ES2656405T3 - Fosfatasas modificadas - Google Patents

Abstract

Una fosfatasa alcalina aislada o recombinante que comprende un dominio de corona y un dominio catalítico, en la que dicho dominio de corona es el dominio de corona de una fosfatasa alcalina placentaria (ALPP) y en la que dicho dominio catalítico es el dominio catalítico de una fosfatasa alcalina intestinal (ALPI).

Description

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DESCRIPCION

Fosfatasas modificadas

La invención se refiere a fosfatasas y más específicamente a fosfatasas (genéticamente) modificadas, composiciones farmacéuticas que comprenden fosfatasas (genéticamente) modificadas y el uso de fosfatasas (genéticamente) modificadas para tratar o curar, por ejemplo, sepsis, enfermedad inflamatoria del intestino u otras enfermedades inflamatorias o insuficiencia renal. La invención se refiere además a un método para producir fosfatasas.

Una fosfatasa es una enzima que desfosforila su sustrato; es decir, hidroliza monoésteres de ácido fosfórico en un ion fosfato y una molécula con un grupo hidroxilo libre. Esta acción es directamente opuesta a la de las fosforilasas y quinasas, que unen los grupos fosfato a sus sustratos mediante el uso de moléculas energéticas como el ATP. Las fosfatasas se pueden categorizar en dos categorías principales: fosfatasas dependientes de cisteína (CDP) y metalofosfatasas. Las últimas dependen de la presencia de uno o más iones metálicos en su(s) sitio(s) activo(s) para su actividad.

Los CDP catalizan la hidrólisis de un enlace fosfoéster a través de un intermediario de fosfocisteína. El nucleófilo de cisteína libre forma un enlace con el átomo de fósforo de la unidad estructural fosfato, y el enlace P-O que une el grupo fosfato con la tirosina es protonado, bien por un residuo de aminoácido ácido colocado adecuadamente o bien por una molécula de agua. El intermedio de fosfocisteína es luego hidrolizado por otra molécula de agua, regenerando así el sitio activo para otra reacción de desfosforilación.

Las metalofosfatasas coordinan 1 o más iones metálicos catalíticamente esenciales dentro de su sitio activo. Actualmente existe cierta confusión sobre la identidad de estos iones metálicos, ya que los intentos sucesivos de identificarlos producen respuestas diferentes. Actualmente hay evidencia de que estos metales pueden ser magnesio, manganeso, hierro, zinc o cualquier combinación de los mismos. Se cree que un ion hidroxilo que puentea los dos iones metálicos participa en el ataque nucleofílico en el grupo fosfato

Las fosfatasas actúan en oposición a las quinasas/fosforilasas, que añaden grupos fosfato a las proteínas. La adición de un grupo fosfato puede activar o desactivar una enzima (por ejemplo, rutas de señalización de quinasas) o permitir que tenga lugar una interacción proteína-proteína (por ejemplo, dominios SH3); por lo tanto, las fosfatasas son esenciales para muchas rutas de transducción de señales. Debe observarse que la adición y eliminación de fosfato no corresponde necesariamente a la activación o inhibición de la enzima, y que varias enzimas tienen sitios de fosforilación separados para activar o inhibir la regulación funcional. La CDK, por ejemplo, puede activarse o desactivarse dependiendo del residuo de aminoácido específico que se fosforila. Los fosfatos son importantes en la transducción de señales porque regulan las proteínas a las que están unidos. Para revertir el efecto regulador, se elimina el fosfato. Esto ocurre por sí solo mediante hidrólisis, o está mediado por proteínas fosfatasas.

Sin limitar la presente invención, las fosfatasas alcalinas se discuten con más detalle como un ejemplo de las fosfatasas descritas y reivindicadas aquí. La fosfatasa alcalina (ALP) (EC 3.1.3.1) es una enzima hidrolasa responsable de eliminar los grupos fosfato de muchos tipos de moléculas, incluidos nucleótidos, proteínas y alcaloides. El proceso de eliminación del grupo fosfato se llama desfosforilación. Como su nombre indica, las fosfatasas alcalinas son más efectivas en un ambiente alcalino.

La fosfatasa alcalina se ha convertido en una herramienta útil en los laboratorios de biología molecular, ya que el ADN normalmente posee grupos de fosfato en el extremo 5'. La eliminación de estos fosfatos evita que el aDn se ligue (el extremo 5' se une al extremo 3' de la misma u otra molécula); también, la eliminación de los grupos fosfato permite la radiomarcación (reemplazo por grupos de fosfato radioactivo) con el fin de medir la presencia del ADN marcado a través de etapas adicionales en el proceso o experimento. Para estos fines, la fosfatasa alcalina del camarón es la más útil, ya que es la más fácil de desactivar una vez que ha hecho su trabajo.

Otro uso importante de la fosfatasa alcalina es como etiqueta para inmunoensayos enzimáticos.

Además, las fosfatasas alcalinas se usan en el tratamiento de, por ejemplo, sepsis, enfermedad inflamatoria del intestino o insuficiencia renal.

Aunque las fosfatasas (alcalinas) actualmente disponibles son útiles tanto en el diagnóstico como en el tratamiento de la enfermedad, existe la necesidad de fosfatasas alternativas con, por ejemplo, una actividad específica alterada (por ejemplo mejorada), estabilidad (por ejemplo, T1/2 in vivo, o estabilidad con respecto al almacenamiento (vida útil)) o especificidad del sustrato. Además, también existe la necesidad de fosfatasas con un perfil diferente de (in)dependencia del pH o la temperatura o la sal.

La presente invención proporciona fosfatasas alternativas (genéticamente) modificadas.

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La invención se refiere a una fosfatasa alcalina aislada o recombinante que comprende un dominio de corona y un dominio catalítico, en el que dicho dominio de corona y dicho dominio catalítico se obtienen a partir de diferentes fosfatasas alcalinas. Estos mutantes se denominan en el presente documento “mutantes intercambiados en dominio”.

En una primera realización, la invención proporciona una fosfatasa alcalina aislada o recombinante que comprende un y un dominio catalítico, en el que dicho dominio de corona es el dominio de corona de una fosfatasa alcalina de placenta (MF) y en donde dicho dominio catalítico es el dominio catalítico de una fosfatasa alcalina intestinal (ALPI).

Fosfatasa alcalina (AP); EC 3.1.3.1 según IUBMB Enzyme Nomenclature, el nombre común es fosfatasa alcalina (AP), es una enzima que cataliza la reacción de un monoéster de fosfatasa y H2O a un alcohol y fosfato. Otros nombres para la AP son fosfomonoesterasa alcalina; fosfomonoesterasa; glicerofosfatasa; fosfohidrolasa alcalina; fenil fosfatasa alcalina; ortofosfórico-monoéster fosfohidrolasa (alcalino óptimo). El nombre sistémico de AP es fosfato-monoéster fosfohidrolasa (alcalino óptimo).

La AP es una enzima de amplia especificidad, y también cataliza transfosforilaciones. En humanos y otros mamíferos, se conocen al menos cuatro fosfatasas alcalinas distintas, pero relacionadas. En humanos, son fosfatasa alcalina intestinal, placentaria, similar a placentaria y de hígado/hueso/riñón (o tejido no específico). Las tres primeras se encuentran juntas en el cromosoma 2, mientras que la forma no específica del tejido se encuentra en el cromosoma 1. No se conocen las funciones fisiológicas exactas de las AP, pero las AP parecen estar involucradas en una gran cantidad de procesos fisiológicos.

La fosfatasa alcalina placentaria se abrevia aquí como ALPP o PLAP Las abreviaturas ALPI o IAP se refieren a la fosfatasa alcalina intestinal. La fosfatasa alcalina tipo 2 placentaria se abrevia aquí como ALPP2, ALPG o GCAP y las abreviaturas ALPL, TNSALP, TNAP o BLK se usan en este documento para referirse a la fosfatasa alcalina no específica de hígado/tejido. Las diferentes abreviaturas para una y la misma fosfatasa alcalina se usan indistintamente en este documento.

Desde un punto de vista conformacional, una fosfatasa alcalina consiste aproximadamente en dos dominios: un dominio de corona y un dominio de sitio activo. El dominio de sitio activo se puede dividir en partes separadas como el residuo catalítico y los tres sitios de ion metálico (Zn1, Zn2 y Mg3). Desde el punto de vista de la estructura primaria, está claro que el dominio de corona está flanqueado por los aminoácidos que forman el dominio de sitio activo. Por lo tanto, en una realización preferida, el dominio catalítico no está compuesto de una secuencia contigua de aminoácidos, sino que está flanqueando el dominio de corona.

La secuencia de aminoácidos de las fosfatasas alcalinas y las posiciones relativas del dominio catalítico y corona son conocidas por la persona experta. Como ejemplo, se hace referencia a la Figura 1 que muestra, entre otros, la secuencia de aminoácidos de las cuatro fosfatasas alcalinas humanas. El dominio de corona está subrayado en estas secuencias. Los mutantes intercambiados en el dominio de la invención preferiblemente se han fabricado reemplazando su propio dominio de corona (subrayado) por un dominio de corona de otra fosfatasa subrayado). Por ejemplo, el dominio de corona de ALPP está localizado entre los aminoácidos 366 a 430 y por lo tanto en una realización preferida la referencia al dominio de corona corresponde a los aminoácidos 366 a 430 en la figura 1, es decir, en una realización preferida la fosfatasa alcalina recombinante según las reivindicaciones, cuyo dominio de corona en el ALPP de la Figura 1 está localizada entre los aminoácidos 366 a 430.

Las fosfatasas alcalinas están presentes en prácticamente todos los organismos, desde bacterias hasta humanos. En una realización preferida, la invención proporciona una fosfatasa alcalina aislada o recombinante que comprende un dominio de corona y un dominio catalítico, donde dicho dominio de corona y dicho dominio catalítico se obtienen de diferentes fosfatasas alcalinas, donde dicho dominio de corona es el dominio de corona de una alcalina fosfatasa de placenta (ALPP) y en el que dicho dominio catalítico es el dominio catalítico de una fosfatasa alcalina intestinal (ALPI), y en el que al menos una de dichas fosfatasas diferentes es una fosfatasa humana. La otra fosfatasa es, por ejemplo, ECAP (fosfatasa alcalina de Escherichia coli) o una de las siete BIAP conocidas (fosfatasa alcalina intestinal bovina). En una realización preferida, la invención proporciona una fosfatasa alcalina aislada o recombinante que comprende un dominio de corona y un dominio catalítico, donde dicho dominio de corona y dicho dominio catalítico se obtienen de diferentes fosfatasas alcalinas, donde dicho dominio de corona es el dominio de corona de una alcalina fosfatasa de placenta (ALPP) y en el que dicho dominio catalítico es el dominio catalítico de una fosfatasa alcalina intestinal (ALPI) y en el que las diferentes fosfatasas alcalinas son fosfatasas humanas. Esto es especialmente útil si la fosfatasa modificada se usa posteriormente en terapia humana, por ejemplo en el tratamiento de sepsis, enfermedad inflamatoria del intestino u otra enfermedad inflamatoria o insuficiencia renal. Se espera que tales fosfatasas (genéticamente) modificadas de origen humano no sean o sean muy poco inmunogénicas. Sin embargo, es evidente para el experto en la materia que si una fosfatasa modificada se utiliza por ejemplo en diagnósticos "in vitro" o "ex vivo", una fosfatasa modificada puede estar compuesta, por ejemplo, de una fosfatasa alcalina humana y una E. coli o puede estar compuesta de una fosfatasa alcalina de E. coli y bovina.

La invención proporciona así una fosfatasa alcalina aislada o recombinante que comprende un dominio de corona y un dominio catalítico, donde dicho dominio de corona y dicho dominio catalítico se obtienen de diferentes fosfatasas

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alcalinas y en el que dicho dominio de corona es el dominio de corona de ALPP y en el que dicho dominio catalítico es el dominio catalítico de ALPI. Preferiblemente, al menos una de dichas fosfatasas diferentes es una fosfatasa humana y en una realización aún más preferida, ambas fosfatasas diferentes son fosfatasas humanas.

Hasta la presente invención, generalmente se creía que el dominio catalítico de una fosfatasa alcalina era el dominio más importante con respecto a la actividad específica. Además, se creía que el dominio de corona estaba involucrado en la estabilidad de una fosfatasa alcalina. Por lo tanto, al probar una fosfatasa alcalina recombinante que comprende el dominio catalítico de ALPI y el dominio de corona de ALPP (referido adicionalmente como ALPIcat/ALPPcorona) se esperaba que la actividad de esta fosfatasa alcalina recombinante fuera comparable a la actividad de ALPI. Sin embargo, la producción de ALPIcat/ALPPcorona en un medio sin o con muy poco Zn2+, por ejemplo medio de expresión Freestyle™ 293 (GIBCO), dio como resultado una actividad específica de aproximadamente 600 U/mg mientras que ALPI producida por la misma línea celular y en el mismo medio dio como resultado una actividad específica de aproximadamente 30 U/mg.

Aún más sorprendente fue el efecto de añadir iones Zn2+ al medio de crecimiento de las células productoras: esto tiene poco efecto sobre la actividad específica de ALPIcat/ALPPcorona mientras que la actividad específica de ALPI aumentó a aproximadamente 750 U/mg. La adición de concentraciones similares de Zn2+ después de la producción indujo solo un aumento de 2 veces en la actividad específica de ALPI después de 16 h.

Se proporciona un resumen de estos resultados en las Tablas 1 y 2.

Sin estar limitados por la teoría, se cree que el dominio de corona de ALPP proporciona un cambio conformacional en la ALPIcat/ALPPcorona recombinante producida que da como resultado una actividad específica más alta y una enzima independiente de Zn2+, es decir, la presencia del dominio de corona de ALPP da como resultado una actividad específica relativamente alta y se considera que es independiente de Zn2+.

Además, no solo se demostró que ALPI requería altas concentraciones de Zn2+ durante la producción para aumentar la actividad específica de la enzima, sino también que la actividad específica de ALPI disminuía en 24 horas en medio deficiente en Zn2+, mientras que ALPIcat/ALPPcorona conservaba su actividad específica inicial bajo las mismas condiciones. Estos resultados implican que la actividad in vivo es independiente de Zn2+. Dicha enzima, cuya actividad es independiente de Zn2+, podría ser útil en enfermedades donde la pérdida de Zn2+ es parte de la patología (por ejemplo, defectos nutricionales, abuso de alcohol y daño a la integridad intestinal, infecciones crónicas incluyendo sepsis o enfermedades inflamatorias en general) o donde la adición de Zn2+ puede estar contraindicada (por ejemplo, fase aguda de la sepsis, enfermedades autoinmunes). Además de las ventajas de producción y aplicación, ALPIcat/ALPPcorona también tiene ventajas con respecto a la estabilidad durante el almacenamiento.

Por lo tanto, se ha demostrado que una AP nativa, como ALPI, pierde su actividad enzimática en entornos con bajas concentraciones de Zn2+. Por tanto, en enfermedades en las que la pérdida de Zn2+ es parte de la patología, dicha AP nativa no puede desplegar su actividad enzimática en el sitio donde se cree que es el más beneficiosa, por ejemplo en el sitio de la inflamación Por el contrario, una AP recombinante no susceptible a bajas concentraciones de Zn2+, por ejemplo ALPIcat/ALPPcorona conserva su actividad en un entorno con baja concentración de Zn2+, por ejemplo en un sitio de inflamación En un individuo sano, los valores de referencia del Zn2+ en suero están entre 10 y 20 jM. Por ejemplo, en el abuso del alcohol o durante la desnutrición, estos niveles pueden disminuir a menos de l0 |jM o incluso a menos de 1 jM. Varias enzimas en el cuerpo humano dependen del Zn2+ para su actividad y, por ejemplo, las respuestas inmunológicas son más eficaces si hay niveles suficientes de Zn2+. Se sabe que las partes innata y específica del sistema inmune están influenciadas por el zinc y se ha establecido que las proteínas que contienen zinc se acumulan en los sitios de inflamación. Además, la inflamación (sub)crónica, como la artritis reumatoide, la sepsis y la enfermedad de Crohn se presentan con deficiencia de zinc en suero. Sorprendentemente, la invención también proporciona la idea de que ALPIcat/ALPPcorona conserva su actividad en un intervalo de pH mucho más amplio que la fosfatasa alcalina no modificada (recombinante). Dado el hecho de que muchos trastornos, tales como inflamación y/o isquemia, abarcan alteraciones en el pH del tejido, ALPIcat/ALPPcorona es, por lo tanto, particularmente útil para el tratamiento de tales enfermedades. Por lo tanto, en una realización, la invención proporciona un uso de una fosfatasa que comprende un dominio catalítico de ALPI y un dominio de corona de ALPP como medicamento, preferiblemente para uso en el tratamiento de una enfermedad que está acompañada por pH de tejido alterado, preferiblemente dicha enfermedad comprende una enfermedad inflamatoria y/o una enfermedad acompañada de isquemia.

La descripción proporciona la idea de que una fosfatasa recombinante que comprende el dominio catalítico de ALPI y el dominio de corona de ALPP (ALPIcat/ALPPcorona) es especialmente útil en el tratamiento de una enfermedad que está acompañada de deficiencia de Zn2+ local o sistémica. Por lo tanto, en otra realización, la invención se refiere a un uso de una fosfatasa que comprende un dominio catalítico de ALPI y un dominio de corona de ALPP como medicamento, preferiblemente para uso en el tratamiento de una enfermedad que está acompañada por deficiencia de Zn2+. Preferiblemente, dicha enfermedad comprende una enfermedad inflamatoria, más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, neurodermitis y enfermedades representadas en la Tabla 10.

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En otra realización, la invención se refiere al uso de una fosfatasa que comprende un dominio catalítico de ALPI y un dominio de corona de ALPP en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que está acompañada por deficiencia de Zn2+, preferiblemente dicha enfermedad comprende una enfermedad inflamatoria, más preferiblemente una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, neurodermitis y enfermedades representadas en la Tabla 10.

En aún otra realización, la invención se refiere a un método para tratar un sujeto (preferiblemente un ser humano) para tratar una enfermedad que está acompañada por deficiencia de Zn2+, que comprende administrar una cantidad efectiva de una fosfatasa que comprende un dominio catalítico de ALPI y un dominio de corona de ALPP a un sujeto que lo necesita, donde dicha enfermedad comprende preferiblemente una enfermedad inflamatoria, más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, neurodermitis y enfermedades representadas en la Tabla 10.

También se describe una fosfatasa alcalina aislada o recombinante que comprende un dominio de corona y un dominio catalítico, donde dicho dominio de corona y dicho dominio catalítico se obtienen de diferentes fosfatasas alcalinas y en el que dicho dominio de corona es el dominio de corona de ALPI y en el que dicho dominio catalítico es el dominio catalítico de ALPP (más conocido como catALPP/coronaALPI). Preferiblemente, al menos una de dichas fosfatasas diferentes es una fosfatasa humana e incluso más preferiblemente, ambas fosfatasas diferentes son fosfatasas humanas.

Otros mutantes preferidos intercambiados en el dominio que se basan en las fosfatasas alcalinas humanas son:

Dominio catalítico

Dominio de corona Denominado

ALPI

GCAP ALPIcat/GCAPcorona

TNAP ALPIcat/TNAPcorona

ALPP

GCAP ALPPcat/GCAPcorona

TNAP ALPPcat/TNAPcorona

GCAP

ALPI GCAPcat/ALPIcorona

ALPP GCAPcat/ALPPcorona

TNAP GCAPcat/TNAPcorona

TNAP

ALPI TNAPcat/ALPIcorona

ALPP TNAPcat/ALPPcorona

GCAP TNAPcat/GCAPcorona

En aras de la claridad, ALPI es AP intestinal, ALPP es AP placentario, GCAP es AP similar a placentario y TNAP es AP no específico de tejido.

Está claro que también se pueden realizar combinaciones entre el dominio catalítico de ECAP o cualquiera de las formas humanas (ALPI, ALPP, GCAP o TNAP) con el dominio de corona de BIAP Además, también se pueden producir combinaciones del dominio de corona de BIAP con el dominio catalítico de ECAP o cualquiera de las formas humanas.

A lo largo de la especificación, ejemplos y bibliografía en la técnica, se usa otra nomenclatura para designar las isoformas respectivas de fosfatasa alcalina. En aras de la claridad, en la tabla a continuación, se enumeran los nombres y abreviaturas utilizados comúnmente, o utilizados en esta solicitud.

FOSFATASAS ALCALINAS

ABREVIATURAS

Placenta alcalina fosfatasa

ALPP, PLAP,

Fosfatasa alcalina placentaria secretable

shPLAP, sALPP

Fosfatasa alcalina intestinal

ALPI, IAP hIAP

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FOSFATASAS ALCALINAS

ABREVIATURAS

Fosfatasa alcalina intestinal secretable

shIAP, sALPI

Fosfatasa alcalina similar a placenta

GCAP

Fosfatasa alcalina no específica de tejido

TNAP.BLK, ALPL, TNSALP

Fosfatasa alcalina de E.coli

ECAP

Fosfatasa alcalina intestinal bovina

BIAP

Fosfatasa alcalina recombinante que comprende el dominio catalítico de ALPI y el dominio de corona de ALPP

ALPIcat/ALPPcorona, RecAP, Xinplap

Fosfatasa alcalina recombinante que comprende el dominio catalítico de ALPI y el dominio de corona de ALPP

catALPP/coronaALPI, shPLAP- hIAP-CD

Otra clase de fosfatasas modificadas útiles son las fosfatasas que en condiciones naturales están unidas a la membrana de una célula a través de un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) pero que ahora están modificadas de manera que ya no están unidas a la membrana de una célula. Ejemplos de fosfatasas que están ancladas a GPI son fosfatasa alcalina y 5'-nucleotidasa. Todas las isoenzimas son funcionalmente activas en la membrana celular y las formas deficientes en anclaje a GPI no están presentes de manera natural a niveles detectables. Aunque se ha demostrado la actividad del fosfato alcalino sérico, generalmente se acepta que la enzima aún está presente en fracciones de membranas de membrana o vesículas de membrana. La actividad de AP en leche también está presente en fracciones que contienen vesículas de membrana. El ancla de GPI se almacena como una molécula precursora en la célula donde está unida al sitio de unión a través de una transamidasa. La cadena principal del anclaje de GPI es idéntica en mamíferos, pero se conocen modificaciones dependientes del tipo de célula.

Las fosfatasas alcalinas se encuentran predominantemente en asociación con membranas plasmáticas a través de su anclaje de GPI. Por ejemplo, los neutrófilos presentan la enzima contra el fondo de su membrana celular cargada negativamente en lugar de liberarla en el microambiente inflamatorio. Por esta razón, se acepta comúnmente que para una actividad in vivo óptima de AP, la enzima debe estar incrustada en una membrana celular o una membrana vesicular. Además, se ha observado que los sustratos polianiónicos pueden contribuir adicionalmente a condiciones aniónicas favorables in vivo para la actividad de fosfatasa de las enzimas fosfatasa y sus derivados que normalmente tienen un pH alcalino óptimo, en particular para la actividad fosfatasa de la fosfatasa alcalina.

Para el uso farmacéutico de AP en sujetos humanos es para la mayoría de las aplicaciones un requisito aplicar formas humanas de la enzima para medicamentos y tratamiento, ya que las formas de AP obtenidas de otras especies pueden ser inmunogénicas en sujetos humanos y el tratamiento podría provocar reacciones inmunológicas y efectos secundarios patológicos En algunos sujetos, incluso pueden producirse efectos secundarios letales, es decir, choque anafiláctico (que se muestra en nuestros estudios con animales) y, por lo tanto, se deben minimizar los riesgos de efectos secundarios inmunológicos. Como el aislamiento de AP de humanos es prácticamente inviable, las formas recombinantes humanas de las proteínas de AP pueden producirse rutinariamente en diferentes plataformas de expresión recombinantes. Sin embargo, la expresión y purificación de proteínas que contienen GPI y ancladas a la membrana es notoriamente difícil; las proteínas GPI son difíciles de separar de las membranas y son difíciles de aislar y purificar. Sin embargo, el anclaje de GPI y la localización de la membrana siempre se han considerado esenciales para la actividad biológica de AP.

Esta parte de la presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que las enzimas AP humanas que carecen de un anclaje de GPI y enzimas que son así solubles y se secretan fácilmente mediante sistemas de expresión de proteínas recombinantes, exhiben actividad fosfatasa significativa a niveles de pH fisiológicos hacia sustratos fosforilados biológicamente relevantes en un ensayo biológico basado en células hepáticas.

La invención describe una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una modificación en la secuencia de señalización de glicosilfosfatidilinositol (GPI), en donde dicha modificación da como resultado una fosfatasa secretada, es decir, la fosfatasa no está unida a la membrana celular.

La invención describe además una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una modificación en la de glicosilfosfatidilinositol (GPI), donde dicha modificación da como resultado una fosfatasa secretada que es biológicamente activa, es decir, muestra actividad hacia un sustrato biológico (relevante).

No hay una secuencia general responsable de la unión de un anclaje de GPI, pero existe un consenso claro:

1) estiramiento hidrofóbico de aminoácidos en el extremo C (al menos 11 aminoácidos, pero preferiblemente más de 11 aminoácidos)

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2) Aguas arriba de la región hidrofóbica, un espaciador de aminoácidos hidrófilos (5-12 aminoácidos)

3) GPI está unido a un pequeño aminoácido: glicina, ácido aspártico, asparagina, alanina, serina o cisteína.

4) Los 2 aminoácidos subsiguientes aguas abajo del sitio de unión de GPI deben ser aminoácidos pequeños y en la mayoría de los casos se seleccionan entre glicina, ácido aspártico, asparagina, alanina, serina o cisteína.

Basado en este consenso, la persona experta es capaz de mutar este consenso, por ejemplo, insertando uno o múltiples aminoácidos y alterando parte del consenso. Sin embargo, la invención describe una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una modificación en la secuencia de señalización de glicosilfosfatidilinositol (GPI), donde dicha modificación da como resultado una fosfatasa secretada y dicha modificación comprende una mutación o eliminación de la secuencia de aminoácidos que abarca la secuencia de señalización de consenso de GPI.

Para aplicaciones en terapia humana, se desea que la fosfatasa modificada resultante no sea o sea muy poco inmunogénica, es decir, que la fosfatasa modificada sea esencialmente de origen humano. La invención describe una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una modificación en la secuencia de señalización de glucosilfosfatidilinositol (GPI), donde dicha modificación da como resultado una fosfatasa secretada (preferiblemente con actividad contra un sustrato biológico relevante) y en el que dicha fosfatasa es una fosfatasa humana.

Ejemplos de fosfatasas que están ancladas a GPI son fosfatasa alcalina y 5'-nucleotidasa y, por lo tanto, la invención describe una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una modificación en la secuencia de señalización de glucosilfosfatidilinositol (GPI), donde dicha modificación da como resultado una fosfatasa secretada y la fosfatasa es una fosfatasa alcalina, por ejemplo, una fosfatasa alcalina humana, como la fosfatasa humana de hígado y riñón, la fosfatasa alcalina intestinal humana o la fosfatasa alcalina similar a la placenta humana.

Está claro que cualquiera de las fosfatasas modificadas secretables descritas puede producirse, por ejemplo, introduciendo en una célula huésped un ácido nucleico capaz de codificar dicha fosfatasa secretable en un enlace operable con secuencias reguladoras y permitiendo que dicha célula huésped exprese dicha fosfatasa secretable y opcionalmente aislar la fosfatasa producida del medio en el que crecen y/o se mantienen las células huésped. Sin embargo, aparte de las mutaciones en la secuencia de inserción de GPI mencionada anteriormente, existen otros métodos que producen proteínas GPI sin anclaje, secretadas:

1) Después de la expresión como proteínas ancladas a la membrana, las fosfolipasas pueden usarse para escindir el anclaje de GPI. Por lo tanto, la invención también describe un método para producir una fosfatasa secretada que comprende cultivar un huésped capaz de expresar una fosfatasa anclada a membrana, permitiendo que dicha célula huésped produzca dicha fosfatasa e incubando las células obtenidas con una fosfolipasa y aislando opcionalmente la fosfatasa liberada. La fosfatasa anclada a la membrana es, por ejemplo, una fosfatasa de tipo salvaje (o natural o no modificada). Sin embargo, la fosfatasa anclada a la membrana puede comprender mutaciones en otras partes de su secuencia (por ejemplo, el dominio de corona).

2) La interferencia con la producción del anclaje de GPI o el uso de una célula (tipo) que es deficiente en la producción de anclaje de GPI también se puede usar para hacer una forma secretable de una proteína anclada a GPI. Los ejemplos de líneas celulares que se han hecho deficientes en la bioquímica de anclaje de GPI son, por ejemplo Jurkat, AM-B, C84, BW, S49, CHO y Raji. Por lo tanto, la invención describe un método para producir una fosfatasa secretada que comprende cultivar una célula huésped capaz de expresar una fosfatasa (alcalina) secretable (por ejemplo, una célula huésped que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de las fosfatasas secretadas modificadas (alcalinas) mencionadas), permitiendo dicho huésped la producción de dicha fosfatasa secretable y opcionalmente aísla la fosfatasa producida, en donde dicha célula huésped no es capaz de biosíntesis de proteínas ancladas a GPI funcionales. Sin embargo, la célula huésped también puede producir una fosfatasa con una secuencia de señal de GPI funcional.

3) La interferencia con o el uso de una célula deficiente en transamidasas puede usarse para inhibir la unión de un anclaje de GPI a la proteína, haciendo que la proteína sea anclable y secretable. Dicha célula deficiente se ha obtenido mediante mutagénesis en CHO.

Está claro para los expertos en la materia que una fosfatasa modificada que comprende un dominio de corona y un dominio catalítico, en el que dicho dominio de corona y dicho dominio catalítico que se obtienen a partir de diferentes fosfatasas alcalinas pueden modificarse adicionalmente y hacerse secretables. Por lo tanto, la invención describe una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una modificación en la secuencia de señalización de glicosilfosfatidilinositol (GPI), donde dicha modificación da como resultado una fosfatasa secretada y en la que dicha fosfatasa recombinante comprende además un dominio de corona y un dominio catalítico que se obtienen de diferentes fosfatasas. Ejemplos de tales mutantes de fosfatasa alcalina se proporcionan en la Figura 1. Tal mutante combinado o "doble" da como resultado, por ejemplo, una fosfatasa modificada con cierta actividad, estabilidad o especificidad de sustrato específica y, al mismo tiempo, la producción de dicho producto es muy mejorada por el hecho de que puede aislarse del medio que rodea las células productoras.

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El dominio catalítico de las fosfatasas alcalinas está compuesto por varias secuencias de aminoácidos que no son contiguas en la secuencia primaria de la enzima. El dominio catalítico contiene el residuo de serina catalítica (Ser92 en ALPP) que sirve como un aceptor para el grupo fosfato que se escinde del sustrato en la reacción de desfosforilación. El dominio catalítico de la enzima contiene además uno o más iones metálicos. Los residuos de aminoácidos específicos contenidos en el dominio catalítico son responsables de la unión y coordinación de los iones metálicos que están implicados en la reacción de desfosforilación. En ALPP, los residuos de coordinación del metal son: Asp42, His153, Ser155, Glu311, Asp316, His320, Asp357, His358, His360 e His432.

La invención también describe una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una mutación en las proximidades de un residuo catalítico y/o en un bolsillo de unión a fosfato coordinador con iones metálicos. El experto en la técnica es muy capaz de identificar y mutar aminoácidos alrededor (es decir, en las cercanías, preferiblemente conformacionales) de un residuo catalítico y/o en un bolsillo de fosfato coordinador con iones metálicos. Como ya se ha descrito anteriormente, se conocen secuencias de fosfatasas. Como ejemplo, la Figura 1 muestra, entre otros, la secuencia de aminoácidos de cuatro fosfatasas alcalinas humanas.

La invención describe una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una mutación en las proximidades de un residuo catalítico y/o en un bolsillo de unión a fosfato coordinador con iones metálicos en el que dicha fosfatasa es una fosfatasa humana. Esto es especialmente útil si la fosfatasa modificada se usa posteriormente en terapia humana, por ejemplo en el tratamiento de sepsis, enfermedad inflamatoria del intestino u otra enfermedad inflamatoria o insuficiencia renal. Se espera que tales fosfatasas (genéticamente) modificadas de origen humano no sean o sean muy poco inmunogénicas. Sin embargo, es evidente para el experto en la materia que si una fosfatasa modificada se utiliza por ejemplo en diagnósticos "in vitro" o "ex vivo", una fosfatasa modificada puede estar compuesta, por ejemplo, de una fosfatasa alcalina humana y una E. coli o puede estar compuesta de una fosfatasa alcalina de E. coli y bovina.

Preferiblemente, dicha fosfatasa es una fosfatasa alcalina.

El bolsillo de unión a fosfato coordinador con iones metálicos es conservado, al menos para las isoformas de fosfatasa alcalina humana. Consiste en dos tramos de unión a Zn y un tramo de unión a Mg que contienen los aminoácidos Asp316, His320 e His432 para Zn1, Asp42, Asp 357 y Asp358 para Zn2 y Ser155 y Glu31 para Mg, respectivamente (se hace referencia a ALPP Figura 1).

Las mutaciones de los restos de aminoácidos coordinadores y/o residuos localizados en la vecindad de los restos de coordinación pueden afectar las propiedades catalíticas de la enzima mutante resultante de una manera positiva o negativa. Por ejemplo, en ALPP, los residuos de aminoácido 44, 87, 93, 322, 323 y 429 están situados en las proximidades de los residuos de coordinación. La mutagénesis de estos residuos por sustitución con uno, dos, tres o cuatro de los aminoácidos correspondientes de ALPI puede afectar las propiedades catalíticas de la enzima. Por el contrario, la sustitución de los residuos de aminoácidos 44, 87, 93, 322, 323 y 429 de ALPI con los aminoácidos correspondientes de ALPP puede afectar a las propiedades catalíticas de la enzima ALPI. Las tablas 4 y 5 muestran (combinaciones de) los aminoácidos que pueden estar sustituidos.

Por lo tanto, en una realización preferida, la invención proporciona una fosfatasa aislada o recombinante de acuerdo con las reivindicaciones, que comprende una mutación en las proximidades de un residuo catalítico y/o en un bolsillo de unión a fosfato coordinador con iones metálicos, donde dicha mutación es una mutación como se muestra en la Tabla 4, 5 o 6.

Está claro para los expertos en la materia que una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una mutación en las proximidades de un residuo catalítico y/o en un bolsillo de unión a fosfato que contiene iones metálicos puede modificarse adicionalmente para, por ejemplo, comprender una modificación en la secuencia de señal gPi. Tal mutante puede incluso modificarse adicionalmente por dominio del dominio catalítico y corona, es decir, tal dominio de corona y dominio catalítico que se obtienen a partir de diferentes fosfatasas.

Una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una mutación en las proximidades de un residuo catalítico y/o en un bolsillo de unión a fosfato que coordina un ion metálico también puede modificarse adicionalmente por intercambio de dominio del dominio catalítico y corona, es decir, de tal forma que dicho dominio de corona y dominio catalítico se obtienen de diferentes fosfatasas.

Además, la invención describe una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una mutación en las proximidades de un residuo catalítico y/o en un bolsillo de unión a fosfato coordinador con iones metálicos.

Las técnicas de biología molecular para llegar a cualquiera de las fosfatasas descritas (genéticamente) modificadas son bien conocidas por el experto en la técnica e incluyen técnicas tales como incubaciones de enzimas de restricción, ligaciones, PCR, introducción de mutaciones, etc.

En otra realización más, la invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una fosfatasa según la invención, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un mutante intercambiado en el

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dominio, etc. La invención proporciona además un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una fosfatasa de acuerdo con la invención. Dicho vector preferiblemente comprende secuencias de ácidos nucleicos adicionales tales como elementos necesarios para la transcripción/traducción de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una fosfatasa (por ejemplo, secuencias promotoras y/o terminadoras). Dicho vector también puede comprender secuencias de ácidos nucleicos que codifican marcadores de selección (por ejemplo, un antibiótico) para seleccionar o mantener células huésped transformadas con dicho vector. Ejemplos de vectores adecuados son vectores de clonación o expresión. Cualquier vector adecuado para mediar la expresión en una célula huésped adecuada se puede usar de acuerdo con la invención, ya sea integrado o replicando episómicamente en una célula huésped. El vector puede ser un plásmido, un virus (que comprende un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado, baculovirus), cósmido, un fago o un fagémido, un vector episómico o un cromosoma artificial.

Además, la invención también proporciona una célula huésped que comprende una secuencia o vector de ácido nucleico como se describe. La célula puede ser una célula eucariota, preferiblemente una célula de mamífero, una célula vegetal o una célula de levadura, que es adecuada para la producción de proteínas recombinantes. Las células huésped de levadura adecuadas comprenden Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Las células huésped preferidas son células derivadas de mamíferos (o más preferidas para los seres humanos) tales como BHK, HEK293, CHO o PerC6™.

Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una fosfatasa como se describe aquí o un vector que comprende dicha secuencia de ácidos nucleicos o una célula huésped que comprende dicha secuencia de ácidos nucleicos o un vector que comprende dicha secuencia de ácidos nucleicos son muy útiles en la producción de fosfatasas modificadas. Las fosfatasas comprenden sitios de glucosilación y, por lo tanto, las fosfatasas se producen preferiblemente en células que proporcionan el patrón de glicosilación deseado. En una realización preferida, el sistema de producción utilizado es una plataforma de producción in vitro de mamíferos (por ejemplo, humanos) e incluso más preferiblemente la producción implica una producción a gran escala. En otra realización preferida, el sistema de producción usado es una plataforma de planta o levadura o de mamífero (preferiblemente no humano) en la que se introduce un patrón artificial de glicosilación de tipo humano.

Después de probar diferentes métodos de producción, los inventores de la presente invención determinaron sorprendentemente que la presencia de iones Zn2+ durante la producción de una fosfatasa (alcalina) de tipo silvestre o mutante puede tener un impacto sobre la actividad específica de la fosfatasa producida. Por ejemplo, la actividad específica de ALPI se puede aumentar de 30 U/mg a 750 U/mg añadiendo Zn2+ al medio de crecimiento de la célula huésped utilizada. El medio normalmente usado para cultivar células huésped comprende 0.5-3 nM de Zn2+. Tras la adición de Zn2+ hasta 1 mM, la actividad específica mejoró drásticamente. Por lo tanto, se concluye que ALPI es una fosfatasa dependiente de Zn2+. Esto está en contraste con el mutante ALPIcat/ALPPcorona ya descrito que parece ser independiente de Zn2+, es decir, la ausencia de Zn2+ durante el cultivo de las células huésped no influye significativamente en la actividad específica de la fosfatasa producida ni la ausencia de Zn2+ durante almacenamiento y durante la reacción disminuyen la actividad específica.

En aún otra realización, la invención proporciona un método para producir una fosfatasa de acuerdo con la invención que comprende cultivar una célula huésped capaz de expresar dicha fosfatasa en un medio que comprende Zn2+ y que permite a la célula producir dicha fosfatasa. En una realización preferida, dicha célula huésped es una célula de mamífero y en otra realización preferida, dicha fosfatasa es una fosfatasa humana. El método de la invención se puede usar para producir fosfatasa de tipo salvaje (o natural o no modificada genéticamente) y puede igualmente se usará para producir una fosfatasa genéticamente modificada, por ejemplo cualquiera de las fosfatasas descritas aquí.

En una realización preferida adicional, la invención proporciona un método para producir una fosfatasa según la invención que comprende cultivar una célula huésped capaz de expresar dicha fosfatasa en un medio que comprende Zn2+ y permitir que la célula produzca dicha fosfatasa, comprendiendo además dicho método aislar dicha fosfatasa. La invención describe además una fosfatasa que se puede obtener mediante un método para producir una fosfatasa que comprende cultivar una célula huésped capaz de expresar dicha fosfatasa en un medio que comprende Zn2+ y que permite que la célula produzca dicha fosfatasa.

Ya sea que las fosfatasas modificadas (genéticamente) descritas aquí tengan una cierta actividad específica, una cierta especificidad de sustrato o una cierta estabilidad (por ejemplo, pH, temperatura, tiempo de semivida in vivo) pueden ser fácilmente probadas por la persona experta utilizando sustratos comercialmente disponibles y midiendo con kits comercialmente disponibles la liberación de fosfato inorgánico tras la incubación con fosfatasa alcalina. Además, también es posible usar las pruebas descritas en este documento en la parte experimental para determinar si las fosfatasas modificadas tienen alguna actividad biológica relevante.

Como ya se mencionó, las fosfatasas modificadas (genéticamente) descritas aquí son útiles en diagnósticos y en terapia. En una de las realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una fosfatasa modificada de acuerdo con la invención. Ejemplos descritos por la invención:

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una fosfatasa alcalina aislada o recombinante que comprende un dominio de corona y un dominio catalítico y en la que dicho dominio de corona y dicho dominio catalítico se obtienen a partir de diferentes fosfatasas alcalinas o

una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una modificación en la secuencia de señalización de glucosilfosfatidilinositol (GPI) y en la que dicha modificación da como resultado una fosfatasa secretada o

una fosfatasa aislada o recombinante que comprende una mutación en las proximidades de un residuo catalítico;

o cualquier combinación de las mismas.

Dicha composición farmacéutica comprende opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica se puede presentar en cualquier forma, por ejemplo como una tableta, como un fluido inyectable o como un fluido de infusión, etc. Además, la fosfatasa (genéticamente modificada) se puede administrar a través de diferentes rutas, por ejemplo, por vía intravenosa, rectal , bronquialmente u oralmente. Otra vía de administración adecuada es el uso de un goteo duodenal.

En una realización preferida, la vía de administración usada es intravenosa. Está claro para la persona experta, que preferiblemente se administra una cantidad eficaz de una fosfatasa modificada (genéticamente). Como punto de partida se pueden usar 1-5000 U/kg/día. Si se usa la vía de administración intravenosa, se aplica preferiblemente una fosfatasa (genéticamente modificada) (al menos durante una cierta cantidad de tiempo) a través de una infusión continua.

Las composiciones pueden comprender opcionalmente excipientes, estabilizantes, activadores, vehículos, permeadores, propelentes, desinfectantes, diluyentes y conservantes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes adecuados son comúnmente conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden ser fácilmente encontrados y aplicados por el experto en la materia, referencias, por ejemplo, Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia PA, 17th ed. 1985.

Para la administración oral, el AP secretable puede, por ejemplo, administrarse en formas de dosificación sólidas, tales como cápsulas, tabletas (preferiblemente con un recubrimiento entérico) y polvos, o en formas de dosificación líquidas, tales como elíxires, jarabes, y suspensiones. La AP puede encapsularse en cápsulas de gelatina junto con ingredientes inactivos y vehículos en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina sódica, talco, carbonato de magnesio y similares. Ejemplos de ingredientes inactivos adicionales que se pueden añadir para proporcionar el color, sabor, estabilidad, capacidad reguladora, dispersión deseable u otras características deseables conocidas son óxido de hierro rojo, gel de sílice, lauril sulfato de sodio, dióxido de titanio, tinta blanca comestible y similares. Diluyentes similares se pueden usar para hacer tabletas comprimidas. Tanto las tabletas como las cápsulas se pueden fabricar como productos de liberación sostenida para proporcionar la liberación continua de medicamentos durante un período de horas. Las tabletas comprimidas pueden recubrirse con azúcar o recubrirse con una película para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger la tableta de la atmósfera, o recubrirse entéricamente para una desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosificación líquidas para la administración oral pueden contener colorantes y saborizantes para aumentar la aceptación del paciente.

En una realización preferida, las composiciones que comprenden una fuente de una fosfatasa modificada (genéticamente) son adecuadas para la administración oral y comprenden un revestimiento entérico para proteger a la AP de los efectos adversos de los jugos gástricos y el pH bajo. Las formulaciones de recubrimiento entérico y liberación controlada son bien conocidas en la técnica. Las composiciones de revestimiento entérico en la técnica pueden comprender una solución de un polímero de revestimiento entérico soluble en agua mezclado con el/los ingrediente(s) activo(s) tal como una fosfatasa (modificada genéticamente) y otros excipientes, que se dispersan en una solución acuosa y que pueden posteriormente secarse y/o conformarse en pellas. El revestimiento entérico formado ofrece resistencia al ataque de una fosfatasa modificada (genéticamente) por la humedad atmosférica y el oxígeno durante el almacenamiento y por los fluidos gástricos y bajo pH después de la ingestión, mientras se descompone fácilmente bajo las condiciones alcalinas que existen en el tracto intestinal inferior.

Las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente son muy útiles en el tratamiento de, por ejemplo, sepsis, enfermedad inflamatoria del intestino u otra enfermedad inflamatoria, y/o insuficiencia renal.

Por lo tanto, en otra realización, la invención proporciona una fosfatasa (genéticamente) modificada de acuerdo con la invención para uso como medicamento, preferiblemente para tratar sepsis, enfermedad inflamatoria del intestino, insuficiencia renal e inflamaciones preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en artritis reumatoide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, neurodermitis y enfermedades representadas en la Tabla 10.

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En aún otra realización, la invención proporciona el uso de una fosfatasa (modificada genéticamente) de acuerdo con la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de sepsis, enfermedad inflamatoria del intestino u otra enfermedad inflamatoria, y/o insuficiencia renal.

La sepsis se considera presente si la infección es altamente sospechada o está demostrada y se cumplen dos o más de los siguientes criterios del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS):

• Frecuencia cardíaca >90 latidos por minuto

• Temperatura corporal <36 (96.8°F) o >38°C (100.4°F)

• Hiperventilación (frecuencia respiratoria alta) >20 respiraciones por minuto o, en gasometría, una PaCO2 menor de 32 mm Hg

• Recuento de glóbulos blancos <4000 células/mm3 o >12000 células/mm3 (<4 x 109 o >12 x 109 células/L), o más del 10% en forma de banda (glóbulos blancos inmaduros).

Sin embargo, las definiciones de consenso continúan evolucionando con la última expansión de la lista de signos y síntomas de sepsis para reflejar la experiencia clínica de cabecera. Los subconjuntos más críticos de la sepsis son la sepsis grave (sepsis con disfunción orgánica aguda) y el choque séptico (sepsis con hipotensión arterial refractaria). Alternativamente, cuando se cumplen dos o más de los criterios del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica sin evidencia de infección, los pacientes pueden ser diagnosticados simplemente con "SIRS". Los pacientes con SIRS y disfunción orgánica aguda pueden denominarse "SIRS grave". Los pacientes se definen como con "sepsis grave" si tienen sepsis más signos de hipoperfusión sistémica, ya sea disfunción del órgano final o un lactato sérico mayor a 4 mmol/dL. Se define a los pacientes con choque séptico si tienen sepsis más hipotensión después de un bolo de fluido apropiado (típicamente 20 ml/kg de cristaloide). La invención proporciona la idea de que una fosfatasa (genéticamente modificada) de acuerdo con la invención es especialmente adecuada para el tratamiento de la sepsis. En el caso de la sepsis, una fosfatasa modificada (genéticamente) como se describe en este documento preferiblemente se administra por vía intravenosa.

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un grupo de afecciones inflamatorias del intestino grueso y, en algunos casos, del intestino delgado. Las principales formas de EII son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (CU). En muchos menos casos hay otras formas de EII: colitis colágena, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis por desviación, síndrome de Behget, colitis infecciosa, colitis indeterminada. La principal diferencia entre la enfermedad de Crohn y la CU es la ubicación y la naturaleza de los cambios inflamatorios en el intestino. La enfermedad de Crohn puede afectar cualquier parte del tracto gastrointestinal, desde la boca hasta el ano, aunque la mayoría de los casos comienzan en el íleon terminal. La colitis ulcerosa, en cambio, está restringida al colon y al ano. Microscópicamente, la colitis ulcerativa se restringe a la mucosa (revestimiento epitelial del intestino), mientras que la enfermedad de Crohn afecta toda la pared intestinal. Finalmente, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa se presentan con manifestaciones extraintestinales (como problemas hepáticos, artritis, manifestaciones de la piel y problemas oculares) en diferentes proporciones. En casos raros, los pacientes han sido diagnosticados tanto con la enfermedad de Crohn como con la colitis ulcerosa, aunque es incierto si es una combinación o simplemente no identificable como una u otra. Aunque las enfermedades son muy diferentes, ambas pueden presentarse con alguno de los siguientes síntomas: dolor abdominal, vómitos, diarrea, hematoquecia, pérdida de peso y diversas dolencias o enfermedades asociadas (artritis, pioderma gangrenoso, colangitis esclerosante primaria). El diagnóstico generalmente es por colonoscopia con biopsia de lesiones patológicas. En el caso de la EII, una fosfatasa (modificada genéticamente) como se describe en el presente documento se administra preferiblemente a través de una tableta con recubrimiento entérico o mediante goteo duodenal.

Junto al grupo de la enfermedad inflamatoria del intestino, la invención proporciona la idea de que una fosfatasa según la invención es adecuada para tratar otras enfermedades inflamatorias. Las enfermedades inflamatorias pueden afectar diversos órganos, como los pulmones, las articulaciones, el hígado, el páncreas, la piel o incluso el tejido nervioso. La Tabla 10 proporciona una lista no limitante de órganos que pueden ser afectados por la inflamación. Se ha demostrado que una amplia variedad de agentes etiológicos causa o mantiene tales enfermedades inflamatorias. Ejemplos no limitantes de dichos agentes etiológicos son microbios (bacterias, hongos, virus), alérgenos, autoinmunes, traumatismos e isquemia/reperfusión. Aunque el agente causal y la etiología pueden ser muy diversos, la inflamación (sub)crónica resulta de una reacción inmune alterada. Comúnmente se piensa que tal reacción inmune alterada se sostiene a través de una espiral viciosa que incluye daño tisular inducido por la inflamación que a su vez activa el sistema inmune. Entre otros, se ha demostrado que el ATP desempeña un papel en la espiral viciosa antes mencionada. La invención proporciona la idea de que una fosfatasa (modificada genéticamente) tal como se describe en el presente documento, es capaz de desfosforilar ATP y así romper dicha espiral viciosa, lo que es beneficioso para el individuo que padece dicha enfermedad inflamatoria. Cuando se trata una enfermedad inflamatoria de este tipo, una fosfatasa (genéticamente modificada) de acuerdo con la invención se administra preferiblemente por vía intravenosa o, si es factible localmente, por ejemplo. intraarticular en el caso de la artritis reumatoide, intratecal en el caso de la inflamación del sistema nervioso (central), intrabronquial en el caso de asma (alérgica) o tópica en el caso de, por ejemplo, neurodermitis. Además, se ha descrito que las reacciones

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inflamatorias (sub)crónicas, tales como la sepsis, la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoide y similares, están acompañadas por deficiencias de zinc (en suero). Una fosfatasa según la invención, en la que dicha fosfatasa no pierde su actividad enzimática cuando se proporciona en un entorno deficiente en zinc, es especialmente adecuada para tratar dichas enfermedades inflamatorias. La invención proporciona la idea de que una fosfatasa según la invención, en la que dicha fosfatasa comprende un dominio catalítico de ALPI y un dominio de corona de ALPP retiene su actividad a concentraciones subfisiológicas de Zn2+ tan bajas como 0.01 pM.

Por lo tanto, en una realización, la invención proporciona el uso de una fosfatasa que comprende un dominio catalítico de ALPI y un dominio de corona de ALPP para la desfosforilación de un sustrato, preferiblemente un fosfato de adenosina, en un ambiente que comprende una concentración de Zn2+ menor de 10 pM, preferiblemente una concentración de Zn2+ inferior a 1 pM, más preferiblemente una concentración de Zn2+ inferior a 0.1 pM.

La insuficiencia renal aguda (IRA) se define como una pérdida aguda de la función renal que da como resultado un aumento del nivel de creatinina sérica. En la insuficiencia renal aguda, la tasa de filtración glomerular disminuye durante días o semanas. Como resultado, se reduce la excreción de residuos nitrogenados y no se pueden mantener los equilibrios de fluidos y electrolitos. Los pacientes con insuficiencia renal aguda a menudo son asintomáticos y la afección se diagnostica por las elevaciones observadas del nitrógeno ureico en sangre (BUN) y los niveles séricos de creatinina. La parada renal completa está presente cuando el nivel de creatinina sérica aumenta en al menos 0.5 mg por dL por día y la producción de orina es menos de 400 mL por día (oliguria). Las fosfatasas modificadas (genéticamente) descritas aquí no solo pueden usarse en el tratamiento de la insuficiencia renal sino también para mejorar la función renal, especialmente en los casos en que la función renal está al menos en parte alterada/reducida. En una realización preferida, la vía de administración utilizada es intravenosa. Está claro para la persona experta, que preferiblemente se administra una cantidad eficaz de una fosfatasa modificada (genéticamente). Como punto de partida se pueden usar 1-5000 U/kg/día. Si se usa la vía de administración intravenosa, se aplica preferiblemente una fosfatasa (genéticamente modificada) (al menos durante una cierta cantidad de tiempo) a través de una infusión continua.

En aún otra realización, la invención se refiere a un método para tratar a un sujeto que padece sepsis, enfermedad inflamatoria del intestino u otra enfermedad inflamatoria, y/o insuficiencia renal que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las fosfatasas modificadas aquí descritas.

Además del hecho de que una fosfatasa (modificada genéticamente) como se describe en este documento puede incorporarse en una composición farmacéutica, dicha fosfatasa también puede ser parte de una composición nutricional.

En una realización preferida de la presente invención, la fuente de una fosfatasa (genéticamente) modificada de acuerdo con la invención es una fosfatasa (genéticamente) modificada que preferiblemente se produce o aísla de la leche, preferiblemente leche bovina. La leche puede obtenerse de animales que han sido criados o genéticamente modificados para producir niveles elevados de una fosfatasa modificada (genéticamente) en su leche, en comparación con los animales salvajes. La preparación de fracciones enriquecidas con fosfatasa (modificada genéticamente) a partir de leche es conocida en la técnica. Por ejemplo, la fracción enriquecida en la membrana del glóbulo de la grasa láctea es la fracción preferida de la leche enriquecida con fosfatasa (modificada genéticamente) y puede obtenerse de forma rutinaria mediante el desnatado convencional de la leche cruda. Una fosfatasa (modificada genéticamente) aislada de leche puede formularse en composiciones farmacéuticas y en composiciones alimenticias o en nutracéuticos.

En una realización preferida, una composición que contiene fosfatasa (genéticamente) modificada para la administración oral de una fosfatasa modificada (genéticamente) a la mucosa del tracto gastrointestinal de acuerdo con la presente invención es un producto alimenticio o nutracéutico enriquecido para una (genéticamente) modificada fosfatasa. En una realización, el producto alimenticio puede ser una planta, fruta o vegetal, opcionalmente modificado genéticamente para contener un nivel potenciado de una fosfatasa modificada (genéticamente). En otra realización, un producto alimenticio o nutracéutico que contiene fosfatasa (modificada genéticamente) es un producto lácteo. En particular, las preparaciones y composiciones que contienen leche no pasteurizada o fracciones de las mismas, preferiblemente leche bovina, contienen altos niveles de una fosfatasa modificada (genéticamente) y son particularmente adecuadas para administración oral como fuente de una fosfatasa (genéticamente) modificada de acuerdo con la presente invención.

La presente invención también se refiere a un método para la preparación de un producto lácteo enriquecido con fosfatasa (genéticamente) modificado, preferiblemente leche, una fracción de leche o producto lácteo. El método comprende el fraccionamiento de la leche cruda, preferiblemente leche bovina, la pasteurización de las fracciones que no contienen o no son ricas en una fosfatasa modificada genéticamente y la reformulación de dichas fracciones con las fracciones no pasteurizadas, modificadas genéticamente (fosfatasa modificada genéticamente), para obtener una menor perecedero y un producto lácteo enriquecido con fosfatasa (genéticamente) modificado. Las fracciones ricas en fosfatasa no modificadas genéticamente (no modificadas genéticamente) se pueden esterilizar por otros medios, tales como, entre otros, irradiación con rayos ultravioleta, rayos X o gamma, filtración, presión, presión osmótica, productos químicos o antibióticos, lo que garantiza que la una enzima fosfatasa (genéticamente

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modificada) permanece sustancialmente activa y que la fracción láctea se vuelve sustancialmente estéril. Este producto lácteo puede usarse en composiciones o administrarse directamente a sujetos que padecen o están en riesgo de desarrollar sepsis, IBD o insuficiencia renal. Sin embargo, un producto lácteo enriquecido con fosfatasa (genéticamente) modificado también se puede ofrecer a sujetos sanos como un producto farmacéutico o nutracéutico para la preservación de la integridad estructural intestinal.

Además, una fosfatasa modificada de la invención también se puede añadir a un nutriente (tal como leche) en lugar de producirse en dicho nutriente. Además, se pueden preparar tabletas y/o cápsulas que posteriormente se agregan a un nutriente o que pueden tomarse directamente por un ser humano.

La invención se explicará con más detalle en los siguientes ejemplos no limitativos.

Parte experimental

Materiales y métodos

Ejemplo 1

Desfosforilación del sustrato ATP biológicamente activo por diferentes fosfatasas

Kit ATPlite™ obtenido de Perkin Elmer que contiene los siguientes reactivos: solución de lisis de mamífero, solución de regulador de sustrato, solución de sustrato liofilizado y estándar de ATP liofilizado.

Preparación de estándar de ATP liofilizado: reconstituir un vial de solución estándar de ATP liofilizada con MiliQ de manera que se obtenga una solución madre de 10 mM. Después de la adición de MiliQ, se permite que el ATP se disuelva por completo rotando durante un minuto.

Determinación de la actividad de desfosforilación de ATP:

Se preparan 6 curvas estándar con una concentración inicial de 20 pM de ATP y se realiza una dilución en serie. El volumen final debe ser de 100 pl por pozo.

Se prepara una actividad de la enzima fosfatasa de 1 U/ml. Se preparan 3 curvas estándar con concentración de inicio de 1 U/ml y se realiza una dilución en serie. El volumen final debe ser de 50 pl.

Se prepara una solución de ATP 40 pM

Se agregan juntos 50 pl de la curva patrón de solución de enzima fosfatasa 1U/ml y 50 pl de la solución de ATP 40 pM en un Optiplate™ negro de 96 pozos (Perkin Elmer). El volumen final en cada pozo será de 100 pl.

Se agita la placa y se incuba por 90 minutos a 37°C.

Se permite que los reactivos se equilibren a temperatura ambiente

Se reconstituye un vial de solución de sustrato liofilizado agregando la cantidad adecuada de solución amortiguadora de sustrato, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se agita suavemente hasta que la solución sea homogénea.

Se añaden 50 pl de la solución de lisis de células de mamífero y se agita la placa durante 5 minutos a 700 rpm.

Se agregan 50 pl de la solución de sustrato al pozo y agita la placa durante 5 minutos a 700 rpm.

Se eliminan las burbujas de aire asperjando alcohol al 70% sobre la placa.

Se adapta la placa en la oscuridad durante 10 minutos y se mide la luminiscencia en el lector de etiquetas múltiples Viktor3™ (Perkin Elmer)

Ejemplo 2

Ensayo de sección hepática usando diferentes isoformas de fosfatasa alcalina

Se sacrificaron ratas bajo anestesia con O2/N2O/Foreno y se extrajeron los hígados y se almacenaron en la solución de preservación de órganos (UW) de la Universidad de Wisconsin hasta la preparación de la sección. Los núcleos (diámetro, 5 mm) se hicieron a partir de los trozos de tejido hepático y se almacenaron en solución UW enfriada en hielo hasta el corte. El corte se realizó con una máquina de cortar Krumdieck. Se usó KHB helado complementado con glucosa hasta una concentración final de 25 mM como regulador de corte. Se prepararon secciones de hígado

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de rata (grosor, 200-250 |jm, peso húmedo, ±3 mg) con ajustes estándar (velocidad del ciclo, 30, modo interrumpido). Después de seccionar, las secciones de hígado de rata se almacenaron en solución UW hasta el inicio del experimento.

Se incubaron las secciones individualmente a 37°C en placas de 12 pozos (Greiner, Alphen a/d Rijn, Países Bajos) en 1.3 ml de medio Williams suplementado con Glutamax I (Gibco BRL, Paisly), Escocia). Se agregó gentamicina de 50 mg/ml (Gibco BRL) y saturada con 95% de O2/5% de CO2. Las secciones se incubaron durante 24 horas con o sin LPS de 10 jg/ml y con o sin isoformas diferentes de AP en diferentes concentraciones. El medio de las secciones se almacenó a -80°C hasta la medición de NOx.

Se midió NOx (la suma de NO, NO2 y NO3) añadiendo 5 jl de una mezcla de 0.275 jl de NADPH 100 mM, 2,2 jl de nitrato reductasa 10 U/ml y 0.055 jl de FAD 10 mM, que se diluyó 2 veces en agua, a 110 jl de sobrenadante. Después de 30 minutos de incubación a 37°C, se agregaron 5 jl de una segunda mezcla; se añadieron 2.2 jl Na- piruvato 0.5 M y 0.55 jl de LDH 5 mg/ml, diluido 1:0.82 en agua. Después de 5 minutos de incubación a 37°C, se añadieron 5 jl de ZnSO4 al 30% y las muestras se centrifugaron a 2000 rpm. Luego se transfirieron 100 jl del sobrenadante a una placa nueva y se mezclaron con 100 jl de reactive de Griess que contenía 0.1% de sulfanilamida, 0.01% de n-Naftiletilendiamina y 2.5% de ácido fosfórico. Finalmente, la absorbancia se midió a 550 nm en un lector de microplacas. La absorbancia estaba relacionada con la absorbancia de una curva estándar de nitrato de sodio.

Ejemplo 3

Efecto biológico de la desfosforilación de ATP extracelular

Se obtuvieron la línea celular de macrófagos murinos RAW264.7 y líneas celulares epiteliales humanas T84 (carcinoma colorrectal) de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, Estados Unidos) y se mantuvieron en medio DMEM/F12 (1:1) y dMeM que contenía 4.5 g/l de glucosa, respectivamente. Ambos medios se obtuvieron de Invitrogen Corp. (Breda, Países Bajos), contenían Glutamax I y se suplementaron con FBS al 10% activado por calor (Wisent Inc. (Quebec, Canadá), 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina (ambos de Invitrogen Corp.). La línea celular T84 se subcultivó en la confluencia mediante el uso de tripsina-EDTA, las células RAW264.7 se rasparon usando un policía de caucho.

Se sembraron en placa 4x105 células T84 en placas de 12 pozos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 2 ml de medio. Al alcanzar la confluencia, el medio se renovó y las células se incubaron con (Figura 3) sin (Figura 2) 1 jg/ml de LPS durante 2 horas en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de ATP y/o AP como se muestra en las Figuras (tablero de ajedrez). Después de 2 horas, el sobrenadante se recogió y se transfirió a placas de 24 pozos que contenían células RAW264.7. Estas células RAW264.7 se sembraron el día anterior en placas de 24 pozos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a una densidad de 2x105 en un ml de medio. Antes de la transferencia de 1 ml de los sobrenadantes de las células T84, el sobrenadante del RAW se aspiró y descartó.

Las células RAW se incubaron con los sobrenadantes de T84 durante 24 horas a 37°C con 5% de CO2, antes de recoger los sobrenadantes y comprobar el contenido de quitocina (IL-6, TNFa) usando un ELISA comercial disponible (Biosource Europe SE , Nivelles, Bélgica).

Ejemplo 4

Preparación de mutantes

Los mutantes como se describen en la presente invención y más específicamente, los mutantes que se describen en las Tablas 4, 5 y 6 se prepararon usando técnicas de biología molecular convencionales.

Las posiciones de aminoácidos que se mencionan en las Tablas 4 a 6 corresponden a las secuencias como se representa en la Figura 1. Solo se indican las posiciones mutadas, es decir, solo se dan las desviaciones de las secuencias de tipo salvaje. Por ejemplo, el mutante 1 de la Tabla 4 es, si se compara con la secuencia de tipo silvestre dada, sin cambios en las posiciones 87, 93 y 429, es decir, la posición 87 es una K, la posición 93 es una G y la posición 429 es una E.

Los mutantes se prepararán y comprobarán mediante técnicas estándar de biología molecular, tales como mutagénesis dirigida a sitios de PCR, análisis de enzimas de restricción y análisis de secuencias.

Ejemplo 5

En t=0 diferentes fosfatasas alcalinas recombinantes que contienen 450±50 Unidades se diluyeron 4000x en regulador diluyente (glicina/NaOH 0.025 M, pH 9.6/MgCl2 1 mM/manitol al 1%/BSA al 0.05%) con diferentes concentraciones de Zn2+. En un segundo ejemplo, se omitió BSA como posible fuente de Zn2+ del. Dentro de 1 minuto después de la dilución (T=0), se tomó una muestra y se midió la actividad de fosfatasa alcalina usando el

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ensayo de pNPP descrito a continuación. 90 minutos (T=11^ h), 180 minutos (T=3 h) y 22 horas (T=22 h) más tarde, cada vez que se tomó una muestra y se midió directamente la actividad de fosfatasa alcalina utilizando el ensayo pNPP como se describe a continuación. La actividad en U/ml se volvió a calcular mediante la actividad específica (U/mg) dividiendo el resultado obtenido en U/ml a través del contenido de proteína previamente obtenido usando un kit de BCA comercialmente disponible (Pierce).

Medición de la actividad de la fosfatasa pNPP:

Sustrato de trabajo:

La temperatura de los reactivos, sustratos, muestras y la cámara de incubación se ajustaron a 25°C. El espectrofotómetro se ajustó a una longitud de onda de 405 nm y la trayectoria de la luz fue de 1 cm.

En una cubeta desechable, se pipetearon 50 pl de la sustancia de prueba y 1450 pl del sustrato de trabajo, se mezcló e inmediatamente se colocó la cubeta en el espectrofotómetro y se registró el aumento de la absorbancia a 405 nm durante 3 minutos.

La actividad por volumen se calculó usando la siguiente ecuación:

Actividad (U/ml) = AE405/min x 1.6 x factor de dilución Nota: el rango de medición debe estar entre 0.04 y 0.4 U/ml Ejemplo 6

Efecto del pH en la estabilidad de diferentes fosfatasas.

Se investigó la estabilidad del pH de las fosfatasas alcalinas expresadas transitoriamente en células HEK293. Se analizó un rango de pH de 4.0-9.0 utilizando 5 diferentes reguladores 0.1M (acetato de sodio, MES (ácido 2-(N- morfolino)etanosulfónico), ácido MOPS (3-N-morfolino)propanosulfónico), Tris(2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3- diol) y glicina) ajustados en su pH específico a 25°C. Se usó BiAP estabilizado con 1% de manitol como referencia. Las soluciones de fosfatasa alcalina se diluyeron en los reguladores respectivos hasta aproximadamente 100 U/ml, se almacenaron durante 24 h a temperatura ambiente y se determinó la actividad enzimática usando el ensayo de actividad de fosfatasa de pNPP como se describió anteriormente.

Ejemplo 7

Efecto del zinc en la expresión de las diferentes fosfatasas.

Se investigó la influencia de diferentes sales de zinc sobre la actividad de fosfatasas alcalinas expresadas transitoriamente en células HEK293 usando transfecciones a pequeña escala en medio de cultivo suplementado con MgCl2 1 mM + sal de Zinc 0.1 mM (ZnCl2 o ZnSO4 o ZnAc2). Las células HEK293 se transfectaron con shIAP, shPLAP, Xinplap (ALPIcat/ALPPcorona) y sALPP-ALPI-CD (catALPP/coronaALPI) y en t=144 h se tomaron muestras y se analizaron para determinar su actividad enzimática utilizando el ensayo de actividad de fosfatasa pNPP como se describió anteriormente.

Ejemplo 8

Efecto del zinc en la estabilidad de las diferentes fosfatasas.

Se prepararon soluciones que contenían aproximadamente 20 U/ml de diferentes isoformas (recombinantes) de fosfatasa alcalina en presencia o ausencia de 100 pM de ZnCl2 para la prueba de estabilidad de la temperatura. Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente, 37°C y 56°C y se determinó la actividad enzimática (pNPP) a t=0, 2 h y 24 h usando el ensayo de actividad de fosfatasa de pNPP como se describe anteriormente.

Ejemplo 9

Generación de proteínas de fusión y mutantes de fosfatasa alcalina.

Para seleccionar un sistema de expresión adecuado, el ADNc del intestino humano (hIAP) y de la placenta humana (hPLAP), que codifica las proteínas maduras, con o sin la secuencia de anclaje de GPI, se clonaron en varios vectores. Después de infecciones a pequeña escala, el vector de expresión utilizado fue dirigido por CMV, contenía la secuencia de señalización de cistatina y albergaba la etiqueta HIS N-terminal para facilitar la purificación. Después de expresar con éxito tanto hIAP como hPLAP secretables, se construyeron dos fosfatasas alcalinas secretables humanas de fusión en silico, una basada en la estructura de AP intestinal que contiene el dominio de corona de placenta (aa 360-430 de la secuencia madura) y la segunda basada en la estructura de la AP placentaria con el

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dominio de corona de la AP intestinal (la primera se denomina RecAP o ALPIcat/ALPPcorona y la segunda se denomina shPLAP-shIAP-CD o catALPP/coronaALPI). Los dos genes se sintetizaron conteniendo la secuencia de señalización de cistatina humana y se clonaron en el vector de expresión que contenía el promotor de CMV.

Ejemplo 10

Efecto del ancla GPI sobre la actividad específica de la fosfatasa

Se produjeron varias formas recombinantes de AP, se purificaron y se evaluaron para determinar la actividad enzimática usando el ensayo de actividad de fosfatasa de pNPP como se describió anteriormente. Además, la cantidad de proteína en las muestras se midió usando SDS-PAGE y el software GelEval. La actividad específica se calculó dividiendo la actividad (U/ml) por la concentración de proteína (mg/ml) y se expresó como U/mg.

Parte experimental

Resultados

Ejemplo 1

Desfosforilación del sustrato de ATP biológicamente activo por diferentes fosfatasas

Se incubó ATP a una concentración final de 20 pM con diferentes concentraciones de BIAP, sALPP, sALPI o la quimera ALPIcat/ALPPcorona. De la Tabla 9, es obvio que la actividad química de pNPP no está relacionada con la actividad hacia un sustrato biológico 1:1, por ejemplo ATP. Mientras BIAP y sALPI muestran más del 50% de desfosforilación de ATP después de 90 minutos a 37°C a concentraciones de pNPP de 0.031 y 0.004 unidades, respectivamente, ALPP y catALPP/ALPPcorona solo pueden desfosforilar esta cantidad en concentraciones de unidades de pNPP de 0.125 y 0.0625, respectivamente.

Ejemplo 2

Ensayo de corte hepático usando diferentes isoformas de fosfatasa alcalina

Tras la estimulación con LPS (10 pg/ml), las secciones de hígado producen NOx. La Figura 6 muestra que en presencia de diferentes fosfatasas alcalinas humanas recombinantes (sALPI, sALPP, ALPI ancladas a GPI, ALPIcat/ALPPcorona) a diferentes concentraciones, la producción de NOx se inhibió significativamente. En este experimento, se utilizó ALPI derivado de bovino como control positivo y disolvente como control negativo.

Sin la adición de LPS, la producción de NOx por las secciones de hígado fue menor que 10 pM y no se alteró significativamente por la presencia de las diferentes fosfatasas durante la incubación (datos no mostrados). A partir de esto, se concluye que todas las isoformas recombinantes ensayadas de fosfatasas alcalinas humanas, independientemente de la presencia de un anclaje de GPI, tienen actividad hacia un sustrato biológico que está implicado en la producción de NOx inducida por lPs.

Ejemplo 3

Efecto biológico de la desfosforilación de ATP extracelular

La producción de IL-6 por células RAW264.7 tras la incubación con sobrenadante de T84 fue dependiente de LPS. Sin LPS (Figura 2), se produjeron niveles bajos de IL-6. El ATP y la AP no pueden alterar los niveles de IL-6 producidos por las células RAW264.7. Por el contrario, cuando estaba presente LPS, la producción de IL-6 por RAW264.7 incubado con sobrenadante de T84 aumentaba con concentraciones crecientes de ATP. Este aumento en la producción de citoquinas por el ATP podría verse completamente disminuido por concentraciones de AP de 0.1 U/ml y superiores (Figura 3).

Se obtuvieron resultados similares (no mostrados) para TNFa usando el mismo protocolo y para TNFa e IL-6 usando HT29 en lugar de T84 como fuente de células epiteliales.

Se concluye que AP desfosforila el ATP y por lo tanto disminuye su efecto potenciador de LPS. Es poco probable que AP desfosforile LPS ya que no se observó ningún efecto de AP en LPS. La combinación de ATP y LPS solo podría reducirse mediante AP a niveles iguales a LPS solo.

Ejemplo 5

Determinación de la dependencia de Zn2+ de diferentes fosfatasas

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Como se representa en la Figura 4 y la Tabla 7, el Zn2+ estabilizó significativamente la actividad específica de sALPI, mientras que sALPP y la quimera ALPIcat/ALPPcorona conservaron su actividad específica inicial independiente de la presencia de Zn2+ en el medio. En este experimento, el BSA, utilizado de forma rutinaria en el ensayo de actividad de fosfatasa pNPP, puede ser una fuente de trazas de Zn2+. Por lo tanto, se realizó un segundo experimento. La Tabla 8 y la Figura 5 muestran que en ausencia de BSA y en presencia de EDTA quelante con pérdida de Zn2+, todas las isoformas pierden su actividad específica después de 22 h. Sin embargo, la adición de concentraciones fisiológicas (0.5-10 nM) de Zn2+ durante el almacenamiento y durante la reacción conservaron más de 60, respectivamente, el 75% de la actividad específica inicial de sALPP y ALPIcat/ALPPcorona, mientras que se perdió más del 95% de la actividad específica inicial de sALPI. Fueron necesarias concentraciones no fisiológicamente altas de Zn2+ para preservar la actividad específica de sALPI.

Por lo tanto, se concluye que la quimera ALPIcat/ALPPcorona muestra una actividad específica alta, comparable con la de sALPI, combinada con actividad específica independiente de Zn2+, comparable con la de sALPP. Se concluye que la dependencia de Zn2+ se encuentra en el dominio de corona sALPI, mientras que la actividad específica alta se encuentra en el dominio catalítico sALPI.

Ejemplo 6

Efecto del pH en la estabilidad de diferentes fosfatasas.

Se diluyeron BiAP, shIAP, shPLAP, RecAP y se almacenaron en 0.1 M (acetato de sodio, MES (ácido 2-(N- morfolino)etanosulfónico), ácido MOPS (3-N-morfolino)propanosulfónico), Tris (2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3- diol) y glicina) reguladores con valores de pH de 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 y 9.0 a temperatura ambiente durante 24 h. Para cada valor de pH, la actividad enzimática inicial y la actividad enzimática después del almacenamiento se determinaron de acuerdo con el ensayo de pNPP estándar. Como se esperaba y lo indica su nombre, la actividad de la fosfatasa alcalina es óptima en el rango de pH alto (ambiente alcalino). Sin embargo, como muestra la Figura 7, el tipo de placenta es más estable que las isoformas intestinales. Además, los resultados demuestran que esta estabilidad, especialmente en el rango de pH alto, está determinada por el dominio de corona y no por el dominio catalítico, ya que ALPIcat/ALPPcorona (recAP) sigue el perfil de estabilidad de la shPLAP y es estable entre pH 5-9, mientras que la estabilidad de BIAP y shIAP está restringida a pH 7-8. Por el contrario, catALPP/coronaALPI (shPLAP-hIAP-CD) es menos estable que el tipo placentario AP y ALPIcat/ALPPcorona a pH 9. Esto demuestra que ALPIcat/ALPPcorona conserva su actividad en un rango mucho más amplio de valores de pH que las AP nativas o la quimera inversa (catALPP/coronaALPI) probadas.

Ejemplo 7

Efecto del zinc en la expresión de diferentes fosfatasas.

Usando transfecciones a pequeña escala en células HEK293, se investigó la influencia de diferentes sales de zinc sobre la actividad de las fosfatasas alcalinas expresadas transitoriamente. Para ello, se transfectaron shIAP, shPLAP, Xinplap (ALPIcat/ALPPcorona) y sALPP-ALPI-CD (catALPP/coronaALPI) y en t=144 h se tomaron muestras y se analizaron para determinar la actividad enzimática. Los resultados obtenidos revelaron que había una dependencia de la concentración de iones Zn2+ con respecto a la actividad enzimática, pero que el aumento de la actividad observada era independiente para el tipo de sal de zinc utilizada.

De los resultados presentados en la figura 8 se concluye que la actividad enzimática obtenida depende del zinc, pero que es independiente del tipo de sal de zinc que se use. Además, se demostró que la adición de zinc es más favorable para la producción de shIAP con un factor de inducción para actividad enzimática de >30. Para sALPP y Xinplap, la mejora de la actividad fue <2 y >4, respectivamente. La quimera inversa (sALPP-ALPI-CD, también llamada ALPPcat/ALPIcorona) mostró una actividad insignificante si se producía en ausencia de zinc, mientras que obtenía una actividad comparable con sALPP en presencia de zinc.

Además, Xinplap mostró una actividad enzimática mucho más alta sin la adición de iones de Zn/Mg que cualquiera de las otras AP analizadas (factor 5) y es menos dependiente de Zn/Mg en comparación con shIAP o la quimera inversa, ALPPcat/ALPIcorona.

Ejemplo 8

Efecto del zinc en la estabilidad de las diferentes fosfatasas.

La Figura 9 muestra el perfil de estabilidad de diferentes AP en el tiempo a diferentes temperaturas y en presencia o ausencia de 100 pM de ZnCl2. De los resultados se deduce que, en ausencia de zinc, las isoformas intestinales (sALPI y BIAP) de la fosfatasa alcalina son altamente sensibles a la temperatura con respecto a la actividad de la enzima. A 37° C, la BIAP perdió el 20% de su actividad en 2 horas y después de 24 h solo queda un 20% de actividad enzimática. shIAP muestra una disminución en la actividad del 30% después de 24 horas de almacenamiento a 37°C. La Figura 9C muestra que la presencia de zinc durante la prueba de estabilidad a 37°C

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protege la enzima de la degradación. Sin embargo, a 56°C, el zinc ya no protege las isoformas intestinales y ambos pierden su actividad enzimática casi por completo en las primeras 2 horas. Por el contrario, RecAP (ALPIcat/ALPPcorona) y shPLAP (sALPP) muestran una excelente estabilidad en presencia o ausencia de 100 pM hasta 22 horas, incluso a 56° C.

Ejemplo 9

Generación de proteínas de fusión y mutantes de fosfatasa alcalina.

La hIAP secretable y la hPLAP secretable se expresaron en HEK293 usando un vector que contiene la secuencia de señal de cistatina dirigida por un promotor cMv y que contenía una etiqueta HIS en la parte N-terminal de la proteína. Las proteínas expresadas se purificaron a través de la etiqueta HIS y se analizaron mediante SDS PAGE (ver figura 10). El rendimiento de proteína a partir de 1 litro de cultivo en suspensión para hIAP y hPLAP secretables fue de 38 y 16 mg, respectivamente, y mostró una pureza >95%. La actividad específica de hlAP y hPLAP fue 21 y 100 U/mg, respectivamente.

Con base en estas dos fosfatasas recombinantes secretables, se diseñaron dos variantes de intercambio de dominio in silico, y se expresaron en células HEK293. Se obtuvo un resultado notable para RecAP, que consiste en un esqueleto de fosfatasa alcalina intestinal con el dominio de corona de la fosfatasa alcalina placentaria. RecAP mostró una actividad enzimática cinco veces mayor en comparación con hIAP secretable (14 U/ml frente a 2.7 U/ml) en condiciones de cultivo convencionales. Sin embargo, la adición de sal de zinc hasta 100 pM durante el cultivo celular y la expresión de fosfatasa tiene una influencia menor sobre la actividad enzimática de RecAP (18.8 U/ml frente a 14.0 U.ml sin adición de zinc), mientras que mejora significativamente la actividad de hIAP secretable (37.9 U/ml frente a 2.7 U.ml sin adición de zinc). La variante de cambio de dominio basada en el esqueleto de AP placentaria con el dominio de corona de AP intestinal (catALPP/coronaALPI) por otro lado, muestra una dependencia del zinc comparable con la forma intestinal y una actividad máxima comparable con el PLAP secretable. El aumento observado en la actividad de shIAP y catALPP/coronaALPI no se pudo lograr si se añadió zinc a la enzima después de la expresión y la purificación. Por lo tanto, se concluye que la adición de 100 pM de zinc durante la expresión de fosfatasas alcalinas, preferiblemente aquellas que comprenden un dominio de corona de la forma intestinal, da como resultado un mayor rendimiento de actividad de fosfatasa alcalina.

Ejemplo 10

Efecto del ancla GPI sobre la actividad específica de la fosfatasa

Se produjeron varias formas recombinantes de AP y se evaluó su actividad enzimática. Los resultados presentados en la Figura 11 demuestran que la fosfatasa alcalina intestinal bovina (BIAP) y el recAP (ALPIcat/ALPPcorona) muestran una actividad específica similar que es superior a la de la hIAP secretable, la hPLAP secretable y la hIAP anclada a GPI. La pureza de la enzima es importante para la actividad enzimática específica. Por lo tanto, debe observarse que las cuatro enzimas humanas se purificaron en un laboratorio, mientras que la BIAP se obtuvo como un lote de GMP ultrapuro. Además, debe tenerse en cuenta que la hIAP secretable tiene una actividad específica que es aproximadamente 2 veces mayor que la de la hIAP anclada a GPI. Sin limitarse a la teoría, la mayor actividad específica puede estar relacionada estructuralmente o relacionada con la pureza, ya que el AP secretable se purifica más fácilmente que el AP anclado a GPI (unido a membrana).

Tablas

Tabla 1: Niveles de expresión de HEK293 (U/ml) de fosfatasas alcalinas después de t=144 h y el efecto sobre la actividad después de la incubación durante la noche con ZnCh 0.1 mM

Constructo

Unidades/ml Unidades/ml después de o/n con 0.1mM de ZnCl2

Etiqueta sALPP N-his

3.34 3.55

Etiqueta sALPP C-his

3.75 3.97

Etiqueta sALPI N-his

1.55 1.92

Etiqueta sALPI C-his

7.52 8.07

sALPI nativa

2.84 4.94

Tabla 2: Niveles de expresión de HEK 293 (U/ml) de fosfatasas alcalinas después de t=144 h y el efecto sobre la actividad de diferentes concentraciones de ZnCl2 y/o MgCh en medio de cultivo

Actividad enzimática en unidades/ml

Constructo

Sin adición 0.05mM Zn2+ 0.1mM Zn2+ 1mM Mg2+ 5mM Mg2+ 0.1mM Zn2+/1mM Mg2+

sALPI

2.2 55.8 56.6 6.4 5.9 61.3

sALPP

6.8 8.7 8.9 6.1 5.4 7.7

Tabla 3: Niveles de expresión de HEK 293 (U/ml) de fosfatasas alcalinas quiméricas después de t=96 h y el efecto sobre la actividad de ZnCl2 en medio de cultivo

Actividad enzimática en unidades/ml

Constructo

Sin adición 0.1mM Zn2+/1mM Mg2+

ALPIcat/ALPPcorona

3.72 2.43

Tabla 4: Sitios de mutaciones en ALPP con cambios de aminoácidos propuestos

Posición en ALPP maduro

Nombre

44 87 93 429 Nombre Alternativo

wt

M K G E -

mut 1

L M44L

mut 2

R K87R

mut 3

A G93A

mut 4

S E429S

mut 5

L R M44L, K87R

mut 6

L A M44L,G93A

mut 7

L S M44L, E429S

mut 8

R A K87R, G93A

mut 9

R S K87R, E429S

mut 10

A S G93A, E429S

mut 11

L R A M44L, K87R, G93A

mut 12

L R S M44L, K87R, E429S

mut 13

L A S M44L, G93A, E429S

mut 14

R A S K87R, G93A, E429S

mut 15

L R A S M44L, K87R, G93A, E429S

10

Tabla 5: Sitios de mutación en ALPI con cambios de aminoácidos propuestos

Posición en ALPP maduro

Nombre

44 87 93 429 Nombre Alternativo

wt

L R A S -

mut 16

M L44M

mut 17

K R87K

Posición en ALPP maduro

mut 18

G A93G

mut 19

E S429E

mut 20

M K L44M, R87K

mut 21

M G L44M, A93G

mut 22

M E L44M, S429E

mut 23

K G R87K,A93G

mut 24

K E R87K,S429E

mut 25

G E A93G,S429E

mut 26

M K G L44M, R87K, A93G

mut 27

M K E L44M, R87K, S429E

mut 28

M G E L44M, A93G, S429E

mut 29

K G E R87K, A93G, S429E

mut 30

M K G E L44M, R87K, A93G, S429E

Tabla 6: Mutaciones dobles propuestas en ALPP y ALPI en las proximidades del sitio activo

Mutantes adicionales

mut 31

ALPP S322G, R323V

mut 32

ALPI G322S, V323R

5 Tabla 7: sALPI, pero no sALPP y la quimera ALPIcat/ALPPcorona es dependiente de Zn2 para retener su actividad específica in vitro.

sALPP

—1 II O T= 1/ h T= 3 h T= 22 h

Zn2+ 0a |jM

122 103 105 100

Zn2+ 10 jM

162 123 117 110

Zn2+100 jM

131 128 150 132

Zn2+ 1000 jM

126 135 125 114

sALPI

—1 II O T= 1/ h T= 3 h T= 22 h

Zn2+0 jM

650 500 413 116

Zn2+10 jM

717 648 953 746

Zn2+100 jM

785 733 868 750

Zn2+ 1000 jM

752 762 770 989

ALPIcat/ALPPcorona

—1 II O T= 1/ h T= 3 h T= 22 h

Zn2+ 0 jM

426 407 455 429

Zn2+10 jM

443 500 479 462

Zn2+100 jM

543 560 456 442

Zn2+ 1000 jM

452 452 441 465

a Sin adición de sal de Zn, sin embargo, el ensayo se realizó en presencia de albúmina (0.05%), que tal vez sea una fuente natural de zinc; véase la sección de resultados.

Tabla 8: La actividad específica de sALPI disminuye en más de 95% después de 22 h a concentraciones fisiológicas (0.01 |jM) de Zn2+ en ausencia de albúmina, mientras que sALPP y la quimera ALPIcat/ALPPcorona retienen más de 60, respectivamente 75% de su actividad inicial específica bajo las mismas condiciones.

sALPP

—1 II O T= 1/ h T= 3 h T= 22 h

0 Zn + EDTA100 mM

29 0 0 0

Zn2+ 0.01 |jM

123 74 76 78

Zn2+10 jM

131 94 88 92

Zn2+ 1000 jM

118 6 6 3

sALPI

—1 II O T= 1/ h T= 3 h T= 22 h

0 Zn + EDTA100 mM

290 4 10 0

Zn2+ 0.01 jM

693 384 211 31

Zn2+10 jM

785 541 386 324

Zn2+ 1000 jM

737 505 382 232

ALPIcat/ALPPcorona

—1 II O T= 1/ h T= 3 h T= 22 h

0 Zn + EDTA100 mM

161 8 5 0

Zn2+ 0.01 jM

330 374 316 252

Zn2+10 jM

543 386 315 266

Zn2+ 1000 jM

531 306 299 196

Tabla 9: Propiedades de desfosforilación de diferentes fosfatasas alcalinas hacia el sustrato biológico ATP

Curva estándar

Unidades pNPP BiAP sALPP sALPI ALPIcat/ALPPcorona

ATP (jM)

LFI LFI ATP (jM) LFI ATP (jM) LFI ATP (jM) LFI

ATP (jM)

20.000

38845 0.5000 761 0.25 2273 1.01 213 0 530 0.13

10.000

20978 0.2500 390 0.06 7490 3.67 18 0 2366 1.06

5.000

10902 0.1250 1481 0.61 13633 6.79 24 0 7650 3.75

2.500

5714 0.0625 4893 2.35 21124 10.60 286 0.00 15642 7.81

1.250

2811 0.0313 11008 5.46 24450 12.29 707 0.22 22061 11.07

0.625

1422 0.0156 20401 10.23 31233 15.74 3762 1.77 30911 15.57

0.313

656 0.0078 24100 12.11 32382 16.32 9431 4.65 34178 17.23

0.156

342 0.0039 30479 15.35 37546 18.95 16197 8.09 37735 19.04

0.078

163 0.0020 36232 18.28 38418 19.39 22571 11.33 39841 20.11

0.039

80 0.0010 34902 17.60 40772 20.59 21065 10.57 40324 20.36

0.020

40 0.0005 39927 20.16 37848 19.10 34216 17.25 41683 21.05

Curva estándar

Unidades pNPP BiAP sALPP sALPI ALPIcat/ALPPcorona

ATP (|jM)

LFI LFI ATP (JM) LFI ATP (JM) LFI ATP (JM) LFI ATP (jM)

0.000

4 0 41929 21.17 41299 20.85 41242 20.83 40177 20.28

coeficiente corr. = 0.9981

ecuación: y=1967.1x + 275.9

Tabla 10

Lista no limitante de enfermedades inflamatorias y órganos afectados

Inflamación

Parte del cuerpo

Apendicitis

Apéndice

Arteritis

Arterias

Artritis

Articulación

Blefaritis

Párpados

Bronquiolitis

Bronquiolos

Bronquitis

Bronquios

Bursitis

Bursa

Cervicitis

Cérvix

Colangitis

Conducto biliar

Colecistitis

Vesícula biliar

Corioamnionitis

corion y amnion (saco amniótico

Colitis

Colon

Conjuntivits

Conjuntiva

Cistitis

Vejiga

dacrioadenitis

Glándula lacrimal

Dermatitis

Piel

Dermatomiositis

Piel y músculos

Encepalitos

Cerebro

Endocarditis

Endocardio

Endometritis

Endometrio

Inflamación

Parte del cuerpo

Enteritis

Intestino delgado

Enterocolitis

Intestino delgado e Intestino grueso

Epicondilitis

Epicóndilo

Epididimitis

Epidídimo

Fascitis

Fascia

Fibrositis

Tejido fibroso conectivo

Gastritis

Estómago

Gastroenteritis

Estómago e intestino delgado

Gingivitis

Gíngiva

Glositis

Lengua

Hepatitis

Hígado

Hidradenitis supurativa

Glándula sudorípara apocrina

Ileitis

Íleon

Iritis

Iris

Laringitis

Laringe

Mastitis

Glándula mamaria

Meningitis

Meninges

Mielitis

médula espinal

Miocarditis

Miocardio

Miositis

Músculo

Nefritis

Riñón

Onfalitis

Cordón umbilical

Ooforitis

Ovarios

Orquitis

Testículo

Osteítis

Hueso

Otitis

Oído

Pancreatitis

Páncreas

Parotitis

Glándula parótida

Inflamación

Parte del cuerpo

Pericarditis

Pericardio

Peritonitis

Peritoneo

Faringitis

Faringe

Pleuritis

Pleura

Flebitis

Venas

Neumonitis

Pulmones (también neumonía)

Proctitis

Recto

Prostatitis

Próstata

pielonefritis

Riñón

Rinitis

revestimiento nasal

Salpingitis

trompas de Falopio

Sinusitis

Seno del cráneo

Estomatitis

Boca

Sinovitis

Membrana sinovial

Tendinitis

Tendón

Amigdalitis

Amígdalas

Uveitis

Uvea

Uretritis

Uretra

Vaginitis

Mucosa vaginal

Vasculitis

Vasos sanguíneos y vasos linfáticos

Vulvitis

Vulva

Descripción de las figuras

Figura 1 5

Secuencias de las cuatro isoenzimas de fosfatasa alcalina humana. Nota: estas son las secuencias de las proteínas maduras (es decir, sin secuencia señalización) pero antes de la adición del ancla de GPI y el procesamiento concomitante de los aminoácidos C-terminales con la excepción de las AP quiméricas

10 Figura 2

TP solo no es suficiente para estimular la producción de IL-6 en células RAW tras la incubación con sobrenadante de T84. No se observa ningún efecto sobre la producción de IL-6 al agregar AP

5

10

15

20

25

30

35

40

45

El aumento de las concentraciones de ATP amplifica la producción de IL-6 inducida por LPS en células RAW tras la incubación con sobrenadante de T84. La fosfatasa alcalina inhibe el efecto amplificador del ATP, pero no la producción de IL-6 inducida por LPS.

Figura 4

La actividad específica de ALPIcat/ALPPcorona es independiente de Zn Figura 5

La actividad específica de ALPI pero no ALPIcat/ALPPcorona disminuye en el tiempo Figura 6

La producción de NOx inducida por LPS por cortes de hígado es inhibida por diferentes isoformas secretables de fosfatasa alcalina humana

Figura 7

actividades enzimáticas relativas de diferentes fosfatasas alcalinas recombinantes humanas secretables y fosfatasa intestinal bovina (BIAP) almacenadas durante 24 h en reguladores 01.M de diferentes valores de pH.

Figura 8

Influencia de diferentes sales de zinc añadidas al medio de cultivo durante la producción de diferentes fosfatasas alcalinas recombinantes en la actividad enzimática.

Figura 9

Estabilidad de la actividad enzimática de diferentes fosfatasas alcalinas determinadas después del almacenamiento en presencia de zinc a: A temperatura ambiente, C 37°C y E 56°C o en ausencia de zinc a B temperatura ambiente, D 37°C y F 56°C

Figura 10

SDS-PAGE: perfil de proteína de hIAP secretable purificada y hPLAP secretable. Carril 1) marcador MW, 4+5) hIAP secretable l0 y 25 veces diluida, 12+13) hPLAP secretable l0 y 25 veces diluida.

Figura 11

Actividades enzimáticas específicas de 4 AP humanas y una bovina contra para-nitrofenilfosfato (pNPP), el sustrato químico estándar para la determinación de la actividad Ap.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una fosfatasa alcalina aislada o recombinante que comprende un dominio de corona y un dominio catalítico, en la que dicho dominio de corona es el dominio de corona de una fosfatasa alcalina placentaria (ALPP) y en la que dicho dominio catalítico es el dominio catalítico de una fosfatasa alcalina intestinal (ALPI).
2. 2. Una fosfatasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos una de dichas fosfatasas es una fosfatasa humana.
3. 3. Una fosfatasa aislada o recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una mutación en las proximidades de un residuo catalítico y/o en un bolsillo de unión a fosfato coordinador con iones metálicos, en a que dicha mutación es una mutación como se representa en la Tabla 4, 5 o 6.
4. 4. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una fosfatasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. 5. Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4.
6. 6. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 5.
7. 7. Un método para producir una fosfatasa como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar una célula huésped, preferiblemente una célula de mamífero, capaz de expresar dicha fosfatasa en un medio que comprende Zn2+ y permitir que la célula produzca dicha fosfatasa.
8. 8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende además aislar dicha fosfatasa.
9. 9. Una composición farmacéutica que comprende una fosfatasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
10. 10. Uso de una fosfatasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de sepsis, enfermedad inflamatoria del intestino, inflamación del revestimiento epitelial del intestino y/u otra enfermedad inflamatoria, y/o insuficiencia renal.
11. 11. Uso de una fosfatasa de acuerdo con la reivindicación 1 para la desfosforilación in vitro de un sustrato, preferiblemente un fosfato de adenosina, en un entorno que comprende una concentración de Zn2+ inferior a 10 pM, preferiblemente una concentración de Zn2+ inferior a 1 pM, más preferiblemente una concentración de Zn2+ menor que 0.1 pM.
12. 12. Una fosfatasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso como medicamento, preferiblemente para el tratamiento de sepsis, enfermedad inflamatoria del intestino, inflamación del revestimiento epitelial del intestino y/u otra enfermedad inflamatoria y/o insuficiencia renal.