JPS6229A

JPS6229A - 組換えインタ−ロイキン−１

Info

Publication number: JPS6229A
Application number: JP61095837A
Authority: JP
Inventors: ウルリツヒ　エイ．グブラー; ピーター　テイー．ロメデイコ; スチーブン　ビー．ミゼル
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1985-04-25
Filing date: 1986-04-24
Publication date: 1987-01-06
Anticipated expiration: 2011-12-04
Also published as: JPH08252093A; DE3683186D1; EP0200986A1; JP2559705B2; EP0200986B2; JP2764028B2; US5936066A; US6268180B1; EP0200986B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】インターロイキン−１（ＩＬ−１）は活性化マクロファ
ージによって合成され、分泌される蛋白質である。感染
や他の形の侵襲に対する生体防御機構の一部として、こ
のポリペプチドホルモンは広範囲にわたる細胞種（Ｔ　
６３　Ｊ：びＢリンパ球、肝細胞、骨髄細胞、結合織要
素、骨格筋、脳細胞等）の増殖おにび／または分化を刺
激する。この様々な細胞集団に対する活性により、ＩＬ
−１は、免疫機能、発熱、肝細胞機能（急性相反応体の
合成および分泌の増大ニアミノ酸、鉄および亜鉛の取り
込みの増進）、骨髄からの好中球の産生および放出、骨
格筋の蛋白質分解、結合織変化等を調節する。１し−１
は、従前、リンパ球活性化因子（Ｉｙｍｐｈｏｃｙｔｃ
　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ、　１．ＡＦ　
）　、白血球内在性メディエータ−（Ｉｅｕｋｏｃｙｔ
ｅｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ　１ｅｄｉａｔｏｒ、ＬＥＨ
）　、内在性パイロジエン（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ　
ｐｙｒｏｇｃｎ、ＥＰ）　、また単核細胞因子（ｍｏｎ
ｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ、Ｈ（Ｊ　
）などと呼ばれていた。最近まで、■し−１の研究はす
べて、部分精製蛋白質プレバレージョンで行われていた
ので、ＩＬ−１に関連する活性のづべてが１つの分子内
に含まれているものなのか、あるいは上に略述した機能
の一部はＩＬ−１のフラグメントや他のマクロファージ
蛋白質が関与しているのか等は確定していなかった。

構造や活性の研究に十分な量のヒトＩＬ−１を製造する
ことは難しかったため、この分子の生化学的性質はよく
わかっていない。ＩＬ−１プレバレージヨンは大きさや
電荷の点で異種混合物であることが明らかにされている
。ＩＬ−１の活性は１２０．０００〜１９０．０００の
範囲のいずれかの分子量をもつ単一ポリペプチド鎖に伴
うものである。

最近、ＩＬ−１をコードする遺伝子がクローン化され、
配列が決定され、大腸菌で発現されている〔Ｏメジ］　
（Ｌｏｍｓｄｉｃｏ）ほか：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）　、　３１２．４５８〜４６２（１，９８４＞）。精
製された「天然」マウスＩし−１についての配列決定研
究とともに、このホルモンがどのようにして合成され、
大きさおよび電荷の不均一性を有する分子集団を生成す
るかかが明らかにされた。精製された天然マウスＩＬ−
１を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上電気泳動に付す
と、分子量１２．０００〜１９，０００の多数のポリペ
プチドが認められ、これらはすべて生物学的活性を有す
る。これらのポリペプチドはアミノ末端配列が異なり、
トリス−グリシンポリアクリルアミドゲルに対して電荷
不均一性を示す。

クローン化マウスＩＬ−１ｃＤＮＡの配列決定とｉｎ　
ＶｉｔｒＯでの翻訳実験により、Ｉし−１ははじめ、２
７０個のアミノ酸をもつプレカーサーポリペプチドとし
て合成されることがわかった。生物学的に活性なＩＬ−
１は、大腸菌から、このプレカーサーのカルボキシ末端
の１５６１１１１のアミノ酸の発現により得ることがで
きる。すなわち、ＩＬ−１活性は、２７０個のアミノ酸
のプレカーサー蛋白質のカルボキシ末端から蛋白質分解
的に放出される。プロテアーゼの作用点が多いことから
、アミン末端が不揃いの分子集団が生成し、これが精製
された［天然ＪｒＬ−１に認められる大きさおよび電荷
の不均一性の説明となる。

ヒトＩＬ−１をコードすると考えられる遺伝子のクロー
ニングはオーロン（Ａｕｒｏｎ　）らによって報告され
ている〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕｓＡ）　、　８１　、７
９０７〜７９１１　（１９８４）、１９８５年２月刊〕
。この報告に記載されたＤＮＡおよび蛋白質の配列は、
以下に述べる配列とわずかに一部分がホモロジーを示す
にすぎない。

天然ヒトＩＬ−１の均一体への精製はラヒマン（ＬａＣ
ｈｌａｎ　”）が報告している〔フエデレーション・プ
ロシーディング（Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、）　、±ｌ、２
６３９〜２６４５　（１９８３））。使用した方法は分
子ｍ分画、等電点電気泳動およびプレパラテイプポリア
クリルアミドゲル電気泳動であった。ドデシル硫酸ナト
リウムを最終工程に使用したため、生成物は変性し、は
じめの生物学的活性の痕跡を示すにすぎなかった。単一
な荷電をもつヒトＩＬ−１を製造するためにＨＰＬＣ法
を用いる精製系についてのシュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ
　）の報告（ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・
メデイシン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｈｅｄ、）　、　１６０
．７７２〜７８７　（１９８４））、またクロンハイム
（にｒｏｎｈｃｉｇｍ）ら〔ジャーナル・オブ・エクス
ベリメンタル・メデイシン（Ｊ、　ＥｘＤ、　Ｈｅｄ、
）　、　１６１．４９０〜５０２　（１９８５））の報
告もある。

本技術分野においては、ネズミＩＬ−１に対して産生さ
れる抗体の製造についても知られている〔ミゼル（Ｈｉ
ｚｅｌ　）ほか：ジャーナル・オブ・イミュノロジ−（
Ｊ、　Ｉｉｍｕｎ、　）　、　１３１　、１８３４〜１
８３７　（１９８３））。ヤギで産生されたこれらの抗
体は、’　Ｉ　Ｌ　−１の検定法の開発に、また天然も
しくは組換えネズミ１ｍ−１をさらに精製のするために
有用な抗ＩＬ−１免疫吸着カラムの製造に使用されたも
のである。抗ネズミＩＬ−１抗体とヒトＩＬ−１との交
差反応は弱い。

本発明は、ひとヒトＩＬ−１ｍ仏子のクローニング、そ
の適当な発現ベクターへの構築、このような発現ベクタ
ーによる宿主生物体の形質転換およびこのような形質転
換細胞の培養による生物学的に活性な組換えヒトＩＬ−
１の製造に関する。

さらに、本発明は、生成した組換ヒトＩＬ−１ポリペプ
チドの単離および利用に関する。

すなわち、本発明は、ヒトインターロイキン−１のＤＮ
Ａ配列およびそれから演綽されるアミノ酸配列の発見な
らびにその製造および利用の手段として、組換えＤＮＡ
技術を使用するものである。

さらに詳しくは、本発明は、生物学的に活性型のヒトイ
ンターロイキン−１をコードするＤＮＡ配０列の単離お
よび同定に関する。これは、マウスＩＬ−１ｃＤＮＡク
ローンを使用して行われ、部分ヒトＩＬ−１ゲノムクロ
ーンが単離された。

このゲノムクローンは次に、ヒトＩＬ−１ＣＤＮＡクロ
ーンの単離に用いられた。このｃＤＮＡの配列により、
ヒトＩＬ−１プレカーサー蛋白質の構造が明らかにされ
た。このプレカーサーのカルボキシ末端１５４個のアミ
ノ酸の大腸菌内発現で、生物学的に活性なＩＬ−１蛋白
質が製造された。

したがって、さらに詳しくは、本発明はヒトＩＬ−１プ
レカーサーおよびそれに含有される生物学的に活性な分
子をコードするＤＮＡ配列の単離および同定、ならびに
このＤＮＡ配列をその発現に有効なプロモーター配列と
機能的に結合して含有する発現ベクターの構築に関する
。また他の態様においては、本発明はこのような発現ベ
クターで形質転換され、したがって上述のＤＮＡ配列を
発現する各種微生物およびを椎動物細胞のような宿主培
養系に関する。他の態様においては、本発明はこの発現
の最終生成物を、ヒトの予防的まＩＣは治療的処置ある
いは診断検定系に有用な新規物、たとえば医薬組成物に
変換する手段および方法に関する。本発明は、その好ま
しい態様においては、ヒトインターロイキン−１が成熟
型として宿主細胞内で産生ずるように構築された特定の
発現ベクターを提供する。

本発明は添付された図面を参照すれば、その理解がさら
に容易になるものと考えられる。

第１図は、マウスＩＬ−１プレカーサーＣＤＮＡのヌク
レオチド配列および予測されるアミノ酸配列である。

第２Ａ図は、ヒトＩＬ−１プレカーサー（ｐｈｉｌ＃７
から）のカルボキシ末端領域のヌクレオチド配列と予測
されるアミノ酸配列でｐｈｉｌ＃４の部分配列には下線
を施しである。第２Ｂ図は、クロー＃ンｐｈｔ＋　　７およびｐｈｉｌ＃１９の複合体から推
定されるヒトＩＬ−１プレカーサーのヌクレオチド配列
および予測されるアミノ酸配列である。

第３図はマウスおよびヒトＩＬ−１プレカーサー蛋白質
の配列のホモロジーを例示した図である。

第４図は、ヒトＩＬ−１の修飾された、１５４個のアミ
ノ酸のカルボキシ末端配列（ｐ１岬１〜１５４”）の合
成を行う発現ベクターの、ベクターとしてｐＥＶ−ｖｒ
ｆ２を用いた構築を示す７０−ヂャートである。

第５図は、ｐｈｉｌ＃１〜１５４＊のアミノ末端に異種
アミノ酸をもたないヒト１ｍ−１の１５４個のアミノ酸
カルボキシ末端配列（ｐｈｉｌ＃１〜１５４）の合成を
行う発現ベクターの構築を示すフローチャートである。

上述のように、ヒトＩＬ−１ポリペプチドをコードする
クローン化遺伝子は、マウスＩＬ−ＩＣＤＮＡクローン
をハイブリダイゼーションプローブとして用いることに
より得ることができる。

この操作で、ＥＣＯＲＩ部分ヒトゲノムファージライブ
ラリー〔フリツチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ　）はか：セル（
Ｃｅｌｌ）　、　１９．９５９〜９７２　（１９８０）
　）をハイブリダイゼーションプローブとしてプラスミ
ド゛ｐＩＬ１　１３０１（ロメディ−］　（Ｌｏｍｅｄ
　ｉａｏ　）はか：前出〕を用いることによりスクリー
ニングした。ファージプラークを常法によりニトロセル
ロースフィルターに移し〔マニアテイス（Ｈａｎｉａｔ
ｉｓ）ほか：モルキュラー・クローニング、ア・ラボラ
トリ一番マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｏ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、
ｍｌ−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＩｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　＞　、Ｄ−ルド命スプリング・ハーバ−、ニュー
ヨーク（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ、　Ｎ
、　’／、　）　、１９８２　）　、　固定化ＤＮＡヲ
含むフィルター〈φ＝１３８順）を５ＸＳＳＰＥ（ＩＸ
ＳＳＰＥ＝０．１８Ｍ　　　ＮａＣｊ！、１０ｍＭリン
酸ナトリウム、Ｉ）１１７．０．１１１１４　　Ｅ　Ｄ
　Ｔ　Ａ三ナトリウム）、５×デンハルト液〔０，１％
フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）　４００．０．１％ウシ血清
アルブミン、０．１％ポリビニルビＯリドン（Ｗ／Ｖ　
）　）０．３％ＳＤＳ、２０％ホルムアミド、２５０μ
ｇ／−ウシ胸腺ＤＮＡおよび１０６ＣＤＩＩＩ　３２Ｐ
−ＰＩＬｌ　　１３０１　にツクトランスレーションに
より１〜２ｘ　１０８ｃｏｗ　／μｓ１．：Ｉｆｆ識）
　含有ｍ液１０ｄ中、３７℃で４８時間ハイブリダイズ
した。フィルターを０．５ＸＳＳＰＥ中３０”Ｃで洗浄
し、オートラジオグラフィーに付した。７．９×１０５
プラークをスクリーニングしたのち、２個の陽性組換え
ファージが同定された。これらの２個のファ′−ジは制
限エンドヌクレアーゼマツピングによって同一であるこ
とが明らかにされ、λ−ｈｉｌ　４と命名された。上述
のハイブリダイゼーション条件を用い、次にマウスＩＬ
−１ｃＤＮＡクローンｐｌＬ１　１３０１は組換えファ
ージλ−ｈｉｌ　４からの１．４ｋｂＥｃｏＲＩ　−Ｈ
ｉ　ｎｄＩ［［フラグメントに特異的にハイブリダイズ
することが明らかにされた。この１．４ｋｂフラグメン
トを０ＢＲ３２２にクローン化しｐｈｉｌ＃４が得られ
た。

Ｄｈｉｌ＃４のＥｃｏＲ１部位に隣接するヌクレオチド
配列が決定され（第２Ａ図参照）、マウスＩＬ−１ｍＲ
ＮＡおよび蛋白質の配列と比較された。

この解析により、マウスＩＬ−１プレカーサーのカルボ
キシ末端の６１個のアミノ酸およびそれに伴う３′非暗
号領域と、７５％の核酸ホモロジーおよび６６％アミノ
酸配列ホモロジーが認められた。

上述のように得られた部分ヒトＩＬ−１３１ｉ伝子を次
にプローブとして用い、誘導正常ヒト末梢血白血球から
得られたｍＲＮＡ由来のヒトＩＬ−１ｃＤＮＡクローン
を単離した。正常供血者から採取し調製した濃縮ヒト白
血球はアメリカ赤十字社〔ランシング、ミシガン（Ｌａ
ｎｓｉｎａ、　Ｈｉｃｈｉｏａｎ　）　）より入手した
。５０のｍ縮白血球の内容を無菌的に採取バッグ７）ｓ
ら出し、プールした。白血球ブールを分液ろ耳中で半容
示の６％ヒータスターチ〔ヘスパン（Ｈｅｓｐａｎ）　
、アメリカン・ホスビタル・サプライ・コーポレーショ
ン、アービン、カリホルニア（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｔｌ
ｏｓｐｉｔａｌ　５ｕｐｐｌｙ　Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉ
ｏｎ、Ｉｒｖｉｎ、Ｃａ１ｉｆ、　）　９４）溶液と混
合し、３時間室温に放置した。白血球−へスパン混合物
の容量は、沈降を確実にするために分液ろ斗の容量の２
／３を越えないようにする。分液ろ斗の底に沈降した赤
血球と細胞の分離は、赤血球層のすぐ上に白血球の鋭い
界面の帯が明瞭になったきに完結する。低密度の白血球
をインターロイキン−１の製造に使用した。これらの細
胞は、界面白血球の上に存在する細胞の最上層のみを注
意深く吸引することにより、分液ろ斗か取り出した。こ
の低密度白血球をヘスバランから取り出すために、２５
０ｄの円錐状遠沈管〔コーニング・グラスワークス、コ
ーニング、ニューヨーク（ｃｏｒｎｉｎｑＧｌａｓｓｗ
ｏｒｋｓ　、　Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｎ、Ｙ、　）製〕中
、５００ｘｇで２０分間遠心分離した。ペレットを９倍
量の０．８３％塩化アンモニウム溶液に５分間再懸濁し
た残った赤血球を溶解させた。上に述べたと同様に５０
０Ｘｇで１０分間沈降させて、白血球を塩化アンモニウ
ム溶液から取り出しノだ。

次に、細胞ペレットを、濃度が３．５Ｘ１０７細胞／ｍ
ｌ！を越えないように、予め３７℃に加温してＲＰＭＩ
−１６４０メジウム（ＧＩＢＣＯ）中に再懸濁した。濃
縮された細胞の凝集を避けるため、メジウムにウシ胎内
血清は添加しなかった。

赤血球の夾雑がない新たに単離された白血球を誘導容器
中、２％ウシ胎胎内血清補充したＲＰＭＩ−１６４０メ
ジウムの適当量で希釈し、最終濃度を３×１０６細胞／
Ｉｄとした。この細胞を３７℃で１時間インキュベート
し、１０μｇ／−の大賜菌リポポリサッカライドＢ　（
ＬＰＳ、　Ｄｉｒｃｏ　３８８０−２５＞を加えてＩＬ
−１の産生を誘導した。

ｍＲＮＡ抽出のためにインキュベーションを１２時間続
けた。ついで、細胞を５００Ｘ９で沈降させて誘導メジ
ウムから取り出した。ｍＲＮＡ抽出のために誘導した細
胞は凍結ベレットとして一２０℃以下で保存できる。

ＬＰＳ誘導ヒト末梢血白血球からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを
単離するのにとくに好ましい方法は、チャーゲイン（Ｃ
ｈｉｒＱＷｉｎ）らのグアニジンチオシアネート−Ｃ３
ＣＪ！法〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）　、　１８．５２９４〜５２９９（１９７９））
およびオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー
〔アビブはか（Ａｖｉｖ＆Ｌｅｄｃｒ）　、プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・スティソ・オ
ブ・アメリカ（’Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ）　　、　　６９．　１　
４０８〜１４１２（１９７２））である。このＲＮＡの
ノーサン法解析により、クローンｐｈｉｌ＃４は約２．
１００のヌクレオチド長のｍＲＮＡと特異的にハイブリ
ダイズすることが明らかにされた。全ポリ（Ａ）”ＲＮ
Ａを庶糖濃度勾配遠心分離によって分画し、サイズが１
．０００〜３．０００ヌクレオチドのｍＲＮＡを集めた
。この濃縮ｍＲＮＡプールを用いて、約２０００のクロ
ーンのＣＤＮＡライブラリーを、確立された方法で（ガ
ブラーほか（Ｇｕｂｌｅｒ　＆　Ｈｏｆｆｍａｎ）　、
ジーン（Ｇｅｎｅ）、２５．２６３〜２６９　　（１９
８３））ｐＢＲ３２２中に構築した。このライブラリー
について、ハイブリダイゼーションプローブとしてプラ
スミドｐｈｉｌ＃４からの１．４ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ−
Ｈｉｎｄｌｎ挿入体を用いてスクリーニングを実施した
。細菌コロニーを標準方法〔マニアテイス（Ｈａｎｉａ
ｔｉｓ）ほか：前出〕によってニトロセルロースフィル
ターに移し、固定化ＤＮＡを含有するフィルターを、５
ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハルト液、０、′３％ＳＤＳ、５
０％ホルムアミド（Ｗ／Ｖ　）、２５０μｇ／−ウシ胸
腺ＤＮＡおよび”２ｐ−ｐｈｉｌ＃４挿入体ＤＮＡ中、
３７℃で１６時間ハイブリダイズした。フィルターをＯ
，ｌＸ５ＳＰＥ中５０℃で洗浄し、オートラジオグラフ
ィーに付し、１個の陽性クローンを同定し、ｐｈｉｌ＃
７と命名した。このクローンは２．２００ｂｐの挿入体
を含有する。この挿入体のヌクレオチド配列（第２Ａ図
参照）にはゲノムクローンｐｈｉｌ＃４の部分配列を含
み、したがってこの還伝子によってコードされるｍＲＮ
ＡのＣＤＮＡ配列に相当する。このｐｈｉｌ＃７挿人体
のヌクレオチド配列は１６３個のアミノ酸の蛋白質に対
する読み取り枠を予示する。この予測された蛋白質は、
マウスＩＬ−１プレカーサーのカルボキシ末端の１６０
個のアミノ酸と５５％のホモロジーを示す（第３図参照
）。したがって、ｐｈｉｌ＃７によって与えられた配列
はヒトｒＬ−１プレカーサーのカルボキシ末端領域を示
すものと考えられる。ブライマー延長実験では、ヒトＩ
Ｌ−１ｍＲＮＡの５′末端から約４００のヌクレオチド
がクローンｐｈｉｌ＃７では欠けていることが示されて
いる。

ヒトＩＬ−１ｃＤＮＡクローン＃７はヒトＩＬ−１ｍＲ
ＮＡの不完全コピーであることがわかったので、この配
列を完成するために次のような計画を用いた。すなわち
、クローン＃７のＤＮＡ配列に基づき、配列５’　−Ｇ
ＧＧＣＧＴＣＡＴＴＣ＾−ＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＴ＾
−３′をもつ合成オリゴヌクレオチドを案出し、固体支
持体ホスホールアミダイト法を用いて合成した。このオ
リゴヌクレオチドは、ｐｈｉｌ＃７から予測されるアミ
ノ酸２０〜２８をコードする配列と相補性である。この
オリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ制限部位を含むこと
が予測されるＣＤＮＡ内領域をもたらす。このような部
位は、延長クローンをクローン＃７と融合させ。

ヒトＩＬ−１プレカーサーの完全蛋白質をコードする領
域を包含するｃＤＮＡを口ｊ製するのに有用である。こ
のオリゴヌクレオチドを、ＬＰＳ誘導ヒト末梢血白血球
からのサイズ分画ポリＡ＋ＲＮＡにアニーリングした。

アニーリング条件は５０ｍＨＮａＣｊ、１０ｍＨＤＴＴ
、０．０５１１８ＥＤＴＡ、５５０ｐｍｏｌオリゴヌク
レオチド／ｄ、２５０μ９ポリＡ＋ＲＮＡ／ｄ、９０℃
で１分、４３℃で１０分、２０℃で１０分とし、ついで
反応液を氷上で冷却した。ｃＤＮＡ含成お合成延長ｃＤ
ＮＡライブラリーの確立は、クローン＃７について上述
したと同様に実施した。この方法で、ヒトＩ　Ｌ　−１
ｍ　ＲＮ　Ａ　ｆＪ縮ポリＡ　　ＲＮＡ５μりから約１
０５の独立形質転換体が生成した。

計約２９００の形質転換体を、予めポリヌクレオチドキ
ナーゼとγ−３２Ｐ−ＡＴＰにより標準方法〔マニアテ
イス（ＨａｎｌａｔｉＳ）はか：前出〕で標識した上述
のオリゴヌクレオチドを用いスクリーニングした。コロ
ニー支持ニトロセルロースフィルターを標準方法（マニ
アテイス（Ｈａｎｉａｔｉｓ）はか：前出〕に従って調
製した。このフィルターを標識オリゴヌクレオチドと以
下の条件でハイブリダイズした。すなわち、５ＸＳＳＰ
Ｅ、１０ｘデンハルト液、０．１％ＳＤＳ、１００μ９
／−酵母可溶ＲＮＡ、０．２μｍｏｌ／ｄ標識オリゴヌ
クレオチド（比活性：１μＣｉ　／ＤＩ！１０Ｉ）中６
５℃で１５分、ついで３７℃で２時間とした。フィルタ
ーを次に０．０２５％ＳＤＳ含有２ＸＳＳＰＥで２回洗
浄しく室温での迅速洗浄）、ついで０．０２５％ＳＤＳ
含有４ＸＳＳＰＥ中、５１℃で６０分間洗浄した。フィ
ルターを風乾し、増感スクリーンを用い一７０℃で１６
時間、Ｘ線フィルムに曝露した。１２個の陽性コロニー
を制限エンドヌクレアーゼ切断によってさらに解析した
。それ以上の解析にはクローンｐｈｉｌ＃１９を選択し
た。ｐｈｉｌ＃１９からの挿入体の配列（第２Ｂ図参照
）は期待されたｐｈｉｌ＃７との重複を含有し、１３９
個のアミノ酸をコードする単−読り取り枠が予測される
。

この領域はヒト、１Ｌ−１プレカーサー蛋白質のアミン
末端を表し、マウスＩＬ−１プレカーサー蛋白質の相当
する領域と高いホモロジーを示す（第３図）。したがっ
て、ｐｈｉｌ　　７およびｐｈｉｌ＃１９　　。

＃からの配列情報を合わせると、ヒトＩＲ−１ｍＲ，ＮＡ
は２７０個のアミノ酸のマウス蛋白質と有意に関連する
２７１個のアミノ酸の蛋白質をコードする（第３図）　
プラスミドｐｈｉｌ”　７は２７１個のアミノ酸のヒト
ＩＬ−１プレカーサー蛋白質の１６３個のカルボキシ末
端アミノ酸についての暗号情報を含有する。プラスミド
ｐｈｉｌ＃１９はこの蛋白質の１３９個のアミン末端ア
ミノ酸についての暗号情報を含有する。各プラスミドは
、それらの挿入体に共通の配列（９４ヌクレオチド長）
内に１個のＥＣＯＲＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位
を有する。このＥＣｏＲｌ部位は、ヒトＩＬ−１プレカ
ーサー蛋白質からの全暗号領域を含有する単一の複合プ
ラスミドへ、２個のプラスミドからの情報を結合するた
めに使用できる。

標準方法を用いて、プラスミドｐｈｉｌ＃７とｐｈｉｌ
＃１９を個々にＥＣＯＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、
生したＤＮＡフラグメントをポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分離できる。ｐｈｉｌ＃７消化物からは約２１
００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ！フラグメントを、ｐ
ｈｉｌ＃１９消化物からは約４６０ｂＤのＢａｍＨＩ−
ＥｃｏＲＩフラグメントを単離できる。単離された２個
のフラグメントはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてたがいに
結合できるｂリガーゼを熱不活性化し、混合物をＢａｍ
ＨＩで処理する。この混合物はＢａｍＨＩ−線状化ｐＥ
Ｖ−ｖｒｆ２（下方）に結合することができ、適合性プ
ラスミドｐＲＫ２４８ｃ　Ｉ　ｔｓ含有大腸菌株ＭＣ１
０６１の形質転換に使用でき、アンピシリン抵抗性で選
択される。細菌クローンは制限エンドヌクレアーゼ切断
解析によってスクリーニングし、期待される挿入体を正
しい方向に含有するプラスミド、ｐｈｉｌ＃ｉ〜２７１
＊を同定できる。

プラスミドｐｈｉｌ　　１〜２７１＊は特定部位のオリ
ゴヌクレオチド突然変異誘発（下方）によって修飾し、
開始ＡＴＧコドンと２７１個のアミノ酸プレカーサー蛋
白質の二番目のアミノ酸であるアラニンのコドン（ＧＣ
Ｃ）との間の異種ヌクレオチドを除去し、ｐｈｉｌ＃４
〜２７１を生成させる。

ｐｈｉｌ＃ｌ〜２７１を含む細菌を、温度シフトにより
誘導するとく下方）、第２Ｂ図に示すような２７１個の
アミノ酸の完全ＩＬ−１プレカーサー蛋白質を合成する
。

プラスミドｐＥＶ−ｖｒｆ２Ｇ；ｔ、合成ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドを用い、密着調部されたファージλＰＬプ
ロモーターから下流にリポソーム結合部位（ＲＢＳ）−
開始コドンを含むように修飾されたｐＢＲ３２２誘導体
である。多重用途の制限エンドヌクレアーゼ部位は開始
コドンのすぐ下流に存在し、２〜９の過剰のアミノ末端
アミノ酸をもつ融合蛋白質として発現させる略号領域配
列を挿入させることができる。これらの異種アミノ酸は
特定部位突然変異によって除去でき、所望の蛋白質の発
現が行われる。ｐＥｖ−Ｖｒｆ’２の系譜は、ｐＢＲ３
２２→ｐＲＣ２→ｐＲＣ２３→ｐＥＶ−ｖｒｆ２である
。

１）Ｒｅ２は、Ｉ）ＢＲ３２２（ＡＴＣＣＮα３７０１
７）中のＥＣＯＲ１部位に隣接して（ａｍｐＲ側）１個
のＢｑｊ！　ｎ部位を含有するｐＢＲ３２２の誘導体で
ある。このプラスミドは以下の方法で構築された。すな
わち、ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ２０ｕ９をＥｃｏ
ＲＩで消化し、ツイテ反応液を２個に分けた。一方は、
Ｓ１ヌクレアーゼで突出５′−重鎖末端を除去し、他方
の反応液は、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメ
ントでデオキシヌクレオチドを導入して末端を充填した
。

両反応ともフェノール抽出で停止させ、ついでエタノー
ルで沈殿させた。各反応液からのＤＮＡ約１μ３を９０
ｐＨ１０１のホスホリル化ＥｌＩＴｉリンカ−（ＣＡＧ
ＡＴＣＴＧ、コラボレイテイブ・リザーチ（Ｃｏｌｌａ
ｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）より購入〕とと
もに混合し、Ｔ４ＤＡＮリガーゼと１５℃で１８時間イ
ンキュベートした。リゲーション生成物を次にＢＱｆｉ
Ｉ［およびＰｓｔＩで消化し、１％アガロース中電気泳
動に付した。両反応からの３６００ｂｐおよび７６０ｂ
ｐフラグメントをゲルより回収した。

ｐＲｃ２の構築には、フレノウ反応からの３６００ｂｐ
フラグメントをＳ１反応からの７６０ｂｐフラグメント
と結合させた。大腸菌株ＲＲ１をこのリゲーション混合
物で形質転換し、形質転換体を５μｇ／ｒｄのアンピシ
リンを含むＬＢアガール板上で選択した。期待されたプ
ラスミド構築体を含む形質転換体を単離プラスミドＤＮ
Ａの制限解析によって同定した。ＤＮＡ配列により、Ｓ
１ヌクレアーゼ処理は正確に５′−重鎖末端を除去した
ことが確認された。

ｐＲｃ２３はｐＲＣ２に、モデルリポソーム結合部位（
ＲＢＳ）からなる１対の相補性合成オリゴヌクレオチド
に結合したλＰＬブＯモーターを含む２５０ｂｐ　　Ｂ
ｑｊ！ＩＩ−Ｈａｅｌ［［７ラクグメントを挿入するこ
とにより構築した。Ｈａｅｌ１１部位は、Ｐ、転写開始
部位の１１５ｂＤ下流、λＮ遺伝子の５′非暗号領域内
に存在する〔ヘンドリツクス（Ｈｅｎｄｒｉｘ　）ほか
：″ラムダ・ツー（Ｌａｎ＋ｂｄａｌＩ　）コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプ
リング・ハーバ−、ニューヨーク（Ｃｏｌｄ　５ｐｒｉ
ｎ（Ｊ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、）刊、１
９８３）、ファージλＤＮＡから単離された４５０ｂｐ
　　ＥＩＩＴＩ−ＨｐａＩフラグメント約１μグをＨａ
ｅｌ［Ｉで消化した。生成した消化生成物２００　ｎｏ
を、モデルＲＢＳを含むホスホリル色合成オリゴヌクレ
オチド各６Ｑ　ｇａｏｌと混合した。これらの相補性デ
オキ＃ジヌクレオチド（１＝ＴＴ＾ＡＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧ
Ｇ、　＃２−　ＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＡＴＴＴＴＴ
ＡＡ　’）は固体支持体上ホスファイト法を用いて合成
した〔マテユーチはか（Ｈａｔｔｅｕｃｉ、Ｈ，口、　
＆　Ｃａ１ｕｔｈｅｒｓ、　Ｈ，Ｈ，）　、シンはシス
・オブ・デオキシオリゴヌクレオチヅ・オン・ア・ポリ
マー・サポート（５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆｄｅＯＸＶ
Ｏ１ｉ！１ｏｎｕｃｌｅＯｔｉｄｅｓ　Ｏｎ　ａ　ＥＩ
ＯＩＶｌｅｒ　５ｕＤＩ）Ｏｒｔ）　。

ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテ
イ（Ｊ、　Ａｅ、　Ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、）　、　１０３
　、３１８５〜３１９１　（１９８１））。合成は、制
御された多孔性ガラス支持体（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣＰＧ、
長鎖アルキルアミン樹脂）に付着させた３′末端ヌクレ
オチド１μｓｏｌで開始させた。混合物をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼと１５℃で１８時間インキュベートし、結合した
分子をＢＱＪ！ＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、５％ポ
リアクリルアミドゲル上で分離した。２７０ｂｐのリゲ
ーション生成物をゲルから回収し、予めＦ３ｏＩ　ＩＩ
とＥＣ０ＲＩで消化したゲル精製ＤＲＣ２ベクターと混
合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとともに１５℃で１５時間イ
ンキュベートした。

リゲーション混合物を株ＲＲ１（ｐＲＫ２４８ＣＩｔｓ
）の形質転換に使用した。アンピシリン含有メジウム上
で選択した形質転換体を、単離プラスミドＤＮＡの制限
解析によってスクリーニングした。期待されたプラスミ
ド構築体、ＤＲＣ２３は、さらに制限酵素消化によりま
たＥｃｏＲＩ接合物前後のＤＮＡ配列解析により確認さ
れた。プラスミドｐＲｃ２３はＲＢＳの３′末端に唯一
のＥＣＯＲＩ部位を含有し、５′末端にＡＴＧを有する
遺伝子をここに挿入することができる。

プラスミドｐＥｖ−Ｖｒｆ２の構築には、ｐＲＣ２３を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ［［Ｆ消化し、線状化した
ベクターをプレバラティブ・アガロースゲル電気泳動に
よって単離した。２個の相補性デオキシヌクレオチド（
＃３　＝　ＡＡＴＴＡＡＴ八１６　−＃へＡＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＡ、　
　　４＝ＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡ−ＴＧＧ＾ＴＣＣＧＡＡ
ＴＴＣＴＡＴＴＣＡＴＡＴＴ　）を合成し、両者を合し
、１５０１１ＨＮａＣｊ！中５８℃に５分間加熱し、徐
々に冷却してアニーリングを行う。合成二重鎖０．１μ
ｍｏｌをｐＲｃ２３／ＥｃｏＲＩ−）１ｉｎｄｌベクタ
ー０．０７ｐｍｏｌに加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１５
℃で１５時間インキュベートした。株ＲＲＩ　（ｐＲＫ
２４８ｃｌｔｓ）をリゲーション生成物で形質転換し、
アンピシリン抵抗性形質転換体を制限エンドヌクレアー
ゼ切断解析によりスクリーニングしてｐＥＶ−ｖｒｆ２
を同定し、その期待された構築体をＤＮＡ配列解析で確
認した。プラスミドｏＥＶ−ｖ　ｒ　ｆ　２は適当に配
置された開始コドン−ＲＢＳから下流に制限部位（ＥＣ
ＯＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｃｊ！ａｔおよび＠　ｉ　ｎｄＩ
［［）を含有する。したがって、これらの制限部位に挿
入される適当に配置された暗号領域配列はＰ、プロモー
ターの制御下に発現し、２〜９の過剰アミン末端アミノ
酸とともに相当する蛋白質を生成する。これらの異種ア
ミノ酸の除去、ならびに不適当に配置されたくすなわち
、読み取り枠が正しくない）暗号領域の再配置には特定
部位突然変異が使用できる。

上に用いた合成オリゴヌクレオチドは、アプライド・バ
イオシステムズ（＾Ｄｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｃｍ
ｓ）３８０Ａ型ＤＮＡシンセサイザー上で合成した支持
体に結合させる活性ヌクレオチジル成分としてはジイソ
プロピルホスホルアミダイトを用いた〔ビューケージは
か（Ｂｅａｕｃａｏｅ　＆　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）　：
デトラヘトロンーレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　
Ｌｅｔｔ、　）。

２２．１８５９〜１８６２　（１９８１））。支持体上
での合成はマテユーチら（Ｈａｔｔｅｕｃｃｉ　＆Ｃａ
ｒｕｔｈｅｒｓ　、前出）の記載に従ってＣＰＧ樹脂を
樹脂に付着させた３′ヌクレオチドとともに用い０．５
０１１１１０ルベルで実施した。合成サイクルは製造業
者の指示にほぼ従ったが、脱トリチル化試薬としては３
％トリクロロ酢酸の代わりに２％ジクロロ酢酸を用いた
。合成オリゴヌクレオチドは２０％ポリアクリルアミド
配列決定ゲル上に単離した。単離されたオリゴヌクレオ
チドをゲルから切り出し、ゲル溶出緩衝液中で溶出し、
ｃ１８逆相カラム上で脱塩した。

かくして得られた組換えＤＮＡによって生細胞を形質転
換し、クローン化ＣＤＮＡの増幅またはＩＬ−１ポリペ
プチドの製造を行うことができる。

ＩＬ−１の製造に使用できる適当な真核生物宿主には、
を椎動物細胞、Ｖｆ母等が包含される。たとえば、サル
の細胞たとえばグラッッマン（ＧＩｕＺｌａｎ　）によ
って報告されている〔セル（Ｃｅｌｌ）、２４．１７５
〜１８２．１９８１）ような５Ｖ−４０の複製起源欠陥
変異株によって形質転換され、５Ｖ−４０大王抗原を発
現するｃＶ−１１１胞（ＣＯ８細胞）、オオノらによっ
て報告されているマウス誘導細胞（Ｏｈｎｏ　＆　Ｔａ
ｎｉｇｕｃ旧ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）、１０，９６７〜９７７　
（１９８２））、ヒツツエマン〈旧ｔｚｅｎ＋ａｎ　）
らによって報告され、インターフェロン遺伝子の発現に
用いられてきた酵母宿主−ベクター系〔ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）　。

２９３．７１７〜７２２（１９８１））が使用できる。

さらに、スミス（Ｓｍｉｔｈ　）らによって記述された
ような昆虫細胞の使用も可能である〔モルキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジー（Ｈｏｔ、　Ｃｅ１１．
　Ｂｉｏｌ、）　、　３．２１５６〜２１６５（１９８
３））。適当な原核生物宿主には、大腸菌、枯草菌等が
包含される。宿主生物中でのＤＮＡの増幅には、宿主と
して大腸菌を用いるのが好ましいが、伯の宿主も使用で
きる。

大腸菌に使用できる適当なベクターとしては、ＥＫ型プ
ラスミドベクター（緊縮型）：ｏｓｃｌｏｌ、ｐＲＫ３
５３．　ｐ′ＲＫ６４６゜ｐＲＫ２４８．ＤＤＦ４１等
：ＥＫ型プラスミドベクター（緩和型）：Ｃｏｊ！Ｅ１
．ｐＶｌ−（５１゜ｐＡｃ１０５．Ｒ８Ｆ２１２４．ｐ
ｃＲｌ。

ＤＭＢ９．　　ｐＢＲ３１３，ＤＢＲ３２２゜ｐＢＲ３
２４，ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７゜ｐＢＲ３２８，ｐ
ＫＹ２２８９．ｐＫＹ２７００゜ｐＫＮ８０．ｐＫＣ７
，ｐＫＢ１５８゜ＤＭＫ２００４．　　ｐＡＣＹＣＩ。

ｐＡＣＹＣ１８４，ｄｕｊ！等；λａｔ型ファージベク
ター：λａｔ、λＣ９λｇｔ、λＢ。

λＷＥＳ、　　λＣ１λｇｔ、λＢ、λＷＥＳ。

λＣ０λＷＥＳ、　　λＢ、λｚＪｖ；ｒ、。

λＢ′　、λＡＬＯ，λＢ、λＷＥＳ、Ｔｓ６２２゜λ
Ｄａｍ等を挙げることができる。一般には、大腸菌に対
するベクターとしては、ｐＢＲ３２２が頻繁に使用され
てきた。

宿主細胞の組換えＤＮＡによる形質転換は次のような慣
用された方法で実施できる。

宿主が大”腸閉のような原核生物の場合には、ＤＮＡの
取り込みが可能なコンビ−テント細胞は、指数生育期に
収穫しついで公知のＣａＣｌ２法で処理して調製する。

ＭｑＣ１２またはＲｂＣｊ！が形質転換反応メジウム中
に存在すると、形質転換は効率的に増加する。形質転換
は、宿主細胞のプロトプラストを形成させたのちに実施
することもできる。

使用する宿主が真核生物の場合には、ＤＮＡをリン酸カ
ルシウムとして沈殿としてトランスフェクションする方
法、マイクロインジェクションのような礪械的方法、赤
血球宿主もしくはリポソームに封入したプラスミドの挿
入、リゾホスファチジルコリンのような試薬による細胞
の処理、ウィルスベクターの使用等が使用できる。

しかしながら、他の様々な微生物株、たとえば大腸菌８
１大腸菌ＸＩ　７７６　（ＡＴＣＣＮＱ３１５３７〉お
よび大腸菌Ｗ３３１０　（ＡＴＣＣ社２７３２５）のよ
うな公知の大腸菌株、とくに好ましくは大腸菌ＲＲＩ　
（ＡＴＣＣ順３１３４３）、またはＭＣ１０６１のよう
な他の微生物が有用である。これらの多くは、寄託機関
たとえばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ＡＩＩｌｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　、　ＡＴＣＣ，）に寄託され
ていて利用できる（ＡＴＣＣカタログ参照）。また、ド
イツ公開特許第２６４４４３２号も参考になる。これら
の他の微生物には、枯草菌のような桿菌属、ネズミチフ
ス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａｔｙｐｈｉｉｕｒｉｕｍ
　）や璽菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅＳＣｅｎＳ
　＞のような腸内細菌が包含され、それらの菌内で異種
遺伝子配列を複製し、発現できるプラスミドが使用され
る。

異種ポリペプチドの微生物産生を開始し維持するために
は、たとえば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロ
モーターシステムが有利に使用できる。これらのプロモ
ーターシステムの組立および構築に関する詳細はチャン
ら（Ｃｈａｎａ　ｅｔ　ａｌ、　：ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）　、　２７５．６７１〜６２４（１９７８））
およびイタクラら（Ｂａｋｕｒａ　ｅｔａｌ、：サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　、　１９８．１０５６〜１
０６３　（１９７７））によって報告されている。さら
に最近になって、トリプトファンに関するシステム、い
わゆるｔｒｐプロモーターシステムが開発された。この
システムの組立および構築に関する詳細はゲラデルら（
Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｔ、　：ヌクレイツク・アシ
ツズ・リサーチ（ＮＵＣＩ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、　８．４０５７〜４０７４
　（１９８０）〕により記述されている。多くの他の微
生物プロモーターが発見され、使用されており、それら
のヌクレオチド配列、プラスミドベクター内への機能的
な結合についての詳細も報告されている〔たとえば、ジ
−ベンリスト（Ｓｉｃｂｅｎｌｉｓｔ）はか：セル（Ｃ
ｅｌｌ）、２０，２６９　（１９８０）参照〕。

発現システムとしては、大腸菌でも酵母、ビール酵母菌
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）のいずれでも複製可能なプラスミドＹＲｐ７も使用で
きる。

有用な菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに制限なく寄託されている（ＡＴＣＣＮｏ、４４
０７６＞。しかしながら、細胞ｔｒｐ１を作る突然変異
を含む任意のビール酵母菌がこの発現システムを含有す
るプラスミドの発現に有効な環境であると考えてよい。

使用できる他の菌株の例にはｐｅｐ４−ｉがある。この
トリプトファン栄養要求株もＴＲＰＩ！仏子内に点変異
を有する。

マウスＩ　Ｌ−１ｃＤＮＡの大腸菌内発現での経験から
、ヒトＩＬ−１プレカー号−のカルボキシ末端部分がＩ
Ｌ−１の生物学的活性を有することが示唆される。上述
のクローンｐｈｉｌ＃７は、ヒトＩＬ−１プレカーサー
のカルボキシ末端１６３個のアミノ酸の暗号情報を含ん
でいる。ｐｈｉｌ＃７挿入体（第２Ａ図参照）の５′末
端付近、９番目のアミノ酸（すなわち、プレカーサーの
カルボキシ末端から１５５”アミノＦｉｌ）のコドン内
にＡＪｕＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位がある。

次の下流ＡＪ！ｕＩ部位は、約６００　ｂｐ離れた３′
非暗号領域内に（すなわち停止コドンを過ぎて）ある。

ヒトＩＬ−１プレカーサーのカルボキシ末端１５４のア
ミノ酸をコードする配列を含むこの約６００ｂｐ　　Ａ
ｊ！ｕＩフラグメントハｐｈ！Ｉ＃７カら単離され、大
腸菌発現プラスミドの１３　ａ　ｍ　ＨＩ部位（第４図
参照）に以下の方法で挿入された。

すなわち、標準方法を用いて、クローンｐ旧岬７からの
挿入体をＡｊ！ｕＩで消化し、ホスホリル化ＢａｍＨＩ
リンカ−（ＣＧＧＡＴＣＣＧ、　ニュー慢イングランド
・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎａｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ
ｂｓ　＞、カタログ１０２１）を／ｌｕＩ切断挿入体に
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。リガーゼを熱
不活性化し、混合物をＢａｍＨＩで処理し、過剰のリン
カ−を除去し、付着端を生成させた。この混合物をポリ
アクリルアミド上電気泳動に付し、約６００ｂｐフラグ
メントを単離した。プラスミドＤＥＶ−ｖｒｆ２をＢａ
ｍＨＩで消化し、線状化ベクターをアガロースゲル電気
泳動によって回収した。約６００　ｂｐフラグメントと
ＢａｍＨＩ切断ベクターを互いに結合させ、適合性プラ
スミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ　（ベルナルトはか（Ｂｅ
ｒｎａｒｄ　＆　Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ）　、メソツズ・イ
ン・エンザイモロジ−（Ｈｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｔ）　、
　６８．４８２〜４９２（１９７９）；ＡＴＣＣＮα３
７７６６）を含む大腸菌株ＭＣ１０６１（カサダバンは
か（Ｃａｓａｄａｂａｎ　＆　Ｃｏｈｅｎ　）　：ジャ
ーナル・オブ・モルキュラーーバイオロジー（Ｊ、　Ｈ
ｏｔ、　Ｂｉｏｌ、　）　。

１３８．１７９〜２０７　（１９８０））の形質転換に
用い、アンピシリン抵抗性を利用して選択した。細菌ク
ローンを制限エンドヌクレアーゼ消化解析によってスク
リーニングし、この挿入体を正しい方向に含有するプラ
スミドｐｈｉｌ＃１〜１５４＊を同定した。プラスミド
ｐｈｉｌ＃１〜１５４＊の部分配列決定を行い、その構
造が正しいことを確認した。ｐｈｉｌ＃１〜１５４＊ま
たはその親プラスミドｐＥｖ−Ｖｒｆ２を含む細菌を、
アンピシリン含有Ｍ９メジウム中３０℃で、Ａ　　が０
．７に達するまで生育させた。この時点で培養条件を４
２℃にシフトし、２時間培養した。培養液１ｒ１１から
の細菌を遠心分離によって回収し、７Ｍグアニジン塩酸
塩５０μｍ中で可溶化した。これらの粗細菌抽出液につ
いて、ネズミ胸腺細胞増殖検定法〔ミゼル（旧ｚｅｌ　
）はか：前出〕によりＩＬ−１活性を調べた。ｐＥｖ−
Ｖｒｆ’２のみを含む細菌抽出液はこの検定でバックグ
ラウンド以上に刺激しなかった。ρ旧１＃１〜１５４＊
を含む細菌の抽出液はグアニジン塩′Ｆｉ塩溶液１１Ｉ
ｉ！あたり３２．０００単位ＩＬ−１活性を示した。

比活性を６Ｘ１０６単位／＋９と想定すると、これは、
細菌培養液１１あたり少なくとも０．３ＲｇのＩし一１
蛋白質に相当する。

発現プラスミドｐｈｉｌ＃１〜１５４＊によってコード
される蛋白質は、イニシエイターのメチオニンに加えて
６個の異種アミノ酸をそのアミノ末端に有する。これら
は、特定部位突然変異により、次のようにして除去され
た。

プラスミドル旧１＃１〜１５４”１〜２μグを２つに分
けていずれもＩ１１限エンドヌクレアーゼ消化に付した
。一方の反応では、１〜２単位のａａｌｍおよびＢａｍ
ＨＩによりギャップ構造を有する線状化プラスミドをｆ
ｉｌ製しく第５図参照）、もう一方の反応では、ｐｓｔ
■により線状化プラスミドを生成させた。ＰｓｔＩ処理
後は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウフラグメン
ト１単車位で処理した。これらの開環プラスミドを０．
７％アガＯ−スゲルを用い電気泳動に付し、エタノール
沈殿で回収して精製した。各プラスミドを５μｌの水に
再懸濁した。それぞれから１１１１を取って、１２ｍＨ
のトリス塩酸塩ｐＨ７，５，９ｍＨＭ　Ｑ　Ｃ１，２０
０ｍＨＮ　ａ　Ｃ１および２０μｌβ−メルカプトエタ
ノールを含む反応液１２μλ中ホスホリル化合成オリゴ
ヌクレオチド：５　　’　　　−Ｐ　　−ＡＴＴＧＣＴ
ＣＡＧＧＡＡＣＡＴ＾ＴＴ＾ＡＴＴＣＣ−０ト１−３’
５０ｎｇと合した。反応液を１００℃に３分間加熱して
開環プラスミドを変性させ、反応液２３℃に１０分間、
４℃に３０分間ついで０℃に１０分間保持して徐々に冷
却して、オリゴヌクレオチドをアニーリングした。この
操作でヘテロ二重鎖型のｐｈｉｌ＃１〜１５４１が生成
し、オリゴヌクレオチドは一重鎮領域にアニーリングし
た。

−ｆｆｉ鎮領域を二重鎖にし、このプラスミドを７５μ
Ｍ　　ｄＡＴＰ、７５′ＩｉＭ　　ｄＴＴＰ、７５μＭ
　　ｄＣＴＰ、７５μＭ　　ｄＧＴＰ、５００μＭＡＴ
Ｐ、２〜３単位大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ
フラグメントおよび１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む
反応２０μｍ中でリゲートさせた。この反応は１５℃で
１２〜１６時間行った。プラスミドＤＮＡはエタノール
沈殿で回収し、１０μｌの水に再懸濁した。その５μｌ
を取り、アンピシリン抵抗性の適合性プラスミドｐＲＫ
２４８．ｃｉｔｓを含む大腸菌株ＭＣ１０６１の形質転
換に用いた。各形質転換体からのプラスミドＤＮＡを回
収し、このプラスミドＤＮＡプレバレージョンに対して
Ｆ３Ｑ１’ｆｉ／ＢａｍＨＩ制限消化を行うことにより
、アンピシリン抵抗性形質転換体について、ｐｈｉｌ＃
１〜１５４８パックグラウンド中の新規プラスミドｐｈ
ｉｌ＃ｉ〜１５４をスクリーニングした。ｐｈｉ岬１〜
１５４を含むプラスミドＤＮＡを用いて第２ラウンドＭ
Ｃ１０６１（ｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ）形質転換を行い、
ｐｈｉｌ＃１〜１５４とｐｈｉｌ＃１〜１５４＊を分離
した。ｐｈｉｌ＃１〜１５４のみを含む形質転換体を回
収し、各大腸菌コロニーを以下に述べるようにｐｈｉｌ
＃１〜１５４蛋白質の製造に使用した。

組換えヒトインターロイキン−１の多くの他の組換え蛋白質と同様に〔ウィリアム（Ｗｉｌ
ｌｉａｍ、Ｄ、Ｃ，）はか：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｉ　。

２１５．６８７〜６８９　（１９８２）；ラカル（Ｌａ
Ｃａ１．Ｊ、Ｃ，’）ほか：プロシーデイングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・スティソ・オブ・アメリカ（
Ｐｒｏｃ、　Ｗａｔｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ）　、　８１．５３０５〜５３０９　（１９８４）参
照〕、ヒトインターロイキン−１を大腸菌内の不溶性細
胞質内封入体中に凝集する。したがって、組換えヒトＩ
Ｌ−１の精製は、これらの封入体の単離に始まる〔ラカ
ル（Ｌａｃａｌ　）ほか：前出参照）。

大ｗｊＪ菌ペースト（１ｇ）を緩衝液Ａ（３０＋Ｈトリ
ス塩酸塩ｐＨ８，５ｍＨＥＤＴＡ）中１　ｉＭフェニル
メチルスルホニルフルオライド５ｍに懸濁し、この細胞
をソニファイア−（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）　Ｉｌｌ胞ディ
スラブター３５０型（プランソン・ソニック・パワｍ−
カンパニー　（Ｂｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅ
ｒ　Ｃｏ、　）　）を用いて６回、計３分間超音波処理
した。細胞溶解物を３０．ＯＯＯｘｇで３０分間遠心分
離して不溶性分画を分離した。微粒子分画（大部分のＩ
Ｌ−１活性を含む）をそれぞれ５ｍの１）ＩＩ衝液液Ａ
１２緩衝液Ａ中１％トリトンＸ−１００および３）１．
７５Ｍグアニジン塩ｉ［で順次洗浄した。

各洗浄後に、微粒子分画を３０．０００Ｘ９で２０分間
遠心分離してベレット化した。ＩＬ−１活性を５Ｍグア
ニジン塩酸塩３ＩＩ１１によって残った微粒子分画から
可溶化し、ついで３０．ＯＯＯｘｇで３０分間遠心分離
した。この工程まで、すべての操作は４℃で実施した。

可溶化したＩＬ−１蛋白質は、５Ｍグアニジンｊ！！　
Ｍ塩で平衡化したセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　
）　Ｓ　−２００またはセファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ）　Ｇ　−７５（ファーマシア・ファイン・ケミカ
ルズ、ビス力タウエイ、ニューシャーシー（Ｐｈａｒｉ
ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｏ＋１ｃａｌｓ。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｍｌ、　）　）上ゲルろ過クロ
マトグラフィーに付し、５Ｍグアニジン塩酸塩で溶出し
て精製した。精製した１〜１５４”　ＩＬ−１はＳＯＳ
ポリアクリルアミドゲル上単−のポリペプチドとして挙
動した〔レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、）、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、　　２２７．６８０〜６８
５　（１９７０））。アミノ酸組成分析およびアミノ末
端配列解析に付すと、期待された結果が１昇られ、この
蛋白質の純粋性と同一性が確認された。同様に、ｐｈｉ
１＃１〜１５４で形質転換した大腸菌は１〜１５４蛋白
質の製造に使用され、この蛋白質も上述したと同様に精
製された。

マウスＩＬ−１遺伝子の欠失変異株の発現生成物につい
ての実験より、生物活性蛋白質を与えるマウス！し一１
カルボキシ末端からの最小配列を決定する根拠が与えら
れている。結果を第１表にまとめる。

第１表欠失変異株のマウスＩＬ−１活性１７−１５６　　　　　６ｘ１０６１−１４３．１５６　　　　０１７−１４３．１５６　　　０３０−１４３．１５６　　　０１、蛋白質１−１５６はマウスＩＬ−１プレカーサーの
カルボキシ末端１５６個のアミノ酸を含むことを意味す
る。欠失変異株はすべて、この分子との対比で定義され
ていて、蛋白質１７−１５６は蛋白質１−１５６に対し
１６個の７ミノ末端アミノ酸を欠（こと、蛋白質１−１
４３，１５６は蛋白質１−１５６に対しアミノ酸１４４
−１５５を欠く。

２３）胸腺細胞増殖検定〔ミゼル（Ｈｉｚｅｌ　）はか
：前出〕、単位／η蛋白質第１表から明らかなように、活性にはカルボキシ末端に
近い配列が必須である。１７−１５６が高い活性を示し
、一方さらにこのフラグメントのアミノ末端から１３個
のアミノ酸を欠失させると活性は消失することから、最
低約１３９個のアミノ酸が活性の維持に必要なことが明
らかである。

マウス分子におけるデータからの類推により、ヒトＩＬ
−１プレカーサーのカルボキシ末端の１３９個のアミノ
酸を包含する配列がＩＬ−１活性を表す最小フラグメン
トであると考えられる。これは、第２Ｂ図に示したヒト
ＴＬ−１プレカーサー蛋白質配列の位置１３２〜２７１
に相当する。したがって、本発明はその一態において、
上述の最小カルボキシ末端配列を含み、ヒトＩＬ−活性
を表すペプチドに関する。

生物学的活性に必要な配列を包含する組換えヒトＩＬ−
１ペプチドの精製物は、それ自体公知の方法により、た
とえば病原に対する宿主の防御応答の改善、ワクチンア
ジュバントとしての作用および新生物疾患に対する宿主
の防御の増強によって、宿主対象の免疫系の刺激に用い
ることができる。本技術分野においてヒトＩＬ−１の伯
の臨床的応用が確認されているものには、線維芽細胞の
増殖刺激を介した創傷治癒の促進および重篤な蛋白質栄
養不良患者の回復の改善がある。

本発明の方法に従って製造された精製ＩＬ−１ペプチド
は、上述の臨床的利用のため温血動物に投与することが
できる。投与は任意の慣用方法により、たとえば静脈内
、皮下また筋肉内に非経口的に行われる。必要投与量が
、５１！ｌ置される特定の症状、症状の重症度、処置期
間および投与方法等によって変動することは自明のとお
りである。医薬用途における適当な剤型はＩＬ−１ペプ
チドを滅菌ろ過し、凍結乾燥した剤型がある。これは常
法により使用前に再構築させる。非経口投与用医薬剤型
に慣用される緩衝剤、安定剤、静菌剤および他の賦形剤
もしくは補助剤を添加できることも、本技術分野の熟練
者によれば容易に想到する範囲内で、本発明に包含され
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、マウスＩＬ−１プレカーサーＣＤＮへのヌク
レオチド配列およびそれから予測されるアミノ酸配列で
ある。第２Ａ図は、ヒトＩＬ−１プレカーサー（ｐｈｉｌ＃７
から）のカルボキシ末端領域のヌクレオチド配列とそれ
から予測されるアミノ酸配列で、ｐｈｉｌ＃４の部分配
列には下線を施しである。第２Ｂ図は、クローンｐｈｉｌ＃７およびｏｈ＃１９の
複合体から推定されるヒトＩし一１プレカーサーのヌク
レオチド配列およびそれから予測されるアミノ酸配列で
ある。第３図は、マウスおよびヒトＩＬ−１プレカーサー蛋白
質の配列のホモロジーを示した図である。第４図は、修飾された１５４個のアミノ酸のヒトＩＬ−
１カルボキシ末端配列（ｐｈｉｌ＃１〜１５４“）の合
成を行う発現ベクターの、ベクターとしてｏＥＶ−Ｖｒ
ｆ２を用いた構築を示すフローチャートである。第５図は、Ｄｈｉｌ＃１〜１５４＊のアミノ末端異種ア
ミノ酸をもたないヒトＩＬ−１の１５４個のアミノ酸カ
ルボキシ末端配列（１）ｈｉｌ＃１〜１５４）の合成を
行う発現ベクターの構築を示すフローチャートである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）他のヒトポリペプチドを含まず、生物学的活性に
必要な最小カルボキシ末端配列からなり、その最小配列
はヒトインターロイキン−１（ＩＬ−１）プレカーサー
蛋白質の位置１３２〜２７１に相当するヒトインターロ
イキン−１ポリペプチド
（２）グリコシル化を全く受けていない特許請求の範囲
第１項記載のヒトインターロイキン−１ポリペプチド
（３）配列：【遺伝子配列があります】を有する特許請求の範囲第２項記載のヒトインターロイ
キン−１ポリペチド
（４）配列：【遺伝子配列があります】を有する特許請求の範囲第２項記載のヒトインターロイ
キン−１ポリペプチド
（５）ヒトインターロイキン−１の生物学的活性を有す
るポリペプチドをコードするクローン化遺伝子
（６）細菌性リポポリサッカライドで誘導された正常末
梢人血白血球から産生されるメッセンジャーＲＮＡより
調製した特許請求の範囲第５項記載の遺伝子
（７）第２Ａ図に示すヌクレオチド配列からなる特許請
求の範囲第５項または第６項のいずれかに記載の遺伝子
（８）ヌクレオチド配列：【遺伝子配列があります】からなる特許請求の範囲第５項または第６項のいずれか
に記載の遺伝子
（９）第２Ｂ図に示すヌクレオチド配列からなる特許請
求の範囲第５項または第６項のいずれかに記載の遺伝子
（１０）ヒトインターロイキン−１の生物学的活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子と原核生物または
真核生物細胞中での増殖とそのポリペプチドの発現が可
能なＤＮＡ配列からなり、ヒトインターロイキン−１の
コード配列はプロモーター配列の下流位置に存在する発
現ベクター
（１１）ヒトインターロイキン−１の生物学的活性を右
するポリペプチドをコードする遺伝子は特許請求の範囲
第５項から第９項までのいずかに記載の遺伝子である特
許請求の範囲第１０項記載の発現ベクター
（１２）グラム陰性菌内で複製可能な特許請求の範囲第
１０項または第１１項のいずれかに記載の発現ベクター
（１３）大腸菌株内で複製可能な特許請求の範囲第１２
項記載の発現ベクター
（１４）プラスミドｐｈｉｌ＾＃１−１５４＾＊である
特許請求の範囲第１３項記載の発現ベクター
（１５）プラスミドｐｈｉｌ＾＃１−１５４である特許
請求の範囲第１３項記載の発現ベクター
（１６）真核生物細胞内で複製可能な特許請求の範囲第
１０項または第１１項のいずれかに記載の発現ベクター
（１７）特許請求の範囲第１０項から第１６項までのい
ずれかに記載の発現ベクターで形質転換された原核生物
または真核生物細胞
（１８）大腸菌属に属する原核生物細胞である特許請求
の範囲第１７項記載の形質転換細胞
（１９）大腸菌ＭＣ１０６１株である特許請求の範囲第
１８項記載の形質転換細胞
（２０）真核生物細胞である特許請求の範囲１７項記載
の形質転換細胞
（２１）酵母菌属に属する真核生物細胞である特許請求
の範囲第２０項記載の形質転換細胞
（２２）サルの細胞である特許請求の範囲第２０項記載
の形質転換細胞
（２３）特許請求の範囲１０項から第１６項までのいず
れかに記載の発現ベクターで形質転換された真核生物ま
たは原核生物細胞を培養してヒトインターロイキン−１
を産生させ、産生したヒトインターロイキン−１を回収
することから構成される特許請求の範囲第１項から第４
項までのいずれかに記載のヒトインターロイキン−１ポ
リペプチドの製造方法
（２４）細胞は特許請求の範囲第１９項記載の細胞であ
る特許請求の範囲第２３項記載の製造方法
（２５）細胞は特許請求の範囲第２０項から第２２項ま
でのいずれかに記載の真核生物細胞であり、ヒトインタ
ーロイキン−１の生物学的活性型は発現後修飾により得
られる特許請求の範囲第２３項記載の製造方法
（２６）アミノ末端が異なるヒトインターロイキン−１
の生物学的活性型の不均一集団が形成される特許請求の
範囲第２５項記載の製造方法
（２７）特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
かに記載のヒトインターロイキン−１ポリペプチドを発
現可能な真核生物または原核生物細胞を製造するにあた
り、上記ポリペプチドを発現可能な発現ベクターで真核
生物または原核生物細胞を形質転換し、形質転換された
真核生物または原核生物細胞を培養することからなる方
法
（２８）特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
かに記載のヒトインターロイキン−１ポリペプチドを形
質転換された真核生物または原核生物細胞中で発現可能
な発現ベクターを製造するにあたり、上記ポリペプチド
をコードする遺伝子を構築し、原核生物または真核生物
細胞中で上記ポリペプチドの増殖および発現が可能なＤ
ＮＡ配列内のプロモーター配列の下流位置に上記遺伝子
を位置させる方法
（２９）特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
かに記載のヒトインターロイキン−１ポリペプチドの均
一型の有効量が小部分を、慣用の非経口投与医薬用担体
物質が大部分をなす非経口投与用医薬組成物
（３０）特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
かに記載のヒトインターロイキン−１ポリペプチドの、
ヒト創傷治癒促進のための使用
（３１）特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
かに記載のヒトインターロイキン−１ポリペプチドの、
重篤な、蛋白栄養不良患者の改善もしくは回復のための
使用
（３２）特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
かに記載のヒトインターロイキン−１ポリペプチドの、
病原に対する防御反応の改善、ワクチンアジユバントと
しての活性または新生物疾患に対する防御の増進による
ヒト免疫系の刺激のための使用
（３３）特許請求の範囲第５項から第９項までのいずれ
かに記載のクローン化遺伝子の、特許請求の範囲第１項
から第４項までのいずれかに記載のポリペプチドの製造
における使用
（３４）特許請求の範囲第１０項から第１６項までのい
ずれかに記載の発現ベクターの、特許請求の範囲第１項
から第４項までのいずれかに記載のポリペチドの製造に
おける使用
（３５）特許請求の範囲第１７項から第３２項までのい
ずれかに記載の原核生物または真核生物細胞の、特許請
求の範囲第１項から第４項までのいずれかに記載のポリ
ペプチドの製造における使用（３６）本明細書に記載さ
れた発明