La caractérisation des séquences régulatrices du gène ABCA7 humain permettrait de détecter des mutations chez des patients, en particulier de diagnostiquer les individus appartenant à des groupes familiaux à risques. En outre, l'isolement de ces séquences régulatrices rendrait possible la complémentation de la séquence mutée par une séquence fonctionnelle susceptible de pallier les dysfonctionnements métaboliques induits par la ou les mutations diagnostiquées, grâce à la construction de moyens thérapeutiques ciblés, tels que des moyens destinés à la thérapie génique. b) La caractérisation des séquences régulatrices du gène ABCA7 mettrait à la disposition de l'homme du métier des moyens aptes à permettre la construction par génie génétique puis l'expression de gènes déterminés dans les types cellulaires dans lesquels le gène ABCA7 est préférentiellement exprimé.
" " " " c) Par ailleurs; certaines parties des séquences régulatrices du gène ABCA7 pourraient constituer des séquences promotrices constitutives à fort niveau d'expression, de nature à permettre la construction de moyens nouveaux pour l'expression de séquences déterminées dans les cellules, complétant un ensemble de moyens déjà existants.
Force est de constater que, malgré les efforts entrepris, les séquences régulatrices du gène ABCA7 étaient restées jusqu'à ce jour totalement inconnues.
Les inventeurs ont désormais isolé puis analysé un ADN génomique humain de 33,5kb comprenant les 46 exons du cadre ouvert de lecture du gène ABCA7 ainsi que la région non transcrite d'environ 1 ,1 kb localisée du côté 5' de l'exon 1 , en amont du site +1 de transcription, et comprenant des signaux de régulation du gène ABCA7 humain.
Les inventeurs ont également isolé puis analysé un ADN génomique murin de 20Kb comprenant les 45 exons du cadre ouvert de lecture du gène ABCA7 ainsi que la région non transcrite d'environ 1 ,2Kb chez la souris localisée du côté 5' de l'exon 1 , en amont du site +1 de transcription, et comprenant des signaux de régulation du gène ABCA7 murin. DEFINITIONS GENERALES
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Par exemple un polynucleotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucleotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".
Un tel polynucleotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucleotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucleotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucleotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel de génétique lui- même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucleotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucleotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex. Le terme " nucleotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucleotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucleotide lorsque chaque base du premier nucleotide est appariée à la base complémentaire du second polynucleotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou
C et G.
Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucleotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagenèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquences d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.
Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi produire des substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre, de telles modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d'aminoacides. De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent pour des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial. Certains acides nucléiques variants coderont ainsi pour des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question. La connaissance de ces variants par rapport à la maladie étudiée est fondamentale puisqu'elle permet de comprendre la cause moléculaire de la pathologie.
On entendra par " fragment " un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à l'acide nucléique de référence.
Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucleotide plus grand duquel il est constitutif.
De tels fragments comprennent, ou alternativement consistent en, des oligonucleotides de longueur allant de 20 à 25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 ou 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Par " fragment biologiquement actif " d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention, on entend un acide nucléique capable de moduler la transcription d'une séquence d'ADN placée sous son contrôle. Un tel fragment biologiquement actif comprend un promoteur de base et/ou un élément régulateur, tels que définis dans la présente description.
Par " acide nucléique régulateur " selon l'invention, on entend un acide nucléique qui active et/ou régule l'expression d'une séquence d'ADN sélectionnée et placée sous son contrôle. Par " promoteur ", on entend une séquence d'ADN reconnue par les protéines de la cellule impliquées dans l'initiation de la transcription d'un gène. Le promoteur de base est l'acide nucléique régulateur minimal capable d'initier la transcription d'une séquence d'ADN déterminée qui est placée sous son contrôle. En général, le promoteur de base consiste en une région d'ADN génomique en amont du site d'initiation de la transcription où se trouve très souvent une séquence CAAT (où se fixe un ou plusieurs facteurs protéiques de transcription) ainsi que, sauf dans de rares cas comme dans certains gènes domestiques, la séquence TATA ou " TATA box " ou une boîte apparentée. C'est au niveau de cette boite que se fixe une ARN polymérase ainsi qu'un ou plusieurs facteurs de transcription, tels que les protéines se fixant sur la boîte " TATA " (TATA box Binding Proteins ou TBPs).
Une séquence nucléotidique est " placée sous le contrôle " d'un acide nucléique régulateur lorsque cet acide nucléique régulateur est localisé, par rapport à la séquence nucléotidique, de telle manière à contrôler l'initiation de la transcription de la séquence nucléotidique par une ARN polymérase.
Par " élément régulateur " ou " séquence régulatrice " au sens de l'invention, on entend un acide nucléique comprenant des éléments capables de moduler la transcription initiée par un promoteur de base, tels que des sites de fixation de divers facteurs de transcription, des séquences " enhancer " d'augmentation de la transcription ou des séquences " silencer " d'inhibition de la transcription.
Par séquence " enhancer ", on entend une séquence d'ADN incluse dans un acide nucléique régulateur capable d'augmenter ou de stimuler la transcription initiée par un promoteur de base.
Par séquence " silencer ", on entend une séquence d'ADN incluse dans un acide régulateur capable de diminuer ou d'inhiber la transcription initiée par un promoteur de base.
Des éléments régulateurs peuvent être présents en dehors de la séquence localisée du côté 5' du site d'initiation de la transcription, par exemple dans les introns et les exons, y compris dans les séquences codantes.
Le promoteur de base et l'élément régulateur peuvent être " spécifiques d'un ou plusieurs tissus ", s'ils permettent la transcription d'une séquence d'ADN déterminée, placée sous leur contrôle, préférentiellement dans certaines cellules (par exemple les cellules spécifiques d'un tissu), c'est à dire soit exclusivement dans les cellules de certains tissus, soit à des niveaux de transcription différents selon les tissus.
Par " facteur de transcription ", on entend des protéines qui interagissent préférentiellement avec des éléments régulateurs d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, et qui stimulent ou au contraire répriment la transcription. Certains facteurs de transcription sont actifs sous forme de monomères, d'autres étant actifs sous la forme d'homo- ou d'hétérodimères.
Le terme " modulation " vise soit une régulation positive (augmentation, stimulation) de la transcription, soit une régulation négative (diminution, inhibition, blocage) de la transcription. Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences. Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison, WISCONSIN. À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4.9 de mars 1996, BLAST 2.0.4 de février 1998 et BLAST 2.0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (AltschuI et al, J. Mol. BioL, (1990) 215 : 403-410 ; AltschuI et al, Nucleic Acids Res. (1997) 25 : 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence " requête " de référence, à l'aide de l'algorithme d'AltschuI et al. (Supra). La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.
Par " conditions d'hybridation de forte stringence " au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes :
1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION :
- Mélanger : 40μl ADN sperme de saumon (10mg/ml)
+ 40 μl ADN placentaire humain (10mg/ml)
- Dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace le mélange. - Oter le tampon SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.
- Incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde marquée :
- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 μl ADN Cot I, selon la quantité d'hybridations non spécifiques.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95°C.
- Incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures.
3- Hybridation:
- Oter le mix de pré hybridation.
- Mélanger 40 μl ADN sperme de saumon + 40 μl ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace.
- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation.
4- Lavages :
- Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1%.
- 2 fois 15 minutes SSC 0,1X et SDS 0,1% à 65°C. Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) (Nucleic acid Hybridization iapractical Approach, Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de F. AUSUBEL et al (1999) (Currents Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y). Par " transformation " au sens de l'invention, on entend l'introduction d'un acide nucléique (ou d'un vecteur recombinant) dans une cellule hôte. Le terme " transformation » englobe également une situation "dans laquelle le génotype d'une cellule a été modifié par un acide nucléique exogène, et que cette cellule ainsi transformée exprime ledit acide nucléique exogène, par exemple sous la forme d'un polypeptide recombinant ou encore sous la forme d'un acide nucléique sens ou antisens.
Par " animal transgénique " au sens de l'invention, on entend un animal non humain, de préférence un mammifère, dans lequel une ou plusieurs cellules contiennent un acide nucléique hétérologue introduit grâce à l'intervention humaine, tel que par des techniques de transgénèse bien connues de l'homme du métier. L'acide nucléique hétérologue est introduit directement ou indirectement dans la cellule ou le précurseur de la cellule, par manipulation génétique telle que micro-injection ou infection par un virus recombinant. L'acide nucléique hétérologue peut être intégré dans le chromosome, ou peut se présenter sous la forme d'ADN se répliquant de manière extra-chromosomique.
ACIDE NUCLEIQUE REGULATEUR DU GENE ABCA7 A partir de banques de vecteurs de type BAC préparées à partir de matériel génomique humain et murin, les inventeurs ont réussi à isoler un acide nucléique régulateur des gènes ABCA7 humain et murin.
Les inventeurs ont déterminé par une analyse comparative des séquences genomiques humaines et murines, un acide nucléique régulateur comprenant particulièrement deux modules de régulation conservés chez l'homme et la souris. Les inventeurs ont donc déterminé que l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7, lorsqu'il est défini de la manière la plus large, est constitué d'un polynucleotide comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3': - une région non transcrite d'environ 1 ,2 kb localisée en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7, et
- la séquence partielle du premier exon du gène ABCA7. Dans sa définition la plus générale, l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 comprend l'ensemble des régions nucléotidiques telles que définies ci-dessus et est identifié dans la séquence SEQ ID N°1 selon l'invention. Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucleotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire. La région d'environ 1 ,1 Kb localisée en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7, et comprenant le promoteur de base et de multiples éléments régulateurs de la transcription est comprise également dans la séquence identifiée comme la SEQ ID N°2 selon l'invention.
Plus précisément, le nucleotide en position 1 de la séquence SEQ ID N°2 est le nucleotide en position -1111 , par rapport au site d'initiation de la transcription du gène ABCA7.
Selon un second aspect, l'invention est relative à un acide nucléique comprenant un polynucleotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Comme déjà précisé ci-dessus, l'acide nucléique régulateur de la transcription du gène ABCA7 de séquence SEQ ID N°1 comprend, outre une région 5' régulatrice non transcrite, également la partie 5' du premier exon du gène ABCA7 humain. La séquence partielle du premier exon du gène ABCA7 est définie comme la séquence SEQ ID N°3.
Selon un troisième aspect, l'invention est relative à un acide nucléique comprenant un polynucleotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de séquence nucléotidique SEQ ID N° 3 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
De préférence, un acide nucléique selon l'invention sera sous une forme isolée et/ou purifiée.
Fait également partie de l'invention tout fragment " biologiquement actif " d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus. Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini ci- dessus.
En particulier, cet acide nucléique peut être d'origine murine, et est constitué d'un polynucleotide de séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 comprenant de l'extrémité 5' vers 3' :
- une région non transcrite d'environ 1 ,2 Kb localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7 murin, et
- la séquence partielle du premier exon du gène ABCA7.
La région d'environ 1 ,2Kb localisée en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7, et comprenant le promoteur de base et de multiples éléments régulateurs de la transcription est comprise également dans la séquence identifiée comme la SEQ ID NO :5 selon l'invention.
L'invention englobe également un acide nucléique caractérisé en ce qu'il hybride, dans des conditions de forte stringence, avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention.
L'invention concerne aussi un acide nucléique ayant au moins 80%, avantageusement 90%, de préférence 95% et de manière tout à fait préférée 98% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°5.
ANALYSE DETAILLEE DES SEQUENCES SEQ ID N° :2 ET SEQ ID N° :5 Selon une caractéristique principale, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2, compris dans l'acide nucléique régulateur du gène humain ABCA7 de séquence SEQ ID N°1, comprend les éléments constitutifs d'un promoteur de base, respectivement une boîte " TATA " dégénérée (TTAAG) localisée 30pb en amont du point d'initiation de la transcription. De même, une boite " TATA " dégénérée (TTAAA) a été localisée 30pb en amont du point d'initiation de la transcription, sur l'acide nucléique murin de séquence SEQ ID NO : 5, compris dans l'acide nucléique régulateur du gène murin ABCA7 de séquence SEQ ID NO :4. Les boites " TATA " sur les promoteurs des gènes humain et murin ABCA7 ainsi que la position des points d'initiation de la transcription sont représentés sur la Figure 1.
Les séquences régulatrices SEQ ID N°2 et SEQ ID N°5 comprennent également de nombreux sites de fixation de divers facteurs de transcription susceptibles de réguler positivement ou négativement l'activité du promoteur de base. Ainsi, les différentes séquences caractéristiques des sites de fixation de divers facteurs de transcription dans les séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°5 ont été identifiées par les inventeurs de la manière détaillée ci-après.
Les séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°5 ont été utilisées comme séquences de référence et traitées selon les algorithmes des logiciels Matlnspector (Quandt et al., Nucl Acid Res (1995) 23(23), 4878-4884) et comparées aux données répertoriées dans plusieurs bases de données telles que Transfac et la présence ainsi que la localisation des différentes sites caractéristiques des séquences SEQ ID N°2 et 5, et particulièrement les sites de liaison des facteurs de transcription ont été déterminés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.
Plus particulièrement, une analyse détaillée a été réalisée en utilisant les logiciels NNPP (Reese et al. J. Comput Biol. (1997) 4(3) 311-23), TSSG, et TSSW (Soloryev et al., Ismb (1995), 5, 294-302), sur les 1 ,1 kb et 1 ,2Kb en amont du site d'initiation respectivement des séquences SEQ ID N°2 et 5, a permis d'identifier 193 et 233 sites putatifs de liaison aux facteurs de transcription, chez l'homme et la souris lors de la première étape de la recherche. Ceux-ci sont répertoriés dans les tableaux 1 et 2. Après compilation et filtrage comme décrit ci-dessus, et comparaison des séquences régulatrices humaine et murine, deux modules communs aux séquences régulatrices humaine et murine ont été déterminés, et 5 et 3 sites de fixation possibles de facteurs de transcription différents ont été retenus respectivement dans les modules 1 et 2 sur les séquences humaine et murine. La position avec les scores de filtration des sites de fixation aux facteurs de transcription identifiés dans les 1 11 1 pb de la séquence SEQ ID N°2 selon l'invention, ainsi que dans les 1220 pb de la séquence SEQ ID NO : 5 selon l'invention, sont présentés dans le tableau 3. Les différents sites de fixation ont été aussi schématiquement représentés dans la figure 1.
Les positions des nucléotides de début de chacun des sites de fixation aux facteurs de transcription sont désignées en référence à la numérotation des nucléotides des séquences SEQ ID N°2 et NO :5 par rapport au point +1 d'initiation de la transcription, contenu dans les séquences SEQ ID N°1 et N°4, telle que représentée sur la figure 1 .
La Figure 2 représente la séquence SEQ ID NO : 1 , qui contient la séquence SEQ ID N°2. Le premier nucleotide en position 5' de la séquence de la Figure 2 est également le premier nucleotide en position 5' de l'une des séquences nucléiques SEQ ID N°1 et SEQ ID N° 2. Sur la Figure 2, les sites de fixation aux facteurs de transcription sont illustrés en caractères gras qui délimitent leurs positions respectives, et leurs désignations respectives sont indiquées au-dessus de chacune des boîtes correspondantes. La numérotation des nucléotides de la séquence représentée à la figure 2 a été effectuée par rapport au site d'initiation de la transcription, numéroté " +1 ", le nucleotide en 5' du nucleotide +1 étant lui-même numéroté "-1 ". La Figure 3 représente la séquence SEQ ID NO : 4, qui contient la séquence
SEQ ID N°5. Le premier nucleotide en position 5' de la séquence de la figure 3 est également le premier nucleotide en position 5' de l'une des séquences nucléiques SEQ ID N°4 et SEQ ID N° 5. Sur la figure 3, les sites de fixation aux facteurs de transcription sont illustrés en caractères gras qui délimitent leurs positions respectives, et leurs désignations respectives sont indiquées au-dessus de chacune des boîtes correspondantes. La numérotation des nucléotides de la séquence représentée à la figure 3 a été effectuée par rapport au site d'initiation de la transcription, numéroté " +1 ", le nucleotide en 5' du nucleotide +1 étant lui-même numéroté "-1 ".
L'analyse génomique des acides nucléiques régulateurs des séquences humaine et murine SEQ ID NO :2 et 5, a révélé deux modules de régulation qui sont notés module 1 et module 2, et sont particulièrement conservés chez l'homme et la souris. Ces deux modules de régulation comprennent des sites de fixation de facteur de transcription ubiquitaires, tels que NF1 , NFY et AP4, ainsi que des sites de fixation de facteurs de transcription spécifiques du foie tels que CEBP et HNF3B. Ceci est compatible avec les données expérimentales d'expression, présentées dans l'Exemple 3 ci-après, et fournies par Kaminski et al. (Supra), qui montrent une expression du gène ABCA7 dans les tissus fœtaux hépatiques humains. Les deux modules de régulation conservés chez la souris et l'homme comprennent également des sites de fixation de facteurs de transcription tels que GFI1 et NFkappaB (NFkB), qui sont essentiellement présents dans les organes lymphatiques.
La description des caractéristiques des sites de fixation à chacun des facteurs de transcription désignés dans les figures 2 et 3 ainsi que dans le tableau 3 peut être aisément retrouvée par l'homme du métier. Une courte description de certains d'entre eux en est faite ci-après.
Facteur NF1 : Les caractéristiques de fixation du facteur NF1 peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline: 88319941 , 91219459, 861401 12, 87237877, 90174951 , 89282387, 90151633," 892618136, 86274639, 87064414, 89263791 . Le facteur NF1 reconnaît la séquence palindromique suivante: " TGGCANNNTGCCA (NNTTGGCNNNNNNNNCCNN) " qui est présente dans des promoteurs viraux et cellulaires et au niveau de l'origine de réplication des adénovirus de type 2. Ces protéines sont capables d'activer la transcription et la réplication. Elles se fixent à l'ADN sous la forme d'un homodimère.
Facteur NFY : Le facteur NFY est notamment décrit dans l'entrée n°P25.208 de la base de données Swissprot. C'est un facteur qui reconnaît un motif " CCAAT " dans les séquences promotrices telles que celles du gène codant pour le collagène de type 1 , de l'albumine et de la β-actine. Il s'agit d'un stimulateur de la transcription.
Facteur AP4:
L'homme du métier pourra se référer avantageusement aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline : 2123466, 2833704, 8530024. Le facteur AP4 a un domaine de liaison à l'ADN du type "hélix loop hélix" (bHLH) ainsi que deux domaines de dimérisation. Le site consensus du facteur AP4 est le suivant « CWCAGCTGGN », et celui-ci se chevauche généralement avec un site de fixation du facteur AP1.
CEBP
Les caractéristiques de liaison au facteur CEBP peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline: 93315489, 91248826, 94193722, 93211931 , 92390404, 90258863, 94088523, 90269225 et 96133958. Il s'agit d'un activateur de la transcription important dans la régulation de gènes impliqués dans les réponses immunes et inflammatoires. Il se fixe spécifiquement à un élément de réponse à IL-1 dans le gène de l'IL-6. Il joue vraisemblablement un rôle dans la régulation de la phase aiguë de l'inflammation et dans Phémopoïése. Le site de reconnaissance consensus est le suivant: " T(T/G) NNGNAAfJVG) ".
Facteur HNF3B:
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à l'article de OVERDIER et al. (1994, Mol. Cell Biol. voU4: 2755-2766), ainsi qu'aux entrées suivantes de la base de données Medline: 91352065, 91032994, 92345837, 89160814, 91187609, 91160974, 91029477, 94301798 et 94218249. Ce facteur de transcription agit comme activateur de nombreux gènes du foie tels que des gènes AFT, de l'albumine, de la tyrosine aminotransférase et interagit avec des régions régulatrices agissant en cis de ces gènes.
GFI1
Les caractéristiques de liaison au facteur G FM peuvent être retrouvées notamment dans les entrées suivantes de la base de données Medline : 10762661 , 9931446, 9571157, 9285685, 9070650, et 7789186. Le gène GFI1 code pour une protéine en doigt de zinc impliquée dans la régulation transcriptionnelle et plus particulièrement dans la voie de signalisation de l'interleukine 2. Le site de reconnaissance consensus est le suivant : « NNNNNNAAATCANNGNNNNNNN » Facteur NFkappa-B:
L'homme du métier pourra avantageusement se référer aux articles correspondant aux entrées suivantes de la base de données Medline: 95369245, 91204058, 94280766, 89345587, 93024383, 88248039, 94173892, 91088538, 91239561, 91218850, 92390404, 90156535, 93377072, 92097536, 93309429, 93267517, 92037544, 914266911 , 91105848 et 95073993. Le facteur NFkappa-B est un hétérodimère constitué d'une première sous-unité de 50 kDa et d'une seconde sous-unité de 65 kDa. Deux hétérodimères peuvent former un tétramère labile. Sa fixation à l'ADN dépend de la présence de zinc (Zn++). Il peut être induit par de nombreux agents tels que le TNF, la PKA ou encore la PKC. C'est un régulateur clef de gènes impliqués dans des réponses à l'infection, à l'inflammation, ainsi qu'au stress.
Une caractéristique essentielle de l'acide nucléique régulateur selon l'invention, et plus particulièrement de la séquence localisée en amont du site d'initiation de la transcription comprise à la fois dans la séquence SEQ ID N°2 et dans la séquence SEQ ID N°5 est la présence de motifs caractéristiques de sites putatifs de liaison à des facteurs de transcription impliqués dans l'expression génique des lymphocytes T, tels que les facteurs de transcription CEBP, NFKB, et GFI1
GFI1 est un proto-oncogène qui code pour une protéine nucléaire en doigt de zinc impliquée dans la voie de signalisation par les cytokines et dans l'amplification clonale des cellules T (Zweidler-McKay, et al., Mol. Cell. Biol. (1996), 16(8), 4024- 4034). Le facteur de transcription GFI1 qui agit comme un répresseur transcriptionnel des gènes qui inhibent l'activation des cellules T et l'oncogénèse. Il est spécifiquement présent dans le thymus, la rate et les lymphocytes T.
Les facteurs de transcription CEBP et NFkappaB qui sont exprimés dans le thymus, la rate et les lymphocytes T, sont bien connus de l'homme du métier et agissent en coopération dans la médiation de l'induction de l'expression des gènes des lymphocytes T (Runch et al., 1994) et des cellules HepB3 (Shimizu et al., Gène, (1994) 149, 305-310).
Les positions des nucléotides de début, par rapport au site d'initiation de la transcription qui sont à -498 et -469 pour les sites CEBP , et à -260 pour le site NFkB, sur le module régulateur humain, et à -787 et -760, pour les sites CEBP, et à -301 pour le site NFKB, montrent que les deux sites de régulation sont plus éloignés dans le promoteur de souris. Toutefois, il est vraisemblable que les deux sites se rapprochent dans une structure tridimensionnelle afin de permettre la coactivation par les deux facteurs CEBP et NFkB.
La présence de ces sites potentiels de fixation au CEBP et au NFkB de manière conservée chez l'homme et la souris sur les acides nucléiques régulateurs selon l'invention est compatible avec l'observation selon laquelle l'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 humaine est prédominante dans les tissus hématopoïétiques et les lymphocytes T, et interviendrait très probablement dans la médiation cellulaire de l'immunité, notamment dans la pathogenèse de l'athérosclérose (Kaminski et al. Supra). Comme déjà mentionné précédemment, l'invention concerne un acide nucléique comprenant un polynucleotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 ou 2, et SEQ ID N°4 ou 5, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Sont englobés dans la définition ci-dessus les acides nucléiques comprenant un ou plusieurs fragments " biologiquement actifs " de l'une des séquences SEQ ID N°1 ou 2, et SEQ ID N°4 ou 5. L'homme du métier peut aisément obtenir des fragments biologiquement actifs de ces séquences, en se référant notamment au tableau 3 ci- dessus ainsi qu'aux figures 2 et 3 dans lesquels les différents motifs caractéristiques de la séquence régulatrice du gène ABCA7 sont présentés. L'homme du métier pourra ainsi obtenir de tels fragments biologiquement actifs par synthèse chimique totale ou partielle des polynucléotides correspondants ou encore en faisant agir des endonucléases de restriction afin d'obtenir des fragments d'ADN recherchés, les sites de restriction présents sur les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°5 pouvant être aisément retrouvés à partir de l'information de séquence, à l'aide de logiciels courants de cartographie de restriction tel que GCG version 9J module map.
L'obtention de fragments d'acides nucléiques déterminés à l'aide d'endonucléases de restriction est par exemple décrite dans l'ouvrage de SAMBROOK et al., (Molecular cloning: a laboratory manual, 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New York (1989). L'invention est donc également relative à un acide nucléique tel que défini ci- dessus, capable de moduler la transcription d'un polynucleotide placé sous son contrôle. Selon un premier mode de réalisation préféré, un fragment biologiquement actif d'un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention comprend un premier module conservé (module 2) qui comprend le promoteur de base (boîte TATA) allant du nucleotide en position -1 au nucleotide en position -390, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucleotide transcrit étant le nucleotide en position 1 1 12 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1 , ou le nucleotide en position 1221 de la séquence nucléotidique SE ID NO :4.
Selon un second mode de réalisation, un fragment biologiquement actif d'un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention comprend les modules 1 et 2 conservés (figure 1) du nucleotide en position -1 au nucleotide en position -860, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucleotide transcrit étant le nucleotide en position 1 1 12 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1 , ou le nucleotide en position 1221 de la séquence nucléotidique SE ID NO :4.
Selon un troisième mode de réalisation, un tel fragment biologiquement actif d'un acide régulateur de la transcription selon l'invention comprend, outre le promoteur de base (core promoter) et les éléments régulateurs proximaux, également d'autres éléments régulateurs tels que les différents sites GFI1 , HNF3B, CEBPB, NF1 et s'étend du nucleotide en position -1 au nucleotide en position -1 1 1 1 , par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucleotide transcrit étant le nucleotide en position 1 1 12 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1 , et au nucleotide en position - 1220, par rapport au site d'initiation de la transcription, le premier nucleotide transcrit étant le nucleotide en position 1221 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4.
ANALYSE DE L'EXON 1 Le demandeur a également identifié les séquences nucléotidiques localisées en aval du site d'initiation de la transcription et correspondant à l'extrémité 5' de l'exon
1 , des gènes humain et murin codant pour la protéine ABCA7.
Plus précisément, l'extrémité 5' de l'exon 1 , d'une taille de 1210 nucléotides, débute au nucleotide en position 1 112 de la séquence SEQ ID N°1 et se termine au nucleotide en position 2322 de la séquence SEQ ID N°1 . L'extrémité 5' de l'exon 1 est identifiée comme la séquence SEQ ID N°3 et la séquence complète de l'exon 1 est identifiée comme la séquence SEQ ID N°6. L'exon 1 contient le début de la phase ouverte de lecture du gène ABCA7 humain, le nucleotide A du codon ATG étant localisé en position 1208 des séquences SEQ ID N° 3 et 6. L'exon 1 code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N° 7.
L'exon 1 est susceptible de contenir des éléments de régulation de l'expression du gène ABCA7, notamment des éléments de type enhancer amplificateur et/ou des éléments de type silencer ou répresseur.
En conséquence, un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention peut également contenir, outre des fragments biologiquement actifs de la séquence SEQ ID N°1 , également des fragments nucléotidiques, voire la totalité des séquences SEQ ID N°2 à SEQ ID N°3 et 6.
Les séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°3, et 6, ainsi que leurs fragments, peuvent être notamment utilisés comme sondes ou amorces nucléotidiques pour détecter la présence d'au moins une copie du gène ABCA7 dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein de la séquence régulatrice du gène ABCA7.
L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini ci-dessus, en particulier provenant de l'une des séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°3 et 6.
L'invention concerne également un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, en particulier un acide nucléique provenant d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°3 et 6.
L'invention a également trait à un acide nucléique tel que défini ci-dessus et caractérisé en outre en ce qu'il est capable de moduler la transcription d'un polynucleotide d'intérêt placé sous son contrôle.
Selon un premier aspect, un tel acide nucléique est capable d'activer la transcription du polynucleotide d'intérêt placé sous son contrôle.
Selon un second aspect, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être caractérisé en ce qu'il est capable d'inhiber la transcription du polynucleotide d'intérêt placé sous le contrôle de celui-ci.
Préférentiellement, un acide nucléique régulateur de la transcription selon l'invention, lorsqu'il est localisé convenablement par rapport à un polynucleotide d'intérêt dont l'expression est recherchée, va permettre la transcription dudit polynucleotide d'intérêt, soit de manière constitutive, soit de manière inductible.
Le caractère inductible de la transcription initiée par un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être conféré par un ou plusieurs des éléments régulateurs qu'il contient, par exemple la présence d'un ou plusieurs sites tels que précédemment définis dans la séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N° 2.
De plus, une expression spécifique de tissu du polynucleotide d'intérêt peut être recherchée en plaçant ce polynucleotide d'intérêt sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention capable, par exemple, d'initier la transcription de ce polynucleotide d'intérêt spécifiquement dans certaines catégories de cellules, par exemple des cellules du tissu hématopoïétique, telles les leucocytes périphériques, les cellules du thymus, les cellules de la rate, et la moelle osseuse.
De manière préférée, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs éléments régulateurs " discrets", tels que des éléments enhancers et silencers. En particulier, un tel acide nucléique régulateur peut comprendre un ou plusieurs sites de fixation potentiels aux facteurs de transcription tels que définis dans là figure 2.
Un acide régulateur selon l'invention englobe également une séquence ne comprenant pas le promoteur de base, c'est-à-dire la séquence allant du nucleotide en position -1 au nucleotide en position -25, par rapport au site d'initiation de la transcription.
Un tel acide nucléique régulateur comprendra alors préférentiellement un promoteur de base dit " hétérologue " , c'est-à-dire un polynucleotide comprenant une boîte " TATA " et une " homéo-boîte " ne provenant pas de l'acide nucléique régulateur du gène ABCA7.
Fait également partie de l'invention, un acide nucléique régulateur de la transcription comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N°1 qui a été modifié, par exemple par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides. De telles modifications peuvent moduler l'activité transcriptionnelle en provoquant une augmentation ou au contraire une diminution de l'activité du promoteur ou de l'élément régulateur.
Une telle modification peut également affecter la spécificité tissulaire du promoteur ou de l'élément régulateur. Ainsi, par exemple, un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être modifié afin de stimuler la transcription dans seulement l'un des tissus dans lequel il est naturellement exprimé.
Un acide régulateur de la transcription selon l'invention peut également être modifié et être rendu inductible par un composé particulier, par exemple en créant dans la séquence un site inductible par un composé thérapeutique donné.
Les modifications dans une séquence comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N°1 et comprenant le promoteur ou un élément régulateur peuvent être réalisées avec des méthodes bien connues de l'homme du métier, telle que la mutagenèse. L'activité du promoteur ou de l'élément régulateur modifié peut ensuite être testée, par exemple par clonage du promoteur modifié en amont d'un gène rapporteur, en transfectant la construction d'ADN résultante dans une cellule hôte et en mesurant le niveau d'expression du gène rapporteur dans la cellule hôte transfectée. L'activité du promoteur modifié peut également être analysée in vivo dans des animaux transgéniques. Il est également possible de construire des banques de fragments modifiés qui peuvent être criblées en utilisant des tests fonctionnels dans lesquels, par exemple, seuls les promoteurs ou les éléments régulateurs ayant l'activité désirée seront sélectionnés.
De tels essais peuvent être basés, par exemple sur l'utilisation de gènes rapporteurs conférant une résistance à des composés déterminés, par exemple à des antibiotiques. La sélection de cellules ayant une construction acide nucléique régulateur/gène rapporteur et contenant un promoteur ou un élément régulateur ayant la modification recherchée peut alors être isolée par culture des cellules hôtes transformées avec une telle construction en présence du composé déterminé, par exemple de l'antibiotique déterminé. Le gène rapporteur peut également coder pour toute protéine facilement détectable, par exemple une protéine optiquement détectable telle que la luciférase.
En conséquence, l'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant: a) un acide nucléique régulateur de la transcription telle que définie ci-dessus; et b) un polynucleotide d'intérêt codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt. Selon un premier aspect, le polynucleotide d'intérêt dont la transcription est recherchée code pour une protéine ou un peptide. La protéine peut être de toute nature, par exemple une protéine d'intérêt thérapeutique, y compris des cytokines, des protéines de structure, des récepteurs ou encore des facteurs de transcription. Par exemple, dans le cas où une transcription spécifiquement dans certains tissus est recherchée, comme par exemple dans des cellules du tissu hématopoïétique, c'est à dire de la rate, de la moelle osseuse, ou dans les leucocytes périphériques, l'acide nucléique régulateur de la transcription comprendra avantageusement un acide nucléique allant du nucleotide en position -1 au nucleotide en position -1111 , par rapport au site d'initiation de la transcription de la séquence SEQ ID N°1 ou 2, et allant du nucleotide en position -1 au nucleotide en position -1220 SEQ ID N°4 ou 5.
Dans ce cas, le polynucleotide d'intérêt codera pour un gène impliqué dans la lutte contre l'inflammation, tel qu'un récepteur aux cytokines ou encore pour une superoxyde dismutase. Si un effet antitumoral est recherché, on cherchera alors à stimuler le nombre et l'activation de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'un antigène tumoral donné.
Dans un autre mode de réalisation, un acide nucléique régulateur selon l'invention sera utilisé en combinaison avec un polynucleotide d'intérêt codant pour la protéine ABCA7. Egalement, le polynucleotide d'intérêt peut également peut être un oligonucléotide de type sens.
Comme déjà mentionné, le polynucleotide d'intérêt peut également produire un acide nucléique, tel qu'un acide nucléique antisens spécifique d'un gène dont on cherche à inhiber la traduction.
Selon un autre aspect, le polynucleotide d'intérêt dont la transcription est régulée par l'acide nucléique régulateur est un gène rapporteur, tel que tout gène codant pour une protéine détectable.
Parmi les gènes rapporteurs préférés , on peut citer notamment le gène de la luciférase, de la β-galactosidase (LacZ), de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) ou encore tout gène codant pour une protéine conférant une résistance à un composé particulier, particulièrement à un antibiotique. VECTEURS RECOMBINANTS
Par " vecteur " au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin. Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique régulateur selon l'invention qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique régulateur conforme à l'invention, des séquences dont l'expression est recherchée dans une cellule hôte ou dans un organisme multicellulaire déterminé.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants :
(1) un acide nucléique régulateur selon l'invention; (2) un polynucleotide d'intérêt comprenant une séquence codante comprise dans l'acide nucléique à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits au (1 ) ; et
(3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection.
A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.
Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996; Immunologyin Current Protocols in Molecular Biology). Lorsque l'expression de la séquence génomique du gène ABCA7 sera désirée, on aura préférentiellement recours à des vecteurs capables d'inclure de grandes séquences d'insertion. Dans ce mode de réalisation particulier, on utilisera de préférence des vecteurs de bactériophages, tels que les vecteurs de bactériophage P1 comme le vecteur p158 ou encore le vecteur p158/neo8 décrits par Sternberg (Trends Genêt., (1992) 8 : 1 -16; Mamm. Génome (1994) 5 : 397-404).
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322(ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, ETATS-UNIS). On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stratagene).
Il peut s'agir aussi du vecteur recombinant PXP1 décrit par Nordeen SK et al. (BioTechniques, (1988) 6 : 454-457). II peut s'agir également de vecteurs de type Baculovirus tels que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N°CRL 1711 ) dérivées de Spodoptera frugiperda.
Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5. Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno-associés sont par exemple décrits par Flotte et al., Am. J. Respir., Cell Mol. Biol. (1992) 7 : 349-356 ; Samulski et al., J. Virol. (1989) 63 : 3822-3828 ; MacLaughlin et al., Am. J. Hum. Genêt. (1996) 59 : 561-569). Pour permettre l'expression d'un polynucleotide d'intérêt sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, la construction polynucléotidique comprenant la séquence régulatrice et la séquence codante doit être introduite dans une cellule hôte. L'introduction d'une telle construction polynucléotidique selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires. On peut aussi réaliser l'introduction des polynucléotides selon l'invention in vivo ou ex vivo, pour la prévention ou le traitement de maladies liées à un déficit dans le transport en protéine ABCA7.
Pour introduire les polynucléotides ou les vecteurs dans une cellule hôte, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à différentes techniques, comme la technique de précipitation au phosphate de calcium (Graham et al., Virology (1973) 52 : 456-457 ; Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7 : 2745-2752), le DEAE Dextran (Gopal et al., Mol. Cell. Biol., (1985) 5 : 1188-1190), l'électroporation (Tur- Kaspa et al., Mol Cel. Biol, (1986) 6 : 716-718.; Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984), 81(22), 7161-5), la microinjection directe (Harland ét al., J Cell Biol (1985) 101 : 1094-1095), les liposomes chargés en ADN (Nicolau et al., Methods Enzymol (1987) 149 : 157-76 ; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76 : 3348-3352).
Une fois que le polynucleotide a été introduit dans la cellule hôte, il peut être intégré de manière stable dans le génome de la cellule. L'intégration peut être réalisée à un endroit précis du génome, par recombinaison homologue, ou peut être intégré au hasard. Dans certains modes de réalisation, le polynucleotide peut être maintenu de manière stable dans la cellule hôte sous la forme d'un fragment d'épisome, l'épisome comprenant des séquences permettant le maintien et la réplication de ce dernier, soit de manière indépendante, soit de manière synchronisée avec le cycle cellulaire.
Selon un mode de réalisation particulier, une méthode pour introduire un polynucleotide selon l'invention dans une cellule hôte, en particulier une cellule hôte provenant d'un mammifère, in vivo, comprend une étape au cours de laquelle on introduit une préparation comprenant un vecteur d'expression pharmaceutiquement compatible et un polynucleotide " nu " selon l'invention, placé sous le contrôle de séquences de régulation appropriées, par injection locale au niveau du tissus choisi, par exemple un tissu musculaire lisse, le polynucleotide " nu " étant absorbé par les cellules de ce tissu.
Des compositions pour l'utilisation in vitro et in vivo comprenant des polynucléotides " nus " sont par exemples décrites dans la demande PCT N° WO 95/11307 ainsi que dans les articles de Tacson et al. (Nature Med. (1996) 2(8), 888- 892) et de Huygen et al., (Nat. Med. (1996) 2(8), 893-898).
Selon un mode de réalisation spécifique de l'invention, il est fourni une composition pour la production in vivo d'une protéine d'intérêt. Cette composition comprend un polynucleotide codant pour le polypeptide d'intérêt placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice selon l'invention, en solution dans un vecteur physiologiquement acceptable.
La quantité de vecteur qui est injectée à l'organisme hôte choisi varie selon le site de l'injection. A titre indicatif, il peut être injecté entre environ 0,1 et environ 100 μg de la construction polynucléotidique séquence régulatrice/séquence codante dans le corps d'un animal.
Lorsque l'acide nucléique régulateur selon l'invention est localisé, sur la construction polynucléotidique (ou vecteur), de telle manière à contrôler la transcription d'une séquence comprenant un cadre de lecture ouvert codant la protéine ABCA7, le vecteur est injecté de préférence dans le corps d'un patient susceptible de développer une maladie liée à un déficit en protéine ABCA7.
En conséquence, l'invention concerne également une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement de la protéine ABCA7, comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et un polynucleotide d'intérêt codant pour la protéine ABCA7, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Avantageusement, une telle composition comprendra l'acide nucléique régulateur défini par l'une des séquences SEQ ID N°1 ou 2, et SEQ ID N°4 ou 5, ou un fragment biologiquement actif de cet acide nucléique régulateur.
L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement dans le métabolisme des lipides, comprenant un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation, comprenant un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles. L'invention est également relative à l'utilisation d'une construction polynucléotidique conforme à l'invention et comprenant un acide nucléique régulateur du gène ABCA7 ainsi qu'une séquence codant pour la protéine ABCA7, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du métabolisme des lipides ou d'un problème d'origine immunologique ou encore d'origine inflammatoire.
L'invention a également trait à l'utilisation d'un vecteur recombinant selon l'invention, comprenant, outre un acide nucléique régulateur de l'invention, un acide nucléique codant pour la protéine ABCA7, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
Vecteurs utiles dans des procédés de thérapie génique somatique et compositions contenant de tels vecteurs
La présente invention concerne aussi une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement et/ou la prévention des pathologies liées au métabolisme des lipides ainsi que pour le traitement et/ou la prévention des pathologies liées au dysfonctionnement des mécanismes de médiation lymphocytaire de l'inflammation. Elle propose une solution avantageuse aux inconvénients de l'art antérieur, en démontrant la possibilité de traiter les pathologies, notamment des pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme des lipides dans les tissus myélo-lymphatiques, par la thérapie génique, par le transfert et l'expression in vivo d'une construction polynucléotidique comprenant, outre un acide nucléique régulateur selon l'invention, une séquence codant pour une protéine ABCA7 qui est fortement présumée comme étant impliquée dans le transport et/ou le métabolisme des lipides. L'invention offre ainsi un moyen simple permettant un traitement spécifique et efficace des sujets affectés d'un dysfonctionnement des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie
(mutation, expression aberrante, etc.) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Viroi. 1 (1967) 891 ), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc.), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
La présente invention est donc également relative à une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées au transport des lipides, consistant à transférer et à exprimer in vivo des gènes codant pour ABCA7 placés sous le contrôle d'un acide régulateur selon l'invention. Il est particulièrement avantageux de construire des virus recombinants contenant une séquence d'ADN comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence codant pour une protéine ABCA7 impliquée dans le métabolisme de lipides, d'administrer ces virus recombinants in vivo, et que cette administration permette une expression stable et efficace d'une protéine ABCA7 biologiquement active in vivo, et sans effet cytopathologique.
Les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression du gène ABCA7. En particulier, l'utilisation d'adénovirus recombinants comme vecteurs permet d'obtenir des niveaux d'expression suffisamment élevés du gène d'intérêt pour produire l'effet thérapeutique recherché. D'autres vecteurs viraux, tels que les rétrovirus ou les virus adéno-associés (AAV), permettant une expression stable du gène sont aussi revendiqués.
La présente invention offre ainsi une nouvelle approche pour le traitement et la prévention des pathologies liées à des dysfonctionnements dans le métabolisme des lipides et dans les voies de signalisation de l'inflammation par les lymphocytes.
L'invention a donc aussi pour objet un virus recombinant défectif comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence nucléique codant pour une protéine ABCA7 impliquée dans le métabolisme des lipides ou dans les processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
L'invention a également trait à l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des dysfonctionnements de la signalisation de l'inflammation par les lymphocytes.
La présente invention concerne également l'utilisation de cellules modifiées génétiquement ex vivo par un virus tel que décrit ci-dessus, ou de cellules productrices de tels virus, implantées dans l'organisme, permettant une expression in vivo prolongée et efficace d'une protéine ABCA7 biologiquement active.
La présente invention montre qu'il est possible d'incorporer une séquence d'ADN codant pour ABCA7 dans le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini ci-dessus dans un vecteur viral, et que ces vecteurs permettent d'exprimer efficacement une forme mature, biologiquement active. Plus particulièrement, l'invention montre que l'expression in vivo de ABCA7 peut être obtenue par administration directe d'un adénovirus ou par implantation d'une cellule productrice ou génétiquement modifiée par un adénovirus ou par un rétrovirus incorporant un tel ADN.
La présente invention est particulièrement avantageuse, car elle permet d'induire une expression contrôlée et sans effet nocif de ABCA7 dans des organes qui ne sont pas normalement concernés par l'expression de cette protéine. En particulier, une- libération significative de la protéine ABCA7 est obtenue par implantation de cellules productrices de vecteurs de l'invention, ou infectées ex vivo par des vecteurs de l'invention. L'activité de médiateur dans le métabolisme des lipides produit dans le cadre de la présente invention peut être du type ABCA7 humaine ou animale. La séquence nucléique utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), un ARN (dans le cas des rétrovirus) ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, l'utilisation d'un ADNg permet une meilleure expression dans les cellules humaines. Pour permettre leur incorporation dans un vecteur viral selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mutagenèse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des expressions importantes. Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une séquence nucléique codant pour une protéine ABCA7 humaine. Par ailleurs, il est également possible d'utiliser une construction codant pour un dérivé de ces protéines ABCA7. Un dérivé de ces protéines ABCA7 comprend par exemple toute séquence obtenue par mutation, délétion et/ou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un produit conservant l'activité de médiateur du métabolisme des lipides. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après). L'activité biologique des dérivés ainsi obtenus peut ensuite être aisément déterminée, comme indiqué notamment dans les exemples décrivant la mesure de Pefflux de lipides à partir des cellules. Les dérivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.
Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement ayant de nouvelles propriétés biologiques. Les dérivés incluent également les séquences d'ADN modifiées permettant une expression améliorée in vivo.
Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un virus recombinant défectif comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et une séquence d'ADNc codant pour une protéine ABCA7 impliquée dans le transport et le métabolisme du cholestérol. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg. La séquence d'ADNc codant pour la protéine ABCA7, et utilisable dans un vecteur selon l'invention est avantageusement la séquence SEQ ID N°8.
Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus, des virus adéno-associés (AAV), des virus de l'herpès (HSV) ou des rétrovirus. Il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus, pour une administration directe ou pour la modification ex vivo de cellules destinées à être implantées, ou un rétrovirus, pour l'implantation de cellules productrices.
Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non- fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence nucléique codant pour la protéine ABCA7. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO 94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mav1 , Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche Manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans" le cadre "de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour la protéine ABCA7 placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention. Avantageusement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est rendue non fonctionnelle. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) et L5 (WO 95/02697). Selon un mode préféré de mise en œuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4 et la séquence codant pour ABCA7 est insérée au niveau de la région E1 inactivée. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans la région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour ABCA7 (Demande de brevet Français FR 94 13355). Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène (1991 ) 101 : 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. (1984) 3: 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour la protéine ABCA7. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. (1977) 36 :59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO 95/02697. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941 , EP 488 528). Ces documents décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Toutefois, aucun de ces documents ne décrit ni ne suggère l'utilisation d'un AAV recombinant pour le transfert et l'expression in vivo ou ex vivo d'une protéine ABCA7, ni les avantages d'un tel transfert. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans une lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour la protéine ABCA7 bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al.,- (New Biologist 3 (1991) 203); EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. (Genêt. Eng. 7 (1985) 235); McCormick, (BioTechnology 3 (1985) 689), etc.
En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour la protéine ABCA7 placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US 4,861 ,719); la lignée PsiCRIP (WO 90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO 89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. Pour la mise en œuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. Les résultats donnés ci-après démontrent en effet les propriétés particulièrement intéressantes des adénovirus pour l'expression in vivo d'une protéine ayant une activité de médiateur du métabolisme des lipides. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale. Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en œuvre de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux contenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et la séquence codant pour la protéine ABCA7, pour une implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont notamment les cellules PA317 (US4.861.719), PsiCrip (WO 90/02806) et GP+envAm-12 (US 5,278,056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant pour une protéine ABCA7 selon l'invention. Par exemple des cellules souches totipotentes, précurseurs des lignées cellulaires sanguines, peuvent être prélevées et isolées chez le sujet. Ces cellules mises en culture peuvent être alors transfectées par le vecteur rétroviral contenant la séquence codant pour la protéine ABCA7 sous le contrôle de son propre promoteur. Ces cellules sont alors réintroduites chez le sujet. La différentiation de ces cellules sera à l'origine de cellules du tissu hématopoïétique exprimant la protéine ABCA7, notamment des lymphocytes T qui, participent à la signalisation de l'inflammation. Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour la protéine ABCA7 est placée sous le contrôle d'un acide régulateur selon l'invention comprenant les éléments régulateurs permettant son expression dans les cellules infectées, et tout particulièrement les éléments régulateurs de type NFkappaB, CEBP, et GFH .
Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des pathologies liées au métabolisme des lipides ou encore au dysfonctionnement lié aux processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intra-occulaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement "acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection intraveineuse, telle que par exemple dans la veine porte du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la veine porte du patient est avantageuse car elle permet de cibler l'infection au niveau du foie et ainsi, de concentrer l'effet thérapeutique au niveau de cet organe.
Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectées par ces virus. Il peut s'agir en particulier de cellules d'origine sanguine (cellules souches totipotentes ou précurseurs), fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules musculaires lisses et endothéliales, cellules gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Celles- ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham (Methods Cell Biol (1980) 21a: 255). Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les virus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
Les cellules en culture sont ensuite infectées par les virus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire une protéine ABCA7 biologiquement active. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infections et éventuellement le nombre de cycles d'infections réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro. Pour l'infection par des rétrovirus, il est également possible de co-cultiver les cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus recombinants selon l'invention. Ceci permet de s'affranchir de la purification des rétrovirus. Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules de mammifères infectées par un ou plusieurs virus recombinants défectifs telles que décrites ci-dessus ou des cellules productrices de virus recombinants, et une matrice extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 10^ à 101 ° cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférentiellement, on utilise du collagène de type I.
Comme indiqué ci avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entraînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou biocompatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique. La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies liées au transport du cholestérol, en particulier l'obésité, l'hypertriglycéridémie, ou, dans le domaine des affections cardio-vasculaires, l'infarctus du myocarde, l'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque et les accidents cérébro-vasculaires. En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc.), les chevaux, les poissons, etc. CELLULES HOTES RECOMBINANTES
L'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante comprenant l'un quelconque des acides nucléiques de l'invention de séquence SEQ ID N° 1 à SEQ ID N°6, et plus particulièrement un acide nucléique de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID N°3.
Selon un autre aspect, l'invention est également relative à une cellule hôte recombinante comprenant un vecteur recombinant tel que ci-dessus décrit.
Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont par exemple les suivantes : a) cellules hôtes procaryotes: souches d'Escherichia coli (souche DH5-α), de
Bacillus subtilis, de Salmonella typhimurium, ou encore des souches d'espèces telles que Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococus ; b) cellules hôtes eucaryotes: cellules HeLa (ATCC N°CCL2), cellules Cv 1 (ATCC N°CCL70), cellules COS (ATCC N°CRL 1650), cellules Sf-9 (ATCC N°CRL 1711 ), cellules CHO (ATCC N°CCL-61 ) ou encore cellules 3T3 (ATCC N°CRL-6361 ), ou encore les cellules de la lignée Hepa1-6 référencées à l'American Type Culture Collection (ATCC, Rόckville, MD, Etats-Unis d'Amérique). c) les cellules en culture primaire provenant d'un individu chez lequel l'expression d'un acide nucléique d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention est recherchée. d) Les cellules à multiplication indéfinie (lignées cellulaires) obtenues à partir des cellules en culture primaire du c) ci-dessus, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
PROCEDES DE CRIBLAGE
Procédé de criblage in vitro.
L'invention fournit des procédés pour traiter un sujet affecté d'une pathologie liée au niveau d'expression de la protéine ABCA7. En particulier, une telle méthode de traitement consiste à administrer au sujet un composé modulant l'expression du gène ABCA7, qui peut être identifié selon divers procédés de criblage in vitro tels que définis ci-après.
Une première méthode consiste à identifier des composés modulant l'expression du gène ABCA7. Selon une telle méthode, des cellules exprimant le gène ABCA7 sont incubées avec une substance ou molécule candidate à tester et le niveau d'expression de l'ARN messager de ABCA7 ou encore le niveau de production de la protéine ABCA7 est ensuite déterminé.
Les niveaux d'ARN messager de ABCA7 peuvent être déterminés par hybridation sur gel de type Northern, bien connu de l'homme du métier. Les niveaux d'ARN messager de ABCA7 peuvent également être déterminés par des procédés mettant en oeuvre la PCR ou encore la technique décrite par WEBB et al. (Journal of
Biomolecular Screening (1996), vol. 1 : 119).
Les niveaux de production de la protéine ABCA7 peuvent être déterminés par immunoprécipitation ou immunochimie en utilisant un anticorps qui reconnaît spécifiquement la protéine ABCA7.
Selon une autre méthode de criblage d'une molécule ou substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, une construction nucléotidique telle que définie ci-dessus, comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention ainsi qu'un polynucleotide rapporteur placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur, est utilisée, ledit acide nucléique régulateur comprenant au moins un promoteur de base et au moins un élément régulateur de l'une des séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°3. Le polynucleotide rapporteur peut être un gène codant pour une protéine détectable, tel qu'un gène codant pour une luciférase.
Selon un tel procédé de criblage, les cellules sont transfectées avec la construction polynucléotidique contenant l'acide nucléique régulateur selon l'invention et le polynucleotide rapporteur, de manière stable ou transitoire.
Les cellules transformées sont ensuite incubées en présence ou en l'absence de la molécule ou de la substance candidate à tester pendant un temps suffisant, puis le niveau d'expression du gène rapporteur est déterminé. Les composés qui induisent un changement statistiquement significatif de l'expression du gène rapporteur (soit une augmentation, soit au contraire une diminution de l'expression du gène rapporteur) sont ensuite identifiés et, le cas échéant, sélectionnés. Ainsi, l'invention a encore pour objet un procédé pour le criblage in vitro d'une molécule ou d'une substance modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, notamment modulant la transcription du polynucleotide rapporteur constitutif d'une construction polynucléotidique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à : a) mettre en culture une cellule hôte recombinante comprenant un polynucleotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention; b) incuber la cellule hôte recombinante avec la substance ou molécule à tester; c) détecter l'expression du polynucleotide d'intérêt; d) comparer les résultats obtenus à l'étape c) avec les résultats obtenus lorsque la cellule hôte recombinante est mise en culture en l'absence de la molécule ou substance candidate à tester. L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour le criblage in vitro d'une molécule ou d'une substance candidate capable de moduler l'activité d'un acide ' nucléique régulateur selon l'invention, comprenant: a) une cellule hôte transformée avec une construction polynucléotidique telle que définie ci-dessus, comprenant un polynucleotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention; et b) le cas échéant, des moyens de détection de l'expression du polynucleotide rapporteur d'intérêt.
De préférence, le polynucleotide rapporteur d'intérêt est la séquence codante d'une luciférase. Dans ce cas, l'acide nucléique régulateur selon l'invention est inséré dans un vecteur, en amont de la séquence codant pour la luciférase. Il peut s'agir par exemple du vecteur pGL3-basic (pGL3-b) commercialisé par la Société PROMEGA
(Madison, Wisconsin, Etats-Unis).
Dans ce cas, le vecteur recombinant comprenant la séquence codante de la luciférase placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention est transfecté dans les cellules hôtes recombinantes dont l'activité luciférase est ensuite déterminée après mise en culture en présence ou non de la substance ou de la molécule candidate à tester. On peut dans ce cas utiliser comme témoins des vecteurs pGL3-b contenant soit le promoteur du cytomégalovirus (CMV), le promoteur ApoAl ou encore aucun promoteur. Pour le test d'activité luciférase, les cellules transfectées sont lavées avec un tampon PBS et lysées avec 500 μl de tampon de lyse (50 mM tris, 150 mM NaCI, 0,02% d'azide de sodium, 1% de NP-40, 100 μg/ml de AEBSF et 5 μg/ml de leupeptine).
50 μl du lysat cellulaire obtenu sont ensuite ajoutés à 100 μl du substrat de la luciférase (Promega) et les mesures d'activité sont réalisées sur un lecteur spectrophotométrique de microplaque, 5 minutes après l'addition du lysat cellulaire. Les données sont exprimées en unités relatives d'activité luciférase. Les constructions polynucléotidiques produisant de hauts niveaux d'activité luciférase dans les cellules transfectées sont celles qui contiennent un acide nucléique régulateur selon l'invention compris dans la séquence SEQ ID N°1 qui est capable de stimuler la transcription. Pour les mesures des niveaux d'expression d'ARN messager dans un procédé de criblage selon l'invention, on prépare tout d'abord des sondes spécifiques de l'ARN messager du polynucleotide rapporteur d'intérêt, par exemple à l'aide du kit multiprime labeling kit (commercialisé par la Société Amersham Life Sciences, Cleveland, Ohio, Etats-Unis).
PROCEDE DE CRIBLAGE IN VIVO
Selon un autre aspect de l'invention, des compositions modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peuvent être identifiées in vivo, dans des animaux transgéniques non humains. Selon une telle méthode, un animal transgénique non humain, par exemple une souris, est traité avec une molécule ou une substance candidate à tester, par exemple une substance ou molécule candidate auparavant sélectionnée par un procédé de criblage in vitro tel que défini ci-dessus.
Après une durée déterminée, le niveau d'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention est déterminé et comparé à l'activité d'un animal transgénique non humain identique, par exemple une souris transgénique identique, qui n'a pas reçu la molécule ou la substance candidate. L'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention fonctionnel dans l'animal transgénique peut être déterminée par diverses méthodes, par exemple la mesure des niveaux d'ARN messager correspondant aux polynucléotides rapporteurs d'intérêt placés sous le contrôle dudit acide nucléique régulateur par hybridation de type Northern, ou encore par hybridation in situ, ou encore par imagerie biophotonique non invasive (Xenogen Corporation).
Selon une alternative, l'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention peut être déterminée en mesurant les niveaux d'expression de protéine codée par les polynucléotides rapporteurs d'intérêt, par exemple par immunohistochimie, dans le cas où le polynucleotide rapporteur d'intérêt comprend un cadre de lecture ouvert codant pour une protéine détectable par une telle technique.
Pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, on préférera des mammifères non humains tels que des souris, des rats ou des cobayes ou des lapins qui ont leur génome modifié par l'insertion d'une construction polynucléotidique comprenant un polynucleotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.
Les animaux transgéniques selon l'invention comprennent le transgène, c'est- à-dire la construction polynucléotidique précitée, dans une pluralité de leurs cellules somatiques et/ou germinales.
La construction d'animaux transgéniques selon l'invention peut être réalisée selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra en particulier se référer à la production d'animaux transgéniques, et particulièrement à la production de souris transgéniques, telles que décrites dans les brevets US N°4,873,191 (délivré le 10 Octobre 1989), US N°5,464,764 (délivré le 7 Novembre 1995) et US 5,789,215 (délivré le 4 Août 1998) le contenu de ces documents étant ici incorporé par référence.
En bref, une construction polynucléotidique comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et un polynucleotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle de ce dernier est insérée dans une lignée de cellules souches de type ES.
L'insertion de la construction polynucléotidique est réalisée de préférence par électroporation, telle que décrite par Thomas et al. (1987, Cell, Vol.51 :503-512). Les cellules ayant subi l'étape d'électroporation sont ensuite criblées pour la présence de la construction polynucléotidique (par exemple par sélection à l'aide de marqueurs, ou encore par PCR ou par analyse sur gel d'électrophorèse d'ADN de type Southern) afin de sélectionner les cellules positives ayant intégré la construction polynucléotidique exogène dans leur génome, le cas échéant à la suite d'un événement de recombinaison homologue. Une telle technique est par exemple décrite par MANSOUR et al. (Nature (1988) 336: 348-352).
Ensuite, les cellules sélectionnées positivement sont isolées, clonées et injectées dans des blastocystes de souris de 3,5 jours, comme cela est décrit par BRADLEY (1987, Production and Analysis of Chimaeric mice. In: E. J. ROBERTSON (Ed., teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. IRL press, Oxford, page 1 13). Des blastocystes sont ensuite introduits dans un animal hôte femelle et le développement de l'embryon est poursuivi jusqu'au terme.
Selon une alternative, des cellules de type ES sélectionnées positivement sont mises en contact avec des embryons de 2,5 jours à un stade 8-16 cellules (moruiae) comme décrit par WOOD et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90: 4582-4585) ou par NAGY et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90: 8424-8428), les cellules ES étant internalisées afin de coloniser extensivement le blastocyste, y compris les cellules donnant naissance à la lignée germinale. Les descendants sont ensuite testés afin de déterminer ceux qui ont intégré la construction polynucléotidique (le transgène).
L'invention a donc également pour objet un animal transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou germinales ont été transformées par un acide nucléique ou une construction polynucléotidique selon l'invention. L'invention a également trait à des cellules hôtes recombinantes obtenues à partir d'un animal transgénique tel que décrit ci-dessus. Des lignées de cellules recombinantes provenant d'un animal transgénique selon l'invention peuvent être établies en culture à long terme à partir de n'importe quel tissu d'un tel animal transgénique, par exemple par transfection des cultures de cellules primaires avec des vecteurs exprimant des oncogènes tels que le grand antigène T de SV40, tel que décrit par exemple par CHOU (1989, Mol. Endocrinol. Vol.3: 1511 -1514) et SCHAY et al. (1991 , Biochem. Biophys. Acta, vol. 1072: 1 -7). L'invention est également relative à un procédé pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comportant les étapes consistant à a) administrer la substance ou la molécule candidate à un animal transgénique tel que défini ci-dessus ; b) détecter le niveau d'expression d'un polynucleotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur ; c) comparer les résultats obtenus au b) avec les résultats obtenus chez un animal transgénique n'ayant pas reçu la substance ou la molécule candidate.
L'invention est en outre relative à un procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule modulant la transcription d'un polynucleotide d'intérêt constitutif d'un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (a) administrer la substance ou molécule candidate à un mammifère transgénique non humain tel que défini ci-dessus; (b) détecter l'expression du polynucleotide d'intérêt chez le mammifère transgénique tel que traité à l'étape a); et (c) comparer les résultats de détection de l'étape (b) aux résultats observés chez un mammifère transgénique non humain tel que défini ci-dessus n'ayant pas reçu l'administration de la substance ou molécule candidate.
L'invention se rapporte aussi à un kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comprenant (a) un animal transgénique tel que défini ci- dessus ; (b) le cas échéant, les moyens de détection du niveau d'expression du polynucleotide rapporteur d'intérêt. COMPOSES ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES
L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques destinées à la prévention ou au traitement d'un déficit dans le métabolisme des lipides, ou d'un dysfonctionnement dans les processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
En premier lieu, l'invention a également pour objet une substance ou une molécule candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention. De manière tout à fait préférée, l'invention concerne également une substance ou une molécule candidate caractérisée en ce qu'elle augmente l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, et tout particulièrement d'un acide nucléique régulateur comprenant la séquence SEQ ID N°1 , 2, 4 ou 5. Préférentiellement, une telle substance ou molécule capable de moduler l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention a été sélectionnée selon l'un des procédés de criblage in vitro ou in vivo défini ci-dessus.
Ainsi, un sujet affecté dans le métabolisme des lipides ou dans la signalisation de l'immunité est traité par l'administration à ce sujet d'une quantité efficace d'un composé modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.
Ainsi, un patient ayant une faible activité du promoteur ABCA7 peut être traité avec une molécule ou une substance précitée afin d'augmenter l'activité du promoteur ABCA7. De manière alternative, un patient ayant une activité du promoteur ABCA7 anormalement haute peut être traité avec un composé capable de diminuer ou de bloquer l'activité du promoteur ABCA7.
Ainsi, la présente invention se rapporte également à une substance ou molécule utilisée en tant que principe actif d'un médicament. Un tel composé peut être un composé qui module l'interaction d'au moins un facteur de transcription avec le promoteur ABCA7 ou un élément régulateur d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.
Par exemple, le composé peut inhiber l'interaction de l'un des facteurs de transcription listés dans le tableau 1 avec un acide nucléique régulateur selon l'invention.
Le composé peut également être un composé qui module l'activité d'un facteur de transcription se fixant au promoteur de ABCA7 ou encore d'un élément régulateur présent sur ce dernier.
Un composé d'intérêt thérapeutique selon l'invention peut également être un composé qui module l'interaction d'un premier facteur de transcription avec un second facteur de transcription.
Comme détaillé dans l'analyse des différents facteurs de transcription susceptibles de se fixer à la séquence SEQ ID N°1 , 2, 4, ou 5 certains facteurs de transcription sont actifs seulement s'ils sont associés avec un autre facteur de transcription.
Un composé d'intérêt thérapeutique selon l'invention est préférentiellement choisi parmi les acides nucléiques, les peptides et les petites molécules.
Par exemple, un tel composé peut être un acide nucléique antisens qui se fixe spécifiquement sur une région du promoteur ABCA7 ou sur un élément régulateur d'un acide nucléique régulateur d'ABCA7 et inhibant ou diminuant l'activité du promoteur.
Ce composé d'intérêt thérapeutique peut également être un acide nucléique antisens qui interagit spécifiquement avec un gène codant pour un facteur de transcription modulant l'activité du promoteur ABCA7, de telle manière que l'interaction de l'acide nucléique antisens avec le gène codant pour le facteur de transcription se fixant sur le promoteur ABCA7 diminue la production de ce facteur de transcription, résultant en une augmentation ou une diminution de l'activité du promoteur ABCA7, selon que le facteur de transcription augmente ou au contraire réduit l'activité du promoteur ABCA7.
La toxicité et l'efficacité thérapeutique des composés thérapeutiques selon l'invention peuvent être déterminées selon les protocoles pharmaceutiques standard dans des cellules en culture ou chez des animaux expérimentaux, par exemple pour déterminer la dose létale LD50 (c'est-à-dire la dose létale pour 50% de la population testée) ainsi que la dose efficace ED5o (c'est-à-dire la dose therapeutiquement efficace dans 50% de la population testée).
Pour tous les composés d'intérêt thérapeutique selon l'invention, la dose therapeutiquement efficace peut être estimée initialement à partir de tests réalisés dans des cultures cellulaires in vitro. L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité therapeutiquement efficace d'une substance ou molécule d'intérêt thérapeutique selon l'invention.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont plus particulièrement destinées au traitement et/ou à la prévention des déficiences dans le métabolisme des lipides, ou dans les mécanismes impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
De telles compositions pharmaceutiques peuvent être formulées de manière classique en utilisant un ou plusieurs vecteurs ou excipients physiologiquement acceptables.
Ainsi, les composés d'intérêt thérapeutique selon l'invention, ainsi que leurs sels et solvates physiologiquement acceptables, peuvent être formulés pour une administration par injection, inhalation ou encore par administration orale, buccale, parentérale ou rectale. Des techniques de préparation de compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être aisément retrouvées par l'homme du métier, par exemple dans l'ouvrage Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mead Publishing Co., Easton, PA, Etats-Unis.
Pour une administration systémique, on préférera l'injection, y compris les injections intramusculaires, intraveineuses, intrapéritonéales et sous-cutanées. Dans ce cas, les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées sous forme de solutions liquides, de préférence dans des solutions ou tampons physiologiquement compatibles.
PROCEDE DE DETECTION D'UNE ALTERATION DE LA TRANSCRIPTION DU GENE ABCA7 HUMAIN
L'invention a en outre pour objet des procédés pour déterminer si un sujet présente un risque pour le développement d'une pathologie liée à un déficit dans le métabolisme des lipides, ou dans les processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
De telles méthodes comprennent la détection, dans des cellules d'un échantillon biologique provenant du sujet à tester, de la présence ou de l'absence d'une altération génétique caractérisée par une altération dans l'expression d'un gène dont l'expression est régulée par le promoteur de ABCA7. A titre illustratif, de telles altérations génétiques peuvent être détectées afin de déterminer l'existence d'une délétion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence d'un acide nucléique régulateur d'ABCA7, de l'addition d'un ou plusieurs nucléotides ou encore de la substitution d'un ou plusieurs nucléotidiques dans ladite séquence SEQ ID N°1 , 2, 3 ou 6. Selon un mode particulier de réalisation d'un procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, l'altération génétique est identifiée selon une méthode comprenant le séquençage de tout ou partie de la séquence SEQ ID N°1 , ou alternativement de tout ou partie d'au moins la séquence SEQ ID N°2. Des amorces de séquençage peuvent être construites afin d'hybrider avec une région déterminée de la séquence SEQ ID N°1. De telles amorces de séquençage sont construites préférentiellement de manière à amplifier des fragments d'environ 300 à environ 500 nucléotides de la séquence SEQ ID N°1 ou d'une séquence complémentaire.
Les fragments amplifiés, par exemple par la méthode PCR, sont ensuite séquences et la séquence obtenue est comparée à la séquence de référence SEQ ID N°1 afin de déterminer si une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions de nucléotides sont retrouvées dans la séquence amplifiée à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique provenant du sujet testé.
L'invention concerne donc encore un procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comportant les étapes suivantes : a) séquençage d'un fragment d'acide nucléique amplifiable à l'aide d'au moins une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2 selon l'invention; b) aligner la séquence obtenue en a) avec la séquence SEQ ID N°1 ou la SEQ ID N°2; c) déterminer la présence d'une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions d'au moins un nucleotide dans la séquence du fragment d'acide nucléique, par rapport à la séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N° 2 de référence.
L'invention concerne également un kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant une ou plusieurs amorces de séquençage capables de s'hybrider avec une région de la séquence SEQ ID No : 1 , et ainsi de permettre le séquençage d'un polynucleotide localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7 chez le sujet à tester.
En outre, font également partie de l'invention des sondes oligonucléotidiques hybridant avec une région de la séquence SEQ ID N°1 ou de la séquence SEQ ID N° 2 dans laquelle une altération dans la séquence a été déterminée lors de la mise en oeuvre du procédé de détection décrit ci-dessus.
De manière alternative, font aussi partie de l'invention des sondes oligonucléotidiques hybridant spécifiquement avec une région correspondante de la séquence SEQ ID N°1 ou de la séquence SEQ ID N°2, pour laquelle une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions d'au moins un nucleotide a été déterminée chez un sujet. De telles sondes oligonucléotidiques constituent des moyens de détection d'altérations dans la séquence régulatrice du gène ABCA7 et donc également des moyens de détection d'une prédisposition au développement d'une pathologie liée à un déficit dans le métabolisme des lipides ou à dysfonctionnement au niveau des processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
L'invention a donc encore pour objet un kit ou nécessaire de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant: a) une ou plusieurs amorces hybridant avec une région de la séquence SEQ ID N°1 ou de la séquence SEQ ID N°2 ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification.
L'invention a encore pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant : a) une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques telles que définies ci-dessus; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation.
L'invention a également pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant une ou plusieurs sondes hybridant avec une région de la séquence SEQ ID No : 1 ou de la séquence SEQ ID No : 2 permettant de quantifier l'ARN messager de ABCA7 dans un matériel biologique provenant dudit sujet à tester.
Les fragments d'acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 1 -6 sont donc utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique régulatrice du gène ABCA7 ou encore d'un fragment ou d'un variant (contenant une mutation ou un polymorphisme) de cette dernière dans un échantillon.
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 8 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 1 -5, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire. De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur de 10, 12, 15, 18 ou 20 à 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un acide nucléique de séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 1- 5.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ
ID N°1 -5, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucleotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-avant, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID NO 1 -5, 6 ou 8 ou avec une séquence complémentaire de ces derniers.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène ABCA7 sont représentés ci-dessous.
Il s'agit par exemple du couple d'amorces représenté par l'amorce de séquence SEQ ID N°9 : AGCCAGCAACGCAATCCTCC et l'amorce de séquence SEQ ID N°10: CGCACCATGTCAATGAGCCC.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al., (Methods Enzymol (1979) 68:90-98) ou de Brown et al. (Methods Enzymol (1979) 68:109-151 ), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett (1980) 22: 1859-1862) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EP 0 707 592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine. Le marquage des sondes est réalisé de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3' ou encore par « nick translation ».
Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n° FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (Nucleic Acid Res (1988) 11: 4937-4957) ou Sanchez-pescador et al. (J Clin Mircrobiol (1988) 26(10) 1934-1938).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al. (Mol. Cell. Biol., (1991 ) 6 : 716-718), ou encore dans le brevet européen n° EP-0 225 807 (CHIRON).
Les sondes oligonucleotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou bien de type northern à l'ARN. Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ci-avant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : 1 ) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable. L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites ci-dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable. Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 1-5, 6 et 8 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N° 5,143,854, dans les demandes PCT N° WO 90/15070 et 92/10092.
Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N°5.412,087 et dans la demande PCT N°WO 95/11995.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5, ou encore un variant de celui-ci.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5 ou un fragment ou un variant de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact l'échantillon, dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée, avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détecter des acides nucléiques amplifiés. Pour mettre en œuvre le procédé d'amplification tel que défini ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-avant.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-5 ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification. Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples ci-après.
La figure 1 est une représentation schématique des sites de facteurs de transcription retrouvés chez l'homme et la souris au sein de la région promotrice des gènes ABCA7.
La figure 2 illustre la séquence SEQ ID N°1 et la position de chacun des motifs caractéristiques de fixation à différents facteurs de transcription est représentée en caractères gras, la désignation du facteur de transcription spécifique de la séquence correspondante étant indiquée au-dessus de la séquence nucléotidique.
La figure 3 illustre la séquence SEQ ID N°4 et la position de chacun des motifs caractéristiques de fixation à différents facteurs de transcription est représentée en caractères gras, la désignation du facteur de transcription spécifique de la séquence correspondante étant indiquée au-dessus de la séquence nucléotidique. La figure 4 illustre le pattern d'expression du gène ABCA7 humain sur des northern blots de différents tissus adultes et fœtaux (Clontech) hybrides avec un amplimère réalisé avec les amorces SEQ ID N°9 et 10 (tableau 4). La figure 5 illustre le pattern d'expression du gène ABCA7 murin sur un northern blot de différents tissus adultes hybrides avec un amplimère réalisé avec des amorces spécifiques du transcrit murin.
La figure 6 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 sur une coupe transversale d'artère inflammée, par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7.
La figure 7 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 sur une section de bronches d'une patiente asthmatique, par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7. La figure 8 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine
ABCA7 sur une section de colon d'un patient atteint de la maladie de Crohn, par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7.
La figure 9 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 sur une section de ganglion lymphatique, par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7.
La figure 10 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 d'une section de synovie d'une patiente atteinte d'arthrite rhumatoïde, par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7.
La figure 11 représente le profil d'expression du gène codant pour la protéine ABCA7 sur une section de peau d'une patiente atteinte de psoriasis par hybridation in situ avec une sonde antisens ABCA7.
EXEMPLES:
EXEMPLE 1 : Détermination de l'extrémité 5' du cDNA de ABCA7
Une amplification de l'extrémité du mRNA par RT-PCR (RACE) a été réalisée en utilisant le kit d'amplification SMART RACE cDNA (Clontech, Palo Alto, CA). Des ARNm (polyA) extraits à partir des tissus humains de la rate ont été utilisés comme matrice pour produire une banque de cDNA 5' SMART selon les instructions du constructeur. Les amorces de première amplification et les amorces internes ont été choisies à partir de la séquence cDNA. Les amplifications réalisées avec les amorces internes d'amplification PCR ont été clones. Des clones spécifiques ont été ensuite amplifiés en utilisant des amorces dont les séquences sont respectivement (CAGGAAACAGCTATGAC) et (GCCAGTGTGATGGATAT) et séquences sur les deux brins. Enfin les primers ABCA7 L1 GCGGAAAGCAGGTGTTGTTCAC (SEQ ID N° :11) et ABCA7L2 CGATGGCAGTGGCTTGTTTGG (SEQ ID N° :12) ont été utlisés pour identifier l'extrémité du cDNA de ABCA7 humain.
EXEMPLE 2 : Analyse du promoteur des gènes ABCA7 humain et murin
Le site d'initiation de la transcription a été situé sur les promoteurs des gènes humain et murin de ABCA7 en utilisant les trois logiciels suivants: TSSG et TSSW (Solovyev et al., Ismb (1997) 5, 294-302) et NNPP (Reese MG, et al., 1999). Une prévision des sites de fixation des facteurs de transcription humains et murins a été effectuée en utilisant le programme de recherche de motifs Matlnspector (Quandt et al., Nucl Acid Research (1995) 23(23) 4878-84). Le calcul des scores pour chaque site de fixation des facteurs de transcription est effectué en utilisant la formule suivante : (Of- Tf)/(Tf)1/2, dans laquelle Of est la fréquence d'observation d'un motif et Tf est la fréquence calculée d'un motif consensus. Afin de séparer les motifs qui ne sont pas considérés comme pertinents, une première étape de filtration a été réalisé en ajustant le score « similarité de la matrice » du programme Matlnspector au dessus de 0,85 et le score « similarité du core » au dessus de 0,99. Enfin, une analyse comparative des promoteurs inter-espèces a été réalisée selon ce qui est décrit par Werner T (Models for prédiction and récognition of eukaryotic promoters, Mammalian Génome (1999) 10: 168-175) afin de définir des modules de transcription comprenant des sites ayant un motif similaire et présents à la fois sur les séquences humaine et murine de la séquence en amont du gène ABCA7.
EXEMPLE 3: Expression préférentielle des gènes ABCA7 humain et murin dans les tissus hématopoïétiques
Le profil d'expression des polynucléotides selon la présente invention est déterminé selon les protocoles d'analyse de northern blot et de transcription inverse couplée à la PCR décrits notamment par Sambrook et al (réf. CSH Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). " Molecular Cloning : A Laboratory Manual, " 2π éd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).
Par exemple, dans le cas d'une analyse par transcription inverse, un couple d'amorces synthétisées à partir de chacun des ADNc complets des gènes humain et murin ABCA7 pour détecter les ADNc correspondants. Les séquences de ces amorces sont présentés dans le tableau 4.
La réaction de polymérase en chaîne (PCR) est réalisée sur des matrices d'ADNc correspondant à des ARNm polyA+ rétrotranscrits. La transcription inverse en ADNc est réalisée avec l'enzyme SUPERSCRIPT II (GibcoBRL, Life Technologies) selon les conditions décrites par le fabricant.
La réaction de polymérase en chaîne est réalisée selon des conditions standard, dans 20 μl de mélange réactionnel avec 25 ng de la préparation d'ADNc. Le mélange réactionnel est composé de 400 μM de chacun des dNTP, de 2 unités de Thermus aquaticus (Taq) ADN polymérase (Ampli Taq Gold ; Perkin Elmer), de 0,5 μM de chaque amorce, de 2,5 mM MgCI2, et de tampon PCR. Trente cycles de PCR ( dénaturation 30 s à 94 °C, hybridation de 30 s décomposé comme suit lors des 30 cycles : 64°C 2 cycles, 61 °C 2 cycles, 58°C 2 cycles et 55°C 28 cycles et une élongation d'une minute par kilobase à 72°C) sont réalisés après une première étape de dénaturation à 94°C durant 10 min dans un appareil thermocycler Perkin Elmer 9700. Les réactions de PCR sont visualisées sur gel d'agarose par electrophorèse. Les fragments d'ADNc obtenus peuvent être utilisés comme sondes pour une analyse par Northern blot et peuvent également être utilisés pour la détermination exacte de la séquence polynucléotidique.
Dans le cas d'une analyse par Northern Blot, une sonde d'ADNc produite comme décrit ci-dessus est marquée au 32P grâce au système de marquage d'ADN High Prime (Boehringer) selon les instructions indiquées par le fabricant. Après marquage, la sonde est purifiée sur une microcolonne de Sephadex G50 (Pharmacia) selon les instructions indiquées par le fabricant. La sonde marquée et purifiée est alors utilisée pour la détection de l'expression des ARNm dans différents tissus. Le northern blot contenant des échantillons d'ARN de différents tissus humains
(Multiple Tissue northern ou MTN ; références (Human II, 7759-1 , Human 7760-1 , and Human Fetal II 7756-1 , Clontech) est hybride avec la sonde spécifique marquée désignée de ABCA7 (2637-4881 pb). Le protocole suivi pour les hybridations et lavages peut être soit directement celui décrit par le fabricant (Manuel d'utilisation PT1200-1) soit une adaptation de ce protocole en utilisant les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (Currents Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience NY (1989). On pourra ainsi faire varier par exemple les températures de préhybridation et d'hybridation en présence de formamide.
Par exemple on pourra utiliser le protocole suivant :
1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION :
- Mélanger : 40μl ADN sperme de saumon (10mg/ml)
+ 40 μl ADN placentaire humain (10mg/ml)
- Dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace le mélange.
- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADN dénaturés.
- Incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde marquée :
- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 μl ADN Cot I, selon la quantité de séquences répétées.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95°C.
- Incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures.
3- HYBRIDATION : - Oter le mélange de pré-hybridation.
- Mélanger 40 μl ADN sperme de saumon + 40 μl ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace.
- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mélange formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation.
4- Lavages :
- Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1%.
- 2 fois 15 minutes SSC 0,1 X et SDS 0,1% à 65°C.
Après hybridation et lavage, le blot est analysé après une nuit d'exposition au contact d'un écran au phosphore révélé à l'aide du Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Les résultats présentés à la figure 5 montrent que le gène ABCA7 de souris est exprimé dans les tissus adultes. Une quantité plus élevée d'ARNm ABCA7 murin est détectée dans les tissus hématopoïétiques tels que la rate et le thymus, ce qui est cohérent avec l'expression de ABCA7 qui a été observée dans les lignées myélomonocytaires et lymphocytaires. Aucune expression du gène ABCA7 n'a été détectée dans les lignées cellulaires fibroblastiques.
La figure 4 montre un pattern d'expression similaire du gène ABCA7 humain avec toutefois un fort signal d'hybridation dans le foie fœtal.
EXEMPLE 4 : Analyse du profil d'expression génique pour les dysfonctionnements dans le métabolisme des lipides, ou dans la signalisation de l'inflammation La vérification de l'altération du niveau d'expression du gène ABCA7 peut-être déterminé par hybridation de ces séquences avec des sondes correspondant aux ARNm provenant de tissus hématopoïétiques de sujets atteints ou non, selon les méthodes décrites ci-dessous :
1. Préparation des ARN totaux, des ARNm polv(A)+ et de sondes de cDNA
Les ARN totaux sont obtenus à partir de tissus hématopoïétiques de sujets normaux ou bien atteints par la méthode à l'isothiocyanate de guanidine (Chomczynski et al., Anal Biochem (1987) 162:156-159). Les ARNm poly(A)+ sont obtenus par chromatographie d'affinité sur colonnes d'oligo(dT)-cellulose (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New York)e\ les cDNA utilisés comme sondes sont obtenus par RT-PCR (DeRisi et al., Science (1997) 278: 680-686) avec des oligonucleotides marqués avec un produit fluorescent (Amersham Pharmacia Biotech ; CyDye™).
2. Hvdridation et détection des niveaux d'expressions
Les lames de verre contenant les séquences selon la présente invention correspondant au gène ABCA7 sont hydridées avec les sondes nucléotidiques préparées à partir de l'ARN messager de la cellule à analyser. L'utilisation du système Amersham/molecular Dynamics (Avalanche Microscanner™) permet la quantification différentielle des expressions des produits de séquences sur le type cellulaire sain ou affecté.
EXEMPLE 5 : Test destiné au criblage de molécules activant ou inhibant l'expression du gène ABCA7.
Le test de criblage permet d'identifier une substance susceptible de moduler l'activité de synthèse de la protéine ABCA7. 5.1 Construction des plasmides d'expression contenant un acide nucléique régulateur du αène ABCA7 humain.
La région de l'acide régulateur du gène ABCA7 humain allant du nucleotide en position -1111 jusqu'au nucleotide en position -1 , par rapport au site d'initiation de la transcription, peut être amplifiée par la technique PCR à l'aide du couple d'amorces spécifiques de la région décrite ci-dessus à partir d'ADN génomique humain présent dans un vecteur BAC d'une collection de vecteurs BAC humains.
Le fragment d'ADN amplifié est digéré par l'endonucléase de restriction Sal 1 , puis inséré dans le vecteur PXP1 décrit par Nordeen et al. (Bio Techniques, (1988) 6 : 454-457), au niveau du site de restriction Sal 1 de ce vecteur. L'insert a ensuite été séquence.
5.2 Culture cellulaire et transfection
Des cellules de la lignée CHO ou HELA (ATCC, Rockville, MD, USA) ont été mises en culture dans le milieu E-MEM (Minimun Essential Médium with Earle's Salts) additionné de 10% (v/v) de sérum de veau fœtal (BioWhittaker, Walkersville, MD). Approximativement 1 ,5 X 105 cellules ont été distribuées dans chacun des puits d'une plaque de culture de 12 puits (2,5 cm), et ont été cultivées jusqu'à environ 50-70% de confluence, puis co-transformées avec 1 μg du plasmide Sal-Lucif et 0,5 μg du vecteur témoin pBetagal (CloneTech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA) en utilisant le nécessaire Superfectin Reagent Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). Deux heures après l'addition de l'ADN, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu complet AMEM (Minimum Esential Médium Eagle's Alpha Modification). Après une durée de vingt heures, les cellules sont placées dans du milieu frais de type DMEM (Dulbecco's Minimum Essential Médium) additionné de 2 μg/ml de glutamine, 100 unités/ml de streptomycine et de 0,1% de sérumalbumine bovine (BSA, Fraction V), en présence ou non de molécules à différentes concentrations.
Les cellules sont récupérées 16 heures après le dernier changement de milieu en utilisant une solution de lyse (Lysis Solution) provenant du nécessaire Tropix Luciférase Assay Kit (Tropix Inc., Bedford, MA, USA). Le lysat cellulaire est divisé en fractions aliquotes qui sont utilisées pour quantifier les protéines en utilisant le nécessaire MicroBCA Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) ainsi que pour quantifier la production de luciférase et de béta-galactosidase en utilisant respectivement les nécessaires Tropix Luciférase Assay Kit et Galacto-Light Plus Kit. Les tests sont réalisés selon les recommandations du fabricant. Les molécules actives sur le promoteur ABCA7 sont ensuite sélectionnées en fonction du ratio « activité luciférase/activité beta-galactosidase.
EXEMPLE 6 : Expériences d'hybridation in situ.
Des échantillons de tissus concernés dans la paraffine ont été hybrides avec des sondes ARN complémentaires marquées radioactives. Plus précisément, un fragment du gène ABCA7 correspondant à la séquence nucléotidique allant du nucleotide 594 au nucleotide 1055 de la séquence GenBank désignée NM-0191 12 a été sous clonée dans la plasmide pCRIl (Invitrogen).
Des sondes ARN antisens marquées à l'Uridine triphosphate 35S ont été ensuite générées avec les ARN polymerases SP6 et T7, puis hybridées aux différentes sections tissulaires.
Les différentes sections de tissus ont été digérées avec la protéinase K et hybridées avec les sondes précédemment décrites à une concentration égale à environ 3,5x107 dpm/ml pendant 18 heures à 65°C. Les lames ont été ensuite traitées avec de l'ARNase A et lavées dans du SSC, 0,1 X à 70°C pendant 2 heures, et ont été recouvertes d'une émulsion photographique Kodak NTB-2, exposées pendant 7 jours à 4°C, puis révélées en utilisant une solution Kodak D-19.
Elles ont été enfin colorées à l'hématoxyline et l'éosine (H&E) et les images ont été réalisées en utilisant une caméra photo digitale DVC couplée à un microscope Nikon. La figure 6 est une coupe de l'artère d'un homme de 92 ans ayant subi une amputation au-dessous du genou, et présentant de l'artériosclérose ainsi qu'une inflammation aiguë. On observe un faible marquage spécifique des macrophages dans les thrombus et dans le site d'infiltration inflammatoire dans la tunique adventice.
La figure 7 qui est une section de bronches prélevées lors de l'autopsie d'une femme asthmatique âgée de 63 ans, montre un faible marquage des lymphocytes et des macrophages dans l'infiltrat inflammatoire sous-muqueux.
La figure 8 est une section de colon prélevé au cours de l'opération d'une femme de 81 ans présentant un diagnostic clinique de la maladie de Crohn. On observe un marquage des macrophages et d'une sous-famille de lymphocytes dans la lamina propria.
La figure 9 correspond à une coupe d'un ganglion lymphatique prélevé au cours de l'opération d'un homme âgé de 48 ans. Dans le centre germinatif réactif, les cellules ganglionnaires sont faiblement marquées, et des macrophages isolés sont également marqués dans le ganglion lymphatique.
La figure 10 qui représente une coupe de la synoviale d'une femme de 25 ans présentant un diagnostic clinique d'arthrite rhumatoïde, montre un fort marquage des histiocytes sous synoviaux et des macrophages. La figure 11 qui représente une section de peau obtenue suite à la biopsie d'une femme de 55 ans atteinte de psoriasis, montre un marquage moyen des macrophages dans l'infiltrat inflammatoire périvasculaire. Des lymphocytes isolés périvasculaires sont également marqués.
Tableau 1 : Sites, scores, consensus, et positions par rapport au point d'initiation de la transcription (TSS) prédits par les logiciels NNPP, TSSG et TSSW chez l'Homme
Tableau 2 : Sites, scores, consensus, et positions par rapport au point d'initiation de la transciription (TSS) prédits par les logiciels NNPP, TSSG et TSSW chez la souris
Tableau 3
Tableau 4
Oligonucleotides spécifiques du gène ABC-A7 humain.

Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique comprenant un polynucleotide ayant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique choisie parmi les séquences
SEQ ID N°1 -5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon la revendication 1 .
3. Acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2.
4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, capable de moduler la transcription d'un polynucleotide placé sous son contrôle.
5. Acide nucléique selon la revendication 4, comprenant un polynucleotide allant du nucleotide en position -1 au nucleotide en position -1 1 1 1 par rapport au premier nucleotide transcrit, localisé en position 1 1 12 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1.
6. Acide nucléique selon la revendication 4, capable d'activer la transcription d'un polynucleotide d'intérêt placé sous son contrôle.
7. Acide nucléique selon la revendication 4, capable d'inhiber la transcription d'un polynucleotide d'intérêt placé sous son contrôle.
8. Acide nucléique comprenant: a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7; et b) un polynucleotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt.
9. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'acide nucléique d'intérêt est un oligonucléotide de type sens ou antisens.
10. Vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.
1 1 . Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 10.
12. Mammifère transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou les cellules germinales ont été transformées par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 10.
13. Procédé pour le criblage d'une substance ou d'une molécule modulant la transcription du polynucleotide constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) mettre en culture une cellule hôte transformée selon la revendication 1 1 ; b) incuber la cellule hôte transformée en présence de la substance ou molécule candidate; c) détecter l'expression du polynucleotide d'intérêt; d) comparer les résultats de détection obtenus à l'étape c) avec les résultats de détection obtenus par mise en culture de la cellule hôte transformée en l'absence de la molécule ou substance candidate.
14. Kit ou nécessaire pour le criblage in vitro d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polypeptide d'intérêt codé par un polynucleotide constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, comprenant : a) une cellule hôte transformée selon la revendication 11 : b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection de la transcription du polynucleotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8.
15. Procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule modulant la transcription d'un polynucleotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) administrer la substance ou molécule candidate à un mammifère transgénique non humain selon la revendication 12; b) détecter l'expression du polynucleotide d'intérêt chez le mammifère transgénique tel que traité à l'étape a); c) comparer les résultats de détection de l'étape b) aux résultats observés chez un mammifère transgénique non humain selon la revendication 12 n'ayant pas reçu l'administration de la substance ou molécule candidate.
16. Kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polynucleotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, comprenant: a) un mammifère transgénique non humain selon la revendication 12; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection de la transcription dudit polynucleotide d'intérêt.
17. Substance ou molécule modulant la transcription d'un polynucleotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8.
18. Substance ou molécule selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée selon le procédé de la revendication 13 ou de la revendication 15.
19. Composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, une substance ou une molécule selon l'une des revendications 17 ou 18.
20. Composition pharmaceutique selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement et/ou à la prévention des déficiences dans le métabolisme des lipides, ou dans les mécanismes impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
21. Substance ou molécule selon l'une des revendications 17 ou 18, en tant que principe actif d'un médicament.
22. Procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant les étapes suivantes: a) extraire l'ARN messager total à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester; b) quantifier l'ARN messager de ABCA7 présent dans ledit matériel biologique: c) comparer la quantité d'ARN messager de ABCA7 obtenue à l'étape b) avec la quantité d'ARN messager de ABCA7 attendue chez un sujet normal.
23. Procédé de détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant les étapes suivantes: a) séquencer, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, un polynucleotide localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène
ABCA7; b) aligner la séquence nucléotidique obtenue en a) avec la séquence SEQ
ID N°1 ; c) déterminer les différences nucléotidiques entre le polynucleotide séquence provenant du matériel biologique du sujet à tester et la séquence SEQ ID
N°1 de référence.
24. Kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant les moyens nécessaires à quantifier l'ARN messager de ABCA7 dans un matériel biologique provenant dudit sujet à tester.
25. Kit ou nécessaire pour la détection d'une altération de la transcription du gène ABCA7 chez un sujet, comprenant les moyens nécessaires au séquençage d'un polynucleotide localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7 chez le sujet à tester.
26. Procédé de criblage d'une molécule ou substance modulant la transcription du polynucleotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8, comprenant les étapes suivantes: a) incuber un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou un vecteur recombinant selon la revendication 10 avec une molécule ou substance candidate à tester; b) détecter le complexe formé entre la molécule ou substance candidate et la molécule ou la substance candidate.
27. Kit ou nécessaire pour le criblage d'une molécule ou substance candidate modulant la transcription du polynucleotide d'intérêt constitutif de l'acide nucléique selon la revendication 8 comprenant : a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou un vecteur recombinant selon la revendication 10; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe formé entre la molécule ou la substance candidate et ledit acide nucléique.
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Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROCCARDO C. ET AL., BIOCHIMICA & BIOPHYSICA ACTA, vol. 1461, 1999, pages 395 - 404 *
DATABASE EMBL [online] EBI; 3 March 2000 (2000-03-03), "mq52a09.x1 Soares 2NbMt Mus musculus cDNA clone IMAGE:582328 3', mRNA sequence", retrieved from EBI Database accession no. AI452004 *
DATABASE GENBANK [online] NCBI; 18 July 2000 (2000-07-18), retrieved from NCBI Database accession no. AC011558 *
SANTAMARINA-FOJO S., PROC.NATL.ACAD.SCI.USA, vol. 97, no. 14, 5 July 2000 (2000-07-05), pages 7987 - 7992 *
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