JPH07100663B2 - インタ−ロイキン１を有効成分とする感染症予防・治療剤 - Google Patents
インタ−ロイキン１を有効成分とする感染症予防・治療剤Info
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- JPH07100663B2 JPH07100663B2 JP61305005A JP30500586A JPH07100663B2 JP H07100663 B2 JPH07100663 B2 JP H07100663B2 JP 61305005 A JP61305005 A JP 61305005A JP 30500586 A JP30500586 A JP 30500586A JP H07100663 B2 JPH07100663 B2 JP H07100663B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はインターロイキン１又はインターロイキン１様
物質を有効成分とする感染症予防・治療剤に関する。
物質を有効成分とする感染症予防・治療剤に関する。
インターロイキン１（以下IL−１と略記することもあ
る。）はＴ細胞やＢ細胞の増殖分化を促進させ、またＴ
細胞に作用してリンホカイン、特にインターロイキン２
の産生を促進させる効果を有し、抗体産生や細胞性免疫
の調節に重要な役割を果たす因子の一つと考えられてい
る［Staruch,M.J.,et al.,J.Immunol.130,2191（198
3）］。その他、プロスタグランジンＥやコラゲナーゼ
の産生促進、繊維芽細胞の増殖促進、又はインターロイ
キン２やインターフェロンの有するNK（ナチュラル キ
ラー）細胞活性化作用を増強させる効果があると報告さ
れている［Simon,P.L.,et al.,“Lymphokines"vol.6,p.
47（1982）Academic Press Inc.］。
る。）はＴ細胞やＢ細胞の増殖分化を促進させ、またＴ
細胞に作用してリンホカイン、特にインターロイキン２
の産生を促進させる効果を有し、抗体産生や細胞性免疫
の調節に重要な役割を果たす因子の一つと考えられてい
る［Staruch,M.J.,et al.,J.Immunol.130,2191（198
3）］。その他、プロスタグランジンＥやコラゲナーゼ
の産生促進、繊維芽細胞の増殖促進、又はインターロイ
キン２やインターフェロンの有するNK（ナチュラル キ
ラー）細胞活性化作用を増強させる効果があると報告さ
れている［Simon,P.L.,et al.,“Lymphokines"vol.6,p.
47（1982）Academic Press Inc.］。
本発明者らは、鋭意研究の結果、インターロイキン１お
よびインターロイキン１様物質が優れた感染症予防・治
療作用を示すことを見い出し、本発明を完成した。
よびインターロイキン１様物質が優れた感染症予防・治
療作用を示すことを見い出し、本発明を完成した。
本発明の対象物質としては、下記のアミノ酸配列を有す
るヒト インターロイキン１ポリペプチド Ser Ser Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile Thy Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp Glu Thr His Gly Thy Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala ［Ｉ］ およびその感染症予防・治療活性部位を有するポリペプ
チド，例えばそのＮ末端より１〜14個のアミノ酸および
／又はＣ末端より１〜４個のアミノ酸残基が欠失したポ
リペプチドが挙げられる。また、これらポリペプチドの
生理的に許容される塩、例えば水酸化ナトリウム，水酸
化カリウム，アルギニン，カフェイン，プロカイン，塩
酸，グルコン酸等との塩も本発明の対象物質に含まれ
る。本発明の対象物質であるインターロイキン１および
インターロイキン１様物質は、後記参考例に示した方
法、ヨーロッパ公開特許No.188920等に記載の方法によ
り製造することができる。
るヒト インターロイキン１ポリペプチド Ser Ser Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile Thy Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp Glu Thr His Gly Thy Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala ［Ｉ］ およびその感染症予防・治療活性部位を有するポリペプ
チド，例えばそのＮ末端より１〜14個のアミノ酸および
／又はＣ末端より１〜４個のアミノ酸残基が欠失したポ
リペプチドが挙げられる。また、これらポリペプチドの
生理的に許容される塩、例えば水酸化ナトリウム，水酸
化カリウム，アルギニン，カフェイン，プロカイン，塩
酸，グルコン酸等との塩も本発明の対象物質に含まれ
る。本発明の対象物質であるインターロイキン１および
インターロイキン１様物質は、後記参考例に示した方
法、ヨーロッパ公開特許No.188920等に記載の方法によ
り製造することができる。
以下に本発明の対象物質の感染症予防・治療効果につき
実験例を挙げて具体的に説明する。
実験例を挙げて具体的に説明する。
実験例 1. 緑膿菌に対する感染防御効果 実験方法 Std−ddV系雄性マウス（体重約20g）の腹腔内に緑膿菌
（Pseudomonas aeruginosa 12）を接種（感染菌量:3×1
06生菌／マウス）し、全身感染症の動物モデルを作製し
た。
（Pseudomonas aeruginosa 12）を接種（感染菌量:3×1
06生菌／マウス）し、全身感染症の動物モデルを作製し
た。
リン酸緩衝液（0.1％ゼラチンと0.15M NaCl含有）に試
験薬を溶解し、感染３日前と１日前に筋肉内投与し、感
染後７日目における生存率を求めた。対照薬として上記
リン酸緩衝液を用いた。
験薬を溶解し、感染３日前と１日前に筋肉内投与し、感
染後７日目における生存率を求めた。対照薬として上記
リン酸緩衝液を用いた。
2. カンジダ菌感染症に対する治療効果 実験方法 Std−ddV系雄性マウス（体重約20g）の静脈内にカンジ
ダ アルビカンス（Candida albicans 3170）を接種
（感染菌量:6×106生菌／マウス）し、全身感染症の動
物モデルを作製した。試験薬および対照薬を前記実験例
と同様に調製、投与し、感染後14日目における生存率を
求めた。
ダ アルビカンス（Candida albicans 3170）を接種
（感染菌量:6×106生菌／マウス）し、全身感染症の動
物モデルを作製した。試験薬および対照薬を前記実験例
と同様に調製、投与し、感染後14日目における生存率を
求めた。
3. 肺炎桿菌感染症に対する治療効果 実験方法 Std−ddV系雄性マウス（体重約20g）の腹腔内に肺炎桿
菌（Klebsiella pneumoniae P−5709）を接種（感染菌
量:2×10生菌／マウス）し、全身感染症の動物モデルを
作製した。
菌（Klebsiella pneumoniae P−5709）を接種（感染菌
量:2×10生菌／マウス）し、全身感染症の動物モデルを
作製した。
感染直後および１日後に試験薬、対照薬を前記実験例と
同様に調製、投与し、感染後14日目における生存率を求
めた。
同様に調製、投与し、感染後14日目における生存率を求
めた。
上記の実験結果から明らかなように本発明の対象物質は
優れた感染症予防・治療作用を示し、種々の感染症に対
する予防・治療剤として有用である。
優れた感染症予防・治療作用を示し、種々の感染症に対
する予防・治療剤として有用である。
本発明の対象物質の投与形態としては非経口投与が好ま
しい。その投与量は症状，年令により異なるが、0.01〜
600μg/kg/日好ましくは0.1〜200μg/kg/日である。
しい。その投与量は症状，年令により異なるが、0.01〜
600μg/kg/日好ましくは0.1〜200μg/kg/日である。
本発明の対象物質を含有する製剤としては、溶液又は凍
結乾燥品が挙げられる。製剤化の際に、賦形剤や安定化
剤を添加するのが好ましい。安定化剤としては、例えば
アルブミン，グロブリン，ゼラチン，プロタミン，プロ
タミン塩，グルコース，ガラクトース，キシローズ，マ
ンニトール，グルクロン酸，トレハローズ，デキストラ
ン，ヒドロキシエチルデンプン，非イオン界面活性剤
（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル，ポリオキシエチ
レンアルキルエーテル，ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸
エステル，ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステ
ル，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油，ポリオキシエチ
レンヒマシ油，ポリオキシエチレンポリオキシプロピレ
ンアルキルエーテル，ポリオキシエチレンポリオキシプ
ロピレンブロックポリマー，ソルビタン脂肪酸エステ
ル，ジョ糖脂肪酸エステル，グリセリン脂肪酸エステ
ル）等が挙げられる。
結乾燥品が挙げられる。製剤化の際に、賦形剤や安定化
剤を添加するのが好ましい。安定化剤としては、例えば
アルブミン，グロブリン，ゼラチン，プロタミン，プロ
タミン塩，グルコース，ガラクトース，キシローズ，マ
ンニトール，グルクロン酸，トレハローズ，デキストラ
ン，ヒドロキシエチルデンプン，非イオン界面活性剤
（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル，ポリオキシエチ
レンアルキルエーテル，ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸
エステル，ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステ
ル，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油，ポリオキシエチ
レンヒマシ油，ポリオキシエチレンポリオキシプロピレ
ンアルキルエーテル，ポリオキシエチレンポリオキシプ
ロピレンブロックポリマー，ソルビタン脂肪酸エステ
ル，ジョ糖脂肪酸エステル，グリセリン脂肪酸エステ
ル）等が挙げられる。
製剤例 ヒトIL−１ポリペプチド［Ｉ］を適量の８％食塩水（10
％ヒト血漿アルブミン及び20％Ｄ−マンニトール含有）
に溶かし、この溶液のpHを6.8に調整する。この溶液を
除菌濾過し、バイアルに充填後凍結乾燥して、注射用粉
末を製する。
％ヒト血漿アルブミン及び20％Ｄ−マンニトール含有）
に溶かし、この溶液のpHを6.8に調整する。この溶液を
除菌濾過し、バイアルに充填後凍結乾燥して、注射用粉
末を製する。
参考例１ ヒトIL−１ポリペプチド［Ｉ］生産用形質転換体の作製 前記式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するヒトIL−
１ポリペプチド生産用形質発現プラスミド（pHLP383）
を第１図に示すように構築した。
１ポリペプチド生産用形質発現プラスミド（pHLP383）
を第１図に示すように構築した。
すなわち、参考例５で得た組み換え体プラスミドpHL4か
ら制限酵素Pst Iによりクローン化cDNA部分を切り出
し、更に制限酵素Alu Iを作用させ、第１表に示した塩
基配列の第351番目から下流側の約533bpのDNA断片を
得、更にこれに制限酵素BstN Iを作用させ、第１表の塩
基配列の第351番から第808番までに相当するDNA断片を
単離した。このDNA断片に、常法により合成した次式 ５′−CGATTATGTCATCACCTTTTAG ３′−TAATACAGTAGTGGAAAATC ［１］ 及び次式 ５′−AGGCGTGATGA ３′−CCGCACTACTTCGA ［２］ で示されるオリゴヌクレオチド アダプターを順次T4DN
Aリガーゼを用いて結合させることにより、ヒトIL−１
ポリペプチド［１］をコードする塩基配列の５′末端に
開始コドンATGを付加し、更に終止コドンTGATGAを付加
したDNA断片を得た。このDNA断片をHIL−１断片とい
う。
ら制限酵素Pst Iによりクローン化cDNA部分を切り出
し、更に制限酵素Alu Iを作用させ、第１表に示した塩
基配列の第351番目から下流側の約533bpのDNA断片を
得、更にこれに制限酵素BstN Iを作用させ、第１表の塩
基配列の第351番から第808番までに相当するDNA断片を
単離した。このDNA断片に、常法により合成した次式 ５′−CGATTATGTCATCACCTTTTAG ３′−TAATACAGTAGTGGAAAATC ［１］ 及び次式 ５′−AGGCGTGATGA ３′−CCGCACTACTTCGA ［２］ で示されるオリゴヌクレオチド アダプターを順次T4DN
Aリガーゼを用いて結合させることにより、ヒトIL−１
ポリペプチド［１］をコードする塩基配列の５′末端に
開始コドンATGを付加し、更に終止コドンTGATGAを付加
したDNA断片を得た。このDNA断片をHIL−１断片とい
う。
一方、プラスミドpCT−１［Ikehara,M.et al.,Proc.Na
t.Acad.Sci.USA 81,5956（1984）］に制限酵素Hpa IとA
at IIを作用させtrpプロモーター領域の一部を含む約38
0bpのDNA断片を切り出し、このDNA断片に、常法により
合成した次式 ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTAT ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGC ［３］ で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。
t.Acad.Sci.USA 81,5956（1984）］に制限酵素Hpa IとA
at IIを作用させtrpプロモーター領域の一部を含む約38
0bpのDNA断片を切り出し、このDNA断片に、常法により
合成した次式 ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTAT ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGC ［３］ で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。
この結合DNA断片に、先に調製したHIL−１断片をT4DNA
リガーゼを用いて結合させ、DNA断片を得た。このDNA断
片をプロモーターHIL−１断片という。
リガーゼを用いて結合させ、DNA断片を得た。このDNA断
片をプロモーターHIL−１断片という。
別途に、プラスミドpBR322に制限酵素Ava IとPvu IIを
作用させ、大きなDNA断片（約3.7kbp）を0.7％アガロー
スゲル電気泳動により分離した。このDNA断片の両端をD
NAポリメラーゼＩ（クレノー フラグメント）およびdG
TP,dATP,dCTP,dTTPを用い平滑末端とし、その両端をT4D
NAリガーゼを用いて結合させた。このプラスミドベクタ
ーをpBRS6という。更に、このpBRS6ベクターに制限酵素
Aat IIとHind IIIを作用させ、大きなDNA断片（約3.6kb
p）を単離精製した。
作用させ、大きなDNA断片（約3.7kbp）を0.7％アガロー
スゲル電気泳動により分離した。このDNA断片の両端をD
NAポリメラーゼＩ（クレノー フラグメント）およびdG
TP,dATP,dCTP,dTTPを用い平滑末端とし、その両端をT4D
NAリガーゼを用いて結合させた。このプラスミドベクタ
ーをpBRS6という。更に、このpBRS6ベクターに制限酵素
Aat IIとHind IIIを作用させ、大きなDNA断片（約3.6kb
p）を単離精製した。
そのDNA断片に先に調整したプロモーターHIL−１断片を
T4DNAリガーゼを用いて結合させることにより、ヒトIL
−１ポリペプチド［Ｉ］生産用形質発現プラスミドを構
築した。この形質発現プラスミドをpHLP383と名づけ
た。
T4DNAリガーゼを用いて結合させることにより、ヒトIL
−１ポリペプチド［Ｉ］生産用形質発現プラスミドを構
築した。この形質発現プラスミドをpHLP383と名づけ
た。
この形質発現ベクター（pHLP383）を下記の方法により
E.coli HB101に導入し形質転換体を得た。すなわち、E.
coli HB101をＬブロス（組成:1当たり、トリプトン10
g,酵母エキス5g,NaCl5g,ブドウ糖1g;pH7.2）の5mlに接
種し、37℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の1mlを100
mlのＬブロスに接種し、濁度（吸光度650nm）が0.6にな
るまで37℃で培養した。氷水中で30分間静置後、菌体を
遠心分離により集め、これを50mlの50mM CaCl2に懸濁
し、０℃で60分間静置した。次いで、遠心分離により菌
体を集め、20％グリセリンを含む50mM CaCl2の10mlに再
懸濁した。
E.coli HB101に導入し形質転換体を得た。すなわち、E.
coli HB101をＬブロス（組成:1当たり、トリプトン10
g,酵母エキス5g,NaCl5g,ブドウ糖1g;pH7.2）の5mlに接
種し、37℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の1mlを100
mlのＬブロスに接種し、濁度（吸光度650nm）が0.6にな
るまで37℃で培養した。氷水中で30分間静置後、菌体を
遠心分離により集め、これを50mlの50mM CaCl2に懸濁
し、０℃で60分間静置した。次いで、遠心分離により菌
体を集め、20％グリセリンを含む50mM CaCl2の10mlに再
懸濁した。
この懸濁液に上記の形質発現ベクターpHLP383を添加
し、これを氷水中で20分間,42℃で１分間；室温で10分
間インキュベートした後、LBブロス（組成:1当たり、
トリプトン10g,酵母エキス5g及びNaCl10g,pH7.5））を
加え、37℃で60分間振盪した。その菌体懸濁液の一部を
25μg/mlアンピシリンを含むLB寒天平板に播き、37℃で
一夜培養した後、アンピシリン耐性クローンを選択して
形質転換体を得た。この形質転換体をHB101/pHLP383と
名づけた。
し、これを氷水中で20分間,42℃で１分間；室温で10分
間インキュベートした後、LBブロス（組成:1当たり、
トリプトン10g,酵母エキス5g及びNaCl10g,pH7.5））を
加え、37℃で60分間振盪した。その菌体懸濁液の一部を
25μg/mlアンピシリンを含むLB寒天平板に播き、37℃で
一夜培養した後、アンピシリン耐性クローンを選択して
形質転換体を得た。この形質転換体をHB101/pHLP383と
名づけた。
参考例２ ヒトIL−１ポリペプチド［Ｉ］の製造および精製 参考例１で得た形質転換体HB101/pHLP383をLBブロス中3
7℃で一夜振盪培養した。その菌体懸濁液の10mlを１
の改良M9培地（組成:1.5％Na2HPO4・12H2O,0.3％KH2P
O4,0.05％NaCl,0.1％NH4Cl,2mg/ビタミンB1,0.5％カ
ザミノ酸,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,0.5％ブドウ糖）に接
種し、37℃で１時間培養し、次いでインドール−３−ア
クリル酸を終濃度20μm/mlになるように加え、更に24時
間培養を継続した後、遠心分離により菌体を集めた。菌
体を100mlの0.1％リゾチーム及び30mM NaClを含む50mM
Tris−HC1（pH8.0）緩衝液に再懸濁し、０℃で30分間静
置した後、ドライアイス／エタノール浴での凍結と37℃
での融解を繰り返した後2mlの10％ポリエチレンイミン
を加え静置した。次いで、遠心分離により菌体残渣を除
き、清澄な抽出液を得た。
7℃で一夜振盪培養した。その菌体懸濁液の10mlを１
の改良M9培地（組成:1.5％Na2HPO4・12H2O,0.3％KH2P
O4,0.05％NaCl,0.1％NH4Cl,2mg/ビタミンB1,0.5％カ
ザミノ酸,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,0.5％ブドウ糖）に接
種し、37℃で１時間培養し、次いでインドール−３−ア
クリル酸を終濃度20μm/mlになるように加え、更に24時
間培養を継続した後、遠心分離により菌体を集めた。菌
体を100mlの0.1％リゾチーム及び30mM NaClを含む50mM
Tris−HC1（pH8.0）緩衝液に再懸濁し、０℃で30分間静
置した後、ドライアイス／エタノール浴での凍結と37℃
での融解を繰り返した後2mlの10％ポリエチレンイミン
を加え静置した。次いで、遠心分離により菌体残渣を除
き、清澄な抽出液を得た。
この抽出液に等容量の飽和硫酸アンモニウム水溶液を加
え静置したのち、遠心分離にて沈殿画分を集めた。この
沈殿画分を約100mlの20mM Tris−HC1緩衝液（pH8.0）に
溶解し、同緩衝液に対して透析したのち、予め同緩衝液
にて平衡化されたDEAE−セファロースCL−6Bカラムに負
荷した。同緩衝液にて該カラムを充分洗浄したのち、Na
Cl濃度０〜0.5Mの濃度勾配にて溶出した。IL−１活性を
有する溶出画分を集め、限外濾過にて濃縮したのち、セ
ファクリルＳ−200によるゲル濾過に付い、IL−１活性
を有する画分を集めた。更に、上記のDEAE−セファロー
スを用いるカラム クロマトグラフィー及びセファクリ
ルＳ−200によるゲル濾過を繰り返すことによりヒトIL
−１ポリペプチド［Ｉ］の精製品を得た。
え静置したのち、遠心分離にて沈殿画分を集めた。この
沈殿画分を約100mlの20mM Tris−HC1緩衝液（pH8.0）に
溶解し、同緩衝液に対して透析したのち、予め同緩衝液
にて平衡化されたDEAE−セファロースCL−6Bカラムに負
荷した。同緩衝液にて該カラムを充分洗浄したのち、Na
Cl濃度０〜0.5Mの濃度勾配にて溶出した。IL−１活性を
有する溶出画分を集め、限外濾過にて濃縮したのち、セ
ファクリルＳ−200によるゲル濾過に付い、IL−１活性
を有する画分を集めた。更に、上記のDEAE−セファロー
スを用いるカラム クロマトグラフィー及びセファクリ
ルＳ−200によるゲル濾過を繰り返すことによりヒトIL
−１ポリペプチド［Ｉ］の精製品を得た。
参考例３ ヒトIL−１ポリペプチド［Ｉ］のＮ末端の14個のアミノ
酸を欠失させたポリペプチド［IL−１（N14）］の製造 （１） 生産用形質転換体の作製 参考例１で得た組み換え体プラスミドpHLP383から制限
酵素EcoR IとHind IIIにて、第１表に示した塩基配列の
第398番目から下流側の約422bpのDNA断片を得た。このD
NA断片に、常法により合成した次式 ５′−AAATTATGAGGATCATCAAATACG ３′−TAATACTCCTAGTAGTTTATGCTTAA ［４］ で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。得られたDNA断片を、断片
（Ａ）という。
酸を欠失させたポリペプチド［IL−１（N14）］の製造 （１） 生産用形質転換体の作製 参考例１で得た組み換え体プラスミドpHLP383から制限
酵素EcoR IとHind IIIにて、第１表に示した塩基配列の
第398番目から下流側の約422bpのDNA断片を得た。このD
NA断片に、常法により合成した次式 ５′−AAATTATGAGGATCATCAAATACG ３′−TAATACTCCTAGTAGTTTATGCTTAA ［４］ で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。得られたDNA断片を、断片
（Ａ）という。
一方、プラスミドpCT−１に制限酵素Hpa IとAat IIを作
用させtrpプロモーター領域の一部を含む約380bpのDNA
断片を切り出し、このDNA断片に、常法により合成した
次式 ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTT ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAAATT ［５］ で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。
用させtrpプロモーター領域の一部を含む約380bpのDNA
断片を切り出し、このDNA断片に、常法により合成した
次式 ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTT ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAAATT ［５］ で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。
このDNA断片に、先に調製した断片（Ａ）をT4DNAリガー
ゼを用いて結合させ、DNA断片を得た。このDNA断片を断
片（Ｂ）という。
ゼを用いて結合させ、DNA断片を得た。このDNA断片を断
片（Ｂ）という。
別途に、参考例１で作製したプラスミドpBRS6に制限酵
素Aat IIとHind IIIを作用させ、大きなDNA断片（約3.6
kbp）を単離精製した。
素Aat IIとHind IIIを作用させ、大きなDNA断片（約3.6
kbp）を単離精製した。
このDNA断片に先に調製した断片（Ｂ）をT4DNAリガーゼ
を用いて結合させることにより、形質発現プラスミドを
構築した（第２図参照）。この形質発現プラスミドをpH
LN14と名づけた。
を用いて結合させることにより、形質発現プラスミドを
構築した（第２図参照）。この形質発現プラスミドをpH
LN14と名づけた。
このプラスミドpHLN14を用い、参考例１の方法によりE.
coli HB101に導入し、形質転換体を得た。
coli HB101に導入し、形質転換体を得た。
この形質転換体をHB101/pHLN14と名づけた。
（２） 生産及び精製 前項で得た形質転換体（HB101/pHLN14）をLBブロス中37
℃で一夜振盪培養した。その菌体懸濁液の10mlを１の
改良M9培地（組成:1.5％Na2HPO4・12H2O,0.3％KH2PO4,
0.05％NaCl,0.1％NH4Cl,2ml/ビタミンB1,0.5％カザミ
ノ酸,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,0.5％ブドウ糖）に接種
し、37℃で１時間培養し、次いでインドール−３−アク
リル酸を終濃度20μm/mlになるように加え、更に24時間
培養を継続した後、遠心分離により菌体を集めた。菌体
を100mlの0.1％リゾチーム及び30mM NaClを含む50mM Tr
is−HCl（pH8.0）緩衝液に再懸濁し、０℃で30分間静置
した後、ドライアイス／エタノール浴での凍結と37℃で
の融解を繰り返した後、2mlの10％ポリエチレンイミン
を加え静置した。次いで、遠心分離により菌体残渣を除
き、清澄な抽出液を得た。
℃で一夜振盪培養した。その菌体懸濁液の10mlを１の
改良M9培地（組成:1.5％Na2HPO4・12H2O,0.3％KH2PO4,
0.05％NaCl,0.1％NH4Cl,2ml/ビタミンB1,0.5％カザミ
ノ酸,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,0.5％ブドウ糖）に接種
し、37℃で１時間培養し、次いでインドール−３−アク
リル酸を終濃度20μm/mlになるように加え、更に24時間
培養を継続した後、遠心分離により菌体を集めた。菌体
を100mlの0.1％リゾチーム及び30mM NaClを含む50mM Tr
is−HCl（pH8.0）緩衝液に再懸濁し、０℃で30分間静置
した後、ドライアイス／エタノール浴での凍結と37℃で
の融解を繰り返した後、2mlの10％ポリエチレンイミン
を加え静置した。次いで、遠心分離により菌体残渣を除
き、清澄な抽出液を得た。
この抽出液に硫酸アンモニウムを55％飽和になるように
加えた後静置し、遠心分離にて沈殿画分を集めた。この
沈殿画分を20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）に溶解し、5
mMリン酸緩衝化（pH7.4）生理食塩水溶液（以下、PBSと
いう）に対して透析したのち、セファクリルＳ−200に
よるゲル濾過に付し、IL−１活性を有する画分を集め
た。この溶出画分を20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）に
対して透析し、予め同緩衝液にて平衡化されたDEAE−セ
ファロースCL−6Bカラムに負荷した。同緩衝液にて該カ
ラムを充分洗浄し、更に0.08M NaClを含む同緩衝液に
て洗浄したのち、濃度範囲0.1〜0.2MのNaClを含む同緩
衝液にて、段階的に溶出した。IL−１活性を有する溶出
画分を集め、限外濾過にて濃縮した。更に、トヨパール
HW−55によるゲル濾過を行い、IL−１（N14）の精製品
を得た。
加えた後静置し、遠心分離にて沈殿画分を集めた。この
沈殿画分を20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）に溶解し、5
mMリン酸緩衝化（pH7.4）生理食塩水溶液（以下、PBSと
いう）に対して透析したのち、セファクリルＳ−200に
よるゲル濾過に付し、IL−１活性を有する画分を集め
た。この溶出画分を20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）に
対して透析し、予め同緩衝液にて平衡化されたDEAE−セ
ファロースCL−6Bカラムに負荷した。同緩衝液にて該カ
ラムを充分洗浄し、更に0.08M NaClを含む同緩衝液に
て洗浄したのち、濃度範囲0.1〜0.2MのNaClを含む同緩
衝液にて、段階的に溶出した。IL−１活性を有する溶出
画分を集め、限外濾過にて濃縮した。更に、トヨパール
HW−55によるゲル濾過を行い、IL−１（N14）の精製品
を得た。
参考例４ ヒトIL−１ポリペプチド［Ｉ］のＮ末端の14個のアミノ
酸およびＣ末端の４個のアミノ酸を欠失させたポリペプ
チド［IL−１（N14C4）］の製造 （１） 生産用形質転換体の作製 参考例３で作製した断片（Ｂ）に制限酵素Sau96Iを作用
させ、得られたDNA断片のうち、合成オリゴヌクレオチ
ド アダプター［４］及び［５］と第１表の塩基配列の
第398番目から第769番までに相当するDNAが結合してな
るDNA断片を単離した。
酸およびＣ末端の４個のアミノ酸を欠失させたポリペプ
チド［IL−１（N14C4）］の製造 （１） 生産用形質転換体の作製 参考例３で作製した断片（Ｂ）に制限酵素Sau96Iを作用
させ、得られたDNA断片のうち、合成オリゴヌクレオチ
ド アダプター［４］及び［５］と第１表の塩基配列の
第398番目から第769番までに相当するDNAが結合してな
るDNA断片を単離した。
このDNA断片に、次式 ５′−GGCCACCCTCTATCACTGACTTTCAGATACTGTGATGA ３′−GTGGGAGATAGTGACTGAAAGTCTATGACACTACTTCGA
［６］ で示される合成オリゴヌクレオチド アダプターをT4DN
Aリガーゼを用いて結合させた。
［６］ で示される合成オリゴヌクレオチド アダプターをT4DN
Aリガーゼを用いて結合させた。
このDNA断片を、参考例１で作製したプラスミドpBRS6の
制限酵素Aat IIとHind IIIによる大きなDNA断片（約3.6
kbp）にT4DNAリガーゼを用いて結合させることにより、
形質発現プラスミドを構築した（第３図参照）。この形
質発現プラスミドをpHLN14C4と名づけた。
制限酵素Aat IIとHind IIIによる大きなDNA断片（約3.6
kbp）にT4DNAリガーゼを用いて結合させることにより、
形質発現プラスミドを構築した（第３図参照）。この形
質発現プラスミドをpHLN14C4と名づけた。
このプラスミドpHLN14C4を用い、参考例１の方法によ
り、E.coliHB101に導入し、形質転換体を得た。この形
質転換体をHB101/pHLN14C4と名づけた。
り、E.coliHB101に導入し、形質転換体を得た。この形
質転換体をHB101/pHLN14C4と名づけた。
（２） 生産と精製 前項で得た形質転換体（HB101/pHLN14C4）を用い、参考
例３に記載された方法に準じて培養したのち、菌体抽出
液を得、更に精製操作を行うことによりIL−１（N14C
4）の精製品を得た。
例３に記載された方法に準じて培養したのち、菌体抽出
液を得、更に精製操作を行うことによりIL−１（N14C
4）の精製品を得た。
参考例５ ヒドIL−１ポリペプチド［１］をコードするcDNAのクロ
ーニング及び塩基配列の決定 （１） 急性骨髄性白血病株細胞（HL−60細胞）からの
ヒトIL−1mRNAの調製 HL−60細胞をペトリディッシュ（直径8cm）に１×107個
/10ml/dishの条件で播いた。培養液には10％牛胎児血清
含有のRPMI−1640培地を用い、分化誘導剤としてホルボ
ール−12−ミリステート−13−アセテートとビタミンＡ
酸をいずれも最終濃度として500ng/mlになるように添加
した。37℃で５％炭酸ガス含有空気中、湿度90〜100％
で２日間培養したのち、培養液と浮遊細胞を吸引除去し
た。分化した細胞が付着したディッシュに10％牛胎児血
清含有RPMI−1640培地に誘導剤としてエンドトキシン
（大腸菌由来のリポポリサッカライド）を10μg/ml濃度
に、蛋白合成阻害剤としてシクロヘキシミドを１μg/ml
濃度に添加した培地の10mlを加え、更に５時間培養し
た。培養終了後、培養液を吸引除去し、ディッシュ上に
残った分化細胞を0.5％ラウロイルサルコシン酸ナトリ
ウム,5mMクエン酸ナトリウム及び0.1M2−メルカプトエ
タノールを含む6Mグアニジリウムチオシアネート液で溶
解し、ホモジナイズした。このホモジネートを0.1M EDT
A含有5.7M塩化セシウム水溶液上に重層し、超遠心分離
機（RPS27−２ローター，日立工機）を用い26,500rpmで
20時間遠心し全RNA画分をペレットとして得た。これを
0.35M NaCl,20mM Tris及び20mM EDTAを含む7M尿素液の
少量に溶解し、エタノール沈殿として回収した。
ーニング及び塩基配列の決定 （１） 急性骨髄性白血病株細胞（HL−60細胞）からの
ヒトIL−1mRNAの調製 HL−60細胞をペトリディッシュ（直径8cm）に１×107個
/10ml/dishの条件で播いた。培養液には10％牛胎児血清
含有のRPMI−1640培地を用い、分化誘導剤としてホルボ
ール−12−ミリステート−13−アセテートとビタミンＡ
酸をいずれも最終濃度として500ng/mlになるように添加
した。37℃で５％炭酸ガス含有空気中、湿度90〜100％
で２日間培養したのち、培養液と浮遊細胞を吸引除去し
た。分化した細胞が付着したディッシュに10％牛胎児血
清含有RPMI−1640培地に誘導剤としてエンドトキシン
（大腸菌由来のリポポリサッカライド）を10μg/ml濃度
に、蛋白合成阻害剤としてシクロヘキシミドを１μg/ml
濃度に添加した培地の10mlを加え、更に５時間培養し
た。培養終了後、培養液を吸引除去し、ディッシュ上に
残った分化細胞を0.5％ラウロイルサルコシン酸ナトリ
ウム,5mMクエン酸ナトリウム及び0.1M2−メルカプトエ
タノールを含む6Mグアニジリウムチオシアネート液で溶
解し、ホモジナイズした。このホモジネートを0.1M EDT
A含有5.7M塩化セシウム水溶液上に重層し、超遠心分離
機（RPS27−２ローター，日立工機）を用い26,500rpmで
20時間遠心し全RNA画分をペレットとして得た。これを
0.35M NaCl,20mM Tris及び20mM EDTAを含む7M尿素液の
少量に溶解し、エタノール沈殿として回収した。
この全RNA画分を1mM EDTAを含む10mM Tris−HCl緩衝液
（pH7.4）（以下TE液という）2mlに溶解し、65℃で５分
間加熱した。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加えた
後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平衡化したオリ
ゴ（dT）セルロースカラムに付し、吸着したポリ（Ａ）
mRNAをTE液で溶出した。
（pH7.4）（以下TE液という）2mlに溶解し、65℃で５分
間加熱した。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加えた
後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平衡化したオリ
ゴ（dT）セルロースカラムに付し、吸着したポリ（Ａ）
mRNAをTE液で溶出した。
ここで得られたポリ（Ａ）mRNAを以下の実験に用いた。
（２） cDNAの合成 （１）項で得られたポリ（Ａ）mRNAを鋳型としてグブラ
ーとホフマンの方法［Gene25,263（1983）］に準じてcD
NAを合成した。該ポリ（Ａ）mRNA（６μｇ）を６μの
蒸留水に溶解させ、これに0.6μの100mM水酸化メチル
水銀水溶液を添加し室温で10分間放置した。次いで、20
単位のRNA分解酵素阻害剤（RNasin ,Promega Biotec社
製品）を含む500mM2−メルカプトエタノール液の1.7μ
を添加した。室温で５分間放置したのち、更に10mM M
gCl2,1.25mM dGTP,1.25mM dATP,1.25mM dTTP,0.5mM dCT
P,0.17μＭα−32P−dCTP（比活性,750Ci/mmole）,4μ
ｇオリゴ（dT）12〜18,120単位トリ骨髄性白血病ウイル
ス由来逆転写酵素を含む32μの50mM Tris−HCl（pH8.
3）緩衝液を添加し、42℃で60分間反応させた後、EDTA
を加えて反応を停止させた。フェノール／クロロホルム
混液（1:1）で抽出し、その水層に酢酸アンモニウムを
終濃度2.5Mになるように加え、エタノールにより反応生
成物（sscDNA−mRNA複合体）を沈殿させた。このsscDNA
−mRNA複合体を下記組成の反応緩衝液100μに溶解し
た。
ーとホフマンの方法［Gene25,263（1983）］に準じてcD
NAを合成した。該ポリ（Ａ）mRNA（６μｇ）を６μの
蒸留水に溶解させ、これに0.6μの100mM水酸化メチル
水銀水溶液を添加し室温で10分間放置した。次いで、20
単位のRNA分解酵素阻害剤（RNasin ,Promega Biotec社
製品）を含む500mM2−メルカプトエタノール液の1.7μ
を添加した。室温で５分間放置したのち、更に10mM M
gCl2,1.25mM dGTP,1.25mM dATP,1.25mM dTTP,0.5mM dCT
P,0.17μＭα−32P−dCTP（比活性,750Ci/mmole）,4μ
ｇオリゴ（dT）12〜18,120単位トリ骨髄性白血病ウイル
ス由来逆転写酵素を含む32μの50mM Tris−HCl（pH8.
3）緩衝液を添加し、42℃で60分間反応させた後、EDTA
を加えて反応を停止させた。フェノール／クロロホルム
混液（1:1）で抽出し、その水層に酢酸アンモニウムを
終濃度2.5Mになるように加え、エタノールにより反応生
成物（sscDNA−mRNA複合体）を沈殿させた。このsscDNA
−mRNA複合体を下記組成の反応緩衝液100μに溶解し
た。
反応緩衝液組成： 5mM MgCl2,10mM（NH4）2SO4,100mM KCl,0.15mMβ−ニコ
チンアミド アデニン ジヌクレオチド,40μM dGTP,40
μM dATP,40μM dTTP,40μM dCTP,及び５μｇウシ血清
アルブミン,1.25単位大腸菌リボヌクレアーゼH,24単位
大腸菌DNAポリメラーゼＩを含む20mM Tris−HCl（pH7.
5）緩衝液。
チンアミド アデニン ジヌクレオチド,40μM dGTP,40
μM dATP,40μM dTTP,40μM dCTP,及び５μｇウシ血清
アルブミン,1.25単位大腸菌リボヌクレアーゼH,24単位
大腸菌DNAポリメラーゼＩを含む20mM Tris−HCl（pH7.
5）緩衝液。
該溶解液を12℃で60分間反応させ、これに2.5単位の大
腸菌DNAリガーゼを添加し、更に22℃で60分間反応させ
た。EDTAを加えて反応を停止させた後、上記と同様にフ
ェノール／クロロホルム混液で抽出し、エタノールによ
り反応生成物（dscDNA）を沈殿させ、回収した。
腸菌DNAリガーゼを添加し、更に22℃で60分間反応させ
た。EDTAを加えて反応を停止させた後、上記と同様にフ
ェノール／クロロホルム混液で抽出し、エタノールによ
り反応生成物（dscDNA）を沈殿させ、回収した。
（３） dCテール付加cDNAの調製 （２）項で得られたdscDNAを下記組成の反応緩衝液100
μに溶解させ、37℃で30分間反応させ、dscDNAにdCテ
ールを付加させた。
μに溶解させ、37℃で30分間反応させ、dscDNAにdCテ
ールを付加させた。
反応緩衝液組成： 2mM CoCl2,0.2mMジチオスレイトール,0.1mMα−32P−dC
TP（比活性1Ci/mmole）及び10単位ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを含有する100mMカ
コジル酸ナトリウム（pH7.2）。
TP（比活性1Ci/mmole）及び10単位ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを含有する100mMカ
コジル酸ナトリウム（pH7.2）。
反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール／ク
ロロホルム混液で抽出し、dCテール付加dscDNAをエタノ
ールにより沈殿させ回収した。これを1mM EDTA及び100m
M NaClを含む10mM Tris−HCl（pH7.4）を緩衝液にて、
２μg/mlの濃度に溶解させた。
ロロホルム混液で抽出し、dCテール付加dscDNAをエタノ
ールにより沈殿させ回収した。これを1mM EDTA及び100m
M NaClを含む10mM Tris−HCl（pH7.4）を緩衝液にて、
２μg/mlの濃度に溶解させた。
（４） 組み換え体プラスミドの作製 dGテール付加pBR322（Bethesda Res.Labs.Inc.製）と
（３）項で得られたdCテール付加dscDNAを1.5mlの1mM E
DTA及び100mM NaClを含む10mM Tris−HCl（pH7.4）緩衝
液中、それぞれ1.5μｇ及び0.09μｇ含むように溶解混
合させた後、65℃で10分間,57℃で２時間，さらに45℃
で２時間加温しアニーリングを行い、組み換え体プラス
ミド溶液を調製した。
（３）項で得られたdCテール付加dscDNAを1.5mlの1mM E
DTA及び100mM NaClを含む10mM Tris−HCl（pH7.4）緩衝
液中、それぞれ1.5μｇ及び0.09μｇ含むように溶解混
合させた後、65℃で10分間,57℃で２時間，さらに45℃
で２時間加温しアニーリングを行い、組み換え体プラス
ミド溶液を調製した。
（５） 形質転換体の選択 （４）項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、
E.coli X 1776株を形質転換させた。即ち、E.coli X 17
76株を、ジアミノピメリン酸100μg/ml及びチミジン40
μg/mlを補ったＬ−ブロス（組成:1当りトリプトン10
g,酵母エキス5g,NaCl5g,ブドウ糖1g,pH7.2）20ml中、37
℃で吸光度（600nm）が0.5となるまで培養し、菌体を遠
心分離し、50mM CaCl2含有10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.
3）10mlにて洗浄した。
E.coli X 1776株を形質転換させた。即ち、E.coli X 17
76株を、ジアミノピメリン酸100μg/ml及びチミジン40
μg/mlを補ったＬ−ブロス（組成:1当りトリプトン10
g,酵母エキス5g,NaCl5g,ブドウ糖1g,pH7.2）20ml中、37
℃で吸光度（600nm）が0.5となるまで培養し、菌体を遠
心分離し、50mM CaCl2含有10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.
3）10mlにて洗浄した。
集めた菌体を同じ緩衝液2mlに懸濁させ、０℃で５分間
静置した。この懸濁液0.2mlに上記組み換え体プラスミ
ド溶液0.1mlを添加混合し、０℃で15分間静置し、更に4
2℃で２分間保持した後、上記の培養で用いたのと同一
組成のＬ−ブロス0.5mlを加えて１時間振盪培養を行っ
た。この培養液の一部を取り、上記組成に加えてテトラ
サイクリン（15μg/ml）が添加されたＬ−ブロス寒天平
板に広げ37℃で約12時間培養し、テトラサイクリン耐性
菌を選択してcDNAライブラリーを作製した。
静置した。この懸濁液0.2mlに上記組み換え体プラスミ
ド溶液0.1mlを添加混合し、０℃で15分間静置し、更に4
2℃で２分間保持した後、上記の培養で用いたのと同一
組成のＬ−ブロス0.5mlを加えて１時間振盪培養を行っ
た。この培養液の一部を取り、上記組成に加えてテトラ
サイクリン（15μg/ml）が添加されたＬ−ブロス寒天平
板に広げ37℃で約12時間培養し、テトラサイクリン耐性
菌を選択してcDNAライブラリーを作製した。
（６） クローニング （５）項で得られたcDNAライブラリーから、参考例６で
得た組み換え体プラスミドpRL15からウサギIL−１をコ
ードするクローン化cDNAの断片をプローブとして用いた
コロニーハイブリダイゼーション試験及びハイブリダイ
ゼーショントランスレーショ試験［Maniatis,T.,et a
l.,“MolecularCloning"329（1980）Cold Spring Harbo
r Lab.］によりヒトIL−１ポリペプチドをコードするcD
NAを含むプラスミドを有する形質転換体を選び出した。
得た組み換え体プラスミドpRL15からウサギIL−１をコ
ードするクローン化cDNAの断片をプローブとして用いた
コロニーハイブリダイゼーション試験及びハイブリダイ
ゼーショントランスレーショ試験［Maniatis,T.,et a
l.,“MolecularCloning"329（1980）Cold Spring Harbo
r Lab.］によりヒトIL−１ポリペプチドをコードするcD
NAを含むプラスミドを有する形質転換体を選び出した。
この組み換え体プラスミドをpHL4と名づけた。
（７） クローン化cDNAの塩基配列の決定 クローン化cDNAの塩基配列はM13ファージを用いるジデ
オキシ法にて決定した。M13mp18及びM13mp19（Pharmaci
a P−L Biochemicals社製）をクローニングベクターと
し、M13シークエンシングキット（Amersham Internatio
nal plc社製）を用い、“M13クローニング及びシークエ
ンシング ハンドブック”（Amersham Internationalpl
c社製）に従って実施した。
オキシ法にて決定した。M13mp18及びM13mp19（Pharmaci
a P−L Biochemicals社製）をクローニングベクターと
し、M13シークエンシングキット（Amersham Internatio
nal plc社製）を用い、“M13クローニング及びシークエ
ンシング ハンドブック”（Amersham Internationalpl
c社製）に従って実施した。
その塩基配列及びその塩基配列から推測されるアミノ酸
は下記第１表に示すとおりであり、ヒトIL−１前駆体ポ
リペプチドをコードしている。
は下記第１表に示すとおりであり、ヒトIL−１前駆体ポ
リペプチドをコードしている。
第１〜３番の塩基が開始コドンATGであり、第814〜816
番の塩基は終止コドンTAGである。
番の塩基は終止コドンTAGである。
参考例６ ウサギIL−1cNAの調製 （１） ウサギIL−1mRNAの調製 ウサギにプロピオニバクテリウム アクネス死菌体を１
羽当たり100mgの投与量で静脈内に注入し、８日後に屠
殺した。直ちに開胸気管切開し、気管内に挿入したチュ
ーブを介してリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺洗浄を繰
り返し、肺胞マクロファージを採取した。この肺胞マク
ロファージを10％牛胎児血清含有のRPMI−1640培地に懸
濁させてペトリディッシュ（直径8cm）に１枚当たり１
×107個となるように播き、37℃で５％炭酸ガス含有空
気中、湿度90〜100％で前培養した。１時間の前培養の
後、エンドトキシン（大腸菌由来のリポポリサッカライ
ド）,TPA（ホルボール−12−ミリステート−13−アセテ
ート）及びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が10μ
g/ml,500ng/ml及び１μg/mlとなるように添加混和し、
更に培養を継続した。
羽当たり100mgの投与量で静脈内に注入し、８日後に屠
殺した。直ちに開胸気管切開し、気管内に挿入したチュ
ーブを介してリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺洗浄を繰
り返し、肺胞マクロファージを採取した。この肺胞マク
ロファージを10％牛胎児血清含有のRPMI−1640培地に懸
濁させてペトリディッシュ（直径8cm）に１枚当たり１
×107個となるように播き、37℃で５％炭酸ガス含有空
気中、湿度90〜100％で前培養した。１時間の前培養の
後、エンドトキシン（大腸菌由来のリポポリサッカライ
ド）,TPA（ホルボール−12−ミリステート−13−アセテ
ート）及びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が10μ
g/ml,500ng/ml及び１μg/mlとなるように添加混和し、
更に培養を継続した。
４時間後に培養液を吸引除去し、ディッシュ上に残った
マクロファージから参考例１−（１）項に示した方法に
従ってポリ（Ａ）mRNAを得た。
マクロファージから参考例１−（１）項に示した方法に
従ってポリ（Ａ）mRNAを得た。
ここで得たポリ（Ａ）mRNAをアガロースゲル電気泳動
（ゲル濃度１％,6M尿素存在,pH4）に付し、2.6〜3.7kb
の分子サイズに相当する泳動位置からポリ（Ａ）mRNAを
回収した。
（ゲル濃度１％,6M尿素存在,pH4）に付し、2.6〜3.7kb
の分子サイズに相当する泳動位置からポリ（Ａ）mRNAを
回収した。
（２） cDNAライブラリーの作製 （１）項で得られたポリ（Ａ）mRNAを鋳型として、参考
例５−（２）から（５）に示した方法に準じて、cDNAラ
イブラリーを作製した。
例５−（２）から（５）に示した方法に準じて、cDNAラ
イブラリーを作製した。
（３） クローニング 上記のcDNAライブラリーについて、ウサギIL−１をコー
ドするcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体をスクリ
ーニングするため32P標識cDNAプローブを用いるコロニ
ー・ハイブリダイゼーション試験をハナハンらの方法
［Gene,10,63（1980）］に従って行った。エンドトキシ
ン,TPA及びシクロヘキシミドと共に培養［上記（１）項
参照］した肺胞マクロファージ及びこれらの誘導操作を
省略した肺胞マクロファージからそれぞれ上記（１）項
の方法で得たポリ（Ａ）mRNAを鋳型として、参考例５−
（２）項の方法で合成し、32Pで標識したcDNAをそれぞ
れ誘導プラス及び誘導マイナスプローブとした。この試
験により誘導プラスのプローブと結合し、誘導マイナス
のプローブとはハイブリダイズしない塩基配列を含む組
み換え体プラスミドを有する形質転換体を選別した。
ドするcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体をスクリ
ーニングするため32P標識cDNAプローブを用いるコロニ
ー・ハイブリダイゼーション試験をハナハンらの方法
［Gene,10,63（1980）］に従って行った。エンドトキシ
ン,TPA及びシクロヘキシミドと共に培養［上記（１）項
参照］した肺胞マクロファージ及びこれらの誘導操作を
省略した肺胞マクロファージからそれぞれ上記（１）項
の方法で得たポリ（Ａ）mRNAを鋳型として、参考例５−
（２）項の方法で合成し、32Pで標識したcDNAをそれぞ
れ誘導プラス及び誘導マイナスプローブとした。この試
験により誘導プラスのプローブと結合し、誘導マイナス
のプローブとはハイブリダイズしない塩基配列を含む組
み換え体プラスミドを有する形質転換体を選別した。
次いで、これらの選択されたクローンについてハイブリ
ダイゼーション・トランスレーション試験を上記（１）
項で得たポリ（Ａ）mRNAを用い、ウサギIL−1mRNAと強
くハイブリダイズするクローンを選び出した。
ダイゼーション・トランスレーション試験を上記（１）
項で得たポリ（Ａ）mRNAを用い、ウサギIL−1mRNAと強
くハイブリダイズするクローンを選び出した。
このクローンの有する組み換え体プラスミドをpRL15と
名づけた。
名づけた。
第１図は形質発現ベクターpHLP383の構築工程を示す。
尚、図中の式［１］，［２］，［３］は参考例１で示し
たそれぞれのオリゴ ヌクレオチド アダプターを意味
する。 第２図は形質発現プラスミドpHLN14の構築工程を示す。
尚、図中の［４］，［５］は参考例３で示したそれぞれ
の合成オリゴヌクレオチド アダプターを意味する。 第３図は形質発現プラスミドpHLN14C4の構築工程を示
す。尚、図中の［６］は参考例４で示した合成オリゴヌ
クレオチド アダプターを意味する。
尚、図中の式［１］，［２］，［３］は参考例１で示し
たそれぞれのオリゴ ヌクレオチド アダプターを意味
する。 第２図は形質発現プラスミドpHLN14の構築工程を示す。
尚、図中の［４］，［５］は参考例３で示したそれぞれ
の合成オリゴヌクレオチド アダプターを意味する。 第３図は形質発現プラスミドpHLN14C4の構築工程を示
す。尚、図中の［６］は参考例４で示した合成オリゴヌ
クレオチド アダプターを意味する。
Claims (4)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有するヒトインター
ロイキン１αポリペプチド、下記のアミノ酸配列のＮ末
端より１〜14個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列
を有するポリペプチド、下記のアミノ酸配列のＣ末端よ
り１〜４個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有
するポリペプチド、下記のアミノ酸配列のＮ末端より１
〜14個およびＣ末端より１〜４個のアミノ酸残基が欠失
したアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はそのポリ
ペプチドの生理的に許容される塩を有効成分とする感染
症予防・治療剤。 Ser Ser Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile Thy Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp Glu Thr His Gly Thy Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala 〔Ｉ〕 - 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列
〔Ｉ〕を有するヒトインターロイキン１αポリペプチド
又はそのポリペプチドの生理的に許容される塩を有効成
分とする特許請求の範囲第１項記載の感染症予防・治療
剤。 - 【請求項３】特許請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列
〔Ｉ〕のＮ末端より１〜14個のアミノ酸残基が欠失した
アミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのポリペプチ
ドの生理的に許容される塩を有効成分とする特許請求の
範囲第１項記載の感染症予防・治療剤。 - 【請求項４】特許請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列
〔Ｉ〕のＣ末端より１〜４個のアミノ酸残基が欠失した
アミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのポリペプチ
ドの生理的に許容される塩を有効成分とする特許請求の
範囲第１項記載の感染症予防・治療剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81279685A | 1985-12-23 | 1985-12-23 | |
| US812796 | 1985-12-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62246522A JPS62246522A (ja) | 1987-10-27 |
| JPH07100663B2 true JPH07100663B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
ID=25210652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61305005A Expired - Fee Related JPH07100663B2 (ja) | 1985-12-23 | 1986-12-19 | インタ−ロイキン１を有効成分とする感染症予防・治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07100663B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1329119C (en) * | 1988-03-29 | 1994-05-03 | Milton David Goldenberg | Cytotoxic therapy |
| DK172424B1 (da) * | 1988-07-29 | 1998-06-08 | Otsuka Pharma Co Ltd | IL-1alfa-Derivater, farmaceutisk præparat omfattende sådanne derivater, anvendelse af IL-1alfa-derivater, DNA sekvenser kod |
| ZA902663B (en) * | 1989-04-07 | 1991-12-24 | Syntex Inc | Interleukin-1 formulation |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3683186D1 (de) * | 1985-04-25 | 1992-02-13 | Hoffmann La Roche | Rekombinantes humaninterleukin-1. |
-
1986
- 1986-12-19 JP JP61305005A patent/JPH07100663B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62246522A (ja) | 1987-10-27 |
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