JP2559705B2 - 組換えインタ−ロイキン−１ - Google Patents
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/545—IL-1
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
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- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 インターロイキン−１（IL−１）は活性化マクトフア
ージによつて合成され、分分泌される蛋白質である。感
染や他の形の侵襲に対する生体防御機構の一部として、
このポリペプチドホルモンは広範囲にわたる細胞種（Ｔ
およびＢリンパ球、肝細胞、骨髄細胞、結合織要素、骨
格筋、脳細胞等）の増殖および／または分化を刺激す
る。この様々な細胞集団に対する活性により、IL−１
は、免疫機能、発熱、肝細胞機能（急性相反応体の合成
および分泌の増大；アミノ酸、鉄および亜鉛の取り込み
の増進）、骨髄からの好中球の産生および放出、骨格筋
の蛋白質分解、結合織変化等を調節する。IL−１は、従
前、リンパ球活性化因子（lymphocyte activaing facto
r,LAF）、白血球内在性メデイエーター（leukocyte end
ogeneous mediator,LEM）、内在性パイロジエン（endog
eneous pyrogen,EP）、また単核細胞因子（mononuclear
cell factor,MCF）などと呼ばれていた。最近まで、IL
−１の研究はすべて、部分精製蛋白質プレパレーシヨン
で行われていたので、IL−１に関連する活性のすべてが
１つの分子内に含まれているものなのか、あるいは上に
略述した機能の一部はIL−１のフラグメントや他のマク
ロフアージ蛋白質が関与しているのか等は確定していな
かつた。
ージによつて合成され、分分泌される蛋白質である。感
染や他の形の侵襲に対する生体防御機構の一部として、
このポリペプチドホルモンは広範囲にわたる細胞種（Ｔ
およびＢリンパ球、肝細胞、骨髄細胞、結合織要素、骨
格筋、脳細胞等）の増殖および／または分化を刺激す
る。この様々な細胞集団に対する活性により、IL−１
は、免疫機能、発熱、肝細胞機能（急性相反応体の合成
および分泌の増大；アミノ酸、鉄および亜鉛の取り込み
の増進）、骨髄からの好中球の産生および放出、骨格筋
の蛋白質分解、結合織変化等を調節する。IL−１は、従
前、リンパ球活性化因子（lymphocyte activaing facto
r,LAF）、白血球内在性メデイエーター（leukocyte end
ogeneous mediator,LEM）、内在性パイロジエン（endog
eneous pyrogen,EP）、また単核細胞因子（mononuclear
cell factor,MCF）などと呼ばれていた。最近まで、IL
−１の研究はすべて、部分精製蛋白質プレパレーシヨン
で行われていたので、IL−１に関連する活性のすべてが
１つの分子内に含まれているものなのか、あるいは上に
略述した機能の一部はIL−１のフラグメントや他のマク
ロフアージ蛋白質が関与しているのか等は確定していな
かつた。
構造や活性の研究に十分な量のヒトIL−１を製造する
ことは難しかつたため、この分子の生化学的性質はよく
わかつていない。IL−１プレパレーシヨンは大きさや電
荷の点で異種混合物であることが明らかにされている。
IL−１の活性は120,000〜190,000の範囲のいずれかの分
子量をもつ単一ポリペプチド鎖に伴うものである。
ことは難しかつたため、この分子の生化学的性質はよく
わかつていない。IL−１プレパレーシヨンは大きさや電
荷の点で異種混合物であることが明らかにされている。
IL−１の活性は120,000〜190,000の範囲のいずれかの分
子量をもつ単一ポリペプチド鎖に伴うものである。
最近、IL−１をコードする遺伝子がクローン化され、
配列が決定され、大腸菌で発現されている〔ロメジコ
（Lomedico）ほか：ネイチヤー（Nature）,312,458〜46
2（1984）〕。精製された「天然」マウスIL−１につい
ての配列決定研究とともに、このホルモンがどのように
して合成され、大きさおよび電荷の不均一性を有する分
子集団を生成するかかが明らかにされた。精製された天
然マウスIL−１をSDS−ポリアクリルアミドゲル上電気
泳動に付すと、分子量12,000〜19,000の多数のポリペプ
チドが認められ、これらはすべて生物学的活性を有す
る。これらのポリペプチドはアミノ末端配列が異なり、
トリス−グリシンポリアクリルアミドゲルに対して電荷
不均一性を示す。クローン化マウスIL−1cDNAの配列決
定とin vitroでの翻訳実験により、IL−１ははじめ、27
0個のアミノ酸をもつプレカーサーポリペプチドとして
合成されることがわかつた。生物学的に活性なIL−１
は、大腸菌から、このプレカーサーのカルボキシ末端の
156個のアミノ酸の発現により得ることができる。すな
わち、IL−１活性は、270個のアミノ酸のプレカーサー
蛋白質のカルボキシ末端から蛋白質分解的に放出され
る。プロテアーゼの作用点が多いことから、アミノ末端
が不揃いの分子集団が生成し、これが精製された「天
然」IL−１に認められる大きさおよび電荷の不均一性の
説明となる。
配列が決定され、大腸菌で発現されている〔ロメジコ
（Lomedico）ほか：ネイチヤー（Nature）,312,458〜46
2（1984）〕。精製された「天然」マウスIL−１につい
ての配列決定研究とともに、このホルモンがどのように
して合成され、大きさおよび電荷の不均一性を有する分
子集団を生成するかかが明らかにされた。精製された天
然マウスIL−１をSDS−ポリアクリルアミドゲル上電気
泳動に付すと、分子量12,000〜19,000の多数のポリペプ
チドが認められ、これらはすべて生物学的活性を有す
る。これらのポリペプチドはアミノ末端配列が異なり、
トリス−グリシンポリアクリルアミドゲルに対して電荷
不均一性を示す。クローン化マウスIL−1cDNAの配列決
定とin vitroでの翻訳実験により、IL−１ははじめ、27
0個のアミノ酸をもつプレカーサーポリペプチドとして
合成されることがわかつた。生物学的に活性なIL−１
は、大腸菌から、このプレカーサーのカルボキシ末端の
156個のアミノ酸の発現により得ることができる。すな
わち、IL−１活性は、270個のアミノ酸のプレカーサー
蛋白質のカルボキシ末端から蛋白質分解的に放出され
る。プロテアーゼの作用点が多いことから、アミノ末端
が不揃いの分子集団が生成し、これが精製された「天
然」IL−１に認められる大きさおよび電荷の不均一性の
説明となる。
ヒトIL−１をコードすると考えられる遺伝子のクロー
ニングはオーロン（Auron）らによつて報告されている
〔プロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテツド・ス
テイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），
81,7907〜7911（1984）,1985年２月刊〕。この報告に記
載されたDNAおよび蛋白質の配列は、以下に述べる配列
とわずかに一部分がホモロジーを示すにすぎない。
ニングはオーロン（Auron）らによつて報告されている
〔プロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテツド・ス
テイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），
81,7907〜7911（1984）,1985年２月刊〕。この報告に記
載されたDNAおよび蛋白質の配列は、以下に述べる配列
とわずかに一部分がホモロジーを示すにすぎない。
天然ヒトIL−１の均一体への精製はラヒマン（Lachma
n）が報告している〔フエデレーシヨン・プロシーデイ
ング（Fed.Proc.），42,2639〜2645（1983）〕。使用し
た方法は分子量分画、等電点電気泳動およびプレパラテ
イブポリアクリルアミドゲル電気泳動であつた。ドデシ
ル硫酸ナトリウムを最終工程に使用したため、生成物は
変性し、はじめの生物学的活性の痕跡を示すにすぎなか
った。単一な電荷をもつヒトIL−１を製造するためにHP
LC法を用いる精製系についてのシユミツト（Schmidt）
の報告〔ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデ
イシン（J.Exp.Med.）,160,772〜787（1984）〕、また
クロンハイム（Kronheim）ら〔ジヤーナル・オブ・エク
スペリメンタル・メデイシン（J.Exp.Med.）,161,490〜
502（1985）〕の報告もある。
n）が報告している〔フエデレーシヨン・プロシーデイ
ング（Fed.Proc.），42,2639〜2645（1983）〕。使用し
た方法は分子量分画、等電点電気泳動およびプレパラテ
イブポリアクリルアミドゲル電気泳動であつた。ドデシ
ル硫酸ナトリウムを最終工程に使用したため、生成物は
変性し、はじめの生物学的活性の痕跡を示すにすぎなか
った。単一な電荷をもつヒトIL−１を製造するためにHP
LC法を用いる精製系についてのシユミツト（Schmidt）
の報告〔ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデ
イシン（J.Exp.Med.）,160,772〜787（1984）〕、また
クロンハイム（Kronheim）ら〔ジヤーナル・オブ・エク
スペリメンタル・メデイシン（J.Exp.Med.）,161,490〜
502（1985）〕の報告もある。
本技術分野においては、ネズミIL−１に対して産生さ
れる抗体の製造についても知られている〔ミゼル（Mize
l）ほか：ジヤーナル・オブ・イミユノロジー（J.Immu
n.）,131,1834〜1837（1983）〕。ヤギで産生されたこ
れらの抗体は、IL−１の検定法の開発に、また天然もし
くは組換えネズミIL−１をさらに精製のするために有用
な抗IL−１免疫吸着カラムの製造に使用されたものであ
る。抗ネズミIL−１抗体とヒトIL−１との交差反応は弱
い。
れる抗体の製造についても知られている〔ミゼル（Mize
l）ほか：ジヤーナル・オブ・イミユノロジー（J.Immu
n.）,131,1834〜1837（1983）〕。ヤギで産生されたこ
れらの抗体は、IL−１の検定法の開発に、また天然もし
くは組換えネズミIL−１をさらに精製のするために有用
な抗IL−１免疫吸着カラムの製造に使用されたものであ
る。抗ネズミIL−１抗体とヒトIL−１との交差反応は弱
い。
本発明は、ひとヒトIL−１遺伝子のクローニング、そ
の適当な発現ベクターへの構築、このような発現ベクタ
ーによる宿生生物体の形質転換およびこのような形質転
換細胞の培養による生物学的に活性な組換えヒトIL−１
の製造に関する。さらに、本発明は、生成した組換ヒト
IL−１ポリペプチドの単離および利用に関する。
の適当な発現ベクターへの構築、このような発現ベクタ
ーによる宿生生物体の形質転換およびこのような形質転
換細胞の培養による生物学的に活性な組換えヒトIL−１
の製造に関する。さらに、本発明は、生成した組換ヒト
IL−１ポリペプチドの単離および利用に関する。
すなわち、本発明は、ヒトインターロイキン−１のDN
A配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列の発見な
らびにその製造および利用の手段として、組換えDNA技
術を使用するものである。
A配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列の発見な
らびにその製造および利用の手段として、組換えDNA技
術を使用するものである。
さらに詳しくは、本発明は、生物学的に活性型のヒト
インターロイキン−１をコードするDNA配列の単離およ
び同定に関する。これは、マウスIL−1cDNAクローンを
使用して行われ、部分ヒトIL−１ゲノムクローンが単離
された。このゲノムクローンは次に、ヒトIL−1cDNAク
ローンの単離に用いられた。このcDNAの配列により、ヒ
トIL−１プレカーサー蛋白質の構造が明らかにされた。
このプレカーサーのカルボキシ末端154個のアミノ酸の
大腸菌内発現で、生物学的に活性なIL−１蛋白質が製造
された。
インターロイキン−１をコードするDNA配列の単離およ
び同定に関する。これは、マウスIL−1cDNAクローンを
使用して行われ、部分ヒトIL−１ゲノムクローンが単離
された。このゲノムクローンは次に、ヒトIL−1cDNAク
ローンの単離に用いられた。このcDNAの配列により、ヒ
トIL−１プレカーサー蛋白質の構造が明らかにされた。
このプレカーサーのカルボキシ末端154個のアミノ酸の
大腸菌内発現で、生物学的に活性なIL−１蛋白質が製造
された。
本発明に係る生物学的に活性な1L−１蛋白質は、 他のヒトポリペプチドを含まないヒトインターロイキ
ン−１（1L−１）ポリペプチドであって、 ヒトIL−１プレカーサー蛋白質のアミノ酸配列の位置
118〜271に相当する、アミノ酸配列： を有するヒト1L−１ポリペプチドに関する。
ン−１（1L−１）ポリペプチドであって、 ヒトIL−１プレカーサー蛋白質のアミノ酸配列の位置
118〜271に相当する、アミノ酸配列： を有するヒト1L−１ポリペプチドに関する。
したがつて、さらに詳しくは、本発明はヒトIL−１プ
レカーサーおよびそれに含有される生物学的に活性な分
子をコードするDNA配列の単離および同定、ならびにこ
のDNA配列をその発現に有効なプロモーター配列と機能
的に結合して含有する発現ベクターの構築に関する。ま
た他の態様においては、本発明はこのような発現ベクタ
ーで形質転換され、したがつて上述のDNA配列を発現す
る各種微生物および脊椎動物細胞のような宿主培養系に
関する。他の態様においては、本発明はこの発現の最終
生成物を、ヒトの予防的または治療的処置あるいは診断
検定系に有効な新規物、たとえば医薬組成物に変換する
手段および方法に関する。本発明は、その好ましい態様
においては、ヒトインターロイキン−１が成熟型として
宿主細胞内で産生するように構築された特定の発現ベク
ターを提供する。
レカーサーおよびそれに含有される生物学的に活性な分
子をコードするDNA配列の単離および同定、ならびにこ
のDNA配列をその発現に有効なプロモーター配列と機能
的に結合して含有する発現ベクターの構築に関する。ま
た他の態様においては、本発明はこのような発現ベクタ
ーで形質転換され、したがつて上述のDNA配列を発現す
る各種微生物および脊椎動物細胞のような宿主培養系に
関する。他の態様においては、本発明はこの発現の最終
生成物を、ヒトの予防的または治療的処置あるいは診断
検定系に有効な新規物、たとえば医薬組成物に変換する
手段および方法に関する。本発明は、その好ましい態様
においては、ヒトインターロイキン−１が成熟型として
宿主細胞内で産生するように構築された特定の発現ベク
ターを提供する。
本発明は添付された図面を参照すれば、その理解が容
易になるものと考えられる。
易になるものと考えられる。
第１図は、マウスIL−１プレカーサーcDNAのヌクレオ
チド配列および予測されるアミノ酸配列である。
チド配列および予測されるアミノ酸配列である。
第2A図は、ヒトIL−１プレカーサー（phil＃７から）
のカルボキシ末端領域のヌクレオチド配列と予測される
アミノ酸配列でphil＃４の部分配列には下線を施してあ
る。第2B図では、クローンphil＃７および＃19の複合体
から推定されるヒトIL−１プレカーサーのヌクレオチド
配列および予測されるアミノ酸配列である。
のカルボキシ末端領域のヌクレオチド配列と予測される
アミノ酸配列でphil＃４の部分配列には下線を施してあ
る。第2B図では、クローンphil＃７および＃19の複合体
から推定されるヒトIL−１プレカーサーのヌクレオチド
配列および予測されるアミノ酸配列である。
第３図はマウスおよびヒトIL−１プレカーサー蛋白質
の配列のホモロジーを例示した図である。
の配列のホモロジーを例示した図である。
第４図は、ヒトIL−１の修飾された、154個のアミノ
酸のカルボキシ末端配列（phil＃１〜154＊）の合成を
行う発現ベクターの、ベクターとしてpEV−vrf2を用い
た構築を示すフローチヤートである。
酸のカルボキシ末端配列（phil＃１〜154＊）の合成を
行う発現ベクターの、ベクターとしてpEV−vrf2を用い
た構築を示すフローチヤートである。
第５図は、phil＃１〜154＊のアミノ末端に異種アミ
ノ酸をもたないヒトIL−１の154個のアミノ酸カルボキ
シ末端配列（phil＃１〜154）の合成を行う発現ベクタ
ーの構築を示すフローチヤートである。
ノ酸をもたないヒトIL−１の154個のアミノ酸カルボキ
シ末端配列（phil＃１〜154）の合成を行う発現ベクタ
ーの構築を示すフローチヤートである。
上述のように、ヒトIL−１ポリペプチドをコードする
クローン化遺伝子は、マウスIL−1cDNAクローンをハイ
ブリダイゼーシヨンプローブとして用いることにより得
ることができる。この操作で、EcoR I部分ヒトゲノムフ
アージライブラリー〔フリツチユ（Fritsch）ほか：セ
ル（Cell）,19,959〜972（1980）〕をハイブリダイゼー
シヨンプローブとしてプラスミドpIL1 1301〔ロメデイ
コ（Lomedico）ほか：前出〕を用いることによりスクリ
ーニングした。フアージプラークを常法によりニトロセ
ルロースフイルターに移し〔マニアテイス（Maniatis）
ほか：モルキユラー・クローニング、ア・ラボラトリー
・マニユアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manua
l）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ニユーヨーク（Cold Spring Harbo
r,N.Y.）、1982〕，固定化DNAを含むフイルター（φ＝1
38mm）を５×SSPE（１×SSPE＝0.18M NaCl、10mMリン
酸ナトリウム、pH7.0、1mM EDTA三ナトリウム）、５×
デンハルト液〔0.1％フイコル（Ficoll）400、0.1％ウ
シ血清アルブミン、0.1％ポリビニルピロリドン（w/
v）〕0.3％SDS、20％ホルムアミド、250μg/mlウシ胸腺
DNAおよび106cpm32P−PIL1 1301（ニツクトランスレー
シヨンにより１〜２×108cpm/μｇに標識）含有溶液10m
g中、37℃で48時間ハイブリダイズした。フイルターを
0.5×SSPE中30℃で洗浄し、オートラジオグラフイーに
付した。7.9×105プラークをスクリーニングしたのち、
２個の陽性組換えフアージが同定された。これらの２個
のフアージは制限エンドヌクレアーゼマツピングによつ
て同一であることが明らかにされ、λ−hil4と命名され
た。上述のハイブリダイゼーシヨン条件を用い、次にマ
ウスIL−1cDNAクローンpIL1 1301は組換えフアージλ
−hil4からの1.4kbEcoR I−Hind IIIフラグメントに特
異的にハイブリダイズすることが明らかにされた。この
1.4kbフラグメントをpBR322にクローン化しphil＃４が
得られた。phil＃４のEcoR I部位に隣接するヌクレオチ
ド配列が決定され（第2A図参照）、マウスIL−1mRNAお
よび蛋白質の配列と比較された。この解析により、マウ
スIL−１プレカーサーのカルボキシ末端の61個のアミノ
酸およびそれに伴う３′非暗号領域と、75％の核酸ホモ
ロジーおよび66％アミノ酸配列ホモロジーが認められ
た。
クローン化遺伝子は、マウスIL−1cDNAクローンをハイ
ブリダイゼーシヨンプローブとして用いることにより得
ることができる。この操作で、EcoR I部分ヒトゲノムフ
アージライブラリー〔フリツチユ（Fritsch）ほか：セ
ル（Cell）,19,959〜972（1980）〕をハイブリダイゼー
シヨンプローブとしてプラスミドpIL1 1301〔ロメデイ
コ（Lomedico）ほか：前出〕を用いることによりスクリ
ーニングした。フアージプラークを常法によりニトロセ
ルロースフイルターに移し〔マニアテイス（Maniatis）
ほか：モルキユラー・クローニング、ア・ラボラトリー
・マニユアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manua
l）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ニユーヨーク（Cold Spring Harbo
r,N.Y.）、1982〕，固定化DNAを含むフイルター（φ＝1
38mm）を５×SSPE（１×SSPE＝0.18M NaCl、10mMリン
酸ナトリウム、pH7.0、1mM EDTA三ナトリウム）、５×
デンハルト液〔0.1％フイコル（Ficoll）400、0.1％ウ
シ血清アルブミン、0.1％ポリビニルピロリドン（w/
v）〕0.3％SDS、20％ホルムアミド、250μg/mlウシ胸腺
DNAおよび106cpm32P−PIL1 1301（ニツクトランスレー
シヨンにより１〜２×108cpm/μｇに標識）含有溶液10m
g中、37℃で48時間ハイブリダイズした。フイルターを
0.5×SSPE中30℃で洗浄し、オートラジオグラフイーに
付した。7.9×105プラークをスクリーニングしたのち、
２個の陽性組換えフアージが同定された。これらの２個
のフアージは制限エンドヌクレアーゼマツピングによつ
て同一であることが明らかにされ、λ−hil4と命名され
た。上述のハイブリダイゼーシヨン条件を用い、次にマ
ウスIL−1cDNAクローンpIL1 1301は組換えフアージλ
−hil4からの1.4kbEcoR I−Hind IIIフラグメントに特
異的にハイブリダイズすることが明らかにされた。この
1.4kbフラグメントをpBR322にクローン化しphil＃４が
得られた。phil＃４のEcoR I部位に隣接するヌクレオチ
ド配列が決定され（第2A図参照）、マウスIL−1mRNAお
よび蛋白質の配列と比較された。この解析により、マウ
スIL−１プレカーサーのカルボキシ末端の61個のアミノ
酸およびそれに伴う３′非暗号領域と、75％の核酸ホモ
ロジーおよび66％アミノ酸配列ホモロジーが認められ
た。
上述のように得られた部分ヒトIL−１遺伝子を次にプ
ローブとして用い、誘導正常ヒト末梢血白血球から得ら
れたmRNA由来のヒトIL−1cDNAクローンを単離した。正
常供血者から採取し調製した濃縮ヒト白血球はアメリカ
赤十字社〔ランシング、ミシガン（Lansing,Michiga
n）〕より入手した。50の濃縮白血球の内容を無菌的に
採取バッグから出し、プールした。白血球プールを分液
ろ斗中で半容量の６％ヒータスターチ〔ヘスパン（Hesp
an）、アメリカン・ホスピタル・サプライ・コーポレー
シヨン、アービン、カリホルニア（American Hospital
Supply Coyporation,Irvin,Calif.）製〕溶液と混合
し、３時間室温に放置した。白血球−ヘスパン混合物の
容量は、沈降を確実にするために分液ろ斗の容量の2/3
を越えないようにする。分液ろ斗の底に沈降した赤血球
と細胞の分離は、赤血球層のすぐ上に白血球の鋭い界面
の帯が明瞭になつたときに完結する。低密度の白血球を
インターロイキン−１の製造に使用した。これらの細胞
は、界面白血球の上に存在する細胞の最上層のみを注意
深く吸引することにより、分液ろ斗か取り出した。この
低密度白血球をヘスパランから取り出すために、250ml
の円錐状遠沈管〔コーニング・グラスワークス、コーニ
ング、ニユーヨーク（Corning Glasswork,Corning,N.
Y.）製〕中、500×ｇで20分間遠心分離した。ペレツト
を９倍量の0.83％塩化アンモニウム溶液に５分間再懸濁
した残つた赤血球を溶解させた。上に述べたと同様に50
0×ｇで10分間沈降させて、白血球を塩化アンモニウム
溶液から取り出した。
ローブとして用い、誘導正常ヒト末梢血白血球から得ら
れたmRNA由来のヒトIL−1cDNAクローンを単離した。正
常供血者から採取し調製した濃縮ヒト白血球はアメリカ
赤十字社〔ランシング、ミシガン（Lansing,Michiga
n）〕より入手した。50の濃縮白血球の内容を無菌的に
採取バッグから出し、プールした。白血球プールを分液
ろ斗中で半容量の６％ヒータスターチ〔ヘスパン（Hesp
an）、アメリカン・ホスピタル・サプライ・コーポレー
シヨン、アービン、カリホルニア（American Hospital
Supply Coyporation,Irvin,Calif.）製〕溶液と混合
し、３時間室温に放置した。白血球−ヘスパン混合物の
容量は、沈降を確実にするために分液ろ斗の容量の2/3
を越えないようにする。分液ろ斗の底に沈降した赤血球
と細胞の分離は、赤血球層のすぐ上に白血球の鋭い界面
の帯が明瞭になつたときに完結する。低密度の白血球を
インターロイキン−１の製造に使用した。これらの細胞
は、界面白血球の上に存在する細胞の最上層のみを注意
深く吸引することにより、分液ろ斗か取り出した。この
低密度白血球をヘスパランから取り出すために、250ml
の円錐状遠沈管〔コーニング・グラスワークス、コーニ
ング、ニユーヨーク（Corning Glasswork,Corning,N.
Y.）製〕中、500×ｇで20分間遠心分離した。ペレツト
を９倍量の0.83％塩化アンモニウム溶液に５分間再懸濁
した残つた赤血球を溶解させた。上に述べたと同様に50
0×ｇで10分間沈降させて、白血球を塩化アンモニウム
溶液から取り出した。
次に、細胞ペレツトを、濃度が3.5×107細胞/mlを越
えないように、予め37℃に加温してRPMI−1640メジウム
（GIBCO）中に再懸濁した。濃縮された細胞の凝集を避
けるため、メジウムにウシ胎仔血清は添加しなかつた。
赤血球の夾雑がない新たに単離された白血球を誘導容器
中、２％ウシ胎仔血清を補充したRPMI−1640メジウムの
適当量で希釈し、最終濃度を３×106細胞/mlとした。こ
の細胞を37℃で１時間インキユベートし、10μg/mlの大
腸菌リポポリサツカライドＢ（LPS,Difco3880−25）を
加えてIL−１の産生を誘導した。mRNA抽出のためにイン
キユベーシヨンを12時間続けた。ついで、細胞を500×
ｇで沈降させて誘導メジウムから取り出した。mRNA抽出
のために誘導した細胞は凍結ペレツトとして−20℃以下
で保存できる。
えないように、予め37℃に加温してRPMI−1640メジウム
（GIBCO）中に再懸濁した。濃縮された細胞の凝集を避
けるため、メジウムにウシ胎仔血清は添加しなかつた。
赤血球の夾雑がない新たに単離された白血球を誘導容器
中、２％ウシ胎仔血清を補充したRPMI−1640メジウムの
適当量で希釈し、最終濃度を３×106細胞/mlとした。こ
の細胞を37℃で１時間インキユベートし、10μg/mlの大
腸菌リポポリサツカライドＢ（LPS,Difco3880−25）を
加えてIL−１の産生を誘導した。mRNA抽出のためにイン
キユベーシヨンを12時間続けた。ついで、細胞を500×
ｇで沈降させて誘導メジウムから取り出した。mRNA抽出
のために誘導した細胞は凍結ペレツトとして−20℃以下
で保存できる。
LPS誘導ヒト末梢血白血球からポリ（Ａ）+RNAを単離
するのにとくに好ましい方法は、チヤーグイン（Chirgw
in）らのグアニジンチオシアネート−CsCl法〔バイオケ
ミストリー（Bicchemistry）,18,5294〜5299（1979）〕
およびオリゴ（dT）−セルロースクロマトグラフイー
〔アビブほか（Aviv＆Leder）、プロシーデイングズ・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ・オブ・ザ・ユナイテツド・ステイツ・オブ・アメリ
カ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,69,1408〜1412（197
2）〕である。このRNAのノーザン法解析により、クロー
ンphil＃４は約2,100のヌクレオチド長のmRNAと特異的
にハイブリダイズすることが明らかにされた。全ポリ
（Ａ）+RNAを庶糖濃度勾配遠心分離によつて分画し、サ
イズが1,000〜3,000ヌクレオチドのmRNAを集めた。この
濃縮mRNAプールを用いて、約2000のクローンのcDNAライ
ブラリーを、確立された方法で〔ガブラーほか（Gubler
＆Hoffman）、ジーン（Gene）,25,263〜269（1983）〕p
BR322中に構築した。このライブラリーについて、ハイ
ブリダイゼーシヨンプローブとしてプラスミドphil＃４
からの1.4kb EcoR I−Hind III挿入体を用いてスクリ
ーニングを実施した。細菌コロニーを標準方法〔マニア
テイス（Maniatis）ほか：前出〕によつてニトロセルロ
ースフイルターに移し、固定化DNAを含有するフイルタ
ーを、５×SSPE、５×デンハルト液、0.3％SDS、50％ホ
ルムアミド（w/v）、250μg/mlウシ胸腺DNAおよび32P−
phil＃４挿入体DNA中、37℃で16時間ハイブリダイズし
た。フイルターを0.1×SSPE中50℃で洗浄し、オートラ
ジオグラフイーに付し、１個の陽性クローンを同定し、
phil＃７と命名した。このクローンは2,200bpの挿入体
を含有する。この挿入体のヌクレオチド配列（第2A図参
照）にはゲノムクローンphil＃４の部分配列を含み、し
たがってこの遺伝子によつてコードされるmRNAのcDNA配
列に相当する。このphil＃７挿入体のヌクレオチド配列
は163個のアミノ酸の蛋白質に対する読み取り枠を予示
する。この予測された蛋白質は、マウスIL−１プレカー
サーのカルボキシ末端の160個のアミノ酸と55％のホモ
ロジーを示す（第３図参照）。したがって、phil＃７に
よつて与えられた配列はヒトIL−１プレカーサーのカル
ボキシ末端領域を示すものと考えられる。プライマー延
長実験では、ヒトIL−1mRNAの５′末端から約400のヌク
レオチドがクローンphil＃７では欠けていることが示さ
れている。
するのにとくに好ましい方法は、チヤーグイン（Chirgw
in）らのグアニジンチオシアネート−CsCl法〔バイオケ
ミストリー（Bicchemistry）,18,5294〜5299（1979）〕
およびオリゴ（dT）−セルロースクロマトグラフイー
〔アビブほか（Aviv＆Leder）、プロシーデイングズ・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ・オブ・ザ・ユナイテツド・ステイツ・オブ・アメリ
カ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,69,1408〜1412（197
2）〕である。このRNAのノーザン法解析により、クロー
ンphil＃４は約2,100のヌクレオチド長のmRNAと特異的
にハイブリダイズすることが明らかにされた。全ポリ
（Ａ）+RNAを庶糖濃度勾配遠心分離によつて分画し、サ
イズが1,000〜3,000ヌクレオチドのmRNAを集めた。この
濃縮mRNAプールを用いて、約2000のクローンのcDNAライ
ブラリーを、確立された方法で〔ガブラーほか（Gubler
＆Hoffman）、ジーン（Gene）,25,263〜269（1983）〕p
BR322中に構築した。このライブラリーについて、ハイ
ブリダイゼーシヨンプローブとしてプラスミドphil＃４
からの1.4kb EcoR I−Hind III挿入体を用いてスクリ
ーニングを実施した。細菌コロニーを標準方法〔マニア
テイス（Maniatis）ほか：前出〕によつてニトロセルロ
ースフイルターに移し、固定化DNAを含有するフイルタ
ーを、５×SSPE、５×デンハルト液、0.3％SDS、50％ホ
ルムアミド（w/v）、250μg/mlウシ胸腺DNAおよび32P−
phil＃４挿入体DNA中、37℃で16時間ハイブリダイズし
た。フイルターを0.1×SSPE中50℃で洗浄し、オートラ
ジオグラフイーに付し、１個の陽性クローンを同定し、
phil＃７と命名した。このクローンは2,200bpの挿入体
を含有する。この挿入体のヌクレオチド配列（第2A図参
照）にはゲノムクローンphil＃４の部分配列を含み、し
たがってこの遺伝子によつてコードされるmRNAのcDNA配
列に相当する。このphil＃７挿入体のヌクレオチド配列
は163個のアミノ酸の蛋白質に対する読み取り枠を予示
する。この予測された蛋白質は、マウスIL−１プレカー
サーのカルボキシ末端の160個のアミノ酸と55％のホモ
ロジーを示す（第３図参照）。したがって、phil＃７に
よつて与えられた配列はヒトIL−１プレカーサーのカル
ボキシ末端領域を示すものと考えられる。プライマー延
長実験では、ヒトIL−1mRNAの５′末端から約400のヌク
レオチドがクローンphil＃７では欠けていることが示さ
れている。
ヒトIL−1cDNAクローン＃７はヒトIL−1mRNAの不完全
コピーであることがわかつたので、この配列を完成する
ために次ような計画を用いた。すなわち、クローン＃７
のDNA配列に基づき、配列５′−GGGCGTCATTCAGGATGAATT
CGTA−３′をもつ合成オリゴヌクレオチドを案出し、固
体支持体ホスホールアミダイト法を用いて合成した。こ
のオリゴヌクレオチドは、phil＃７から予測されるアミ
ノ酸20〜28をコードする配列と相補性である。このオリ
ゴヌクレオチドは、EcoR I制限部位を含むことが予測さ
れるcDNA内領域をもたらす。このような部位は、延長ク
ローンをクローン＃７と融合させ、ヒトIL−１プレカー
サーの完全蛋白質をコードする領域を包含するcDNAを創
製するのに有用である。このオリゴヌクレオチドを、LP
S誘導ヒト末梢血白血球からのサイズ分画ポリA+RNAにア
ニーリングした。アニーリング条件は50mMNaCl、10mM
DTT、0.05mM EDTA、550pmolオリゴヌクレオチド/ml、2
50μｇポリA+RNA/ml、90℃で１分、43℃で10分、20℃で
10分とし、ついで反応液を氷上で冷却した。cDNA合成お
よび延長cDNAライブラリーの確立は、クローン＃７につ
いて上述したと同様に実施した。この方法で、ヒトIL−
1mRNA濃縮ポリA+RNA5μｇから約105の独立形質転換体が
生成した。計約2900の形質転換体を、予めポリヌクレオ
チドキナーゼとγ−32P−ATPにより標準方法〔マニアテ
イス（Maniatis）ほか：前出〕で標識した上述のオリゴ
ヌクレオチドを用いスクリーニングした。コロニー支持
ニトロセスロールフイルターを標準方法〔マニアテイス
（Maniatis）ほか：前出〕に従つて調製した。このフイ
ルターを標識オリゴヌクレオチドと以下の条件でハイブ
リダイズした。すなわち、５×SSPE、10×デンハルト
液、0.1％SDS、100μg/ml酵母可溶RNA、0.2pmol/ml標識
オリゴヌクレオチド（比活性:1μCi/pmol）中65℃で15
分、ついで37℃で２時間とした。フイルターを次に0.02
5％SDS含有２×SSPEで２回洗浄し（室温での迅速洗
浄）、ついで0.025％SDS含有４×SSPE中、51℃で60分間
洗浄した。フイルターを風乾し、増感スクリーンを用い
−70℃で16時間、Ｘ線フイルムに曝露した。12個の陽性
コロニーを制限エンドヌクレアーゼ切断によつてさらに
解析した。それ以上の解析にはクローン＃19を選択し
た。phil＃19からの挿入体の配列（第2B図参照）は期待
されたphil＃７との重複を含有し、139個のアミノ酸を
コードする単一読り取り枠が予測される。この領域はヒ
トIL−１プレカーサー蛋白質のアミノ末端を表し、マウ
スIL−１プレカーサー蛋白質の相当する領域と高いホモ
ロジーを示す（第３図）。したがつて、phil＃７および
phil＃19からの配列情報を合わせると、ヒトIR−1mRNA
は270個のアミノ酸のマウス淡白質を有意に関連する271
個のアミノ酸の蛋白質をコードする（第３図）プラスミ
ドphil＃７は271個のアミノ酸のヒトIL−１プレカーサ
ー蛋白質の163個のカルボキシ末端アミノ酸についての
暗号情報を含有する。プラスミドphil＃19はこの蛋白質
の139個のアミノ末端アミノ酸についての暗号情報を含
有する。各プラスミドは、それらの挿入体に共通の配列
（94ヌクレオチド長）内に１個のEcoR I制限エンドヌク
レアーゼ切断部位を有する。このEcoR I部位は、ヒトIL
−１プレカーサー蛋白質からの全暗号領域を含有する単
一の複合プラスミドへ、２個のプラスミドからの情報を
結合するために使用できる。標準方法を用いて、プラス
ミドphil＃７とphil＃19を個々にEcoR IおよびBamH Iで
消化し、生じたDNAフラグメントをポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分離できる。phil＃７消化物からは約21
00bpのEcoR I−BamH Iフラグメントを、phil＃19消化物
からは約460bpのBamH I−EcoR Iフラグメントを単離で
きる。単離された２個のフラグメントはT4DNAリガーセ
を用いてたがいに結合できる。リガーゼを熱不活性化
し、混合物をBamH Iで処理する。この混合物はBamH I−
線状化pEV−vrf2（下方）に結合することができ、適合
性プラスミドpRK248cIts含有大腸菌株MC1061の形質転換
に使用でき、アンピシリン抵抗性で選択される。細菌ク
ローンは制限エンドヌクレアーゼ切断解析によつてスク
リーニングし、期待される挿入体を正しい方向に含有す
るプラスミド、phil＃１〜271＊を同定できる。プラス
ミドphil＃１〜271＊は特定部位のオリゴヌクレオチド
突然変異誘発（下方）によつて修飾し、開始ATGコドン
と271個のアミノ酸プレカーサー蛋白質の二番目のアミ
ノ酸であるアラニンのコドン（GCC）との間の異種ヌク
レオチドを除去し、phil＃１〜271を生成させる。phil
＃１〜271を含む細菌を、温度シフトにより誘導すると
（下方）、第2B図に示すような271個のアミノ酸の完全I
L−１プレカーサー蛋白質を合成する。
コピーであることがわかつたので、この配列を完成する
ために次ような計画を用いた。すなわち、クローン＃７
のDNA配列に基づき、配列５′−GGGCGTCATTCAGGATGAATT
CGTA−３′をもつ合成オリゴヌクレオチドを案出し、固
体支持体ホスホールアミダイト法を用いて合成した。こ
のオリゴヌクレオチドは、phil＃７から予測されるアミ
ノ酸20〜28をコードする配列と相補性である。このオリ
ゴヌクレオチドは、EcoR I制限部位を含むことが予測さ
れるcDNA内領域をもたらす。このような部位は、延長ク
ローンをクローン＃７と融合させ、ヒトIL−１プレカー
サーの完全蛋白質をコードする領域を包含するcDNAを創
製するのに有用である。このオリゴヌクレオチドを、LP
S誘導ヒト末梢血白血球からのサイズ分画ポリA+RNAにア
ニーリングした。アニーリング条件は50mMNaCl、10mM
DTT、0.05mM EDTA、550pmolオリゴヌクレオチド/ml、2
50μｇポリA+RNA/ml、90℃で１分、43℃で10分、20℃で
10分とし、ついで反応液を氷上で冷却した。cDNA合成お
よび延長cDNAライブラリーの確立は、クローン＃７につ
いて上述したと同様に実施した。この方法で、ヒトIL−
1mRNA濃縮ポリA+RNA5μｇから約105の独立形質転換体が
生成した。計約2900の形質転換体を、予めポリヌクレオ
チドキナーゼとγ−32P−ATPにより標準方法〔マニアテ
イス（Maniatis）ほか：前出〕で標識した上述のオリゴ
ヌクレオチドを用いスクリーニングした。コロニー支持
ニトロセスロールフイルターを標準方法〔マニアテイス
（Maniatis）ほか：前出〕に従つて調製した。このフイ
ルターを標識オリゴヌクレオチドと以下の条件でハイブ
リダイズした。すなわち、５×SSPE、10×デンハルト
液、0.1％SDS、100μg/ml酵母可溶RNA、0.2pmol/ml標識
オリゴヌクレオチド（比活性:1μCi/pmol）中65℃で15
分、ついで37℃で２時間とした。フイルターを次に0.02
5％SDS含有２×SSPEで２回洗浄し（室温での迅速洗
浄）、ついで0.025％SDS含有４×SSPE中、51℃で60分間
洗浄した。フイルターを風乾し、増感スクリーンを用い
−70℃で16時間、Ｘ線フイルムに曝露した。12個の陽性
コロニーを制限エンドヌクレアーゼ切断によつてさらに
解析した。それ以上の解析にはクローン＃19を選択し
た。phil＃19からの挿入体の配列（第2B図参照）は期待
されたphil＃７との重複を含有し、139個のアミノ酸を
コードする単一読り取り枠が予測される。この領域はヒ
トIL−１プレカーサー蛋白質のアミノ末端を表し、マウ
スIL−１プレカーサー蛋白質の相当する領域と高いホモ
ロジーを示す（第３図）。したがつて、phil＃７および
phil＃19からの配列情報を合わせると、ヒトIR−1mRNA
は270個のアミノ酸のマウス淡白質を有意に関連する271
個のアミノ酸の蛋白質をコードする（第３図）プラスミ
ドphil＃７は271個のアミノ酸のヒトIL−１プレカーサ
ー蛋白質の163個のカルボキシ末端アミノ酸についての
暗号情報を含有する。プラスミドphil＃19はこの蛋白質
の139個のアミノ末端アミノ酸についての暗号情報を含
有する。各プラスミドは、それらの挿入体に共通の配列
（94ヌクレオチド長）内に１個のEcoR I制限エンドヌク
レアーゼ切断部位を有する。このEcoR I部位は、ヒトIL
−１プレカーサー蛋白質からの全暗号領域を含有する単
一の複合プラスミドへ、２個のプラスミドからの情報を
結合するために使用できる。標準方法を用いて、プラス
ミドphil＃７とphil＃19を個々にEcoR IおよびBamH Iで
消化し、生じたDNAフラグメントをポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分離できる。phil＃７消化物からは約21
00bpのEcoR I−BamH Iフラグメントを、phil＃19消化物
からは約460bpのBamH I−EcoR Iフラグメントを単離で
きる。単離された２個のフラグメントはT4DNAリガーセ
を用いてたがいに結合できる。リガーゼを熱不活性化
し、混合物をBamH Iで処理する。この混合物はBamH I−
線状化pEV−vrf2（下方）に結合することができ、適合
性プラスミドpRK248cIts含有大腸菌株MC1061の形質転換
に使用でき、アンピシリン抵抗性で選択される。細菌ク
ローンは制限エンドヌクレアーゼ切断解析によつてスク
リーニングし、期待される挿入体を正しい方向に含有す
るプラスミド、phil＃１〜271＊を同定できる。プラス
ミドphil＃１〜271＊は特定部位のオリゴヌクレオチド
突然変異誘発（下方）によつて修飾し、開始ATGコドン
と271個のアミノ酸プレカーサー蛋白質の二番目のアミ
ノ酸であるアラニンのコドン（GCC）との間の異種ヌク
レオチドを除去し、phil＃１〜271を生成させる。phil
＃１〜271を含む細菌を、温度シフトにより誘導すると
（下方）、第2B図に示すような271個のアミノ酸の完全I
L−１プレカーサー蛋白質を合成する。
プラスミドpEV−vrf2は、合成DNAオリゴヌクレオチド
を用い、密着調節されたフアージλPLプロモータから下
流にリボソーム結合部位（RBS）−開始コドンを含むよ
うに修飾されたpBR322誘導体である。多重用途の制限エ
ンドヌクレアーゼ部位は開始コドンのすぐ下流に存在
し、２〜９の過剰のアミノ末端アミノ酸をもつ融合蛋白
質として発現させる暗号領域配列を挿入させることがで
きる。これらの異種アミノ酸は特定部位突然変異によつ
て除去でき、所望の蛋白質の発現が行われる。pEV−vrf
2の系譜は、pBR322→pRC2→pRC23→pEV−vrf2である。
を用い、密着調節されたフアージλPLプロモータから下
流にリボソーム結合部位（RBS）−開始コドンを含むよ
うに修飾されたpBR322誘導体である。多重用途の制限エ
ンドヌクレアーゼ部位は開始コドンのすぐ下流に存在
し、２〜９の過剰のアミノ末端アミノ酸をもつ融合蛋白
質として発現させる暗号領域配列を挿入させることがで
きる。これらの異種アミノ酸は特定部位突然変異によつ
て除去でき、所望の蛋白質の発現が行われる。pEV−vrf
2の系譜は、pBR322→pRC2→pRC23→pEV−vrf2である。
pRC2は、pBR322（ATCCNo.37017）中のEcoR I部位に隣
接して（ampR側）１個のBgl II部位を含有するpBR322の
誘導体である。このプラスミドは以下の方法で構築され
た。すなわち、pBR322プラスミドDNA20μｇをEcoR Iで
消化し、ついで反応液を２個に分けた。一方は、S1ヌク
レアーゼで突出５′一重鎖末端を除去し、他方の反応液
は、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでデオ
キシヌクレオチドを導入して末端を充填した。両反応と
もフエノール抽出で停止させ、ついでエタノールで沈殿
させた。各反応液からのDNA約１μｇを90pmolのホスホ
リル化Bgl IIリンカー〔CAGATCTG、コラボレイテイブ・
リサーチ（Collaborative Research）より購入〕ととも
に混合し、T4DANリガーゼと15℃で18時間インキユベー
トした。リゲーシヨン生成物を次にBgl IIおよびPst I
で消化し、１％アガロース中電気泳動に付した。両反応
からの3600bpおよび760bpフラグメントをゲルより回収
した。pRC2の構築には、クレノウ反応からの3600bpフラ
グメントをS1反応からの760bpフラグメントと結合させ
た。大腸菌株RR1をこのリゲーシヨン混合物で形質転換
し、形質転換体を５μg/mlのアンピシリンを含むLBアガ
ール板上で選択した。期待されたプラスミド構築体を含
む形質転換体を単離プラスミドDNAの制限解析によつて
同定した。DNA配列により、S1ヌクレアーゼ処理は正確
に５′一重鎖末端を除去したことが確認された。
接して（ampR側）１個のBgl II部位を含有するpBR322の
誘導体である。このプラスミドは以下の方法で構築され
た。すなわち、pBR322プラスミドDNA20μｇをEcoR Iで
消化し、ついで反応液を２個に分けた。一方は、S1ヌク
レアーゼで突出５′一重鎖末端を除去し、他方の反応液
は、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでデオ
キシヌクレオチドを導入して末端を充填した。両反応と
もフエノール抽出で停止させ、ついでエタノールで沈殿
させた。各反応液からのDNA約１μｇを90pmolのホスホ
リル化Bgl IIリンカー〔CAGATCTG、コラボレイテイブ・
リサーチ（Collaborative Research）より購入〕ととも
に混合し、T4DANリガーゼと15℃で18時間インキユベー
トした。リゲーシヨン生成物を次にBgl IIおよびPst I
で消化し、１％アガロース中電気泳動に付した。両反応
からの3600bpおよび760bpフラグメントをゲルより回収
した。pRC2の構築には、クレノウ反応からの3600bpフラ
グメントをS1反応からの760bpフラグメントと結合させ
た。大腸菌株RR1をこのリゲーシヨン混合物で形質転換
し、形質転換体を５μg/mlのアンピシリンを含むLBアガ
ール板上で選択した。期待されたプラスミド構築体を含
む形質転換体を単離プラスミドDNAの制限解析によつて
同定した。DNA配列により、S1ヌクレアーゼ処理は正確
に５′一重鎖末端を除去したことが確認された。
pRC23はpRC2に、モデルリボソーム結合部位（RBS）か
らなる１対の相補性合成オリゴヌクレオチドに結合した
λPLプロモーターを含む250bp Bgl II−Hae IIIフラグ
メントを挿入することにより構築した。Hae III部位
は、PL転写開始部位の115bp下流、λＮ遺伝子の５′非
暗号領域内に存在する〔ヘンドリツクス（Hendrix）ほ
か：″ラムダ・ツー（Lambda II）コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・
ハーバー、ニユーヨーク（Cold Sping Harbor Laborato
ry,Cold Sping Harbor,N.Y.）刊、1983〕。フアージλD
NAから単離された450bp Bgl II−Hpa Iフラグメント約
１μｇをHae IIIで消化した。生成した消化生成物200ng
を、モデルRBSを含むホスホリル化合成オリゴヌクレオ
チド各60pmolと混合した。これらの相補性デオキシヌク
レオチド（＃１＝TTAAAAATTAAGGAGG,＃２＝AATTCCTCCTT
AATTTTTAA）は固体支持体上ホスフアイト法を用いて合
成した〔マテユーチほか（Matteuci,M.D.＆Caruthers,
M.H.）、シンセシス・オブ・デオキシオリゴヌクレオチ
ド・オン・ア・ポリマー・サポート（Synthesis of deo
xyoligonucleotides on a polymer support），ジヤー
ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ（J.
Am.Chem.soc.）,103,3185〜3191（1981）〕。合成は、
制御された多孔性ガラス支持体（Pierce CPG、長鎖アル
キルアミン樹脂）に付着させた３′末端ヌクレオチド１
μmolで開始させた。混合物をT4DNAリガーゼと15℃で18
時間インキユベートし、結合した分子をBgl IIおよびEc
oR Iで消化し、５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し
た。270bpのリゲーシヨン生成物をゲルから回収し、予
めBgl IIとEcoR Iで消化したゲル精製pRC2ベクターと混
合し、T4DNAリガーゼとともに15℃で15時間インキユベ
ートした。リゲーシヨン混合物を株RR1（pRK248cIts）
の形質転換に使用した。アンピシリン含有メジウム上で
選択した形質転換体を、単離プラスミドDNAの制限解析
によつてスクリーニングした。期待されたプラスミド構
築体、pRC23は、さらに制限酵素消化によりまたEcoR I
結合物前後のDNA配列解析により確認された。プラスミ
ドpRC23はRBSの３′末端に唯一のEcoR I部位を含有し、
５′末端にATGを有する遺伝子をここに挿入することが
できる。
らなる１対の相補性合成オリゴヌクレオチドに結合した
λPLプロモーターを含む250bp Bgl II−Hae IIIフラグ
メントを挿入することにより構築した。Hae III部位
は、PL転写開始部位の115bp下流、λＮ遺伝子の５′非
暗号領域内に存在する〔ヘンドリツクス（Hendrix）ほ
か：″ラムダ・ツー（Lambda II）コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・
ハーバー、ニユーヨーク（Cold Sping Harbor Laborato
ry,Cold Sping Harbor,N.Y.）刊、1983〕。フアージλD
NAから単離された450bp Bgl II−Hpa Iフラグメント約
１μｇをHae IIIで消化した。生成した消化生成物200ng
を、モデルRBSを含むホスホリル化合成オリゴヌクレオ
チド各60pmolと混合した。これらの相補性デオキシヌク
レオチド（＃１＝TTAAAAATTAAGGAGG,＃２＝AATTCCTCCTT
AATTTTTAA）は固体支持体上ホスフアイト法を用いて合
成した〔マテユーチほか（Matteuci,M.D.＆Caruthers,
M.H.）、シンセシス・オブ・デオキシオリゴヌクレオチ
ド・オン・ア・ポリマー・サポート（Synthesis of deo
xyoligonucleotides on a polymer support），ジヤー
ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ（J.
Am.Chem.soc.）,103,3185〜3191（1981）〕。合成は、
制御された多孔性ガラス支持体（Pierce CPG、長鎖アル
キルアミン樹脂）に付着させた３′末端ヌクレオチド１
μmolで開始させた。混合物をT4DNAリガーゼと15℃で18
時間インキユベートし、結合した分子をBgl IIおよびEc
oR Iで消化し、５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し
た。270bpのリゲーシヨン生成物をゲルから回収し、予
めBgl IIとEcoR Iで消化したゲル精製pRC2ベクターと混
合し、T4DNAリガーゼとともに15℃で15時間インキユベ
ートした。リゲーシヨン混合物を株RR1（pRK248cIts）
の形質転換に使用した。アンピシリン含有メジウム上で
選択した形質転換体を、単離プラスミドDNAの制限解析
によつてスクリーニングした。期待されたプラスミド構
築体、pRC23は、さらに制限酵素消化によりまたEcoR I
結合物前後のDNA配列解析により確認された。プラスミ
ドpRC23はRBSの３′末端に唯一のEcoR I部位を含有し、
５′末端にATGを有する遺伝子をここに挿入することが
できる。
プラスミドpEV−vrf2の構築には、pRC23をEcoR Iおよ
びHind IIIで消化し、線状化したベクターをプレパラテ
イブ・アガロースゲル電気泳動によつて単離した。２個
の相補性デオキシヌクレオチド（＃３＝AATTAATATGAATA
GAATTCGGATCCATCGATA、＃４＝AGCTTATCGATGGATCCGAATTC
TATTCATATT）を合成し、両者を合し、150mM NaCl中58
℃に５分間加熱し、徐々に冷却してアニーリングを行
う。合成二重鎖0.1pmolをpRC/EcoR I−Hind IIIベクタ
ー0.07pmolに加え、T4DNAリガーゼと15℃で15時間イン
キユベートした。株RR1（pRK248cIts）をリゲーシヨン
生成物で形質転換し、アンピシリン抵抗性形質転換体を
制限エンドヌクレアーゼ切断解析によりスクリーニング
してpEV−vrf2を同定し、その期待された構築体をDNA配
列解析で確認した。プラスミドpEV−vrf2は適当に配置
された開始コドン−RBSから下流に制限部位（EcoR I、B
amH I、Cla IおよびHind III）を含有する。したがつ
て、これらの制限部位に挿入される適当に配置された暗
号領域配列はPLプロモーターの制御下に発現し、２〜９
の過剰アミノ末端アミノ酸とともに相当する蛋白質を生
成する。これらの異種アミノ酸の除去、ならびに不適当
に配置された（すなわち、読み取り枠が正しくない）暗
号領域の再配置には特定部位突然変異が使用できる。
びHind IIIで消化し、線状化したベクターをプレパラテ
イブ・アガロースゲル電気泳動によつて単離した。２個
の相補性デオキシヌクレオチド（＃３＝AATTAATATGAATA
GAATTCGGATCCATCGATA、＃４＝AGCTTATCGATGGATCCGAATTC
TATTCATATT）を合成し、両者を合し、150mM NaCl中58
℃に５分間加熱し、徐々に冷却してアニーリングを行
う。合成二重鎖0.1pmolをpRC/EcoR I−Hind IIIベクタ
ー0.07pmolに加え、T4DNAリガーゼと15℃で15時間イン
キユベートした。株RR1（pRK248cIts）をリゲーシヨン
生成物で形質転換し、アンピシリン抵抗性形質転換体を
制限エンドヌクレアーゼ切断解析によりスクリーニング
してpEV−vrf2を同定し、その期待された構築体をDNA配
列解析で確認した。プラスミドpEV−vrf2は適当に配置
された開始コドン−RBSから下流に制限部位（EcoR I、B
amH I、Cla IおよびHind III）を含有する。したがつ
て、これらの制限部位に挿入される適当に配置された暗
号領域配列はPLプロモーターの制御下に発現し、２〜９
の過剰アミノ末端アミノ酸とともに相当する蛋白質を生
成する。これらの異種アミノ酸の除去、ならびに不適当
に配置された（すなわち、読み取り枠が正しくない）暗
号領域の再配置には特定部位突然変異が使用できる。
上に用いた合成オリゴヌクレオチドは、アプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）380A型DNAサ
ンセサイザー上で合成した支持体に結合させる活性ヌク
レオチジル成分としてはジイソプロピルホスホルアミダ
イトを用いた〔ビユーケージほか（Beaucage ＆ Caruth
ers）：テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Let
t.）,22,1859〜1862（1981）〕。支持体上での合成はマ
テユーチら（Matteucci ＆ Caruthers、前出）の記載に
従つてCPG樹脂を樹脂に付着させた３′ヌクレオチドと
ともに用い0.5mmolレベルで実施した。合成サイクルは
製造業者の指示にほぼ従つたが、脱トリチル化試薬とし
ては３％トリクロロ酢酸の代わりに２％ジクロロ酢酸を
用いた。合成オリゴヌクレオチドは20％ポリアクリルア
ミド配列決定ゲル上に単離した。単離されたオリゴヌク
レオチドをゲルから切り出し、ゲル溶出緩衝液中で溶出
し、C18逆相カラム上で脱塩した。
バイオシステムズ（Applied Biosystems）380A型DNAサ
ンセサイザー上で合成した支持体に結合させる活性ヌク
レオチジル成分としてはジイソプロピルホスホルアミダ
イトを用いた〔ビユーケージほか（Beaucage ＆ Caruth
ers）：テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Let
t.）,22,1859〜1862（1981）〕。支持体上での合成はマ
テユーチら（Matteucci ＆ Caruthers、前出）の記載に
従つてCPG樹脂を樹脂に付着させた３′ヌクレオチドと
ともに用い0.5mmolレベルで実施した。合成サイクルは
製造業者の指示にほぼ従つたが、脱トリチル化試薬とし
ては３％トリクロロ酢酸の代わりに２％ジクロロ酢酸を
用いた。合成オリゴヌクレオチドは20％ポリアクリルア
ミド配列決定ゲル上に単離した。単離されたオリゴヌク
レオチドをゲルから切り出し、ゲル溶出緩衝液中で溶出
し、C18逆相カラム上で脱塩した。
かくして得られた組換えDNAによつて生細胞を形質転
換し、クローン化cDNAの増幅またはIL−１ポリペプチド
の製造を行うことができる。
換し、クローン化cDNAの増幅またはIL−１ポリペプチド
の製造を行うことができる。
IL−１の製造に使用できる適当な真核生物宿主には、
脊椎動物細胞、酵母等が包含される。たとえば、サルの
細胞たとえばグラツツマン（Gluzman）によつて報告さ
れている〔セル（Cell）、24,175〜182,1981〕ようなSV
−40の複製起源欠陥変異株によつて形質転換され、SV−
40の大Ｔ抗原を発現するCV−１細胞（COS細胞）、オオ
ノらによつて報告されているマウス誘導細胞（Ohno ＆
Taniguchiヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucl.Ac
ids Res.）,10,967〜977（1982）〕、ヒツツエマン（Hi
tzeman）らによつて報告され、インターフエロン遺伝子
の発現に用いられてきた酵母宿主−ベクター系〔ネイチ
ヤー（Nature）,293,717〜722（1981）〕が使用でき
る。さらに、スミス（Smith）らによつて記述されたよ
うな昆虫細胞の使用も可能である〔モルキユラー・アン
ド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Bicl.）,3,215
6〜2165（1983）〕。適当な原核生物宿主には、大腸
菌、枯草菌等が包含される。宿主生物中でのDNAの増幅
には、宿主として大腸菌を用いるのが好ましいが、他の
宿主も使用できる。
脊椎動物細胞、酵母等が包含される。たとえば、サルの
細胞たとえばグラツツマン（Gluzman）によつて報告さ
れている〔セル（Cell）、24,175〜182,1981〕ようなSV
−40の複製起源欠陥変異株によつて形質転換され、SV−
40の大Ｔ抗原を発現するCV−１細胞（COS細胞）、オオ
ノらによつて報告されているマウス誘導細胞（Ohno ＆
Taniguchiヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucl.Ac
ids Res.）,10,967〜977（1982）〕、ヒツツエマン（Hi
tzeman）らによつて報告され、インターフエロン遺伝子
の発現に用いられてきた酵母宿主−ベクター系〔ネイチ
ヤー（Nature）,293,717〜722（1981）〕が使用でき
る。さらに、スミス（Smith）らによつて記述されたよ
うな昆虫細胞の使用も可能である〔モルキユラー・アン
ド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Bicl.）,3,215
6〜2165（1983）〕。適当な原核生物宿主には、大腸
菌、枯草菌等が包含される。宿主生物中でのDNAの増幅
には、宿主として大腸菌を用いるのが好ましいが、他の
宿主も使用できる。
大腸菌に使用できる適当なベクターとしては、EK型プ
ラスミドベクター（緊縮型）:pSC101,pRK353,pRK646,pR
K248,pDF41等;EK型プラスミドベクター（緩和型）:ColE
I,pVH51,pAC105,RSF2124,pCR1,pMB9,pBR313,pBR322,pBR
324,pBR325,pBR327,pBR328,pKY2289,pKY2700,pKN80,pKC
7,pKB158,pMK2004,pACYC1,pACYC184,dul等；λgt型フア
ージベクター：λgt.λc,λgt.λB,λWES,λc,λgt.λ
B,λWES,λc,λWES,λB,λZJvir.,λＢ′．λALO.λB.
λWES.Ts622,λDam等を挙げることができる。一般に
は、大腸菌に対するベクターとしては、pBR322が頻繁に
使用されてきた。
ラスミドベクター（緊縮型）:pSC101,pRK353,pRK646,pR
K248,pDF41等;EK型プラスミドベクター（緩和型）:ColE
I,pVH51,pAC105,RSF2124,pCR1,pMB9,pBR313,pBR322,pBR
324,pBR325,pBR327,pBR328,pKY2289,pKY2700,pKN80,pKC
7,pKB158,pMK2004,pACYC1,pACYC184,dul等；λgt型フア
ージベクター：λgt.λc,λgt.λB,λWES,λc,λgt.λ
B,λWES,λc,λWES,λB,λZJvir.,λＢ′．λALO.λB.
λWES.Ts622,λDam等を挙げることができる。一般に
は、大腸菌に対するベクターとしては、pBR322が頻繁に
使用されてきた。
宿主細胞の組換えDNAによる形質転換は次のような慣
用された方法で実施できる。
用された方法で実施できる。
宿主が大腸菌のような原核生物の場合には、DNAの取
り込みが可能なコンピーテント細胞は、指数生育期に収
穫しついで公知のCaCl2法で処理して調製する。MgCl2ま
たはRbClが形質転換反応メジウム中に存在すると、形質
転換は効率的に増加する。形質転換は、宿主細胞のプロ
トプラストを形成させたのちに実施することもできる。
り込みが可能なコンピーテント細胞は、指数生育期に収
穫しついで公知のCaCl2法で処理して調製する。MgCl2ま
たはRbClが形質転換反応メジウム中に存在すると、形質
転換は効率的に増加する。形質転換は、宿主細胞のプロ
トプラストを形成させたのちに実施することもできる。
使用する宿主が真核生物の場合には、DNAをリン酸カ
ルシウムとして沈殿としてトランスフエクシヨンする方
法、マイクロインジエクシヨンのような機械的方法、赤
血球宿主もしくはリポソームに封入したプラスミドの挿
入、リゾホスフアチジルコリンのような試薬による細胞
の処理、ウイルスベクターの使用等が使用できる。
ルシウムとして沈殿としてトランスフエクシヨンする方
法、マイクロインジエクシヨンのような機械的方法、赤
血球宿主もしくはリポソームに封入したプラスミドの挿
入、リゾホスフアチジルコリンのような試薬による細胞
の処理、ウイルスベクターの使用等が使用できる。
しかしながら、他の様々な微生物株、たとえば大腸菌
Ｂ、大腸菌X1776（ATCCNo.31537）および大腸菌W3310
（ATCCNo.27325）のような公知の大腸菌株、とくに好ま
しくは大腸菌RR1（ATCCNo.31343）、またはMC1061のよ
うな他の微生物が有用である。これらの多くは、寄託機
関たとえばアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨン（American Type Culture Collectin,ATCC）に寄託
されていて利用できる（ATCCカタログ参照）。また、ド
イツ公開特許第2644432号も参考になる。これらの他の
微生物には、枯草菌のような桿菌属、ネズミチフス菌
（Salmonella typhimurium）や靈菌（Serratia marcesc
ens）のような腸内細菌が包含され、それらの菌内で異
種遺伝子配列を複製し、発現できるプラスミドが使用さ
れる。
Ｂ、大腸菌X1776（ATCCNo.31537）および大腸菌W3310
（ATCCNo.27325）のような公知の大腸菌株、とくに好ま
しくは大腸菌RR1（ATCCNo.31343）、またはMC1061のよ
うな他の微生物が有用である。これらの多くは、寄託機
関たとえばアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨン（American Type Culture Collectin,ATCC）に寄託
されていて利用できる（ATCCカタログ参照）。また、ド
イツ公開特許第2644432号も参考になる。これらの他の
微生物には、枯草菌のような桿菌属、ネズミチフス菌
（Salmonella typhimurium）や靈菌（Serratia marcesc
ens）のような腸内細菌が包含され、それらの菌内で異
種遺伝子配列を複製し、発現できるプラスミドが使用さ
れる。
異種ポリペプチドの微生物産生を開始し維持するため
には、たとえば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプ
ロモータシステムが有利に使用できる。これらのプロモ
ータシステムの組立および構築に関する詳細はチヤンら
〔Chang et al.:ネイチヤー（Nature）,275,671〜624
（1978）およびイタクラら〔Itakura et al.:サイエン
ス（Scinece）,198,1056〜1063（1977）〕によつて報告
されている。さらに最近になつて、トリプトフアンに関
するシステム、いわゆるtrpプロモータシステムが開発
された。このシステムの組立および構築に関する詳細は
ゲツデルら〔Goeddel et al.:ヌクレイツク・アシツズ
・リサーチ（Nucl.Acids Res.）,8,4057〜4074（198
0）〕により記述されている。多くの他の微生物プロモ
ーターが発見され、使用されており、それらのヌクレオ
チド配列、プラスミドベクター内への機能的な結合につ
いての詳細も報告されている〔たとえば、ジーベンリス
ト（Siebenlist）ほか：セル（Cell）,20,269（1980）
参照〕。
には、たとえば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプ
ロモータシステムが有利に使用できる。これらのプロモ
ータシステムの組立および構築に関する詳細はチヤンら
〔Chang et al.:ネイチヤー（Nature）,275,671〜624
（1978）およびイタクラら〔Itakura et al.:サイエン
ス（Scinece）,198,1056〜1063（1977）〕によつて報告
されている。さらに最近になつて、トリプトフアンに関
するシステム、いわゆるtrpプロモータシステムが開発
された。このシステムの組立および構築に関する詳細は
ゲツデルら〔Goeddel et al.:ヌクレイツク・アシツズ
・リサーチ（Nucl.Acids Res.）,8,4057〜4074（198
0）〕により記述されている。多くの他の微生物プロモ
ーターが発見され、使用されており、それらのヌクレオ
チド配列、プラスミドベクター内への機能的な結合につ
いての詳細も報告されている〔たとえば、ジーベンリス
ト（Siebenlist）ほか：セル（Cell）,20,269（1980）
参照〕。
発現システムとしては、大腸菌でも酵母、ビール酵母
菌（Saccharomyces cerevisiae）のいずれでも複製可能
なプラスミドYRp7も使用できる。有用な菌株はアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに制限なく寄託
されている（ATCCNo.44076）。しかしながら、細胞trp1
を作る突然変異を含む任意のビール酵母菌がこの発現シ
ステムを含有するプラスミドの発現に有効な環境である
と考えてよい。使用できる他の菌株の例にはpep4−１が
ある。このトリプトフアン栄養要求株もTRP1遺伝子内に
点変異を有する。
菌（Saccharomyces cerevisiae）のいずれでも複製可能
なプラスミドYRp7も使用できる。有用な菌株はアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに制限なく寄託
されている（ATCCNo.44076）。しかしながら、細胞trp1
を作る突然変異を含む任意のビール酵母菌がこの発現シ
ステムを含有するプラスミドの発現に有効な環境である
と考えてよい。使用できる他の菌株の例にはpep4−１が
ある。このトリプトフアン栄養要求株もTRP1遺伝子内に
点変異を有する。
マウスIL−1cDNAの大腸菌内発現での経験から、ヒトI
L−１プレカーサーのカルボキシ末端部分がIL−１の生
物学的活性を有することが示唆される。上述のクローン
phil＃７は、ヒトIL−１プレカーサーのカルボキシ末端
163個のアミノ酸の暗号情報を含んである。phil＃７挿
入体（第2A図参照）の５′末端付近、９番目のアミノ酸
（すなわち、プレカーサーのカルボキシ末端から155rd
アミノ酸）のコドン内にAlu I制限エンドヌクレアーゼ
切断部位がある。次の下流Alu I部位は、約600bp離れた
３′非暗号領域内に（すなわち停止コドンを過ぎて）あ
る。ヒトIL−１プレカーサーのカルボキシ末端154のア
ミノ酸をコードする配列を含むこの約600bp Alu Iフラ
グメントはphil＃７から単離され、大腸菌発現プラスミ
ドのBamH I部位（第４図参照）に以下の方法で挿入され
た。すなわち、標準方法を用いて、クローンphil＃７か
らの挿入体をAlu Iで消化し、ホスホリル化BamH Iリン
カー〔CGGATCCG,ニユー・イングランド・バイオラブズ
（New England Biolabs）、カタログ1021〕をAlu I切断
挿入体にT4DNAリガーゼを用いて結合させた。リガーゼ
を熱不活性化し、混合物をBamH Iで処理し、過剰のリン
カーを除去し、付着端を生成させた。この混合物をポリ
アクリルアミド上電気泳動に付し、約600bpフラグメン
トを単離した。プラスミドpEV−vrfをBamH Iで消化し、
線状化ベクターをアガロースゲル電気泳動によつて回収
した。約600bpフラグメントとBamH I切断ベクターを互
いに結合させ、適合性プラスミドpRK248cIts〔ベルナル
ドほか（Bernard＆Helinski）、メソツズ・イン・エン
ザイモロジー（Meth.Enzym.）,68,482〜492（1979）;AT
CC No.37766〕を含む大腸菌株MC1061〔カサダバンほか
（Casadaban ＆ Cohen）：ジヤーナル・オブ・モルキユ
ラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）,138,179〜207（19
80）〕の形質転換に用い、アンピシリン抵抗性を利用し
て選択した。細菌クローンを制限エンドヌクレアーゼ消
化解析によつてスクリーニングし、この挿入体を正しい
方向に含有するプラスミドphil＃１〜154＊を同定し
た。プラスミドphil＃１〜154＊の部分配列決定を行
い、その構造が正しいことを確認した。phil＃１〜154
＊またはその親プラスミドpVE−vrf2を含む細菌を、ア
ンピシリン含有Ｍメジウム中30℃で、A550が0.7に達す
るまで生育させた。この時点で培養条件を42℃にスフト
し、２時間培養した。培養液1mlからの細菌を遠心分離
によつて回収し、7Mグアニジン塩酸塩50μ中で可溶化
した。これらの粗細菌抽出液について、ネズミ胸腺細胞
増殖検定法〔ミゼル（Mizel）ほか：前出〕によりIL−
１活性を調べた。pEV−vrf2のみを含む細菌抽出液はこ
の検定でバツクグラウンド以上に刺激しなかつた。phil
＃１〜154＊を含む細菌の抽出液はグアニジン塩酸塩溶
液1mlあたり32,000単位IL−１活性を示した。比活性を
６×106単位/mgと想定すると、これは、細菌培養液１
あたり少なくとも0.3mgのIL−１蛋白質に相当する。
L−１プレカーサーのカルボキシ末端部分がIL−１の生
物学的活性を有することが示唆される。上述のクローン
phil＃７は、ヒトIL−１プレカーサーのカルボキシ末端
163個のアミノ酸の暗号情報を含んである。phil＃７挿
入体（第2A図参照）の５′末端付近、９番目のアミノ酸
（すなわち、プレカーサーのカルボキシ末端から155rd
アミノ酸）のコドン内にAlu I制限エンドヌクレアーゼ
切断部位がある。次の下流Alu I部位は、約600bp離れた
３′非暗号領域内に（すなわち停止コドンを過ぎて）あ
る。ヒトIL−１プレカーサーのカルボキシ末端154のア
ミノ酸をコードする配列を含むこの約600bp Alu Iフラ
グメントはphil＃７から単離され、大腸菌発現プラスミ
ドのBamH I部位（第４図参照）に以下の方法で挿入され
た。すなわち、標準方法を用いて、クローンphil＃７か
らの挿入体をAlu Iで消化し、ホスホリル化BamH Iリン
カー〔CGGATCCG,ニユー・イングランド・バイオラブズ
（New England Biolabs）、カタログ1021〕をAlu I切断
挿入体にT4DNAリガーゼを用いて結合させた。リガーゼ
を熱不活性化し、混合物をBamH Iで処理し、過剰のリン
カーを除去し、付着端を生成させた。この混合物をポリ
アクリルアミド上電気泳動に付し、約600bpフラグメン
トを単離した。プラスミドpEV−vrfをBamH Iで消化し、
線状化ベクターをアガロースゲル電気泳動によつて回収
した。約600bpフラグメントとBamH I切断ベクターを互
いに結合させ、適合性プラスミドpRK248cIts〔ベルナル
ドほか（Bernard＆Helinski）、メソツズ・イン・エン
ザイモロジー（Meth.Enzym.）,68,482〜492（1979）;AT
CC No.37766〕を含む大腸菌株MC1061〔カサダバンほか
（Casadaban ＆ Cohen）：ジヤーナル・オブ・モルキユ
ラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）,138,179〜207（19
80）〕の形質転換に用い、アンピシリン抵抗性を利用し
て選択した。細菌クローンを制限エンドヌクレアーゼ消
化解析によつてスクリーニングし、この挿入体を正しい
方向に含有するプラスミドphil＃１〜154＊を同定し
た。プラスミドphil＃１〜154＊の部分配列決定を行
い、その構造が正しいことを確認した。phil＃１〜154
＊またはその親プラスミドpVE−vrf2を含む細菌を、ア
ンピシリン含有Ｍメジウム中30℃で、A550が0.7に達す
るまで生育させた。この時点で培養条件を42℃にスフト
し、２時間培養した。培養液1mlからの細菌を遠心分離
によつて回収し、7Mグアニジン塩酸塩50μ中で可溶化
した。これらの粗細菌抽出液について、ネズミ胸腺細胞
増殖検定法〔ミゼル（Mizel）ほか：前出〕によりIL−
１活性を調べた。pEV−vrf2のみを含む細菌抽出液はこ
の検定でバツクグラウンド以上に刺激しなかつた。phil
＃１〜154＊を含む細菌の抽出液はグアニジン塩酸塩溶
液1mlあたり32,000単位IL−１活性を示した。比活性を
６×106単位/mgと想定すると、これは、細菌培養液１
あたり少なくとも0.3mgのIL−１蛋白質に相当する。
発現プラスミドphil＃１〜154＊によつてコードされ
る蛋白質は、イニシエイターのメチオニンに加えて６個
の異種アミノ酸をそのアミノ末端に有する。これらは、
特定部位突然変異により、次のようにして除去された。
る蛋白質は、イニシエイターのメチオニンに加えて６個
の異種アミノ酸をそのアミノ末端に有する。これらは、
特定部位突然変異により、次のようにして除去された。
プラスミドphil＃１〜154＊１〜２μｇを２つに分け
ていずれも制限エンドヌクレアーゼ消化に付した。一方
の反応では、１〜２単位のBgl IIおよびBamH Iによりギ
ヤツプ構造を有する線状化プラスミドを創製し（第５図
参照）、もう一方の反応では、Pst Iにより線状化プラ
スミドを生成させた。Pst I処理後は大腸菌DNAポリメラ
ーゼＩのクレノウフラグメント１単単位で処理した。こ
れらの開環プラスミドを0.7％アガロースゲルを用い電
気泳動に付し、エタノール沈殿で回収して精製した。各
プラスミドを５μの水に再懸濁した。それぞれから１
μを取つて、12mMのトリス塩酸塩pH7.5、9mM MgC
l2、200mM NaClおよび20μβ−メルカプトエタノー
ルを含む反応液12μ中ホスホリル化合成オリゴヌクレ
オチド:5′−Ｐ−ATTGCTCAGGAACATATTAATTCC−OH−３′
50ngと合した。反応液を100℃に３分間加熱して開環プ
ラスミドを変性させ、反応液23℃に10分間、４℃に30分
間ついで０℃に10分間保持して徐々に冷却して、オリゴ
ヌクレオチドをアニーリングした。この操作でヘテロ二
重鎖型のphil＃１〜154＊が生成し、オリゴヌクレオチ
ドは一重鎖領域にアニーリングした。
ていずれも制限エンドヌクレアーゼ消化に付した。一方
の反応では、１〜２単位のBgl IIおよびBamH Iによりギ
ヤツプ構造を有する線状化プラスミドを創製し（第５図
参照）、もう一方の反応では、Pst Iにより線状化プラ
スミドを生成させた。Pst I処理後は大腸菌DNAポリメラ
ーゼＩのクレノウフラグメント１単単位で処理した。こ
れらの開環プラスミドを0.7％アガロースゲルを用い電
気泳動に付し、エタノール沈殿で回収して精製した。各
プラスミドを５μの水に再懸濁した。それぞれから１
μを取つて、12mMのトリス塩酸塩pH7.5、9mM MgC
l2、200mM NaClおよび20μβ−メルカプトエタノー
ルを含む反応液12μ中ホスホリル化合成オリゴヌクレ
オチド:5′−Ｐ−ATTGCTCAGGAACATATTAATTCC−OH−３′
50ngと合した。反応液を100℃に３分間加熱して開環プ
ラスミドを変性させ、反応液23℃に10分間、４℃に30分
間ついで０℃に10分間保持して徐々に冷却して、オリゴ
ヌクレオチドをアニーリングした。この操作でヘテロ二
重鎖型のphil＃１〜154＊が生成し、オリゴヌクレオチ
ドは一重鎖領域にアニーリングした。
一重鎖領域を二重鎖にし、このプラスミドを75μＭ
dATP,75μＭ dTTP,75μＭ dCTP,75μＭ dGTP,500μ
Ｍ ATP,2〜３単位大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ
フラグメントおよび１単位のT4DNAリガーゼを含む反応2
0μ中でリゲートさせた。この反応は15℃で12〜16時
間行つた。プラスミドDNAはエタノール沈殿で回収し、1
0μの水に再懸濁した。その５μを取り、アンピシ
リン抵抗性の適合性プラスミドpRK248cITsを含む大腸菌
株MC1061の形質転換に用いた。各形質転換体からのプラ
スミドDNAを回収し、このプラスミドDNAプレパレーシヨ
ンに対してBgl II/BamH I制限消化を行うことにより、
アンピシリン抵抗性形質転換体について、phil＃１〜15
4＊バツクグラウンド中の新規プラスミドphil＃１〜154
をスクリーニングした。phil＃１〜154を含むプラスミ
ドDNAを用いて第２ラウンドMC1061（pRK248cIts）形質
転換を行い、phil＃１〜154とphil＃１〜154＊とを分離
した。phil＃１〜154のみを含む形質転換体を回収し、
各大腸菌コロニーを以下に述べるようにphil＃１〜154
蛋白質の製造に使用した。
dATP,75μＭ dTTP,75μＭ dCTP,75μＭ dGTP,500μ
Ｍ ATP,2〜３単位大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ
フラグメントおよび１単位のT4DNAリガーゼを含む反応2
0μ中でリゲートさせた。この反応は15℃で12〜16時
間行つた。プラスミドDNAはエタノール沈殿で回収し、1
0μの水に再懸濁した。その５μを取り、アンピシ
リン抵抗性の適合性プラスミドpRK248cITsを含む大腸菌
株MC1061の形質転換に用いた。各形質転換体からのプラ
スミドDNAを回収し、このプラスミドDNAプレパレーシヨ
ンに対してBgl II/BamH I制限消化を行うことにより、
アンピシリン抵抗性形質転換体について、phil＃１〜15
4＊バツクグラウンド中の新規プラスミドphil＃１〜154
をスクリーニングした。phil＃１〜154を含むプラスミ
ドDNAを用いて第２ラウンドMC1061（pRK248cIts）形質
転換を行い、phil＃１〜154とphil＃１〜154＊とを分離
した。phil＃１〜154のみを含む形質転換体を回収し、
各大腸菌コロニーを以下に述べるようにphil＃１〜154
蛋白質の製造に使用した。
組換えヒトインターロイキン−１の精製 多くの他の組換え蛋白質と同様に〔ウイリアム（Will
iam,D.C.）ほか：サイエンス（Science）,215,687〜689
（1982）；ラカル（Lacal,J.C.）ほか：フロシーデイン
グズ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ・オブ・ザ・ユナイテツド・ステイツ・オブ・
アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,81,5305〜5309
（1984）参照〕、ヒトインターロイキン−１を大腸菌内
の不溶性細胞質内封入体中に凝集する。したがつて、組
換えヒトIL−１の精製は、これらの封入体の単離に始ま
る〔ラカル（Lacal）ほか：前出参照〕。
iam,D.C.）ほか：サイエンス（Science）,215,687〜689
（1982）；ラカル（Lacal,J.C.）ほか：フロシーデイン
グズ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ・オブ・ザ・ユナイテツド・ステイツ・オブ・
アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,81,5305〜5309
（1984）参照〕、ヒトインターロイキン−１を大腸菌内
の不溶性細胞質内封入体中に凝集する。したがつて、組
換えヒトIL−１の精製は、これらの封入体の単離に始ま
る〔ラカル（Lacal）ほか：前出参照〕。
大腸菌ペースト（1g）を緩衝液Ａ（30mMトリス塩酸塩
pH8.5mM EDTA）中1mMフエニルメチルスルホニルフルオ
ライド5mlに懸濁し、この細胞をソニフアイアー（Sonif
ier）細胞デイスラプター350型〔プランソン・ソニック
・パワー・カンパニー（Branson Sonic Power Co.）〕
を用いて６回、計３分間超音波処理した。細胞溶解物を
30,000xgで30分間遠心分離して不溶性分画を分離した。
微粒子分画（大部分のIL−１活性を含む）をそれぞれ5m
lの１）緩衝液Ａ、２）緩衝液Ａ中１％トリトンＸ−100
および３）1.75Mグアニジン塩酸塩で順次洗浄した。各
洗浄後に、微粒子分画を30,000xgで20分間遠心分離して
ペレツト化した。IL−１活性を5Mグアニジン塩酸塩3ml
によつて残つた微粒子分画から可溶化し、ついで30,000
xgで30分間遠心分離した。この工程まで、すべての操作
は４℃で実施した。可溶化したIL−１蛋白質は、5Mグア
ニジン塩酸塩で平衡化したセフアクリル（Sephacryl）
Ｓ−200またはセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−75〔フ
アーマシア・フアイン・ケミカルズ，ピスカタウエイ，
ニユージヤージー（Pharmacia Fine Chemicals,Piscata
way,N.J.）〕上ゲルろ過クラマトグラフイーに付し、5M
グアニジン塩酸塩で溶出して精製した。精製した１〜15
4＊IL−１はSDSポリアクリルアミドゲル上単一のポリペ
プチドとして挙動した〔レムリ（Laemmli,U.K.），ネイ
チヤー（Nature）,227,680〜685（1970）〕。アミノ酸
組成分析およびアミノ末端配列解析に付すと、期待され
た結果が得られ、この蛋白質の純粋性と同一性が確認さ
れた。同様に、phil＃１〜154で形質転換した大腸菌は
１〜154蛋白質の製造に使用され、この蛋白質も上述し
たと同様に精製された。
pH8.5mM EDTA）中1mMフエニルメチルスルホニルフルオ
ライド5mlに懸濁し、この細胞をソニフアイアー（Sonif
ier）細胞デイスラプター350型〔プランソン・ソニック
・パワー・カンパニー（Branson Sonic Power Co.）〕
を用いて６回、計３分間超音波処理した。細胞溶解物を
30,000xgで30分間遠心分離して不溶性分画を分離した。
微粒子分画（大部分のIL−１活性を含む）をそれぞれ5m
lの１）緩衝液Ａ、２）緩衝液Ａ中１％トリトンＸ−100
および３）1.75Mグアニジン塩酸塩で順次洗浄した。各
洗浄後に、微粒子分画を30,000xgで20分間遠心分離して
ペレツト化した。IL−１活性を5Mグアニジン塩酸塩3ml
によつて残つた微粒子分画から可溶化し、ついで30,000
xgで30分間遠心分離した。この工程まで、すべての操作
は４℃で実施した。可溶化したIL−１蛋白質は、5Mグア
ニジン塩酸塩で平衡化したセフアクリル（Sephacryl）
Ｓ−200またはセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−75〔フ
アーマシア・フアイン・ケミカルズ，ピスカタウエイ，
ニユージヤージー（Pharmacia Fine Chemicals,Piscata
way,N.J.）〕上ゲルろ過クラマトグラフイーに付し、5M
グアニジン塩酸塩で溶出して精製した。精製した１〜15
4＊IL−１はSDSポリアクリルアミドゲル上単一のポリペ
プチドとして挙動した〔レムリ（Laemmli,U.K.），ネイ
チヤー（Nature）,227,680〜685（1970）〕。アミノ酸
組成分析およびアミノ末端配列解析に付すと、期待され
た結果が得られ、この蛋白質の純粋性と同一性が確認さ
れた。同様に、phil＃１〜154で形質転換した大腸菌は
１〜154蛋白質の製造に使用され、この蛋白質も上述し
たと同様に精製された。
マウスIL−１遺伝子の欠失変異株の発現生成物につい
ての実験より、生物活性蛋白質を与えるマウスIL−１カ
ルボキシ末端からの最小配列を決定する根拠が与えられ
ている。結果を第１表にまとめる。
ての実験より、生物活性蛋白質を与えるマウスIL−１カ
ルボキシ末端からの最小配列を決定する根拠が与えられ
ている。結果を第１表にまとめる。
1.蛋白質１−156はマウスIL−１プレカーサーのカルボ
キシ末端156個のアミノ酸を含むこと意味する。欠失変
異株はすべて、この分子との対比で定義されていて、蛋
白質17−156は蛋白質１−156に対し16個のアミノ末端ア
ミノ酸を欠くこと、蛋白質１−143,156は蛋白質１−156
に対しアミノ酸144−155を欠く。
キシ末端156個のアミノ酸を含むこと意味する。欠失変
異株はすべて、この分子との対比で定義されていて、蛋
白質17−156は蛋白質１−156に対し16個のアミノ末端ア
ミノ酸を欠くこと、蛋白質１−143,156は蛋白質１−156
に対しアミノ酸144−155を欠く。
2.胸腺細胞増殖検定〔ミゼル（Mizel）ほか：前出〕、
単位/mg蛋白質 第１表から明らかなように、活性にはカルボキシ末端
に近い配列が必須である。17−156が高い活性を示し、
一方さらにこのフラグメントのアミノ末端から13個のア
ミノ酸を欠失させると活性は消失することから、最低約
139個のアミノ酸が活性の維持に必要なことが明らかで
ある。マウス分子におけるデータからの類推により、ヒ
トIL−１プレカーサーのカルボキシ末端の139個のアミ
ノ酸を包含する配列がIL−１活性を表す最小フラグメン
トであると考えられる。これは、第2B図に示したヒトIL
−１プレカーサー蛋白質配列の位置132〜271に相当す
る。したがつて、本発明はその一態において、上述の最
小カルボキシ末端配列を含み、ヒトIl−活性を表すペプ
チドに関する。
単位/mg蛋白質 第１表から明らかなように、活性にはカルボキシ末端
に近い配列が必須である。17−156が高い活性を示し、
一方さらにこのフラグメントのアミノ末端から13個のア
ミノ酸を欠失させると活性は消失することから、最低約
139個のアミノ酸が活性の維持に必要なことが明らかで
ある。マウス分子におけるデータからの類推により、ヒ
トIL−１プレカーサーのカルボキシ末端の139個のアミ
ノ酸を包含する配列がIL−１活性を表す最小フラグメン
トであると考えられる。これは、第2B図に示したヒトIL
−１プレカーサー蛋白質配列の位置132〜271に相当す
る。したがつて、本発明はその一態において、上述の最
小カルボキシ末端配列を含み、ヒトIl−活性を表すペプ
チドに関する。
生物学的活性に必要な配列を包含する組換えヒトIL−
１ペプチドの精製物は、それ自体公知の方法により、た
とえば病原に対する宿主の防御応答の改善、ワクチンア
ジユバントとしての作用および新生物疾患に対する宿主
の防御の増強によつて、宿主対象の免疫系の刺激に用い
ることができる。本技術分野においてヒトIL−１の他の
臨床的応用が確認されているものには、線維芽細胞の増
殖刺激を介した創傷治癒の促進および重篤な蛋白質栄養
不良患者の回復の改善がある。
１ペプチドの精製物は、それ自体公知の方法により、た
とえば病原に対する宿主の防御応答の改善、ワクチンア
ジユバントとしての作用および新生物疾患に対する宿主
の防御の増強によつて、宿主対象の免疫系の刺激に用い
ることができる。本技術分野においてヒトIL−１の他の
臨床的応用が確認されているものには、線維芽細胞の増
殖刺激を介した創傷治癒の促進および重篤な蛋白質栄養
不良患者の回復の改善がある。
本発明の方法に従つて製造された精製IL−１ペプチド
は、上述の臨床的利用のため温血動物に投与することが
できる。投与は任意の慣用方法により、たとえば静脈
内、皮下または筋肉内に非経口的に行われる。必要投与
量が、処置される特定の症状、症状の重症度、処理期間
および投与方法等によつて変動することは自明のとおり
である。医薬用途における適当な剤型はIL−１ペプチド
を減菌ろ過し、凍結乾燥した剤型がある。これは常法に
より使用前に再構築させる。非経口投与用医薬剤型に慣
用される緩衝剤、安定剤、静菌剤および他の賦形剤もし
くは補助剤を添加できることも、本技術分野の熟練者に
よれば容易に想到する範囲内で、本発明に包含される。
は、上述の臨床的利用のため温血動物に投与することが
できる。投与は任意の慣用方法により、たとえば静脈
内、皮下または筋肉内に非経口的に行われる。必要投与
量が、処置される特定の症状、症状の重症度、処理期間
および投与方法等によつて変動することは自明のとおり
である。医薬用途における適当な剤型はIL−１ペプチド
を減菌ろ過し、凍結乾燥した剤型がある。これは常法に
より使用前に再構築させる。非経口投与用医薬剤型に慣
用される緩衝剤、安定剤、静菌剤および他の賦形剤もし
くは補助剤を添加できることも、本技術分野の熟練者に
よれば容易に想到する範囲内で、本発明に包含される。
第１図は、マウスIL−１プレカーサーcDNAのヌクレオチ
ド配列およびそれから予測されるアミノ酸配列である。 第2A図は、ヒトIL−１プレカーサー（phil＃７から）の
カルボキシ末端領域のヌクレオチド配列とそれから予測
されるアミノ酸配列で、phil＃４の部分配列には下線を
施してある。 第2B図は、クローンphil＃７およびph＃19の複合体から
推定されるヒトIL−１プレカーサーのヌクレオチド配列
およびそれから予測されるアミノ酸配列である。 第３図は、マウスおよびヒトIL−１プレカーサー蛋白質
の配列のホモロジーを示した図である。 第４図は、修飾された154個のアミノ酸のヒトIL−１カ
ルボキシ末端配列（phil＃１〜154＊）の合成を行う発
現ベクターの、ベクターとしてpEV−vrf2を用いた構築
を示すフローチヤートである。 第５図はphil＃１〜154＊のアミノ末端異種アミノ酸を
もたないヒトIL−１の154個のアミノ酸カルボキシ末端
配列（phil＃１〜154）の合成を行う発現ベクターの構
築を示すフローチヤートである。
ド配列およびそれから予測されるアミノ酸配列である。 第2A図は、ヒトIL−１プレカーサー（phil＃７から）の
カルボキシ末端領域のヌクレオチド配列とそれから予測
されるアミノ酸配列で、phil＃４の部分配列には下線を
施してある。 第2B図は、クローンphil＃７およびph＃19の複合体から
推定されるヒトIL−１プレカーサーのヌクレオチド配列
およびそれから予測されるアミノ酸配列である。 第３図は、マウスおよびヒトIL−１プレカーサー蛋白質
の配列のホモロジーを示した図である。 第４図は、修飾された154個のアミノ酸のヒトIL−１カ
ルボキシ末端配列（phil＃１〜154＊）の合成を行う発
現ベクターの、ベクターとしてpEV−vrf2を用いた構築
を示すフローチヤートである。 第５図はphil＃１〜154＊のアミノ末端異種アミノ酸を
もたないヒトIL−１の154個のアミノ酸カルボキシ末端
配列（phil＃１〜154）の合成を行う発現ベクターの構
築を示すフローチヤートである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＤ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 スチーブン ビー．ミゼル アメリカ合衆国 ペンシルバニア州ステ イト カレツジ，イースト プロスペク ト アベニユー 454 (56)参考文献 特開 昭61−149092（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−170395（ＪＰ，Ａ) Ｌａｃｈｍａｎ，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏ ｎ Ｐｒｏｃ．，42，（９）Ｐ．2639− 2645（1983) Ｍｉｚｅｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．, 131，（４）Ｐ．1834−1837（1983) Ｓｃａｌａ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒ ｅ．309，Ｐ．56−59（1984)
Claims (7)
- 【請求項１】他のヒトポリペプチドを含まないヒトイン
ターロイキン−１（1L−１）ポリペプチドであって、 ヒトIL−１プレカーサー蛋白質のアミノ酸配列の位置11
8〜271に相当する、アミノ酸配列： を有するヒト1L−１ポリペプチド。 - 【請求項２】グリコシル化を全く受けていない特許請求
の範囲第１項記載のヒトインターロイキン−１ポリペプ
チド。 - 【請求項３】他のヒトポリペプチドを含まないヒトイン
ターロイキン−１（1L−１）ポリペプチドであって、 ヒトIL−１プレカーサー蛋白質のアミノ酸配列の位置11
8〜271に相当する、アミノ酸配列： を有するヒト1L−１ポリペプチドをコードする遺伝子を
含む発現ベクターで形質転換された真核生物または原核
生物細胞を培地中で培養してヒトインターロイキン−１
を産生させ、産生したヒトインターロイキン−１を回収
することから構成される前記のヒト1L−１ポリペプチド
の製造方法。 - 【請求項４】ヒトインターロイキン−１ポリペプチド
が、グリコシル化を全く受けていないポリペプチドであ
る特許請求の範囲第３項に記載の製造方法。 - 【請求項５】細胞が真核生物細胞であり、ヒトインター
ロイキン−１の生物学的活性型は発現後修飾により得ら
れる特許請求の範囲第３項に記載の製造方法。 - 【請求項６】他のヒトポリペプチドを含まないヒトイン
ターロイキン−１（1L−１）ポリペプチドであって、 ヒトIL−１プレカーサー蛋白質のアミノ酸配列の位置11
8〜271に相当する、アミノ酸配列： を有するヒト1L−１ポリペプチドの均一型の有効量が小
部分を、慣用の非経口投与医薬用担体物質が大部分をな
す、ヒト免疫系の刺激、ヒト創傷治癒促進または重篤な
蛋白栄養不良患者の改善もしくは回復に用いる、非経口
投与用医薬組成物。 - 【請求項７】ヒトインターロイキン−１ポリペプチド
が、グリコシル化を全く受けていないポリペプチドであ
る特許請求の範囲第６項に記載の医薬組成物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72077485A | 1985-04-25 | 1985-04-25 | |
| US720774 | 1985-04-25 | ||
| US74863285A | 1985-06-24 | 1985-06-24 | |
| US748632 | 1985-06-24 |
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Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61095837A Expired - Fee Related JP2559705B2 (ja) | 1985-04-25 | 1986-04-24 | 組換えインタ−ロイキン−１ |
| JP8054745A Expired - Fee Related JP2764028B2 (ja) | 1985-04-25 | 1996-03-12 | 組換えインターロイキン−１の遺伝子、ベクター及び形質転換体 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8054745A Expired - Fee Related JP2764028B2 (ja) | 1985-04-25 | 1996-03-12 | 組換えインターロイキン−１の遺伝子、ベクター及び形質転換体 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0200986B2 (ja) |
| JP (2) | JP2559705B2 (ja) |
| DE (1) | DE3683186D1 (ja) |
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| US5342614A (en) * | 1984-12-21 | 1994-08-30 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of treating arthritus or inflammation with IL-1β or derivatives thereof |
| US6107465A (en) * | 1984-12-21 | 2000-08-22 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | IL-1β and derivatives thereof and drugs |
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| EP0200986B2 (en) | 1985-04-25 | 1998-03-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant human interleukin-1 |
| JPH07100663B2 (ja) * | 1985-12-23 | 1995-11-01 | 大日本製薬株式会社 | インタ−ロイキン１を有効成分とする感染症予防・治療剤 |
| US5831022A (en) * | 1986-02-18 | 1998-11-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Purification of recombinant human IL-1α |
| US5008374A (en) * | 1986-03-14 | 1991-04-16 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | IL-1α derivatives and drugs |
| US5266311A (en) * | 1987-05-28 | 1993-11-30 | Immunex Corporation | Bovine interleukin-1α |
| US4894333A (en) * | 1987-05-28 | 1990-01-16 | Immunex Corporation | Bovine interleukin-1α |
| AU630341B2 (en) * | 1987-12-18 | 1992-10-29 | Immunex Corporation | Topical wound-healing preparations comprising interleukin-1 proteins |
| ZA89202B (en) * | 1988-01-15 | 1989-09-27 | Hoffmann La Roche | Recombinant human interleukin-1 alpha polypeptides |
| US5290917A (en) * | 1988-02-03 | 1994-03-01 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Modified polypeptides of IL-1α |
| JP2698976B2 (ja) * | 1988-02-03 | 1998-01-19 | 大日本製薬株式会社 | 新規ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ |
| DK172424B1 (da) * | 1988-07-29 | 1998-06-08 | Otsuka Pharma Co Ltd | IL-1alfa-Derivater, farmaceutisk præparat omfattende sådanne derivater, anvendelse af IL-1alfa-derivater, DNA sekvenser kod |
| AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US6713605B1 (en) * | 1996-04-10 | 2004-03-30 | Kansas State University Research Foundation | Synthetic peptides that inhibit leukocyte superoxide anion production and/or attract leukocytes |
| US6191269B1 (en) * | 1997-05-30 | 2001-02-20 | The Regents Of The University Of California | Selective induction of cell death by delivery of amino-terminal interleukin-1-α pro-piece polypeptide |
| US7176179B1 (en) | 1997-05-30 | 2007-02-13 | The Regents Of The University Of California | Selective induction of cell death by delivery of amino-terminal interleukin-1-α pro-piece polypeptide |
| US20030154504A1 (en) | 1998-06-24 | 2003-08-14 | Farese Robert V. | Methods and compositions for modulating carbohydrate metabolism |
| US6265165B1 (en) * | 1998-11-12 | 2001-07-24 | The Regents Of The University Of California | Methods for EST-specific full length cDNA cloning |
| US20030026806A1 (en) * | 2000-10-27 | 2003-02-06 | Amgen Inc. | Antibodies and other selective IL-1 binding agents that allow binding to IL-1 receptor but not activation thereof |
| US8414714B2 (en) | 2008-10-31 | 2013-04-09 | Fort Wayne Metals Research Products Corporation | Method for imparting improved fatigue strength to wire made of shape memory alloys, and medical devices made from such wire |
| WO2011038754A1 (en) * | 2009-09-29 | 2011-04-07 | United Technologies Ut Ag | Oral care compositions containing human recombinant interleukin-1 |
| WO2011042056A1 (en) | 2009-10-08 | 2011-04-14 | United Technologies Ut Ag | Cosmetic method for treatment of skin and hair with cosmetic compositions containing interleukin-1 |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4503035B1 (en) * | 1978-11-24 | 1996-03-19 | Hoffmann La Roche | Protein purification process and product |
| US4298729A (en) * | 1979-05-25 | 1981-11-03 | Merck & Co., Inc. | Xanthan gum-modified starches |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| IL58765A (en) * | 1979-11-21 | 1986-09-30 | Yeda Res & Dev | Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta |
| US4411992A (en) * | 1981-04-14 | 1983-10-25 | Immunex Corporation | Process for preparing murine interleukin 2 |
| US4406830A (en) * | 1981-04-17 | 1983-09-27 | Shanksville Corporation, N.V. | Regulatory glycoprotein for immune response and the use thereof in the production of T-cell growth factor |
| DE3149360A1 (de) * | 1981-12-12 | 1983-06-16 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | "verfahren zur reinigung und/oder phytohaemagglutinin-abtrennung von human-interleukin-2" |
| DE3378128D1 (en) * | 1982-04-20 | 1988-11-03 | Sloan Kettering Inst Cancer | Purification of interleukin 2 |
| GR79124B (ja) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
| JPS59169492A (ja) * | 1983-03-15 | 1984-09-25 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト融合細胞からの生理活性物質の産生方法 |
| US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| JPS6039762A (ja) * | 1983-08-11 | 1985-03-01 | Japan Storage Battery Co Ltd | 電解液循環装置 |
| JPS60112474A (ja) * | 1983-11-25 | 1985-06-18 | Ricoh Co Ltd | 和文出力装置 |
| JPS60171493A (ja) * | 1984-02-17 | 1985-09-04 | 日立造船株式会社 | 燃料輸送容器への核燃料収納方法と燃料輸送容器用プラグ |
| JPS60200894A (ja) * | 1984-03-27 | 1985-10-11 | Nec Corp | 液相成長装置 |
| US4762914A (en) * | 1984-05-18 | 1988-08-09 | Auron Philip E | Truncated protein of interleukin-1 |
| DE3587669T2 (de) * | 1984-05-18 | 1994-03-31 | New England Medical Center Inc | Menschliche IL-1-cDNS-Sequenzen die für biologisch aktive menschliche IL-1-Proteine kodieren. |
| IE61353B1 (en) * | 1984-06-19 | 1994-11-02 | Immunex Corp | Purified interleukin 1 |
| JP2579747B2 (ja) * | 1984-12-25 | 1997-02-12 | 大日本製薬株式会社 | ヒトインタ−ロイキン１をコ−ドする新規ｄｎａ |
| EP0188920B1 (en) * | 1984-12-25 | 1993-09-29 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Interleukin 1 and its derivative |
| AU577856B2 (en) * | 1985-01-17 | 1988-10-06 | Immunex Corporation | Cloning and characterization of the human interleukin 1 gene |
| EP0200986B2 (en) | 1985-04-25 | 1998-03-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant human interleukin-1 |
-
1986
- 1986-04-22 EP EP86105538A patent/EP0200986B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-22 DE DE8686105538T patent/DE3683186D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-04-24 JP JP61095837A patent/JP2559705B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-06-15 US US08/259,927 patent/US5936066A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-03-12 JP JP8054745A patent/JP2764028B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-04-13 US US09/290,563 patent/US6268180B1/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｌａｃｈｍａｎ，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ．，４２，（９）Ｐ．２６３９−２６４５（１９８３） |
| Ｍｉｚｅｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１，（４）Ｐ．１８３４−１８３７（１９８３） |
| Ｓｃａｌａ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３０９，Ｐ．５６−５９（１９８４） |
Also Published As
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