ES2213147T3 - Lipasa gastrica recombinante canina y composiciones farmaceuticas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA LIPASA GASTRICA DE PERRO OBTENIDA POR VIA GENETICA ASI COMO LA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN ESTE LGC RECOMBINANTE. SE REFIERE TAMBIEN A ESTA LGC RECOMBINANTE PARA LA OBTENCION DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS DESTINADAS, PARTICULARMENTE AL TRATAMIENTO DE PATOLOGIAS UNIDAS A LA INSUFICIENCIA, INCLUSO A LA AUSENCIA DE SECRECION DE LIPASAS EN EL ORGANISMO DE UN INDIVIDUO.

Description

Lipasa gástrica recombinante canina y composiciones farmacéuticas.

La presente invención está relacionada con ácidos nucleicos que codifican para la lipasa gástrica de perro (LGC) y con otros derivados polipeptídicos de esta última que poseen una actividad lipásica, así como con su utilización, especialmente para la producción de estos polipéptidos. La invención tiene igualmente por objeto los polipéptidos codificados por estos ácidos nucleicos y la utilización de estos polipéptidos en composiciones farmacéuticas.

La LGC es una glicoproteína de aproximadamente 380 aminoácidos (AA) de un peso molecular de aproximadamente 49 kilodaltons (KD), sintetizada en forma de un precursor que contiene un péptido señal en la extremidad aminoterminal (NH_{2}-terminal) y secretada por las células medianas de la mucosa fúndica del estómago de perro (Carrière F. Et al., Eur. J. Biochem, 202 (1991) 75-83).

Este enzima pertenece a una familia de lipasas denominadas "preduodenales", en relación con la cual determinados componentes han sido ya purificados y a veces incluso clonados (Docherty A.J.P. et al., Nucl. Ac. Res. 13 (1985) 1891-1903; Bodmer M.W. et al., Biochem. Biophys. Act 909 (1987) 237-244; Moreau H. et al., Biochem. Biophys. Act. 960 (1988) 286-293; patentes europeas nº 0 191 061 y nº 0 261 016).

Durante mucho tiempo, se ha tenido por sabido que la hidrólisis de lípidos alimentarios se efectuaba a nivel del intestino delgado gracias a la acción de enzimas producidos por el páncreas (Bernard C., C.R. Acad. Sci. 28 (1849) 249-253).

Sin embargo, determinadas observaciones permiten ahora pensar que la hidrólisis de los triglicéridos podía tener lugar en el estómago por medio de la utilización de enzimas preduodenales (Volhard, F., Z. Klin Med. 42 (1901) 414-429; Shonheyder, F. Y Voiquartz, K. Acta Physiol. Scand. 9 (1945) 57-67). Estos enzimas, y en particular la lipasa gástrica de perro, poseen propiedades enzimáticas y físico-químicas que los diferencias de las lipasas pancreáticas de los mamíferos. Estas diferencias entre lipasas gástricas y pancreáticas conciernen esencialmente a los siguientes puntos: peso molecular, composición de aminoácidos, resistencia a la pepsina, especificidad de sustrato, pH óptimo de acción, y estabilidad en medio ácido.

Además, in vitro, en determinadas condiciones, se puede poner en evidencia una sinergia de acción entre las lipasas gástricas y las pancreáticas sobre la hidrólisis de triglicéridos de cadenas largas (Gargouri, Y et al., Biochem. Biophys. Act.1006 (1989) 255-271).

Se conocen diversas situaciones patológicas (mucoviscidosa, insuficiencia pancreática exócrina) en las cuales los pacientes están total o parcialmente desprovistos de secreción pancreática exócrina y, por lo tanto, de los enzimas necesarios para la hidrólisis de los alimentos (amilasas, lipasas, proteasas). La no absorción de las grasas a nivel intestinal e especialmente de los triglicéridos de cadena larga, se traduce en un incremento muy importante de la esteatorrea en los pacientes y en una ralentización muy sensible en la toma de los pesos en los jóvenes enfermos. Para remediarlo, se les administra a estos sujetos extractos pancreáticos de cerdo en el momento de las comidas. La eficacia terapéutica de estos extractos podría ser mejorada en gran manera en base a la co-prescripción de la LGC, gracias a su especificidad de acción sobre los triglicéridos de cadena larga.

En el artículo aparecido en Eur. Biochem, 201, 75-83, 1991, de F. Carrière, se describe la purificación y la determinación de la secuencia NH_{2}-terminal de la LGC. En esta publicación se describe igualmente un procedimiento que permite la extracción de este enzima a partir del estómago de perro. Este procedimiento consiste esencialmente en someter a los estómagos de perro a una extracción en un medio acuoso ácido (pH, 2,5), se amplia el extracto lipásico mediante la adición de sales hidrosolubles, posteriormente por medio de una filtración sobre tamiz molecular, seguido de separación mediante cromatografía de intercambio iónico, así como mediante filtración sobre gel, y se recoge una fracción de la elución que contiene la lipasa. La LGC purificada obtenida mediante estos procedimientos tiene un peso molecular, de acuerdo con la técnica de Laemmli, de 49.000 daltons, de los cuales 6.000 corresponden a azúcares y 43.000 a una proteína.

Razones evidentes derivadas de las dificultades de aprovisionamiento de estómagos de perro dificultan todo desarrollo de este procedimiento, tanto a nivel de laboratorio como a nivel industrial. De ahí la necesidad de encontrar un procedimiento que evite la utilización de estómagos de perro y que permita producir la LGC en gran cantidad.

La presente invención tiene precisamente como objetivo el permitir la producción de LGC a escala industrial, suprimiendo cualquier tipo de problema de aprovisionamiento de primera materia, y a un precio que resulte ventajoso.

La invención parte del descubrimiento hecho por los inventores de la secuencia de nucleótidos del ARN mensajero (ARNm) que codifica para la LGC, después del clonado del ADN complementario (ADNc) de este ARNm, con la ayuda de una sonda que corresponde a la secuencia nucleótida de la lipasa gástrica recombinante de conejo descrita en la solicitud de patente francesa depositada el 13 de noviembre de 1991, y publicada bajo número 2.683.549.

La presente invención resultará particularmente ilustrada con la ayuda de la figuras 1 a 12, en las cuales las leyendas indican lo siguiente:

Figura 1: secuencias polipeptídicas de la región de corte de los precursores de las lipasas gástricas de conejo, hombre y rata y comparación con la secuencia NH_{2} terminal de la lipasa gástrica de perro (SEQ ID NO 11).

Figura 2A: concepción de un oligonucleótido degenerado (DGL_{1}) que codifica para la región de corte del precursor de la LGC, a partir de la comparación de sus homólogos conejo, hombre y rata.

Figura 2B: secuencia de oligonucleótidos DGL_{1} (SEQ ID NO 7) y LPC_{2} (SEQ ID NO 8).

Figura 3: cartografía del clon 3.12.

Figura 4: esquema de clonaje de la LGC en el vector pBluescript KS(+) y bajo clonaje del fragmento "H" del clon 3.12 en pKSPCR: obtención del clon pKSDGL10.

Figura 5: mapa de restricción del vector plasmídico pRU303.

Figura 6: secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN EcoRI-Ndel, del plásmido pRU303.

Figura 7: Bajo clonaje del ADNc de la lipasa gástrica de perro en el vector de expresión pRU303 y construcción del plásmido pDGL5.303.

Figura 8 secuencia nucleótida del ADNc que codifica para la LGC madura (SEQ ID NO 1).

Figura 9A: secuencia de polipéptidos de la LGC madura (SEQ ID NO 3).

Figura 9B: comparación de las secuencias de polipéptidos de la LGH (lipasa gástrica humana) y la LGC, y determinación del porcentaje de homología.

Figura 9C: comparación de las secuencias de polipéptidos de la LLR (lipasa lingual de rata) y de la LGC y determinación del porcentaje de homología.

Figura 9D: comparación de las secuencias polipeptídicas de la LGL (lipasa gástrica de conejo y de la LGC y determinación del porcentaje de homología.

Figura 10: mutagénesis in vitro del ADNc de la LGC mediante la técnica de la PCR, con la ayuda de cebadores oligonucleóticos DGL_{2} (SEQ ID NO 9) y DGL_{3} (SEQ ID NO 10), a la vista de la construcción del plásmido pDGL5.303.

Figura 11: análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de las proteínas sintetizadas, en ausencia o en presencia de IPTG, en E. Coli W3110 Iq transformada por el plásmido pDGL5.303.

Figura 12: inmunodetección con la ayuda de anticuerpos específicos de la LGC sintetizada en E. Coli W3110 Iq, transformada por el plásmido pDGL5.303, después de transferencia de tipo "Western" sobre membrana de nylon de las proteínas salidas de estas bacterias.

Así pues, la presente invención concierne a cualquier ácido nucleico caracterizado porqué el mismo comprende todo o parte del fragmento de ADN representado en la Figura 8 (SEQ ID NO 1), y más particularmente, todo o parte del fragmento de ADN delimitado por los nucleótidos situados en las posiciones 1 y 1137 /SEQ ID NO 2) del ADN representado en la figura 8, codificando este fragmento de ADN para el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 1 y 379 de la secuencia de aminoácidos representada en la figura 9A (SEQ ID NO 3), correspondiendo este polipéptido a la LGC madura.

A través de la expresión LGC indicada anteriormente y seguidamente, se quiere dar a entender toda lipasa secretada por la mucosa gástrica o por una mucosa pregástrica en el perro.

Los ácidos nucleicos mencionados anteriormente pueden igualmente comprender, más arriba del fragmento de ADN delimitado por los nucleótidos situados en las posiciones 1 y 1137 de la figura 8, un fragmento de ADN (más particularmente una secuencia ATG) que codifica para una metionina (SEQ ID NO 4).

La invención se refiere igualmente a los fragmentos de ASDN mencionados anteriormente que presentan, más abajo de la posición 1137, un codon STOP, particularmente el constituido por la secuencia delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 1138, 1139, y 1140 de la figura 8 (SEQ ID NO 6).

La LGC, al igual que todas las lipasas gástricas purificadas o clonadas hasta la fecha se sintetiza bajo forma de precursor constituido por un péptido señal que precede a la secuencia polipeptídica de la proteína madura.

De una manera general, la invención concierne a cualquier ácido nucleico caracterizado porqué el mismo comprende, más arriba de uno de los fragmentos de ADN mencionados anteriormente, una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido señal.

Por oposición a los ácidos nucleicos de doble cadena mencionados anteriormente, la invención se refiere igualmente a los ácidos nucleicos de una sola cadena constituidos de una u otra de las dos secuencias de nucleótidos complementarios que constituyen los fragmentos de ADN mencionados anteriormente.

La invención concierne igualmente a cualquier ácido nucleico susceptible de hibridarse con un ácido nucleico de una sola cadena, tal como el descrito anteriormente, especialmente en las condiciones de hibridación citadas en la descripción detallada que resulta del clonaje del ADNc de la LGC según la invención.

Cualquier ácido nucleico que codifique para un polipéptido según la invención y cuya secuencia de nucleótidos difiera en función de la degeneración del código genético de las secuencias genéticas mencionadas anteriormente, entra igualmente en el cuadro de la presente invención.

La invención tiene igualmente por objeto cualquier ácido nucleico recombinante caracterizado porqué el mismo comprende un ácido nucleico tal como el descrito anteriormente según la invención, insertado en una molécula de ADN heteróloga, en relación con el referido ácido nucleico.

A este respecto, la invención tiene además particularmente por objeto cualquier ácido nucleico recombinante que comprende un promotor situado más arriba del ácido nucleico según la invención y bajo el control del cual la transcripción del citado ácido nucleico es susceptible de ser efectuada, así como una secuencia que codifica para señalas de terminación de la transcripción situada más abajo del citado ácido nucleico.

La invención concierne igualmente a cualquier vector recombinante, especialmente de tipo plásmido, cósmido o fago, caracterizado porqué el mismo contiene un ácido nucleico recombinante tal como el descrito anteriormente, insertado en uno de sus puntos no esenciales para la replicación.

Los vectores recombinantes según la invención se caracterizan, de manera ventajosa, porqué los mismos contienen, en uno e sus puntos no esenciales para su replicación, elementos necesarios para promover y controlar la expresión de un ácido nucleico según la invención en un hospedador celular y, más particularmente, un promotor reconocido por las polimerasas del hospedador celular, especialmente un promotor inducible.

La invención se refiere también a cualquier hospedador celular, de tipo procariota o eucariota, transformado por un vector recombinante tal como el descrito anteriormente, y que comprende los elementos de regulación que permiten la expresión de un gen o de un ADNc según la invención.

A título de ejemplo de células hospedadoras susceptibles de ser transformadas por un vector recombinante según la invención se pueden citar las células de mamíferos tales como las células COS o CHO, células de insectos infectables por un virus recombinante de tipo baculovirus, los hongos filamentosos tales como Aspergillus niger u orizae, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae o Kluyveromyces lactis, así como bacterias tales como la E. Coli (bacteria Gram negativa) o B. Subtilis (bacteria Gram positiva).

La invención tiene igualmente por objeto cebadores de ADN (o de ARN) utilizables para la síntesis de ácidos nucleicos según la invención o a través de la técnica de la amplificación en cadena el ADN, designada en adelante como la técnica PCR (Polymerase Chain Reaction). Esta técnica se encuentra particularmente descrita en las patentes americanas nº. 4.683.202 y nº. 4.683.195, así como en la patente europea nº. 200.362. Los cebadores según la invención están constituidos de manera ventajosa por alrededor de 15 a 40 nucleótidos correspondientes a las extremidades 3' y 5' de una y otra de las dos cadenas que constituyen los fragmentos de ADN mencionados anteriormente.

La invención se refiere también a sondas nucleótidas obtenidas de una u otra de las dos cadenas que constituyen los fragmentos de ADN mencionados anteriormente, especialmente para la detección en una muestra biológica de la presencia eventual de LGC.

De manera ventajosa, las sondas de la invención están constituidas por alrededor de 17 a 23 nucleótidos. La detección de la presencia de LGC en una muestra se realiza preferentemente después de la ampliación del número de copias de los genes o del ARNm que codifican para LGC, susceptibles de estar presentes en la muestra, con la ayuda de los cebadores indicados anteriormente.

A este respecto, la invención esta relacionada con un equipo para la realización del procedimiento de detección mencionado anteriormente, que comprende:

- llegado el caso, cebadores tales como los descritos anteriormente, así como los reactivos para la constitución de un medio adecuado para la realización de la amplificación de secuencia de ADN o de ARN que codifica para la LGC.

-

una sonda de nucleótidos tal como la descrita anteriormente, llegado el caso marcada, especialmente de manera radioactiva o enzimática, así como los reactivos para la constitución de un medio adecuado para la realización de la hibridación entre la sonda y la secuencia de ADN o de ARN mencionada anteriormente.

-

los reactivos que permiten la detección de la sonda hibridada con la citada secuencia.

De manera ventajosa, las sondas de nucleótidos de la invención son susceptibles de hibridarse a la vez con la secuencia de ADN o de ARN que codifica para la LGC y con las que codifican para la lipasa gástrica humana (LGH) y la de conejo (LGL). Las citadas sondas son utilizadas para la realización de un procedimiento de detección in vitro de la presencia eventual de LGH en una muestra biológica susceptible de contener esta última. El citado procedimiento de detección es llevado a la práctica de la forma indicada anteriormente y permite el diagnóstico in vitro de patologías vinculadas con la sobreproducción o, a la inversa, con la insuficiencia, incluso con la ausencia, de producción de lipasa gástrica en el organismo.

La invención tiene igualmente por objeto los polipéptidos que corresponden, según el código genético universal, a los ácidos nucleicos según la invención, descritos anteriormente o cualquier fragmento de estos polipéptidos recombinantes o cualquier polipéptido modificado por sustitución y/o adición y/o supresión de uno o de varios aminoácidos de estos polipéptidos recombinantes, conservando estos fragmentos o polipéptidos modificados las propiedades enzimáticas de los polipéptidos recombinantes mencionados anteriormente.

Es preciso entender por "polipéptido recombinante" cualquier molécula que posee una cadena polipeptídica susceptible de ser producida a través de ingeniería genética, por transcripción y traducción de una secuencia de ADN correspondiente, bajo el control de elementos de regulación apropiados en el interior de un hospedador celular eficaz. Por consiguiente, la expresión "polipéptidos recombinantes" no excluye la posibilidad de que estos polipéptidos hayan sufrido modificaciones post-traduccionales, tales como la glicosilación.

El término "recombinante" implica el hecho de que el polipéptido ha sido producido a través de ingeniería genética, más particularmente, en base al hecho de que este polipéptido es el resultado de la expresión en un hospedador celular de secuencias de ácidos nucleicos que han sido introducidos previamente en un vector de expresión utilizado en el citado hospedador.

Sin embargo, debe quedar claro que esta expresión no excluye la posibilidad de que el polipéptido sea producido a través de un procedimiento diferente, por ejemplo, a través de síntesis química clásica según los procedimientos utilizados habitualmente para la síntesis de las proteínas o por rotura de moléculas de tamaño más grande.

La invención se refiere igualmente a los polipéptidos mencionados anteriormente en forma biológicamente pura. Por la expresión "biológicamente puro", debe entenderse, de una parte, un grado de pureza que permite al polipéptido recombinante ser utilizado para la producción de composiciones farmacéuticas y, por otra, una ausencia de contaminantes, más particularmente, de contaminantes de origen natural.

En este sentido, la invención se refiere, más particularmente, a:

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el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 1 y 379 de la secuencia de aminoácidos representada en la figura 9A (SEQ ID NO 3), y correspondiente a la LGC madura, tal como la obtenida a través de ingeniería genética y en la cual el peso molecular varía desde aproximadamente 43.200 hasta aproximadamente 50.000 daltons, una vez que el hospedador, en el cual la misma se produce, efectúa modificaciones post-traduccionales sobre la cadena polipeptídica de esta LGC.

-

Los polipéptidos mencionados anteriormente, en los cuales las secuencias de aminoácidos están precedidas de una metionina (SEQ ID NO 5).

De manera ventajosa, los polipéptidos según la invención mencionados anteriormente, y más particularmente la LGC recombinante, poseen una actividad lipolítica comprendida entre aproximadamente 50 U/mg de polipéptido y aproximadamente 750 U/mg de polipéptido y preferentemente superior a 250 U/mg de polipéptido, cuando se mide con la ayuda de un triglicérido de cadena corta (tal como la tributirina), como sustrato, según el procedimiento de Gargouri (descrito más particularmente en la descripción detallada que surge de la invención). Una unidad U corresponde a la cantidad de enzima necesaria para liberar un \mumol de iones H^{+} (es decir, de ácidos grasos libres) por minuto,
a 37ºC.

La actividad lipolítica máxima de los polipéptidos recombinantes, según la invención, sobre los ácidos grados de cadena larga, resulta obtenida de manera ventajosa a valores de pH comprendidos entre 3 y 5.

Según otro aspecto ventajoso de los polipéptidos recombinantes de la invención, su actividad lipolítica permanece no modificada después de la incubación durante una hora a pH 2 y a 37ºC.

La presente invención concierne igualmente a un procedimiento de preparación de un polipéptido tal como el descrito anteriormente, comprendiendo este procedimiento la sucesión de las siguientes etapas:

-

el cultivo de un hospedador celular, transformado por un vector recombinante, tal como el descrito anteriormente, en un medio de cultivo adecuado, y

-

la recuperación del polipéptido producido por el citado hospedador celular, ya sea directamente a partir del citado medio de cultivo, cuando la secuencia que codifica para el citado polipéptido está precedida de una secuencia señal y que el hospedador celular sea capaz de secretar el polipéptido en el medio de cultivo (especialmente en el caso de células eucariotas y levaduras), sea después de la lisis del hospedador celular (especialmente en el caso de bacterias).

Según sea el caso, la etapa de recuperación es seguida de una etapa de purificación del polipéptido recuperado y, especialmente, después de la recuperación por medio de lisis de la bacteria, por una etapa de solubilización del polipéptido, después de su renaturización.

Los agentes y las técnicas de solubilización de los polipéptidos obtenidos bajo forma de inclusión son bien conocidos por parte del experto en la materia, Esencialmente, los agentes solubilizantes son urea; halogenuros de amonio cuaternarios, tal como el cloruro de guanidinio o el cloruro de cetiltrimetilamonio, los cuales son utilizados en procedimientos experimentales tales como los descritos por N.K. Puri y col., en Biochem. J. (1992) 285 871-879.

De manera ventajosa, tal como ya ha sido precisado anteriormente, las secuencias de nucleótidos que codifican para los polipéptidos cuya producción se investiga, e insertados en el vector utilizado para transformar las células hospedadoras, van precedidos de una secuencia señal que permite también la secreción de los polipéptidos producidos fuera de las células hospedadoras y su recuperación directamente a partir del medio de cultivo, sin tener que proceder a la lisis de las citadas células hospedadoras.

A título de ejemplo, la síntesis de la LGC madura en células de mamíferos, tales como las células COS o las células CHO, podrá ser obtenida mediante la inserción del ácido nucleico que codifica para el precursor de la LGC en un vector de expresión adecuado.

La presencia del segmento de ADN que codifica para el péptido señal le permitirá a la maquinaria celular glicosilar en el retículo endoplásmico y secretar la LGC en el medio de cultivo, bajo una forma biológicamente activa.

De forma alternativa, la producción de lipasa gástrica de perro a través de células de insectos podrá ser obtenida mediante la inserción de ADNc que codifica para la LGC o su precursor detrás de un promotor adecuado en el genoma de un virus de tipo baculovirus, susceptible de infectar a las referidas células.

Para que una levadura tal como la Saccharomyces cerivisiae o la Kluiveromyces lastis produzca y secrete la LGC resultará preferible reemplazar, en el cDNA, el segmento de ADN que codifica para el péptido señal de la LGC por un fragmento que codifique para un péptido señal de proteína de levadura. El ADNc complementario obtenido de esta forma será entonces introducido en un vector de expresión específico del hospedador considerado. Los citados sistemas de expresión son relativamente corrientes en la actualidad. Por ejemplo, se puede citar la expresión de la sueroalbúmina humana (patente europea nº. 0 361 991 A2) o la quimosina de ternera (Van den Berg J.A. et al., Biotechnology 8 (1990) 135-139).

La Escherichia coli es una bacteria Gram negativa provista de una pared tal que los fenómenos de secreción de proteínas en el medio de cultivo resultan extremadamente reducidos. Un determinado número de proteínas se acumulan en el periplasma bacteriano gracias a la presencia de señales similares a las secuencias señal de las proteínas eucariotas. Entre las mismas se pueden citar los productos de los genes phoA y malE, por ejemplo. Determinadas regiones de estos genes han sido utilizadas para producir proteínas heterólogas en el espacio periplasmático de E. Coli. Sin embargo, la síntesis en el citoplasma de proteínas extrañas hace que el sistema devenga el mejor conocido y el más utilizado en la E. Coli.

El respeto de determinadas reglas educidas de la experiencia, fuera de la realización de las construcciones de plásmidos, permite optimizar el nivel de expresión de proteínas de interés.

En un primer momento, convendrá colocar ADNc que codifica para la parte madura de la LGC, es decir, desprovisto del segmento que codifica para el péptido señal, detrás de un promotor bacteriano o fago creciente. Pare evitar eventuales problemas de toxicidad de la proteína extraña en la bacteria se elegirá, preferiblemente, un promotor inducible por un agente químico (promotores Lac o Trp) o por un agente físico tal como el cambio de temperatura (promotor P_{L} y represor cI857). El ADNc deberá estar en posición contigua en su región 5' terminal a una secuencia ATG que especifique el inicio de la síntesis proteica sobre el ARN mensajero. Este iniciador ATG deberá estar precedido, a una distancia de 6 a 12 pares de bases, de una región rica en purinas, denominada región de Shine y Dalgarno y que corresponde, sobre el ARN mensajero, al punto de fijación de los ribosomas.

La secuencia del segmento de ADN situado en la región de Shine y Dalgarro y el iniciador ATG podrá ser modificada en su composición, con vistas a reducir los elementos de estructura secundaria alrededor del codon de iniciación AUG sobre el ARN mensajero. Una vez efectuadas las modificaciones necesarias, el vector será introducido en un hospedador adecuado.

La invención está relacionada con anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos de la invención y, más particularmente, los dirigidos contra la LGC y susceptibles de reconocer igualmente a la LGH y a la LGL. Los citados anticuerpos pueden ser obtenidos por medio de inmunización de un animal con estos polipéptidos, seguida de la recuperación de los anticuerpos formados.

Resulta obvio que esta producción no está limitada a los anticuerpos policlonales.

La misma se aplica todavía a cualquier anticuerpo producido por cualquier hibridoma susceptible de ser formado, a través de los procedimientos habituales, a partir de células esplénicas de un animal, especialmente de ratón o de rata, inmunizados contra uno de los polipéptidos purificados de la invención, de una parte, y de células de un mieloma apropiado, de otra, y de ser seleccionado, por su capacidad de producir anticuerpos monoclonales que reconocen al polipéptido inicialmente puesto en circulación por la inmunización de los animales, al igual que la LGH.

La invención se refiere igualmente a la utilización de anticuerpos para la puesta en práctica de un procedimiento de detección o de dosificación de la LGC o de la LGH en una muestra biológica susceptible de contenerla.

La invención está particularmente relacionada con la utilización de estos anticuerpos para la puesta en práctica de un procedimiento de diagnosis in vitro de patologías vinculadas a la sobreproducción o, a la inversa, con a la insuficiencia, incluso con la ausencia de producción de lipasa en el organismo.

Este procedimiento de diagnosis in vitro realizado a partir de una muestra biológica obtenida previamente de un paciente, comprende una etapa de observación de esta muestra, seguida de una etapa de detección de eventuales complejos anticuerpo-LGH, formados fuera de la etapa precedente.

A este respecto, la invención concierne también a un equipo para la puesta en práctica de un procedimiento de detección o de diagnosis in vitro mencionado anteriormente, que comprende:

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anticuerpos tales como los descritos anteriormente, marcados ventajosamente de forma radioactiva o enzimática, al igual que los reactivos para la constitución de un medio propicio para la realización de la reacción inmunológica entre estos anticuerpos y la LGH,

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los reactivos que permiten la detección de complejos inmunológicos formados entre estos anticuerpos y la LGH.

La invención se refiere igualmente a la utilización de uno o varios polipéptidos descritos anteriormente, para la obtención de composiciones farmacéuticas utilizables especialmente por vía oral, destinadas a facilitar la absorción de grasas animales o vegetales ingeridas por un individuo sano o afectado por una o varias patologías que afectan o no al porcentaje de producción de lipasa gástrica. Especialmente, las citadas composiciones son utilizadas ventajosamente en individuos que están sometidos a un tratamiento médico que altera el mecanismo de absorción de las grasas, o en las personas de edad.

La invención se refiere, más particularmente, a la utilización de uno o varios polipéptidos descritos anteriormente para la obtención de medicamentos destinados al tratamiento de patologías vinculadas con la insuficiencia, incluso con la ausencia, de producción de lipasas en el organismo y, más particularmente, con patologías tales como mucoviscidosa y la insuficiencia pancreática exócrina.

La invención tiene igualmente por objeto composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un polipéptido según la invención, llegado el caso en combinación con uno o diversos polipéptidos con actividad lipásica, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas según la invención son administrables preferiblemente por vía oral, y se presentan especialmente en forma de cápsulas, comprimidos y polvos para diluir.

La posología diaria en el hombre se encuentra, ventajosamente, entre aproximadamente 400 mg y aproximadamente 1200 mg, repartidos preferentemente en el momento de las comidas principales, o sea a razón de entre aproximadamente 130 mg a aproximadamente 400 mg por comida.

La invención está igualmente relacionada con la utilización de polipéptidos tales como los descritos anteriormente, según la invención, para la puesta en práctica de reacciones de bioconversión enzimáticas (tales como hidrólisis, transesterificaciones enzimáticas), especialmente bajo forma inmobilizada sobre un soporte sólido.

Tratándose de la preparación de ácidos nucleicos de la invención, esta puede ser efectuada por la vía química, especialmente según uno de los siguientes procedimientos.

Un modo de preparación adecuado de ácidos nucleicos (comportando un máximo de 200 nucleótidos) de la invención por vía química, comprende las siguientes etapas:

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síntesis de ADN utilizando el procedimiento automatizado de \beta-cianoetilfosforamidita, descrito en Bioorganic Chemistry 4; 274-325, 1986.

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clonaje de los ADN obtenidos de esta forma en un vector plásmido apropiado y recuperación de los ADN por hibridación con una sonda adecuada.

Un modo de preparación, por la vía química, de ácidos nucleicos de longitud superior a 200 nucleótidos, comprende las siguientes etapas:

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la unión de oligonucleótidos sintetizados químicamente, provistos en sus extremidades de puntos de restricción diferentes, en los cuales las secuencias son compatibles con el encadenamiento de aminoácidos del polipéptido natural, según el principio descrito en Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80; 7461-7465, 1983.

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el clonaje de los ADN obtenidos de esta forma en un vector plásmido apropiado y la recuperación del ácido nucleico buscado por hibridación con una sonda adecuada.

La invención se ilustrará de una manera más particular con la ayuda de la descripción detallada que resulta de la construcción de vectores recombinantes según la invención y de su utilización para la producción de LGC.

Se ha realizado una preparación de ARN a partir de mucosa aislada de la región fúndica del estómago de perro. Los ARN mensajeros aislados por medio de cromatografía de afinidad, sobre columna de oligo-dT celulosa, han sido convertidos en ADN complementario (ADNc) gracias a la utilización de enzimas particulares: la transcriptasa inversa del Virus de Sarcoma de Rous y la DNA polimerasa I de E coli (fragmento de Klenow). Este ADNc ha sido introducido en el vector pUC18 después de determinadas modificaciones y las moléculas recombinantes han sido utilizadas para transformar la bacteria E. Coli MM294. Los clones transformadores han sido cribados por hibridación in situ, con la ayuda de una sonda que contiene el ADNc de la lipasa gástrica de conejo marcada radioactivamente. Después de una auto-radiografía, las colonias bacterianas correspondientes a una señal positiva fuera de la experiencia de hibridación han sido aisladas y el ADN plasmídico presente en su citoplasma, amplificado y purificado.

Después del cribado de los clones obtenidos, el clon 3.12 ha sido seleccionado y secuenciado. Este clon contiene un inserto PstI-PstI de 1201 pares de bases, dividido a si mismo en dos partes desiguales H y L, por un punto de restricción PstI.

Ningún otro clon conteniendo el ADN completo ha podido ser puesto en evidencia en este estadio.

Con vistas a poder aislar el clon que contiene el ADNc que codifica para la lipasa de perro madura, se ha utilizado una técnica complementaria.

Una fracción de ARNm obtenida de la preparación de partida es convertida en ADNc de cadena única, gracias al enzima transcriptasa inversa y a un cebador oligonucleotídico LPC_{2} (figura 2B), obtenido a partir de la secuencia 3' terminal del ADNc contenido en el clon 3.12, previamente aislado y secuenciado.

El ADNc que codifica para la parte madura de la LGC es después obtenido y amplificado por el procedimiento de la PCR, en presencia de Taq Polimerasa y de dos cebadores oligonucleotídicos, LPC_{2} tal como el mencionado anteriormente, y DGL_{1}, concebido a partir de la comparación de secuencias nucleótidas 5'-terminales de lipasa gástrica humana y de conejo, de la lipasa lingual de rata y de la secuencia proteica NH_{2}-terminal conocida de la LGC.

El ADNc de doble cadena obtenido de esta manera ha sido introducido en el vector pBluesript KS(+) después de determinadas modificaciones y las moléculas recombinantes han sido utilizadas para transformar la bacteria E. Coli MM294. Los clones transformadores han sido cribados por PCR con la ayuda de sondas oligonucleotídicas que corresponden a las partes de la secuencia del vector pBluescript KS(+) situadas a una parte y otra del inserto. El clon pKSPCR que contiene un inserto de 700 pares de bases ha sido seleccionado y secuenciado.

Paralelamente, después de digestión por medio del enzima de restricción PstI, el fragmento "H" del inserto de ADNc del clon 3.12, tal como se ha obtenido anteriormente, es insertado en el plásmido pKSPCR linealizado por PstI; se obtiene un clon pKSPCR 10 que contiene el ADNc que codifica para la lipasa gástrica de perro madura.

El análisis de la secuencia de nucleótidos de este ADNc ha permitido poner en evidencia una fase abierta de lectura de 1137 nucleótidos (NT) correspondiente a una proteína de 379 AA y de un peso molecular de 43222 daltons.

La comparación con las secuencias de nucleótidos de otras lipasas preduodenales (Docherty, A.P.J. et al., (1985) op. cit., Bodmer, M.W. et al., (1987) op. cit.; Moreau, H. et al., (1988) op. cit.) hace aparecer una homología del 84,7% con la LGH, del 75,7% con la LLR y del 81% con la LGL, en las regiones codificantes.

De manera alternativa, puede utilizarse un segundo procedimiento para la obtención de un clon que contiene el ADNc que codifica para la LGC madura.

En el caso en el que los extractos ARNm de la mucosa de estómago de perro, aislados por cromatografía de afinidad sobre columna oligo-dT, y convertidos en ADNc gracias a la utilización de enzimas específicos (transcriptasa inversa del virus de Sarcoma de Rous y DNA polimerasa I de E. Coli) correspondiente al ARNm entero de la LGC madura o de su precursor, el ADNc así obtenido podrá ser introducido después de determinadas modificaciones en el vector pUC18 y las moléculas recombinantes utilizadas para transformar una célula hospedadora, preferiblemente bacteria o levadura, los clones transformadores serán cribados por hibridación in situ con la ayuda de sondas obtenidas de la lipasa gástrica de conejo.

Después de auto-radiografía, las colonias de células hospedadoras correspondientes a un señal positivo fuera de la hibridación será aisladas y el ADN plasmídico presente en el citoplasma de estas células, amplificado y purificado. De forma ventajosa, las técnicas generales de clonaje utilizadas en este segundo procedimiento serán las mismas que las puestas en práctica en el procedimiento descrito anteriormente.

Técnicas generales de clonaje

Procedimientos clásicos de biología molecular, tales como la purificación de ARN mensajeros, la extracción y la purificación de ADN plasmídico, la digestión mediante enzimas de restricción, la electrofóresis sobre gel agarosa o de poliacrilamida, la electroelución de gel de agarosa de fragmentos de ADN, la trasformación en E coli, aparecen descritos en la literatura (Maniatis, T. Et al., "Molecular cloning: a laboratory manual, second edition", Cold Sping Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel, F.M. et al., (eds.) "Current Protocols in Molecular Biology", John Willey and Sons, New York, 1987).

El "cebado aleatorio" se efectúa según el procedimiento descrito por Feinberg y Wogelstein (Anal. Biochem. (1983) 132:6; Anal. Biochem. (1984) 137:266).

Los enzimas son obtenidos después en las compañías Boehringer o New England Biolabs y utilizados en las condiciones preconizadas por los suministradores.

Los fragmentos de ADN destinados a ser ensamblados son separados según su tamaño mediante electroforesis de gel de agarosa al 1%, purificados mediante electroelución y precipitados a través de etanol. La ligadura de los fragmentos de AND se efectúa en presencia de T_{4}DNA ligasa a 4ºC ó a 16ºC, en un tampón apropiado, en función de si los trozos a ensamblar poseen extremidades francas o cohesivas.

El secuenciado del ADN se efectúa según el procedimiento de didesoxinucleótidos (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) (5463-5467), utilizando un equipo "T7 Sequencing" (Pharmacia).

La amplificación enzimática de fragmentos de ADN específicos se efectúa según el procedimiento de "Reacción en cadena catalizada por polimerasa" o PCR (Saiki, R.K. et al., Science 220 (1985) 1350-1354), con la ayuda de un aparato PREM III LEP Scientific.

Los oligonucleótidos utilizados como cebadores en las reacciones de PCR o de secuenciado son sintetizados con la ayuda de un sintetizador de ADN modelo 391 PCR-MATE (Applied Biosystems) y purificados mediante cromatografía a elevada presión en fase líquida antes de su utilización.

Las moléculas de ADN recombinantes son utilizadas para transformar células de las siguientes cepas de E. Coli:

-MM294 [F-, endA1, hsdR17 (r_{K}-M_{K}+), supE44, thi-1, reIA1] o

-W3110I^{q} [F'TraD36, LacI^{q}, _(lacZ)M15, pro+]

El ADN plasmídico es extraído de los transformadores bacterianos resistentes a la ampicilina, según un protocolo derivado del procedimiento de lisis alcalina descrito por Birnboin et Doly, H.C. (Birnboim, H.C. and Doly, J. Nucl. Ac. Res. 7 (1979) 14512-1523).

La inmunodetección de la lipasa gástrica de perro sintetizada en la bacteria E.coli W3110 I^{q}, después de la adición de IsoPropylThioGalactopyranoside (IPTG) en el medio de cultivo, se efectúa a través de un procedimiento de inmunoimpresion sobre membrana de nylon utilizando un anticuerpo de cobaya anti-LGC y el equipo de revelado de la peroxidasa ImmunoPure ABC (Pierce).

El proceso de preparación de la lipasa comprende diversas etapas, las cuales son detalladas de acuerdo con lo siguiente:

Etapa nº 1

Clonaje de un ADNc que codifica para la lipasa gástrica de perro 1.1 Aislamiento y purificación de ARN mensajeros de mucosa fúndica de estómago de perro

Después de la trituración de los tejidos en un tampón que contiene cloruro de litio y urea (Auffray, C. Y Rougeon, F., J. Biochem. 107 (1980) 303-314), el ARN total es separado del ADN por precipitación selectiva con cloruro de litio. Las proteínas contaminantes el ARN son entonces eliminadas por medio de extracción fenólica. Los ARN mensajeros, poliadenilados en su extremo 3'OH, son separados de los ARN ribosómicos por medio de cromatografía de columna de oligo-dT celulosa (Maniatis, T et al., ya mencionado). Se obtienen de esta forma alrededor de 75 microgramos de ARN mensajero por gramo de tejido.

1.2. Puesta en evidencia del ARN mensajero que codifica para la LGC en la preparación del ARN mensajero extraído de la mucosa fúndica del estómago de perro

La lipasa gástrica de perro ha sido purificada hasta homogeneidad y determinada su secuencia polipeptídica NH_{2} terminal (Carriere F., et al., ya citado).

Una sonda constituida por el ADN que codifica para el precursor de la lipasa de conejo es utilizada para verificar la presencia de un ARN que codifica para la LGC en la preparación obtenida.

Se realiza una experiencia de hibridación de tipo "Northern". Una muestra de 20 \mug de ARN mensajero de estómago de perro es desnaturalizada a 60ºC, en presencia de glioxal y de DMSO, después los ARN son separados según el tamaño por medio de electroforesis en un gel de agarosa al 1% en tampón fosfato 10 mM, pH=7 (Thomas, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 5201-5205.

Después de la electroforesis, el ARN mensajero es transferido sobre una membrana de nylon (Biodyne PALL), de acuerdo con el protocolo preconizado por el suministrador.

El fragmento de ADNc correspondiente a la lipasa de conejo es marcado por medio de "cebado aleatorio". Las membranas obtenidas anteriormente son hibridadas individualmente durante 36 horas a 37ºC en un tampón 5 x SSC -5X Denhart's -50 mM fosfato de sodio, pH=6,5-0,1% SDS-50% formamida, conteniendo 10 ng/ml de la sonda radioactiva (Ausubel, F. et al (eds)., ya mencionada). Las temperaturas utilizadas tienen en cuenta eventuales homologías de secuencias entre la LGL y la LGC. Un ARNm de aproximadamente 1700 nucleótidos se hibrida con la sonda radioactiva.

1.3 Síntesis de ADN complementario a partir de ARNm de estómago de perro e inserción en el vector pUC18

La síntesis de ADNc de doble cadena se realiza a partir de 4 \mug de ARN polyA+, en presencia de 50 unidades de AMV transcriptasa inversa, de 100 ng de un cebador olig-dT y de la DNA polimerasa I de E. Coli.

Una fracción de este ADN es insertada en el vector pUC18 mediante la utilización de colas oligo-dC y oligo-dG, añadidas respectivamente sobre el ADNc y sobre el vector linearizado previamente por medio del enzima PstI (Gubler, U. Y Hoffamn, B.J., Gene 25 (1883) 263-269).

Las moléculas hibridadas son utilizadas para transformar bacterias competentes E. Coli MM294. La selección de transformadores se efectúa exponiendo el producto de la transformación sobre un medio nutritivo sólido (LB-Agar) que contiene ampicilina a razón de 50 mg/litro.

1.4 Aislamiento del ADNc que codifica para la LGC

Las colonias bacterianas obtenidas de la transformación son transferidas sobre membranas de nylon (Biodyne PALL) y sometidas a lisis de acuerdo con un procedimiento recomendado por el suministrador. Esta operación tiene por efecto la desnaturalización y la fijación sobre la membrana del ADN bacteriano y plasmídico contenido en las colonias.

Después de diversos lavados con un ampón 3X SSC -0,1% SDS, a temperatura ambiente y después a 65ºC, los filtros son pre-hibridados durante dos horas en un tampón 6 X SSC -10 X Denhart's- 0,1% SDS, después hibridados a 50ºC en el mismo tampón conteniendo la sonda de conejo marcada en ^{32}P por medio de "cebado aleatorio", a razón de 0,5 \muci por ml de tampón.

Los filtros son lavados en un tampón 2XSSC -0,1% SDS a temperatura ambiente después a 50ºC en el mismo tampón, antes de ser colocados en auto-radiografía durante 24 a 48 horas.

Se efectúa un cribado de las colonias sobre dos series de filtros con la sonda de conejo. Se obtiene de esta forma el clon 3.12 (figura 3).

1.5. Síntesis de ADNc gracias al oligonucleótido específico LPC_{2} e inserción en el vector pBluescript KS(+) 1.5a. Síntesis de ADNc gracias al oligonucleótido específico LPC_{2}

Se realiza una síntesis de ADNc de cadena simple a partir de 5 \mug de ARN poly A+, e presencia de 50 unidades de AMV de transcriptasa inversa y de 100 ng de unoligonucleótido sintético LPC_{2} específico de la LGC, correspondiente a la secuencia en 3' del ADNc contenido en el clon 3.12 descrito anteriormente.

Después de la extracción de la solución con fenol-cloroformo y de precipitación en alcohol, el resto obtenido es disuelto en 20 microlitros de agua destilada; el ADNc de cadena simple en solución es entonces amplificado y transformado en ADN de doble cadena por medio de la técnica de la "PCR", con la ayuda de los cebadores DGL_{1} y LPC_{2} presentados en la figura 2B, con vistas a ser clonado en un vector apropiado. El cebador DGL_{1} utilizado anteriormente está constituido por una mezcla de 12 secuencias, correspondiendo cada una de ellas a una de las combinaciones posibles de representación de DGL_{1}, teniendo en cuenta el hecho de que dos nucleótidos T pueden ser sustituidos por un nucleótido C y que un nucleótido G puede ser sustituido por un nucleótido T o un nucleótido A, en las posiciones indicadas debajo del cebador DGL_{1} representado en las figuras 2A y 2B.

1.5.b. Inserción en el vector pBluescript KS(+)

Después de digestión por medio del enzima PstI, el fragmento de 700 pb de ADNc es insertado en el vector pBluescript KS(+) digerido por los enzimas de restricción Smal y PstI.

Las moléculas recombinantes resultantes de la unión son utilizadas para transformar las bacterias competentes E. Coli MM294. La selección de los transformadores se efectúa exponiendo el producto de la transformación sobre un medio nutritivo sólido (LB.Agar) que contiene ampicilina a razón de 50 mg/litro.

Se obtiene también el clon pKSPCR.

1.5.c. Unión del fragmento "H" del clon 3.12 en el plásmido pKSPCR

El clon 3.12 es digerido por el enzima de restricción PstI; el fragmento "H" PstI-PstI de 850 pares de bases del clon 3.12 correspondiente a la región 3' del ADNc de la LGC es insertado en el plásmido pKSPCR linealizado con anterioridad, por medio del enzima PstI.

La conjunción de estas etapas se encuentra presente en la figura 4.

1.6 Aislamiento del ADNc del clon pKS DGL10

Un clon, pKS DGL10, ha sido seleccionado después de cribado por "PCR" (C. Blanchard et C. Benicourt,
Boehringer, "Le brin complementaire", septembre 1992, nº 8, p6). La rotura mediante enzimas de restricción del plásmido pKSDGL10, demuestra que el mismo contiene un inserto de 1,5 kb. Este plásmido se prepara a partir de un litro de cultivo bacteriano, a la vista de su análisis y de su secuenciado.

El secuenciado del clon se realiza sobre el ADN de doble cadena, por el procedimiento de Sanger (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467).

La secuencia completa del ADNc comporta 1528 nucleótidos y se presenta en la figura 8. Una fase abierta de lectura que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 1137 codifica para una proteína de 379 AA. La secuencia de esta proteína se indica en la figura 9A. Esta proteína posee el 81% de homología con la lipasa gástrica de conejo (patente francesa nº 91 13948).

Etapa nº 2

Construcción de plásmidos para expresar la LGC en Escherichia Coli 2.1 Elección del vector de expresión

El vector retenido para expresar la LGC en E coli es un plásmido en el cual un fragmento de ADN sintético de 160 pb que contiene un promotor de tipo Tac y un finalizador de transcripción, ha sido insertado entre los puntos EcoRI y DdeI de pBR322 (Bolivar, F. Et al, Gene 2 (1977) 95-113). El mapa de restricción del vector pRU303 está presente en la figura 5 y la secuencia de nucleótido del fragmento de ADN EcoRI-NdeI en la figura 6.

2.2 Construcción del plásmido pDGL5.303

A pesar de los exhaustivos estudios que se han efectuado, han podido establecerse escasas correlaciones entre el nivel de expresión de una proteína heteróloga en una bacteria y la secuencia de nucleótidos de la región 5'-terminal del ARN mensajero de esta misma proteína. Sin embargo, un determinado número de observaciones han permitido deducir determinadas reglas empíricas que pueden conducir a un nivel de expresión más elevado en las bacterias recombinantes.

Entre estas reglas se pueden citar:

-

la distancia entre la región de Shine y Dalgarno y el AUG iniciador comprende entre 6 y 12 nucleótidos,

-

una secuencia de Shine y Dalgarno rica en purinas (AGGA),

-

una estructura secundaria mínima entre Shine y Dalgarno y el AUG iniciador,

-

la ausencia de estructura secundaria (doble cadena) en las regiones del ARN mensajero que contiene la secuencia Shine y Dalgarro y el AUG iniciador.

En los programas de análisis que permiten definir las secuencias de nucleótidos de las regiones 5' que no codifican para ARNm susceptibles de conducir a los mejores niveles de expresión de proteínas heterólogas particulares, tales como la LGC en E coli, se pueden tener en cuenta las citadas limitaciones.

Gracias a cebadores sintéticos específicos DGL_{2} y DGL_{3} presentados en la figura 10 y mediante la técnica de amplificación genética "PCR" , el ADNc que codifica para la parte madura de la LGC está posicionado detrás de un codon de iniciación de la traducción ATG y colocado detrás de secuencias de nucleótidos tales que favorecen la inserción en el vector de expresión pRU303 entre los puntos de restricción BgIII y SaII. Del hecho de la presencia, en la construcción pDGL5.303, de un codon ATG inmediatamente por más arriba de las secuencias que codifican para LGC, las proteínas recombinantes obtenidas poseerán, total o parcialmente, una metionina en su extremidad NH_{2}-terminal.

El plásmido recombinante pDGL5.303 cuyo esquema de construcción se indica en la figura 7, ha sido obtenido en la cepa E coli MM294, después transferida en la cepa E coli W3110 I^{q}, frecuentemente utilizada para la expresión de proteínas heterólogas. Esta cepa contiene el gen del represor Lac I^{q} situado sobre un episomo no transferible F': el represor sintetizado en cantidad importante en la bacteria limita la expresión de todos los genes colocados bajo control de un promotor de tipo lactosa.

Etapa nº 3 Expresión de la LGC en E coli

El plásmido pDGL5.303 ha sido introducido en el hospedador E. Coli W3110 I^{q}.Las bacterias transformadas por el plásmido son cultivadas en el medio en presencia de M9 glucosa (Maniatis, T. et al., ya mencionado). Durante la fase exponencial de crecimiento, la expresión de la lipasa gástrica de perro es inducida mediante la adición de IPTG a la concentración final de 2 mM.

Después de 4 horas a 37ºC, las bacterias son recogidas, centrifugadas y lavadas con tampón PBS. Las bacterias son después sometidas a lisis en un tampón que contiene SDS y \beta-mercaptoetanol, durante 10 minutos a 100ºC.

El análisis de proteínas sobre gel de electroforesis en condiciones desnaturalizantes permite la puesta en evidencia de una banda proteica que puede corresponder a la lipasa. La proteína es expresada a un porcentaje tal que la misma puede ser detectada por esta técnica, tal como se muestra en la figura 11.

A los efectos de tener la seguridad de que esta proteína, inducida por la adición de IPTG al medio de cultivo, corresponde bien a la LGC, las proteínas que proceden de cultivos de bacterias transformadas por el plásmido pGLC5.303, inducidas y no inducidas por el agente químico, son transformadas sobre una membrana de nylon, después de que las mismas hayan sido separadas según su tamaño, por medio de electroforesis sobre gel de poliacrilamida-SDS.

El complejo entre la LGC y el anticuerpo anti-LGC puede ser puesto en evidencia gracias a una reacción colorimétrica que hace intervenir un segundo anticuerpo acoplado a una enzima, la peroxidasa de rábano. Los resultados se presentan en la figura 12.

Además de ser producida en forma de cuerpo de inclusión en el citoplasma de la bacteria Eschericchia Coli, la lipasa gástrica de perro puede ser secretada de manera ventajosa en el periplasma bacteriano insertando el ADNc que codifica para el enzima maduro en un vector adecuado, bajo control de un promotor inducible por un agente físico o químico y más bajo de un segmento de ADN que codifica para un péptido señal, tal como el que se encuentra presente en la extremidad NH_{2}-terminal de la proteína ompA (Movva N.R. et al., J. Biol. Chem. 256: 27-29, 1980).

La lipasa gástrica de perro puede ser igualmente sintetizada en Eschericchia coli en forma de una proteína de fusión soluble con la proteína A de Staphylococcus aureus, que permite su purificación posterior. A tal fin, el ADNc que codifica para la lipasa madura es insertado en el vector pRIT2T (Nilsson B. et al., EMBO J. 4: 1075-1080, 1985), que ha sido modificado previamente con vistas a introducir un fragmento de ADN que codifica para el punto de reconocimiento Ile-Glu-Gly-Arg del factor Xa de la coagulación. La proteína de fusión producida de esta forma puede ser separada de las otras proteínas del citoplasma de la bacteria por medio de cromatografía de afinidad sobre una columna de IgG-Sepharosa (Pharmacia). Después de la elución de la columna, la proteína de fusión es cribada por el factor Xa. El producto de la hidrólisis es sometido de nuevo a cromatografía sobre columna de IgG-Sepharose que retiene la proteína A, permitiendo de esta forma obtener la lipasa gástrica de perro en estado puro y bajo forma soluble.

Resulta igualmente posible obtener la lipasa gástrica de perro a partir de células de mamíferos en cultivo. Para ello, resulta conveniente insertar el ADNc que codifica para el precursor de esta lipasa en un vector apropiado, tal como el plásmido pCDNAI-Neo (Invitrogen corporation) bajo control del promotor de Cytomegalovirus (CMV), o todavía el ADNc que codifica para la lipasa madura en el mismo tipo de vector, pero más abajo de un segmento de ADN que codifica para el péptido señal de la lipasa gástrica de conejo (Bénicourt C., et al; solicitud de patente francesa nº 2 633 549, mencionada anteriormente). La introducción de tales plásmidos recombinantes en las células COS-7 de riñón de mono que expresan el antígeno T del virus SV40 de forma consecutiva permite producir transitoriamente la lipasa gástrica de perro en el medio de cultivo en cantidad notable. Pueden obtenerse líneas celulares que expresan la lipasa gástrica de perro de forma consecutiva, mediante la introducción de uno de los dos plásmidos recombinantes en células de ovario de hámster (CHO) y ejerciendo una presión de selección con el antibiótico G418 o genetecina, del hecho de la presencia de un gen de resistencia a los aminoglicósidos, tales como la neomicina, sobre los citados plásmidos.

La detección de la actividad de la LGC recombinante, especialmente la que resulta de un lisato bacteriano procedente de un cultivo de W3110 I^{q} (pDGL5.303), es realizada por el procedimiento de Gargouri et al (Gastroenterology 91 (1986) 265-275), utilizando la tributirina como sustrato.

Se recordarán seguidamente las condiciones experimentales en las cuales son determinadas las actividades específicas de los polipéptidos recombinantes.

La actividad específica se define como el informe de la actividad enzimática y de la cantidad de proteínas de la muestra expresada en miligramos. La actividad lipásica es determinada por el procedimiento de valoración de Y. Gargouri (mencionado anteriormente), en el cual el sustrato utilizado es la tributirina. La dosis consiste en neutralizar el ácido butírico liberado bajo la acción de la lipasa por medio de una solución de sosa 0,1 N a pH constante de 6 y a una temperatura de 37ºC. En estas condiciones de ensayo, la actividad enzimática corresponde al número de micromoles de ácido liberados en un minuto por medio de la acción del producto sometido a ensayo.

Prácticamente, el ensayo consiste en introducir en una cédula de valoración con termostato a 37ºC:

-

Tributirina: 0,50 ml

-

Solución isotónica de albúmina bovina de suero y taurodesoxicolato sódico 14,50 ml (composición: albúmina bovina de suero 100 mg, taurodesoxicolato sódico 2 mM., solución isotónica a 0,9% de NaCl q.s.p. un litro).

Bajo agitación electromagnética y con la ayuda de un medidor automático de valoración, la mezcla es conducida hasta pH 6 mediante la adición de sosa 0,1 N. Después de la estabilización del pH a este valor, se añaden, medidos exactamente, de 0,5 a 1 ml de una solución acuosa del compuesto enzimático a dosificar. En estas condiciones experimentales, la cantidad de solución de sosa 0,1 N necesaria para mantener al pH a 6 durante 2 minutos permite el cálculo de la actividad lipásica tal como la definida anteriormente.

La actividad lipolítica puede igualmente ser medida a través del procedimiento que utiliza un sustrato cromógeno, tal como el 1,2-O-dilauril-rac-glicero-3-glutarato de resorufina (Boehringer) y descrito en la reseña del fabricante.

Claims (19)

1. Ácido nucleico, caracterizado porque comprende todo o parte del fragmento de ADN representado en la figura 8, codificando dicho ácido nucleico el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 1 y 379 de la secuencia de aminoácidos representada en la figura 9A, correspondiendo este polipéptido a la lipasa gástrica de perro y poseyendo una actividad lipolítica, o codificando un fragmento de este polipéptido, conservando este fragmento las propiedades enzimáticas del polipéptido mencionado anteriormente.

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende todo o parte del fragmento de ADN delimitado por los nucleótidos situados en las posiciones 1 y 1137 del ADN representado en la figura 8 y, si fuera el caso, un fragmento de ADN que codifica para una metionina y situado más arriba del fragmento de ADN mencionado anteriormente.

3. Ácido nucleico caracterizado porque comprende, más arriba de uno de los fragmentos de ADN según la reivindicación 1, una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido señal.

4. Ácido nucleico de cadena sencilla, caracterizado porque comprende una u otra de las dos secuencias de nucleótidos complementarias que constituyen los fragmentos de ADN según las reivindicaciones 1 a 3.

5. Acido nucleico que codifica para el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 1 y 379 de la secuencia de aminoácidos representada en la figura 9a, correspondiendo este polipéptido a la lipasa gástrica de perro y poseyendo una actividad lipolítica, o codificando para un fragmento del citado polipéptido que conserva las propiedades enzimáticas de dicho polipéptido, estando caracterizado dicho ácido nucleico porque su secuencia de nucleótidos difiere, en función de la degenerescencia del código genético, de las secuencias de nucleótidos definidas en una de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Ácido nucleico recombinante, caracterizado porque comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 5, insertado en una secuencia de nucleótidos heteróloga en el ácido nucleico mencionado anteriormente.

7. Ácido nucleico recombinante según la reivindicación 6, caracterizado porque comprende un promotor situado arriba del ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 5 y bajo el control del cual dicho ácido nucleico es capaz de ser transcrito, así como una secuencia que codifica para señales de terminación de la transcripción situada más abajo de dicho ácido nucleico.

8. Vector recombinante, especialmente de tipo plásmido, cósmido o fago, caracterizado porque contiene un ácido nucleico recombinante según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en uno de sus puntos no esenciales para su replicación.

9. Vector recombinante según la reivindicación 8, caracterizado porque contiene en uno de sus puntos no esenciales para su replicación, elementos necesarios para favorecer y controlar la expresión de un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 5, en un hospedador celular y, más particularmente, un promotor reconocido por las polimerasas del hospedador celular, especialmente un promotor inducible.

10. Hospedador celular, de tipo procariota o eucariota, transformado por un vector recombinante según la reivindicación 8 o la reivindicación 9 y que comprende los elementos de regulación que permiten la expresión de un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Polipéptido caracterizado porque es codificado por un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 5, y porque posee una actividad lipolítica, con la exclusión de la LGC extraída y purificada a partir de estómagos de perro, que tiene un peso molecular de 49.000 daltons.

12. Polipéptido según la reivindicación 11, que corresponde de acuerdo con el código genético universal al ácido nucleico según la reivindicación 1, y está delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 1 y 379 de la secuencia de aminoácidos representada en la figura 9A, poseyendo dicho polipéptido una actividad lipolítica.

13. Polipéptido según la reivindicación 11, que corresponde, de acuerdo con el código genético universal, al ácido nucleico según la reivindicación 2, consistiendo este polipéptido en la secuencia de aminoácidos delimitada por los aminoácidos situados en las posiciones 1 y 379 de la figura 9A y precedido de una metionina en el extremo NH_{2}, poseyendo dicho polipéptido actividad lipolítica.

14. Polipéptido caracterizado porque comprende un fragmento de los polipéptidos recombinantes según una de las reivindicaciones 11 a 13, o cualquier polipéptido modificado por sustitución y/o adición y/o eliminación de uno o más aminoácidos de estos polipéptidos recombinantes, conservando estos fragmentos o polipéptidos modificados las propiedades enzimáticas de los polipéptidos recombinantes mencionados anteriormente.

15. Procedimiento de preparación de un polipéptido según una de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende la sucesión de las siguientes etapas:

-

cultivo de un hospedador celular según la reivindicación 10, en un medio de cultivo apropiado, y

-

recuperación del polipéptido producido por dicho hospedador celular, ya sea directamente a partir del medio de cultivo mencionado anteriormente, o bien después de lisis del hospedador celular.

16. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos un tipo de polipéptido según una de las reivindicaciones 11 a 14, en caso necesario, en combinación con uno o más polipéptidos con actividad lipásica, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Utilización de uno o más polipéptidos según una de las reivindicaciones 11 a 14, para la preparación de medicamentos destinados a facilitar la absorción de grasas animales o vegetales ingeridas por un individuo sano o un individuo afectado por una o diversas patologías que afectan o no a la tasa de producción de lipasa gástrica.

18. Utilización de uno o más polipéptidos según una de las reivindicaciones 11 a 14, para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento de patologías relacionadas con la insuficiencia, o incluso con la ausencia, de producción de lipasas en el organismo y, más particularmente, con patologías tales como la fibrasis cística y la insuficiencia pancreática exocrina.

19. Utilización de uno o más polipéptidos según una de las reivindicaciones 11 a 14, para llevar a cabo reacciones de bioconversión enzimática (tales como hidrólisis y esterificación enzimática) especialmente en una forma inmovilizada sobre un soporte sólido.