JPS62292726A - インタ−ロイキン１を有効成分とする鎮痛・消炎剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はインターロイキン１又はインターロイキン１様
物質をイ「効成分とする鎮痛・消炎剤に閃する。

インターロイキ／ｌ（以下１ｔ−１と略記することもあ
る。）はＴ細胞やＢ細胞の増殖分化を促進させ、またＴ
　４１１１　胞に作用してリンホカイン、特にインター
ロイキン２の産生を促進させる効果をイＴ　Ｌ　、抗体
産生や細胞性免疫のユ１産に重要な役割を果たす因子の
一つと考えられている［５ｔａｒｕｃｈ、Ｍ、Ｊ、、ａ
ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３０，２＋９１（
１９８３＞１゜その他、プロスタグランジンＩＣやコラ
ゲナーゼの産生促進、繊維対細胞の増殖促進、又はイン
ターロイキ７２やインターフェロンの打するＮＫ（ナチ
ュラルキラー）細胞活性化作用を増強させる効果がある
と報告されている［　Ｓ；ｗｏｎ、Ｐ、Ｌ、　。

ｅｉ　　ａｌ、、　　″　Ｌｙｗｐｈｏｋｉｎｅｓ−ｖ
ｏｌ、Ｇ、ｐ、４７（１９８２）八ｃａｄｃｍ　１ｃＰ
ｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、］。

本発明者らは、インターロイキン１について、税金研究
の結果、インターロイキン１及びインターロイキン１様
物質が優れた鎮静・消炎作用を示すことを見い出し、本
発明を完成した。

本発明の対象物質としては、下記のアミノ酸配列をイｆ
するヒト　インターロイ↑・７１１′リベプヂド Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｓｃｒ　　
Ｐｈｃ　　Ｌｅｕ　　Ｓｃｒ　　へＳｎ　　ＶａｔＬ、
ｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｈｃ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｉｌ
ｅ　Ｉｌｃ　Ｌ、ｙｓ　ＴｙｒＧｌｕ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ
　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　、ＡｓＰ　Ａｌａ　Ｌｃｕ　Ａｓｎ
　Ｇ１ｎ５ｃｒ　ｌｉｅ　Ｉｌｅ　Ａｒｉ　Ａｌａ　Ａ
ｓｎ　ＡＳｐ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　１．ｅｕＴｈｒ　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　＋、ｅ
ｕ　Ａｓｐ　ＧｌｕＡｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　
ＡＳ＋）　％１ｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｌ：Ｌ　Ｔｙｒ　ＬＶ
ＳＳｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　八ｓｐ　　Ａｓｐ　
　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｔｌ
ｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｃ　Ｓｃｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈ
ｒ　Ｇｌｎ　１．ｅｕ　ＴｙｒＶａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ
　Ｇｉｎ　ＡＳＰ　Ｇｌｕ　ＡｓＰ、　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ
　ＶａｌＬｃｕ　Ｌｃｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ〜ｌｅｔ　Ｐ
ｒｏ　にｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ丁ｈｒ　　Ｉｌ
ｅ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｓｃｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈ
ｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　ＬｃｕＰｈｅ　Ｐｈｅ　Ｔ
ｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｂｒ　１ｌｉｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｙｓ　ＡｓｎＴｙｒ　Ｐｈｅτｈｒ　Ｓｃｒ　Ｖａｔ　
Ａｌａ　）Ｉｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ＬｅｕＰｈｅ　Ｉ
ｌｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｙ
ｒ　Ｔｒｐ　ＶａｌＣｙｓ　Ｌ、ｃｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｃｒ　目ｅ　ＴｈｒＡｓ
ｐ　　Ｐｈｅ　　Ｇｉｎ　　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌ
ｕ　　Ａｓｎ　　Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　　［１コおよび
その鎮痛・消炎活性部位を有する。１？リベプ、↓ チド２例えばそのＮ末端より１〜舛個のアミ／Ｍおよび
／又はＣ末端より１〜ｆ個のアミノ酸残基が欠失したｊ
！リベプチドが挙げられる。また、これら−トリペプチ
ドの生理的に許容される塩、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アルギニノ、カフェイン、プロ力イン
、塩酸、グルフン酸等との塩も本発明の対象物質に含ま
れる。本発明の対象物質であるインターロイキン１およ
びインターロイキン１様物質は、後記参考例に示した方
法、特願昭ＧＯ−１７１４９３，特願昭ｆＥＯ−２００
８９↓に記載した方法により製造することができる。

以下に本発明の対象物質の鎮届、消炎作用につき実験例
を挙げて具体的に説明する。

尚、本実験においては、参考例２で得られたインターロ
イキノ１ポリペプチド全ヒトＩＬＬ、＃各個３で１−＞
らえたｊてリペブチドをヒトｌ　Ｌ−１（Ｎ＋りと表示
する。

実験例１．　抗炎症作用 ウィスター系雄性ラット（体重１１０〜＋３０ｆｆ）を
用イ、す７ｆｆｉｔ、Ｈ＆１ｉｆｆｌ（０，１％　セラ
ー’ｆ−ｙ　トｏ、Ｉ５Ｍ　Ｎａｉ合イｒ）に試験薬を
溶解し、静脈内に投与した。１時間後に１％力ラうニ／
水溶液０１１１をラットの右側後肢思量皮下に注射して
、足前浮腫を惹起させた。カラゲニンのｉ−１：耐直前
および注射後１，２゜３．４および５時間に後肢足容積
を測定し、ｉ、ＩＱ＋直前をノ、（準として各時間後の
肚脹率を算出した。

尚、コントロール群にはリン酸緩衝液（０，１％ゼラチ
／とＯ，１５Ｍ　ＮａＣ１含仔）を静脈内に没１）シた
。

レー果は、コントロール１ｉ丁に対する試験薬投与７＋
１の抑制率として示した。結果を第１表に示した。

第１表 実験例２　鎮痛作用 ５ｔｄ−ｄｄ’／系１１１１性？’／ス（体ｒｆＣ１８
〜２２ｇ）　０）腹腔内に５％エタ／−ル中０．０３％
フェニルキ／ン液０．１ｍｌ／　ＩＯｇ＜＋重を注入し
、その５分後ヨリ２０分後迄の１５分間に亘りライジン
グ症伏の発現回数を計測した。試験薬は生理食塩水に溶
解し、フェニル↑・ノン注入５分前に静脈内に投与した
。コント【＋　−ルｌ：Ｔには生理食塩水を投与した。

結果は、コントロール群のライジング数に対する試験薬
投与ｊ：ηのライジング数の抑制率で表わした。

［参考文献：　Ｅ、Ｓｉａｇｉｕｎｄ、　Ｒ，Ｃａｄｍ
ｕｓ　ａｎｄ　Ｇ、Ｌｕ：Ｉ’ｒｏｃ、Ｓｏｃ、ＥＸＰ
、旧ｏ１．Ｍｅｄ、９５．７２９（１９５７）コ結果を
第２表に示した。

第２表 上記の実験結果から明らかなように本発明の対象物グ１
は低用量にて極めて優れた４霜・消炎作用を示し、鎮痛
剤、消炎剤として使用されｉひる物質である。更に慢性
関節リウマチ、変形性関節症。

エリテマトーデス等の治療剤としても使用され得る。

本発明の対象物質の投与形ゴとしては非経口役ノｊが好
ましい。その投与Ｌｔは症状２年令により異なるが、０
．０１〜ＧＯＯ１１ｇ／　ｋｇ／日好ましくは０．１〜
２００μｇ／　ｋｇ／口である。

本発明の対象物質の製剤化にあたっては、溶液又は凍結
乾燥品が好ましい。その際に、賦形剤や安定化剤を添加
するのが好ましい。安定化剤としては、例えばアルブミ
／、グ「Ｊプリン、ゼラチン。

ブ「Ｊクミン、ブＩＪタミノ塩、グルコース、ガラクト
ース、キンローズ、マンニトール、クルク［１）１’ｌ
、）レバロース、デキストラン　２　ト’　ｎ↑・ンエ
ヂルデンブン、非イオンｙｌＩ１７１′ｉ活性剤（，１
′リオキンエチレ／脂肪酸エステル、ポリオ１−７毛チ
レ／γルキルエーテル、ポリオキンエチレンアル１ルフ
ェニルエーテル、ポリオキシエチレンンルビタン脂肪酸
エステル、ポリオキンエチレングリセリ／１１１ｉ　Ｕ
ｉ　１％ｔエステル、ポリオキシエチレノ硬化ヒマノ浦
、ポリオキシエチレンヒマン油、ポリオキンエチレ／ポ
リオキンプロビレ７アルキルエーテル。

ボリオヤシエチレンポリオキンプロピレ／ブロック−！
【リマー、ソルビタ／脂肪酸エステル、シ、糖脂肪酸エ
ステル、グリセリノ脂Ｕｊ酸ニス１ル）等が挙げられる
。

また、本発明の対象物質は、製剤上の工夫をすることに
より、経口投与及び噴石吸入ら可能である。

製剤例 ヒトＩＬ−１ポリペブヂドをＭ＋；ｔの８％食ニー水（
１０％ヒト血京アルブミ／及び２０％Ｄ　−−／　７　
二）　−ル含自−）に７ｔＩかし、この溶液のＩ）１１
を６８にユ′Ｉ整する。この溶液を除菌−２過し、バイ
アルに充１ｉ１ｆを（中結乾燥して、よ１１７川も）末
を製する。

参考例１ ヒ）ＩＬ−１ポリペプチド生産用形質転換体の作製式［
１］で示されるアミノ酸配列を仔するヒトＩＬ−１ポリ
ペプチド生産用形質発現プラスミド（ｐＨＬＰ３８３）
を第１図に示すように構築した。

すなわち、参考例４で得た組み換え体プラスミドｐＨＬ
４から制限酵素ｐｓｔｌによりクローン化ｃ　ＤＮＡ部
分を切り出し、更に；ｔ（Ｉ限酵素＾１ｕｌを作用させ
、第３表に示した塩バ配列の第３５１番目から下流側の
約５３３ｂｐのＤＮＡ断片を得、更にこれに制限酵素Ｂ
ｓｔＮＩを作用させ、第３表の塩基配列の第３５１番か
ら第８０８番までに相半するＤＮＡ断片をｉｔ　離した
。このＤＮＡ断片に、常法により合成した次式５式％［
］ 及び次式 ５’−ＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＡ　　　　　　　　　［■
］３’−ＣＣＧＣＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡ ｔ示されるオリゴヌクレオチドアダプターを順次Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、ヒトＩＬ
−１ポリペプチド［１］をコードする塩Ｊλ配列の５′
末端に開始コドンＡＴ　Ｇを付加し、更にＬ’　ｔコド
ンＴＧＡＴＧＡを付加したＤＮＡ断片を得た。

このＤＮＡ断片をＩＩＩＬ−１断片という。

一方、プラスミドｐＣＴ−ｌ　［１ｋｃｈａｒａ、Ｌｅ
ｔ　ａｌ、。

Ｉ’ｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾８１，
５９５Ｇ（１９８↓）コに制限酵素１１ｐａｌと＾ａｔ
ｌｌを作用させｔｒｐプロモーター領域の一部を含む約
３８０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、このＤＮＡ断片に
、フエ法により合成した次式５式％［］ で示されるオリゴスクレオチド　アダプターをＴ４１）
ＮＡリガーゼを用いて結合させた。

この結合ＤＮＡ断片に、先にユリ製したＩＩＩＬ−１断
片をＴ４１）ＮＡリガーゼを用いて結合させ、ＤＮＡ断
片を得た。このＤＮＡ断片をプロモーター１１１Ｌ−１
断片という。

別途に、プラスミドＰ［１Ｒ３２２に制限酵素、へｖａ
ｌとｐｖｕ　ＩＩを作用させ、大きなりＮＡ断片（約３
．７ｋｂｐ）を０．７％アガロースゲル電気泳動により
分離した。

このＤＮＡ断片の両端をＤＮＡポリメラーゼ■（クレノ
ー　フラグメント）及びｄＧＴＰ、　ｄＡＴｌ）、　ｄ
ＣＴＰ。

ｄＴＴＰを用い平滑末端とし、その両端をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合させた。このプラスミドベクターを
ｐｎＲｓ（ｉという。更に、このｐ［１Ｒｓｏベクター
に制限酵素Ａａｔｌｌと１ＩｉｎｄＩ［Ｉを作用させ、
大きなりＮＡ断片（約３．ｆ３ｋｂｐ）を単離精製した
。

このＤＮＡ断片に先に調整したプロモーター１１１Ｌ−
１断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることに
より、ヒトＩＬ−１ポリペプチド［Ｉ］生産用形質５！
現プラスミドを構築した。この形質発現プラスミドをｐ
ＨＬＰ３８３と名づけた。

この形質発現ベクター（ｐＨＬＰ３８３）を下記の方法
によりＥ、ｃｏｌｉ　ｌ１ｆｌｌ旧に４人し形質転換体
を得た。

ずなわち、Ｅ、ｃｏｌｉ　１１１１１０１をＬプロス（
組成：１１当たり、トリプトン１０ｇ。酵母エキス５ｇ
、ＮａＣ１５ｇ、　　ブドウ糖１　ｇ；　ｐＨ７，２）
の５１に接種し、３７℃で一夜培養した。その菌体懸濁
液の１層１を１００１のしプロスに接種し、濁度（吸光
度Ｇ５０ｎｍ）が０．６になるまで３７°Ｃで培養した
。氷水中で１３０分間静置後、菌体を遠心分離により集
め、これを５０１の５０ｍＭｃａｃ１：に懸濁し、０℃
で６０分間静置した。次いで、遠心分離により菌体を集
め、２０％グリセリンを含む５０ｍＭ　ＣａＣ＋　２の
１０１に再セ濁した。

この懸濁液に」−記の形質発現ベクターＰＩＩＬＩ’３
８３を添加し、これを氷水中で２０分間、４２℃で１分
間。

室潟でＩＯ分間イ／キュベートした後、Ｌ、Ｉｌプロス
（組成：１１当たり、トリプトンｌｏｇ、酵１８上エト
ス５ｇ及びＮａＣＩ　ＩＯｇ　、　　ｐＨ７，５）　）
を加え、３７℃で６０分間振盪した。その菌体懸濁液の
一部を２５μｇ／■；ア／ビシリ／を含む１．１３寒天
平板に１１１き、：（７℃で一夜培養した後、アンピシ
リンＮＪ　ｔｌクロー／を選ｔＲして形質転換体を得た
。この形質転換体を１１り１０１／ＰＩＩＬｒ’３８３
と名づけた。

参考例２ ヒトＩ　＋、、　−１＝七すベブヂドの装造及び精製参
考例１で得た形質転換体ｌＩｎ１Ｏ１／　ｐＨＬｌ”３
８３を１−Ｂ）ｒ＋ス中中子７℃一枚’＆　！１′Ｌ培
養した。その菌体懸濁液の１０１を１１の改良〜１９培
」１（組成゛１．５％Ｎａｚ１１１）０４・＋２１１２
０　、０．３％ＫＩＴ２ＰＯ４，０，０５％ＮａＣ１゜
０．１％Ｎｌｌ４ＣＩ　、　　２　ｍ（Ｈ／　Ｉビタミ
７１１＋　、　０．５％カザミノ酸、　　２　ｍＭ　Ｎ
１ｇ５Ｏ４，Ｏ，１ｍＭ　ＣａＣ＋２　、０．５％ブド
ウ結）に接種し、３７°Ｃで１時間培養し、次いでイン
ドール−３−アクリル酸を終濃度２０μｇ／ｍｌになる
ように加え、更に２４時間培養を継続した後、遠心分離
により菌体を集めた。菌体を１００１の０．１％リゾデ
ーム及び３０ｍＭ　ＮａＣＩを含む５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ
　ｓ　−１１ＣＩ　　（ｐＨａ、ｏ）緩衝液に再懸濁し
、０℃で３０分間静置した後、ドライアイス／エタノー
ル浴での凍１１−と３７゛Ｃでの融解を謀り返した後２
１の１０％・１？リエヂレノイミ／を加え静置した。次
いで、遠心分離により菌体残渣を除き、清澄な抽出液を
得た。

この抽出液に等容ｆｉｋの飽和硫酸ア／そニウム水溶液
を加え１７Ｐ置したのち、遠心分離にて沈殿画分を集め
た。この沈殿画分を約１００ｍ１の２０ｍＭ　Ｔ　ｒ　
ｉ　５−ＩＩＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、同１
’ｌ衝我に対して透析したのち、予め同緩衝液にて平衡
化されたＩ］シＡＥ−セファＩ’ｆｆ−スＣＬ−０１３
カラムに負荷した。

同ｊ公衝液にて該カラムを充分洗呼したのち、ＮａＣ１
０度０〜０　、５　Ｍの０度勾配にて溶出した。　　Ｉ
Ｌ−１活性を存する溶出画分を集め、限外濾過にてＣ縮
したのら、セファクリルＳ−２００によるゲル７、′ｉ
過に付し、ＩＬ−１活性を有する両分を集めた。更に、
上記のＤＩシＡＥ−セフ１０−スを用いるカラム　クロ
マトグラフィー及びセファクリルＳ−２００によるゲル
濾過を繰り返すことにより精製品を得た。

１１の培養により得た菌体ＩＩＩ！出液より、約１５１
ｇのｆ＋’ｉ製ヒトＩｆ−１ポリペプチド［１が得られ
た。

このユリ製品中には、前記の５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動分析によりＩＬ−１活性をイ１−する単
一の蛋白質バンドのみが検出され、不純蛋白質は認めら
れなかった。尚、ＩＬ−１活性は、マイ）　−ゲンによ
るマウス胸腺細胞分裂作用を促進させる生物活性、すな
わちす／パ球活性化Ｖ１子（１，ＡＰ　）活性により２
１価した。

（以下余白） 参考例３ ヒ）ＩＬ−１ポリペプチドのＮ末端の１４個のアミノ酸
を欠失させたポリペプチド［ＴＬ−１（ＮＩ４）］の製
５（１）生産用形質転換体の作製 参考例１で１ｒＪた組み換え体プラスミドＰ１１１、Ｐ
２Ｓ５から制限酵素ＥｃｏＲＩとｌｌｉｎｄｍにて、第
３表に示した塩ノλ配列の第３９８番目から下流側の約
４２２ｂｐの１）　７ＩＪＡ断片を得た。このＤＮＡ断
片に、′１１Ｉ′ｌノξにより合成した次式 で示されるオリゴヌクレオチド　アダプターをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させた。得られたＤ　Ｎ　Ａ断
片を、断片（Δ）という。

一方、プラスミドｐＣＴ−１［１ｋｅｈａｒａ、Ｍ、ｅ
ｔ　ａｌ、。

１’ｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾Ｉｌ＋
、５９５０（ｌＯｌｌ↓）］に制限域の一部を含む、豹
３８０ｂｐのＤＮＡ断片をソノリ出し、このＤＮＡ断片
に、；δ゛法により合成した次式５式％［：］ で示されるオリゴヌクレオチド　アダプターをＴ４ＤＮ
Δリガーゼを用いて結合させた。

このＤＮＡ断片に、先にユ２製した断片（Δ）をＩ４１
）ＮＡＩＪガーゼを用いて結合させ、ＤＮＡ　！ｆｉ片
を得た。このＤＮＡ断片を断片（ｎ）という。

別途に、参考例１ｌｌ）で作製したプラスミドｐｎＲ５
Ｇに制限酵素＾ａｔｌｌと１ＩｉｎｄｌＩＩを作用させ
、大きなＩ）ＮＡＡ断片約３．ＩＥｋｂｐ）を単離精製
した。

このＤＮＡ断片に先に調製した断片（Ｉ３）をＴ４Ｄ　
Ｎ　Ａリガーゼを用いて結合させることにより、形質発
現プラスミドを１１Ｙｔ築した（第２図参照）。

この形質発現プラスミドをｐＨＬＮＩ↓と名づけだ。

このプラスミドｐＨＬ旧↓を用い、参考例１ｉｔ）の方
法によりＥ、ｃｏｌｉ　ＩＩＩＩＩＯ＋に１８人し、形
質転換体を得た。

この形質転換体を１１Ｂ１０ｔ／ｐＨＬ＼１４と名づけ
だ。

（２）　　生産及び精製 前Ｉｎ　テ得り形’？ｔ　転換体（＋１１１１０１／　
ｐＨＬＮ＋４）を！、【３プロス中３７°Ｃで一夜振田
培養した。その菌体懸濁液の１０１を１１の改良Ｍ３培
地（ｌｉｌ成薯５ＬＡＮａ２１１ＰＯ４・ｌ２Ｈｚ０．
０．３％Ｋ）１２１’０４，０．０５％　ＮａＣｌ　　
。

０．１％Ｎ１１４ＣＩ　、　２　ｍｇ／　ｌビタミンＡ
酸、０．５％カザミノ酸、　２　ｍＭ　ＭｇＳＯ４，Ｏ
，１ｍＭ　ＣａＣ１２、０，５％ブドウ糖）に接穂し、
３７℃で１時間培養し、次いでインドール−３−アクリ
ル酸を終Ω度２０μｇ／菖１になるように加え、更に２
４時間培養を継続した後、遠心分離により菌体を集めた
。菌体をｌｏｏｍ　ｌの０．１％リゾチーム及び３０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−１１ＣＩ　　（
ｐＨ８，０）緩衝液に再竪濁し、０℃で３０分間り置し
た後、ドライアイス／エタノール浴での凍結と３７℃で
の融解を繰り返した後、２１１の１０％ポリエチレンイ
ミ／を加え静置した。次いで、遠心公刊により菌体残渣
を除き、清澄な抽出液を得た。

この抽出液に硫酸アンモニウムを５５％飽和になるよう
に加えた後静置し、遠心分数にて沈殿画分を集めた。こ
の沈殿画分を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ緩衝、ｆｔ
（ｐＨ８，０）に溶解し、５ｍＭリン酸緩衝化（ｐ１１
７．４）生理食塩水溶液（以下、１）Ｉ３Ｓという）に
対して透析したのち、セファクリルＳ−２００によるゲ
ル濾過に付し、ＩＬ−１活性を有する両分を集めた。こ
の溶出画分を２０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣＩ　
緩衝１ｆｆｌ（ｐｌ＋８．０）に対して透析し、予め同
鋼衝液にて平衡化されたＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セファ０−ス
ＣＬ−ｆＥＢカラムに負荷した。同緩衝液にて譲カラム
を充分洗７１シ、更に０．０８Ｍ　　ＮａＣ］を含む同
緩衝液にて洗ン争したのち、へ度範囲０．１〜０．２Ｍ
のＮ　ａ　Ｃ＋を含む同緩衝液にて、段階的に溶出した
。ＩＬ−１活性を有する溶出画分を集め、限外濾過にて
濃縮した。更に、トヨバールＩＩＷ−５５によるゲル濾
過を行い、精製品を得た。

この精製品を前記の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動分析に付したところ、ＩＬ−１活性を有する単一
の蛋白質バンドのみが検出された。

（以下余白） 参考側４ ヒトＩＬ−１１？リペブチドをコードするｃＤＮＡのク
ローニング及び塩基配列の決定 ＨＬ　−８０細胞をペトリディッシュ（直径８Ｃ＠）に
ｌＸｌ０’個／　ｌ０ｍ１／　ｄｉｓｈの条件で播いた
。培養液にはｌＯ％牛脂児血清含イｒのＲＰＭＩ−１６
４０培地を用い、分化誘導剤としてホルｊ？−ルー１２
−ミリステート−１３−アセテートとビタミンＡ酸をい
ずれも最終り度として５００ｎｇ／　ｍｌになるように
添加した。３７゛Ｃで５％炭酸ガス含イＩ−空気中、７
す度９０〜１００％で２日間培養したのち、培養液と浮
遊細胞を吸引除去した。分化した細胞が付着したディツ
シュにＩＱ％牛脂児血清含有ＲＰＭ１−１６４０培地に
誘導剤としてエンドトキシン（大腸菌由来のりボボリサ
ブカライド）をＩＯμｇ／ｍｌ濃度に、■白合成阻害剤
としてシクロへキンミドを１Ｍｇ／ｍｌＱ度に添加した
培地のｌ０ｍ１を加え、更に５時間培養した。培養終了
後、培養液を吸引除去し、ディツシュ上に残った分化細
胞を０．５％ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム及び０．１Ｍ　２−メルカブトエ
タ／−ルを含む６へ１グアニジリウムチオシアネート液
で溶解し、ホモジナイズした。このホモジネートを０．
ＩＭ　ＥＤＴＡ含イｒ５．７Ｍ塩化セシウム水溶液上に
重層し、超遠心分子：１機（ＲＰＳ２１−２０−ター、
日立工機）を用い２０，５００ｒｐｍで２０　Ｉ］４７
間遠心し全ＲＮＡ画分をペレットとして得た。これを０
．３５Ｍ　　ＮａＣ］、　２０ｍＭ　ＴｒｉＳ及び２０
ｍＭ　ｒＥ［）ＴＡを合む７　Ｍ尿素液の少量に溶解し
、エタノール沈殿として回収した。

この全ＲＮＡ画分を１　ｍＮＩ　ＥＤＴＡを含むｌ　Ｏ
ｍ　ＭＴｒｉｓ−１１ＣＩ　Ｂｍ液（ｐＨ７、↓）（以
下Ｔｔ＞ａという）２１に溶解し、６５℃で５分間加熱
した。これにＮａＣ］溶液を０　、５　Ｍとなるように
加えた後、あらかじめ０．５Ｍ　ＮａＣＩをＣむＴ＋：
液で平衡化したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｆ、
ｒシ、吸「）シた・ｊ！す（Ａ　）　ｍ　ＲＮ　ＡをＴ
ＩＥｉｆｆｌで溶出した。

ここで得られた。１′す（Ａ）　ｍ　Ｒゝ、Ｊ　Ａを以
下の実験に用いた。

（２）　ｃＤＮＡの合成 （１）項で得られたポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを１Ｊｊ型と
してグブラーとホフマンの方法［Ｇａｎｃ２５，２０３
（１９８３）コにべτ（じてｃｌ）ＮＡを合成した。該
ポリ（Ａ　）　ｍ　ＲＮ　Ａ（６μｇ）を６μβの蒸留
水に溶解させ、これに０．６ｕｌの１００ｍＭ水酸化メ
チル水銀水＋８液を添加し室潟で１０分間放置した。次
いで、２Ｑ！ｌｊ位のＲＮ　Ａ分解酵素阻害剤（ＲＮａ
ｓ＋ｎ■、Ｉ’ｒｏｍｅｇａ１１；ｏｔｃｃ？Ｊ：　”
Ｊ’Ｊ品）を含む５００ｍＭ　２−メルｈブトエタノー
ル液の１．７μａを添加した。室、−で５分間放置した
のち、更に１０ｍＭ　ＭＩｒＣ１２，１，２５ｍＭ　ｄ
ＧＴＰ、　１．２５ｍＭ　ｄＡＴｒ’。

１．２５ｍＭ　ｄＴＴＰ、　０．５ｒｎＭ　ｄｃＴｒ’
、ｏ、Ｉ”ｌｕＭ　α−”Ｉ’−ｄＣＴＰ　（比活性、
　７５０Ｃｉ／　ｍｍｏｌａ）　、　４　ｕｒｒオリゴ
（ｄＴ）　１２〜＋８．　１２０単位トリ骨髄性白１ｆ
ｆｌ病ウィルス１１１来逆転η酵素を含む３２ｕｌの５
０ｍＬｊ　Ｔｒ　ｉ　５−１１ＣＩ（ｐ１１８．３）緩
衝液を添加し、４２°Ｃで６０分間反応させたｌ、ＥＤ
ＴＡを加えて反応を停止させた。フェノール／クロｒＪ
ホルム混液（１：Ｉ）で抽出し、その水層に酢酸アンモ
ニウムを終濃度２．５Ｍになるように加え、エタノール
により反応生成物（ｓ　ｓ　ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ　ＦＭ
会合体を沈殿させた。このｓ　ｓ　ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ
複合体を下記組成の反応緩衝液１００μβに溶解した。

反応緩衝液組成： ５　　ｍＭＭｆｆｃ！　２．　　　ｌ０ｍＭ　　　（Ｎ
ＩＬ）ｚｓＯａ、　　　１００ｍＮ１ＫＣＩ、　Ｏ，１
５ｍＭβ−ニコチ／アミ）’　　７デ二／　ジヌクレオ
チド、４０μＭ　ｄＧＴＰ、　１ｏｔｔ〜１ｄＡＴＰ、
　４０μＭ　ｄＴＴＰ、　４０μＭｄＣＴＰ、及び５μ
ｇウシ１ｆｉｌ　’ｆ？？アルブミン、　１．２５！ｌ
’−位大腸菌リボヌクレアーゼ１１．２４！ｌ”−位大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
１１ＣＩ　（ｐｌｒ７．５）　’ｔ’Ｄ−衝液。

：新液１′溶解液を１２℃で６０分間反応させ、これに
２．５単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼを添加し、更に２２
°Ｃで６０分間反応させた。Ｅ　ｔ）　Ｔ　Ａを加えて
反応を停止させた後、上記と同様にフェ／−ル／クロロ
ボルム混液で抽出し、エタノールにより反応生成物（ｄ
ｓｃＤＮＡ　）を沈殿させ、回収した。

（３）　　ｄｃ７−−ル付加ｃＤＮＡの：Ａ製Ｉ２Ｊ項
で得られたｄｓｃＤＮＡを下記組成の反応緩衝液１００
μ！に溶解させ、３７℃で３０分間反応させ、ｄ　ｓ　
ｃ　ＤＮＡにｄＣテールを付加させた。

反応緩衝液組成： ２　ｍＭ　ＣＯＣｌ２．０．２ｍ〜１ジチオスレイトー
ル。

０、ＩｍＭ　α−”Ｉ’−ｄｃＴＰ（比活性Ｉ　Ｃｉ／
　ｓｍｏｔｅ）及び１０屯位ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトラ／スフェラーゼを含有する１００ｍＭ力；
ｌジル酸ナトリウム（ｐＨ７，２）。

反応はＩＥＩ）ＴＡ水溶液を＞Ｅ加して停止させ、フェ
ノール／クロロ；ｔルム混液で抽出し、ｄＣゾール付付
加　ｓ　ｃ　Ｉ）ＮＡをエタノールにより沈殿させ回収
した。これをＩ　ｍＭ　Ｉ”：ＤＴＡ及び１００ｍＭ　
ＮａＣ１を含むｌ０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣＩ
　（ｐｌ＋　７．４Ｈ：Ｑ新液にて。

２μｇ／ｍｌの０度に溶解させた。

（・１）　　紺ろ換え体プラスミドの作製ｄＧデテール
加ｐ　［Ｉ　Ｉ≧３２２　（１＋ａｔｈａｓｄａ　Ｒｃ
ｓ、Ｌａｂｓ。

Ｉｎｃ、１ｉＪ）と１゛３）項で得られたｄＣテール（
”Ｆ　Ｊｌｌｌ　ｄ　ｓ　ｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａを１，５１
の１　ｍＭ　ｌ：ＤＴＡ及び１００ｍＭ　ＮａＣＩ　’
Ｄ　Ｑ、む１０ｍＭ　”、　ｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣＩ　
　（ｐｌ＋　７．４）緩衝液中、それぞれ１．５μｇ及
び０．０９μｇ含むように溶解混合させた後、０５℃で
１０分間、５７℃で２時間、さらに４５℃で２時間加温
しアニーリングを行い、組み換え体プラスミド溶液を調
製した。

（５）　　形質転換体の選択 （４）項で得られた組み換え体プラスミド＆’ｌ　Ｈを
用い、　Ｅ、ｃｏｌ−７１７７６株を形質転換させた。

即ち、Ｅ、ｃｏ　Ｉ　ｉχ１７７６株を、ジアミ／ビメ
υ７Ｉｔ　Ｉ　００　Ｂ　＋；／１及びチミジン４０μ
ｉＨ／ｍｌを補ったＬ−ブロス（組成：１１当りトリプ
トンｌｏｇ、酵（；上エトス５　Ｆ　、ＮａＣ１５ｇ、
　　ブドウ糖１１？　、　　ｐｌ＋　７．２）　２０ｍ
１中、３７°Ｃで吸光度（ＧＯＯｎｍ）が０．５となる
まで培養し、菌体を遠心分離し、５０　ｍＭ　Ｃａ　Ｃ
１２Ｇ　イ＋’　Ｉ　ＯｍＭＴｒｉｓ−１１ＣＩ　１１
衝液（ｐＨ７，：１）　ｌ０ｍ１にて九７子した。

集めた菌体を同じ緩衝液２１に懸濁させ、０°Ｃで５分
間静置した。この９濁ｉ＆０．２ｍｌに１−１尼、紹み
換え体プラスミド溶液０．１１を添加混合し、０゛Ｃで
１５分間静１ηし、更に４２°Ｃで２分間保持した後、
−上記の培養で用いたのと同−ｉｎ成の！、−ブロス０
．５１を加えて１時間振盪培養を行った。この培養液の
一部を取り、上記組成に加えてテトラサイクリン（１５
μｇ／ｌ）が添加されたＬ−ブロス寒天平板に広げ３７
℃で約１２時間培養し、テトラサイクリン酎性菌を進択
してｃＤＮＡライブラリーを作製した。

（６）　　クローニング ６）項で得られたｃ　ＤＮＡライブラリーから、参考例
５で得た組み換え体プラスミドｐＲＬ＋５からウサギＩ
Ｌ−１をコードするクローン化ｃ　ＤＮＡの断片をプロ
ーブとして用いたコロニーハイブリダイゼーシマン試験
及びハイブリダイゼーシコントランスレーシ３ン試験［
Ｍａｎｉａｔ＋ｓ、Ｔ、、ａｔ　ａｌ、。

”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”　３２９（＋９
８０）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂ、］によりヒトｌ−１ポリペプチドをコードするｃＤ
ＮＡを含むプラスミドを仔する形質転換体を選び出した
。

この組み換え体プラスミドをｐＨＬ４と名づけた。

ω　クロー／化（ＤＮＡの塩基配列の決定クローン化ｃ
　ＤＮＡの塩基配列はＭＩ３２１−ジを用いるジデオキ
シ法にて決定した。ＭＩ：ｌ■ｐ１８及びＭ　１３ｍｐ
１９（Ｉ’ｈａｒｍａｃｔａ　Ｐ−Ｌ　Ｉｉｉｏｃｈｃ
ｍｉｃａｌｓ社製）をクローニングベクターとし、Ｍ１
３シークエンシ７グキフト（Ａｍｅｒｓｈａｉ　Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ社製）を用い、”ＭＩ３
クローニング及びシーフェンシングハンドブック”　　
（Ａｍａｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐｌ
ｃ社製）に従って実施した。

その塩基配列及びその塩基配列から推測されるアミノ酸
は下記第３表に示すとおりであり、ヒトＩＬ−１前駆体
ポリペプチドをコードしている。

第１〜３番の塩バが開始コドンＡＴＧであり、第８１４
〜８１０番の塩基は終止コドンＴＡＧである。

（以下余白） 第３表 −（資） ＣＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＣ
ＡＴＴＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＡＧＣＡΔ
ＡＧΔｒ’、　Ｇ　Ｔ　ＣＡＡ　Ｇ［Ｘ主コ※※※は終
止コドンを示す。

（以下余白） 参考例５ ウサギＩＬＩ　ｃＤＮＡの調製 （１）　　ウサギ１１．−１　ｍＲＮＡの調製ウサギに
プロピオニバクテリウム　アクネス死菌体を１別当たり
１００■の投与量で静脈内に注入し、８日後に屠殺した
。直ちに開胸気管切Ｃｉｌ　ｌ、　、気管内に１１１人
したチューブを介してリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺
洗浄を繰り返し、肺胞マクロファージを採取した。この
肺胞マクロファージをｌθ％牛脂児血１ｎ含有のＲｐｒ
ｖｕ−ｔｅ４ｏ培地に懸濁させてベトリディフンユ（直
径８　ｃｍ）に１枚当たりｌＸｌ０’個となるように播
き、３７℃で５％炭酸ガス含有空気中、湿度９０〜１０
０％でｎｒ「培養した。１時間の萌培養の後、エントド
キシ７（大腸菌由来のりボボリサブカライド）、　ＴＩ
）Ａ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテ
ート）及びシクロへキシミドをそれぞれ最終濃度がＩＯ
μｇ／　ｍｌ、　５００ｎｇ／　ｍｌ及びｌμｇ／ｍｌ
となるように添加混和し、更に培養を継続した。

４時間後に培養液を吸引除去し、ディツシュ上ニ残った
マクロファージから参考例１−　（１）項に示した方法
に従ってポリ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。

ここで得たポリ（Ａ）　ｍＲＮＡをアガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度１％、０Ｍ尿素存在下、　　ｆ）Ｉ！４
）に付し、２．６〜３．７ｋｂの分子サイズに相当する
泳動位置からポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを回収した。

（２）　ｃＤＮＡライブラリーの作製 （１）項で得られたポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを鋳型として
、’ｊ”；例４−（２）から（５）に示した方法にをじ
て、　ｃ　ＤＮＡライブラリーを作製した。

（３）　　クローニング 上記のｃ　ＤＮＡライブラリーについて、ウサギＩＬ−
１をコードするｃ　ＤＮＡを含むプラスミドを持つ形質
転換体をスクリーニングするため３ｆｆ　ｐ漂ｍｃＤＮ
Ａプローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーション
試験をハナハンらの方法［Ｇｅｎｅ。

１０．０３（１９８０）コに従って行った。エントドキ
シ７゜ＴＰＡ及びシクロへキシミドと共に培養［上記（
１）項参照コした肺胞マクロファージ及びこれらの誘導
操作を省略した肺胞マクロファー′）からそれぞれ上記
（１）項の方法で得たポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを鋳型とし
て、参考例４−（２）項の方法で合成し、３２　ｐで測
微したｃ　ＤＮＡをそれぞれ誘導プラス及びｆ’ｒ’Ｊ
マイナスプローブとした。この試験により誘導プラスの
プローブと結合し、誘導マイリースのプローブとはハイ
ブリダイズしない塩基配列を含む組み換え体プラスミド
を任する形質転換体を選別した。

次いで、これらの選択されたクローンについてハイブリ
ダイゼーション・トランスレーション試験を」二記（１
１項で得たポリ（＾）　ｍ　ＲＮ　Ａを用い、ウサギ１
■、−１ｍＲＮＡと強くハイブリダイズするクローンを
選び出した。

このクロー／の有する組み換え体プラスミドをｐＲＬ＋
５と名づけだ。

４、　図ｉ１＋７　’）　簡１ｊ’−す説明第１図は形
質発現ベクターｐＨＬ＋’３８３の構築工程を示す。尚
、図中の式［１１１１、［ＩＶ］　、　　［：Ｖ］は参
考例１で示したそれぞれのオリゴ　ヌクレオヂドアダブ
クーを育味する。

第２図は形質発現プラスミドｐＨＬＮ＋４の祷築工程を
示す。尚、図中の［Ｖ１］、［■］は参考例３で示した
それぞれの合成オリゴヌクレオチド　アダプターを特徴
する 特許出願人　大日本製朶株式会社 代　　理　　人　　坪　　井　　佇　　四　　部Ａ１ｕ
ｌ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）インターロイキン１又はインターロイキン１様物
   質を有効成分とする鎮痛・消炎剤。
2. （２）下記のアミノ酸配列もしくはその鎮痛・消炎活性
   部位を有するポリペプチド又はその生理的に許容される
   塩を有効成分とる特許請求の範囲第１項記載の鎮痛・消
   炎剤。 【アミノ酸配列があります】［ I ］
3. （３）特許請求の範囲第２項記載のアミノ酸配列［ I
   ］において、そのＮ末端の１〜１８個のアミノ酸が欠失
   したアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその生理的
   に許容される塩を有効成分とする特許請求の範囲第１項
   記載の鎮痛消炎剤。
4. （４）特許請求の範囲第２項記載のアミノ酸配列［ I
   ］において、そのＣ末端の１〜１０個のアミノ酸が欠失
   したアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその生理的
   に許容される塩を有効成分とする特許請求の範囲第１項
   記載の鎮痛消炎剤。
5. （５）特許請求の範囲第２項記載のアミノ酸配列［ I
   ］において、そのＮ末端の１〜１８個のアミノ酸および
   Ｃ末端の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列
   を有するポリペプチド又はその生理的に許容される塩を
   有効成分とする特許請求の範囲第１項記載の鎮痛・消炎
   剤。