ES2618794T3 - El uso de fosfatasa alcalina para preservar la función renal - Google Patents

Abstract

Fosfatasa alcalina para uso en un método para prevenir y/o tratar fibrilación auricular, en la que dicha fibrilación auricular se debe a función renal reducida.

Description

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El uso de fosfatasa alcalina para preservar la funcion renal

La invencion se relaciona con el campo de la medicina y en particular con medios y usos en la prevencion y/o tratamiento de fibrilacion auricular.

Los rinones realizan diversas funciones en un cuerpo animal, tales como excrecion de residuos, homeostasis de acido- base, regulacion de osmolalidad, regulacion de presion arterial y secrecion de hormonas. Para activar los rinones para que realicen estas tareas, los rinones reciben, a pesar de su tamano relativamente pequeno, aproximadamente el 20% del gasto cardfaco. En consecuencia, una interrupcion del flujo sangufneo a los rinones (flujo sangufneo renal, RBF) tiene un impacto directo en muchas de las funciones del rinon. Por ejemplo podrfan ocurrir reduccion de excrecion de desechos nitrogenados y alteraciones de fluido y equilibrio hidroelectrolftico. A largo plazo, el RBF reducido, pero tambien otros eventos toxcos, tales como isquemia (lesion por reperfusion), uso de medios de contraste u (otros) farmacos nefrotoxcos, por ejemplo, antibioticos, pueden ser muy estresantes para los rinones lo que resulta en lesion renal aguda (AKI).

Es muy importante para prevenir y/o tratar adecuadamente la AKI, porque en primer lugar, la AKI esta acompanada con altos costes, morbilidad y mortalidad, y en segundo lugar, la AKI prolongada puede conducir a lesion renal cronica (CKI), que posiblemente puede llevar a perdida irreversible de la funcion renal. Adicionalmente, un individuo que ha adquirido CKI es mas propenso a (de nuevo) adquirir AKI, que a continuacion se denomina “lesion renal aguda sobre cronica”. Debido a que la funcion renal en pacientes de CKI ya esta reducida, la lesion renal aguda sobre cronica puede reducir la funcion renal por debajo de un umbral crftico. Por lo tanto, es particularmente importante esa prevencion de AKI en pacientes de CKI. Adicionalmente, se ha especulado que la AKI en la parte superior de CKI deja al paciente con una funcion renal aun mas reducida, incluso despues de que se resuelve el componente agudo de la lesion renal.

Dependiendo de la causa de la AKI (prerrenal, renal o postrenal), estan disponibles diferentes metodos de tratamiento. Si, por ejemplo, el RBF reducido es causante de la AKI, la normalizacion de RBF temprana predice un mejor pronostico para recuperacion de la funcion renal. El tratamiento inicial se debe enfocar en corregir los equilibrios de fluidos y electrolitos y la uremia, mientras que se busca la causa de la AKI aguda. Un paciente con volumen agotado se resucita con solucion salina. Sin embargo, mas a menudo, se presenta sobrecarga de volumen, especialmente si los pacientes tienen oliguria o anuria.

Si la AKI no es provocada por una reduccion en el RBF, sino por ejemplo resulta de isquemia o exposicion a agentes nefrotoxicos, tales como agentes de contraste o antibioticos, es importante eliminar esta causa de AKI. Por ejemplo esto se puede realizar al eliminar la causa de isquemia, por ejemplo, un trombo, o al detener el medicamento que dana el rinon.

Un ejemplo de un tratamiento actual de AKI provocada por el RBF reducido es la furosemida administrada de forma intravenosa (Lasix). Otro ejemplo de uno de los tratamientos actuales es calcio administrado por via intravenosa. El potasio se puede desplazar temporalmente en el compartimiento intracelular utilizando insulina administrada por via intravenosa (10 unidades) y glucosa (25 g), agonistas beta inhalados o bicarbonato de sodio administrado por via intravenosa. La excrecion de potasio se consigue con sulfonato de poliestireno de sodio (Kayexalato) y/o diureticos. El sulfonato de poliestireno de sodio se administra por via oral (25 a 50 g se mezcla con 100 mL de 20 por ciento de sorbitol) o como un enema (50 g en 50 mL de 70 por ciento de sorbitol y 150 mL de agua del grifo). Si estas medidas no controlan el nivel de potasio, se inicia el procedimiento de dialisis.

La acidosis normalmente se trata con bicarbonato de sodio administrado por via intravenosa o por via oral si el nivel de bicarbonato en suero es menor de 15 mEq por L (15 mmol por L) o el pH es menor de 7.2. Los pacientes tambien se pueden tratar por via oral con comprimidos de bicarbonato de sodio, solucion de Shohl en dosis de 30 mL o bicarbonato de sodio en polvo. Los niveles de bicarbonato en suero y el pH se deben seguir de cerca. La acidosis intratable requiere dialis is.

Todos los medicamentos se deben revisar, y se deben ajustar las dosis con base en la tasa de filtracion glomerular y los niveles de suero de medicamentos.

Entre el 20 y el 60 por ciento de los pacientes con AKI requieren dialisis a corto plazo, particularmente cuando el nitrogeno de urea en sangre (BUN) es superior a 100 mg por dL (35.7 mmol por L de urea) y el nivel de creatinina en suero excede el rango de 5 a 10 mg por dL (442 a 884 pmol por L). Las indicaciones para dialisis incluyen alteraciones de acidosis o electrolfticas que no responden a la terapia farmacologica, sobrecarga de fluidos que no responden a diureticos, y uremia. La EMEA por ejemplo, aconseja los siguientes criterios, que estan en lfnea con las recomendaciones ADQII para determinacion del requisito del RRT:

a) oliguria <0.3 ml/kg/h O

b) anuria >12 h Y urea en suero >15 mmol/L O

c) hipercalemia >7.5 mmol/L o con cambios del ECG tfpicos a pesar de la intervencion terapeutica O

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d) acidosis con bicarbonato estandar <15 mmol/L a pesar de intervencion terapeutica O

e) hiponatremia <120 mmol/L a pesar de intervencion terapeutica O

f) diagnostico clfnico de sobrecarga de fluidos con existencia o amenaza de edema pulmonar o cerebral a pesar de intervencion terapeutica.

En algunos casos, los pacientes que sufren de CKI y/o AKI no pueden recibir un tratamiento medico importante para una (otra) afeccion, debido a los posibles efectos toxicos, que dicho tratamiento puede tener. Por ejemplo, un umbral de nivel de creatinina en la sangre se podrfa fijar en 1.4 mg/dL con el fin de recibir contraste yodado. Aunque aparentemente contradictorio, bajo ciertas circunstancias, la terapia de reemplazo renal (RRT) en si tambien es estresante para los rinones.

Normalmente, la RRT agota el volumen desde dentro del espacio intravascular, ya que, como resultado de la eliminacion de desechos, tambien se eliminan fluidos. El volumen de agotamiento se restablece lentamente desde el espacio extravascular. Sin embargo, en pacientes crfticamente enfermos, que ya estan hipovolemicos, el agotamiento del volumen intravascular puede conducir a lesiones isquemicas, por ejemplo, en los rinones. Por lo tanto, se considera que el RRT es un tratamiento estresante para los rinones. Tambien se ha reportado que los pacientes que requieren RRT cronica con el tiempo (3 a 12 meses) pueden perder cualquier funcion renal residual que puedan tener, probablemente como resultado de RRT.

Por lo tanto, se necesitan medios y/o metodos alternatives que conserven y o aumenten la funcion renal, prevengan o acorten la duracion de la RRT, o aumenten la depuracion de creatinina renal.

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar medios y metodos para prevenir o tratar fibrilacion auricular.

La farmacoterapia de la fibrilacion auricular se revisa en Jacob et al, Am. J. of Therapeutics, 18, 241-260 (2011).

La presente divulgacion proporciona fosfatasa alcalina (AP) para uso en por lo menos en parte la conservacion y/o aumento de la funcion renal despues de un tratamiento con el riesgo de reducir la funcion renal. Dicho tratamiento implica administrar dicha fosfatasa alcalina antes de, y, opcionalmente, durante y/o despues del tratamiento con el riesgo de reducir la funcion renal. Tambien se divulga el uso de fosfatasa alcalina para la fabricacion de un medicamento para por lo menos en parte conservar y/o aumentar la funcion renal despues de un tratamiento con el riesgo de reducir la funcion renal. Dicha fosfatasa alcalina se administra preferiblemente antes de, y, opcionalmente, durante y/o despues del tratamiento con el riesgo de reducir la funcion renal.

Como se utiliza aquf, el termino “conservar” incluye prevenir una reduccion, ralentizar una reduccion, detener una reduccion y/o por lo menos reversar parcialmente, una reduccion de una funcion renal. El termino “aumentar” no se limita necesariamente a aumentar dicha funcion renal a un valor igual o mayor que antes que ocurra dicho tratamiento. Incluye restaurar parcialmente la funcion renal.

El termino “tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal” se utiliza normalmente para referirse a un tratamiento que lleva el riesgo de que se reduzca la funcion renal en dicho tratamiento al comparer el valor de por lo menos un parametro renal relacionado con un valor reconocido o promedio (laboratorio) de dicho parametro, o al comparar dicho parametro con el valor antes de que se realice dicho tratamiento. Si, por ejemplo, la cantidad de protefna en la orina de un sujeto, preferiblemente un humano esta significativamente por encima de un valor reconocido o promedio (laboratorio), se dice que se “reduce” dicha funcion. El analisis correspondiente se puede realizar en un laboratorio, pero tambien en el hogar. Por ejemplo, desde septiembre de 2006, el holandes “Nierstichting” ha introducido una prueba simple (llamada verificacion de rinon (“Niercheck”)) que se puede realizar en casa para probar si los rinones funcionan correctamente. Esta prueba se dirige por ejemplo a la cantidad de protefna en la orina.

Otros ejemplos de parametros que se pueden revisar con el fin de determinar la funcion renal son la tasa de filtracion glomerular (GFR), depuracion de creatinina endogena como una aproximacion de GFR, los niveles de creatinina en suero, alteracion de electrolitos, cantidad de orina producida, BUN, niveles de calcio, niveles de fosforo, niveles de albumina y/o globulos rojos y blancos en la orina. Otras pruebas que se pueden realizar son un conteo sangufneo completo con diferencial.

Como se describe aquf dentro de la parte experimental tambien es posible analizar una muestra de orina en la presencia o ausencia de una molecula de ARN. Preferiblemente, dicha molecula de ARN es una molecula de mARN. Incluso mas preferida, dicha molecula de mARN es mARN de iNOS. En una realizacion mas preferida dicho ARN se obtiene de celulas renales secretadas en orina.

Un tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal incluye de este modo cualquier tratamiento que tiene el potencial de influir negativamente en cualquiera de los parametros mencionados anteriormente, de tal manera que se dice de la funcion renal se disminuye. Los tratamientos tfpicos que pueden tener riesgo de reduccion de funcion renal son la terapia de reemplazo renal, exposicion a medios de contraste intravascular, cirugfa de rinon y/o corazon, trasplante de rinon y/o corazon, transfusion de sangre, transfusion de globulos rojos, tratamiento con farmacos nefrotoxicos y/o reexploracion quirurgica. La presente divulgacion proporciona la percepcion de que la AP es muy bien capaz de prevenir

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el dano renal cuando se realiza dicho tratamiento que lleva a un riesgo de reduccion de la funcion renal. Se prefiere que la AP se administre antes de que se realice el tratamiento que lleva el riesgo de reduccion de la funcion renal, con el fin de evitar la reduccion de la funcion renal.

Esta nueva percepcion es especialmente util para un sujeto en el que ya se confirmo que tiene una funcion renal reducida y programada para un tratamiento con un riesgo de reducir la funcion renal. En general, dicho tratamiento tiene el riesgo de reducir la funcion renal aun mas. Esto puede ser problematico si el sujeto programado para dicho tratamiento tiene solo queda poco de la funcion renal. En dicho caso, puede ser necesario posponer o incluso abstenerse de dicho tratamiento, tal como por ejemplo administracion de medios de contraste para propositos de diagnostico. Esto por supuesto no es una situacion ideal ya que dicho tratamiento o metodo de diagnostico puede ser importante para el bienestar de los pacientes. Hasta la presente divulgacion, se ha decidido si se va a abstener del tratamiento o tomar el riesgo de reducir la funcion renal aun mas. Sin embargo, con la percepcion proporcionada por la presente divulgacion ya no es necesario elegir entre estas dos opciones, ya que la AP es capaz de conservar la funcion renal en una persona que experimenta un tratamiento que tiene el riesgo de reducir la funcion renal. Por lo tanto, la divulgacion proporciona un metodo para por lo menos en parte conservar y/o aumentar la depuracion de creatinina renal en un sujeto que experimenta un tratamiento con un riesgo de reducir la depuracion de creatinina renal, por lo menos de esta manera en parte conservar y/o aumentar dicha depuracion de creatinina renal. Esto es particularmente util si dicha persona que experimenta dicho tratamiento tiene un riesgo de reduccion de la funcion renal por debajo de un umbral crftico. De acuerdo con la presente divulgacion, la fosfatasa alcalina es capaz de evitar la reduccion de la funcion renal por debajo de un umbral crftico y por lo tanto permite a dicha persona a recibir el tratamiento, ahora lleva un riesgo mucho menor de reduccion de la funcion renal. Preferiblemente una funcion renal, preferiblemente la depuracion de creatinina renal, se determina antes de que se utilice la AP para conservar la funcion renal con el fin de determinar el riesgo de que la funcion renal de dicha persona se reduzca por debajo de un cierto nivel de umbral.

Preferiblemente, se proporciona un uso de AP de acuerdo con la divulgacion, en la que dicha AP es para administracion a un sujeto que ya sufre de enfermedad renal. Como se dijo anteriormente, dicha persona, que ya sufre de enfermedad renal tiene un mayor riesgo de que el tratamiento conlleve al riesgo de reducir la funcion renal resultando en una funcion renal por debajo de un nivel de umbral. Preferiblemente la AP se utiliza de acuerdo con la invencion en un sujeto que ya sufre de enfermedad renal, que tiene una tasa de filtracion glomerular estimada (GFR) o calculada de menos de aproximadamente 75 ml/min por 1.73 m2, mas preferiblemente menos de aproximadamente 55 ml/min por 1.73 m2, mas preferiblemente menos de aproximadamente 45 ml/min por 1.73 m2, mas preferiblemente menos de aproximadamente 35 ml/min por 1.73 m2. Especialmente en estos bajos valores de GFR, es muy importante conservar la funcion renal restante. Por lo tanto, es importante que las personas que tienen dichos bajos valores de GFR reciban AP con el fin de conservar tanto como sea posible la funcion renal. La GFR se puede evaluar de diversas maneras: En primer lugar, se puede medir por la depuracion de inulina o de cromo EDTA Sin embargo, es decir se restringe a configuraciones experimentales, y en general es muy costoso y consume mucho tiempo para la practica clfnica general. Alternativamente, se puede hacer una aproximacion de la GFR, por ejemplo, al calcular la depuracion de creatinina endogena (ECC). Esto se calcula a partir de un volumen medido en orina de 24 horas, nivel de creatinina en orina y nivel de creatinina en suero. Esto no se hace de forma rutinaria en la practica clfnica, pero en principio es posible. En este calculo de ECC existen errores sistematicos, y los resultados tienden a sobrestimar la GFR real. Los otros metodos para evaluar la GFR son metodos de estimacion. Existen dos metodos principales conocidos en la tecnica, es decir, Cockroft-Gault y MDRD, ambos son mas confiables en enfermedad renal cronica (CKD) que en AKI.

A pesar de que la conservacion a corto plazo de la funcion renal ya puede tener consecuencias inmediatas de soporte vital, se prefiere que el efecto de la AP sobre la funcion renal sea de larga duracion.

Se prefiere que se utilice una AP para conservar la funcion renal despues de tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal, en el que dicho tratamiento es de duracion relativamente corta. Se prefiere que dicho tratamiento sea menor de aproximadamente 4 dfas. Cuando dicho tratamiento comprende por ejemplo los medios de contraste yodados, dicho tratamiento es relativamente corto. Una ventaja de utilizar AP para dichos tratamientos cortos es que la AP tambien se administra durante un perfodo relativamente corto que por ejemplo mejora el cumplimiento de la medicacion.

Se divulga aquf la AP para conservar la funcion renal despues de un tratamiento con el riesgo de reducir la funcion renal, en el que la duracion de dicho tratamiento con el riesgo de reducir la funcion renal es de menos de 4 dfas, preferiblemente menos de 3 dfas, mas preferiblemente menos de 2 dfas, mas preferiblemente menos de 1 dfa.

Como ya se dijo anteriormente, el rinon tiene diversas funciones. Una funcion muy importante es la depuracion de productos de desecho nitrogenados de la sangre. Si estos productos de desecho nitrogenados no se depuran por el rinon, se acumulan en el cuerpo y pueden llevar a toxicidad, por ejemplo, en el sistema nervioso central. La funcion de depuracion de los rinones se mide preferiblemente por depuracion de creatinina renal (endogena), pero por ejemplo tambien son adecuadas otras formas de estimacion de la GFR. La depuracion de creatinina se puede determinar por metodos conocidos en la tecnica. Un metodo para el calculo de la depuracion de creatinina endogena es recoger orina (usualmente 24 horas) para determinar la cantidad de creatinina que se elimina de la sangre durante un intervalo de tiempo dado. Si se quita, por ejemplo, 1440 mg en 24 horas, esto es equivalente a la eliminacion de 1 mg/min. Si la concentracion de sangre es 0.01 mg/mL (1 mg/dL), se dice que la depuracion de creatinina es 100 mL/min. Esto se debe a que, con el fin de excretar 1 mg de creatinina, tendrfan que haber sido depurados 100 mL de sangre que contenfa 0.01 mg/ mL. De acuerdo con la descripcion, la AP es muy capaz de retener la funcion renal. Como

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consecuencia la AP es capaz de mejorar muchos parametros relacionados con la funcion renal, tales como BUN, depuracion de creatinina y niveles de creatinina en suero. Es especialmente util conservar la depuracion de creatinina, ya que la depuracion de creatinina reducida generalmente resulta en aumento de la creatinina y otros productos de desecho toxcos en suero.

Un uso de la AP se divulga aquf, en el que dicha conservacion y/o aumento de funcion renal comprende conservar y/o aumentar la depuracion de creatinina renal con respecto a la depuracion de creatinina renal antes de dicho tratamiento con el riesgo de reducir la funcion renal.

Como se dijo anteriormente, un tratamiento con un riesgo de reducir la funcion renal puede ser cualquier tratamiento que tiene el potencial de reducir la funcion renal en un sujeto cuando dicho sujeto ha recibido dicho tratamiento. Dicho tratamiento comprende terapia de reemplazo de renal (RRT) de ejemplo, exposicion a medios de contraste intravasculares, cirugfa de rinon y/o corazon, trasplante de rinon y/o corazon, transfusion de sangre, transfusion de globulos rojos, tratamiento de farmaco y/o reexploracion quirurgica. La divulgacion proporciona ahora la percepcion de que la AP es adecuada para conservar la funcion renal durante todos estos diferentes tratamientos.

Como ya se ha explicado anteriormente, la funcion renal reducida puede ser una indicacion de RRT, pero en algunos casos la funcion renal reducida tambien puede ser una contraindicacion para la RRT. Esto se explica por el hecho de que la RRT generalmente esta acompanada por el agotamiento de fluido intravasal y los pacientes crfticamente enfermos no toleran las fluctuaciones en la cantidad de fluido intravasal. Esto en ultima instancia puede llevar a un choque hipovolemico, que compromete el flujo sangufneo a los rinones, exponer los rinones a una lesion isquemica. Como ya se menciono anteriormente, se ha observado la perdida completa de la funcion renal residual en los sujetos que recibieron RRT cronica. La presente divulgacion proporciona ahora la idea de que dicha perdida completa de la funcion renal residual en sujetos que recibieron RRT cronica se puede evitar cuando se administra AP antes y/o durante RRT. Por lo tanto, la divulgacion proporciona el uso de AP para evitar y/o reducir una perdida de funcion renal en un sujeto que recibe RRT cronica.

Otro tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal es el uso de medio de contraste intravascular, tal como, por ejemplo, medio de contraste yodinado. Especialmente el medio de contraste yodinado, que es altamente hiperosmolar en comparacion con plasma (sangre) se asocia frecuentemente con una reduccion en la funcion renal. Sin estar limitado por la teorfa, el efecto de los medios de contraste ionicos se puede explicar como sigue. El agente de contraste hiperosmolar puede atraer fluidos extravasales en el sistema vascular, lo que puede provocar que las arterias de los rinones se expandan. Cuando las arterias se expanden los vasoconstrictores se liberan para compensar la expansion arterial. Estas acciones pueden resultar en una accion de apertura y cierre rapido de las arterias. El resultado de esta accion es un suministro sangufneo disminuido a los rinones que puede conducir a un cierre total de los rinones. Tambien exste una posibilidad de que las arterias se puedan restringir en una medida tal que queden completamente cerradas. El cuerpo intenta regular la sobrecarga de fluidos en el sistema vascular. Sin embargo, si los rinones no son funcionales, como resultado del agente de contraste o independiente de este, el fluido se ve obligado a buscar otras venas de escape provocando que ocurra sobrecarga de fluido en otros sistemas del cuerpo. Uno de los principales resultados de este evento es el edema pulmonar. De acuerdo con la divulgacion, se utiliza AP para retener o mejorar la funcion renal cuando se utilizan medios de contraste ionicos. En dicho caso, un paciente que requiere medios de contraste puede recibir dicho tratamiento necesario con menos riesgo de reducir la funcion renal. En casos en donde, antes de la divulgacion actua, los medios de contraste fueron contraindicados en pacientes con funcion renal reducida (severa), ahora es posible tratar dichos pacientes con AP con el fin de permitirles recibir dicho medio de contraste.

Se ha mostrado que la cirugfa cardiaca tambien puede reducir la funcion renal y que no solo la cirugfa cardiaca propiamente dicha un factor de riesgo para AKI, sino tambien que los parametros perioperativos influencian independientemente en el riesgo en AKI despues de cirugfa cardiaca. Estos parametros fueron: anemia preoperatoria, transfusion de globulos rojos y re-exploracion quirurgica. Sin estar limitado por la teorfa, estos parametros, y la cirugfa cardiaca como tal, se considera que todos provocan isquemia al rinon. Por supuesto, no solo la cirugfa cardiaca, sino tambien por ejemplo la cirugfa de rinon o trasplante de rinon provoca isquemia al tejido renal, lo que por lo tanto tambien se considera como un tratamiento con un riesgo de reducir la funcion renal. Como la cirugfa cardiaca es un tratamiento que conlleva un riesgo de reducir la funcion renal, la administracion de AP es capaz de mejorar o retener la funcion renal en un paciente que recibe cirugfa cardiaca.

Otros tratamientos que tienen un riesgo de reducir la funcion renal incluyen, por ejemplo, el uso de determinada medicacion o farmaco. La lesion y disfuncion renal secundaria a medicamentos son comunes y pueden presentarse como lesiones sutiles y/o sobrefalla renal. Algunos farmacos perturban la perfusion renal e inducen perdida de capacidad de filtracion. Otros lesionan directamente las celulas vasculares, tubulares, glomerulares e intersticiales, de tal manera que la perdida especffica de la funcion renal conduce a hallazgos clfnicos, que incluyen microangiopatfa, sfndrome de Fanconi, necrosis tubular aguda, nefritis intersticial aguda, sfndrome nefrotico, obstruccion, diabetes nefrogenica insfpida, anormalidades de electrolitos y falla renal cronica. Especfficamente, el uso de determinados agentes antimicrobianos (tal como anfotericina B, caspofungina, vancomicina, levofloxacina y aminoglicosidos tal como tobramicina y gentamicina), otros farmacos (por ejemplo, agentes quimioterapeuticos (tal como cisplatina, carboplatina, metotrexato), inhibidores de proteasa (tal como indinavir y ritonavir), oro, litio, farmacos antiinflamatorios (tal como farmacos antiinflamatorios no esteroideos, ciclosporina, tacrolimus, sirolimus), y farmacos hipertensivos (tal como inhibidores de enzimas que convierten angiotensina (ACE) y bloqueadores del receptor de angiotensina (ARB)) y

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determinados productos qufmicos (tal como silicatos, hidrocarburos, metales pesados (tal como Cd, Hg, Pb), insecticidas, herbicidas, etilenglicol y toxinas bacterianas (tal como tetano, toxinas estreptococicas) Son conocidas por tener riesgo de reducir la funcion renal en sujetos que han tomado o han sido expuestos a dichos agentes o productos qufmicos. De acuerdo con la presente divulgacion, ahora es posible reducir el efecto de estos agentes o productos qufmicos al administrar AP a sujetos expuestos a dichos agentes o productos qufmicos. Tambien es posible reducir la cantidad de determinados farmacos, ya que la presente invencion proporciona la idea de que el uso de AP de acuerdo con la invencion reduce la cantidad de comedicacion en un paciente.

Se divulga el uso de AP, en el que dicho tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal comprende terapia de reemplazo renal (RRT), exposicion a medio de contraste intravascular, cirugfa cardiaca y/o renal, trasplante de corazon y/o rinon, transfusion sangufnea, transfusion de globulos rojos, tratamiento de farmacos y reexploracion quirurgica.

Un tratamiento que tiene riesgo de reducir la funcion renal puede resultar en reduccion del flujo sangufneo a traves de los rinones. La medula externa del rinon es especialmente susceptible a lesion y/o dano celular cuando se reduce el suministro sangufneo, provocando un evento isquemico. De acuerdo con la divulgacion, es especialmente util utilizar AP para retener o mejorar la funcion renal cuando la presion sangufnea arterial media es, o se espera que sea, menor de 80 mm Hg. Por debajo de una presion sangufnea arterial media de 80 mm Hg, el rinon esta en riesgo de lesion, lo que por lo general resulta en una reduccion de la funcion renal.

Por lo tanto, se divulga el uso de AP, en el que dicho tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal resulta en o esta acompanado por, hipoperfusion del rinon, preferiblemente debido a que la presion sangufnea arterial esta por debajo de 80 mm Hg, preferiblemente por debajo de 75 Mm Hg, mas preferiblemente por debajo de 70 mm Hg, mas preferiblemente por debajo de 65 mm Hg, mas preferiblemente por debajo de 60 mm Hg. De acuerdo con la divulgacion, la AP es capaz, por lo menos en parte, evitar la reduccion en la funcion renal al evitar la lesion del rinon debido a la cafda de la presion sangufnea media arterial.

La AP se utiliza preferiblemente con el fin de conservar y/o mejorar la funcion renal durante un tratamiento que tiene riesgo de reducir la funcion renal, debido a una reduccion transitoria en la funcion renal resulta frecuentemente en una condicion que en sf misma es posiblemente danar el rinon, tal como por ejemplo el requerimiento RRT. Como se dijo anteriormente, el RRT propiamente dicho se puede contraindicar en sujetos que tienen funcion renal reducida. Por lo tanto, se proporciona un uso de AP de acuerdo con la divulgacion, en el que dicha funcion renal se preserva durante dicho tratamiento con un riesgo de reducir la funcion renal. En dicho caso, se evita preferiblemente el requerimiento de RRT. Esto es especialmente util en sujetos que ya tienen una reduccion (severa) en la funcion renal.

Preferiblemente, se utiliza una fosfatasa alcalina para acortar la duracion del RRT. De esta manera, se divulga aquf una fosfatasa alcalina para uso en un metodo para acortar la duracion de RRT a traves de por lo menos en parte conservar y/o aumentar la funcion renal durante y/o despues de RRT, al administrar dicha AP antes de, y opcionalmente durante y/o despues de RRT. Como se dijo anteriormente, el RRT y especialmente el RRT cronico se consideran un tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal. Por lo tanto, es especialmente util acortar la duracion del RRT con el fin de disminuir el riesgo de reducir la funcion renal. Preferiblemente se detiene el RRT cuando una funcion renal ha alcanzado un nivel umbral, de tal manera que ya no se requiere mas RRT. Por lo tanto, se divulga el uso de AP, en el que se determina una funcion renal, preferiblemente GFR, mas preferiblemente depuracion de creatinina renal, y se detiene dicho RRT cuando dicha funcion renal, preferiblemente dicho GFR, mas preferiblemente dicha depuracion de creatinina renal, se aumenta a y/o preserva en un nivel umbral.

Como ya se dijo anteriormente, se prefiere que la preservacion y/o aumento de la funcion renal, tal como la depuracion de creatinina renal, sea de larga duracion. Sin embargo, tambien se prefiere que dicha preservacion y/o aumento ya inicie durante un tratamiento que tiene riesgo de reducir la funcion renal, tal como RRT. De esta manera, se prefiere que el uso de AP preserve y/o aumente la depuracion de creatinina renal durante RRT. En un ejemplo de trabajo, la presente divulgacion muestra que la fosfatasa alcalina es capaz de conservar y/o aumentar la depuracion de creatinina renal despues de RRT.

Un nivel crftico de depuracion de creatinina crftico, en particular para enfermedad renal cronica, se considera que es de aproximadamente 15-25 ml/min. Por debajo de dicho umbral, se acumulan residuos nitrogenados en el cuerpo, ejerciendo posiblemente efectos toxicos. Por lo tanto, se divulga aquf, el uso de fosfatasa alcalina para aumentar y/o conservar la depuracion de creatinina renal en un nivel de por lo menos 15 ml/min, preferiblemente por lo menos 20 ml/min, mas preferiblemente por lo menos 25 ml/min, mas preferiblemente por lo menos 50 ml/min.

La divulgacion proporciona adicionalmente la idea de que los pacientes en UCI requieren significativamente menos medicacion cuando se administra AP. En un ejemplo de trabajo se mostro, por ejemplo, que la medicacion especfficamente que se proporciono para tratamiento de una afeccion cardiaca, tal como una afeccion cardiaca que resulta de infarto de miocardio o falla cardiaca. Se administro significativamente menos a sujetos que reciben AP en comparacion con sujetos que reciben medicacion de placebo. Ahora que la divulgacion proporciona esta idea, es posible utilizar AP para reducir la cantidad de medicacion para el tratamiento de una afeccion cardiaca, reduciendo por lo tanto por ejemplo los efectos colaterales adversos de dicha medicacion.

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Por lo tanto, se divulga el uso de una fosfatasa alcalina, para reducir la cantidad de (co)medicadon, conservando y/o incrementando de este modo por lo menos en parte la funcion renal. Adicionalmente, la divulgacion proporciona una fosfatasa alcalina para uso en un metodo para reducir la cantidad de (co)medicacion en un paciente que ya sufre de (o en riesgo de sufrir) de funcion renal reducida.

Preferiblemente, dicha (co)medicacion es para el tratamiento de una afeccion cardfaca, preferiblemente una afeccion cardiaca que resulta de infarto de miocardio o falla cardfaca. Preferiblemente, dicha (co)medicacion es un medicamento diuretico. Los medicamentos diureticos influenaan el equilibrio de fluidos en un individuo mediante diuresis forzada. Se ha probado que los diureticos son utiles para, entre otras cosas, el tratamiento de la falla cardfaca, hipertension y enfermedades renales. De otra parte, en una persona que ya sufre de funcion renal reducida, los diureticos pueden reducir aun mas la funcion renal, como resultado de una reduccion en la presion sangufnea debido a diuresis. Sin embargo, la AP es capaz de disminuir dicha reduccion en la presion sangufnea y/o evitar o mejorar la funcion renal reducida que resulta de dicha reduccion en presion sangufnea.

Preferiblemente, se divulga el uso de una fosfatasa alcalina de acuerdo con la invencion para reducir la (co)medicacion en la que la (co)medicacion es un antiarrltmico clase III, un -bloqueador selectivo, un glucosido digitalis, un antagonista de vitamina K, o un agonista selectivo de p-2-adrenoceptor. En un ejemplo de trabajo, se ha mostrado que la necesidad de dicha medicacion se reduce en sujetos que reciben AP.

Preferiblemente, se divulga un uso de fosfatasa alcalina para reducir la (co)medicacion, en la que la (co)medicacion es potasio, un benzoderivado, una sulfonamida simple, magnesio y/o glucosidos digitalis. Como los farmacos mencionados anteriormente son potencialmente perjudiciales para el rinon, el uso de AP para reducir la cantidad de estos farmacos, disminuye por consiguiente el riesgo de reduccion de funcion renal en pacientes que reciben AP.

Sin estar limitada por la teorfa, se considera que la reduccion en la (co)medicadOn observada en individuos que reciben AP es un efecto beneficioso directo o indirecto de AP en el riesgo de fibrilacion auricular u otros trastornos vasculares o cardiacos. Por lo tanto, en una realizacion, se proporciona un uso de AP de acuerdo con la invencion, en el que dicha AP es para uso en un metodo para evitar y/o tratar fibrilacion auricular, en el que dicha fibrilacion auricular se debe a funcion renal reducida.

Por lo tanto, en una realizacion, la invencion proporciona una fosfatasa alcalina para uso en un metodo con el fin de evitar y/o tratar la fibrilacion auricular, el que dicha fibrilacion auricular se debe a funcon renal reducida. Tambien se describe el uso de AP para la preparaaon de un medicamente de cualquiera de las indicaciones anteriores.

Ahora que la divulgacion ha proporcionado la idea de que la AP es util para conservar y/o aumentar la funcion renal en un individuo que experimenta un tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal, se divulgan metodos para el tratamiento de individuos en riesgo de reduccion de funcion renal.

Se divulga un metodo para conservar y/o aumentar por lo menos en parte el GFR, preferiblemente por la depuracion de creatinina renal en un sujeto que experimenta un tratamiento con riesgo de reduccion de GFR y/o depuracion creatinina renal, el metodo comprende administrar fosfatasa alcalina antes, y opcionalmente durante y/o despues de dicho tratamiento, conservado y/o aumentando por lo menos en parte dicho GFR, preferiblemente dicha depuracion de creatinina renal y determinar dicha GFR conservada y/o aumentada, preferiblemente dicha depuracion de creatinina renal de por menos 7 dfas despues, preferiblemente por lo menos 14 dfas despues, mas preferiblemente por lo menos 21 dfas despues, mas preferiblemente por lo menos 28 dfas despues de dicho tratamiento con riesgo de reduccion de depuracion de creatinina renal.

Se prefiere que brevemente despues del inicio de la administracion de AP, se tome la decision de si el tratamiento con AP se continua o se detiene. Los individuos que reciben AP para conservacion de la funcion renal se dividen preferiblemente en sujetos que responden bien a tratamiento y sujetos que no responden bien a tratamiento con AP. Prefieren que los buenos respondedores reciban continua administracion de AP hasta que se alcance un nivel umbral de la funcion renal, mientras que se prefiere que los sujetos que no responden bien no reciban necesariamente medicaaon AP adicional. Sujetos que no responden bien a tratamiento con AP se cambian preferiblemente a otro tipo de medicacion tal como diureticos u otros medicamentos de soporte para funcion renal. Por lo tanto, se divulga un metodo para determinar si un sujeto experimenta un tratamiento con riesgo de reducir GFR y/o depuracion de creatinina renal responde bien a un tratamiento de fosfatasa alcalina para por lo menos en parte conservar y/o aumentar el GFR, preferiblemente depuraaon de creatinina renal, el metodo que comprende administrar fosfatasa alcalina antes, y opcionalmente durante y/o despues de dicho tratamiento; Determinar el GFR, preferiblemente depuracion de creatinina renal en valores iniciales y/o en el primer dfa despues del inicio de administracion de fosfatasa alcalina; Determinar GFR, preferiblemente depuracion de creatinina renal en el segundo y/o tercer dfa despues del inicio de administracion de fosfatasa alcalina, en el que un aumento de dicha GFR y/o dicha depuracion de creatinina renal en el segundo y/o tercera dfa, con relacion a dicha GFR y/o depuracion de creatinina renal en valores iniciales y/o en el primer dfa es indicador que dicho sujeto respondiendo bien a dicho tratamiento con fosfatasa alcalina; y determinar si dicho individuo responde bien a dicho tratamiento con fosfatasa alcalina.

No solo es posible discriminar entre sujetos que responden bien a AP y sujetos que no responden bien a AP mediante comparacion de una funcion renal en valores iniciales y/o en el dfa 1 con una funcion renal en el segundo y/o tercera

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dfa, sino tambien al comparar una funcion renal en el segundo y/o tercer dfa despues del inicio de administracion de fosfatasa alcalina con un nivel umbral. Dicho nivel umbral se fija en, por ejemplo, una depuracion de creatinina de 15 ml/min, preferiblemente de 20 ml/min, mas preferiblemente 25 ml/min, mas preferiblemente 50 ml/min, mas preferiblemente 75 ml/min. Dicho umbral puede depender por ejemplo de la condicion general del sujeto en cuestion, o por ejemplo la funcion renal en valores iniciales, es decir, antes de administrar la AP.

Por lo tanto, se divulga un metodo para determinar si un sujeto que experimenta un tratamiento con riesgo de reducir GFR y/o depuracion de creatinina renal responde bien a un tratamiento de fosfatasa alcalina para por lo menos en parte conservar y/o aumentar el GFR, preferiblemente depuracion de creatinina renal, el metodo comprende administrar fosfatasa alcalina antes, durante y/o despues de dicho tratamiento; determinar GFR, preferiblemente depuracion de creatinina renal en el segundo y/o tercer dfa despues del inicio de la administracion de fosfatasa alcalina, en el que una depuracion de creatinina renal de por lo menos 15 ml/min, preferiblemente por lo menos 20 ml/min, mas preferiblemente por lo menos 25 ml/min, mas preferiblemente por lo menos 50 ml/min, mas preferiblemente por lo menos 75 ml/min en el segundo o tercer dfa es indicador de que dicho sujeto responde bien a dicho tratamiento de fosfatasa alcalina; y determinar si dicho individuo responde bien a dicho tratamiento con fosfatasa alcalina.

Un experto puede determinar facilmente un umbral comparable para GFR basado en los umbrales de depuracion de creatinina suministrado anteriormente. Un experto en la tecnica es capaz de estimar el GFR sobre la base de una depuracion de creatinina dada y viceversa. El experto puede ser guiado, por ejemplo, por Levey et al.

Como se dijo anteriormente, la fosfatasa alcalina se administra preferiblemente a un sujeto que recibe un tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal, en el que la duracion de dicho tratamiento es relativamente corta. Preferiblemente, para dicho tratamiento corto, se administra AP durante un corto perfodo de tiempo, asf, mejorando de esta manera por ejemplo la conformidad de la medicacion. Por lo tanto, se divulga un metodo, en el que la duracion de dicho tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal es de menos de 4 dfas, preferiblemente menos de 3 dfas, mas preferiblemente menos de 2 dfas, mas preferiblemente menos de 1 dfa. Como se dijo anteriormente, la AP es especialmente util para tratar pacientes que ya sufren de funcion renal reducida, debido a que dichos pacientes son propensos a tener su funcion renal reducida por debajo de un nivel umbral, que puede resultar en AKI. Con el fin de determinar si un individuo que experimenta un tratamiento con un riesgo de funcion renal reducida ya esta sufriendo de funcion renal reducida, dicha funcion renal se determina preferiblemente antes de empezar dicho tratamiento de potencial dano renal. Por lo tanto, se divulga un metodo de acuerdo con la descripcion, dicho metodo comprende adicionalmente determinar el fndice de filtracion glomerular, depuracion de creatinina, y/o niveles KIM-1 urinarios antes de empezar dicho tratamiento, como se discutio aquf anteriormente.

Preferiblemente, dicho tratamiento con riesgo de reducir la funcion renal comprende terapia de reemplazo renal, exposicion a medios de contraste intravasculares, trasplante de corazon y/o rinon, cirugfa de corazon y/o rinon, transfusion sangufnea, transfusion de globulos rojos, y/o reexploracion quirurgica. Preferiblemente, se utiliza AP durante tratamiento que resultana en, o estarfa acompanado por, hipoperfusion renal, preferiblemente debido a presion sangufnea arterial media que esta por debajo de 80 mm Hg, preferiblemente por debajo de 75 mm Hg, mas preferiblemente por debajo de 70 mm Hg, mas preferiblemente por debajo de 65 mm Hg, mas preferiblemente por debajo de 60 mm Hg, si la AP no se hubiera administrado. Dicha presion sangufnea arterial baja generalmente resulta en funcion renal reducida y/o lesion renal. El uso de AP durante dicho tratamiento, sin embargo, resulta en menor hipoperfusion, menos reduccion en la funcion renal y/o menos dano renal.

Como se dijo anteriormente, la AP es esencialmente util para el acortamiento del RRT. Por lo tanto, se divulga un metodo para acortar la duracion de RRT en un sujeto que experimenta RRT, el metodo comprende administrar una fosfatasa alcalina antes, durante y/o despues de que dicho sujeto experimenta RRT; y determinar la funcion renal, antes, durante y/o despues de que dicho sujeto experimenta RRT; y descontinuar el RRT en dicho sujeto cuando dicha funcion renal se ha incrementado a y/o conservado en un valor umbral, acortando por lo tanto la duracion del RRT en dicho sujeto. Como se dijo anteriormente, la reduccion del RRT es especialmente util cual el RRT (cronico) se considera un tratamiento con un riesgo de reduccion de la funcion renal.

Como se dijo anteriormente, la AP es especialmente util en reducir la cantidad y/o efectos colaterales adversos de la (co)medicacion. Por lo tanto, tambien se divulga un metodo para reducir la cantidad de (co) medicacion, el metodo comprende administrar fosfatasa alcalina a un sujeto que recibe dicha (co) medicacion o estar en riesgo de recibir dicha (co) medicamento. Los inventores han observado que no solo la cantidad de (co) medicacion se reduce en sujetos que recibieron AP en comparacion con sujetos que reciben placebo, sino tambien esa administracion de AP reduce los efectos adversos de la (co) medicacion. Por lo tanto, se divulga un metodo para reducir los efectos adversos de la (co) medicamento en un sujeto que recibe dicha (co) medicacion o esta en riesgo de recibir dicha (co) medicacion, el metodo comprende administrar fosfatasa alcalina antes, durante y/o despues de que dicho sujeto recibe dicha medicacion, reduciendo por lo tanto los efectos adversos de dicha (co)medicacion en dicho sujeto.

Preferiblemente, se divulga un metodo, en el que la AP se utiliza para reducir la (co)medicamento para el tratamiento de una afeccion cardiaca, preferiblemente una afeccion cardfaca que resulta de infarto de miocardio o falla cardfaca.

Preferiblemente, se divulga un metodo, en el que la (co)medicacion es un antiarrftmico clase III|3 un -bloqueador selective, un glucosido digitalis, un antagonista de vitamina K, o un antagonista p-2-adrenoceptor selectivo. La

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divulgacion proporciona la idea de que la necesidad de que estos farmacos especialmente es menor en sujetos que reciben AP.

Preferiblemente, se divulga un metodo, en el que la (co)medicacion es potasio, un benzo-derivado, una sulfonamida simple, magnesio y/o glucosidos digitalis. Como los farmacos mencionados anteriormente son potencialmente perjudiciales para el rinon en sujetos expuestos a ellos, reducir la cantidad de estos farmacos resulta en disminucion del riesgo de funcion renal reducida en estos sujetos.

Cuando se reduce especialmente la (co)medicacion que se proporciona generalmente para el tratamiento de una afeccion cardiaca, especialmente para el tratamiento de fibrilacion auricular, la invencion proporciona la idea de que la AP es capaz de evitar y/o tratar fibrilacion auricular. Por lo tanto, se divulga un metodo para evitar y/o tratar fibrilacion auricular, el metodo comprende administrar fosfatasa alcalina a un sujeto que sufre o esta en riesgo de sufrir de fibrilacion auricular, evitando por lo tanto o tratando dicha fibrilacion auricular. En pacientes de unidad de cuidados intensivos (UCI), la incidencia de y morbilidad debido a la fibrilacion auricular es relativamente alta (hasta 70%, dependiendo del tipo de UCI).

Fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina (AP; EC 3.1.3.1 de acuerdo con nomenclature de enzimas IUBMB), es una enzima que cataliza la reaccion de un monoester de fosfatasa y H2O a un alcohol y fosfato. Otros nombres para la AP son fosfomonoesterasa alcalina; fosfomonoesterasa; glicerofosfatasa; fosfohidrolasa alcalina; fenil fosfatasa alcalina; fosfohidrolasa monoester ortofosforico (alcalino optimo). El nombre sistemico la AP es fosfohidrolasa monofosfato monoester (optimo alcalino).

La AP es una enzima ampliamente especffica, tambien cataliza las transfosforilaciones. En humanos y otros mamfferos se conocen por lo menos cuatro AP distintos pero relacionados. Ellos son AP intestinal, placentario, similar a placenta, y de hfgado/hueso/rinon (o de tejido no especffico). Las tres primeras se ubican junas en el cromosoma 2 mientras que la forma no especffica del tejido se ubica en el cromosoma 1. Las funciones fisiologicas exactas de la AP no se conocen, pero la AP parece estar implicada en un gran numero de procesos fis iologicos.

Una fuente de AP para uso en la invencion puede ser enzima AP comercial, o cualquier composicion que comprende la enzima AP y cualesquier medios capaces de producir enzima AP funcional en el contexto de la presente invencion, tal como acidos nucleicos ADN o ARN que codifican una protefna AP. El acido nucleico que codifica AP puede ser incorporados en vectores adecuados, tales como plasmidos, fagemidos, fagos, (retro) virus, transposones, vectores de terapia genica y otros vectores capaces de inducir o conferir produccion de AP. Tambien microorganismos naturales o recombinantes, tales como bacterias, hongos, protozoos y levadura se pueden aplicar como una fuente de AP en el contexto de la presente invencion.

Las composiciones que contiene AP para uso de acuerdo con la presente invencion comprenden preferiblemente una AP eucariotico, mas preferiblemente una AP de mamfferos, que puede ser de los tipos de tejido AP no especfficos, tal como del tipo rinon, hfgado o hueso, o tejido especffico, tal como AP placentario, AP intestinal y AP similar a placenta. Este ultimo, tambien conocido como AP de estirpe celular, se localiza en los testfculos, timo y determinados tumores de celulas germinales (1), y esta estrechamente relacionado con las formas de (2) placentarias e intestinales. El experto es muy capaz de buscar colecciones de acido nucleico y seleccionar una secuencia que codifique AP. Mas preferiblemente el mamffero es una AP humano o una AP de bovina. Por lo tanto, preferiblemente, se divulga aquf el uso de AP en la fabricacion de un medicamento para mejorar la funcion renal reducida, en el que dicha AP es AP de mamfferos e incluso mas preferiblemente en el que dicha AP es AP humano. Ejemplos no limitantes de una secuencia de AP humana se pueden encontrar en la coleccion NCBI (Genpept) e incluyen: NP_001622 (AP intestinal), NP_001623 (AP placentario), NP_112603 (AP similar a placenta) o NP_000469 (AP no especffico de tejido). La invencion tambien comprende el uso de polimorfismos de cualquiera de dichas secuencias. En aun otra realizacion preferida, dicha AP es AP placentaria, AP similar a placenta, AP intestinal o AP de hfgado/hueso/rinon.

En aun otra realizacion preferida, se proporcionan metodos y usos de acuerdo con la invencion en el que la AP es AP recombinante.

Desde un punto de vista conformacional, rigurosamente la AP consiste de dos dominios: un dominio de corona y un dominio de sitio activo. El dominio de sitio activo se puede dividir en partes separadas similares al residuo catalftico y los tres sitios de iones de metal (Zn1, Zn2 y Mg3). Desde un punto de vista la estructura primaria es claro que el dominio de corona se flanquea por los aminoacidos que forman el dominio de sitio activo. La secuencia de aminoacidos de AP y las posiciones relativas del dominio de corona y catalftico son conocidos por el experto. Como un ejemplo, se hace referencia a la figura 20 que muestra, entre otras cosas, la secuencia de aminoacido de las cuatro AP humanas. El dominio de corona se subraya en estas secuencias.

Las AP estan presentes en virtualmente todos los organismos, desde bacterias hasta humanos. Se prefiere que una AP para uso en la invencion sea una AP aislada o recombinante que comprende un dominio de corona y un dominio catalftico, en el que dicho dominio de corona y dicho dominio catalftico se obtienen de diferentes AP y en el que por lo menos una de dichas fosfatasas diferentes es una fosfatasa humana. Las otras fosfatasas, son por ejemplo ECAP (AP Escherichia coli) o una de las siete BIAP (AP Intestinal de bovino) conocidas. Preferiblemente, se utiliza una AP recombinante o aislada que comprende un dominio de corona y un dominio catalftico, en el que dicho dominio de corona

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y dicho dominio catalftico se obtienen de diferentes AP y en el que las diferentes AP son AP humanas. Esto es especialmente util si la fosfatasa modificada se utiliza posteriormente en terapia humana. Se espera que dichas AP modificadas (geneticamente) de origen humano no sean inmunogenicas o sean poco inmunogenicas. Sin embargo, es claro para el experto que si una AP modificada se utiliza por ejemplo “in vitro” o “ex vivo” de una fosfatasa modificada podra estar bien compuesto de, por ejemplo, una AP humana y de E. coli o puede estar compuesto de una AP de bovina y una AP E. coli.

Una AP para uso en la invencion es preferiblemente una AP aislada o recombinante que comprende un dominio de corona y un dominio catalftico, en el que dicho dominio de corona y dicho dominio catalftico se obtienen de diferentes AP y en el que dicho dominio de corona es el dominio de corona de la AP placentaria (ALPP) y en el que dicho dominio catalftico es el dominio catalftico de la AP intestinal (ALPI). Preferiblemente, por lo menos una de dichas fosfatasas diferentes es una fosfatasa humana y en una realizacion mas preferida, ambas fosfatasas diferentes son fosfatasas humanas.

Otros dominios de mutantes de intercambio preferidos adecuados para uso de acuerdo con la presente invencion se basan en las AP humanas y se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. Dominios de enzimas de fosfatasa alcalina intercambiados

Dominio catalftico

Dominio de corona Denominado como

ALPI

GCAP catALPI/crownGCAP

TNAP catALPI/crownTNAP

ALPP

GCAP catALPP/crownGCAP

TNAP catALPP/crownTNAP

GCAP

ALPI catGCAP/crownALPI

ALPP catGCAP/crownALPP

TNAP catGCAP/crownTNAP

TNAP

ALPI catTNAP/crownALPI

ALPP catTNAP/crownALPP

GCAP catTNAP/crownGCAP

Por motivo de claridad, el ALPI es AP intestinal, ALPP es AP placentario, GCAP es AP similar a placenta y TNAP es tejido AP no especffico.

Es claro que tambien se pueden preparar las combinaciones entre el dominio catalftico de ECAP para cualquiera de las formas humanas (ALPI, ALPP, GCAP o TNAP) con el dominio corona de BIAP. Mas aun, tambien se pueden producir las combinaciones de los dominios de corona del BIAP con el dominio catalftico del ECAP o cualquiera de las formas humanas.

Otra clase de fosfatasas modificadas utiles son fosfatasas que bajo condiciones naturales se ligan a la membrana de una celula a traves de un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI), pero que se modifican ahora de tal manera que no se unen mas a la membrana de una celula. Ejemplos de fosfatasas que son GPI ancladas son AP y nucleotidasa 5'. Todas las isoenzimas son funcionalmente activas en la membrana celular y las formas deficientes de GPI anclado no estan naturalmente presentes en niveles detectables. Aunque se ha demostrado actividad fosfatasa de alcalina de suero es generalmente aceptado que la enzima aun este presente en vesfculas de membrana o fracciones de membrana desprendidas. La actividad en la leche tambien esta presente en fracciones que contienen vesfculas de membrana. El anclaje GPI se almacena como una molecula precursora en la celula en donde se une al sitio de union a traves de una transamidasa. La estructura del anclaje GPI es identica en mamfferos, pero se conocen modificaciones dependientes del tipo celular.

Para uso farmaceutico de la AP en sujetos humanos se prefiere para la mayorfa de aplicaciones aplicar formas humanas de la enzima para uso en medicamentos y tratamiento, ya que las formas de AP obtenidas a partir de otras especies pueden ser inmunogenica en sujetos humanos y el tratamiento puede provocar reacciones inmunologicas y efectos colaterales patologicos. En algunos sujetos incluso efectos secundarios letales, es decir, puede ocurrir choque anafilactico y riesgo de efectos secundarios inmunologicos, por lo tanto, se prefiere minimizar el uso de formas AP humanas. Como el aislamiento del AP de humanos practicamente no es factible, las formas recombinantes humanas de las protefnas AP se pueden producir en forma rutinaria en diferentes plataformas de expresion recombinantes. Sin

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embargo, la expresion y purificacion de GPI modificado y protefnas de membrana anclada es notoriamente diffcil; las protefnas GPI son diffciles de separar de las membranas y diffciles de aislar y purificar. Por lo tanto, se prefiere utilizar una AP aislada o recombinante que comprende una modificacion en la secuencia de senal glucosilfosfatidilinositol (GPI), en el que dicha modificacion resulta en una fosfatasa secretada, es decir, la fosfatasa no se una a la membrana celular.

Preferiblemente, se utiliza dicha fosfatasa recombinante o aislada comprende una modificacion en la secuencia de senal glucosilfosfatidilinositol (GPI), en el que dicha modificacion resulta en una fosfatasa secretada que es biologicamente activa, es decir muestra actividad hacia un sustrato biologico (relevante).

No hay secuencia general responsable por la union de un anclaje GPI, pero existe un consenso claro:

1. Estiramiento hidrofobo de aminoacidos en el terminal C (por lo menos 11 aminoacidos, pero preferiblemente mas de 11 aminoacidos)

2. Direccion 5' de la region hidrofoba, un separador de aminoacidos hidrofilos (5-12 aminoacidos)

3. El GPI se une a un aminoacido pequeno: glicina, acido aspartico, asparagina, alanina, serina o cistefna.

4. Los 2 aminoacidos posteriores en direccion 3' del sitio de union GPI deben ser aminoacidos pequenos y en la mayorfa de casos se seleccionan de glicina, acido aspartico, asparagina, alanina, serina o cistefna.

Basado en este consenso, el experto es capaz de mutar este consenso, por ejemplo al insertar uno o multiples aminoacidos e interrumpir parte del consenso. Sin embargo, en una realizacion preferida, se utiliza una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una modificacion en la secuencia de senal glucosilfosfatidilinositol (GPI), en el que dicha modificacion resulta en una fosfatasa secretada y en el que dicha modificacion comprende una mutacion o una eliminacion de la secuencia de aminoacidos que abarca la secuencia de senal GPI consenso.

Para aplicaciones en terapia humana se desea que la fosfatasa modificada resultante no sea inmunogenica o sea poco inmunogenica, es decir, que la fosfatasa modificada sea esencialmente de origen humano. En una realizacion preferida, se proporciona un uso de acuerdo con la invencion, en la que la AP es una fosfatasa recombinante o aislada que comprende una modificacion en la secuencia de senal glucosilfosfatidilinositol (GPI), en el que dicha modificacion resulta en una fosfatasa secretada (preferiblemente con actividad contra un sustrato relevante biologico) y en el que dicha fosfatasa es una fosfatasa humana.

Ejemplos de fosfatasas que son GPI ancladas son AP y 5' nucleotidasa y por lo tanto en una realizacion preferida, se utiliza una fosfatasa aislada o recombinante, que comprende una modificacion en la secuencia de senal de glucosilfosfatidilinositol (GPI), en el que dicha modificacion resulta en una fosfatasa secretada y en el que dicha fosfatasa es una AP, por ejemplo, una AP humana, tal como por ejemplo una fosfatasa hfgado-rinon-hueso, AP intestinal humana, o fosfatasa de alcalina similar a placenta humana.

Es claro que cualquiera de las fosfatasas modificadas secretables descritas se puede producir por ejemplo al introducir en una celula huesped un acido nucleico capaz de codificar dicha fosfatasa secretable, preferiblemente en conexion operable con secuencias reguladoras, y permitir que dicha celula anfitriona exprese dicha fosfatasa secretable y opcionalmente aisle la fosfatasa producida del medio en que crece y/o se mantiene la celula anfitriona. Sin embargo, aparte de las mutaciones en la secuencia de union GPI mencionado anteriormente, existen otros metodos que hacen protefnas secretadas, GPI-menos anclables:

1. Despues de expresion como protefnas de membrana anclada, se pueden utilizar fosfolipasas para dividir el anclaje GPI.

2. Interferencia con la produccion de anclaje GPI o uso de celulas (tipo) que es deficiente en la produccion de anclaje GPI tambien se puede utilizar para realizar una forma secretable de una protefna GPI anclada de otra forma. Ejemplos de estirpes celulares que se han elaborado para que sean deficientes en bioqufmica de anclaje GPI son por ejemplo, Jurkat, AM-B, C84, BW, S49, CHO y Raji.

3. Se puede utilizar interferencia con o el uso de celulas deficientes en transamidasas para inhibir la union de un anclaje GPI a la protefna, haciendo que a la protefna menos anclable y secretable. Dicha celula deficiente se ha obtenido a traves de mutagenesis en CHO.

Esta claro para el experto que una fosfatasa modificada que comprende un dominio de corona y un dominio catalftico, en el que dicho dominio de corona y dicho dominio catalftico se obtienen de diferentes APs adicionalmente se puede modificar y hacer secretable. Por lo tanto, en una realizacion preferida, se utiliza una AP que es una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una modificacion en la secuencia de senal de glicosilfosfatidilinositol (GPI), en la que dicha modificacion resulta en una fosfatasa secretada y en la que dicha fosfatasa recombinante comprende adicionalmente un dominio de corona y un dominio catalftico que se obtienen de diferentes fosfatasas. Ejemplos no limitantes de dichos mutantes de fosfatasa (alcalinas) se proporcionan en la Figura 20. Dicho mutante combinado o “doble” resulta por ejemplo en una fosfatasa modificada con una determinada actividad especffica, estabilidad o especificidad de sustrato y al mismo tiempo la produccion de dicho producto es mucho mayor por el hecho de que se

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puede aislar a partir del medio que rodea a las celulas productoras. Dicha fosfatasa alcalina mutante o quimerica recombinante se ha descrito ampliamente en la solicitud de patente internacional publicada WO 08/133511.

La AP se puede administrate por diferentes rutas, por ejemplo por via intravenosa, rectal, bronquial u oral.

En una realizacion preferida, la ruta de administracion utilizada es por vfa intravenosa. Es evidente para el experto, que preferiblemente se suministra una cantidad efectiva de AP. Como punto de partida se puede utilizar 10 a 500 U/kg/dfa. Si se utiliza la ruta de administracion intravenosa, la AP (por lo menos para una cierta cantidad de tiempo) se aplica preferiblemente a traves de infusion continua.

La invencion se explicara con mas detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.

Descripcion de las figuras

Figura 1: Requisito (ITT) de Terapia de Reemplazo Renal (dialis is)

Figura 2: Duracion de Terapia de Reemplazo Renal (ITT; medios/EEM); p: prueba t

Figura 3: Media de Duracion Relative de la Terapia de Reemplazo Renal (horas; ITT; media/EEM); t: prueba t; [(duracion acumulada de RRT)/(tiempo (d) en el estudio)/*100%]

Figura 4: Analisis de Regresion de Depuracion de creatinina 0 a 7 dfas; (AP versus placebo; FAS; media/EEM)

Figura 5: Progresion de Depuracion de creatinina (FAS; media/EEM)

Figura 6: Progresion de Depuracion de creatinina Ajustada a Valores Perdidos (FAS; media/EEM)

Figura 7: Duracion de la Estancia en UCI (subgrupo A ITT; media/EEM)

Figura 8: Requerimiento de Ventilacion Mecanica (ITT; media/EEM)

Figura 9: Cambios en Clasificacion SOFA (ITT; media/EEM)

Figura 10: Analisis del biomarcador KIM-1 en los pacientes durante las primeras 48 horas de tratamiento. El grafico representa la concentracion media (en ng/ml) en la orina de pacientes (A) y la concentracion media (en ng/mg de creatinina) en la orina de pacientes que requerfan RRT (B). Los diamantes denotan el grupo de tratamiento con AP, los triangulos denotan el grupo placebo.

Figura 11: Analisis del biomarcador IL-18 en pacientes durante las primeras 48 horas de tratamiento. El grafico representa la concentracion media (en pg/ml) en la orina de pacientes (A) y la concentracion media (en pg/ml) en la orina de pacientes que requerfan rRt (B). Los diamantes denotan grupo de tratamiento con AP, los triangulos denotan grupo placebo.

Figura 12: Analisis del biomarcador KIM-1 en pacientes durante las primeras 168 horas despues del inicio del tratamiento. El grafico representa la concentracion media (en ng/ml) en la orina de pacientes (A) y la concentracion media (en ng/ml) en pacientes que requerfan RRT (B). Los diamantes denotan el grupo de tratamiento con AP, los triangulos denotan el grupo placebo.

Figura 13: Analisis del biomarcador de IL-18 en pacientes durante las primeras 168 horas despues del inicio del tratamiento. El grafico representa la concentracion media (en pg/ml) en orina de pacientes (A) y la concentracion media (en pg/ml) en pacientes que requerfan RRT (B). Los diamantes denotan el grupo de tratamiento con AP, los triangulos denotan el grupo placebo.

Figura 14: Analisis del biomarcador CRP en pacientes durante las primeras 168 horas despues del inicio del tratamiento. El grafico representa la concentracion media (en mg/dl) en la sangre de los pacientes (A) y la concentracion media (en mg/dl) en pacientes que requerfan RRT (B). Los diamantes denotan el grupo de tratamiento con AP, los triangulos denotan el grupo placebo.

Figura 15: Analisis del biomarcador LBP en los pacientes durante las primeras 168 horas despues del inicio del tratamiento. El grafico representa la concentracion media en sangre de los pacientes. Los diamantes denotan el grupo de tratamiento con AP, los triangulos denotan el grupo Placebo

Figura 16: Analisis del biomarcador NGAL en los pacientes durante las primeras 144 horas despues del inicio del tratamiento. El grafico representa la concentracion media normalizada, creatinina en la orina de los pacientes. Los diamantes denotan el grupo de tratamiento con AP, los triangulos denotan el grupo Placebo

Figura 17: Analisis del biomarcador IL-6 en pacientes durante las primeras 168 horas despues del inicio del tratamiento. El grafico representa la concentracion media en sangre de los pacientes. Los diamantes denotan el grupo de tratamiento con AP, los triangulos denotan el grupo Placebo

Figura 18: Analisis del biomarcador GST alfa en los pacientes durante las primeras 144 horas despues del inicio del tratamiento. El grafico representa la concentracion media normalizada de creatinina en la orina de los pacientes. Los diamantes denotan el grupo de tratamiento con AP, los triangulos denotan el grupo Placebo

Figura 19: Analisis del biomarcador GST pi en los pacientes durante las primeras 144 horas despues del inicio del 5 tratamiento. El grafico representa la concentracion media normalizada de creatinina en la orina de los pacientes. Los diamantes denotan el grupo de tratamiento con AP, los triangulos denotan el grupo Placebo

Figura 20: Secuencias de enzimas de fosfatasa alcalina en humanos. Se representan las secuencias de las protefnas maduras (es decir, sin secuencia de senal), pero antes de la adicion del anclaje GPI y procesamiento concomitante de los aminoacidos de terminal C con excepcion de las AP quimericas.

10 Ejemplos

Materiales y metodos

Ejemplo 1 - Efecto de la AP sobre la funcion renal en pacientes con septicemia Pacientes

Un total de 36 pacientes fueron asignados al azar y se inscribieron en seis centros en Belgica y los Pafses Bajos. La 15 inscripcion a traves de los centros vario entre 1 a 13 pacientes. Los parametros demograficos y de gravedad de la enfermedad en los valores iniciales no sugirieron diferencias relevantes o significativas entre los grupos de tratamiento, tal como se resume en la Tabla 2.

Tabla 2: Comparacion de lfnea base entre grupos

Parametro al inicio del estudio

AP (n =16) Placebo (n = 19)

Hombre: n (%)

13 (81) 14 (74)

Edad: media de anos (DE)

65 (12) 67 (15)

Altura: media de cm (DE)

176 (10) 174 (8)

Peso: media de kg (DE)

86 (12) 80 (14)

Frecuencia cardfaca: media de bpm (DE)

103 (23) 105 (22)

PB sistolica: media de mmHg (DE)

103 (26) 110 (26)

BP diastolica: media de mmHg (DE)

52 (13) 55 (13)

Temperatura: media de °C (DE)

37 (1) 37 (1)

Clasificacion APACHE-II: media (DE)

24 (7) 23 (8)

Clasificacion SOFA: media (DE)

10 (4) 11 (5)

Creatinina en suero: media de pmol/L (IQR)

172 (126; 198) 173 (115; 268)

Depuracion de creatinina: media de mL/min (DE)*

50 (27) 40 (37)

Notas: todos los pacientes eran caucasicos. *: Valores faltantes estimados por la formula Cockroft-Gault.

20 Intervencion

La medicacion del estudio fue preparada dentro de 1 hora antes de dosificacion. La medicacion del estudio fue marcada (segun las regulaciones vigentes) por la Farmacia del Hospital.

El ingrediente activo fue fosfatasa alcalina intestinal bovina (BIAP), que es una enzima de origen bovino, compuesta de 533 aminoacidos con un peso molecular de 140 kD, y que lleva a cabo reacciones de esterasa sobre sustratos que 25 contienen fosfato en un alto pH optimo bajo condiciones de ensayo bioqufmico in vitro. La AP se suministra como una solucion esteril para infusion que contiene la actividad de AP de 13.600U/mL (segun se determina utilizando regulador de glicina a 25°C) en un regulador acuoso que contiene Tris-HCl 5 mM, cloruro de magnesio 5 mM, cloruro de zinc 0.1 mM, pH 7.2 a 7.4, con 30-35% (p/v) de glicerol como estabilizador. El placebo correspondiente para uso en ensayos controlados consiste en una solucion esteril para infusion que contiene un regulador acuoso que contiene Tris-HCl 5 30 mM, cloruro de magnesio 5 mM, cloruro de zinc 0.1 mM, pH 7.2-7.4, 30-35% (p/v) de glicerol y agua para inyeccion (cs).

5

10

15

20

25

30

Los pacientes recibieron una inyeccion intravenosa de AP 67.5 U/kg durante 10 minutos seguido de una infusion continua 132.5 U/kg/24 h durante 48 horas, o placebo, y se hizo seguimiento por 28 dfas.

La AP se suministro como una solucion clara a ligeramente opalescente, incolora, esteril, libre de pirogenos en frascos de vdrio tipo I de 10 mL con un tapon de caucho de bromobutilo recubierto de teflon. Cada frasco contenfa 1 mL de solucion de AP (13.600 unidades).

El placebo correspondiente se suministro como una solucion clara, incolora, esteril, libre de pirogenos en frascos de vidrio tipo I con tapon de caucho de bromobutilo recubierto de teflon. Cada frasco de 1 mL de placebo contenfa Tris-HCl 5 mM, cloruro de magnesio 5 mM, cloruro de zinc 0.1 mM, pH 7.2-7.4, con 30-35% (p/v) de glicerol como estabilizador y agua para inyeccion (cs).

Toda la medicacion de estudio se almaceno en el Hospital Pharmacy en una instalacion de almacenamiento con llave bajo condiciones farmaceuticas adecuadas.

Requisitos para Terapia de Reemplazo Renal

La RRT (dialisis) es actualmente la principal intervencion para la lesion renal aguda (AKI) en la configuracion UCI, mientras que la AKI que requiere que la rRt se asocie con un peor pronostico. Por lo tanto, la necesidad reducida de RRT se definio como un criterio de valoracion de eficacia principal para el tratamiento de la AKI en el entorno de septicem ia.

La elegibilidad (requisito) para RRT se definio estrictamente en el Protocolo por varias razones. En primer lugar, solo ha surgido recientemente un consenso sobre los criterios para la iniciacion RRT, el metodo sigue siendo diferente en todos los hospitales y entre los medicos en el mismo hospital. Por lo tanto, la EMEA aconseja la adopcion de una definicion estricta para el requerimiento de RRT, en lfnea con el Consenso de Dialisis Aguda de Iniciativa de Calidad Internacional (ADQII), que consta de los siguientes criterios (incorporados en el Protocolo):

1. Oliguria: <0.3 mL/kg/h para >6h Y urea en suero >20 mmol/L, O

2. Anuria : >12h Y urea en suero >15 mmol/L, O

3. hipercalemia: >7.5 mmol/L o con cambios en ECG tfpicos a pesar de intervencion terapeutica, O

4. Acidosis con bicarbonato estandar <15 mmol/L a pesar de intervencion terapeutica, O

5. Hiponatremia: <120 mmol/L a pesar de intervencion terapeutica, O

6. Diagnostico clfnico de la sobrecarga de lfquidos con lo existente o amenazar edema pulmonar o cerebral pesar de la intervencion terapeutica.

Adicionalmente, las autoridades holandesas (CCMO, IRB Central) mandan que los pacientes que ya estan en RRT en la entrada se deban excluir del Protocolo.

Los resultados para requisito RRT (analisis Si-No) se ilustran en la Figura 1, con los datos numericos que se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: Requisito y duracion de terapia de reemplazo renal (ITT)

AP (n =16) Placebo (n = 19)

RRT requerido: n

3 (19%) 7 (37%)

RRT no requerido: n

13 (81%) 12 (63%)

p*

0.2853

Duracion media de RRT: horas (DE)

10 (23) 53 (99)

p**

0.0801

Duracion RRT relativa (pacientes que se requieren RRT):% (DE)

12 (4.8) 34 (15.8)

p**

0.0456

*: Prueba exacta de Fisher; **: Prueba T [(Duracion de RRT acumulada)/(Tiempo (d) en el estudio)]* 100%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Los resultados de la Figura 1 y Tabla 3 demuestran que el grupo de placebo tenia aproximadamente unas 2 veces mas necesidad de intervenciones de RRT (37%) que el grupo de AP (19%). La media de duracion de RRT mostro una fuerte tendencia (p=0.0801; prueba t) a favor del grupo tratado con AP con 10±23 h, con relacion a 53± 99 h sobre placebo, como se muestra en la Figura 2.

La duracion relativa de RRT para pacientes que requieren dialisis tambien fue significativamente menor en el grupo de AP (p=0.0456), en comparacion con placebo (Figura 3).

Depuracion de creatinina

La depuracion de creatinina es probablemente la medida mas adecuada de la funcion renal. Es importante destacar que a diferencia de los niveles sericos de creatinina, la depuracion de creatinina tiene un grado mucho menos influenciado por RRT, siendo asi un indicador mas robusto para la funcion renal en esta configuracion. Los AUC de depuracion de creatinina se calcularon utilizando niveles de creatinina en suero y orina, produccion de orina y area corporal. Cuando la produccion de orina en 24 h no estuvo disponible (en el inicio del estudio), se utilizo la formula de Cockroft-Gault para estimar la depuracion. Los valores faltantes fueron imputados de la ultima extrapolacion de la ultima observacion (LOCF) o interpolacion lineal.

Para permitir la estimacion del efecto del tratamiento sobre la depuracion de creatinina en el tiempo, se condujo un analisis de regresion para dilucidar una posible relacion de cualquier grupo de tratamiento con la direccion del efecto y tiempo. El analisis de regresion de los valores corregidos del inicio del estudio confirmo una diferencia altamente significativa (p=0.0181) y el efecto progresivo de AP sobre los niveles de depuracion hasta el dia 7, en relacion con el placebo, como se muestra en la Figura 4.

La Figura 5 muestra el progreso de la depuracion de creatinina por punto de tiempo a lo largo periodo de estudio de 28 dias. Por lo tanto, el efecto del tratamiento observado sugiere una mejora en la depuracion de creatinina en el grupo tratado a niveles normales (~100 mL/min), en relacion con placebo donde la depuracion permanece alterada.

En la Figura 5, despues del dia 14 los datos estan influenciados porque hay muy pocos pacientes aun en UCI, particularmente en el grupo de AP (n=4), debido a que no se recolecta de forma rutinaria la produccion de orina de 24 horas en la UCI. En consecuencia, los medios de la Figura 5 son una subestimacion de la muestra completa del paciente debido a la ausencia de pacientes que mejoraron y dejaron la UCI. Una estimacion de la depuracion se presenta en la Figura 6, con valores faltantes imputados de la ultima extrapolacion de la ultima observacion (LOCF) o interpolacion lineal. La depuracion de creatinina durante el periodo de 28 dias fue significativamente superior para el grupo tratado con AP en relacion con el placebo (p=0.0199; ANOVA de medidas repetidas).

Por lo tanto, los resultados de los datos de depuracion de creatinina confirman que el efecto del tratamiento es superior para el grupo de AP, tanto durante los primeros 7 dias como a traves de toda la duracion del estudio de 28 dias.

Creatinina en suero

La creatinina en suero se utiliza ampliamente para la evaluacion de la funcion renal en la practica clfnica. Sin embargo, la creatinina en suero no es optima debido a que es un marcador tardfo del dano tisular. La creatinina en suero solo empieza a aumentar despues de ya ha ocurrido un dano considerable en las nefronas; por lo tanto, los incrementos relativamente pequenos en los niveles tienen gran influencia sobre los resultados. Adicionalmente, los niveles de creatinina en suero se ven afectados en gran medida por la intervencion de la TRR. Por lo tanto, los niveles de creatinina en suero son punteros de la direccion de los resultados, pero no reflejan la funcion renal en presencia de RRT.

De acuerdo con el Protocolo, se tomaron muestras de creatinina en suero en los dias de estudio 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 y 28. Sin embargo, como en las UCI LA creatinina se determina diariamente, todos los valores de creatinina en suero que estaban disponibles se recolectaron y entraron en la base de datos con el fin de conseguir tan completamente como sea posible una representacion sobre el periodo de estudio completo.

Debido a la mayor proporcion de pacientes en RRT en el grupo de placebo (n=7) con respecto al grupo de AP (n=3) y la duracion mas larga de RRT en pacientes con placebo, la magnitud real del efecto RRT no puede estimar de manera confiable, pero se puede suponer con seguridad que los niveles de creatinina observados en placebo son una subestimacion, ya que los valores reales serfan considerablemente mas altos sin intervencion de RRT.

Las AUC de valores de creatinina en suero se calcularon utilizando los niveles de creatinina en suero segun los resultados bioqufmicos. Los valores faltantes se imputaron de la ultima extrapolacion de la ultima observacion (LOCF) o interpolacion lineal. Las diferencias en las AUC de creatinina en suero para los periodos de 0-7 y 0-28 dias, como se muestra en la Tabla 4, no alcanzaron significancia.

Tabla 4: Creatinina en suero de AUC (pmol/L; FAS)

AP Placebo Q1; Q3

AP

Placebo

Media (DE) 0-7 dias

1099 (510) 1411 (843) 725; 1265 710; 1977

Media (DE) 0-28 dfas

4091(2623) 4284 (2920) 2298;4833 2400;4562

Los valores de AUC menores denotan mejor funcion renal.

Los resultados anteriores confirman que los niveles de creatinina en suero en el periodo de 28 dfas en el grupo de AP fueron similares a, aunque ligeramente mejores que el placebo. La diferencia observada es una subestimacion debido a 5 la creatinina sustancial que reduce el efecto de la RRT intensa requerida por los pacientes con placebo.

Efectos del tratamiento combinado sobre parametros de eficacia

Un analisis combinado de todas las variables principales de eficacia se realizo de acuerdo al Plan de Estadfstica, para evaluar el efecto del tratamiento global sobre la funcion renal mediante un metodo aceptado existente cuando se consideran todos los parametros principales. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

10 Tabla 5: Analisis de las significancias de las variables combinadas (ITT)

Leyenda:

A Requisito de RRT (0-28d)

B: duracion acumulada de RRT (0-28d)

C: duracion relativa de RRT (0-28d)

D: regresion lineal de depuracion de creatinina (0-7d)

E: creatinina en suero de AUC sin correcdon de RRT (0-7d; dfa 0 como covariable)

Parametros Combinadas

valor de p

A+C+D+E

0.005

B+D+E

0.001

A+C+D

0.018

B+D

0.016

*: unilateral

Parametros de eficacia secundarios

Los siguientes parametros relacionados con severidad clave se examinaron y resumieron: Calificacion SOFA duracion 15 de la estancia hospitalaria/UCI, duracion de ventilacion mecanica y mortalidad. Como se mostro anteriormente, los dos grupos de tratamiento se equilibraron en la entrada (vease Tabla 2). Por lo tanto, las siguientes secciones muestran diferencias en los puntos relevantes durante el estudio, en relacion con el inicio del estudio.

Duracion de la estancia en cuidados intensivos y en el hospital

La duracion de la estancia en la UCI fue considerablemente mas corta para el grupo de AP en relacion con el placebo 20 en todos los analisis y en todos los subgrupos.

La duracion de la estancia en la UCI y hospitalaria se registro durante toda la duracion de la hospitalizacion. Ya que las muertes pueden sesgar la duracion de la estancia, este parametro se analizo sin muertes durante el penodo de estudio

(subgrupo A) e incluyendo muertes (subgrupo B, donde la muerte se considero estancia maxima, es decir, 28 dfas). En ambos analisis, los resultados mostraron una clara ventaja para el grupo de AP. La media de la estancia en la UCI fue significativamente mas corta en >2 veces para el grupo de Ap en el subgrupo A (p=0.0174), mientras que el subgrupo B mostro una tendencia a favor del grupo de AP (p=0.1099). La duracion total de la estancia hospitalaria tambien mostro 5 estancia mas larga para el placebo en un 42% con respecto al grupo de AP en el subgrupo A aunque la diferencia no alcanzo significancia.

El analisis de la duracion de la estancia en la UCI confirmo que no se logro hospitalizacion mas corta general a expensas de estancia en UCI mas larga, como se muestra en la siguiente Tabla 6 (subgrupos A y B) y en la Figura 7 (subgrupo A).

10 Tabla 6: Duracion de estancia en UCI y el hospital (n=35)

AP Placebo

Subgrupo A

Estancia en UCI (dfas): media (DE)

10.9 (7.5) 24.5 (17.9)

AP-placebo (95% de CI)

13.6 (-26.6; -0.5)

p*

0.0174

Estancia en hospital (dfas): media (DE)

33.4 (26.4) 47.1 (35.7)

AP-Placebo (95% de CI)

-13.7 (-42.2; 14.8)

p*

0.3305

Subgrupo B

Estancia en UCI (dfas): media (DE)

13.9 (9.8) 23.6 (17.6)

AP-placebo (95% de CI)

-9.7 (-21.8; 2.4)

*p

0.1099:

*: prueba t; A = excluir muertes; B = incluir muertes (contadas como 28 dfas de estancia)

Duracion de ventilacion mecanica

La duracion de la ventilacion mecanica se registro durante toda la duracion del requisito. Normalmente, la ventilacion mecanica se lleva a cabo en la UCI, y 13 pacientes de ambos grupos estaban ya en ventilacion mecanica al inicio del 15 estudio. Los resultados mostraron una fuerte tendencia para el grupo de AP en relacion con el placebo (p=0.094). El requisito de ventilacion mecanica se relaciona directamente con la supervivencia. La magnitud de las diferencias representa un requisito mayor del 74% de ventilacion mecanica en el placebo, como se muestra en la Tabla 7 y la Figura 8.

Tabla 7: Duracion de la ventilacion mecanica requerida (ITT)

AP Placebo

Duracion MV (dfas): media (DE)

8.0 (8.3) 13.9 (11.3)

AP-Placebo (95% de IC)

-5.9 (-12.8; 1.1)

p *

0.094

*: prueba t

Calificacion SOFA

SOFA es un sistema de calificacion utilizado en ensayos dfnicos de septicemia con fallo multiple de organo. Por lo tanto, la calificacion SOFA refleja la gravedad general de los pacientes en la UCI, relacionada con la insuficiencia de organos al evaluar seis sistemas de organos, con lo que cada uno contribuye un maxmo de 4 puntos; por lo tanto, la calificacion total maxima es de 24 puntos, los puntos mas altos indican una peor condicion. La calificacion SOFA se 5 relaciona directamente con la supervivencia. Un descenso de la calificacion SOFA en 2 puntos se considera clfnicamente significative. La media de calificacion SOFA del estudio inicial fue de 10.4 (DE = 3.6) y 10.6 (DE = 5.3) en los grupos activo y placebo, respectivamente, y los elementos de calificacion se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8: elementos del sistema de calificacion SOFA

Sistema respiratorio PaO2/FiO2 (mmHg)

Calificacion Higado: de bilirrubina (mg/dL) Calificacion

>400

0 <1.2 0

<400

1 1.2-1.9 1

<300

2 2.0-5.9 2

<200 y ventilados mecanicamente

3 6.0-11.9 3

<100 y ventilados mecanicamente

4 >12.0 4

Sistema Nervioso central: Escala de Glasgow Coma

Coagulacion: plaquetas x 103/pL

15

0 >150 0

13-14

1 <150 1

10-12

2 <100 2

6-9

3 <50 3

<6

4 <20 4

Sistema cardiovascular (presion arterial media/ administracion de vasopresores requeridos)

Sistema renal: creatinina (mg/dL) (o produccion de orina)

Sin hipotension

0 <1.2 0

MAP <70 mmHg

1 1.2-1.9 1

Dopamina <5 o dobutamina (cualquier dosis)

2 2.0-3.4 2

Dopamina >5 o epinefrina/noradrenalina <0.1

3 3.5-4.9 (o <500 mL/d) 3

Dopamina >15 o epinefrina/norepinefrina >0.1

4 >5.0 (o <200 mL/d) 4

10 Las calificaciones de SOFA se registraron hasta el dfa 28. Los datos mas al la del dfa 7 son menos confiables cuando los numeros de los pacientes son pequenos, en particular en el grupo de AP, debido a la descarga temprana de la UCI. Aunque el tamano de la muestra no fue disenado para detectar diferencias de tratamiento en las calificaciones SOFA el grupo de AP tenia aproxmadamente un 30% mas mejoria que el placebo en el dfa 7, como se ilustra en la Figura 9.

Mortalidad

15 Toda la mortalidad provocada en el dfa 28 fue relativamente baja (n=12; 33%), sin diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. En total, hubo siete muertes en AP y cinco en placebo (Tabla 9). Las causas de las muertes fueron atribuidas a la afeccion subyacente en todos los casos.

Tabla 9: Estado de mortalidad

Grupo SAF

AP (n=16) Placebo (n=20)

Muertes

7 5

p*

p = 0.2532

Todos los informes de muerte fueron revisados por el DSMB independiente y no plantearon problemas de seguridad.

Eventos adversos

La incidencia y el tipo de eventos adversos (AE) fueron los esperados para una poblacion con septicemia e insuficiencia renal. En el punto de bloqueo de base de datos final, la incidencia de eventos general fue similar en los dos grupos de tratamiento (AP: 94%; placebo: 100%). Los eventos adversos graves reflejan la gravedad de la enfermedad.

10 Todos los datos de seguridad se revisaron por el DSMC independiente que notaron que si bien su cometido no inclufa estrictamente consideraciones de eficacia, no obstante, se observaron tendencias favorables en las pruebas de laboratorio para pacientes tratados con AP, particularmente en terminos de los parametros renales. El DSCM concluyo que la AP tiene un perfil de seguridad favorable en los pacientes gravemente enfermos estudiados y tiene un equilibrio potencial de riesgo: beneficio en este grupo.

15 Un resumen de los AE y SAE reportados se presentan en la Tabla 10 adelante.

Tabla 10: Resumen de los EA y reacciones adversas graves (SAF)

Grupo PP

AP (n=14) Placebo (n=18)

Muertes

5 3

p*

p = 0.2653 5

* rango logarftmico

AP Placebo

TODOS EA

n (%) 130 (100) 154(100)

AE emergentes de tratamiento

n (%) 124 (95) 147 (96)

Pacientes con AE emergentes de tratamiento

n (%) 15 (94 ) 20 (100)

AE emergentes de tratamiento no grave *:

Fibrilacion auricular

3 6

Diarrea

6 3

Hipotension

2 7

Delirio

2 5

Ulcera de decubito

1 4

Dolor abdominal

3 2

Pirexia

1 4

Deterioro de vaciado gastrico

3 2

Traqueotomfa

1 3

Estrenimiento

1 3

Inquietud

2 2

aleteo auricular

1 3

Taquicardia

n 3

Hipertension

2 1

Edema periferico

2 1

Neumotorax

3

Dolor

1 2

Estado de confusion

1 2

Hipocalemia

3

AP Placebo

TODOS EA

n (%) 130 (100) 154(100)

AE emergentes de tratamiento

n (%) 124 (95) 147 (96)

Pacientes con AE emergentes de tratamiento

n (%) 15 (94 ) 20 (100)

Agitacion

1 2

Insomnio

1 2

Hemoglobina reducida

2 1

Saturacion de oxfgeno reducida

3

Herpes simple

1 1

Acidosis metabolica

1 1

Hematoma

1 1

Falla de destete

2

Hemorragia posterior a procedimiento

1 1

Erupcion

1 1

Hiperglucemia

1 1

Fosforo en sangre

2

Vomito reducido

1 1

Dolor de espalda

2

Taquipnea

2

Todos los AE emergentes de tratamiento

grave

2 2

Choque septico

3 1

Insuficiencia respiratoria

2

Necrosis gastrointestinal

2

Hipotension

2

Muerte

n 1

Necrosis hepatica

1

Necrosis de vesfcula biliar

1

Desequilibrio electrol ftico

1

Azotemia

1

Paro cardiaco

1

Bradicardia

1

Electrocardiograma QT prolongado

1

Reduccion de calcio en sangre

1

Coma

1

Hiperlactacidemia

AP Placebo

TODOS EA

n (%) 130 (100) 154(100)

AE emergentes de tratamiento

n (%) 124 (95) 147 (96)

Pacientes con AE emergentes de tratamiento

n (%) 15 (94 ) 20 (100)

Disminucion del nivel de conciencia

1

Osteomielitis

1

Neoplasia cerebral

1

Insuficiencia renal

1

Cese de terapia

1

Ecocardiograma anormal

1

*: Incluye >1 evento reportado en cualquiera los grupos de tratamiento

Revision de los datos de seguridad por el DSMB independiente no plantea seguridad real.

un problema de

Medicacion concomitante

MEDICACION CONCOMITANTE: fArmacos cardiovasculares POR codigo atc

Grupo de tratamiento

Placebo

AP

n

n

AGENTES ADRENERGICOS Y DOPAMINERGICOS

132 102

ANTIARRITMICOS, CLASE III

41 20

AGENTES BETA BLOQUEANTES, SELECTIVOS

32 20

GLUCOSIDOS DIGITALICOS

23 5

INHIBIDORES DE ACE, SIMPLES

13 9

ANTIARRITMICOS, CLASE IB

9 6

ANTAGONISTAS DE VITAMINA K

9 3

DERIVADOS DE DIHIDROPIRIDIN A

7 4

AGONISTAS BETA-2 DE RECEPTORES ADRENERGICOS SELECTIVOS

8 2

ACTH

4 4

SIMPATICOMIMETICOS, SIMPLE

4 4

FARMACOS PARA TRATAMIENTO DE HIPERCALEMIA

2 3

AGENTES DE BLOQUEO BETA NO SELECTIVOS

4

VASOPRESINA Y ANALOGOS

4

ANTAGONISTAS DE ANGIOTENSINA II, SIMPLES

1 2

TIAZIDAS, SIMPLES

2 1

MEDICACION CONCOMITANTE: fArmacos cardiovasculares por codigo atc

Grupo de tratamiento

Placebo

AP

n

n

OTROS VASODILATADORES UTILIZADOS EN ENFERMEDADES CARD^ACAS

3

AGENTES DE BLOQUEO ALFA-ADRENERGICOS

2

CANAL DE BLOQUEO DE CALCIO DEL ANTAGONISTA DE ANGIOTENSINA II

2

AGENTES ALFA Y BETA-BLOQUEANTES

2

OTROS VASODILATADORES PERIFERICOS

1

ANTIARRITMICOS, CLASE IC

1

ANTAGONISTAS Y DIURETICOS DE ANGIOTENSINA II

1

OTRAS PREPARACIONES CARDIACAS

1

Todos

288 205

MEDICAMENTOS CONCOMITANTES: FARMACOS CV CON ACCIONES VASOPRESORAS O VASODILATADORAS POR CODIGO ATC

Grupo de Tratamiento

Placebo

AP

n

n

AGENTES ADRENERGICOS Y DOPAMINERGICOS

132 102

AGENTES BETA BLOQUEANTES, SELECTIVOS

32 20

GLUCOSIDOS DIGITALICOS

23 5

INHIBIDORES DE ACE, SIMPLES

13 9

ANTAGONISTAS DE VITAMINA K

9 3

ACTH

4 4

SIMPATICOMIMETICOS, SIMPLES

4 4

FARMACOS PARA TRATAMIENTO DE HIPERCALEMIA

2 3

VASOPRESINA Y ANALOGOS

4

ANTAGONISTAS DE ANGIOTENSINA II, PLANAS

1 2

TIAZIDAS, PLANAS

2 1

OTROS VASODILATADORES UTILIZADOS EN ENFERMEDADES CARDIACAS

3

AGENTES DE BLOQUEO ALFA-ADRENERGICOS

2

CANAL DE BLOQUEO DE CALCIO DEL ANTAGONISTA DE ANGIOTENSINA II

2

AGENTES ALFA Y BETA-BLOQUEANTES

2

OTROS VASODILATADORES PERIFERICOS

1

ANTAGONISTAS Y DIURETICOS DE ANGIOTENSINA II

1

MEDICAMENTOS CONCOMITANTES: FARMACOS CV CON ACCIONES VASOPRESORAS O VASODILATADORAS POR CODIGO ATC

Grupo de Tratamiento

Placebo

AP

n

n

Todos

222 168

Biomarcadores y muestreo

Para investigar el efecto de la AP sobre los parametros inflamatorios en pacientes con septicemia con insuficiencia renal se analizaron los siguientes biomarcadores:

5 Orina

• Molecula-1 de Lesion de rinon (KIM- 1), aumento de expresion en tubulo proximal

• interleuquina-18 (IL-18)

• lipocalina-2/lipocalina asociada con gelatinasa neutrofila (NGAL)

Nota: Los ensayos para a- o n-glutation S-transferasa (a-GST o n-GST) esperan validacion y resultados de los analisis 10 estaran disponible en breve.

Sangre

• Protefna de union a lipopolisacarido (LBP)

• Protefna C reactiva (CRP)

• Interleuquina-6 (IL-6)

15 Muestreo

Se recolectaron muestras a intervalos regulares (Tablas 11-13) y se congelaron inmediatamente:

Tabla 11. Programacion de muestreo de biomarcadores urinarios

Puntos de tiempo de muestra

Tiempo acumulado (h)

Dfa 1, t = 0, 3, 6, 12,18

0, 3, 6, 12, 18

Dfa 2, t = 0, 6, 12, 18

24,30, 36, 42

Dfa 3, t = 0, 12

48, 60

Dfa 4, t = 0, 12

72, 84

Dfa 5, t = 0, 12

96, 108

Dfa 6, t = 0, 12

120, 132

Dfa 7, t = 0, 12

144, 156

Dfa 8, t = 0, 12

168, 180

Dfa 14, t = 0, 12

336, 348

Dfa 21, t = 0, 12

504,516

Dfa 28, t = 0 , 12

672, 684

Tabla 12. Programacion de muestreo de biomarcadores sangufneos (LBP, IL-6)

Puntos de tiempo de muestra

Tiempo acumulado (h)

Dfa 1, t = 0, 12

0, 12

Dfa 2, t = 0, 12

24, 36

Dfa 3, t = 0, 12

48, 60

Dfa 4, t = 0

72

Dfa 5, t = 0

96

Dfa 6, t = 0

120

Dfa 7, t = 0

144

Dfa 8, t = 0

168

Tabla 13. Programacion de muestreo de biomarcadores en sangre (CRP)

Puntos de tiempo de muestra

Tiempo acumulado (h)

Dfa 1, t = 0

0

Dfa 2, t = 0

24

Dfa 3, t = 0

48

Dfa 4, t = 0

72

Dfa 5, t = 0

96

dfa 6, t = 0

120

dfa 7, t = 0

144

dfa 8, t = 0

168

dfa 14, t = 0

336

dfa 21, t = 0

504

dfa 28, t = 0

672

5 Analisis de biomarcadores NGAL

La lipocalina asociada con gelatinasa neutrofila (NGAL) se determino por medio de ELISA Se obtuvieron anticuerpo de captura y anticuerpo de deteccion de R&D systems (Abingdon, Reino Unido). El anticuerpo de captura se diluyo en regulador de carbonato de sodio pH 9.6 y se pipeteo en placas de microtitulacion de 96 pozos Nunc Maxisorp. Despues

10 de incubacion durante 12 horas a 4°C las placas se lavaron tres veces con PBS 50 mM, pH 7.4 que contiene 0.1% de Tween-20 (ELx50 BioTek Instruments, Winooski, VT, EE.UU.). Las muestras de orina se diluyeron 10, 100, o 1000 veces en 0.1% de BSA en PBS. Las curvas de estandar fueron hechas de NGAL purificada, variando de 20 a 0 ng/ml. Las muestras y los estandares se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Despues de lavar tres veces, el anticuerpo de deteccion, se diluyo en 1% de BSA en PBS, y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente.

15 Despues de lavar se agrego 100 pl de estreptavidina-HRP en 1% de BSA en PBS y se incubo durante 20 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavo de nuevo y luego se agrego 100 pl de solucion de sustrato, regulador de citrato- fosfato pH 5 + 0.05% de O-fenilendiamina (OPD) + 0.03% de H2O2 y la formacion de color se detuvo despues de 15 minutos a temperatura ambiente al agregar H2SO4 0.5 M. La placa se leyo a 490 nm en un lector de placa Biotek (Powerwave 200, (BioTek Instruments, Winooski, VT, EE.UU.)

20 Kim-1

El marcador 1 de lesion renal (Kim-1) se determino por medio de ELISA Se obtuvieron anticuerpo de captura y anticuerpo de deteccion de R&D systems. El anticuerpo de captura se diluyo en regulador de carbonato de sodio pH 9.6 y se pipeteo en placas de microtitulacion 96 pozos Nunc Maxisorp. Despues de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces con PBS 50 mM, pH 7.4 que contiene 0.1% de Tween-20 (ELx50, BioTek 5 Instruments, Winooski, VT, EE.UU.). Las muestras de orina se diluyeron 2 veces en 0.1% de BSA en PBS. Las curvas estandar se hicieron de KIM-1 purificado, variando de 8 a 0 ng/ml. Las muestras y los estandares se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Despues de lavar tres veces, se agrego el anticuerpo de deteccion, diluido en 1% de BSA en PBS, y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues de lavado se agrego 100 pl de estreptavidina-HRP en 1% de BSA en PBS y se incubo durante 20 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavo de 10 nuevo y luego se agrego 100 pl de solucion de sustrato, regulador de citrato-fosfato de pH 5 + 0.05% de O- fenilendiamina (OPD) + 0.03% de H2O2 y la formacion de color se detuvo despues de 15 minutos a temperatura ambiente al agregar H2SO4 0.5 M. La placa se leyo a 490 nm en un lector de placas Biotek (Powerwave 200, (Instrumentos BioTek, Winooski, VT, EE.UU.)

GST-pi

15 La glutation S-transferasa (GST)-PI se determino por medio de EIA Placas de Polysorp-NUNC se recubrieron con GST- pi purificada (0.33 pg/ml, Abnova, Taipei City Taiwan) en cada pozo 100 pl de regulador de carbonato de sodio pH 9.6 durante 16 horas a 4°C. Las muestras de orina sin diluir (60 pl) y anticuerpo GST-pi anti-humano (Immundiagnostik, Bensheim, Aemania, AK3105) en 1% de BSA-PBS (60 ml) tambien se incubaron durante 12 horas a 4°C en placas de fondo redondo Greiner separadas. Las curvas estandar se hicieron de GST-pi purificada, variando desde 82 hasta 0 20 ng/ml. Despues de 12 horas la placa de Polysorp se lavo tres veces y 100 pl de la mezcla de muestra/anticuerpo se pipeteo en la placa de Polysorp. Despues de lavado se agrego 100 pl de estreptavidina-HRP en 1% de BSA en PBS y se incubo durante 20 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavo de nuevo y despues se agrego 100 pl de solucion de sustrato, regulador de citrato-fosfato pH 5 + 0.05% de O-fenilendiamina (OPD) + 0.03% de H2O2 y la formacion de color se detuvo despues de 15 minutos a temperatura ambiente al agregar H2SO4 0.5 M. La placa se leyo 25 a 490 nm en un lector de placas Biotek (Powerwave 200, (Instrumentos BioTek, Winooski, VT, EE.UU.).

GST alfa

La glutation S-transferasa (GST)-alfa se determino por medio de EIA Placas Maxisorp-NUNC se recubrieron con GST- alfa purificada (0.9 pg/ml, Abnova, Taipei City Taiwan) en cada pozo 100 pl de regulador de carbonato de sodio pH 9.6 durante 16 horas a 4°C. Las muestras de orina sin diluir (60 pl) y anticuerpo GST-alfa anti-humano (Abnova) en 1% 30 BSA-PBS (60 pl) se mezclaron en placas Greiner de fondo redondo separadas. Despues de 16 horas se lavo la placa

Maxisorp tres veces y 100 pl de la mezcla de muestra/anticuerpo se pipeteo en la placa Maxisorp. Las curvas estandar se realizaron de GST-alfa purificada, variando desde 900 hasta 0 pg/ml. Despues de incubacion de 1 hora a temperatura ambiente y lavado se agrego 100 pl de anticuerpo marcado con biotina ml anti-raton de conejo en 1% de BSA en PBS y se incubo durante 20 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavo de nuevo y luego se agrego 100 35 pl de solucion de sustrato, regulador de citrato-fosfato pH 5 + 0.05% de O-fenilendiamina (OPD) + 0.03% de H2O2 y la formacion de color se detuvo despues de 45 minutos a temperatura ambiente al agregar H2SO4 0.5 M. La placa se leyo a 490 nm en un lector de placas Biotek (Powerwave 200, (BioTek Instruments, Winooski, VT, EE.UU.).

IL-18

Placas Maxisorp NUNC se recubrieron con 100 pl de antfgeno IL-18 (Randox, Crumlin, Reino Unido) 125 pg/ml de 40 concentracion en regulador de carbonato pH 9.6 y se incubaron 16 horas a 4°C. Las muestras de orina sin diluir (60 pl) se pipetearon en una placa Greiner de fondo redondo y se agrego 60 pl de anticuerpo de union (Randox, anticuerpo policlonal anti-IL-18 de oveja) a las muestras y se incubo 16 horas a 4°C. Las placas Maxisorp se lavaron y 100 pl de la mezcla de muestra/anticuerpo se pipeteo en la placa Maxisorp. Las curvas estandar se incineron de IL-18 purificado, variando desde 125 hasta 0 pg/ml. Despues de lavar tres veces, se agrego anticuerpo marcado con HRP anti oveja de 45 conejo, diluido en 1% de BSA-PBS y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavo de nuevo y luego se agrego 100 pl de solucion de sustrato, regulador de citrato-fosfato pH 5 + 0.05% de O-fenilendiamina (OPD) + 0.03% de H2O2 y la formacion de color se detuvo despues de 45 minutos a temperatura ambiente al agregar H2SO4 0.5 M. La placa se leyo a 490 nm en un lector de placas Biotek (Powerwave 200, (BioTek Instruments, Winooski, VT, EE.UU.).

50 Analisis estadfstico

Los datos del perfodo de tratamiento de 48 horas se presentan como medias de cada punto de tiempo ± error estandar de la media (EEM) y se analizaron utilizando GraphPad Prism. Se realizaron pruebas t apareadas y los medios se consideraron significativamente diferentes cuando los valores de p fueron <0.05.

El analisis de los datos de 7 dfas se realizo mediante mediciones repetidas de ANOVA utilizando el paquete de software 55 estadfstico SigmaStat y las diferencias se consideraron significativas cuando los valores de P fueron <0.05.

Biomarcadores urinarios durante periodo de tratamiento de 48 h

Todos los analisis se realizaron sobre los valores del estudio inicial corregidos. Se encontraron efectos de tratamiento estadfsticamente significativos (prueba t apareada) a favor de BIAP para KIM-1 (p=0.0002) (Figura 10) e IL18 (p=0.0027) (Figura 11) durante las primeras 48 horas de tratamiento. No se encontraron diferencias estadfsticamente significativas entre los grupos de tratamiento y placebo para NGAL o IL-6 (datos no mostrados).

5 Analisis de orina y biomarcadores en suero durante 7 dfas despues del inicio del tratamiento.

Se determinaron los niveles de KIM-1, IL-18 y NGAL (en orina) y CRP, LBP e IL-6 (en suero). Todos los analisis se realizaron sobre los valores de estudio inicial corregidos (Figuras 12-15). Se encontraron efectos de tratamiento estadfsticamente significativos (mediciones repetidas de ANOVA) a favor de BIAP para KIM-1, IL18, CRP y LBP (p<0.0001) durante 7 dfas despues del inicio del tratamiento. Se encontraron diferencias, aunque no estadfsticamente 10 significativas, entre los grupos de tratamiento y placebo para NGAL e IL-6 (Figuras 16 y 17).

Referencias

Levey AS, Green T, Kusek JW, Beck GJ, MDRD Study Group. A simplified equation to predict glomerular filtration rate from serum creatinine. J Am Soc Nephrol. 2000; 11: A0828.

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Fosfatasa alcalina para uso en un metodo para prevenir y/o tratar fibrilacion auricular, en la que dicha fibrilacion auricular se debe a funcion renal reducida.
2. 2. Fosfatasa alcalina para uso de acuerdo con la reiVndicaaon 1, en la que dicha fibrilacion auricular se debe a 5 depuracion de creatinina renal reducida.
3. 3. Fosfatasa alcalina para uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en la que se reduce la (co)medicacion para el tratamiento de fibrilacion auricular.
4. 4. Fosfatasa alcalina para uso de acuerdo con una cualquiera de las reiVndicaciones 1 a 3, en la que fibrilacion auricular se evita o se trata en un paciente de unidad de cuidado intensivo.

   10