CN103656637B - 抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI或G6PI）单克隆抗体在制备促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的药物中的应用。采用鼠抗重组人GPI单克隆抗体或人源性抗GPI单克隆抗体作用于分离培养的RA-FLS和OA-FLS，作用72小时后RA-FLS、OA-FLS的增生受到明显抑制、细胞凋亡增加，且细胞培养上清中IL-1、TNF-α含量显著降低。本发明为RA诊断、预防和治疗提供了新的疾病靶标，针对RA最主要的病理变化，即受累关节滑膜组织炎症、增生提供了一个全新、有效的防治新技术，为后续研发人源性GPI单抗治疗RA奠定了必要的基础，有广泛的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，尤其涉及一种关于细胞增殖、凋亡和分泌的小分子蛋白，具体来说是一种抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体（抗GPI单抗）在制备促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的药物中的应用。
背景技术
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、全身性、自身免疫性疾病，其特征是外周关节的非特异性、对称性慢性炎症，关节滑膜的慢性炎症、增生，形成血管翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，部分患者伴不同程度的全身表现。
类风湿关节炎(RA)在中国是一个常见的多发性自身免疫疾病，患病率约为0.3％～0.4％，美国本病患者约占人群的1％，女性发病率较男性高2～3倍。各年龄组人群均可发病，但25～50岁为本病的好发年龄。RA关节病变是从滑膜开始的，滑膜充血、水肿、滑膜表面有纤维蛋白渗出物覆盖；滑膜表层细胞增生、滑膜组织内各种炎症细胞浸润、血管新生。随着炎症持续和反复，在新生血管周围的滑膜成纤维样细胞增生明显，形成肉芽肿，与软骨粘连，并侵蚀软骨。滑膜增生逐渐向软骨中心部位蔓延，阻断了软骨由滑液中吸收营养，软骨逐步被吸收。同时由于溶酶体内的蛋白降解酶、胶原酶的释放，使软骨基质破坏、溶解，导致关节软骨广泛破坏，关节间隙变窄，关节面粗糙不平，血管翳机化后形成粘连，纤维组织增生，关节腔内形成广泛粘连，而使关节功能明显受限，形成纤维性强直。从RA受累关节病理变化过程可看出，关节滑膜炎症、成纤维样细胞增生和血管新生是导致RA关节不可逆病变的根源。
本发明人近十年致力于有关RA实验室诊断指标试剂盒研发及RA生物治疗药物的研发。在辅助诊断生物指标上，已成功获得发明专利两项，《变性变构型环瓜氨酸多肽及其融合蛋白、技术和试剂盒》（中国专利号200810203396.4）和《GPI抗原酶联免疫法体外定量测定诊断试剂盒》（中国专利号CN200410016140.4）。GPI（又称G6PI）ELISA检测试剂已经临床应用，检测诊断RA敏感度为76.1%、特异性达93.5%，血清GPI含量与RA病情活动状态相关、且在血清GPI阳性的RA患者关节液中也检测到GPI浓度异常升高（Fan LY,et al.ClinicaChimicaActa2010,411:2049-2053）。
本发明是在前期有关RA实验室诊断指标专利发明基础上向RA治疗领域的拓展。GPI是一个多功能蛋白，在细胞内是糖酵解和糖异生的关键酶，催化葡萄糖6磷酸与6磷酸果糖间转化；在细胞外，GPI分子与两个细胞外因子，自分泌蠕动因子（Autocrine Motility Factor，AMF）和神经介素（neuroleukin，NLK)高度同源，三者是同一基因的产物（Watanabe H,et al.Cancer Res1996,56:2960-2963.）。AMF是肿瘤细胞分泌的自分泌细胞因子，能够通过受体（AMFR）介导的信号途径刺激肿瘤细胞，在多种肿瘤研究中显示（包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和肝癌等）与肿瘤细胞生长、进展和转移相关（Tsutsumi S,et al.Clin Cancer Res2004,10:7775-7784.Jiang WG,et al.J Histochem Cytochem2006,54:231–241.）。本发明人发现在人RA关节滑膜中也存在类似肿瘤中的现象，即重组人源性GPI能够促进分离培养的RA、骨关节炎（OA）关节滑膜成纤维样细胞（RA-FLS、OA-FLS）生长，而抗人源性GPI单抗则能有效地抑制RA-FLS、OA-FLS增生、促进细胞凋亡，同时还抑制FLS分泌炎症细胞因子IL-1、TNF-α。
本发明针对RA最主要的病理变化提供了一个全新、有效的防治新技术，不仅为GPI参与RA发病机制提供了实验依据，而且为RA诊断、预防和治疗提供了新的疾病靶标，为后续建立人源性GPI单抗治疗RA生物疗法奠定了必要的基础，有广泛的临床应用前景。
发明内容
为了解决现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体（抗GPI单抗）在制备促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的药物中的应用。所述的这种抗GPI单抗能明显抑制RA-FLS、OA-FLS的增生，显著降低I L-1、TNF-α的含量。
本发明的目的在于提供一种抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体在制备促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的药物中的应用。
具体的，所述的抗体为鼠抗重组人GPI单克隆抗体或者人源性抗GPI单克隆抗体。
从RA、OA患者关节手术切除的关节滑膜组织中分离培养关节滑膜成纤维样细胞（RA-FLS、OA-FLS）。采用重组人GPI作用于分离培养的RA-FLS和OA-FLS（均为第四代细胞），结果GPI促进两种FLS增生，促进FLS分泌炎症因子IL-1、TNF-α。
在此基础上分别采用鼠源性抗重组人GPI单抗和人源性抗GPI单克隆抗体作用于上述细胞，作用72小时后RA-FLS、OA-FLS的增生受到明显抑制、细胞凋亡增加，且细胞培养上清中IL-1、TNF-α含量显著降低。
本发明和已有技术相比，其技术效果是显著的。本发明为RA诊断、预防和治疗提供了新的疾病靶标，针对RA最主要的病理变化，即受累关节滑膜组织炎症、增生提供了一个全新、有效的防治新技术，为后续研发人源性GPI单抗治疗RA奠定了必要的基础，有广泛的临床应用前景。
如图说明
图1显示了培养的关节滑膜成纤维样细胞（×400）。
图2显示了培养的FLSs（第三代）流式细胞仪检测结果。
图3显示了FLSs培养上清液中GPI含量。
图4显示了GPI促进RA-FLS、OA-FLS增殖。
图5显示了GPI抑制ADR诱导FLSs凋亡。
图6显示了鼠源性GPI单抗能显著抑制RA-FLS和OA-FLS增生。
图7显示了鼠源性抗GPI单克隆抗体促进RA-FLS、OA-FLS凋亡。
图8显示了人源性GPI单抗对RA-FLS、OA-FLS凋亡的影响。（A：RA1(GPI highin serm),B：RA3(GPI low in serm),C：OA1）
图9显示了GPI、GPI单抗对RA-FLS、OA-FLS分泌IL-1、TNF-а影响。
具体实施方式
实施例1
1.临床资料：
8例患者均来自上海市东方医院风湿科和骨科2011年住院病人，诊断均符合1987年美国风湿病学会修订的RA诊断标准。其中女性6例，男性2例，年龄46～74岁，病程6月～4年。另取年龄与性别相匹配的6例骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者为对照组，其中女性4例，男性2例，年龄48-75，均为上海市东方医院运动医学科2011年住院病人。关节置换术或关节镜下滑膜清除术后病理检查的剩余滑膜组织，放入1640培养基中4～10℃保存。
附表1.RA、OA患者临床资料
2.主要试剂
GPI（产品编号ab87625）和anti-GPI（产品编号ab66340）购自英国abcam公司，GPI ELISA来自上海北加公司；RPMI Medium1640、胰蛋白酶为Gibco公司产品；胎牛血清（HyClone公司）；cellTiter96A Queous单溶液细胞增值分析（MTS）实验试剂盒购自Promega公司，Rapid Cell Proliferation试剂盒购自Calbiochem公司；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物公司；流式单克隆抗人CD14、CD90（eBioscience公司）；IL-1、TNF-αELISA测定试剂盒（R&D公司）。
3.人源性抗GPI单克隆抗体-1和人源性抗GPI单克隆抗体-2：是利用DNA重组技术，将鼠源单抗的轻链CL、重链CH可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是鼠源的，而C区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
4.主要仪器：酶标仪（Bio-Rad Model680）、流式分析仪（BD公司）、CO2培养箱（FORMA公司）、倒置式系统显微镜（OLYMPUS）、超净台（BAKER公司）
5.滑膜成纤维细胞的培养：术中取下的滑膜组织带入准备好的超净工作台内，剔除表面血污及附着的脂肪组织。用PBS液清洗2次，将组织剪成近似1mm×1mm×1mm小块，加入几滴1640培养基，平铺于培养瓶底后倒置，于37.0℃、5%CO2培养箱中培养4小时，待组织块贴壁后，将培养瓶翻转过来，沿侧壁加入1640培养基（含10%胎牛血清和青、链霉素各10万U/L双抗液）培养。隔天，轻轻洗掉未贴壁的组织，3天后换液，待细胞长满后，用胰蛋白酶消化传代，第四代用于实验（如图1）。
6.滑膜成纤维细胞的表型检测：为检测培养的滑膜成纤维样细胞（FLS）的纯度，采用抗人CD14、CD90荧光标记抗体(eBioscience)，采用流式细胞术检测培养至第三代细胞。结果CD4阳性率3.1%，CD90达96.7%。说明培养的细胞96.7%是成纤维样细胞（FLS）（如图2）。
7.RA-FLS自分泌GPI特性：选择源自病例RA1、3和OA1关节滑膜FLSs第二代细胞，以1×105个/孔种植于6孔板，加入相同体积培养基培养培养3～4天，待细胞长满6孔板，分别收集上清液。分别采用免疫印迹法和ELISA法定性、定量检测由FLS分泌至培养基中GPI含量，结果血清中GPI含量高者(RA1)的FLSs培养上清液中GPI含量显著高于血清含量低者(RA3),OA-FLS不存在自分泌GPI特性。
附表2FLSs培养上清液中GPI含量
注：T1、T2、T3为同一样本重复三孔
8.不同浓度GPI促进RA-FLS、OA-FLS增殖：调整滑膜成纤维细胞浓度为1×104个/ml，置于96孔板(100μL/孔)内培养过夜，分别加入终浓度为1.0μg/ml、10.0μg/ml GPI。GPI原液配制方法，用不含血清培养基配制成100μg/ml原液。每孔分别加入1μL、11μL。继续培养48小时。随后采用cellTiter96A Queous单溶液细胞增值分析（MTS）实验方法测定细胞增殖状况。具体操作：每孔加20μL CellTiter96Aqueous One Solution Reagent，孵育4小时后于酶标仪490nm读数。每个样本、每个浓度设复孔，并且上述实验重复三次.结果见如图3,显示GPI促进RA-FLS和OA-FLS增生。这种促增生作用无疾病特异性，也不呈浓度依赖性。
附表3GPI促进RA-FLS、OA-FLS增殖情况
注：T1、T2、T3为同一样本重复三孔
9.不同浓度GPI抑制ADR诱导的RA-FLS、OA-FLS凋亡:调整细胞浓度1×105个/ml，置于24孔板(500μL/孔)培养6小时后，加入ADR，终浓度为1.0μg/ml,分别加入终浓度为1.0μg/ml、10.0μg/ml GPI培养72小时。Annexin-V FITC细胞凋亡实验：收集上清（-20℃保存,用于细胞因子测定），用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，洗涤细胞，加入500μL Binding Buffer悬浮细胞，15min后加入5μLAnnexin-V FITC和5μL Propidiumlodidc，用流式细胞仪进行检测。每个样本、每个浓度设复孔，并且上述实验重复三次（如图4）。如图4显示GPI显著抑制ADR诱导的RA-FLS凋亡，且有浓度依赖趋势，GPI尽在高浓度时（10.0μg/ml）抑制ADR诱导的OA-FLS凋亡。
附表4GPI抑制ADR诱导FLSs凋亡
注：T1、T2、T3为同一样本重复三孔
10.鼠源性抗GPI单克隆抗体抑制RA-FLS、OA-FLS增殖：调整细胞浓度1×104个/ml，置于96孔板(100μL/孔)内培养过夜，分别加入终浓度为1.0μg/ml、10.0μg/ml鼠源性抗GPI单克隆抗体培养48小时。随后采用cellTiter96A Queous单溶液细胞增值分析（MTS）实验方法测定细胞增殖状况。具体操作：每孔加20μLCellTiter96Aqueous One Solution Reagent，孵育4小时后于酶标仪490nm读数。每个样本、每个浓度设复孔，并且上述实验重复三次.结果见如图5,显示鼠源性GPI单抗抑制RA-FLS和OA-FLS增生，这种抑制作用无疾病特异性,呈浓度依赖性。
附表5鼠源性GPI单抗能显著抑制RA-FLS和OA-FLS增生
注：T1、T2、T3为同一样本重复三孔
11.不同浓度鼠源性抗GPI单克隆抗体促进RA-FLS、OA-FLS凋亡：选择调整细胞浓度1×105个/ml，置于24孔板(500μL/孔)，加入GPI，终浓度为1μg/ml和10μg/ml，培养72小时。收集上清（-20℃保存，用于细胞因子测定），用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，洗涤收集细胞，加入500μL Binding Buffer悬浮细胞，5～15min后加入5μL Annexin-V FITC和5μL Propidiumlodidc，用流式细胞仪进行检测。每个样本、每个浓度设复孔，并且上述实验重复三次。如图6显示鼠源性GPI单抗促进RA-FLS和OA-FLS凋亡，抗体含量越高促凋亡作用越强。
附表6鼠源性抗GPI单克隆抗体促进RA-FLS、OA-FLS凋亡
注：T1、T2、T3为同一样本重复三孔
12.不同浓度人源性抗GPI单克隆抗体促进RA-FLS、OA-FLS凋亡：选择调整细胞浓度1×105个/ml，置于24孔板(500μL/孔)，加入1μg/ml,10μg/ml和100μg/ml GPI培养72小时。收集上清（-20℃保存,用于细胞因子测定），用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，洗涤收集1-5×105个细胞，加入500μL Binding Buffer悬浮细胞，5～15min后加入5μL Annexin-V FITC和5μL Propidiumlodidc，用流式细胞仪进行检测。每个样本、每个浓度设复孔，并且上述实验重复三次（如图8）。
13.培养上清液中IL-1β、TNF-а测定：上述操作收集的培养上清液，R&D公司IL-1β、TNF-аELISA试剂盒放置室温30min。按照试剂盒说明书操作。简要操作步骤为，分别将混匀好的试剂盒标准品和细胞培养上清液100μl加入反应孔内，37℃孵育90min，洗涤，除空白孔外，加入生物素化抗体工作液，37℃孵育60min，随后加入酶结合工作液，37℃避光孵育30min，洗涤去除未结合的酶结合物，加入底显色底物液液10min，450nm测定OD值。绘制标准曲线，获得培养上清液中IL-1β、TNF-а含量（如图9）。
附表8GPI、GPI单抗对RA-FLS、OA-FLS分泌IL-1、TNF-а影响
结论：采用本发明的产品GPI ELISA检测试剂检测患者血清GPI浓度，作为辅助诊断RA特异性指标。跟踪血清GPI阳性、阴性RA患者治疗过程，收集RA患者关节镜下滑膜清除术后的关节滑膜组织，培养滑膜成纤维样细胞（FLSs）。经免疫印迹等试验发现血清GPI含量高者FLSs存在自分泌GPI特性。随后，采用人源性GPI、抗GPI抗体分别刺激培养的RA-FLS、OA-FLS，发现重组人源性GPI能够促进RA-FLS、OA-FLS生长，而鼠源性/人源性抗GPI单抗能有效地抑制RA-FLS、OA-FLS增生、促进细胞凋亡、抑制FLS分泌炎症细胞因子IL-1、TNF-α。此发现的重要意义不仅是在一定程度上阐明GPI在RA致病机制中的重要作用，而且建立了“人源性抗GPI单抗促进RA-FLS凋亡”细胞模型，为研制一种新的、专门针对高GPI血清型RA的生物治疗药物奠定基础。此发明如能成功转化、应用临床，将有效地补充现有的RA个体化治疗方案，具有广泛临床应用前景。
Claims (2)
1.一种抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体在制备治疗由滑膜成纤维样细胞增生引起的类风湿关节炎的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体为鼠抗重组人GPI单克隆抗体或者人源性抗GPI单克隆抗体。
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