JP5320387B2 - 修飾ホスファターゼ - Google Patents
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Description
第1の実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られる。これらの変異体は、ここではさらに「ドメインスワップ変異体」と呼ぶ。
理論に制約されるのではないが、ALPPのクラウンドメインは、生産された組換え触媒ALPI/クラウンALPPに立体配座変化を与え、この立体配座変化が、より高い比活性度およびZn2+非依存性酵素をもたらすと思われる。すなわちALPPのクラウンドメインの存在は、比較的高い比活性度をもたらし、Zn2+非依存性であると考えられる。
1)C−末端のアミノ酸の疎水性ストレッチ(少なくとも11のアミノ酸だが、好ましくは12以上のアミノ酸)
2)疎水性領域の上流に、親水性アミノ酸のスペーサ(5〜12のアミノ酸)
3)GPIが、小さいアミノ酸:グリシン、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、セリンまたはシステイン、に付着している
4)GPI付着部位の下流の、2つの続くアミノ酸は、小さいアミノ酸でなければならず、大多数の場合、グリシン、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、セリンまたはシステインから選ばれる。
cerevisiaeおよびPichia pastorisを含む。好ましい宿主細胞は、BHK、HEK293、CHOまたはPerC6(商標)などの、哺乳類(またはより好ましくはヒト)由来細胞である。
クラウンドメインおよび触媒ドメインを有し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られる、単離もしくは組換えアルカリホスファターゼ、
グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)シグナル配列において修飾を有し、前記修飾が分泌ホスファターゼをもたらす、単離もしくは組換えホスファターゼ、
触媒残基付近に変異を含む、単離もしくは組換えホスファターゼ、
またはそれらのあらゆる組合せといった、修飾ホスファターゼを有する医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は随意的に、医薬的に受入れ可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を有する。
・毎分>90回の心拍数
・<36°C(96.8°F)または>38°C(100.4°F)の体温
・毎分>20回の過呼吸(高い呼吸速度)、または血液ガスについて32mmHg未満のPaCO2
・<4,000細胞/mm3もしくは12,000細胞/mm3(<4×109または>12×109細胞/L)の白血球数、または10%を超える帯状体(未熟な白血球)。
実験の部
材料および方法
異なるホスファターゼによる、生物学的にアクティブな基質ATPの脱リン酸化
Perkin Elmerから得られるATPlite(商標)Kitは、以下の試薬を含む:哺乳類の溶解溶液、基質バッファ溶液、凍結乾燥基質溶液および凍結乾燥ATPスタンダード。
開始濃度が20μM ATPの6つの標準曲線を調製し、連続希釈を作製する。最終容積はウェルあたり100μlにすべきである。
50μlの1U/ml ホスファターゼ酵素溶液標準曲線および50μlの40μM ATP溶液を、96ウェルの黒色のOptiplate(商標)(Perkin Elmer)に加えて合わせる。各ウェルの最終容積は100μlになる。
試薬を室温に平衡化させる。
プレート上に70% アルコールを噴霧することによって、気泡を除去する。
アルカリホスファターゼの異なるアイソフォームを用いた、肝臓スライスアッセイ
O2/N2O/Forene麻酔下でラットを犠牲にし、肝臓を取出し、スライスの調製までウィスコンシン大学器官保存溶液(UW)中で貯蔵した。コア(直径5mm)を肝臓組織の一片から作成し、スライスするまで氷冷UW溶液中で貯蔵した。スライスは、Krumdieckスライサで行った。グルコースを最終濃度の25mMまで補充した氷冷KHBをスライスバッファとして用いた。ラット肝臓スライス(厚さ200〜250μm;湿重量±3mg)を標準の設定(サイクル速度30;中断モード)で調製した。スライス後、実験開始までラット肝臓スライスをUW溶液中で貯蔵した。
細胞外ATPの脱リン酸化の生物学的効果
マウスマクロファージ細胞系RAW264.7およびヒト上皮細胞系T84(結腸直腸癌)を
American Type Culture Collection(ATCC、米国、メリーランド州、ロックビル)から得、4.5g/l グルコースを含む、DMEM/F12(1:1)培地およびDMEM培地においてそれぞれ維持した。両培地とも、Invitrogen社(オランダ、ブレダ)から得、Glutamax Iを含み、10% 熱不活性化FBS(Wisent社(カナダ、ケベック州))、100U/ml ペニシリンおよび100μg/ml ストレプトマイシン(双方ともIntvitrogen社)を補充した。トリプシン−EDTAを用いてT84細胞系をコンフルエントに継代培養し、ラバーポリスマンを用いてRAW264.7細胞を剥がし取った。
変異体の調製
ここに記載される変異体、より具体的には、表4、表5および表6に記載される変異体は、標準的な分子生物学的技術を用いて調製した。
t=0にて、450±50ユニットの異なる組換えアルカリホスファターゼを、異なるZn2+濃度の希釈バッファ(0.025M グリシン/NaOH pH9.6/1mM MgCl2/1% マンニトール/0.05% BSA)に4,000倍希釈した。第2の例において、可能性のあるZn2+源としてのBSAをバッファから除外した。希釈(T=0)後1分以内に、サンプルを採取し、以下に記載されるpNPPアッセイを用いてアルカリホスファターゼ活性について測定した。90分(T=11/2h)、180分(T=3h)および22時間(T=22h)後、各時間でサンプルを摂取し、以下に記載されるpNPPアッセイを用いてアルカリホスファターゼ活性について直接測定した。市販のBCAキット(Pierce)を用いて以前に得られたたんぱく含量を通して、得られたU/mlの結果を割ることによる比活性度(U/mg)によって、U/mlの活性度が逆算された。
作業基質:
試薬、基質、サンプルおよびインキュベーションチャンバの温度を25°Cに設定した。分光光度計を405nmの波長に設定し、光路は1cmであった。
活性(U/ml)=ΔE405/分×1.6×希釈係数
を用いて計算した。
注意:測定範囲は0.04〜0.4U/mlでなければならない。
異なるホスファターゼの安定性に及ぼすpHの影響
HEK293細胞において一時的に発現するアルカリホスファターゼのpH安定性を調査した。4.0〜9.0のpH範囲を、それらの25°Cでの特異的pHで調整された5つの異なる0.1M(酢酸ナトリウム、MES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)、MOPS(3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸)、トリス(2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−プロパン−1,3−ジオール)およびグリシン)バッファを用いて試験した。1% マンニトールで安定化させたBiAPを参照として用いた。アルカリホスファターゼ溶液を、各バッファにおいておおよそ100U/mlに希釈し、24時間室温で貯蔵し、前述のようにpNPPホスファターゼ活性アッセイを用いて酵素活性について判定した。
異なるホスファターゼの発現に及ぼす亜鉛の影響
異なる亜鉛塩の、HEK293細胞において一時的に発現するアルカリホスファターゼの活性への影響を、1mM MgCl2+0.1mM 亜鉛塩(ZnCl2、ZnSO4またはZnAc2)を補充した培地における小規模トランスフェクションを用いて調査した。HEK293細胞を、shIAP、shPLAP、Xinplap(触媒ALPI/クラウンALPP)およびsALPP−ALPI−CD(触媒ALPP/クラウンALPI)でトランスフェクトし、t=144hにてサンプルを採取し、前述のようにpNPPホスファターゼ活性アッセイを用いて酵素活性について分析した。
異なるホスファターゼの安定性に及ぼす亜鉛の影響
100μMのZnCl2の存在または不在下において、おおよそ20U/mlの異なる(組換え)アイソフォームのアルカリホスファターゼを含む溶液を、温度安定性試験のために調製した。サンプルを室温、37°Cおよび56°Cで貯蔵し、酵素活性(pNPP)を、前述のようにpNPPホスファターゼ活性アッセイを用いてt=0、2hおよび24hにて判定した。
アルカリホスファターゼの融合たんぱくおよび変異体の生成
適切な発現システムを選択するために、GPIアンカ配列を有する、または欠く、成熟たんぱくをコードするヒト腸(hIAP)およびヒト胎盤(hPLAP)cDNAを、様々なベクタ内にクローニングした。小規模感染の後、用いた発現ベクタは、CMVドライブされ、シスタチンシグナル配列を含み、精製を促進するためのN−末端HISタグを付加された。うまく分泌型hIAPおよびhPLAPの双方を発現した後、2つの融合ヒト分泌型アルカリホスファターゼをin silicoで構築した。1つは胎盤クラウンドメイン(成熟配列のアミノ酸360〜430)を含む腸APのバックボーンに基づき、2つ目は腸APのクラウンドメインを有する胎盤APのバックボーンに基づく(1つ目をRecAPまたは触媒ALPI/クラウンALPPと呼び、2つ目をshPLAP−shIAP−CDまたは触媒ALPP/クラウンALPIと呼ぶ)。ヒトシスタチンシグナル配列を有する上記2つの遺伝子を合成し、CMVプロモータ含有発現ベクタにクローニングした。
ホスファターゼ比活性度に及ぼすGPIアンカの影響
APの様々な組換え型を生産し、精製し、前述のようにpNPPホスファターゼ活性アッセイを用いて酵素活性について評価した。さらに、サンプルのたんぱく量を、SDS−PAGEおよびGelEvalソフトウェアを用いて測定した。活性度(U/ml)をたんぱく濃度(mg/ml)で割ることによって比活性度を計算し、U/mgで表わした。
結果
実施例1
異なるホスファターゼによる、生物学的にアクティブな基質ATPの脱リン酸化
20μMの最終濃度のATPを、異なる濃度のBIAP、sALPP、sALPIまたはキメラの触媒ALPI/クラウンALPPとインキュベートした。表9から、pNPP化学的活性は、たとえばATPといった生物学的基質に向けた活性と1:1で関連しないことが明らかである。BIAPおよびsALPIはそれぞれ、0.031および0.004のpNPPのユニット濃度で37°Cの90分後、ATPの50%を超える脱リン酸化を示すが、ALPPおよび触媒ALPP/クラウンALPPはそれぞれ、0.125および0.0625のpNPPのユニット濃度でこの量を脱リン酸化することができるだけである。
アルカリホスファターゼの異なるアイソフォームを用いた、肝臓スライスアッセイ
LPS(10μg/ml)による刺激で、肝臓スライスがNOXを生産する。図6は、異なる濃度での、異なるヒト組換えアルカリホスファターゼ(sALPI、sALPP、GPI−アンカALPI、触媒ALPI/クラウンALPP)の存在下において、NOX生産が有意に阻害されたことを示している。この実験において、ウシ由来ALPIをポジティブコントロールとして、溶媒をネガティブコントロールとして用いた。
細胞外ATPの脱リン酸化の生物学的効果
T84の上清とのインキュベーションでのRAW264.7細胞によるIL−6の生産は、LPSに依存した。LPSなしでは(図2)、低いレベルのIL−6を生産した。ATPおよびAPは、RAW264.7細胞によって生産されるIL−6のレベルを変えられなかった。反対に、LPSが存在すると、T84の上清とインキュベートしたRAW264.7によるIL−6の生産は、ATPの濃度の増大とともに、増大した。ATPによるサイトカイン生産のこの増大は、0.1U/ml以上のAP濃度によって完全に減少し得た(図3)。
異なるホスファターゼのZn 2+ 依存性の判定
図4および表7に表わされるように、Zn2+は、sALPIの比活性度を有意に安定化させたが、sALPPおよびキメラの触媒ALPI/クラウンALPPは、培地におけるZn2+の存在に依存せず、初期の比活性度を維持した。この実験において、pNPPホスファターゼ活性アッセイにおいて定められた手順に従って使用されるBSAは、微量のZn2+源となり得る。したがって、第2の実験を実行した。表8および図5は、BSAの不在下およびZn2+枯渇化キレート剤EDTAの存在下において、すべてのアイソフォームが22時間後に比活性度を緩めることを示している。しかし、貯蔵中および反応中の生理学的(0.5〜10nM)濃度のZn2+の追加が、sALPPおよび触媒ALPI/クラウンALPPの初期の比活性度のそれぞれ60%および75%超を保存したが、sALPIの初期の比活性度の95%超を失った。非生理学的に高い濃度のZn2+が、sALPIの比活性度を保存するのに不可欠であった。
異なるホスファターゼの安定性に及ぼすpHの影響
BiAP、shIAP、shPLAP、RecAPを、pH値が4.0,5.0,6.0,7.0,8.0および9.0の0.1M(酢酸ナトリウム、MES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)、MOPS(3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸)、トリス(2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−プロパン−1,3−ジオール)およびグリシン)バッファに希釈し、室温で24時間貯蔵した。各pH値について、初期の酵素活性および貯蔵後の酵素活性を、標準的なpNPPアッセイに従って判定した。その名前によって予想および示唆されるように、アルカリホスファターゼ活性は高いpH範囲(アルカリ環境)において最適である。しかし、図7が示すように、胎盤型は、腸アイソフォームよりも安定している。さらに、この結果は、特に高いpH範囲におけるこの安定性が、触媒ドメインによってではなくクラウンドメインによって決定されることを実証している。というのも、触媒ALPI/クラウンALPP(recAP)は、shPLAPの安定性プロフィールに追随し、pH5〜9で安定しているが、BIAPおよびshIAPの安定性はpH7〜8に制限されるからである。反対に、触媒ALPP/クラウンALPI(shPLAP−hIAP−CD)は、pH9にて、胎盤型APおよび触媒ALPI/クラウンALPPよりも安定していない。このことは、触媒ALPI/クラウンALPPがその活性を、試験した天然APまたは逆キメラ(触媒ALPP/クラウンALPI)よりもかなり広い範囲のpH値において維持することを実証している。
異なるホスファターゼの発現に及ぼす亜鉛の影響
HEK293細胞における小規模トランスフェクションを用いて、一時的に発現するアルカリホスファターゼの活性への異なる亜鉛塩の影響を調査した。そうするために、shIAP、shPLAP、Xinplap(触媒ALPI/クラウンALPP)およびsALPP−ALPI−CD(触媒ALPP/クラウンALPI)をトランスフェクトし、t=144hにてサンプルを採取し、酵素活性について分析した。得られた結果は、酵素活性に関してZn2+イオン濃度への依存性が存在するが、観察された活性の増大は用いた亜鉛塩の種類に依存しないことを明らかにした。
異なるホスファターゼの安定性に及ぼす亜鉛の影響
図9は、異なる温度、および100μM ZnCl2の存在または不在下での、異なるAPの経時的な安定性プロフィールを示す。この結果から、亜鉛の不在下で、アルカリホスファターゼの腸アイソフォーム(sALPIおよびBIAP)は、酵素活性に関してかなり温度感受的であると結論される。37°Cにて、BIAPは2時間以内に活性の20%を失い、24時間後にはたった20%の酵素活性しか残っていない。shIAPは、37°Cでの貯蔵24時間後、30%の活性の低下を示す。図9Cは、37°Cでの安定性試験中の亜鉛の存在が、酵素を分解から保護することを示している。しかし、56°Cでは、亜鉛はもはや腸アイソフォームを保護せず、双方の腸アイソフォームとも最初の2時間でほぼ完全に酵素活性を失う。反対に、RecAP(触媒ALPI/クラウンALPP)およびshPLAP(sALPP)は、56°Cにてさえ22時間まで100μMの存在または不在下で優れた安定性を示す。
アルカリホスファターゼの融合たんぱくおよび変異体の生成
分泌型hIAPおよび分泌型hPLAPは、CMVプロモータドライブされ、シスタチンシグナル配列を含むベクタを用いてHEK293において発現し、たんぱくのN−末端部分にHISタグを有した。発現たんぱくは、HISタグを通じて精製し、SDS PAGEによって分析した(図10参照)。分泌型hIAPおよびhPLAPの懸濁培養の1リットルのたんぱく収量は、それぞれ38および16mgであり、>95%の純度を示した。hIAPおよびhPLAPの比活性度は、それぞれ21および100U/mgであった。
ホスファターゼ比活性度に及ぼすGPIアンカの影響
様々なAP組換え型を生産し、酵素活性について評価した。図11に示される結果は、ウシ腸アルカリホスファターゼ(BIAP)およびrecAP(触媒ALPI/クラウンALPP)が、分泌型hIAP、分泌型hPLAPおよびGPIアンカhIAPよりも優れた、類似の比活性度を提示することを実証している。酵素の純度は、酵素の比活性度にとって重要である。したがって、4つのヒト酵素は実験室で精製し、一方、BIAPは超高純度GMPバッチとして得たことに留意すべきである。さらに、分泌型hIAPは、GPIアンカhIAPよりもおおよそ2倍高い比活性度を有することに留意すべきである。理論に限定されるのではないが、より高い比活性度は、構造または純度のいずれかに関連し得る。というのも、分泌型APは、GPIアンカ(膜結合)APよりも容易に精製されるからである。
Claims (18)
- クラウンドメインおよび触媒ドメインを有し、
前記クラウンドメインが、ヒトALPPのクラウンドメインであり、かつ前記触媒ドメインが、ヒトALPIの触媒ドメインであること、または
前記クラウンドメインが、ヒトALPIのクラウンドメインであり、かつ前記触媒ドメインが、ヒトALPPの触媒ドメインであることを特徴とする単離または組換えアルカリホスファターゼ。 - グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)シグナル配列における修飾をさらに含み、前記修飾は分泌ホスファターゼをもたらすことを特徴とする請求項1に記載のアルカリホスファターゼ。
- 前記修飾は、コンセンサスGPIシグナル配列を包含するアミノ酸配列の変異または欠失を含むことを特徴とする請求項2に記載のアルカリホスファターゼ。
- 触媒残基付近および/または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異をさらに有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のアルカリホスファターゼ。
- 前記変異は、表4、表5または表6に表わされる変異であることを特徴とする請求項4に記載のアルカリホスファターゼ。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のアルカリホスファターゼをコードすることを特徴とする核酸配列。
- 請求項6に記載の核酸を有することを特徴とするベクタ。
- 請求項6に記載の核酸または請求項7に記載のベクタを有することを特徴とする宿主細胞。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のアルカリホスファターゼを生産するための方法であって、Zn2+を有する培地において前記アルカリホスファターゼを発現することができる宿主細胞を培養し、細胞が前記アルカリホスファターゼを生産することを可能にすることを含むことを特徴とする方法。
- 前記宿主細胞は哺乳類細胞であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記アルカリホスファターゼを単離することをさらに含むことを特徴とする請求項9または10に記載の方法。
- 請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法によって得ることができることを特徴とするアルカリホスファターゼ。
- 請求項1〜5および12のいずれか1項に記載のアルカリホスファターゼを有することを特徴とする医薬組成物。
- 10μM未満のZn2+濃度を含む環境における、基質の脱リン酸化のための請求項1〜5および12のいずれか1項に記載のアルカリホスファターゼの使用。
- 薬剤としての使用のための請求項1〜5および12のいずれか1項に記載のアルカリホスファターゼ。
- Zn2+欠乏が付随する疾患の治療のための薬剤の調製における請求項1〜5および12のいずれか1項に記載のアルカリホスファターゼの使用。
- 前記疾患は、炎症性疾患を含むことを特徴とする請求項16に記載の使用。
- 前記疾患は、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、および神経皮膚炎から成る群から選ばれることを特徴とする請求項17に記載の使用。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US92669507P | 2007-04-27 | 2007-04-27 | |
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