CN101688193B - 修饰的磷酸酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及磷酸酶,且更具体地涉及(遗传)修饰的磷酸酶、包含(遗传)修饰的磷酸酶的药物组合物、和(遗传)修饰的磷酸酶在治疗或治愈如败血症、炎性肠疾病或其它炎性疾病、或肾衰竭中的用途。本发明还涉及制备磷酸酶的方法。
Description
技术领域
本发明涉及磷酸酶,且更具体地涉及(遗传)修饰的磷酸酶、包含(遗传)修饰的磷酸酶的药物组合物、和(遗传)修饰的磷酸酶在治疗或治愈如败血症、炎性肠疾病或其它炎性疾病、或肾衰竭中的用途。本发明还涉及制备磷酸酶的方法。
背景技术
磷酸酶是对其底物进行去磷酸化的酶;即其将磷酸单酯水解为磷酸根离子和具有自由羟基基团的分子。此作用与通过使用能量分子如ATP将磷酸根基团连接到其底物上的磷酸化酶和激酶的作用直接相反。磷酸酶可以被分为主要的两类:半胱氨酸依赖性磷酸酶(CDP)和金属磷酸酶。后者的活性依赖于在其活性位点上一种或多种金属离子的存在。
CDP通过磷酸-半胱氨酸中间产物催化磷酸酯键的水解。游离的半胱氨酸亲核试剂与磷酸根部分的磷原子成键,并通过合适位置的酸性氨基酸残基或水分子将连接磷酸根基团和酪氨酸的P-O键质子化。磷酸-半胱氨酸中间产物随后被另一水分子水解,由此产生用于另一去磷酸化反应的活性位点。
金属磷酸酶与其活性位点内的一个或多个催化必需的金属离子配位。目前对这些金属离子的鉴定存在一些混乱,原因是不断尝试去鉴定它们但得出了不同的答案。目前证据表明这些金属可能是镁、锰、铁、锌或其任意组合。认为桥接两金属离子的氢氧根离子参与了对磷酸根基团的亲核攻击。
磷酸酶发挥与将磷酸根基团添加到蛋白质上的激酶/磷酸化酶相反的作用。磷酸根基团的添加可以活化或去活化酶(如激酶信号通路),或使蛋白质-蛋白质相互作用发生(如SH3结构域);因此磷酸酶是许多信号转导通路所必需的。应该注意到磷酸根的添加和去除并非必需对应酶的活化或抑制,且一些酶具有用于活化或抑制功能性调节的单独磷酸化位点。例如,CDK的活化或去活化依赖于被磷酸化的特定氨基酸残基。磷酸根在信号转导中很重要,因为它们调节与其相连的蛋白质。将磷酸根去除以逆转该调节作用。这可以通过水解自行发生,或受蛋白质磷酸酶的调节。
并非限制本发明,将碱性磷酸酶作为本文所述和要求保护的磷酸酶的实例进行详细讨论。碱性磷酸酶(ALP)(EC3.1.3.1)是负责从包括核苷酸、蛋白质和生物碱的多种分子中去除磷酸根基团的水解酶。去除磷酸根基团的过程被称为去磷酸化。顾名思义,碱性磷酸酶在碱性环境下最有效。
因为DNA通常在5’端具有磷酸根基团,所以碱性磷酸酶已成为分子生物学实验室中一种十分有用的工具。去除这些磷酸根防止了DNA的连接(5’端连接相同或另一分子的3’端);此外,磷酸根基团的去除使得可以进行放射标记(被放射活性磷酸根基团替代),以通过方法或实验中的其它步骤测定被标记DNA的存在。出于这些目的,来自虾的碱性磷酸酶最有用,因为其一旦完成其使命则最易被去活化。
碱性磷酸酶的另一重要用途是作为酶免疫分析的标记物。
此外,碱性磷酸酶可以用在如败血症、炎性肠疾病或肾衰竭的治疗中。
虽然现有的(碱性)磷酸酶在诊断学和疾病治疗中都十分有用,但是仍需具有如改变的(如改进的)比活性、稳定性(如体内T1/2、或储存(货架期)方面的稳定性)或底物特异性的备选磷酸酶。此外,也需要具有不同的pH或温度或盐依赖性分布,或不依赖pH或温度或盐的磷酸酶。
发明内容
本发明提供了备选的(遗传)修饰的磷酸酶。
在第一实施方案中,本发明提供了包含花冠结构域和催化结构域的分离或重组的碱性磷酸酶,其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的碱性磷酸酶。这些突变体在本文中也称为“结构域交换突变体”。
碱性磷酸酶(AP)(根据IUBMB酶命名法为EC3.1.3.1,常用名为碱性磷酸酶)是催化磷酸单酯(phosphatase monoester)和H2O反应生成醇和磷酸根的酶。AP的其它名称为碱性磷酸单酯酶、磷酸单酯酶、甘油磷酸酶、碱性磷酸水解酶、碱性苯基磷酸酶、正磷酸单酯磷酸水解酶(最适宜碱性)。AP的系统名称为磷酸单酯磷酸水解酶(最适宜碱性)。
AP是广谱特异性酶,其也可以催化转磷酸作用。已知在人类和其它哺乳动物中已知有至少四类不同但相关的碱性磷酸酶。在人类中,它们是肠、胎盘、胎盘样和肝/骨/肾(或组织非特异性)碱性磷酸酶。前三类一起位于2号染色体上,而组织非特异性形式则位于1号染色体上。尚不知道AP的确切生理学功能,但AP似乎参与大量生理学过程。胎盘碱性磷酸酶在本文中简称为ALPP或PLAP。简称ALPI或IAP是指肠碱性磷酸酶。胎盘样2碱性磷酸酶在本文中简称为ALPP2、ALPG或GCAP,且简称ALPL、TNSALP、TNAP或BLK在本文中用来指肝/组织非特异性碱性磷酸酶。用于一种和相同碱性磷酸酶的不同缩写在本文中可以交换使用。
从构象上看,碱性磷酸酶大致由两个结构域构成:花冠结构域和活性位点结构域。活性位点结构域可以分为单独的部分,如催化残基和三个金属离子位点(Zn1、Zn2和Mg3)。从一级结构看,很明显花冠结构域侧翼连接形成活性位点结构域的氨基酸。因此,在优选的实施方案中,催化结构域不由连续的氨基酸序列构成,而是侧翼连接花冠结构域。
碱性磷酸酶的氨基酸序列和催化和花冠结构域的相对位置是技术人员已知的。例如,参考图1,其显示出四条人碱性磷酸酶的氨基酸序列。这些序列中的花冠结构域用下划线标出。本发明的结构域交换突变体优选通过用另一磷酸酶的花冠结构域(下划线标出)替换其自身花冠结构域(下划线标出)来制备。例如,ALPP花冠结构域位于氨基酸366至430位之间,因此在优选的实施方案中,参照对应于图1中氨基酸366至430位的花冠结构域,即在优选的实施方案中,本发明提供了包含花冠结构域和催化结构域的分离或重组的碱性磷酸酶,其中所述花冠结构域和所述催化结构域是获得自不同的碱性磷酸酶,且图1的ALPP中的花冠结构域位于氨基酸366至430位之间。
碱性磷酸酶存在于从细菌到人类的几乎所有生物体中。在优选的实施方案中,本发明提供了包含花冠结构域和催化结构域的分离或重组的碱性磷酸酶,其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的碱性磷酸酶,且其中所述不同的磷酸酶中的至少一种是人磷酸酶。另一种磷酸酶是如ECAP(大肠杆菌(Escherichiacoli)碱性磷酸酶)或七种已知BIAP(牛肠碱性磷酸酶)中的一种。在优选的实施方案中,本发明提供了包含花冠结构域和催化结构域的分离或重组的碱性磷酸酶,其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的碱性磷酸酶,且其中所述不同的碱性磷酸酶是人磷酸酶。如果修饰的磷酸酶随后用在人类治疗中,例如用在败血症、炎性肠疾病或其它炎性疾病、或肾衰竭治疗中,这一点将特别有用。预期此(遗传)修饰的人源磷酸酶没有免疫原性或免疫原性很低。然而,技术人员清楚如果将修饰的磷酸酶用在如“体外”或“离体”诊断中,修饰的磷酸酶可以由如人和大肠杆菌碱性磷酸酶构成,或可以由牛和大肠杆菌碱性磷酸酶构成。
在另一个优选的实施方案中,本发明提供了包含花冠结构域和催化结构域的分离或重组的碱性磷酸酶,其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的碱性磷酸酶,且其中所述花冠结构域是ALPP花冠结构域,且其中所述催化结构域是ALPI催化结构域。优选地,所述不同的磷酸酶中的至少一个是人磷酸酶,且在更优选的实施方案中,两个不同的磷酸酶都是人磷酸酶。
在本发明之前,通常认为碱性磷酸酶的催化结构域是在比活性方面最重要的结构域。此外,过去认为花冠结构域与碱性磷酸酶的稳定性有关。因此,在检测包含ALPI催化结构域和ALPP花冠结构域(下文称为催化ALPI/花冠ALPP)的重组碱性磷酸酶时,预期此重组碱性磷酸酶的活性能与ALPI的活性相当。然而,在不含或含有极少量Zn2+的培养基中,如FreestyleTM 293表达培养基(GIBCO),催化ALPI/花冠ALPP的产生导致约600U/mg的比活性,然而由相同细胞系且在相同培养基中产生的ALPI导致约30U/mg的比活性。
更令人惊奇地是向产生细胞的生长培养基中加入Zn2+的影响:其对催化ALPI/花冠ALPP的比活性没有影响,而ALPI的比活性增至约750U/mg。在产生后加入相似浓度的Zn2+仅诱导ALPI的比活性在16小时后增加2倍。
这些结果的总结显示在表1和2中。
不受理论的束缚,认为ALPP花冠结构域在产生的重组催化ALPI/花冠ALPP中提供了构象变化,这导致有更高比活性和Zn2+非依赖性的酶,即ALPP花冠结构域的存在导致相对高比活性,且被认为是Zn2+非依赖的。
此外,不但显示出ALPI在产生期间需要高Zn2+浓度以增加酶的比活性,而且ALPI的比活性在Zn2+缺乏的培养基中在24小时内下降,然而催化ALPI/花冠ALPP在相同条件下保持其初始比活性。这些结果暗示体内活性是Zn2+非依赖性的。这类活性不依赖于Zn2+的酶在Zn2+缺失是病理学一部分的疾病(如营养缺乏、酒精成瘾和肠道完整性损伤、包括败血症的慢性感染、或广义的炎性疾病),或可能禁忌添加Zn2+的的疾病(如败血症的急性期、自身免疫性疾病)中可能十分有用。除去产生和应用的优点,催化ALPI/花冠ALPP还具有与储存期间稳定性相关的优点。
因此,已显示出天然AP如ALPI在低Zn2+浓度的环境中会丧失其酶活性。因此在Zn2+缺失是病理学一部分的疾病中,所述天然AP不能在被认为是最有利的位点如在炎性位点展现其酶活性。相反,重组AP对低Zn2+浓度不敏感,例如催化ALPI/花冠ALPP在低Zn2+浓度的环境(如在炎性位点)中保持其活性。在健康个体中,Zn2+血清参考值在10和20μM之间。例如,在酒精成瘾或营养不良时,这些水平可以降低至小于10μM或甚至小于1μM。如果存在充足的Zn2+水平,在人身体中其活性和如免疫原性反应依赖Zn2+的一些酶更为有效。已知免疫系统的先天以及特定部分受锌影响,且已经确定包含锌的蛋白质在炎性位点积累。此外,(亚)慢性炎症如类风湿性关节炎、败血症和克罗恩氏病(Crohn’s disease)表现出血清锌缺乏。令人惊奇地,本发明还发现催化ALPI/花冠ALPP可比未修饰的(重组)碱性磷酸酶在更宽pH范围内保持其活性。考虑到许多疾病如炎症和/或缺血包括组织pH中的紊乱,因此催化ALPI/花冠ALPP在这类疾病的治疗中特别有用。因此,在一个实施方案中,本发明提供了包含ALPI催化结构域和ALPP花冠结构域的磷酸酶作为药物的用途,优选作为用于治疗伴有组织pH紊乱的疾病中药物的用途,优选地所述疾病包括炎性疾病和/或伴有缺血的疾病。
本发明认为包含ALPI催化结构域和ALPP花冠结构域的重组磷酸酶在治疗伴有局部或全身Zn2+缺乏的疾病中特别有用。因此,在另一个实施方案中,本发明提供了包含ALPI催化结构域和ALPP花冠结构域的磷酸酶作为药物的用途,优选作为用于治疗伴有Zn2+缺乏疾病中药物的用途,优选地所述疾病包括炎性疾病,更优选地选自由自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性肠疾病、败血症、神经性皮炎和表10所列疾病组成的组中。
在另一个实施方案中,本发明提供了包含ALPI催化结构域和ALPP花冠结构域的磷酸酶在制备用于治疗伴有Zn2+缺乏疾病的药物中的用途,优选地所述疾病包括炎性疾病,更优选地上述疾病选自由自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性肠疾病、败血症、神经性皮炎和表10所列疾病组成的组中。
在又一个实施方案中,本发明提供了用于治疗受试者(优选人)以治疗伴有Zn2+缺乏疾病的方法,包括向有此需要的受试者给予有效量的包含ALPI催化结构域和ALPP花冠结构域的磷酸酶,其中所述疾病优选包括炎性疾病,更优选地选自由自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性肠疾病、败血症、神经性皮炎和表10所列疾病组成的组中。
在另一个优选的实施方案中,本发明提供了包含花冠结构域和催化结构域的分离或重组的碱性磷酸酶,其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的碱性磷酸酶,且其中所述花冠结构域是ALPI花冠结构域,且其中所述催化结构域是ALPP催化结构域(下文称为催化ALPP/花冠ALPI)。优选地,所述不同的磷酸酶中的至少一个是人磷酸酶,且在更优选的实施方案中,两个不同的磷酸酶都是人磷酸酶。
基于人碱性磷酸酶的其它优选结构域交换突变体是:
催化结构域 | 花冠结构域 | 名称 |
ALPI | GCAP | 催化ALPI/花冠GCAP |
TNAP | 催化ALPI/花冠TNAP | |
ALPP | GCAP | 催化ALPP/花冠GCAP |
TNAP | 催化ALPP/花冠TNAP | |
GCAP | ALPI | 催化GCAP/花冠ALPI |
ALPP | 催化GCAP/花冠ALPP | |
TNAP | 催化GCAP/花冠TNAP | |
TNAP | ALPI | 催化TNAP/花冠ALPI |
ALPP | 催化TNAP/花冠ALPP | |
GCAP | 催化TNAP/花冠GCAP |
为了简明起见,ALPI是肠AP,ALPP是胎盘AP,GCAP是胎盘样AP,TNAP是组织非特异性AP。
很显然可以也可以制备ECAP或任何人形式(ALPI、ALPP、GCAP或TNAP)的催化结构域与BIAP花冠结构域的组合。此外,也可以制备BIAP花冠结构域与ECAP或任何人形式的催化结构域的组合。
贯穿说明书、实施例和本领域文献,其它命名用于指定碱性磷酸酶的各自同种型。为了简明,下表中列出了常用的或本申请中所用的名称和缩写。
碱性磷酸酶 | 缩写 |
胎盘碱性磷酸酶 | ALPP,PLAP |
可分泌的胎盘碱性磷酸酶 | shPLAP,sALPP |
肠碱性磷酸酶 | ALPI,IAP,hIAP |
可分泌的肠碱性磷酸酶 | shIAP,sALPI |
胎盘样碱性磷酸酶 | GCAP |
组织非特异性碱性磷酸酶 | TNAP,BLK,ALPL,TNSALP |
大肠杆菌碱性磷酸酶 | ECAP |
牛肠碱性磷酸酶 | BIAP |
包含ALPI催化结构域和ALPP花冠结构域的重组碱性磷酸酶 | 催化ALPI/花冠ALPP,RecAP,Xinplap |
包含ALPI催化结构域和ALPP花冠结构域的重组碱性磷酸酶 | 催化ALPP/花冠ALPI,shPLAP-hIAP-CD |
另一类有用的修饰磷酸酶是指原来在自然条件下通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定物与细胞膜连接,但现在经修饰而不再与细胞膜连接的磷酸酶。GPI锚定的磷酸酶的实例是碱性磷酸酶和5’-核苷酸酶。全部同工酶均在细胞膜上有功能性活性,且缺乏GPI锚定物的形式不以可检测的水平自然存在。虽然已经表明了血清碱性磷酸酶的活性,但是通常认为此酶仍存在于脱落的膜部分或膜囊泡中。奶中AP活性也存在于包含膜囊泡的部分中。GPI锚定物作为前体分子存储在细胞中,在此处其通过转酰胺酶与附着位点连接。GPI锚定物的骨架在哺乳类中是相同的,但是已知有依赖细胞类型的修饰。
发现碱性磷酸酶主要通过其GPI锚定物与质膜结合。例如,嗜中性粒细胞在其带负电荷的细胞膜背景下呈递该酶,而非将其释放进入炎性微环境中。出于此原因,通常认为为了获得最佳的AP体内活性,应将该酶嵌入细胞膜或囊膜中。此外,已经观察到聚阴离子底物可以在体内进一步导致对于磷酸酶和其衍生物的磷酸酶活性有利的阴离子条件,这些磷酸酶是指通常在碱性pH下最适宜的磷酸酶和其衍生物,特别是对于碱性磷酸酶的磷酸酶活性有利的阴离子条件。
对于人受试者中AP的药学用途,大多数应用中需要将人形式的该酶用于药物和治疗,这是因为获得自其它物种的AP形式在人受试者中具有免疫原性,且治疗会引起免疫反应和病理学上的副作用。在一些受试者中,甚至会发生致死的副作用,即过敏性休克(显示在我们的动物研究中),因此,应将免疫副作用的风险降至最低。从人中分离AP在实践中并不可行,通常可以在不同的重组表达平台上制备人重组形式的AP蛋白质。然而,包含GPI和膜锚定的蛋白质的表达和纯化十分困难;GPI蛋白质很难从膜分离且很难分离和纯化。然而,一直认为GPI锚定物和膜定位是AP生物学活性所必需的。
本发明的此部分是基于惊人的发现,即在基于肝细胞的生物分析中,发现缺乏GPI锚定物的人AP酶(此酶因此是可溶的并易于被重组蛋白质表达系统分泌)在生理pH水平下对于生物学相关的磷酸化底物展现出显著的磷酸酶活性。
在一个实施方案中,本发明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列中包含修饰的分离或重组的磷酸酶,其中所述修饰导致分泌性磷酸酶,即磷酸酶未附着到细胞膜上。
在优选的实施方案中,本发明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列中包含修饰的分离或重组的磷酸酶,其中所述修饰导致具有生物活性的分泌性磷酸酶,即其显示出对生物学(相关)底物的活性。
并没有负责GPI锚定物连接的通用序列,但是可见明显的共有序列:
1)C末端的氨基酸的疏水延伸(至少11个氨基酸,但是优选大于11个氨基酸)。
2)疏水区上游,亲水氨基酸间隔区(5-12个氨基酸)。
3)GPI与小氨基酸(甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或半胱氨酸)连接。
4)GPI连接位点下游之后的2个后续氨基酸必然是小氨基酸,且在多数情况下其选自于甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或半胱氨酸。
基于此共有序列,技术人员能够通过如插入一个或多个氨基酸和破坏部分共有序列来突变此共有序列。然而,在优选的实施方案中,本发明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列中包含修饰的分离或重组的磷酸酶,其中所述修饰导致分泌性磷酸酶,且其中所述修饰包括对含共有GPI信号序列的氨基酸序列的突变或删除。
对于在人治疗中的应用,希望所得修饰的磷酸酶没有免疫原性或免疫原性很低,即此修饰的磷酸酶基本上是人源的。在优选的实施方案中,本发明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列中包含修饰的分离或重组的磷酸酶,其中所述修饰导致分泌性磷酸酶(优选具有针对生物学相关底物的活性),且其中所述磷酸酶是人磷酸酶。
GPI锚定的磷酸酶的实例是碱性磷酸酶和5’-核苷酸酶,因此,在优选的实施方案中,本发明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列中包含修饰的分离或重组的磷酸酶,其中所述修饰导致分泌性磷酸酶,且其中所述磷酸酶是碱性磷酸酶,例如人碱性磷酸酶,如人肝-肾-骨磷酸酶、人肠碱性磷酸酶或人胎盘样碱性磷酸酶。
很明显任何所述可分泌的修饰磷酸酶均可通过如以下步骤来产生:向宿主细胞内引入能够编码所述可分泌的磷酸酶且与调控序列有效连接的核酸,且允许所述宿主细胞表达所述可分泌的磷酸酶,并任选地从用于生长和/或维持宿主细胞的培养基中分离所产生的磷酸酶。然而,除了在上述GPI连接序列中进行突变之外,还存在制备无GPI锚定连接分泌蛋白的其它方法:
1)在作为膜锚定的蛋白质表达后,可以使用磷脂酶来切除GPI锚定物。因此,本发明还提供了用于制备可分泌的磷酸酶的方法,包括培养能够表达膜锚定的磷酸酶的宿主(细胞),使所述宿主细胞产生所述磷酸酶并用磷脂酶孵育所获得的细胞,和任选地分离释放的磷酸酶。膜锚定的磷酸酶例如是野生型(或天然或未修饰的)磷酸酶。然而,膜锚定的磷酸酶可以在其序列的其它部分(例如花冠结构域)中包含突变。
2)可以通过干扰GPI锚定物的产生或使用在GPI锚定物产生中有缺陷的细胞(类型)来产生可分泌形式的GPI锚定蛋白。在GPI锚定生物化学中存在缺陷的细胞系的实例是,例如Jurkat、AM-B、C84、BW、S49、CHO和Raji。在另一个实施方案中,本发明因此提供了用于制备可分泌的磷酸酶的方法,包括培养能够表达可分泌的(碱性)磷酸酶的宿主细胞(例如包含编码任一上述修饰的可分泌的(碱性)磷酸酶的核酸序列的宿主细胞),使所述宿主产生所述可分泌的磷酸酶,和任选地分离产生的磷酸酶,其中所述宿主细胞无法进行功能性GPI锚定的蛋白的生物合成。然而,宿主细胞也可以产生具有功能性GPI信号序列的磷酸酶。
3)可以通过干扰转酰胺酶或使用缺乏转酰胺酶的细胞来抑制GPI锚定物与蛋白质的连接,以使蛋白质无锚定且可分泌。可以通过诱变CHO来获得此类缺陷性细胞。
技术人员清楚可以对包含花冠结构域和催化结构域的修饰的磷酸酶进行进一步修饰并使其可分泌,其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的碱性磷酸酶。因此,在优选的实施方案中,本发明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列中包含修饰的分离或重组的磷酸酶,其中所述修饰导致分泌性磷酸酶,且其中所述重组的磷酸酶还包含获得自不同磷酸酶的花冠结构域和催化结构域。图1提供了此类(碱性)磷酸酶突变体的实例。此组合的或“双”突变体产生例如修饰的磷酸酶,其具有某种比活性、稳定性或底物特异性,且同时由于可以从生产细胞周围的培养基中将其分离,此产物的产量得到极大的提高。
碱性磷酸酶的催化结构域由在酶的一级序列中不相邻的若干氨基酸序列组成。催化结构域包含对在去磷酸化反应中从底物中切除的磷酸根基团起受体作用的催化性丝氨酸残基(ALPP中的Ser92)。酶的催化结构域还包含一种或多种金属离子。包含在催化结构域中的特定氨基酸残基负责参与去磷酸化反应中金属离子的结合和配位。在ALPP中,与金属配位的残基是:Asp42、His153、Ser155、Glu311、Asp316、His320、Asp357、His358、His360和His432。
在另一个实施方案中,本发明提供了在催化残基附近和/或在金属离子配位磷酸根结合的穴中包含突变的分离或重组的磷酸酶。技术人员能够很好地鉴定并突变在催化残基周围(即,在催化残基附近,优选构象上在催化残基附近)和/或在金属离子配位的磷酸根穴中的氨基酸。如上所述,磷酸酶的序列是已知的。作为示例,图1列出了其中四条人碱性磷酸酶的氨基酸序列。
在优选的实施方案中,本发明提供了在催化残基附近和/或在金属离子配位磷酸根结合的穴中包含突变的分离或重组的磷酸酶,其中所述磷酸酶是人磷酸酶。如果修饰的磷酸酶随后用在人类治疗中,例如用在败血症、炎性肠疾病或其它炎性疾病、或肾衰竭治疗中,这一点将特别有用。预期此(遗传)修饰的人源磷酸酶没有免疫原性或免疫原性很低。然而,技术人员清楚如果将修饰的磷酸酶用在如“体外”或“离体”诊断中,修饰的磷酸酶可以由如人和大肠杆菌碱性磷酸酶构成,或可以由牛和大肠杆菌碱性磷酸酶构成。
在另一个优选的实施方案中,所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
至少对于人碱性磷酸酶的同种型而言,金属离子配位磷酸根结合的穴是保守的。其由两个Zn结合的延伸和一个Mg结合的延伸组成,所述延伸分别包含如下氨基酸:对于Zn1为氨基酸Asp316、His320和His432,对于Zn2为氨基酸Asp42、Asp357和Asp358,和对于Mg为氨基酸Ser155和Glu31(参考图1的ALPP)。
配位氨基酸残基和/或位于配位残基附近残基的突变可能以正面或负面的方式影响所得突变体酶的催化性质。例如,在ALPP中,氨基酸残基44、87、93、322、323和429位于配位残基的附近。用ALPI的一个、二个、三个或四个相应氨基酸进行取代来诱变这些残基可以影响该酶的催化性质。相反,用ALPP的相应氨基酸取代ALPI的氨基酸残基44、87、93、322、323和429可以影响ALPI酶的催化性质。表4和5显示了可以被取代的氨基酸(的组合)。
因此,在优选的实施方案中,本发明提供了在催化残基附近和/或在金属离子配位磷酸根结合的穴中包含突变的分离或重组的磷酸酶,其中所述突变是表4、5或6中所示的突变。
技术人员清楚在催化残基附近和/或在包含金属离子的磷酸根结合的穴中包含突变的分离或重组的磷酸酶可以进一步被修饰,以例如包含在GPI信号序列中的修饰。此突变体甚至可以通过催化结构域和花冠结构域来进一步修饰,即修饰获得自不同磷酸酶的所述花冠结构域和催化结构域。
在另一个实施方案中,在催化残基附近和/或在包含金属离子配位的磷酸根结合的穴中包含突变的分离或重组的磷酸酶也可以通过催化和花冠结构域的结构域交换来进一步修饰,即修饰获得自不同磷酸酶的所述花冠结构域和催化结构域。
此外,在又一个实施方案中,本发明提供了在催化残基附近和/或在金属离子配位磷酸根结合的穴中包含突变的分离或重组的磷酸酶。
实现任一所述(遗传)修饰的磷酸酶的分子生物学技术为技术人员所熟知,且包括如限制性酶孵育、连接、PCR、突变引入等技术。
在另一个实施方案中,本发明提供了编码如本文所述磷酸酶的核酸序列,例如,编码结构域交换突变体的核酸序列、或编码分泌性磷酸酶的核酸、或编码分泌性结构域交换突变体的核酸序列等。本发明还提供了包含编码如本文所述磷酸酶的核酸序列的载体。此载体优选地包含其它核酸序列,如对编码磷酸酶的核酸序列转录/翻译所必需的元件(如启动子和/或终止子序列)。所述载体也可以包含编码选择标记(如抗生素)的核酸序列,以选择或保持所述载体转化的宿主细胞。适合的载体的实例是克隆或表达载体。根据本发明,可以使用适用于调节适合宿主细胞中表达的任何载体,该载体在宿主细胞中或整合或游离地复制。该载体可以为质粒、病毒(包括逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、杆状病毒)、粘粒、噬菌体或噬菌粒、游离型载体或人工染色体。
此外,本发明还提供了包含所述的核酸序列或载体的宿主细胞。细胞可以是适用于产生重组蛋白质的真核细胞,优选哺乳动物细胞、植物细胞或酵母细胞。适合的酵母宿主细胞包括酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。优选的宿主细胞为源自哺乳动物(或更优选人)的细胞,如BHK、HEK293、CHO或PerC6TM。
编码如本文所述的磷酸酶的核酸序列,或包含所述核酸序列的载体,或包含所述核酸序列或包含含有所述核酸序列载体的宿主细胞在制备修饰的磷酸酶中非常有用。磷酸酶包含糖基化位点,因此该磷酸酶优选在提供所希望糖基化模式的细胞中制备。在优选的实施方案中,所用的制备体系为哺乳动物(例如人)体外制备平台,且更优选地该制备包括大规模制备。在另一个优选的实施方案中,所用的制备体系为引入人工人样糖基化模式的植物、或酵母或哺乳动物(优选非人类)平台。
通过测试不同制备方法,本发明的发明人意外地测得在制备野生型或突变(碱性)磷酸酶期间,Zn2+离子的存在可以影响所制备磷酸酶的比活性。例如,通过向所用宿主细胞的生长培养基中添加Zn2+,ALPI的比活性可以从30U/mg增至750U/mg。常用于培养宿主细胞的培养基包含0.5-3nM Zn2+。通过添加上至1mM的Zn2+,其比活性显著地改进。因此推断出ALPI是Zn2+依赖性磷酸酶。这与已描述的催化ALPI/花冠ALPP突变体相反,该催化ALPI/花冠ALPP突变体似乎为Zn2+不依赖性的,即在宿主细胞培养期间缺少Zn2+不会显著地影响所制备磷酸酶的比活性,且在存储和反应期间缺少Zn2+也不会降低比活性。
在另一个实施方案中,本发明提供了制备磷酸酶的方法,包括在包含Zn2+的培养基中培养能够表达所述磷酸酶的宿主细胞,并使该细胞产生所述磷酸酶。在优选的实施方案中,所述宿主细胞是哺乳动物细胞,且在另一个优选的实施方案中,所述磷酸酶是人磷酸酶。在另一个优选的实施方案中,所述磷酸酶是碱性磷酸酶。本发明的方法可以用于制备野生型(或天然或非遗传修饰的)磷酸酶,且也同样可以很好地用于制备遗传修饰的磷酸酶,例如任一本文所述的磷酸酶。
在其它优选的实施方案中,本发明提供了制备磷酸酶的方法,包括在包含Zn2+的培养基中培养能够表达所述磷酸酶的宿主细胞,并使该细胞产生所述磷酸酶,所述方法还包括分离所述磷酸酶。本发明还提供了可通过制备磷酸酶的方法获得的磷酸酶,所述方法包括在包含Zn2+的培养基中培养能够表达所述磷酸酶的宿主细胞,且使该细胞产生所述磷酸酶。
无论是否本文所述的(遗传)修饰的磷酸酶具有某种比活性,通过使用可商购的底物并在碱性磷酸酶孵育后用可商购的试剂盒测定无机磷酸根释放,技术人员可以很容易地测试某种底物特异性或某种稳定性(如pH、温度、体内半衰期)。此外,也可以使用本文实验部分所述的测试来测定是否修饰的磷酸酶具有其它生物学相关活性。
如上所述,本文所述的(遗传)修饰的磷酸酶在诊断和治疗中很有用。在一个实施方案中,本发明提供了包含修饰的磷酸酶的药物组合物,例如:
-包含花冠结构域和催化结构域的分离或重组的碱性磷酸酶,其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的碱性磷酸酶,或
-在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列中包含修饰的分离或重组的磷酸酶,其中所述修饰导致分泌性磷酸酶,或
-在催化残基附近包含突变的分离或重组的磷酸酶,或
-其任意的组合。
所述药物组合物任选地包含可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
药物组合物可以以任何形式存在,例如片剂、可注射的流体或输液流体等。此外,上述(遗传)修饰的磷酸酶可以通过不同途径如经静脉、经直肠、经支气管或经口服来给药。另一个适合的给药途径是使用十二指肠滴剂。
在优选的实施方案中,所用的给药途径是经静脉给药。技术人员清楚优选地递送有效量的(遗传)修饰的磷酸酶。初始点时可以使用1-5000U/kg/天。如果使用经静脉给药途径,(遗传)修饰的磷酸酶(至少在一段时间上)优选通过连续输液来施用。
组合物可以任选地包含可药用的赋形剂、稳定剂、活化剂、载体、渗透剂、推进剂、消毒剂、稀释剂和防腐剂。适合的赋形剂是药物制剂领域所公知的,且技术人员很容易发现并使用,参见如Remmington′s PharmaceuticalSciences,Mace Publishing Company,Philadelphia PA,17th ed.1985。
对于口服给药,可分泌的AP可以例如以固体剂型给药,例如胶囊、片剂(优选具有肠包衣)和散剂,或以液体剂型给药,例如酏剂、糖浆和混悬剂。AP可以与非活性成分和粉末化载体(如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等)一起被装入明胶胶囊中。可以加入以提供所需的颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散或其它已知所需特征的其它非活性成分的实例为铁红、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、食用白墨水等。可以使用类似的稀释剂来制备压缩的片剂。片剂和胶囊均可被制成使药物在数小时内连续释放的缓释产品。压缩的片剂可以是糖包衣或膜包衣的,以掩盖任何不希望的味道并保护片剂免受大气影响,或可以是肠包衣的,以用于在胃肠道内选择性崩解。口服给药的液体剂型可以包含调色剂和调味剂以增加患者的接受度。
在优选的实施方案中,包含(遗传)修饰的磷酸酶来源的组合物适用于口服给药,且包含为保护AP免受胃液和低pH不良影响的肠包衣。肠包衣和控释制剂是本领域公知的。本领域的肠包衣组合物可以包含与活性成分如(遗传)修饰的磷酸酶和其它赋形剂混合的水溶性肠包衣聚合物的溶液,其分散在水溶液中且可以随后被干燥和/或制成小球。形成的肠包衣使(遗传)修饰的磷酸酶在存储时可以抵抗大气湿度和氧气的侵袭,且在摄入时可以抵抗胃液和低pH的侵袭,而在下肠道内的碱性条件下易于分解。
上述药物组合物在如败血症,炎性肠疾病或其它炎性疾病,和/或肾衰竭的治疗中非常有用。
因此,在另一个实施方案中,本发明提供了如本文所述的(遗传)修饰的磷酸酶,其用作药物,优选用于治疗败血症、炎性肠疾病、肾衰竭和炎症,所述炎症优选自由类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性肠疾病、败血症、神经性皮炎和表10所列疾病组成的组中。
在另一个实施方案中,本发明提供了如本文所述的(遗传)修饰的磷酸酶在制备用于治疗败血症、炎性肠疾病或其它炎性疾病、和/或肾衰竭的药物中的用途。
如果高度怀疑或证实存在感染,且满足以下全身炎症反应综合征(SIRS)的两个或多个标准,则考虑为败血症:
·心率大于90次搏动/分钟;
·体温小于36℃(96.8°F)或大于38℃(100.4°F);
·换气过度(高呼吸速率),大于20次呼吸/分钟,或血气、PaCO2小于32mmHg;
·白细胞计数小于4000细胞/mm3,或大于12000细胞/mm3(小于4×109或大于12×109细胞/L),或大于10%带型(未成熟白细胞)。
然而,公认的定义随着败血症的征兆和症状最新列表的不断扩展而发展,以反映临床经验。更危急的败血症亚类是严重败血症(具有急性器官障碍的败血症)和感染性休克(具有难治愈动脉低血压的败血症)。或者,当满足两个或多个全身炎症反应综合征标准而没有感染迹象时,患者可以简单地被诊断为“SIRS”。可以将具有SIRS和急性器官障碍的患者称为“严重SIRS”。如果患者具有败血症以及全身灌注不足的征兆(或末端器官障碍或血清乳酸大于4mmol/dL),则将其定义为具有“严重败血症”。在适当的流体推注(通常20ml/kg的crystaloid)后,如果患者患有败血症以及低血压,则将其定义为具有“感染性休克”。本发明提出根据本发明的(遗传)修饰的磷酸酶特别适用于败血症的治疗。在败血症的情况中,如本文所述的修饰的磷酸酶优选经由静脉给药。
炎性肠疾病(IBD)是大肠和小肠(在某些情况下)的炎性病症的集合。IBD的主要类型是克罗恩氏病和溃疡性结肠炎(UC)。占较少情况的是IBD的其它类型:胶原性结肠炎、淋巴细胞结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、Behcet综合症、感染性结肠炎、未确定的结肠炎。克罗恩氏病和UC的主要区别在于炎性变化在肠中的位置和性质。尽管大多数情况是出现在末端回肠,但克罗恩氏病可以影响从口到肛门的任何胃肠道部分。相反地,溃疡性结肠炎局限于结肠和肛门。在显微镜下,溃疡性结肠炎局限于粘膜(肠的上皮内壁),而克罗恩氏病影响整个肠壁。最终,克罗恩氏病和溃疡性结肠炎表现为不同程度上的肠以外的症状(如肝问题、关节炎、皮肤症状和眼问题)。在很少的情况中,将患者诊断为同时患有克罗恩氏病和溃疡性结肠炎,尽管不确定是否为组合或简单地无法确定为其中的一种或另一种。虽然是完全不同的疾病,二者均可以表现出任何以下的症状:腹痛、呕吐、腹泻、便血、失重和各种相关的病症或疾病(关节炎、坏疽性脓皮病、原发硬化性胆管炎)。诊断通常通过结肠镜检查以及病理损伤的活组织检查进行。在IBD的情况中,如本文所述的(遗传)修饰的磷酸酶优选经由肠包衣片或经由十二指肠滴剂给药。
除了这些炎性肠疾病,本发明提出根据本发明的磷酸酶适用于治疗其它炎性疾病。炎性疾病可以影响不同器官,如肺、关节、肝、胰腺、皮肤,或甚至是神经组织。表10给出了可能受炎性影响器官的非限定性列表。多种致病因子显示出引起或维持此炎性疾病。所述致病因子的非限定性实例为微生物(细菌、真菌、病毒)、过敏原、自免疫、外伤和缺血/再灌注。虽然致病因子和病因可以是多种多样,但是(亚)慢性炎症由紊乱的免疫反应所引起。通常认为此紊乱的免疫反应通过恶性循环而持续,其包括可进而活化免疫系统的炎症诱导的组织损伤。其中,ATP显示出在上述恶性循环中起作用。本发明提出如本文所述的(遗传)修饰的磷酸酶能够使ATP去磷酸化,并因此打断所述的恶性循环,这有利于患有所述炎性疾病的个体。当治疗此炎性疾病时,根据本发明的(遗传)修饰的磷酸酶优选经由静脉给药,或如果可行经由局部给药,例如在类风湿性关节炎的情况中经由关节内给药、在(中枢)神经系统发炎的情况中经由鞘内给药、在(变应性)哮喘的情况中经由支气管内给药或在如神经性皮炎的情况中经由局部给药。此外,已描述(亚)慢性炎性反应如败血症、克罗恩氏病、类风湿性关节炎等可伴随有(血清)锌缺乏。根据本发明的磷酸酶特别适用于治疗所述炎性疾病,其中所述磷酸酶处在锌缺乏的环境中时未丧失其酶活性。本发明提出根据本发明的磷酸酶可在低至0.01μM的亚生理Zn2+浓度下保持其活性,其中所述磷酸酶包含ALPI催化结构域和ALPP花冠结构域。
因此,在一个实施方案中,本发明提供了包含ALPI催化结构域和ALPP花冠结构域的磷酸酶在包含Zn2+浓度小于10μM(优选Zn2+浓度小于1μM、更优选Zn2+浓度小于0.1μM)的环境中在底物(优选腺苷磷酸)去磷酸化中的用途。
急性肾衰竭(ARF)是指导致血清肌酸酐水平升高的急性肾功能损失。在急性肾衰竭中,肾小球滤过率在数天至数周内下降。因此,造成含氮废物的排泄降低,且不能维持体液和电解质平衡。患有急性肾衰竭的患者通常没有症状,而所述病症是通过所观察到的血尿素氮(BUN)和血清肌酸酐水平的上升来诊断的。当血清肌酸酐水平每天增加至少0.5mg/dL,且每天的尿排出小于400mL(少尿症)时,则出现完全的肾机能停止。本文所述的(遗传)修饰的磷酸酶不但可以用于治疗肾衰竭,而且可以改进肾功能,特别是在肾功能是至少部分损害/降低的情况下。在优选的实施方案中,所用的给药途径是经静脉。技术人员清楚优选地递送有效量的(遗传)修饰的磷酸酶。初始时可以使用1-5000U/kg/天。如果使用经静脉给药途径,(遗传)修饰的磷酸酶(至少在一段时间上)优选通过连续输液来施用。
在另一个实施方案中,本发明提供了用于治疗患有败血症、炎性肠疾病或其它炎性疾病、和/或肾衰竭患者的方法,包括向所述受试者给予有效量的任一本文所述的修饰的磷酸酶。
除了可以将如本文所述的(遗传)修饰的磷酸酶并入药物组合物,此磷酸酶也可以是营养组合物的一部分。
在本发明优选的实施方案中,(遗传)修饰的磷酸酶的来源是优选从奶(优选牛奶)中制备或分离的(遗传)修饰的磷酸酶。奶可以获得自经饲养或经遗传修饰的动物,以在其奶中制备相比于野生型动物奶中更高水平的(遗传)修饰的磷酸酶。从奶中制备富含(遗传)修饰的磷酸酶的部分是本领域已知的。例如,富含于或源自于乳脂球膜的部分是优选的富含(遗传)修饰的磷酸酶的奶部分,且通常可以通过原奶的常规脱脂获得。可以将从奶中分离的(遗传)修饰的磷酸酶配制在药物组合物和食品组合物或营养食品中。
在优选的实施方案中,根据本发明的用于(遗传)修饰的磷酸酶经口服给药至胃肠道粘膜的包含(遗传)修饰的磷酸酶组合物是富含(遗传)修饰的磷酸酶的食品或营养食品。在一个实施方案中,食品可以是植物、水果或蔬菜,其任选地经过遗传修饰以包含更高水平的(遗传)修饰的磷酸酶。在另一个实施方案中,包含(遗传)修饰的磷酸酶的食品或营养食品是乳制品。在包含未经巴斯德灭菌的奶或其部分(优选牛奶)的特定制剂和组合物中,包含高水平的(遗传)修饰的磷酸酶,且特别适于作为根据本发明的(遗传)修饰的磷酸酶的来源用于口服给药。
本发明还涉及富含(遗传)修饰的磷酸酶的乳制品的制备方法,优选奶、奶部分或奶产品的制备方法。该方法包括分馏原奶(优选牛奶)、巴斯德灭菌不包含或不富含(遗传)修饰的磷酸酶的部分,和将该巴斯德灭菌后的部分与包含富含未经巴斯德灭菌的(遗传)修饰的磷酸酶部分的所述部分再配制,以获得不易腐败且富含(遗传)修饰的磷酸酶的乳制品。富含未经巴斯德灭菌的(遗传)修饰的磷酸酶部分可以通过其它方法灭菌,例如但不限于UV射线、X射线或γ射线辐射、过滤、压力、渗透压、化学品或抗生素,确保(遗传)修饰的磷酸酶保持充分的活性,且奶部分变得基本上无菌。此奶制品可以用在组合物中,或直接给药至患有或有发展为败血症、IBD或肾衰竭风险的受试者中。然而,也可以将富含(遗传)修饰的磷酸酶的乳制品作为用于保持肠结构整体性的药品或营养食品提供给健康受试者。
此外,本发明的修饰的磷酸酶也可以被添加到营养品(例如奶)中以代替在所述营养品中进行制备。此外,可以制备随后加入到营养品中或直接被人类应用的片剂和/或胶囊。
本发明将在以下非限定性实施例中做更详尽解释。
具体实施方式
实验部分
材料和方法
实施例1
不同磷酸酶对生物学活性底物ATP的去磷酸化
获得自Perkin Elmer的ATPliteTM试剂盒,其包含以下试剂:哺乳动物裂解溶液、底物缓冲液、冻干的底物溶液和冻干的ATP标准品。
冻干ATP标准品的制备:用MiliQ配制一小瓶冻干的ATP标准品溶液,以获得10mM储备液。在加入MiliQ之后,涡旋1分钟以使ATP完全溶解。
ATP去磷酸化活性的测定:
-制备ATP起始浓度为20μM的6条标准曲线,并进行一系列的稀释。每孔的终体积应为100μl。
-制备酶活性为1U/ml的磷酸酶。制备起始浓度为1U/ml的3条标准曲线,并进行一系列的稀释。终体积应为50μl。
-制备40μM ATP溶液。
-在96孔黑色OptiplateTM(PerkinElmer)中一起加入50μl的1U/ml磷酸酶溶液标准曲线和50μl的40μM ATP溶液。每孔的终体积为100μl。
-振荡平板并37℃下孵育90分钟。
-使试剂在室温下平衡。
-根据制造商的建议,通过加入适量的底物溶液缓冲剂配制一小瓶冻干的底物溶液。轻轻摇晃至溶液均匀。
-加入50μl的哺乳动物细胞裂解溶液,并在700rpm下将平板振摇5分钟。
-向孔中加入50μl的底物溶液,并在700rpm下将平板振摇5分钟。
-向平板喷洒70%的乙醇以去除气泡。
-将平板置于黑暗处10分钟,并在Viktor3TM Multi Label Reader(PerkinElmer)上测定发光。
实施例2
使用不同同种型的碱性磷酸酶进行的肝切片检测
用O2/N2O/异氟烷麻醉后将大鼠处死,将肝取出并储存在威斯康星大学器官保藏溶液(UW)中直至进行切片。取肝组织片的核心部分(直径5mm),并储存在冰冷却的UW溶液中直至进行切片。用Krumdieck切片机进行切片。使用添加有终浓度为25mM葡萄糖的冰冷却的KHB作为切片缓冲剂。使用标准的设置(循环速度30;中断模式)制备大鼠肝切片(厚度200-250μm;湿重±3mg)。在切片后,将大鼠肝切片储存在UW溶液中直至实验开始。
在37℃下,用添加有Glutamax I(Gibco BRL,Paisly,苏格兰)、50mg/ml庆大霉素(Gibco BRL)的1.3ml Williams培养基E对12孔板(Greiner,Alphena/dRijn,荷兰)中的切片单独孵育,并用95%O2/5%CO2饱和。将切片用或不用10μg/ml LPS和用或不用不同浓度的不同AP同种型孵育24小时。将切片的培养基储存在-80℃直至NOx测定。
通过向110μl上清液中加入5μl的0.275μl 100mM NADPH、2.2μl 10U/ml硝酸盐还原酶和0.055μl 10mM FAD的混合物(该混合物用水稀释2倍)来测定NOx(NO、NO2和NO3的总和)。在37℃孵育30分钟后,加入5μl第二混合物(2.2μl 0.5M丙酮酸钠和0.55μl 5mg/ml LDH,在水中以1∶0.82稀释)。在37℃孵育5分钟后,加入5μl 30%ZnSO4,并将样品在2000rpm下离心。随后将100μl上清液转移至新平板,并与包含0.1%磺胺、0.01%正萘基乙二胺和2.5%磷酸的100μl Griess试剂混合。最终,在微板读数器上在550nm处测定吸光度。将该吸光度与硝酸钠标准曲线的吸光度相关联。
实施例3
细胞外ATP去磷酸化的生物学作用
鼠巨噬细胞系RAW264.7和人上皮细胞系T84(结肠直肠癌)获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,MD,USA),并分别保存在DMEM/F12(1∶1)和包含4.5g/l葡萄糖的DMEM培养基中。两种培养基获得自Invitrogen Corp.(Breda,荷兰),包含Glutamax I,并添加有10%热灭活的FBS(Wisent Inc.,Quebec,加拿大)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(均来自Invitrogen Corp.)。在长至汇合时使用胰蛋白酶-EDTA传代培养T84细胞系,并使用橡胶棒刮下RAW264.7细胞。
将4×105T84细胞铺在含有2ml培养基的12孔板(Nunc,Roskilde,丹麦)中。在达到汇合时,更换培养基,且如图(柱状分布图)所示,将细胞在存在或不存在不同浓度ATP和/或AP下用1μg/ml LPS(图3)或不用1μg/mlLPS(图2)孵育2小时。在2小时后,收集上清液,并转移至包含RAW264.7细胞的24孔板中。在之前一天将这些RAW264.7细胞以每毫升培养基2×105的密度铺在24孔板(Nunc,Roskilde,丹麦)中。在转移1ml的T84细胞上清液之前,将RAW的上清液吸出并弃掉。
在收集上清液并用商购的ELISA(Biosource Europe SE,Nivelles,比利时)检测细胞因子(IL-6、TNFα)含量前,在37℃和5%CO2下将RAW细胞与T84上清液孵育24小时。
实施例4
突变体的制备
使用标准的分子生物学技术制备如本文所述的突变体和,更具体地,如表4、5和6所述的突变体。
表4-6中所述的氨基酸位置与图1所示的序列相对应。仅说明了突变的位置,即仅给出了与野生型序列的差异。例如,表4的突变体1,如果与给出的野生型序列相比,在位置87、93和429上未改变,即位置87为K,位置93为G,且位置429为E。
使用标准的分子生物学技术,如PCR定点诱变、限制性酶分析和序列分析制备和检验突变体。
实施例5
在t=0时,用含有不同浓度Zn2+的稀释缓冲剂(0.025M甘氨酸/NaOHpH9.6/1mM MgCl2/1%甘露醇/0.05%BSA)将包含450±50单位的不同重组碱性磷酸酶稀释4000倍。在第二实施例中,在缓冲剂中省略作为可能Zn2+来源的BSA。在稀释后1分钟内(T=0),取样,并使用下述pNPP检测测定碱性磷酸酶活性。90分钟(T=11/2小时)、180分钟(T=3小时)和22小时(T=22小时)后,在各个时间点取样,并使用下述pNPP检测直接测定碱性磷酸酶活性。通过由之前使用商购BCA试剂盒(Pierce)获得的蛋白质含量除所得结果(U/ml)而产生的比活性(U/mg)来反向计算出活性(U/ml)。
pNPP磷酸酶活性测定:
工作底物:
将试剂、底物、样品和孵育室的温度设为25℃。将分光光度计设为405nm波长和1cm光程。
将50μl测试物和1450μl工作底物移入一次性比色皿中,混合并立即将试管置于分光光度计中,在3分钟内记录405nm吸光度的增加。
每体积的活性使用以下公式计算:
活性(U/ml)=ΔE405/分钟×1.6×稀释因子
注意:测量范围应在0.04和0.4U/ml之间。
实施例6
pH对不同磷酸酶稳定性的影响
研究了HEK293细胞中瞬时表达的碱性磷酸酶的pH稳定性。在25℃下,使用已调节其特定pH的5种不同的0.1M缓冲剂(乙酸钠、MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)、Tris(2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇)和甘氨酸),测试4.0-9.0的pH范围。将1%甘露醇稳定的BiAP用作参照。将碱性磷酸酶溶液在各个缓冲剂中稀释至约100U/ml,在室温下储存24小时,并使用上述pNPP磷酸酶活性检测测定酶活性。
实施例7
锌对不同磷酸酶表达的影响
在添加有1mM MgCl2+0.1mM锌盐(ZnCl2、或ZnSO4、或ZnAc2)的培养基中使用小规模转染研究不同锌盐对HEK293细胞中瞬时表达的碱性磷酸酶的活性的影响。使用shIAP、shPLAP、Xinplap(催化ALPI/花冠ALPP)和sALPP-ALPI-CD(催化ALPP/花冠ALPI)转染HEK293细胞,且在t=144小时,取样,并使用上述pNPP磷酸酶活性检测分析酶活性。
实施例8
锌对不同磷酸酶稳定性的影响
在存在或不存在100μM ZnCl2下,制备包含约20U/ml不同(重组)的碱性磷酸酶同种型的溶液以用于温度稳定性测试。将样品在室温、37℃和56℃下储存,并使用上述pNPP磷酸酶活性检测分析在t=0、2小时和24小时测定酶活性(pNPP)。
实施例9
碱性磷酸酶融合蛋白和突变体的生成
为了选择适合的表达系统,将编码成熟蛋白,具有或不具有GPI锚定物序列的人肠(hIAP)和人胎盘(hPLAP)cDNA克隆到一些载体中。在小规模感染后,所用的表达载体是由CMV驱动的,包含半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)信号序列,且具有便于纯化的N-末端HIS标记。在成功表达可分泌的hIAP和hPLAP后,在silico中构建两种融合的人可分泌的碱性磷酸酶,一种基于包含胎盘花冠结构域(成熟序列的氨基酸360-430)的肠AP的骨架,第二种基于包含肠AP花冠结构域的胎盘AP的骨架(第一种称为RecAP或催化ALPI/花冠ALPP,第二种称为shPLAP-shIAP-CD或催化ALPP/花冠ALPI)。合成包含人半胱氨酸蛋白酶抑制剂信号序列的两个基因,并将其克隆到包含CMV启动子的表达载体中。
实施例10
GPI锚定物对磷酸酶比活性的影响
制备一些AP的重组形式,将它们纯化,并使用上述pNPP磷酸酶活性检测评价酶活性。此外,使用SDS-PAGE和GelEval软件测定样品中蛋白质含量。用活性(U/ml)除以蛋白质浓度(mg/ml)来计算比活性,并用U/mg表示。
实验部分
结果
实施例1
通过不同磷酸酶对生物学活性底物ATP的去磷酸化
用不同浓度的BIAP、sALPP、sALPI或嵌合催化ALPI/花冠ALPP孵育终浓度为20μM的ATP。从表9可明显看出,pNPP化学活性与其针对生物学底物如ATP的活性并非1∶1的关系。然而,在37℃下在90分钟后,浓度分别为0.031和0.004pNPP单位的BIAP和sALPI显示出大于50%的ATP去磷酸化,而ALPP和催化ALPI/花冠ALPP则分别在0.125和0.0625pNPP单位的浓度下才能完成此量的去磷酸。
实施例2
使用碱性磷酸酶不同同种型的肝切片检测
通过LPS(10μg/ml)刺激使肝切片产生NOx。图6显示了在存在不同浓度的不同重组人碱性磷酸酶(sALPI、sALPP、GPI锚定的ALPI、催化ALPI/花冠ALPP)时,NOx的产生被显著地抑制。在此实验中,将牛源的ALPI用作阳性对照,并将溶剂作为阴性对照。
未添加LPS,肝切片产生的NOx小于10μM,且在孵育期间不因为存在不同磷酸酶而显著改变(数据未显示)。由此可以得出,全部测试的重组的人碱性磷酸酶同种型,无论GPI锚定物是否存在,具有针对涉及LPS诱导的NOx产生的生物学底物的活性。
实施例3
细胞外ATP去磷酸化的生物学作用
与T84上清液一起孵育时RAW264.7细胞的IL-6生产依赖于LPS。没有LPS(图2),产生低水平的IL-6。ATP以及AP不能改变RAW264.7细胞产生的IL-6水平。相反,当LPS存在时,与T84上清液一起孵育的RAW264.7产生的IL-6随着ATP浓度的增加而增加。这种通过ATP来增加细胞因子的产生可以完全被0.1U/ml或更高的AP浓度所降低(图3)。
使用相同的方法对于TNFα,以及使用HT29替代T84作为上皮细胞来源对于TNFα和IL-6,可以获得类似的结果(未显示)。
可以推断AP使ATP去磷酸化,并因此降低其LPS增强作用。不可能的是AP使LPS去磷酸化,因为未观察到AP对LPS的作用。ATP和LPS的组合仅能被AP减少至与仅有LPS相同的水平。
实施例5
不同磷酸酶的Zn
2+
依赖性的测定
如图4和表7中所示,Zn2+显著地稳定sALPI的比活性,然而sALPP和嵌合体催化ALPI/花冠ALPP保持其初始比活性,该活性不依赖培养基中Zn2+的存在。在此实验中,通常用在pNPP磷酸酶活性检测中的BSA可以作为微量Zn2+的来源。因此,进行第二实验。表8和图5显示在没有BSA和存在消耗Zn2+的螯合剂EDTA下,在22小时后全部同种型丧失其比活性。然而,在储存和反应期间加入生理浓度(0.5-10nM)的Zn2+使sALPP和催化ALPI/花冠ALPP保持大于60%(个别75%)的初始比活性,然而sALPI的大于95%的初始比活性丧失。非生理学的高浓度Zn2+是保持sALPI比活性所必须的。
因此可以推断嵌合体催化ALPI/花冠ALPP显示与sALPI相当的高比活性,以及与sALPP相当的Zn2+不依赖的比活性。可以推断Zn2+依赖性位于sALPI花冠结构域中,然而高比活性位于sALPI催化结构域中。
实施例6
pH对不同磷酸酶稳定性的影响
将BiAP、shIAP、shPLAP、RecAP稀释,并在室温下在pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的0.1M缓冲剂(乙酸钠、MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)、Tris(2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇)和甘氨酸)中存储24小时。对于每个pH值,根据标准的pNPP检测测定初始酶活性和储存后的酶活性。正如其名称所预期和表明的一样,碱性磷酸酶活性在高pH范围内(碱性环境)为最佳。然而,如图7所示,胎盘型比肠同种型更稳定。此外,这些结果表明,此稳定性,特别是在高pH范围中,由花冠结构域而非由催化结构域所决定,因为催化ALPI/花冠ALPP(recAP)符合shPLAP的稳定性分布,在pH5-9之间稳定,然而BIAP和shIAP的稳定性局限于pH7-8。相反,在pH9时,催化ALPP/花冠ALPI(shPLAP-hIAP-CD)不如胎盘类型的AP和催化ALPI/花冠ALPP稳定。这表明催化ALPI/花冠ALPP比天然AP或测试的反向嵌合体(催化ALPP/花冠ALPI)在更宽的pH值范围内保持其活性。
实施例7
锌对不同磷酸酶表达的影响
在HEK293细胞中使用小规模转染,研究不同锌盐对瞬时表达的碱性磷酸酶的活性的影响。为此,将shIAP、shPLAP、Xinplap(催化ALPI/花冠ALPP)和sALPP-ALPI-CD(催化ALPP/花冠ALPI)转染,且在t=144小时取样并分析酶活性。所获得的结果显示对于酶活性存在对Zn2+离子的浓度依赖性,但是所观察到的活性增加不依赖于所用锌盐的类型。
从图8所示的结果可以推断出所获得的酶活性依赖于锌,但是其不依赖于所用锌盐的种类。此外,加入锌对具有大于30的酶活性诱导因子的shIAP的产生最有利。对于sALPP和Xinplap,活性增加分别小于2和大于4。在缺乏锌时反向嵌合体(sALPP-ALPI-CD,也称作催化ALPP/花冠ALPI)显示出可忽略的(如果有)活性,而在存在锌时其所获得的活性与sALPP相当。
此外,在未添加Zn/Mg时,Xinplap显示出比任何其它测试的AP更高的酶活性(因子5),且与shIAP或反向嵌合体催化ALPP/花冠ALPI相比对Zn/Mg的依赖性更低。
实施例8
锌对不同磷酸酶稳定性的影响
图9显示了在不同温度的时间下且存在或不存在100μM ZnCl2时,不同AP的稳定性分布。从这些结果可以推断,在缺少锌时,碱性磷酸酶的肠同种型(sALPI和BIAP)在酶活性方面是高度温度敏感的。在37℃,BIAP在2小时内丧失了其20%的活性,且在24小时后仅保留有20%的酶活性。shIAP显示在37℃储存24小时后活性降低30%。图9C显示在37℃稳定性测试期间锌的存在保护酶免受降解。然而,在56℃,锌不再保护肠同种型,且二者在最初2小时内几乎完全丧失其酶活性。相反,在存在或不存在100μM ZnCl2时,RecAP(催化ALPI/花冠ALPP)和shPLAP(sALPP)在甚至56℃直至22小时显示出优秀的稳定性。
实施例9
碱性磷酸酶融合蛋白和突变体的生成
可分泌的hIAP和可分泌的hPLAP通过使用CMV启动子驱动的,包含半胱氨酸蛋白酶抑制剂信号序列的载体在HEK293中表达,且其在蛋白质的N-末端部分包含HIS标记。表达的蛋白通过HIS标记纯化并通过SDS-PAGE分析(参见图10)。用于可分泌的hIAP和hPLAP的1升悬浮培养物产生的蛋白质分别为38mg和16mg,且显示出大于95%的纯度。hIAP和hPLAP的比活性分别为21U/mg和100U/mg。
基于这两种可分泌的重组磷酸酶,在silico中设计两种结构域交换突变体,并在HEK293细胞中表达。对于RecAP获得了值得注意的结果,所述RecAP由肠碱性磷酸酶骨架以及胎盘碱性磷酸酶的花冠结构域组成。在常规培养条件下,RecAP显示出比可分泌的hIAP高5倍的酶活性(14U/ml对2.7U/ml)。然而,在细胞培养和磷酸酶表达期间加入上至100μM的锌盐对RecAP的酶活性仅有很小的作用(18.8U/ml对未添加锌时的14.0U/ml),然而其显著地改进了可分泌的hIAP的活性(37.9U/ml对未添加锌时的2.7U/ml)。另一方面,基于胎盘AP骨架以及肠AP花冠结构域的结构域交换突变体(催化ALPP/花冠ALPI)显示出与肠形式相当的锌依赖性,和与可分泌的PLAP相当的最大活性。如果在表达和纯化后向酶中加入锌,则观察到的shIAP和催化ALPP/花冠ALPI的活性的增加无法实现。因此可以推断在碱性磷酸酶(优选包含肠形式的花冠结构域的那些碱性磷酸酶)表达期间加入100μM锌导致产生更高的碱性磷酸酶活性。
实施例10
GPI锚定物对磷酸酶比活性的影响
制备一些AP的重组形式并评价酶活性。图11中所示的结果表明牛肠碱性磷酸酶(BIAP)和recAP(催化ALPI/花冠ALPP)显示出类似的比活性,该比活性优于可分泌的hIAP、可分泌的hPLAP和GPI锚定的hIAP的比活性。酶的纯度对特定酶活性很重要。应该注意在实验室条件下纯化四种人酶,而BIAP作为超纯GMP批次获得。还应注意到可分泌的hIAP具有比GPI锚定的hIAP约高2倍的比活性。不受理论束缚,更高的比活性可以或与结构相关或与纯度相关,因为可分泌的AP比GPI锚定的(膜结合的)AP更易于纯化。
表格
表1:t=144小时后碱性磷酸酶在HEK293中的表达水平,和用0.1mMZnCl2过夜孵育后对活性的影响
构建体 | 单位/ml | 用0.1mM ZnCl2过夜孵育后,单位/ml |
sALPP N-his标记 | 3.34 | 3.55 |
sALPP C-his标记 | 3.75 | 3.97 |
sALPI N-his标记 | 1.55 | 1.92 |
sALPI C-his标记 | 7.52 | 8.07 |
天然sALPI | 2.84 | 4.94 |
表2:t=144小时后碱性磷酸酶在HEK293中的表达水平,和培养基中不同ZnCl2和/或MgCl2浓度对活性的影响
表3:t=96小时后嵌合碱性磷酸酶在HEK293中的表达水平,和培养基中ZnCl2对活性的影响
表4:具有所述氨基酸变化的ALPP中的突变位点
表5:具有所述氨基酸变化的ALPI中的突变位点
表6:在活性位点附近内ALPP和ALPI中的所述双突变
表7:sALPI,而非sALPP和嵌合体催化ALPI/花冠ALPP,对于保持其体外比活性是Zn2+依赖的。
sALPP | T=0 | T=11/2小时 | T=3小时 | T=22小时 |
0aμM Zn2+ | 122 | 103 | 105 | 100 |
10μM Zn2+ | 162 | 123 | 117 | 110 |
100μM Zn2+ | 131 | 128 | 150 | 132 |
1000μM Zn2+ | 126 | 135 | 125 | 114 |
sALPI | T=0 | T=11/2小时 | T=3小时 | T=22小时 |
0μM Zn2+ | 650 | 500 | 413 | 116 |
10μM Zn2+ | 717 | 648 | 953 | 746 |
100μM Zn2+ | 785 | 733 | 868 | 750 |
1000μM Zn2+ | 752 | 762 | 770 | 989 |
催化ALPI/花冠ALPP | T=0 | T=11/2小时 | T=3小时 | T=22小时 |
0μM Zn2+ | 426 | 407 | 455 | 429 |
10μM Zn2+ | 443 | 500 | 479 | 462 |
100μM Zn2+ | 543 | 560 | 456 | 442 |
1000μM Zn2+ | 452 | 452 | 441 | 465 |
a未加入锌盐,然而检测在存在可能是锌天然来源的白蛋白(0.05%)下进行;参见结果部分。
表8:在缺少白蛋白时,sALPI的比活性在生理学(0.01μM)Zn2+浓度下在22小时后降低大于95%,然而在相同条件下,sALPP和嵌合体催化ALPI/花冠ALPP保持大于60%(个别75%)的其初始比活性。
sALPP | T=0 | T=11/2小时 | T=3小时 | T=22小时 |
0 Zn+100mM EDTA | 29 | 0 | 0 | 0 |
0.01μMZn2+ | 123 | 74 | 76 | 78 |
10μM Zn2+ | 131 | 94 | 88 | 92 |
1000μM Zn2+ | 118 | 6 | 6 | 3 |
sALPI | T=0 | T=11/2小时 | T=3小时 | T=22小时 |
0 Zn+100mM EDTA | 290 | 4 | 10 | 0 |
0.01μM Zn2+ | 693 | 384 | 211 | 31 |
10μM Zn2+ | 785 | 541 | 386 | 324 |
1000μM Zn2+ | 737 | 505 | 382 | 232 |
催化ALPI/花冠ALPP | T=0 | T=11/2小时 | T=3小时 | T=22小时 |
0 Zn+100mM EDTA | 161 | 8 | 5 | 0 |
0.01μM Zn2+ | 330 | 374 | 316 | 252 |
10μM Zn2+ | 543 | 386 | 315 | 266 |
1000μM Zn2+ | 531 | 306 | 299 | 196 |
表9:不同碱性磷酸酶对生物学底物ATP的去磷酸化性质。
表10:炎性疾病和受影响器官的非限定性列表
炎症 | 身体部位 |
阑尾炎 | 阑尾 |
动脉炎 | 动脉 |
关节炎 | 关节 |
眼睑炎 | 眼睑 |
细支气管炎 | 细支气管 |
支气管炎 | 支气管 |
滑囊炎 | 滑囊 |
子宫颈炎 | 子宫颈 |
胆管炎 | 胆管 |
胆囊炎 | 胆囊 |
绒毛膜羊膜炎 | 绒毛膜和羊膜 |
结肠炎 | 结肠 |
结膜炎 | 结膜 |
膀胱炎 | 膀胱 |
泪腺炎 | 泪腺 |
皮炎 | 皮肤 |
皮肌炎 | 皮肤和肌肉 |
脑炎 | 脑 |
心内膜炎 | 心内膜 |
子宫内膜炎 | 子宫内膜 |
肠炎 | 小肠 |
小肠结肠炎 | 小肠和大肠 |
上髁炎 | 上髁 |
附睾炎 | 附睾 |
筋膜炎 | 筋膜 |
纤维组织炎 | 纤维结缔组织 |
胃炎 | 胃 |
肠胃炎 | 胃和小肠 |
齿龈炎 | 齿龈 |
舌炎 | 舌 |
肝炎 | 肝 |
化脓性汗腺炎 | 顶泌汗腺 |
回肠炎 | 回肠 |
虹膜炎 | 虹膜 |
喉炎 | 喉 |
乳腺炎 | 乳腺 |
脑膜炎 | 脑膜 |
脊髓炎 | 脊髓 |
心肌炎 | 心肌 |
肌炎 | 肌肉 |
肾炎 | 肾 |
脐带炎 | 脐带 |
卵巢炎 | 卵巢 |
睾丸炎 | 睾丸 |
骨炎 | 骨 |
耳炎 | 耳 |
胰腺炎 | 胰腺 |
腮腺炎 | 腮腺 |
心包炎 | 心包膜 |
腹膜炎 | 腹膜 |
咽炎 | 咽 |
胸膜炎 | 胸膜 |
静脉炎 | 静脉 |
肺炎 | 肺 |
直肠炎 | 直肠 |
前列腺炎 | 前列腺 |
肾盂肾炎 | 肾 |
鼻粘膜炎 | 鼻粘膜 |
输卵管炎 | 输卵管 |
窦炎 | 颅骨窦 |
口腔炎 | 口 |
滑膜炎 | 滑膜 |
肌腱炎 | 肌腱 |
扁桃腺炎 | 扁桃腺 |
眼色素层炎 | 眼色素层 |
尿道炎 | 尿道 |
阴道炎 | 阴道粘膜 |
脉管炎 | 血管和淋巴管 |
外阴炎 | 外阴 |
附图说明
图1:
四条人碱性磷酸酶同工酶的序列。注意:这些是成熟蛋白的序列(即没有信号序列),而且除嵌合AP外,这些序列为在添加GPI锚定物和C末端氨基酸的加工之前的序列。
图2:
在与T84上清液一起孵育的RAW细胞中,单独的ATP未充分刺激IL-6的生产。未观察到添加AP对IL-6产生的影响。
图3:
在与T84上清液一起孵育的RAW细胞中,增加ATP浓度增大了LPS诱导的IL-6的产生。碱性磷酸酶抑制ATP的增大作用,而非LPS诱导的IL-6产生本身。
图4:
催化ALPI/花冠ALPP的比活性是Zn不依赖的。
图5:
ALPI而非催化ALPI/花冠ALPP的比活性随时间降低。
图6:
肝切片产生的LPS诱导的NOx受人碱性磷酸酶的不同可分泌的同种型的抑制。
图7:
在不同pH值的0.1M缓冲剂中储存24小时后,不同可分泌的人重组碱性磷酸酶和牛肠磷酸酶(BIAP)的相对酶活性。
图8:
在不同重组碱性磷酸酶产生期间向培养基中加入的不同锌盐对酶活性的影响。
图9:
存在锌时,在A:室温、C:37℃和E:56℃储存后,或不含锌时,在B:室温、D:37℃和F:56℃储存后,所测定的不同碱性磷酸酶的酶活性的稳定性。
图10:
SDS-PAGE:纯化的可分泌的hIAP和可分泌的hPLAP的蛋白质图。泳道1)MW标记,4+5)10和25倍稀释的可分泌的hIAP,12+13)10和25倍稀释的可分泌的hPLAP。
图11:
四种人AP和一种牛AP针对磷酸对硝基苯酯(pNPP)(用于AP活性测定的标准化学底物)的酶比活性。
Claims (6)
1.一种分离或重组的碱性磷酸酶,所述碱性磷酸酶包含花冠结构域和催化结构域,其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的人碱性磷酸酶,
其中所述花冠结构域是人ALPP花冠结构域,且其中所述催化结构域是人ALPI催化结构域,或者,
其中所述花冠结构域是人ALPI花冠结构域,且其中所述催化结构域是人ALPP催化结构域。
2.一种编码如权利要求1所述的磷酸酶的核酸序列。
3.一种包含如权利要求2所述的核酸的载体。
4.一种包含如权利要求2所述的核酸或如权利要求3所述的载体的宿主细胞。
5.一种包含如权利要求1所述的磷酸酶的药物组合物。
6.如权利要求1所述的磷酸酶在包含Zn2+浓度小于10μM的环境中在底物去磷酸化中的用途,其中所述花冠结构域是人ALPP花冠结构域,且其中所述催化结构域是人ALPI催化结构域。
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