CN114787361A

CN114787361A - 微生物胆固醇催化基因的靶向表达降低过量脂质

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Publication number: CN114787361A
Application number: CN202180006725.XA
Authority: CN
Inventors: 穆拉德·托珀斯; 吉列尔梅·切尔曼·佩尔迪冈·德·奥利维拉; 里森; 马克·里迪拉; 贾扬塔·慕克吉; 戴维·麦肯齐-刘; 加勒特·斯特劳; 戴维·托马斯
Original assignee: Repair Biotechnology Co
Current assignee: Repair Biotechnology Co
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2022-07-22
Also published as: EP4110925A1; US20210268019A1; AU2021226026A1; JP2023515302A; CA3163100A1; WO2021174100A1

Abstract

本文公开通过基因和/或细胞治疗性治疗降低哺乳动物受试者中胆固醇和脂质积累的组合物、构建体、盒、载体、细胞、核酸、肽、蛋白、规程和方法。在多个实施方式中，所公开的组合物、细胞、构建体、盒、载体、核酸、肽、蛋白、规程和方法可以帮助降低哺乳动物中的脂质水平。在一个实施方式中，所公开的组合物、细胞、构建体、盒、载体、核酸、肽、蛋白、规程和方法在降低肝细胞中的脂质积累，特别是胆固醇积累中是有用的。

Description

微生物胆固醇催化基因的靶向表达降低过量脂质

技术领域

所公开的过程、方法和系统涉及通过引入微生物-来源的催化基因和酶经由细胞疗法和/或基因疗法治疗胆固醇-相关疾病。

相关申请的引证

本发明申请依据35U.S.C.§119(e)主张2020年2月28日提交的标题为“微生物胆固醇催化基因的靶向表达降低肝脏中过量脂质(Targeted Expression Of MicrobialCholesterol Catalysis Genes Reduces Excess Lipid In Liver)”的美国临时专利申请No.62/983,102和2020年10月20日提交的标题为“微生物胆固醇催化基因的靶向表达降低肝脏中过量脂质(Targeted Expression Of Microbial Cholesterol Catalysis GenesReduces Excess Lipid In Liver)”的美国临时专利申请No.63/094,075的优先利益，以上每篇专利申请以其全部内容作为参考并入本文。

序列表

本发明申请包含以ASCII格式，以电子形式提交并且以其全部内容作为参考并入本文的序列表。2021年2月25日所创建的所述ASCII拷贝的名称为P286540_WO_01-507078_00010_SL.txt并且大小为82,265字节。

背景技术

细胞内高胆固醇水平是从动脉粥样硬化到脂肪肝疾病的许多病况的特征。这种过量脂质和/或胆固醇积累的治疗通常涉及由于人细胞缺少分解代谢胆固醇的能力而改变天然脂蛋白代谢。

在一些情况下，胆固醇衍生物可以是毒性的。例如，7-酮基胆固醇(7KC)(一种促炎、促氧化、促凋亡和纤维发生氧甾酮)的积累与多种心血管、眼和神经学疾病有关。

所需要的是降低患有过量脂质和胆固醇的受试者中的脂质和胆固醇水平的组合物和方法。

附图说明

图1是组1-3的小鼠的散点图，其显示了在第0天和第14天(d14)时的血清甘油三酯；d14的肝脏甘油三酯、d14时血清和肝脏中的脂肪酸；d14时的血清胆固醇酯。图顶部的条棒显示了组间的p-值关系。

图2是组1-3的小鼠的柱状图，其显示了第14天时，肝脏和血清中的游离胆固醇；和d14时，血清中的总胆固醇。

图3是显示肝脏内部蛋白表达的蛋白免疫印迹。

图4显示了使用所公开的组合物、细胞、疗法和/或方法的一个实施方式治疗易动脉粥样硬化的小鼠的结果。

图5是显示心脏(顶部)和主动脉(底部)部分的解剖学(dissection)的示意图。

图6提供了如本文所公开的示例性核苷酸序列。

图7提供了本文所公开的氨基酸和核苷酸序列。

图8提供了如本文所公开的氨基酸序列。

图9提供了如本文所公开的氨基酸序列。

图10提供了如本文所公开的核苷酸序列。

具体实施方式

高血清胆固醇水平与动脉粥样硬化和冠状动脉病有关。在动脉粥样硬化中，脂肪斑块沉积在血管壁内，特别是心脏中的血管壁内。动脉粥样硬化是造成心血管疾病(CVD)、心肌梗塞、中风和周围性血管疾病的潜在原因，这些疾病在美国均是主要致死原因。脂蛋白代谢的多个不同方面中的遗传性缺陷以及不良饮食、久坐生活方式和其它病症(值得注意地，糖尿病、甲状腺机能减退和肾病)的多种继发作用可以促进动脉粥样硬化的发病和发展。

高胆固醇还可以导致脂肪在多种组织，包括肝脏中的积累。超重或肥胖患者，或者具有高甘油三酯水平、糖尿病和/或高胆固醇的患者可能在他们的肝脏中具有过量脂肪。肝脏脂肪大于总肝脏重量的约5-10％的积累可以指示更严重的潜在病理学和/或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的发展。NAFLD还可以影响瘦/非肥胖个体，它已知是由影响胆固醇信号转导和通路的病症所造成的。NAFLD是指从简单的脂肪肝(皮脂腺病，steatosis)，到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，到肝硬化(不可逆，肝脏的晚期疤痕)的一系列肝脏疾病。这些疾病是相关的，其中脂肪在(肝细胞)的细胞中积累，同时NASH包括肝脏的炎症(肝炎)和/或疤痕(纤维化)。NASH可以最终破坏肝细胞，从而导致肝脏坏死。游离的肝胆固醇是主要的脂毒性分子，它在NASH的发展中可以是至关重要的。

大部分目前用于过量胆固醇和/或脂质水平的治疗涉及改变天然脂蛋白代谢途径和/或信号转导，而很少治疗有效地靶向已积累的脂质和胆固醇。

本申请人在本文中公开了用于向哺乳动物细胞或组织递送胆固醇-分解代谢转基因的组合物、方法和系统以减少和/或防止过量胆固醇的积累。在一些实施方式中，所公开的组合物和方法可以在减少多种组织，包括动脉壁中的胆固醇和脂蛋白积累中有用。

本文公开了包括向哺乳动物受试者施用参与胆固醇代谢的一种或多种蛋白的方法。在一些实施方式中，一种或多种蛋白可以是参与胆固醇分解代谢或降解的细菌来源的酶。在多个实施方式中，一种或多种所公开的蛋白和/或酶的施用可以提供在一种或多种受试者细胞中的多种脂质和/或胆固醇的降解。

胆固醇降解酶

本文公开了多种胆固醇，和胆固醇-相关基因和蛋白。在多个实施方式中，所公开的基因和蛋白可以是酶或转运蛋白。在一些实施方式中，所公开的基因和蛋白可以帮助分解代谢/降解胆固醇，或使胆固醇跨过膜或脂质双层穿梭/转运。如本文所使用的，术语胆固醇(cholesterol)是指胆固醇(cholesterin)或胆甾醇基醇(cholesteryl alcohol)，具有化学式C₂₇H₄₆O的甾醇，其IUPAC名为胆甾基-5-烯-3β-醇和(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(2R)-6-甲基庚-2-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊[a]菲-3-醇。如本文所使用的，术语胆固醇还可以表示胆固醇的衍生物，包括氧化胆固醇、C₂₇H₄₆O₂、羟胆甾醇或5,6-环氧基胆固醇、7-酮基胆固醇(7KC)、胆甾烷-3β,5α,6β-三醇和7-α/β羟基胆固醇等。如本文所使用的，胆固醇相关和胆固醇分解代谢或降解蛋白可以表示与胆固醇代谢途径中的胆固醇、胆固醇衍生物、化合物相互作用、结合或作用于它们的蛋白。

所公开的胆固醇相关基因和蛋白可以选自胆固醇脱氢酶(CholD)、3-酮类固醇Δ1-脱氢酶(Δ1-KstD)、厌氧胆固醇代谢B酶(acmB)、3-酮类固醇9α-羟化酶(KshAB)、3β-羟基类固醇脱氢酶2(HSD2)、P450-铁氧化还原蛋白还原酶-铁氧化还原蛋白融合蛋白(P450-FdxR-Fdx)、ATP-结合盒亚家族A，成员1(ABCA1，在ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_005502.4，登录号#NM_005502)、ATP-结合盒，亚家族G，成员2变体(ABCG2，在ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004827.3，登录号#NM_004827.3)，及其组合。在一些实施方式中，所公开的蛋白包含与SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11和12或者通过SEQ ID NO：1和13所编码的蛋白中的任何一种或多种具有大于约80％的同一性的氨基酸序列。在多个实施方式中，本发明所主张的同一性可以相对于(over)大于约100、150、200、250、300、350或400个氨基酸且小于约500、450、400、350、300、250、200或150个氨基酸的序列。在多个实施方式中，序列同一性可以大于约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，并且小于约100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％或85％。

在多个实施方式中，所公开的胆固醇相关基因和蛋白可以参与胆固醇跨细胞膜的转运。在多个实施方式中，ABCA1(SEQ ID NO：11)和ABCG2(SEQ ID NO：12)基因和蛋白可以在降低受试者中的胆固醇中有用。ABCA1还可以表示为已知的CERP或胆固醇流出调节蛋白。ABCG2蛋白位于哺乳动物细胞的质膜中并且辅助从细胞转运多种化合物。就ABCA1来说，将胆固醇转运至apoA1和apoE。ABCG2可以存在于肝细胞的胆管膜中并且可以帮助将化合物分泌到胆汁中。已知ABCG2对于最大活性需要高膜胆固醇含量，并且通过检查在蛋白磷脂体中复原的纯化的ABCG2，我们最近已表明胆固醇是重要的激活剂，而胆汁酸显著改变该蛋白的活性。

一种或多种所公开的胆固醇相关基因、蛋白和酶可以包装到一种或多种载体、构建体或盒中。在多个实施方式中，包括一种或多种胆固醇相关蛋白或胆固醇降解酶的盒可以被称为胆固醇分解代谢盒(CCC)。在一些实施方式中，所述盒可以是多核苷酸构建体并且可以包括编码与通过SEQ ID NO：1或13中的任一项所编码的蛋白具有同一性的蛋白的核酸序列。在一些实施方式中，所述盒可以是具有与SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11或12中的一种或多种所示的蛋白序列具有约80％或以上的同一性的蛋白序列的构建体。在一些实施方式中，所述盒可以是编码SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11或12所示的一种或多种蛋白的核糖核酸。

本文公开了在降低对其有需要的哺乳动物受试者的至少一种细胞中的胆固醇水平中有用的组合物、载体、方法和规程。在多个实施方式中，所述受试者是患有与高胆固醇水平有关的一种或多种病况或具有发展这些病况的风险的人。

载体、盒和构建体

多种运载体可以用于将载体、盒或构建体递送至靶细胞。在一些实施方式中，所述载体可以是化学的、病毒的和/或非病毒的。在一些实施方式中，所述载体可以选自病毒、纳米颗粒、脂质体、细胞穿膜肽等。当所述载体是病毒载体时，所述病毒可以是哺乳动物的、非哺乳动物的或合成的。在一些实施方式中，所述载体可以是腺病毒、反转录病毒等。当所述载体是纳米颗粒或脂质体时，所述构建体可以是RNA或DNA，例如mRNA。在多个实施方式中，脂-纳米颗粒(LNP)可以用于递送多核苷酸，例如，mRNA或其它治疗核酸(其编码一种或多种胆固醇相关蛋白或胆固醇分解代谢酶)。在多种情况下，LNP的使用可以使得能够递送多个RNA和/或DNA，其大于可以通过其它方法递送的RNA和/或DNA。在一些实施方式中，所公开的LNP和/或LNP系统可以包括4种组分中的一种或多种，所述组分的改变可以优化它们的完整性和器官特异性，特别是对肝脏的特异性。在一些实施方式中，LNP的变化可以包括可电离阳离子脂质、磷脂(通常磷脂酰胆碱)、胆固醇和PEG-脂质中的一种或多种。另外，一些LNP制剂可以包括一种或多种融合-相关的小跨膜蛋白，其可以帮助提高LNP的细胞/组织特异性递送并且可以帮助确保融合，特别是高效融合，并且治疗核酸的胞内递送直接有效负载(payload)至细胞质，从而绕过内吞途径。

可以将所公开的载体、盒和构建体靶向特异性细胞或组织类型，和/或可以限制和/或对于特定细胞和细胞-类型优化通过所述载体、盒和构建体所编码的基因的表达。在一些实施方式中，包含所公开的载体、盒和构建体的颗粒，例如，脂质纳米颗粒可以包含膜，所述膜包含对靶细胞或靶组织细胞上的受体或外膜蛋白具有亲和力的一种或多种跨膜蛋白。在多个实施方式中，可以包含邻接或非邻接序列和/或5'未翻译区的启动子序列可以用于表达所公开的基因，其中所述启动子在非靶细胞或组织中具有有限或不具有活性。在一些实施方式中，所公开的启动子可以耐受沉默，这可以导致表达随时间降低。在一些实施方式中，例如，所述靶细胞可以是肝细胞，例如，肝脏组织中存在的细胞。在这些实施方式中，可以通过包含对肝细胞受体或肝细胞膜蛋白具有亲和力的膜蛋白的颗粒将所述载体、盒和构建体靶向肝细胞和/或所述载体、盒和构建体可以包含一种或多种肝-特异性启动子，其在其它细胞和组织类型中几乎没有或没有活性。所公开的启动子的一些实例可以对CMV、Ef1a、ABCA1(在ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF275948.1？report＝genbank&to＝149034可获得)，或者SEQ ID NO：1和13中的启动子，例如，对约100bp至2kbp，例如，200bp至1.5k，在一些实施方式中，大于100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1.0kb、1.2kbp、1.3kbp、1.4kbp、1.5kbp、1.6kbp、1.7kbp、1.8kbp或1.9kbp且小于约2.5kbp、2.4kbp、2.3kbp、2.2kbp、2.1kbp、2.0kbp、1.9kbp、1.8kbp、1.7kbp、1.6kbp、1.5kbp、1.4kbp、1.3kbp、1.2kbp、1.1kbp、1.0kbp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp或300bp的邻接或非邻接部分具有大于80％的同一性。

基因疗法

可以将胆固醇相关蛋白，作为一个实例，胆固醇降解酶靶向至哺乳动物细胞，例如，对其有需要的受试者中的细胞。在一些实施方式中，在一种或多种载体中将所述蛋白靶向至细胞。在一些实施方式中，所述载体可以包含一种或多种酶、蛋白、肽、核酸或其组合。在一个实施方式(例如，其中所述载体包含核酸)中，所述载体还可以包括一种或多种哺乳动物表达控制序列，其包含调控一种或多种胆固醇相关蛋白或胆固醇降解酶的表达的核酸序列，其可以包括一种或多种细菌胆固醇分解代谢酶。在一些实施方式中，可以将所述载体直接或间接靶向至多种细胞和组织。在一些实施方式中，可以将所述载体递送至肝组织、肝细胞、血管、动脉内皮细胞、肌细胞、上皮细胞、巨噬细胞、肝细胞、肝星形细胞、库柏法细胞、肝窦内皮细胞或者可以含有或与过量胆固醇有关或者可以帮助降低受试者中的胆固醇水平的任何其它细胞。在一些实施方式中，所公开的载体可以优先被肝细胞、内皮细胞和/或巨噬细胞吸收。

所公开的载体、构建体、酶和方法可以在降低用所述载体、构建体、酶或方法治疗的受试者的细胞中的至少一种脂质的浓度中有用。在多个实施方式中，所述至少一种脂质是胆固醇。在多个实施方式中，可以在检测血清中脂质减少前，在一种或多种哺乳动物细胞中降低脂质的浓度。在一些实施方式中，所述细胞可以是肝细胞，或者其它哺乳动物细胞。

细胞疗法

可以将胆固醇降解酶靶向至受试者中的哺乳动物细胞。在一些实施方式中，体外修饰所述细胞以包含一种或多种胆固醇相关基因或蛋白，然后向所述受试者施用。在这些实施方式中，胆固醇降解基因、蛋白和酶的递送可以包括细胞治疗方法。在一个实施方式中，一种或多种细胞可以分离自需要治疗的受试者。在其它实施方式中，所述一种或多种细胞可以得自可以与受试者相关或无关的供体。在大多数实施方式中，所述细胞可以是干细胞或者可以是诱导的多潜能干细胞。细胞可以得自多种来源，例如，组织、血液、骨髓、脐血等，它们已得自受试者或供体。可以修饰细胞以表达一种或多种胆固醇相关基因、蛋白和/或酶。然后，向所述受试者施用所述修饰的细胞。

可以修饰多潜能干细胞(PSC)以表达一种或多种胆固醇相关基因或蛋白，如一种或多种胆固醇降解酶。在一些实施方式中，所述多潜能干细胞可以是诱导的多潜能干细胞(iPSC)。所述iPSC可以来源于受试者(自体同源)或者相关或无关供体(异源或同种异体)。在一些实施方式中，可以修饰所述iPSC以降低免疫原性——也就是说，降低受试者免疫系统的排斥或攻击。在一些实施方式中，可以修饰所述细胞以防止或抑制与免疫原性有关的一种或多种基因、蛋白或受体的表达，例如，主要组织相容性(MHC)基因，例如，MHC I类和MHC II类。在一些实施方式中，可以在向受试者施用前，使这些基因在iPSC中缺失。对于一些细胞类型，MHC I类表达的缺少可以导致通过自然杀伤(NK)细胞的鉴定和攻击(例如，溶胞)。为了克服这种“自我缺失(missing self)”反应，可以在施用前将基因引入细胞——这可以被称为基因的敲入。在一些实施方式中，可以敲入非多形性HLA基因(例如，HLA E)的单一重链。

在一些实施方式中，在处理受试者后，它可以用于除去施用的细胞。在这些实施方式中，可以在向受试者施用前修饰所公开的细胞以包含可以帮助除去、消除、破坏或杀死所施用的细胞，例如，在施用于受试者之后除去、消除、破坏或杀死所施用的细胞的一种或多种基因。在一些实施方式中，所述基因是当表达时，使得所述细胞对一种或多种化合物敏感和/或杀死所述细胞的基因。在一些实施方式中，这可以被称为“自杀基因”。在多个实施方式中，所述基因与分别能够使环磷酰胺、伊立替康和氟胞嘧啶转化为活性代谢产物的细胞色素P450 2B1、人肠羧酸酯酶和胞嘧啶脱氨酶有关。在一些实施方式中，所述基因是胸苷激酶(TK)，例如，来自单纯疱疹病毒的TK(HSV-TK)。在大部分实施方式中，自杀基因的表达可以导致所述修饰的细胞对于对不具有自杀基因的细胞无效(或具有最小效果)的化合物或分子是脆弱的。在多个实施方式中，例如，其中所述自杀基因是HSV-TK的情况，所述化合物可以是前体药物，例如，更昔洛韦(GCV)。在这些实施方式中，可以用低剂量的GCV杀死HSV-TK修饰的细胞，而无HSV-TK基因的细胞不被杀死。

表达一种或多种胆固醇相关基因或蛋白，如胆固醇降解酶的细胞可以经历分化。在多个实施方式中，可以处理所述细胞以促进向所选细胞类型的分化。在这些实施方式中，可以将所述细胞转化、转染、刺激和/或经受一种或多种因子、激素、肽、蛋白、化合物、分子以帮助分化。在多个实施方式中，可以处理所公开的PSC以分化为免疫细胞，例如，单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。在其它实施方式中，可以使所述细胞分化为与受试者中的靶组织或细胞类似的类型。

简要地，可以如下使人iPSC分化为单核细胞。可以使用本领域中熟知的方法接种和培养人iPSC。可以在骨形态发生蛋白4(BMP4)、活化素A和CHIR99021(GSK-3抑制剂)中培养细胞约2天以诱导细胞形成中胚层。然后，将细胞在血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、SB431542(TGF-βR抑制剂)和干细胞因子(SCF)中培养3天以允许分化为生血内皮(HE)。HE细胞是CD144⁺/CD34⁺/CD73^-并且它们可以进一步分化为CD43⁺HPC。在多种情况下，可以通过分别在第2天和第5天对中胚层(CD140a+)和HE(CD144+CD34+CD73-)的FACS分析打分来确定分化效率。从第5天至第9天，通过在VEGF、FGF2、SCF、白介素3(IL-3)、白介素6(IL-6)和促血小板生成素(TPO)中生长诱导造血细胞。此外，可以基于群体中圆形HPC数来估计分化效率，或者可以通过FACS分析，对HPC-特异性标志物CD43(例如，在第9天)打分来定量效率。在第9天，在顺序使用TrypLE和Accutase使贴壁细胞解离以最小化细胞应力前，首先收集圆形HPC。最终，通过在含有IL-3、IL-6和巨噬细胞集落-刺激因子(M-CSF)的培养基以混悬培养生长，从HPC诱导单核细胞。在5至6天，从HPC诱导单核细胞。

在施用于受试者之后，包含选自胆固醇降解酶、自杀基因等的一种或多种基因的修饰的单核细胞和/或巨噬细胞可以迁移至炎症位点，例如，具有动脉粥样硬化病变的血管和/或具有脂肪肝细胞的肝脏组织。在多个实施方式中，所述修饰的单核细胞和/或巨噬细胞可以进入炎症位点，例如，发炎的动脉粥样化血管，并继续吞入和/或降解胆固醇。这可以帮助减小动脉粥样硬化斑块尺寸、整体动脉粥样硬化负担、胆固醇浓度和/或局部炎症。

所公开的组合物、细胞、方法和疗法在治疗动脉粥样硬化和高胆固醇血症中有用。在多个实施方式中，所公开的治疗方法和组合物可以用于治疗或预防I型至VI型动脉粥样硬化病变，例如，早先存在的VI型或者具有血栓、裂纹和血肿病征的复杂病变。在多种情况下，所公开的组合物、细胞、方法和疗法在治疗和预防这些病变，包括复杂病变的发病/形成中有用。

胆固醇-相关疾病和病症

可以使用本发明所公开的组合物和方法治疗或预防多种疾病和病况。在大多数实施方式中，用所公开的方法和组合物治疗的疾病或病况是胆固醇相关疾病和病况。以下公开了可以通过所公开的组合物和方法治疗的一些示例性疾病和病况。

已显示过量的天然LDL和升高的LDL:HDL比在心血管疾病、动脉粥样硬化、中风以及冠心病和心脏病中起重要作用。乙酰化LDL是LDL的体外化学修饰形式并且体内不存在。乙酰化LDL和氧化LDL两者均被巨噬细胞吸收，从而将那些细胞转化为泡沫细胞。在大多数情况下，LDL的所有组分对氧化敏感，从而产生了LDL的氧化形式(oxLDL)。通过动脉巨噬细胞对oxLDL的吸收在斑块的形成中至关重要。不同于未修饰的LDL，oxLDL通过LDL清除受体以不受调控的方式被动脉壁巨噬细胞吸收。氧甾酮比天然胆固醇的反应性高10-100X，它们中毒性最强的是7-酮基胆固醇(7KC)，它也是oxLDL中含量最高的。

研究发现更高的循环7KC水平与未来更大的心血管事件风险和升高的总死亡率有关。7KC是促炎、促氧化、促凋亡和纤维发生分子，其通过破坏细胞膜和用于血管舒张反应的关键离子转运通路来改变内皮细胞功能。

在高胆固醇血症患者中，7KC可以占约57％的血浆氧甾酮。7KC之后是7-α/β羟基胆固醇(血浆氧甾酮的21％)，它是7KC代谢的直接产物。在动脉斑块中，据报道55％的氧甾酮是7KC，而含量第二和第三高的是分别为13％和12％的胆甾烷-3β,5α,6β-三醇和7-α/β羟基胆固醇。

如上所述，NASH(非酒精性脂肪性肝炎)是与过量胆固醇相关的另一种疾病，它可以用所公开的组合物和方法治疗。改变的胆固醇体内平衡和转运促进游离胆固醇在肝脏中的积累，这反过来通过肝细胞损伤和非实质细胞的激活来促进NAFLD(非酒精性脂肪性肝病)。具体地，游离胆固醇在线粒体中及周围的过载引起线粒体功能障碍并且促进炎症、纤维化和肝细胞死亡。

可以用所公开的组合物和方法治疗或预防的其它胆固醇-相关疾病和病况包括肺泡蛋白沉积症(PAP)、眼病、神经退行性疾病、C型尼曼皮克病(NPC)和溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺陷。由于胆固醇含量在有肺动物中在调控表面活性剂流动性和功能中起作用，并且流动性可以快速变化，特别是在极端温度下，因此胆固醇清除降低是驱使PAP病理发生的主要缺陷。就眼病来说，氧甾酮，并且具体地7KC，引起视网膜细胞退化。因此，氧甾酮水平升高可以在多种眼病中起作用，包括黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、青光眼和白内障。

氧甾酮水平升高还可以导致脑胆固醇代谢改变。胆固醇代谢可以是几种脑病的主要组成(integral)部分，包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森氏症和痴呆病发展。已在患有阿尔茨海默氏病的患者的死后的脑中鉴别出了来源于胆固醇自氧化的多种氧甾酮，包括7KC。慢性癫痫也可以具有这些病理学中的多种。具体地，已表明了癫痫症和动脉粥样硬化之间的联系。因此，动脉粥样硬化的治疗，如本发明所公开的组合物、细胞和方法可以减轻癫痫的影响。此外，7KC对神经元细胞是高度细胞毒性的，并且已怀疑参与多种神经学疾病的发展。意外地，不同于胆固醇，氧甾酮可以跨过血脑屏障(BBB)并在脑组织中积累，最终导致神经变性。

多种其它疾病可以与胆固醇水平升高有关，并且可以用所公开的组合物和方法治疗。例如，患有C型尼曼皮克病(NPC)的患者不能清除胆固醇，从而导致胆固醇和氧甾酮大部分在肝脏、脾脏和脑中积累。已报道7KC谱与疾病严重程度之间的正相关。另外，患有溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺陷的患者在溶酶体中积累胆固醇酯和甘油三酯，并且可以出现高胆固醇血症、高脂血症和/或动脉粥样硬化。这些患者还在他们的血浆中具有非常高的氧甾酮，包括7KC水平。氧甾酮形成的增加进一步提高了氧化应激，并使病况恶化。

所公开的组合物和方法在治疗与细胞、组织和器官中过量胆固醇和/或脂肪沉积有关的疾病或病况中有用。在一些实施方式中，所述疾病或病况可以与过量胆固醇以及一种或多种氧化胆固醇物质，如7-酮基胆固醇的存在有关。在一些实施方式中，所述疾病或病况可以是脂肪肝病、动脉粥样硬化、心力衰竭、中风、缺血、冠心病、眼病、神经变性和神经疾病、眼部疾病，如黄斑变性、肺功能障碍等中的一种或多种。

所公开的组合物、细胞、方法和疗法可以帮助治疗、降低或逆转与过量胆固醇有关的多种疾病、病症或病况。在一个实施方式中，所述疾病、病症或病况可以是早期II型病变(即巨噬细胞泡沫细胞形成)、III型病变或前动脉粥样化(pre-atheromas)(即具有胞外脂质的小集合)、IV型病变或动脉粥样化(即具有胞外脂质核)、V型病变或纤维性动脉粥样化(fibroatheromas)(即具有纤维性增厚的动脉粥样化)中的一种或多种。

治疗

所公开的细胞疗法可以帮助降低动脉粥样化或动脉粥样斑块。在一些实施方式中，所公开的疗法可以将动脉粥样化降低约5％至约100％，例如，约70％至约90％，并且大于约30％、40％、50％、60％或更高。例如，所公开的治疗可以减小需要对其进行治疗的患者群体中的动脉粥样化体积，其中所述体积基于通过一种或多种侵入性血管内超声(IVUS)的成像。较新型的无创成像方式，如B-模式超声、心脏计算机断层成像(CT)、正电子发射断层成象术(PET)和磁共振成象(MRI)。在多个实施方式中，与未用所公开的组合物、细胞、方法或疗法治疗的受试者群体相比，群体中动脉粥样化的体积可以减小大于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，并且小于约100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％。在多个实施方式中，减小的间隔为大于处理后约1个月至治疗后约24个月，例如，大于约2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月且小于约36个月、30个月、25个月、24个月、23个月、22个月、21个月、20个月、19个月、18个月、17个月、16个月、15个月、14个月、13个月、12个月、11个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月或1个月。在一些实施方式中，例如，其中基于归一化斑块部分测量所述受试者，所治疗的受试者群体(例如，2个或更多个受试者)可以具有下列平均减小：大于约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％且小于约100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％，例如，约42％。

所公开的载体、构建体、酶和方法可以在降低细胞中至少一种胆固醇的量中有用。在大部分实施方式中，所公开的载体、构建体、酶和方法可以在影响全身胆固醇水平，如受试者血清中的胆固醇水平之前降低细胞胆固醇水平。在一个实施方式中，受试者的至少一种细胞中的胆固醇的减少可以导致全身胆固醇水平的减少。在多个实施方式中，组织中总或游离胆固醇的水平可以降低大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，且小于约95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。在多个实施方式中，所公开的载体、构建体、酶和方法可以用于治疗或预防动脉粥样硬化、心血管疾病(CVD)、心肌梗塞、中风、周围性血管疾病、糖尿病、甲状腺机能减退、肾病、肝病、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、NAFLD、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝炎和肝纤维化。在多个实施方式中，所公开的载体、构建体、酶和方法可以用于治疗或预防肝硬化、脂肪性肝炎、炎症或肝纤维化。

实施例

实施例1-哺乳动物施用

用空载体(组1)、包含细菌-来源的胆固醇分解代谢酶的序列的哺乳动物表达载体(组2和组3)注射3组，每组5只小鼠(C57BL/6J；Jackson Lab#000664)。通过尾静脉注射，每只小鼠接受约10¹²个拷贝的载体、盒或构建体。

注射后，对小鼠饲喂高脂饮食(Envigo TD 88137)。食物和水均无限制，并且每天对每只小鼠称重，并记录数据。

在第14天处死小鼠。收集血清和肝脏组织进行分析。

实施例2-血清和肝脏脂质浓度

如上所述，在处死前收集血清样品，并且在处死后收集肝脏样品。使用CaymanChemical(Ann Arbor,MI)甘油三酯比色测试试剂盒(品目号No.10010303)定量第0天(d0)和第14天(d14)的血清以及d14的肝脏匀浆中的甘油三酯。简要地，用脂蛋白脂肪酶、甘油激酶、磷酸甘油氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林(4-AAP)和N-乙基-N-(3-磺丙基)-m-茴香胺(ESPA)的混合物处理血清。借此，从甘油三酯释放甘油，磷酸化并氧化，从而释放过氧化氢，过氧化氢与4-AAP和ESPA反应以生产通过530-550nm的光吸收所测量的紫色。

定量血清和肝脏样品中的甘油三酯水平，并且在图1中的图中提供结果。这些图显示对于3个组，在d0和在d14，血清中的甘油三酯水平类似。肝脏组织的甘油三酯水平也类似于这3个组。

在d14，如通过生产商(Abcam；ab65341游离脂肪酸定量测定试剂盒)所述，通过比色/荧光测定测试了血清和肝脏中的游离脂肪酸水平。简要地，将脂肪酸转化为CoA衍生物，氧化以产生颜色或荧光，并且通过比色(分光光度法，在λ＝570nm)或者荧光(在Ex/Em＝535/587nm)进行定量。直接测试血清样品。根据生产商的规程，提取并干燥组织样品中的脂肪酸——简要地，首先在冷PBS中清洗样品，然后在存在Triton X-100和氯仿的情况下匀浆化。将样品离心以分离有机相，在处理前收集并干燥所述有机相。

定量第14天时血清和肝脏中的游离脂肪酸水平。结果如图1所示。这些结果表明在3组间，血清或肝脏中脂肪酸水平的变化不大。

根据生产商的规程(Abcam；ab65359，胆固醇/胆固醇酯定量测定试剂盒)，通过比色/荧光测定来测定胆固醇酯、总胆固醇和游离胆固醇水平。简要地，通过用胆甾醇酯酶处理样品将胆固醇酯转化为胆固醇来测定总胆固醇。然后，用胆固醇氧化酶处理胆固醇以获得过氧化物，通过颜色(λmax＝570nm)和荧光(Ex/Em＝535/587nm)测定定量所述过氧化物。通过减去用胆甾醇酯酶处理前所测定的游离胆固醇的量来确定胆甾醇酯水平。根据生产商的规程，直接测试血清样品。首先，在氯仿、异丙醇和NP-40的混合物中将组织样品匀浆化，离心并在分析前收集并干燥有机相。

定量第14天时小鼠血清中的胆固醇酯水平。结果如图1所示。这些结果表明在3组间，胆固醇酯的血清水平差异不大。

实施例3-游离和总胆固醇分析

比较血清中总胆固醇和游离胆固醇的水平，并分析肝脏组织的游离胆固醇。如以上所描述的，测定样品。

尽管在第14天，对于全部3个组，血清中的游离和总胆固醇水平类似，但是对照小鼠的肝脏组织中的游离胆固醇水平大于任一个测试组。具体地，如图2所示，肝脏组织中的总胆固醇水平对于G2和G3基本相同(平均游离胆固醇约30mg/dl)。相反，对照组(G1)的肝脏中的总胆固醇的量高约50％——游离胆固醇约45mg/dl。

这些结果证实靶向肝细胞的本发明所公开的构建体在降低饲喂高脂饮食的小鼠中的脂肪肝中是有效的。如上所述，在2周时，对照小鼠的血清胆固醇水平类似于处理组。此外，在处死时，不利影响不明显。

实施例4-重组蛋白在肝脏组织中的表达

通过蛋白测定确认了以上所描述的研究的结果。具体地，探查蛋白免疫印迹以确认肝脏组织中重组蛋白的表达。简要地，在注射后2周收获肝脏组织。将组织在裂解缓冲液中匀浆化，将裂解液加载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，通过电泳分离，并将蛋白转移至适合于蛋白免疫印迹分析的膜上。使用FLAG(上图)抗体对膜进行蛋白免疫印迹以识别FLAG标签化的重组蛋白。图3显示了结果。

如图3(顶部图)所示，重组蛋白(～120kD)的表达对来自用所公开的构建体/盒所处理的小鼠的肝脏组织是特异的，而来自对照小鼠的样品(空载体；泳道1、7和8)不与FLAG抗体反应。通过用抗-GAPDH&抗-微管蛋白抗体探查，测量了加载量。在图3的两幅底部图中显示了这些结果。

整体上，数据表明含有本发明所公开的构建体/盒的载体导致胆固醇-催化重组蛋白在处理小鼠的肝脏组织中的表达。

图例：G1，组1-空载体，在本文中用作对照；G2，组2-AAV1-HR，G3：组3-AAV 6-HR。M：小鼠。

实施例5-动脉粥样硬化的细胞治疗性治疗

用表达一种或多种胆固醇降解酶的体外修饰的细胞处理易动脉粥样硬化小鼠，ApoE-null小鼠。简要地，用对照表达载体或含有如以上所描述的所公开的胆固醇代谢基因中的一种或多种的编码区的表达载体修饰干细胞。

处理后，将小鼠处死以制备主动脉根、主动脉弓(包括头臂动脉、右锁骨下动脉、右颈总动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉)和主动脉树(降主动脉/胸主动脉和腹主动脉)的组织切片。分析切片相对于未处理的对照小鼠的变化。具体地，分析切片以测量斑块面积/血管壁面积和斑块面积/血管腔面积。

以下无创成像技术中的一种或多种可以用于评价动脉粥样硬化疾病负荷、斑块尺寸、斑块组成等的变化：无创颈动脉超声、颈动脉磁共振、计算机断层成像冠状动脉血管照相术、冠状动脉磁共振成象和正电子发射断层成象术(PET)。将PET示踪剂用于帮助评价。在一个实施方式中，PET示踪剂是18F-氟去氧葡萄糖(18F-FDG)。由于代谢活性升高，PET示踪剂可以被巨噬细胞吸收，并借此相对于活性不高的周围细胞识别巨噬细胞。这使得PET示踪剂能够起到炎症替代物的作用。这提供了对多个血管床的炎性斑块活性的评价。所公开的方法已用于心血管炎症降低试验(CIRT)-成像研究(NCT02576067)。

实施例6-动脉粥样硬化的基因治疗性治疗

动物护理、照顾和药物施用：

将20只雄性ApoE-null小鼠(jax.org/strain/002052)随机分成3个研究组，每组10、5和5只小鼠。在研究第0天，对所有小鼠植入皮下渗透性微型泵(alzet.com/products/alzet_pumps/)以允许血管紧张素II的连续释放(0.7mg/kg/天，4周)并将小鼠置于高脂饮食(insights.envigo.com/hubfs/resources/data-sheets/88137.pdf)4周。然后，使小鼠回到正常饲料，分成3组并且每组通过尾静脉静脉内施用以下之一：组1(n＝10只小鼠)——5×10¹³vg/kg的AAV6-空(2×10¹³vg/mL)；组2-5×10¹³vg/kg的AAV6-CDP(胆固醇降解蛋白：2×10¹³vg/mL)；组3-5×10¹³vg/kg的AAV6-CDP(2×10¹³vg/mL)。

对组2和3注射不太批次的AAV6-CDP以确定是否存在批次间变化。

动物安乐死、组织收获和处理：

在第28天，在通过CO₂麻醉，通过末端安乐死处理后，使小鼠安乐死。使小鼠通过下颌静脉出血，从而收集约0.5mL的血液，将其处理成血清以用于随后的分析。然后，通过左心室向小鼠缓慢灌注10mL PBS+0.5mM EDTA，随后灌注10mL PBS。灌注液从右心房连续流出，并且小心监测肝脏漂白以用于大致估计有效的全身灌注。收获肝脏、肺、脾脏、肾和脑并将其置于冰冷的PBS中并处理。

在全身PBS+EDTA/PBS灌注并除去所指明的器官后，用5mL 10％的中性缓冲的福尔马林(NBF)通过左心室灌注心脏/主动脉树结构。然后，从动物小心除去该结构，浸没到10％NBF中并在4℃储存过夜。然后，将组织在4℃在15％的蔗糖中放置6-12小时(即直至组织沉没)，并将其转移至4℃，30％的蔗糖中过夜，直至组织沉没。蔗糖溶液是高渗的并且将使组织脱水。由于用15％和30％的蔗糖溶液平衡组织，因此组织将沉没到容器底部。在将其在OCT包埋媒介物中冷冻前，组织充分脱水是重要的以防止由于水结晶膨胀所造成的冷冻损伤假象。

将心脏和主动脉树切成5个部分：(1)心脏-主动脉根(HR-AR)；(2)胸腔-I或T1；(3)胸腔-II或T2；(4)腹部-I或A1；和(5)腹部-II或A2。以下简要描述了制备这些样品的方法。

心脏-主动脉根(HR-AR)：将心脏和主动脉根与主动脉树的其余部分分离。使用手术刀片，沿图5所示红线切割心脏。切掉约70％(从顶点至距底部3mm，即下部)的心室。将剩余的HR-AR(上部)置于组织模具中，并在OCT中包埋，从而确保主动脉根垂直置于组织模具的底部表面上。将模具在用干冰冷冻的异戊烷中急冻3-5分钟，直至组织块成为固体和白色。将组织块在干冰上冷冻30min，并在-80℃冰箱中储存直至冰冻切片。

然后，如下并且如图5(底部图)所示，将包含主动脉树的剩余的主动脉块切段。简要地，胸腔-I(T1)结构包括含有无名(innominate)、右锁骨下、右颈总动脉、左颈动脉和左锁骨下动脉的主动脉弓，胸腔-II(T2)结构包括从第7肋骨至隔膜的主动脉，包括肋间动脉，腹部-I(A1)结构包括隔膜下方至腹主动脉中部的主动脉，包括腹腔、上肠系膜和右/左肾动脉。腹部-II(A2)结构包括从腹主动脉中部至低于髂骨分叉水平的主动脉，其包括下肠系膜，和位于髂骨分叉的髂总动脉。

将T1、T2、A1和A2结构浸没在含有OCT包埋媒介物的常规冷冻模具中的相同深度，并处于如附图所示的适当取向。将模具在用干冰冷冻的异戊烷中急冻3-5分钟，直至组织块成为固体和白色。将组织块在干冰上冷冻30min，并在-80℃冰箱中储存直至冷冻切片。如下将块切片：心脏-AR块-将心室组织切片并弃去直至达到主动脉窦。这通过在显微镜下检查直至出现3个主动脉瓣来进行识别。一旦出现全部主动脉瓣，切下10μm切片并在载玻片上作为10μm连续切片固定。然后，将载玻片对油红O/梅尔氏苏木精染色。胸腔I、胸腔II、腹部I和腹部II块(即4个主动脉块)-将10μm厚的连续切片(其中每第10个连续切片相隔100μm)对油红O/梅尔氏苏木精染色。基于油红O/H&E数据，将所选的连续切片(例如，第12、第13、第14和第15切片)分别对Flag、F4/80、CD45和-SMC肌动蛋白染色。

油红O染色规程如下所示。通过将2.5g ORO添加至400mL 99％(vol/vol)异丙醇并通过磁力搅拌在室温(RT)下混合2h来制备ORO储液。对于ORO工作溶液，将1.5份的ORO储液加入至一份的蒸馏水中。将溶液在4℃静置10min，通过45μm过滤器过滤。将冷冻切片在室温(RT)下平衡10min，用60％异丙醇漂洗并在室温(RT)下与ORO工作溶液培育15分钟。用60％的异丙醇漂洗切片，用梅尔氏苏木精复染(counterstain)，在流动的自来水下漂洗并盖片。

如下评价斑块负荷。通过确定斑块面积和血管腔面积并通过将总斑块面积除以总血管腔面积计算比值来定量斑块负荷水平。确定对照处理和CDP-处理小鼠的比值。

尽管公开了多个实施方式，但是根据以下具体说明，本发明的其它实施方式将对本领域技术人员是显而易见的。如将显而易见的，本发明能够在多个明显方面进行修改，这些均不会背离本发明的精神和范围。因此，将具体说明认为在本质上是说明性的而非限制性的。

本文所公开的所有参考文献，无论是专利还是非专利，均如在引用时以其全部内容包括它们一样作为参考并入本文。在参考文献和说明书之间发生冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。

尽管已以特定详细程度描述了本发明公开，但是应理解已通过举例建立了本发明公开，并且可以在不背离如所附权利要求中所定义的本发明公开的精神的情况下做出细节和结构的改变。

序列表

<110> 修理生物科技公司（REPAIR BIOTECHNOLOGIES, INC.）

<120> 微生物胆固醇催化基因的靶向表达降低过量脂质（TARGETED EXPRESSION OFMICROBIAL CHOLESTEROL CATALYSIS GENES

REDUCES EXCESS LIPID）

<130> P286540.WO.01 - 507078.00010

<140>

<141>

<150> 63/094,075

<151> 2020-10-20

<150> 62/983,102

<151> 2020-02-28

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /标注="人工序列的说明: 合成的核苷酸"

<400> 1

atgctggcca agggcctgcc tcctagaagc gtgctcgtga agggctgcca gaccttcctg 60

agcgccccta gagaaggcct gggcagactg agagtgccta caggcgaagg cgccggaatc 120

agcaccagaa gccccagacc cttcaacgag atccccagcc ctggcgacaa cggctggctg 180

aacctgtacc acttctggcg ggaaaccggc acccacaaag tgcatctgca ccacgtgcag 240

aacttccaga agtacggccc catctaccgc gagaagctgg gcaacgtgga aagcgtgtac 300

gtgatcgacc ccgaggacgt ggccctgctg tttaagagcg agggccccaa ccccgagcgg 360

ttcctgattc ctccttgggt ggcctaccac cagtactacc agaggcccat cggcgtgctg 420

ctgaagaagt ccgccgcctg gaagaaagac cgggtggccc tgaaccagga agtgatggcc 480

cctgaggcca ccaagaactt tctgcccctg ctggacgccg tgtccagaga ctttgtgtcc 540

gtgctgcacc ggcggatcaa gaaggccggc agcggcaatt acagcggcga catcagcgac 600

gacctgttca gattcgcctt cgagagcatc accaacgtga tcttcggcga gcggcagggc 660

atgctggaag aggtcgtgaa tcccgaggcc cagcggttca tcgacgccat ctaccagatg 720

ttccacacca gcgtgcccat gctgaatctg ccccccgacc tgtttcggct gttccggacc 780

aagacctgga aggaccatgt ggccgcctgg gatgtgatct tcagcaaggc cgacatctac 840

acccagaact tctactggga gctgcggcag aaaggcagcg tgcaccacga ctaccggggc 900

atcctgtaca gactgctggg cgacagcaag atgagcttcg aggacatcaa ggccaacgtg 960

accgagatgc tggctggcgg cgtggacacc accagcatga ctctgcagtg gcacctgtac 1020

gagatggccc ggaacctgaa ggtgcaggac atgctgagag ccgaggtgct ggccgccaga 1080

catcaggctc agggcgatat ggccacaatg ctgcagctgg tgcctctgct gaaggccagc 1140

atcaaagaga cactgcggct gcaccccatc agcgtgaccc tgcagagata cctcgtgaac 1200

gacctggtgc tgcgggacta catgatcccc gccaagaccc tggtgcaggt ggccatctat 1260

gccctgggaa gagagcctac attcttcttc gaccctgaaa acttcgaccc cacccggtgg 1320

ctgagcaagg acaagaacat cacctacttc cgcaacctgg gcttcggctg gggcgtgcgg 1380

cagtgtctgg gcagaagaat cgccgagctg gaaatgacca tcttcctgat caatatgctg 1440

gaaaacttcc gggtggaaat ccagcacctg agcgacgtgg gcaccacctt caacctgatc 1500

ctgatgcccg agaagcctat cagcttcacc ttctggccct tcaatcagga agccacccag 1560

cagaccgacg gcaccagcag cacccaggaa aagacccccc agatctgcgt cgtgggctct 1620

ggacctgccg gcttttacac agcccagcat ctgctgaaac acccccaggc ccacgtggac 1680

atctacgaga agcagcccgt gcccttcggc ctggtgcgct ttggagtggc cccagatcac 1740

cccgaagtga agaacgtgat caacaccttc acccagaccg cccacagcgg cagatgtgcc 1800

ttctggggca atgtggaagt gggccgggat gtgaccgtgc ccgaactgag ggaagcctac 1860

catgccgtgg tgctgagcta cggcgccgag gatcatcggg ccctggaaat ccctggcgag 1920

gaactgcctg gcgtgtgtag cgccagagcc ttcgtgggct ggtacaacgg cctgcccgaa 1980

aaccaggaac tggaacccga cctgagctgc gacaccgccg tgattctggg ccagggaaat 2040

gtggccctgg atgtggccag aatcctgctg acccctcccg agcacctgga aagaaccgac 2100

atcaccaagg ccgccctggg cgtgctgaga cagagcagag tgaaaaccgt gtggctcgtg 2160

ggcagacggg gacctctgca ggtggcattc accatcaaag aactgcgcga gatgatccag 2220

ctgccaggcg ccagacccat cctggaccct gtggatttcc tgggactgca ggacaagatc 2280

aaagaggtgc ccagaccccg gaagcggctg acagaactgc tgctgagaac cgccacagag 2340

aagcctggcc ctgccgaagc tgctagacag gcctctgcct ctagagcctg gggcctgcgg 2400

ttcttcagat cccctcagca ggtgctgcct agccccgatg ggagaagggc agctggcgtg 2460

cgcctggctg tgactagact ggaaggcgtg gacgaggcca caagagccgt gccaacaggg 2520

gacatggaag atctgccctg cggactggtg ctgtccagca tcggctacaa gagcagaccc 2580

gtggacccct ccgtgccttt cgatagcaag ctgggcgtga tccctaacgt ggaaggcaga 2640

gtgatggacg tgcccggcct gtactgttcc ggctgggtca aaaggggccc cacaggcgtg 2700

atcgccacaa caatgaccga cagcttcctg accggccaga tgctgctgca ggacctgaaa 2760

gccggcctgc tgccatctgg ccctagacct ggatatgccg ccatccaggc tctgctgtcc 2820

tcacggggag tgcggcctgt gtccttcagc gactgggaga aactggatgc cgaagaggtg 2880

gccaggggac agggcactgg caagcccaga gaaaagctgg tggaccctca ggaaatgctg 2940

cgcctgctgg gccatacaga tggcgccagc agcagctccg aggataagat caccgtgcac 3000

ttcatcaacc gggacggcga gacactgacc accaagggca aagtgggcga ctctctgctg 3060

gacgtggtgg tggaaaacaa cctggacatc gacggcttcg gcgcctgcga gggaacactg 3120

gcctgtagca cctgtcacct gatcttcgag gatcacatct acgaaaagct ggacgccatc 3180

accgacgaag agaacgacat gctggacctg gcctacggcc tgaccgatag aagcagactg 3240

ggctgtcaga tctgcctgac caagagcatg gacaacatga ccgtgcgggt gcccgagaca 3300

gtggccgatg ccagacagtc catcgatgtg ggcaagacca gcgactacaa ggacgacgac 3360

gacaagtga 3369

<210> 2

<211> 1122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /标注="人工序列的说明: 合成的核苷酸"

<400> 2

Met Leu Ala Lys Gly Leu Pro Pro Arg Ser Val Leu Val Lys Gly Cys

1 5 10 15

Gln Thr Phe Leu Ser Ala Pro Arg Glu Gly Leu Gly Arg Leu Arg Val

20 25 30

Pro Thr Gly Glu Gly Ala Gly Ile Ser Thr Arg Ser Pro Arg Pro Phe

35 40 45

Asn Glu Ile Pro Ser Pro Gly Asp Asn Gly Trp Leu Asn Leu Tyr His

50 55 60

Phe Trp Arg Glu Thr Gly Thr His Lys Val His Leu His His Val Gln

65 70 75 80

Asn Phe Gln Lys Tyr Gly Pro Ile Tyr Arg Glu Lys Leu Gly Asn Val

85 90 95

Glu Ser Val Tyr Val Ile Asp Pro Glu Asp Val Ala Leu Leu Phe Lys

100 105 110

Ser Glu Gly Pro Asn Pro Glu Arg Phe Leu Ile Pro Pro Trp Val Ala

115 120 125

Tyr His Gln Tyr Tyr Gln Arg Pro Ile Gly Val Leu Leu Lys Lys Ser

130 135 140

Ala Ala Trp Lys Lys Asp Arg Val Ala Leu Asn Gln Glu Val Met Ala

145 150 155 160

Pro Glu Ala Thr Lys Asn Phe Leu Pro Leu Leu Asp Ala Val Ser Arg

165 170 175

Asp Phe Val Ser Val Leu His Arg Arg Ile Lys Lys Ala Gly Ser Gly

180 185 190

Asn Tyr Ser Gly Asp Ile Ser Asp Asp Leu Phe Arg Phe Ala Phe Glu

195 200 205

Ser Ile Thr Asn Val Ile Phe Gly Glu Arg Gln Gly Met Leu Glu Glu

210 215 220

Val Val Asn Pro Glu Ala Gln Arg Phe Ile Asp Ala Ile Tyr Gln Met

225 230 235 240

Phe His Thr Ser Val Pro Met Leu Asn Leu Pro Pro Asp Leu Phe Arg

245 250 255

Leu Phe Arg Thr Lys Thr Trp Lys Asp His Val Ala Ala Trp Asp Val

260 265 270

Ile Phe Ser Lys Ala Asp Ile Tyr Thr Gln Asn Phe Tyr Trp Glu Leu

275 280 285

Arg Gln Lys Gly Ser Val His His Asp Tyr Arg Gly Ile Leu Tyr Arg

290 295 300

Leu Leu Gly Asp Ser Lys Met Ser Phe Glu Asp Ile Lys Ala Asn Val

305 310 315 320

Thr Glu Met Leu Ala Gly Gly Val Asp Thr Thr Ser Met Thr Leu Gln

325 330 335

Trp His Leu Tyr Glu Met Ala Arg Asn Leu Lys Val Gln Asp Met Leu

340 345 350

Arg Ala Glu Val Leu Ala Ala Arg His Gln Ala Gln Gly Asp Met Ala

355 360 365

Thr Met Leu Gln Leu Val Pro Leu Leu Lys Ala Ser Ile Lys Glu Thr

370 375 380

Leu Arg Leu His Pro Ile Ser Val Thr Leu Gln Arg Tyr Leu Val Asn

385 390 395 400

Asp Leu Val Leu Arg Asp Tyr Met Ile Pro Ala Lys Thr Leu Val Gln

405 410 415

Val Ala Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Glu Pro Thr Phe Phe Phe Asp Pro

420 425 430

Glu Asn Phe Asp Pro Thr Arg Trp Leu Ser Lys Asp Lys Asn Ile Thr

435 440 445

Tyr Phe Arg Asn Leu Gly Phe Gly Trp Gly Val Arg Gln Cys Leu Gly

450 455 460

Arg Arg Ile Ala Glu Leu Glu Met Thr Ile Phe Leu Ile Asn Met Leu

465 470 475 480

Glu Asn Phe Arg Val Glu Ile Gln His Leu Ser Asp Val Gly Thr Thr

485 490 495

Phe Asn Leu Ile Leu Met Pro Glu Lys Pro Ile Ser Phe Thr Phe Trp

500 505 510

Pro Phe Asn Gln Glu Ala Thr Gln Gln Thr Asp Gly Thr Ser Ser Thr

515 520 525

Gln Glu Lys Thr Pro Gln Ile Cys Val Val Gly Ser Gly Pro Ala Gly

530 535 540

Phe Tyr Thr Ala Gln His Leu Leu Lys His Pro Gln Ala His Val Asp

545 550 555 560

Ile Tyr Glu Lys Gln Pro Val Pro Phe Gly Leu Val Arg Phe Gly Val

565 570 575

Ala Pro Asp His Pro Glu Val Lys Asn Val Ile Asn Thr Phe Thr Gln

580 585 590

Thr Ala His Ser Gly Arg Cys Ala Phe Trp Gly Asn Val Glu Val Gly

595 600 605

Arg Asp Val Thr Val Pro Glu Leu Arg Glu Ala Tyr His Ala Val Val

610 615 620

Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Asp His Arg Ala Leu Glu Ile Pro Gly Glu

625 630 635 640

Glu Leu Pro Gly Val Cys Ser Ala Arg Ala Phe Val Gly Trp Tyr Asn

645 650 655

Gly Leu Pro Glu Asn Gln Glu Leu Glu Pro Asp Leu Ser Cys Asp Thr

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Ala Val Ile Leu Gly Gln Gly Asn Val Ala Leu Asp Val Ala Arg Ile

675 680 685

Leu Leu Thr Pro Pro Glu His Leu Glu Arg Thr Asp Ile Thr Lys Ala

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Ala Leu Gly Val Leu Arg Gln Ser Arg Val Lys Thr Val Trp Leu Val

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Gly Arg Arg Gly Pro Leu Gln Val Ala Phe Thr Ile Lys Glu Leu Arg

725 730 735

Glu Met Ile Gln Leu Pro Gly Ala Arg Pro Ile Leu Asp Pro Val Asp

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Phe Leu Gly Leu Gln Asp Lys Ile Lys Glu Val Pro Arg Pro Arg Lys

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Arg Leu Thr Glu Leu Leu Leu Arg Thr Ala Thr Glu Lys Pro Gly Pro

770 775 780

Ala Glu Ala Ala Arg Gln Ala Ser Ala Ser Arg Ala Trp Gly Leu Arg

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Phe Phe Arg Ser Pro Gln Gln Val Leu Pro Ser Pro Asp Gly Arg Arg

805 810 815

Ala Ala Gly Val Arg Leu Ala Val Thr Arg Leu Glu Gly Val Asp Glu

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Ala Thr Arg Ala Val Pro Thr Gly Asp Met Glu Asp Leu Pro Cys Gly

835 840 845

Leu Val Leu Ser Ser Ile Gly Tyr Lys Ser Arg Pro Val Asp Pro Ser

850 855 860

Val Pro Phe Asp Ser Lys Leu Gly Val Ile Pro Asn Val Glu Gly Arg

865 870 875 880

Val Met Asp Val Pro Gly Leu Tyr Cys Ser Gly Trp Val Lys Arg Gly

885 890 895

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900 905 910

Gln Met Leu Leu Gln Asp Leu Lys Ala Gly Leu Leu Pro Ser Gly Pro

915 920 925

Arg Pro Gly Tyr Ala Ala Ile Gln Ala Leu Leu Ser Ser Arg Gly Val

930 935 940

Arg Pro Val Ser Phe Ser Asp Trp Glu Lys Leu Asp Ala Glu Glu Val

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Ala Arg Gly Gln Gly Thr Gly Lys Pro Arg Glu Lys Leu Val Asp Pro

965 970 975

Gln Glu Met Leu Arg Leu Leu Gly His Thr Asp Gly Ala Ser Ser Ser

980 985 990

Ser Glu Asp Lys Ile Thr Val His Phe Ile Asn Arg Asp Gly Glu Thr

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Leu Thr Thr Lys Gly Lys Val Gly Asp Ser Leu Leu Asp Val Val

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Val Glu Asn Asn Leu Asp Ile Asp Gly Phe Gly Ala Cys Glu Gly

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Thr Leu Ala Cys Ser Thr Cys His Leu Ile Phe Glu Asp His Ile

1040 1045 1050

Tyr Glu Lys Leu Asp Ala Ile Thr Asp Glu Glu Asn Asp Met Leu

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Asp Leu Ala Tyr Gly Leu Thr Asp Arg Ser Arg Leu Gly Cys Gln

1070 1075 1080

Ile Cys Leu Thr Lys Ser Met Asp Asn Met Thr Val Arg Val Pro

1085 1090 1095

Glu Thr Val Ala Asp Ala Arg Gln Ser Ile Asp Val Gly Lys Thr

1100 1105 1110

Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

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<210> 3

<211> 1767

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /标注="人工序列的说明: 合成的核苷酸"

<400> 3

cctggagatc ctgttgactg tagcatggag ggggcttgtg cagctgaatg tctgcatgca 60

ggtggtggga gttctggaat atgatggagc tggaggtggg aagagaagta ggcttggggc 120

agctctctca tgccacctca ttctggccaa aactcaggtc aaactgtgaa gagtctaaat 180

gtgaatctgc ccttcaaggt ggctacaaag gtatctttgt caaggtagga gaccttgtgg 240

cctccacgtg cacttccagg gcctgcttgg gcctcttcta cgggtctgtc ctgagtcttc 300

tatgaatctg tccttcaggg cagattcata tttagactct tcacagtttg acctgagttt 360

tggccagaat aaggtgacat ttagtttgtt ggcttgatgg atgacttaaa tatttagaca 420

tggtgtgtag gcctgcattc ctactcttgc cttttttttt gcccctccag tgttttgggt 480

agttttgctc ccctacagcc aaaggcaaac agagaagttg gaggtctgga gtggctacat 540

aattttacac gactgcaatt ctctggctgc acttcacaaa tgtatacaaa ctaaatacaa 600

gtcctgtgtt tttatcacag ggaggctgat caatataatg aaattaaaag ggggctggtc 660

catattgttc tgtgtttttg tttgtttgtt ttgtttgttt ctttttttgt ttttgtggcc 720

tccttcctct caatttatga agagaagcag taagatgttc ctctcgggtc ctctgaggga 780

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cacgctgggc gtgctggctg agggaac 1767

<210> 4

<211> 521

<212> PRT

<213> 人类

<400> 4

Met Leu Ala Lys Gly Leu Pro Pro Arg Ser Val Leu Val Lys Gly Cys

1 5 10 15

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Ala Ala Trp Lys Lys Asp Arg Val Ala Leu Asn Gln Glu Val Met Ala

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Pro Glu Ala Thr Lys Asn Phe Leu Pro Leu Leu Asp Ala Val Ser Arg

165 170 175

Asp Phe Val Ser Val Leu His Arg Arg Ile Lys Lys Ala Gly Ser Gly

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Asn Tyr Ser Gly Asp Ile Ser Asp Asp Leu Phe Arg Phe Ala Phe Glu

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Ser Ile Thr Asn Val Ile Phe Gly Glu Arg Gln Gly Met Leu Glu Glu

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Val Val Asn Pro Glu Ala Gln Arg Phe Ile Asp Ala Ile Tyr Gln Met

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Phe His Thr Ser Val Pro Met Leu Asn Leu Pro Pro Asp Leu Phe Arg

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Leu Phe Arg Thr Lys Thr Trp Lys Asp His Val Ala Ala Trp Asp Val

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Ile Phe Ser Lys Ala Asp Ile Tyr Thr Gln Asn Phe Tyr Trp Glu Leu

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Arg Gln Lys Gly Ser Val His His Asp Tyr Arg Gly Ile Leu Tyr Arg

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Leu Leu Gly Asp Ser Lys Met Ser Phe Glu Asp Ile Lys Ala Asn Val

305 310 315 320

Thr Glu Met Leu Ala Gly Gly Val Asp Thr Thr Ser Met Thr Leu Gln

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Trp His Leu Tyr Glu Met Ala Arg Asn Leu Lys Val Gln Asp Met Leu

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Arg Ala Glu Val Leu Ala Ala Arg His Gln Ala Gln Gly Asp Met Ala

355 360 365

Thr Met Leu Gln Leu Val Pro Leu Leu Lys Ala Ser Ile Lys Glu Thr

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Leu Arg Leu His Pro Ile Ser Val Thr Leu Gln Arg Tyr Leu Val Asn

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Asp Leu Val Leu Arg Asp Tyr Met Ile Pro Ala Lys Thr Leu Val Gln

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Val Ala Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Glu Pro Thr Phe Phe Phe Asp Pro

420 425 430

Glu Asn Phe Asp Pro Thr Arg Trp Leu Ser Lys Asp Lys Asn Ile Thr

435 440 445

Tyr Phe Arg Asn Leu Gly Phe Gly Trp Gly Val Arg Gln Cys Leu Gly

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Arg Arg Ile Ala Glu Leu Glu Met Thr Ile Phe Leu Ile Asn Met Leu

465 470 475 480

Glu Asn Phe Arg Val Glu Ile Gln His Leu Ser Asp Val Gly Thr Thr

485 490 495

Phe Asn Leu Ile Leu Met Pro Glu Lys Pro Ile Ser Phe Thr Phe Trp

500 505 510

Pro Phe Asn Gln Glu Ala Thr Gln Gln

515 520

<210> 5

<211> 491

<212> PRT

<213> 人类

<400> 5

Met Ala Ser Arg Cys Trp Arg Trp Trp Gly Trp Ser Ala Trp Pro Arg

1 5 10 15

Thr Arg Leu Pro Pro Ala Gly Ser Thr Pro Ser Phe Cys His His Phe

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Ser Thr Gln Glu Lys Thr Pro Gln Ile Cys Val Val Gly Ser Gly Pro

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Ala Gly Phe Tyr Thr Ala Gln His Leu Leu Lys His Pro Gln Ala His

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Val Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Pro Val Pro Phe Gly Leu Val Arg Phe

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Gly Val Ala Pro Asp His Pro Glu Val Lys Asn Val Ile Asn Thr Phe

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Val Val Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Asp His Arg Ala Leu Glu Ile Pro

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Gly Glu Glu Leu Pro Gly Val Cys Ser Ala Arg Ala Phe Val Gly Trp

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Tyr Asn Gly Leu Pro Glu Asn Gln Glu Leu Glu Pro Asp Leu Ser Cys

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Arg Ile Leu Leu Thr Pro Pro Glu His Leu Glu Arg Thr Asp Ile Thr

195 200 205

Lys Ala Ala Leu Gly Val Leu Arg Gln Ser Arg Val Lys Thr Val Trp

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Leu Val Gly Arg Arg Gly Pro Leu Gln Val Ala Phe Thr Ile Lys Glu

225 230 235 240

Leu Arg Glu Met Ile Gln Leu Pro Gly Ala Arg Pro Ile Leu Asp Pro

245 250 255

Val Asp Phe Leu Gly Leu Gln Asp Lys Ile Lys Glu Val Pro Arg Pro

260 265 270

Arg Lys Arg Leu Thr Glu Leu Leu Leu Arg Thr Ala Thr Glu Lys Pro

275 280 285

Gly Pro Ala Glu Ala Ala Arg Gln Ala Ser Ala Ser Arg Ala Trp Gly

290 295 300

Leu Arg Phe Phe Arg Ser Pro Gln Gln Val Leu Pro Ser Pro Asp Gly

305 310 315 320

Arg Arg Ala Ala Gly Val Arg Leu Ala Val Thr Arg Leu Glu Gly Val

325 330 335

Asp Glu Ala Thr Arg Ala Val Pro Thr Gly Asp Met Glu Asp Leu Pro

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Cys Gly Leu Val Leu Ser Ser Ile Gly Tyr Lys Ser Arg Pro Val Asp

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Pro Ser Val Pro Phe Asp Ser Lys Leu Gly Val Ile Pro Asn Val Glu

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Gly Arg Val Met Asp Val Pro Gly Leu Tyr Cys Ser Gly Trp Val Lys

385 390 395 400

Arg Gly Pro Thr Gly Val Ile Ala Thr Thr Met Thr Asp Ser Phe Leu

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Thr Gly Gln Met Leu Leu Gln Asp Leu Lys Ala Gly Leu Leu Pro Ser

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Gly Val Arg Pro Val Ser Phe Ser Asp Trp Glu Lys Leu Asp Ala Glu

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Glu Val Ala Arg Gly Gln Gly Thr Gly Lys Pro Arg Glu Lys Leu Val

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Asp Pro Gln Glu Met Leu Arg Leu Leu Gly His

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<210> 6

<211> 184

<212> PRT

<213> 人类

<400> 6

Met Ala Ala Ala Gly Gly Ala Arg Leu Leu Arg Ala Ala Ser Ala Val

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ala Gly Arg Trp Leu His His Ala Gly Ser Arg Ala

20 25 30

Gly Ser Ser Gly Leu Leu Arg Asn Arg Gly Pro Gly Gly Ser Ala Glu

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Ala Ser Arg Ser Leu Ser Val Ser Ala Arg Ala Arg Ser Ser Ser Glu

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Asp Lys Ile Thr Val His Phe Ile Asn Arg Asp Gly Glu Thr Leu Thr

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180

<210> 7

<211> 372

<212> PRT

<213> 人类

<400> 7

Met Gly Trp Ser Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly Gly Leu Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Ile Val Arg Leu Leu Val Glu Glu Lys Glu Leu Lys Glu Ile Arg

20 25 30

Ala Leu Asp Lys Ala Phe Arg Pro Glu Leu Arg Glu Glu Phe Ser Lys

35 40 45

Leu Gln Asn Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Gly Asp Ile Leu Asp

50 55 60

Glu Pro Phe Leu Lys Arg Ala Cys Gln Asp Val Ser Val Val Ile His

65 70 75 80

Thr Ala Cys Ile Ile Asp Val Phe Gly Val Thr His Arg Glu Ser Ile

85 90 95

Met Asn Val Asn Val Lys Gly Thr Gln Leu Leu Leu Glu Ala Cys Val

100 105 110

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115 120 125

Gly Pro Asn Ser Tyr Lys Glu Ile Ile Gln Asn Gly His Glu Glu Glu

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Pro Leu Glu Asn Thr Trp Pro Thr Pro Tyr Pro Tyr Ser Lys Lys Leu

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Leu Ser Asn Ser Val Phe Thr Phe Ser Tyr Lys Lys Ala Gln Arg Asp

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<210> 8

<211> 390

<212> PRT

<213> 玫瑰色红球菌（Rhodococcus rhodochrous）

<400> 8

Met Ser Ile Asp Thr Ala Arg Ser Gly Ser Asp Asp Asp Val Glu Ile

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Arg Glu Ile Gln Ala Ala Ala Ala Pro Thr Arg Phe Ala Arg Gly Trp

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His Cys Leu Gly Leu Leu Arg Asp Phe Gln Asp Gly Lys Pro His Ser

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65 70 75 80

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Tyr Ser Phe Pro Arg Tyr Phe Lys Asn Val Phe Glu Gly His Thr Ala

195 200 205

Thr Gln Tyr Met His Ser Thr Gly Arg Glu Asp Val Ile Ser Gly Thr

210 215 220

Asn Tyr Asp Asp Pro Asn Ala Glu Leu Arg Ser Glu Ala Thr Tyr Phe

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Gly Pro Ser Tyr Met Ile Asp Trp Leu Glu Ser Asp Ala Asn Gly Gln

245 250 255

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260 265 270

Glu Phe Val Leu Gln Tyr Gly Ala Ile Val Lys Lys Leu Pro Gly Val

275 280 285

Ser Asp Glu Ile Ala Ala Gly Met Ala Glu Gln Phe Ala Glu Gly Val

290 295 300

Gln Leu Gly Phe Glu Gln Asp Val Glu Ile Trp Lys Asn Lys Ala Pro

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Ile Asp Asn Pro Leu Leu Ser Glu Glu Asp Gly Pro Val Tyr Gln Leu

325 330 335

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355 360 365

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<211> 350

<212> PRT

<213> 玫瑰色红球菌（Rhodococcus rhodochrous）

<400> 9

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Pro Gln Gln Leu Ala Thr Leu Ile Ser Pro Phe Ala Asp His Arg Ala

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Ser Ala Ile Leu Asp Glu Glu Asp Ile Ala Asn Gly Tyr Val Leu Ala

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<210> 10

<211> 510

<212> PRT

<213> 玫瑰色红球菌（Rhodococcus rhodochrous）

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<400> 12

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<210> 13

<211> 11414

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /标注="人工序列的说明: 合成的核苷酸"

<400> 13

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 60

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 120

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 180

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 240

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 300

ctcacatgtc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 360

gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 420

agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 480

cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatac 540

gcgtaccgct agccaggaag agtttgtaga aacgcaaaaa ggccatccgt caggatggcc 600

ttctgcttag tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc ctgcccgcca ccctccgggc 660

cgttgcttca caacgttcaa atccgctccc ggcggatttg tcctactcag gagagcgttc 720

accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtcttccg actgagcctt tcgttttatt 780

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acgttgtaaa acgacggcca gtcttaagct cgggccccaa ataatgattt tattttgact 900

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gtacaaaaaa gcaggcttcg aattcagatc tagaagtact ggcaccatgc tggccaaggg 1020

cctgcctcct agaagcgtgc tcgtgaaggg ctgccagacc ttcctgagcg cccctagaga 1080

aggcctgggc agactgagag tgcctacagg cgaaggcgcc ggaatcagca ccagaagccc 1140

cagacccttc aacgagatcc ccagccctgg cgacaacggc tggctgaacc tgtaccactt 1200

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cgcctggaag aaagaccggg tggccctgaa ccaggaagtg atggcccctg aggccaccaa 1500

gaactttctg cccctgctgg acgccgtgtc cagagacttt gtgtccgtgc tgcaccggcg 1560

gatcaagaag gccggcagcg gcaattacag cggcgacatc agcgacgacc tgttcagatt 1620

cgccttcgag agcatcacca acgtgatctt cggcgagcgg cagggcatgc tggaagaggt 1680

cgtgaatccc gaggcccagc ggttcatcga cgccatctac cagatgttcc acaccagcgt 1740

gcccatgctg aatctgcccc ccgacctgtt tcggctgttc cggaccaaga cctggaagga 1800

ccatgtggcc gcctgggatg tgatcttcag caaggccgac atctacaccc agaacttcta 1860

ctgggagctg cggcagaaag gcagcgtgca ccacgactac cggggcatcc tgtacagact 1920

gctgggcgac agcaagatga gcttcgagga catcaaggcc aacgtgaccg agatgctggc 1980

tggcggcgtg gacaccacca gcatgactct gcagtggcac ctgtacgaga tggcccggaa 2040

cctgaaggtg caggacatgc tgagagccga ggtgctggcc gccagacatc aggctcaggg 2100

cgatatggcc acaatgctgc agctggtgcc tctgctgaag gccagcatca aagagacact 2160

gcggctgcac cccatcagcg tgaccctgca gagatacctc gtgaacgacc tggtgctgcg 2220

ggactacatg atccccgcca agaccctggt gcaggtggcc atctatgccc tgggaagaga 2280

gcctacattc ttcttcgacc ctgaaaactt cgaccccacc cggtggctga gcaaggacaa 2340

gaacatcacc tacttccgca acctgggctt cggctggggc gtgcggcagt gtctgggcag 2400

aagaatcgcc gagctggaaa tgaccatctt cctgatcaat atgctggaaa acttccgggt 2460

ggaaatccag cacctgagcg acgtgggcac caccttcaac ctgatcctga tgcccgagaa 2520

gcctatcagc ttcaccttct ggcccttcaa tcaggaagcc acccagcaga ccgacggcac 2580

cagcagcacc caggaaaaga ccccccagat ctgcgtcgtg ggctctggac ctgccggctt 2640

ttacacagcc cagcatctgc tgaaacaccc ccaggcccac gtggacatct acgagaagca 2700

gcccgtgccc ttcggcctgg tgcgctttgg agtggcccca gatcaccccg aagtgaagaa 2760

cgtgatcaac accttcaccc agaccgccca cagcggcaga tgtgccttct ggggcaatgt 2820

ggaagtgggc cgggatgtga ccgtgcccga actgagggaa gcctaccatg ccgtggtgct 2880

gagctacggc gccgaggatc atcgggccct ggaaatccct ggcgaggaac tgcctggcgt 2940

gtgtagcgcc agagccttcg tgggctggta caacggcctg cccgaaaacc aggaactgga 3000

acccgacctg agctgcgaca ccgccgtgat tctgggccag ggaaatgtgg ccctggatgt 3060

ggccagaatc ctgctgaccc ctcccgagca cctggaaaga accgacatca ccaaggccgc 3120

cctgggcgtg ctgagacaga gcagagtgaa aaccgtgtgg ctcgtgggca gacggggacc 3180

tctgcaggtg gcattcacca tcaaagaact gcgcgagatg atccagctgc caggcgccag 3240

acccatcctg gaccctgtgg atttcctggg actgcaggac aagatcaaag aggtgcccag 3300

accccggaag cggctgacag aactgctgct gagaaccgcc acagagaagc ctggccctgc 3360

cgaagctgct agacaggcct ctgcctctag agcctggggc ctgcggttct tcagatcccc 3420

tcagcaggtg ctgcctagcc ccgatgggag aagggcagct ggcgtgcgcc tggctgtgac 3480

tagactggaa ggcgtggacg aggccacaag agccgtgcca acaggggaca tggaagatct 3540

gccctgcgga ctggtgctgt ccagcatcgg ctacaagagc agacccgtgg acccctccgt 3600

gcctttcgat agcaagctgg gcgtgatccc taacgtggaa ggcagagtga tggacgtgcc 3660

cggcctgtac tgttccggct gggtcaaaag gggccccaca ggcgtgatcg ccacaacaat 3720

gaccgacagc ttcctgaccg gccagatgct gctgcaggac ctgaaagccg gcctgctgcc 3780

atctggccct agacctggat atgccgccat ccaggctctg ctgtcctcac ggggagtgcg 3840

gcctgtgtcc ttcagcgact gggagaaact ggatgccgaa gaggtggcca ggggacaggg 3900

cactggcaag cccagagaaa agctggtgga ccctcaggaa atgctgcgcc tgctgggcca 3960

tacagatggc gccagcagca gctccgagga taagatcacc gtgcacttca tcaaccggga 4020

cggcgagaca ctgaccacca agggcaaagt gggcgactct ctgctggacg tggtggtgga 4080

aaacaacctg gacatcgacg gcttcggcgc ctgcgaggga acactggcct gtagcacctg 4140

tcacctgatc ttcgaggatc acatctacga aaagctggac gccatcaccg acgaagagaa 4200

cgacatgctg gacctggcct acggcctgac cgatagaagc agactgggct gtcagatctg 4260

cctgaccaag agcatggaca acatgaccgt gcgggtgccc gagacagtgg ccgatgccag 4320

acagtccatc gatgtgggca agaccagcga ctacaaggac gacgacgaca agggctccgg 4380

cgccaccaat ttcagcctgc tgaagcaggc aggcgacgtg gaagagaacc ccggacctat 4440

gggctggtcc tgcctcgtga caggcgctgg cgggctgctg gggcagagaa ttgtgcggct 4500

gctggtggaa gaaaaagagc tgaaagagat ccgcgccctg gacaaggcct tcagacccga 4560

gctgcgggaa gagttcagca agctgcagaa caggaccaag ctgaccgtgc tggaagggga 4620

tatcctggac gagcccttcc tgaagagggc ctgccaggat gtgtccgtcg tgatccacac 4680

cgcctgcatc atcgacgtgt tcggcgtgac ccaccgcgag agcatcatga atgtgaacgt 4740

gaagggcacc cagctgctgc tggaagcctg tgtgcaggcc agcgtgcccg tgttcatcta 4800

caccagcagc atcgaggtgg ccggacccaa cagctacaaa gagatcatcc agaacggcca 4860

cgaggaagaa cccctggaaa acacctggcc caccccctac ccctacagca agaagctggc 4920

cgagaaagcc gtgctggccg ccaacggctg gaacctgaag aacggcgaca ccctgtacac 4980

ctgtgccctg cggcccacct acatctatgg cgagggcgga cctttcctga gcgccagcat 5040

caacgaggcc ctgaacaaca acggcatcct gagcagcgtg ggcaagttca gcaccgtgaa 5100

ccccgtgtac gtgggcaatg tggcctgggc ccacattctg gctctgagag ccctgcggga 5160

ccccaagaaa gctccttctg tgcggggcca gttctactac atcagcgacg acacccccca 5220

ccagagctac gacaacctga actacatcct gtccaaagag ttcggcctgc ggctggacag 5280

cagatggtcc ctgcctctga ccctgatgta ctggatcggc ttcctgctgg aagtggtgtc 5340

cttcctgctg agccccatct acagctacca gccccccttc aaccggcaca ccgtgaccct 5400

gagcaacagc gtgttcacct tcagctacaa gaaggcccag cgggacctgg cctacaagcc 5460

cctgtactct tgggaggaag ccaagcagaa aaccgtggaa tgggtgggaa gcctggtgga 5520

ccggcacaaa gagacactga agtccaagac ccagggcagc ggcgagggca gaggatctct 5580

gctgacatgc ggcgacgtgg aagagaaccc tggccccatg gccccatata gcctcctggt 5640

gaccagactg cagaaagccc tgggcgtgcg gcagtaccat gtggcctctg tgctgtgcca 5700

gagggccaag gtggccatga gcgactacaa ggacgacgac gacaaaggcg gcggaggcag 5760

catgagcatc gacacagcca gaagcggcag cgacgacgat gtggaaatca gagagatcca 5820

ggccgctgcc gcccctacca gatttgccag aggatggcac tgcctgggcc tgctgagaga 5880

cttccaggac ggcaagcccc acagcatcga ggcctttggc accaagctgg tggtgttcgc 5940

cgacagcaag ggccagctga acgtgctgga cgcctactgc agacacatgg gcggcgatct 6000

gagcagaggc gaagtgaagg gcgactctat cgcctgcccc ttccacgact ggcggtggaa 6060

tggcaagggc aagtgcaccg acatccctta cgccagacgg gtgcccccta tcgccaagac 6120

cagagcctgg accaccctgg aaagaaacgg ccagctgtat gtgtggaacg acccccaggg 6180

caacccccca cctgaggatg tgaccatccc tgagatcgcc ggctacggca ccgacgagtg 6240

gacagactgg tcctggaaaa gcctgcggat caagggcagc cactgccgcg agatcgtgga 6300

caacgtggtg gatatggccc acttcttcta catccactac agcttccccc ggtacttcaa 6360

gaacgtgttc gagggccaca ccgccaccca gtacatgcac tctaccggca gagaagatgt 6420

gatcagcggc accaactacg acgaccccaa cgccgagctg agaagcgagg ccacctactt 6480

cggccccagc tacatgatcg actggctgga aagcgacgcc aacggccaga ccatcgagac 6540

aatcctgatc aactgccact accccgtgtc caacaacgag ttcgtgctgc agtacggcgc 6600

catcgtgaag aaactgcccg gcgtgtccga cgagatcgct gccggaatgg ccgagcagtt 6660

tgccgaaggc gtgcagctgg gcttcgagca ggacgtggaa atctggaaga acaaggcccc 6720

catcgacaac cccctgctga gcgaagagga cggccctgtg tatcagctgc ggcggtggta 6780

tcagcagttc tacgtggacg tggaagatat caccgaggac atgaccaagc gcttcgagtt 6840

cgagatcgat accaccagag ccgtggcctc ttggcagaaa gaggtggccg agaacctggc 6900

caagcaggcc gaaggctcta cagccacacc tggcagcggc gccaccaact tcagcctgct 6960

gaaacaggcc ggggatgtgg aagagaaccc aggccctatg gccccttact ctctgctcgt 7020

gacacggctg cagaaagctc tgggagtgcg ccagtatcac gtggcaagcg tgctgtgtca 7080

gcgcgctaaa gtggctatga gcggctaccc ctacgatgtg cctgattatg ctggcggcgg 7140

aggctccatg acagccgtgc aggctcctgt gaccagcaga gccacagtgc tgaccgtgtc 7200

tgccgtggtg caggaaacag ccgatgccgt gtccctggtg ttcgacgtgc ccgacgacag 7260

aagagaggac ttcacctaca gacccggcca gttcctgacc ctgagaatcc ccagcgacag 7320

gacaggcagc gtggccagat gttacagcct ggccagcagc cctttcaccg gcgagcctcc 7380

aaaagtgacc gtgaagagaa cagctggcgg ctacggcagc aactggctgt gcgacaatat 7440

cgtggccgga cggtccatcg aggtgctgcc tccagctggc gtgttcaccc ctgccgatct 7500

gaccgagaaa ctggtgctgt ttgctggcgg aagcggcatc acccccgtga tgagcatcct 7560

ggaatccgcc ctgcacagcg gcaacaggga cgtggtgctg atctacggca accgcgacga 7620

gaagtccgtg atcttcgccg agaagctgag agagctggcc gccagacacg ctggcgctct 7680

gacagtggtg cattggctgg aatcagtgca gggcctgccc agccctcagc agctggccac 7740

actgatcagc cccttcgccg accacagggc ctacatgtgt ggcccaggcc ccttcatgga 7800

caccgtgcgg gaaggactgc tgctggctgg cgtgcccaag gacagaatcc acgccgaggt 7860

gttcaccagc ctgagcggcg atcctttcgc cgatgtgccc ctggtggaaa tcgacgagtc 7920

cgacgccgat gccacctctg ccacagtgca gctggatggc gaggaacacg acctcgtgtg 7980

gcctagaagc gccacactgg tggacgtgat gctgtccaag ggcctggacg tgccctacag 8040

ctgcagagaa ggcgagtgcg gcagctgcgc ctgtactgtg gtggaaggcg acgtggacag 8100

cctgcctagc gccatcctgg acgaagagga tatcgccaat ggctacgtgc tggcctgcca 8160

ggctagaccc aagagcgatc acgtgcggat cgagttcggc agcggcgagg gaagaggcag 8220

cctgctgaca tgcggagatg tggaagagaa ccctggcccc gactacaagg acgacgacga 8280

taagatgcag gactggacta gtgaatgcga cgtgctggtc gtgggctctg gcggaggcgc 8340

tctgacaggc gcttatacag ctgccgccca gggcctgacc accatcgtgc tggaaaagac 8400

cgacagattc ggcggcacca gcgcctactc tggcgcctct atttggctgc ctggcaccca 8460

ggtgcaggaa agagccggac tgcctgacag caccgagaac gccagaacct acctgagagc 8520

cctgctgggc gacgccgaga gcgaaagaca ggacgcctac gtggaaaccg cccctgctgt 8580

ggtggctctg ctggaacaga accccaacat cgagttcgag ttccgggcct tccccgacta 8640

ctacaaggcc gagggcagaa tggacaccgg ccgcagcatc aaccccctgg atctggaccc 8700

tgccgacatc ggcgatctgg ccggaaaagt gcggcccgag ctggaccagg atagaaccgg 8760

acaggatcac gcccctggcc ccatgattgg aggcagagcc ctgatcggca gactgctggc 8820

tgctgtgcag agcaccggaa aggccgagct gagaaccgag agcgtgctga ccagcctgat 8880

cgtggaagat ggcagagtcg tgggcgccga ggtggaatct gggggcgaga cacagcggat 8940

caaggccaac agaggcgtgc tgatggccgc tggcggcatc gagggaaacg ccgagatgag 9000

ggaacaggcc ggaacacccg gcaaggccat ctggtctatg ggccccttcg gagccaatac 9060

cggcgacgcc atctctgccg gaattgccgt gggcggagct accgcactgc tggatcaggc 9120

ctggttctgc cctggcgtgg aacagcctga tggcagcgcc gcctttatgg tgggagtgcg 9180

gggaggactg gtggtggatt ctgccgggga gagatacctg aacgagagcc tgccctacga 9240

ccagttcggc agagctatgg acgcccacga tgacaacggc tccgccgtgc ccagcttcat 9300

gatcttcgac agcagagagg gcggaggcct gcccgccatc tgcatcccta ataccgcccc 9360

agccaagcac ctggaagccg gaacatgggt gggagccgac acactggaag aactggccgc 9420

caagacaggc ctgcctgccg atgctctgag aagcaccgtg gaaaagttca acgacgccgc 9480

caagctgggc gtggacgaag agttccatag aggcgaggac ccctacgacg ccttcttctg 9540

cccacctaat ggcggagcca acgccgccct gaccgccatt gagaacggcc ctttttacgc 9600

cgccagaatc gtgctgagcg acctgggcac aaagggcggc ctcgtgaccg atgtgaacgg 9660

cagagtgctg agagccgacg gcagcgccat tgacggactg tatgccgccg gaaataccag 9720

cgccagcctg agcggcagat tctaccctgg cccaggcgtg ccactgggca ccgctatggt 9780

gttcagctac agagctgccc aggacatggc gaagtaattc tagagagctc aaggtgaatt 9840

ggctagcgac ccagctttct tgtacaaagt tggcattata agaaagcatt gcttatcaat 9900

ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgcc atccagctga 9960

tatcccctat agtgagtcgt attacatggt catagctgtt tcctggcagc tctggcccgt 10020

gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa 10080

actgtctgct tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac 10140

gtcgaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg 10200

cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgcttg tatgggaagc ccgatgcgcc 10260

agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt 10320

cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac 10380

tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccgga aaaacagcat tccaggtatt 10440

agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg 10500

gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc 10560

tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg 10620

taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aaacttttgc cattctcacc 10680

ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa 10740

attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc 10800

catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa 10860

atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt 10920

tttctaatca gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg 10980

ggacggcgca agctcatgac caaaatccct taacgtgagt tacgcgtcgt tccactgagc 11040

gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 11100

ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 11160

gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 11220

tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 11280

cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 11340

cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 11400

ttcgtgcaca cagc 11414

Claims

1.一种降低需要治疗疾病或病况的受试者的至少一种细胞中的脂质浓度的方法，所述方法包括以下步骤：

将包含构建体的载体施用至所述受试者；

使所述构建体进入所述至少一种细胞以产生修饰的细胞；

使所述修饰的细胞降解脂质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述构建体包含编码下列蛋白中的一种或多种的核酸序列或者与下列蛋白中的一种或多种具有同源性的蛋白：胆固醇脱氢酶(CholD)、3-酮类固醇Δ1-脱氢酶(Δ1-KstD)、厌氧胆固醇代谢B酶(acmB)、3-酮类固醇9α-羟化酶(KshAB)、3β-羟基类固醇脱氢酶2(HSD2)、P450-铁氧化还原蛋白还原酶-铁氧化还原蛋白融合蛋白(P450-FdxR-Fdx)、SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11和12以及通过SEQ ID NO：1和13编码的蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述构建体包含编码下列蛋白中的一种或多种的核酸序列或者与下列蛋白中的一种或多种具有同源性的蛋白：人源化3-酮类固醇Δ1-脱氢酶(Δ1-KstD)、3-酮类固醇9α-羟化酶(KshAB)、3β-羟基类固醇脱氢酶2(HSD2)、P450-铁氧化还原蛋白还原酶-铁氧化还原蛋白融合蛋白(P450-FdxR-Fdx)、SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11和12以及通过SEQ ID NO：1和13编码的蛋白。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述构建体至少包含人源化3-酮类固醇9α-羟化酶(KshAB)，并且人源化KshAB包括KshAB编码序列中的线粒体靶向序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述构建体是包含CMV启动子序列的真核启动子序列的核酸。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述构建体是来自选自SEQ ID NO：1和13的序列的大于约200个核苷酸的核酸。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述构建体是选自SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11和12以及通过SEQ ID NO：1和13所编码的蛋白中的一种或多种的蛋白。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述受试者患有与高胆固醇水平有关的疾病或病况，所述疾病或病况选自以下中的一种或多种：动脉粥样硬化、心血管疾病(CVD)、心肌梗塞、中风、周围性血管疾病、糖尿病、甲状腺机能减退、肾病、肝病、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、NAFLD、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝炎和肝纤维化。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述受试者患有脂肪肝或NAFLD。

11.一种治疗需要治疗与胆固醇有关的疾病或病况的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

将包含一种或多种胆固醇降解基因的载体施用于哺乳动物细胞以产生修饰的细胞；

将所述修饰的细胞施用于所述受试者；

使所述修饰的细胞降解胆固醇；借此

治疗所述受试者。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种胆固醇降解基因编码与下列蛋白具有同源性的蛋白：胆固醇脱氢酶(CholD)、3-酮类固醇Δ1-脱氢酶(Δ1-KstD)、厌氧胆固醇代谢B酶(acmB)、3-酮类固醇9α-羟化酶(KshAB)、3β-羟基类固醇脱氢酶2(HSD2)、P450-铁氧化还原蛋白还原酶-铁氧化还原蛋白融合蛋白(P450-FdxR-Fdx)、SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11和12以及通过SEQ ID NO：1和13编码的蛋白。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述一种或多种胆固醇降解基因编码与下列蛋白具有同源性的蛋白：人源化3-酮类固醇Δ1-脱氢酶(Δ1-KstD)、3-酮类固醇9α-羟化酶(KshAB)、3β-羟基类固醇脱氢酶2(HSD2)和P450-铁氧化还原蛋白还原酶-铁氧化还原蛋白融合蛋白(P450-FdxR-Fdx)、SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11和12以及通过SEQ ID NO：1和13编码的蛋白。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述一种或多种胆固醇降解基因编码与人源化3-酮类固醇9α-羟化酶(KshAB)具有同源性的蛋白，并且人源化KshAB包括KshAB编码序列中的线粒体靶向序列。

15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述载体包含CMV启动子序列的真核启动子序列。

16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述载体包含来自SEQ ID NO：1或13的一种或多种序列的大于约200nt.的核酸。

17.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述一种或多种胆固醇降解基因编码SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11和12以及通过SEQ ID NO：1和13编码的蛋白中的一种或多种的蛋白。

18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞。

19.根据权利要求11-18中任一项所述的方法，其中在向所述受试者施用之前所述修饰的细胞分化。

20.根据权利要求11-19中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用的所述修饰的细胞选自免疫细胞、单核细胞和巨噬细胞。

21.根据权利要求11-20中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用的所述修饰的细胞是巨噬细胞。

22.根据权利要求11-21中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用的所述修饰的细胞是异源的或同种异体的。

23.根据权利要求11-21中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用的所述修饰的细胞是自体同源的。

24.根据权利要求11-22中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用的所述修饰的细胞在参与自免疫原性的一个或多个基因位点处进行修饰，其中所述位点是一个或多个MHC基因位点。

25.根据权利要求11-24中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用的所述修饰的细胞包含自杀基因。

26.根据权利要求11-25中任一项所述的方法，其中所述受试者患有与高胆固醇水平或毒性胆固醇衍生物有关的疾病或病况，所述疾病或病况选自以下中的一种或多种：动脉粥样硬化、心血管疾病(CVD)、心肌梗塞、中风、周围性血管疾病、糖尿病、甲状腺机能减退、肾病、肝病、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、NAFLD、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝炎、肝纤维化、眼部疾病、肺病、神经疾病和神经退行性疾病。

27.根据权利要求11-26中任一项所述的方法，其中所述受试者患有动脉粥样硬化。

28.根据权利要求11-27中任一项所述的方法，其中在治疗后，所述受试者中的至少一种动脉粥样化在体积方面减少大于约50％。

29.一种用于细胞疗法的组合物，包含：

哺乳动物细胞，包含：

至少一种人源化胆固醇降解酶；和

至少一种自杀基因。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述细胞还包含至少一个修饰的MHC位点。

31.根据权利要求29或权利要求30所述的组合物，其中一种或多种胆固醇降解基因编码与下列蛋白具有同源性的蛋白：胆固醇脱氢酶(CholD)、3-酮类固醇Δ1-脱氢酶(Δ1-KstD)、厌氧胆固醇代谢B酶(acmB)、3-酮类固醇9α-羟化酶(KshAB)、3β-羟基类固醇脱氢酶2(HSD2)、P450-铁氧化还原蛋白还原酶-铁氧化还原蛋白融合蛋白(P450-FdxR-Fdx)、SEQ IDNO：2、4、5、6、7、8、9、10、11和12以及通过SEQ ID NO：1和13编码的蛋白。

32.根据权利要求29-31中任一项所述的组合物，其中一种或多种胆固醇降解基因编码与下列蛋白具有同源性的蛋白：人源化3-酮类固醇Δ1-脱氢酶(Δ1-KstD)、3-酮类固醇9α-羟化酶(KshAB)、3β-羟基类固醇脱氢酶2(HSD2)、P450-铁氧化还原蛋白还原酶-铁氧化还原蛋白融合蛋白(P450-FdxR-Fdx)、SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11和12以及通过SEQ IDNO：1和13编码的蛋白。

33.根据权利要求29-32中任一项所述的组合物，其中一种或多种胆固醇降解基因编码与人源化3-酮类固醇9α-羟化酶(KshAB)具有同源性的蛋白，并且人源化KshAB包括KshAB编码序列中的线粒体靶向序列。

34.根据权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中所述细胞包含序列SEQ ID NO：1或13的核酸。

35.根据权利要求29-35中任一项所述的组合物，其中一种或多种胆固醇降解基因编码SEQ ID NO：2、4、5、6、7、8、9、10、11和12以及通过SEQ ID NO：1和13编码的蛋白中的一种或多种的蛋白。

36.根据权利要求29-36中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。

37.根据权利要求29-37中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是诱导的多潜能干细胞。

38.根据权利要求29-38中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是分化的哺乳动物细胞。

39.根据权利要求29-39中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞选自免疫细胞、单核细胞和巨噬细胞。

40.根据权利要求29-40中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是巨噬细胞。

41.根据权利要求29-41中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞包含至少一个修饰的MHC基因位点。

42.根据权利要求29-42中任一项所述的组合物，用于在向患有与高胆固醇水平有关的疾病或病况的受试者施用中使用，所述疾病或病况选自下列中的一种或多种：动脉粥样硬化、心血管疾病(CVD)、心肌梗塞、中风、周围性血管疾病、糖尿病、甲状腺机能减退、肾病、肝病、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、NAFLD、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝炎和肝纤维化。

43.根据权利要求43所述的组合物，其中所述受试者患有动脉粥样硬化。