JPS62246522A - インタ−ロイキン１を有効成分とする感染症予防・治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

１°１本発明はインターロイｔ）１又はイア　９−ｎイ
ト／１様物質を有効成分とする感染ｆｏｖ’−１−防・
ゞ　　治療剤に関する。 く　　　　インターロイキン１　（以下ｉ１．−１と１
？８記する１°　　　こともある。）はＴ細胞やＢ細胞
の増殖分化を促進させ、またＴ細胞に作用してリンホカ
イン。 １し＝イアクーロイキン２の産生を促進させる効果を（
ｒし、抗体産生や細胞性免疫の調節に重要な役割を果た
す因子の一つと考えられている［５ｔａｒｕｃｈ、Ｍ、
Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ！、１３ル２１
９１（１９１Ｆ）］。 その他、プロスタグランシフＥやコラゲナーゼの産生促
進、繊維芽細胞の増殖促進、又はインターロイキン２や
インターフェロンのイ１゛するＮＫ（ナヂ、グル　キラ
ー）細胞活性化作用を増強させる効果があると報告され
ている［　Ｓｉｍｏｎ、Ｐ　、Ｌ−＊ｃｔ　　ａｌ、、
匈Ｌｙ＊ｐｈｏｋｉｎｅｓ”　　ｖｏｌ、０．ｐ、４７
（１９ｇ２）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅＳｓ　　Ｉｎｃ、
Ｅ　　６ 本発明者らは、説り＆ＪＦ究の結果、インターロイキン
１およびイ／ターロイキン！様物質が侵れた感染症予防
−ｓｕｇ！作用を示′すことを見い出し、本発明を完成
した。 本発明の対象物質としては、下記のアミノ酸配列１を汀
するヒト　インターロイ十ン１ポリペプチド Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈａ　Ｓｅｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｉｎ　ＶａｔＬｙｓ　Ｔｙｒ　
Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　ＩＩｓ　　ＩＩｓ　
Ｌｙｓ　ＴｙｒＧｌｕ　Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　Ｌｓｕ　Ａ
＠ｎ　ＡｓＰ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇ１ｎ５ｅｒ
　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓ
ｐ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　ＬｅｕＴｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　
Ａｌａ　Ｌｅｕ　）（ｉｓ　Ａｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｔｌ
　ＧｌｕＡｌａ　Ｖａｌ　　ＬｙｓＩ’ｈｅ　Ａｓｐ　
Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　ＬｙｓＳｅｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｌｙｓ　ＡｇＰ　ＡｓＰ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　　Ｉｌ
ｅ　Ｔｈｒ　Ｖａｔｌｌｃ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　　ｌｌｅ
　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　ＴｙｒＶ
ａｔ　　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａ
＋＋Ｐ　Ｇｌｎ　　Ｐｒｏ　Ｖａｔｌ、ｅｕ　Ｌｅｕ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　　ｌｉｅ　
Ｐｒｏ　ＬｙｓＴｈｒ　　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕｒ’ｈ
ｅ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　１ｌｌｓ　Ｇｌ
ｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＴｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　
Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｈａ旧ｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　１−ｅ
ｕＰｈｅ　　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ
　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　ＶａｔＣｙｓ　Ｌｅｕ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　　Ｉ
ｌｅ　ＴｈｒＡｓｐ　Ｐｈｅ　　Ｇｉｎ　　Ｉｌｅ　　
Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　　［１
］およびその感染症予防−治療活性部位を有するｒリペ
プチド２例えばそのＮ末端より１〜１４個のアミノ酸お
よび／又はＣ末端より１〜４個のアミノ酸残基が欠失し
たポリペプチドが挙げられる。また、これらポリペプチ
ドの生理的に許容される塩、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アルギニン、カフェイン、プロ力イン
、　塩ｓ、　　グル；ノン酸等との塩も本発明の対象物
質に含まれる。本発明の対象物質であるインターロイキ
ンＩおよびインターロイキン１様物賞は、後記参考例に
示した方法、ヨーａフバ公Ｕｎ特許Ｎｏ、　１８１Ｈ）
２０等に記αの方γｈにより５ＡＲすることができる。 以■に本発明の対象物質のｇ染症予防１１ｄｌ療効果に
つき実験例を挙げて置体的に説明する。 実験例 １、　緑膿菌に対する感染防御効果 実験方法 ５ｔｄ−ｄｄＹ系雄性マウス（体重的２０ｇ）の腹腔内
に緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　ａｅｒｕｇ＋ｎｏ
ｓａ　＋２＞を接種（感染菌量：　３　Ｘ　１０６生菌
／マウス）し、全身感染症の動物モデルを作製した。 す／ｌ！ｌ暖衝液（０，１％　ゼラチンと０．１５ＭＮ
ａＣ１含有）に試験薬を溶解し、感染３０前と１日前に
筋肉内投与し、感染後７白目における生存率を求めた。 対照薬として上記リン酸緩衝液を用いた。 結果 ２　カンジダ菌感染症に対する治療効果実験方法 ５ｔｄ−ｄｄ’／系雄性マウス（体市約２０ｇ）の静脈
内ニカンジダアルビヵンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉ
ｃａｎｓ３１７０）を接！ｌ（感染菌量：０ｘｌＯ’生
［／ｖラウスシ、全身感染症の動物モデルを作製した。 　試験薬および対照薬を前記実験例と同様に調製、投与
し、感染後１４日口における生存率を求めた。 結果 ａ　肺炎桿菌感染症に対する治療効果 実験方法 ５ｔｄ−ｄｄＹ系雄性マウス（体重約２０ｇ）ノ腹腔内
　゛に肺炎桿菌（に１ｅｂｓｌｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ　Ｐ−５７０９＞ヲｔｌ１１（感染ｉＸｉ量：
２ＸｌＯ生ｉＪ／？つＸ）Ｌ、全身感染症の動物モデル
を作製した。 感染直後および１日後に試験薬、対照薬を前記実験例と
同様に！Ｉｌｌ製、投与し、感染後１４日口における生
存率を求めた。 東１ 上記の実験結果から明らかなように本発明の対象物質は
優れた感染症予防−治療作用を示し、種々の感染症に対
する予防・治療剤としてａ川である。 本発明の対象物質の投与形態としては非経口投与が好ま
しい。その投与量は症状２年令により異なるが、　０．
０１〜６００μｇ　／　ｋｇ／日好ましくは０．１〜２
００μｇ　／　ｋｇ／日である。 本発明の対象物質を含有する製剤としては、溶液又は凍
結乾燥品が挙げられる。製剤化の際に、賦形剤や安定化
剤を添加するのが好ましい。安定化剤としては、例えば
アルブミ／、グロブリン。 ゼラチン、プロタミ／、プロタミン塩、グルコース、ガ
ラクトース、牛シローズ、７７ニトール。 グルクロンａ、トレハロース、デキストラン、ヒドロキ
シエチルデンプン、非イオン界面活性剤（ポリオキシエ
チレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエ
ーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル
、ポリオキシエチレンソルビクン脂肪酸エステル、ポリ
オキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシ
エチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンヒマシ油。 ポリオキシエチレンポリオキシプロピレ７アルキルエー
テル、ポリオキシエチレンポリオキシブロピレ／ブロフ
クボリマー、ソルビタ７ＩＩ　ｌ！Ｆｉ　Ｗｌエステル
、シ９糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル）
等が挙げられる。 製剤例 ヒトＩＬ−１ポリペプチド［１１をｌ１１ｆ１の８％食
塩水（１０％ヒト血漿アルブミン及び２０％Ｄ−マンニ
トール含有）に溶かし、この７６液のｐｔｔを６．８に
調整する。この溶液を除菌４過し、バイアルに充填後凍
結乾燥して、庄射用粉末を製する。 （以下余白） 参考例１ ヒトＩＬ−１ポリペプチド［１］生産用形質転換体の作
製 前記式［１］で示されるアＥ／ｌ！Ｉ配列をイ「するヒ
）ＩＬ−１ポリペプチド生産用形質発現プラスミド（Ｐ
ｌｌｌ、Ｐ３１１３）を第１図に示すように構築した。 すなわち、参考例５で得た組み換え体プラスミドｐＨＬ
４からル１限毒素Ｐｓｔ　Ｉによりクローン化ｃ　ＤＮ
Ａ部分を切り出し、更に制限酵素＾Ｉｕｌを作用させ、
第１表に示した塩基配列の第３５１番目から下流側の約
５３３ｂｐのＤＮＡ断片を得、更にこれに制限酵素ｎ５
ｔＮ　Ｉを作用させ、第１表の塩基配列の第３５１番か
ら第８０８番までに相当するＤＮＡ断片を単離した。こ
のＤＮＡ断片に、常法により合成した次式及び次式 で示されるオリゴヌクレオチド　アダプターを順次Ｔａ
　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、ヒト
ＴＬ−１ポリペプチド［Ｉ］をコードする塩ノλ配列の
５′末端に開始コドンＡＴＧを付加し、更に終止コドン
ＴＧΔＴＧＡを付加したＤＮＡ断片を得た。 このＤＮＡ断片をＩＩＩＬ−１断片という。 一方、プラスミドｐＣＴ−Ｉ　ＣＩｋｅｈａｒａ、Ｍ、
ｅｔ　ａｌ、。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾８１，５
９５６（１９８４）］に制限酵毒素１ｐａｌと＾ａｔｒ
ｌを作用させｔｒｐプロモーター領域の一部を含む約３
８０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、このＤＮＡ断片に、
常法により合成した次式５式％［３］ で示されるオリゴヌクレオチド　アダプターをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させた。 この結合ＤＮＡ断片に、先に調製したＩＩＩＬ−１断片
をＴａ　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、ＤＮＡ断片
を得た。このＤＮＡ断片をプロモーター１１１Ｌ−１断
片という。 別θに、プラスミドｐＢＲ３２２に制限酵素＾ｖａＩと
ｐｖｕ　１１を作用させ、大きなりＮＡ断片（約３．７
ｋｂｐ）を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離
した。 このＤＮＡ断片の両端をＤＮＡポリメラーゼＩ（フレ／
−フラグメント）およびｄＧＴＰ、　ｄＡＴＩ’、　ｄ
ＣＴＰ。 ｄＴＴＰを用い平ｍ末端とし、その両端をＴａＤＮＡリ
ガ・−ゼを用いて結合させた。このプラスミドベクター
をｐ［１Ｒ５ｏという。更に、このｐ［１Ｒ５ｏベクタ
ーに制限酵素＾λｔｎとＩｔ！ｎｄｍを作用させ、大き
なりＮＡ断片（約３．０ｋｂｐ）を単離ｆ−１製した。 このＤＮＡ断片に先に調整したプロモーター１１１Ｌ−
１断片をＴａ　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させること
により、ヒトＩＬ−１ポリペプチド［１１生産用形費発
現プラスミドを構築した。この形質発現プラスミドをＰ
ＩＩＬＰ３８３と名づけた。 この形質発現ベクター（ｐＨＬＰ３８３）を下記の方法
によりＥ、ｃｏｌｉ　ＩＩＯ＋ＯＩに導入し形質転換体
を得た。 ずなわち、Ｅ、ｃｏｌｉ　１１［＋１０１をＬグロス（
組成＝１！当たり、トリプトンＩＯｇ、　Ａ％母エキス
５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、　　ブドウＮ　１　ｇ　：　ｐＨ
？、２）の５冒１に１１種し、３７℃で一夜培養した。 その菌体懸濁液の１■１を１００ｍ１＋７）Ｌブ０７．
に１！　１ｍ　ｔ、　、濁度（吸光度０５０ｒｖ）が０
．６になる丈で３７℃で培養した。氷水中で３０分間静
置後、菌体を遠心分離により集め、これを５０１の５０
ｍＭ　ＣａＣＩ　２に懸濁し、０゛Ｃで６０分間静置し
た。次いで、遠心分離により菌体を集め、２０％グリセ
リンを含む５０ｍＭ　ＣａＣ＋２のｌ０ｍ１に再懸濁し
た。 この懸濁液に上記の形質発現ベクターｐＨＬＰ３８３を
添加し、これを氷水中で２０分間、４２℃で１分間。 室温で１０分間インキュベートした後、ＬＢグロス（組
成：１！当たり、トリプト７１０ｇ　、酵母エキス５ｇ
及びＮａＣ１１０ｇ、　　ＰＩＩ７．５＞、）を加え、
３７℃で６０分間振盪した。その菌体懸濁液の一部を２
５μｇ／ｌアンピシリンを含むＬｌｌ寒天平板に播き、
３７℃で一夜培養した後、アンピシリン耐性クローンを
進択して形質転換体を得た。この形質転換体を１１１１
１０１／ＰＩＩＬＰ３８３と名づけた。 参考例２ ヒ）ＩＬ−１ポリペプチド［Ｉ］の製造および精製参考
例１で得た形質転換体１ｌＢｌｏ１／　ｐＨＬＰ３８３
をＬロブロス中３７℃で一夜振盪培養した。その菌体懸
濁液の１０１を１１の改良Ｍ９培堆（組成＝１．５％Ｎ
ａｚｌｌＰＯ４４２１１２０、０，３％ＫＩｆ２ｒ’Ｏ
ａ　、　　０．０５％ＮａＣｌ。 ０．１％Ｎ１１４ＣＩ　、　　２　ｍｇ／　ｌビタミ７
１１．．０．５％カザミノ酸、　　２　ｍＭＭｆｆｓＯ
４，Ｏ，ＩｍＭ　ＣａＣ＋２．０．５％ブドウ糖）に接
種し、３７℃で１時間培養し、次いでインドール−３−
アクリル酸を終濃度２０μｇ／■１になるように加え、
更に２４時間培養を継続した後、遠心分離により菌体を
集めた。ＯＩ体を１００１の０．１％リゾチーム及び３
０ｍＭ　ＮａＣ＋を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−１１ＣＩ（
ｐｌ璽８．０）　Ｉ２１衝液に再墾濁し、０℃で３０分
間静置した後、ドライアイス／エタノール浴での凍結と
３７℃での融解を繰り返した後２ｍｌの１０％ポリエチ
レンイミンを加え静置した６次いで、遠心分離により菌
体残渣を除き、清澄な抽出液を得た。 この抽出液に等容量の飽和硫酸アンモニウム水溶液を加
え静置したのち、遠心分離にて沈殿両分を集めた。この
沈殿画分を約１００ｍ　ｌの２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−
ＩＩＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、同緩衝液に対
して透析したのち、予め同緩衝液にて平衡化されたＤＥ
ＡＥ−セフ１０−スＣＬ−Ｏｎカラムにｆ′Ｌ′Ｒシた
。 ｒＩ同緩衝液て該カラムを充分洗浄したのち、ＮａＣ１
１５度θ〜０．５Ｍの濃度勾配にて溶出した。　　ＩＬ
−１活性を存する溶出画分を集め、限外濾過にて濃縮し
たのち、セファクリルＳ−２００によるゲル濾過に付し
、ＩＬ−１活性を有する両分を集めた。更に、上記のＤ
ＥＡＥ−セフ１０−スを用いるカラム　クロマトグラフ
ィー及びセファクリルＳ−２００によるゲル濾過を繰り
返すことによりヒトＩＬ−１ポリペプチド［１］の精製
品を得た。 （以下余白） 参考例３ ヒトＩＬ−１ポリペプチド［Ｉ］のＮ末端の１４個のア
ミノ酸を欠失させたポリペプチド［Ｉ　Ｌ−１（Ｎ１４
）］の製造 （凰）生産用形質転換体の作製 参考例１で得た組み換え体プラスミドｐＨＬＰ３８３か
ら制限酵′Ｊ８ＥＣＯＲＩと１ｌｌｎｄｎｌにて、第１
表に示した塩基配列の第３９８番目から下流側の約４２
２ｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片に、常法に
より合成した次式 で示されるオリゴヌクレオチド　アダプターをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させた。得られたＤＮＡ断片を
、断片（Ａ）という。 一方、プラスミドｐＣＴ−１に制限酵素ｌ１ｐａｌと＾
ａｔＩＩを作用させｔｒｐプロモーター領域の一部を含
む約３８０ｂＰのＤＮＡ断片を切り出し、このＤＮＡ断
片に、常法により合成した次式 ％式％［５］ で７ｊ、されるオリゴヌクレＡ゛チド　アダプターをＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。 このＤＮＡ断片に、先に２１した断片（Ａ）をＩ４１）
　Ｎ　Ａリガーゼを用いて結合させ、Ｉ）ＮＡ断片を得
た。このＤＮＡ断片を断片（１１）という。 別ｒに、参考例１で作製したプラスミドｐｎＲ５（ｉに
制限酵素＾ａｔｎと　１ｌｉｎｄＩ［Ｉを作用させ、大
きな１）　Ｎ　Ａ断片（約３．Ｇｋｂｐ）ヲ単ｒＨ＆　
’１３　Ｌ　タ。 このＤＮＡ断片に先に調製した断片（１３）をＩ４１）
ＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、形質発現
プラスミドを構築したく第２図参照）。 この形質発現プラスミドをｐＨＬＮ！４と名づけた。 このプラスミドｐＨＬＮ＋４を用い、参考例１の方法に
よりＥ、ｃｏｌ　ｔ　ｌＩ［ｔｌｏｌに４人し、形質転
換体を得た。 この形ｉ転換体を１１８１０１／　ｐｉｔＬＮ１４と名
づけた。 （２）　生産及び精製 前項で得た形質転換体（１１１３１０１／　ｐＨＬＮＩ
４）をＬｌｌブｒＪＸ中３７℃で一夜偏ｅ培養した。そ
の菌体懸濁液の１０１を１１の改良Ｍ９培地（組成：１
，５％Ｎａ２！ｌ！”０４１２＋１ｚＯ，０，３％ＫＩ
Ｉ２１”０４．０．０５％ＮａＣ＋。 ０．１％Ｎ＋ＩｎＣｌ　、２　ｍｇ／　ｉ　ヒ９　ミ７
　ｎ＋、　０．５％　カサＥ／酸、　２　ｍＭ　ＭＩ′
ｒＳＯ４，０，１ｍＭ　ＣａＣ１２、０，５％ブドウ糖
）に接種し、３７℃で１時間培養し、次いでインドール
−３−アクリル酸を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように
加え、更に２４時間培養を継続］７た後、遠心分離によ
り１■体を集めた６閑体を１００１の０．１％リゾチー
ム及び３０ｒｎＭ　ＮａＣＩを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−
１１ＣＩ　　（ｆ）Ｔ！８．０）緩衝液に再懸濁し、０
℃で３０分間静置した後、ドライアイス／エタノール浴
での凍結と３７℃での融解を繰り返した債、２１の１０
％ｊ！リエヂレンイミ／を加え静置した。次いで、遠心
分離により菌体残渣を除き、清澄な抽出液を得た。 この抽出液に硫酸アンモニウムを５５＋Ａ飽和になるよ
うに加えた後Ｉ７Ｐ置し、遠心分離にて沈殿画分を婁め
た。この沈殿画分を２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−１１Ｃ
Ｉ　’４衝ａ　（ｐｉｔ　ａ、ｏ）に溶解し、５　ｍＭ
す／酸緩衝化（ｐＨ７，４）生理食塩水溶液（以下、ｐ
ｎｓという）に対して透析したのち、セファクリルＳ−
２００によるゲル４１６に付し、ＩＬ−１活性をイ「す
る両分を集めた。こノ溶出画分を２０ｍＭ　’［”ｒ　
１ｓ−４１ＣＩ　緩Ｎ液（ｐＨ８０）に対して透析（７
、予め同緩衝液にて平衡化されたＤＥＡＥ−セファ０−
スＣＬ−１３Ｂカラムに負荷した。同緩衝液にて該カラ
ムを充分洗浄し、更に０．０８Ｍ　ＮａＣｌを含む同緩
衝液にて洗１）シたのち、Ｃ度範囲０．１〜０．２Ｍの
ＮａＣ１を含む同緩衝液にて、段階的に溶出した。ＩＬ
−１活性を存する溶出両分を集め、限外濾過にてＯ縮し
た。更に、トヨバールＩＩＷ−５５によるゲル濾過を行
い、Ｉ　Ｌ−１（ＮＩ４＞の精製品を得た。 参考例４ ヒトＩ　１．、、−　Ｉ　１！リベプチド［Ｉ］のＮ末
端の１４個のアミノ酸およびＣ末端の４個のアミノ酸を
欠失させたポリペプチド［Ｉ　Ｌ−１（ＮＩ４Ｃ４）１
の製造Ｅｌ）　　生産用形質転換体の作製 参考例３で作製した断片（１３）に制限酵素５ａｕ９０
　Ｋを作用させ、得られたＤＮＡ断片のうち、合成オリ
ゴヌクレオチド　アダプター［４］及び［５］と第１表
の塩基配列の第３９８番目から第７６９番までに相当す
るＤＮＡが結合してなるＤＮＡ断片を（ト離した。 このＤＮＡ断片に、次式 で示される合成オリゴヌクレオチド　アダプターをＴ　
ａ　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いて結合させた。 このＤＮＡ断片を、参考例１で作製したプラスミドＰＩ
ＩＲ５Ｏのル１限酵素＾ａｔｌＩと１ｌｉｎｄｌ１１に
よる大きなりＮＡ断片（約３．０ｋｂＰ）にＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させることにより、形質交現プラ
スミドを＃ｌＩ築した（第３図参照）。この形質発現プ
ラスミドをｐＨＬｌｌｌＩ４Ｃ４と名づけた。 このプラスミドｐＨＬＮ１４ｃ４を用い、参考例１の方
ｔノ；により、Ｅ、ｃｏｌ団旧０１に導入し、形質転換
体を得た。この形質転換体をＩＩＢＩＯＩ／　ｐＨＬＮ
１４ｃ４と名づけた。 ■　生産とｆａｔ製 前項で得た形質転換体（１１１１１０１／　ｐＨＬＮ１
４ｃ４）　ヲ用い、参考例３に記αされた方法に準じて
培青

【７たのち、菌体抽出液を得、更に精製操作を行う
ことによりＩ　Ｌ−１（ＮＩ４Ｃ４＞の精製品を得た。 （以下余白） 参考例５ ヒトＩＬ−１ポリペプチド［■コをコードするｃ　ＤＮ
Ａのクロー二／グ及び塩基配列の決定ＩＩ　Ｌ　−６０
細胞をベトリディフシュ（直径８ｃｍ）にｌＸｌ０’個
／　＋０１１／　ｄｉｓｈの条件で播いた。培養液には
１０％牛脂児血清含有のＲｒ’ＭＩ−１０４０培地を用
い、分化誘導剤としてホルボール−１２−ミリステート
−１３−アセテートとビタミンＡＩｖｔをいずれも最終
Ｉ５度として５００ｎｇ／■１になるように添加した。 ３７℃で５％炭酸ガス含仔空気中、湿度９０〜１００％
で２日間培養したのち、培養液と浮遊細胞を吸引除去し
た。分化した細胞が伸行したディツシュにＩθ％牛脂児
血γｎ含有Ｒｒ’ＭＩ−１６４０培地に誘導剤としてエ
ントドキン／（大腸菌由来のりボボリサブカライド）を
１０Ｍｇ／票１ｉＱ［ｆに、蛋白合成阻害剤としてンク
ロへキンミドを１Ｍｇ／■１濃度に添加した培地のｌ０
ｍ１を加え、更に５時間培養した。培養終了後、培！！
液を吸引除去し、ディツシュ上に残った分化細胞を０．
５％ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、５ｍＭクエン
酸ナトリウム及”び０．ＩＭ　２−メルカプトエタノー
ルを含む６Ｍグアニジリウムチオシアネート液で溶解し
、ホモジナイズした。このホモジネートを０．ＩＭ　Ｅ
ｒ）ＴＡ含有５．７Ｍ塩化セシウム水溶液上に重層し、
超遠心分ｍ機（ＲＰＳ２７−２　ｒＪ　−ター、日立１
機）を用い２０，５００ｒｐ−で２０時間遠心し全ＲＮ
Ａ画分をベレットとして得た。これを０．３５Ｍ　　Ｎ
ａＣ１，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ及び２０ｍＭ　ＥＤＴＡを
含む７Ｍ尿素液の少量に溶解し、エタノール沈殿として
回収した。 この全ＲＮＡ画分を１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＩＯｍＭ
Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ緩衝液（ＰＨ７，４）　　（以下Ｔ
Ｅ液という）２１に溶解し、６５℃で５分間加熱した。 これにＮａＣｌ溶液を０．５Ｍとなるように加えた後、
あらかじめ０．５Ｍ　ＮａＣ１を含むＴＥ液で平衡化し
たオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに付し、吸着したポ
リ（Ａ）　ｍＲＮＡをＴＥ液で溶出した。 ここで得られたポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを以下の実験に用
いた。 （２）　ｃ　ＤＮＡの合成 （１）項で得られたポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを鋳型として
グプラーとホフマ７の方法［Ｇｅｎｅ２５，２０３（１
９８３）コに準じてｃ　ＤＮＡを合成した。該ポリ（Ａ
　）　ｍ　ＲＮ　Ａ（６Ｍｇ）を６μＩの蒸留水に溶解
させ、これに０．６μ！の１００ｍＭ水酸化メチル水銀
水ｆ水酸水添加し室温で１０分間放置した。次いで、２
０単位のＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓｌｎ＠　、Ｐ
ｒｏｗｅｇａ　ｌｌｉｏｔｅｃ社製品）を含む５００ｍ
Ｍ　２−メルカプトエタノール液の１．７μ！を添加し
た。室温で５分間放置したのち、更に１０ｍＭ　ＭｇＣ
＋２．１．２５ｍＭ　ｄＧＴ＋’、　１．２５ｍＭ　ｄ
ＡＴｒ’。 １．２５ｍＭ　ｄＴＴｒ’、　０．５ｍＭ　ｄｃＴｒ’
、Ｏ，１７ＭＭ　ａ−”Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性、　７５
０Ｃｉ／５ｔｏｌｅ）　、　４　ｕｇオリゴ（ｄＴ）　
１２〜１８．　１２０単位トリ骨髄性白血病ウィルス由
来逆転写酵素を含む３２μｌの５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５
−１１ＣＩ（ｐＨ８，３）緩衝液を添加し、４２℃で６
０分間反応させた後、ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ
た。フェノール／クロロホルム混液（１：１）で抽出し
、その水Ｂに酢酸アンモニウムを柊Ｑ　ｉ＝　２．５Ｍ
　ニナるように加え、エタノールにより反応生成物（ｓ
ｓｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体）を沈殿させた。このｓ　
ｇｃｌ’）ＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を下記組成の反応緩衝
液１００μりに溶解した。 反応緩衝液組成： ５　ｍＭ　ＭｇＣＬ、　ｌ０ｍＭ　（ＮＨ４）　２ＳＯ
４，１００ｍＭＫＣＩ、　Ｏ，ｌ５ｍＭβ−ニコチンア
ミド　アデニン　ジヌクレオチド、４０μＭ　ｄＧＴＰ
、　４０μＭｄΔＴＰ、　４０μＭ　ｄＴＴＰ、　４０
μＭ　ｄＣＴＰ、及び５μｇウシ血１？１アルブミン、
　１．２５単位大腸菌リボヌクレアーゼ）１．２４単位
大ｍΔＤＮＡポリメラーゼ■を含む２０ｍＭ　ＴｒｉＳ
−１１ＣＩ　（ｐＨ７，５）　Ｆｊｊｔ衝液。 該溶解液を１２℃で６０分間反応させ、これに２．５ｍ
位の大ｍ　菌ＤＮＡリガーゼを添加し、更に２２℃で６
０分間反応させた。　ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ
た後、上記と同様にフェノール／クロロホルム混液で抽
出し、エタノールにより反応生成物（ｄｓｃＤＮＡ　）
を沈殿させ、回収した。 （３１ｄＣテール付付加ＤＮＡ　ｆ）　ａ　ｍｌ２）項
で得られたｄ　Ｓ　ＣＤＮＡを下記組成の反応緩衝Ｉ＆
＋ＯＯμ２に溶解さ４上、３７℃で３０分間反応させ、
ｄｓｃＤＮ／’、にｄＣプールを付加させた。 反応緩衝液組成： ２　ｍＭ　ＣＯＣｌ２．０．２ｍＭジチオスレイトール
。 ０、ＩｒｎＭ　ａ−”Ｐ−ｄｃＴＰ（比活性Ｉ　Ｃｉ／
　ｍ５ｏｌｅ）及び１０単位ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼを含イｒする！００ｍＭカ
コジル酸ナトリウム（ｐ）１７．２）。 反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、フェ／−ル
／クロロホルム混液で抽出し、　ｄＣテール付付加　ｓ
　ｃ　ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収した。こ
れをｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び＋００ｍＭ　ＮａＣ１を含
むｌ０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　ｉｌｃ　Ｉ　（Ｐ）１７．
４＞緩衝液にて、２μＩ；／ｍｌの＋５度に溶解させた
。 （４）　　組み換え体プラスミドの作製ｄＧデテール加
ｐＢＲ３２２（［１ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓ、Ｌａｂｓ
。 Ｉｎｃ、製）と（３）項で得られたｄＣテール付付加　
ｓ　ｃ　ＤＮＡを１．５１の１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１
００ｍＭ　ＮａＣＩを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　　（ｐＨ７，４）　Ｂ街液中、それぞれ１．５μｇ及
び０．０９μｇ含むように溶解混合させた後、６５℃で
１０分間、５７℃で２時間、さらに４５℃で２時間加温
しアニーリングを行い、組み換え体プラスミド溶液を調
製した。 ６）　形質転換体の選択 （４）項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、
Ｅ、ｃｏｌ＋χ１７７６株を形質転換させた。即ち、Ｅ
、ｃｏｌｉχ１７７６株を、ジアミノピメリンｌ！ｌ１
００μｇ／■Ｉ及びチミジン４０μｇ／曹１を補ったＬ
−グロス（組成：１１当りトリプト７１０ｇ、酵母エキ
ス５　ｇ　、ＮａＣ１５ｇ、　　ブドウ糖１　ｇ　、　
　ｐｉ−ｘ　７．２）　２０ｓｌ中、３７℃で吸光度（
０００ｎｗ）が０．５となるまで培養し、菌体を遠心分
離し、５０ｍＭ　ＣａＣ１２含有１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
１１ＣＩ　緩衝液（ｐｉｔ　７．３＞　１０ｍ１にて洗
浄した。 集めた菌体を同じｍ衝液２１に懸濁させ、０℃で５分間
静置した。この懸濁液０．２１に上記組み換え体プラス
ミド溶液０．１１を添加混合し、０℃で！５５分間静置
、更に４２℃で２分間保持した後、上記の培養で用いた
のと同一組成のＬ−ブ１１ス０．５１を加えて１時間振
盪培養を行った。この培養液の一部を取り、上記組成に
加えてテトラサイクリン（１５μｇ／■１）が１べ加さ
れたし一グロス寒天平板に広げ３７℃で約１２時間培養
し、テトラサイクリ／耐性菌を選択してｃ　ＤＮＡライ
ブラリーを作製した。 （６）　　クローニング （５）項で得られたｅ　ＤＮＡライブラリーから、参考
例６で得た組み換え体プラスミドｐＲＬ＋５からウサギ
ＩＬ−１をコードするクローン化ｃＤＮＡの断片をプロ
ーブとして用いたコ「Ｊ二−ハイブリダイゼータ３ノ試
験及びハイブリダイゼーショントランスレージタフ試験
［１１１ａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、。 ”　Ｉｉ１ｏｌｃｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ″３２９（
１９８０）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｔｎｇｌｌａｒｂｏｒ　
Ｌａｂ、］により］ヒト１１．−１ポリベプヂをコード
するｃ　ＤＮＡを含むプラスミドをイｆする形質転換体
を選び出した。 この組み換え体プラスミドをｐＨＬ４と名づけた。 ■　クローン化ｃ　ＤＮＡの塩基配列の決定クローン化
ｃ　ＤＮＡの塩基配列はＭＩ３ファージを用いるジデオ
キ７法にて決定した。ＭＩ３■ｐ１８及びＭ　１３ｍｐ
＋９（ｒ’ｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ社製）をクローニングベクターとし、Ｍ１３
ンークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ社製）を用い、”Ｍ＋３ク
ローニング及びシーフェンシング　ハ／ドプフク”　（
１＋ｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐｌｃ
社製）に従って実施した。 その塩基配列及びその塩基配列から推測されるアミノ酸
は下記第１表に示すとおりであり、ヒトＩＬ−１前駆体
ポリペプチドをコードしている。 第１〜３番の塩基が開始コドンＡＴＧであり、第８１４
〜８１６番の塩基は終止コド７　ＴＡＧである。 （以下余白） 第１表 ＣＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣ八ＧΔＧＡＧＧＧＡＧＴＣ
へＴＴＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＡＧＣＡＡ
ＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＰｒＯＬＶＳｌｒｌｒｌ五ｅ１ｎ
ｒ（ｊ１３ｒｓｅｒ（ニー＋ｕ’ｒｈｒＡｓｎ［ｊｔｌ
※ｙＩ※は終止コドンを示す。 （以下余白） 参考例６ ウサー￥　ＩＬ−１ｃＤＮＡの調製 （１）　ウサギＩｆ−１ｒｎＲＮΔの調製ウサｆにプ「
Ｊビオニバクテリウム　アクネス死菌体を１別当たりｌ
００１ｇの投与量で静脈内に注入し、８１］後に屠殺し
た。直ちに開胸気管切開し、気管内に挿入したデユープ
を介してリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺洗浄を繰り返
し、肺胞マクロファージを採増した。この肺胞マクロフ
ァージをｌＯ％牛脂児血清含イｒのＲＰＭＩ−１６４０
培地に９濁させてペトリディフンユ（直径８Ｃ■）に１
枚用たりｌＸｌ０’個となるように播き、３７℃で５％
炭酸ガス含イｊ−空気中、７す度９０〜１００％で前培
養した。１時間の前培養の後、エントドヤシ／（大腸閉
山来のリボ１？リサフカライド）、ＴＰＡ（ｔ′、ルゴ
′−ルー１２−ミリステート−１３−アセテート）及び
シクロへヤシミドをそれぞれＩｆ１終０度が１０／１ｇ
／　ｍｌ、　５００ｎｇ／　ｍｌ及びｌμｇ／ｌとなる
ように７ム加混和し、更に培養を継続Ｉ７た。 ４時間後に培養液を吸引除去し、ディツシュ上に残った
マクロファー７１／Ｉ）ら参考例１−　ｍ項に示した方
法に従って１！す（＾）ｍＲＮＡを得た。 ここで得た。■τす（Ａ）　ｍ　Ｒ，ＮΔをアガ［１−
ズゲル電気詠動（ゲルＣ度１％、ＧＭ尿イ：存在下、　
　ｒ）ＩＩ４）に（、ｔし、２６〜３．７ｋｂの分子サ
イズに相当する泳動位置から、Ｉテリ（Ａ　）　ｍ　Ｒ
Ｎ　Ａを回収した。 （２）　ｃｌ）ＮＡライブラリーの作製（１）項で得ら
れたポリ（Ａ　）　ｍ　ＲＮ　Ａを鋳型として、参考例
５−　（２）から６ンに示した方法に準じて、ｃｆ）Ｎ
Ａライブラリーを作製した。 （３）　　クロー二／グ 」ニー己のｃＤＮＡライブラリーについて、ウサギＩＬ
−１をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドをＦ、１！
つ形質転換体をスクリーニングするため３２　ｐ櫟ｍｃ
ＤＮＡプローブを用いる）　＋１１に一・ハイブリダイ
ゼータ１ノ試験をハナハンらの方１７：［Ｇｅｎ＊。 ＋０，６３（１９８０＞］ニ従って行った。工／ドトキ
ンン。 ＴＰＡ及びシクロヘキシミドとｊ（に培養［１−記ｆＩ
ｊ項参照］した肺胞マクロファージ及びこれらの４４操
作を省略した肺胞マクロファージからそれぞれ上記（１
）項の方法で得たポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを鋳型として、
参考例５−■項の方法で合成し、１２Ｐで標識（−たｃ
　ＤＮＡをそれぞれ誘導プラス及び誘導マイナスブ（’
ｌ−プとした。この試験により誘導プラスのプローブと
結合し、誘導マイナスのクローンとはハイブリダイズし
ない塩基配列を含む組み換え体プラスミドを佇する形質
転換体を遭別した。 次いで、これらの選択されたクローンについてハイブリ
ダイゼーション・トランスレージコン試験を土ＪＬ！　
ｍ　’ｆｌで得たポリ（Ａ）ｍＲＮＡを用い、ウサｔ：
　ｌ　Ｉ−１ｍＲＮＡと強くハイブリダイズするり「１
−ノを】Σび出した。 このクロー／のイｆする組ろ換え体プラスミドをｐＲＬ
　＋５と名づけた。

【図面の簡単な説明】

第１図は形質発現ベクターｐＨＬＰ３８３の横築工程を
示す。１）η、図中の式ＣＩＥ　、　　［２］　、　　
［３］は参考例１で示したそれぞれのオリゴ　ヌクレオ
チド　アダプターを意味する。 第２図は形質発現プラスミドｐｌ＋ＬＮ＋４の構２！に
（“ｉを示ず。尚、図中の［４］、［５］は参考例３で
示したそれぞれの合成オリゴヌクレオチド　アダプター
を意味する。 下３図は形質発現プラスミドｐＨＬＮＩ４ｃ４の溝築工
程を示す。尚、図中の［６］は参考例４で示した合成オ
リゴヌクレオチド　アダプターを意味する。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）インターロイキン１又はインターロイキン１様物
   質を有効成分とする感染症予防・治療剤。
2. （２）下記のアミノ酸配列もしくはその感染症予防・治
   療活性部位を有するポリペプチド又はその生理的に許容
   される塩を有効成分とする特許請求の範囲第１項記載の
   感染症予防・治療剤。 【アミノ酸配列があります】［ I ］
3. （３）特許請求の範囲第２項記載のアミノ酸配列［ I
   ］において、そのＮ末端の１〜１４個のアミノ酸が欠失
   したアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその生理的
   に許容される塩を有効成分とする特許請求の範囲第１項
   記載の感染症予防・治療剤。
4. （４）特許請求の範囲第２項記載のアミノ酸配列［ I
   ］において、そのＣ末端の１〜４個のアミノ酸が欠失し
   たアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその生理的に
   許容される塩を有効成分とする特許請求の範囲第１項記
   載の感染症予防・治療剤。
5. （５）特許請求の範囲第２項記載のアミノ酸配列［ I
   ］において、そのＮ末端の１〜１４個のアミノ酸および
   Ｃ末端の１〜４個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を
   有するポリペプチド又はその生理的に許容される塩を有
   効成分とする特許請求の範囲第１項記載の感染症予防・
   治療剤。