JPH0776525A - インターロイキン−１β組成物の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１
β）活性物と共に、人血清アルブミンを含有させること
を特徴とするＩＬ−１β組成物の安定化方法を提供す
る。 【効果】本発明方法によれば、ＩＬ−１β活性物の安定
化を図ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はインターロイキン−１β
（ＩＬ−１β）活性物を含む組成物の安定化方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ＩＬ−１βは、マクロファージ・単球の
みならず多くの細胞から産生され、多様な生物活性を示
すことが知られている〔代謝、Vol.23, 臨時増刊号、免
疫,86,p97-104(1986)；Medical Immunology, Vol.12,N
o.6, p753-760(1986) 等参照〕。

【０００３】上記活性より該ＩＬ−１βは医薬品として
の応用が期待されており、本出願人もまた先にＩＬ−１
β及びその誘導体が種々の医薬用途に有効であることを
明らかにした〔ヨーロッパ特許公開番号：ＥＰ０２３７
９６７Ａ２参照〕。

【０００４】一方、医薬品としての応用に際しては、そ
の有効成分が通常の医薬形態及び保存条件下において、
経時変化することなく安定であることが要求されること
は勿論であり、上記ＩＬ−１βの場合も当然に上記性能
が要求される。殊に、臨床応用を可能とするまでに高度
に精製された均質標品においては、安定性上その扱いに
より充分な配慮が要求され、その活性を保持するには通
常種々の制限を受ける。しかして、凍結処理や凍結乾燥
処理また温度、時間等の種々の保存条件下において、よ
り安定に保つことのできるＩＬ−１βの安定化された製
剤組成物の開発、改良が斯界で望まれている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ＩＬ−１β活性物は薬
理活性が強く極めて微量で使用される一方、容器壁への
吸着性を有しており、有効成分としての含量が低下すれ
ばするほどこの吸着性が問題となり、その防止が必要と
なる。またＩＬ−１β活性物は不安定で、この不安定さ
は有効成分の含量が低下すればするほど増加する傾向が
ある。

【０００６】本発明は、上記問題点を解決して、医薬品
としての応用面で特に好適なＩＬ−１β活性物の安定な
組成物を提供し、また等張性を有する上記ＩＬ−１β活
性物の安定化された組成物を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的よ
り鋭意研究を重ねた結果、ＩＬ−１β活性物に人血清ア
ルブミン及び／又は糖類と界面活性剤とを配合する時に
は、之等が吸着防止効果及び安定化効果を奏し、ＩＬ−
１β活性物の活性が著しく安定化されることを見出し、
ここに本発明を完成するに至った。

【０００８】本発明によれば、ＩＬ−１β活性物と共
に、人血清アルブミンを含有させることを特徴とするＩ
Ｌ−１β組成物の安定化方法が提供される。

【０００９】本発明において、有効成分として利用する
ＩＬ−１β活性物にはＩＬ−１β及びその誘導体が包含
される。之等有効成分としては、より具体的には、本出
願人の先のヨーロッパ特許公開公報（ＥＰ０２３７９６
７Ａ２）に記載のポリペプチド及びその均等物を例示で
きる。該ポリペプチドは、下式（Ａ） Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp-Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu- Val-Met-Ser-Gly-Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys-Ala-Leu-His-Leu-Gln-Gly-Gln-Asp-Met- Glu-Gln-Gln-Val-Val-Phe-Ser-Met-Ser-Phe-Val-Gln-Gly-Glu-Glu-Ser-Asn-Asp- Lys-Ile-Pro-Val-Ala-Leu-Gly-Leu-Lys-Glu-Lys-Asn-Leu-Tyr-Leu-Ser-Cys-Val- Leu-Lys-Asp-Asp-Lys-Pro-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Ser-Val-Asp-Pro-Lys-Asn-Tyr- Pro-Lys-Lys-Lys-Met-Glu-Lys-Arg-Phe-Val-Phe-Asn-Lys-Ile-Glu-Ile-Asn-Asn- Lys-Leu-Glu-Phe-Glu-Ser-Ala-Gln-Phe-Pro-Asn-Trp-Tyr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gln- Ala-Glu-Asn-Met-Pro-Val-Phe-Leu-Gly-Gly-Thr-Lys-Gly-Gly-Gln-Asp-Ile-Thr- Asp-Phe-Thr-Met-Gln-Phe-Val-Ser-Ser で表わされるＩＬ−１βのアミノ酸配列において、 a)１位Ａla、３位Ｖal、４位Ａrg、５位Ｓer、８位Ｃy
s、１１位Ａrg、３０位Ｈis、７１位Ｃys、９３位Ｌy
s、９７位Ｌys、９８位Ａrg、９９位Ｐhe、１０３位Ｌy
s、１２０位Ｔrp、１２１位Ｔyr及び１５３位Ｓerから
選ばれた少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されてい
るか又は他のアミノ酸残基で置換されていること、 b)１位のＡlaから９位のＴhrに至るアミノ酸配列又はそ
の中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されている
こと（但し上記a)に記載の１位Ａla、３位Ｖal、４位Ａ
rg、５位Ｓer及び８位Ｃysからなる群から選ばれたアミ
ノ酸残基の少なくとも１つが欠失されている場合を除
く）、 c)１０３位のＬysから１５３位のＳerに至るアミノ酸配
列又はその中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失さ
れていること（但し上記a)に記載の１０３位Ｌys、１２
０位Ｔrp、１２１位Ｔyr及び１５３位Ｓerからなる群か
ら選ばれたアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失されて
いる場合を除く）、及び d)上記式（Ａ）のＮ末端にアミノ酸残基又は下式（Ｂ）
で示される１′位Ｍetから１１６′位Ａspに至るアミノ
酸配列もしくはそのＣ末端側の一部アミノ酸配列が付加
されていること、式（Ｂ） Met-Ala-Glu-Val-Pro-Glu-Leu-Ala-Ser-Glu-Met-Met-Ala-Tyr-Tyr-Ser-Gly-Asn- Glu-Asp-Asp-Leu-Phe-Phe-Glu-Ala-Asp-Gly-Pro-Lys-Gln-Met-Lys-Cys-Ser-Phe- Gln-Asp-Leu-Asp-Leu-Cys-Pro-Leu-Asp-Gly-Gly-Ile-Gln-Leu-Arg-Ile-Ser-Asp- His-His-Tyr-Ser-Lys-Gly-Phe-Arg-Gln-Ala-Ala-Ser-Val-Val-Val-Ala-Met-Asp- Lys-Leu-Arg-Lys-Met-Leu-Val-Pro-Cys-Pro-Gln-Thr-Phe-Gln-Glu-Asn-Asp-Leu- Ser-Thr-Phe-Phe-Pro-Phe-Ile-Phe-Glu-Glu-Glu-Pro-Ile-Phe-Phe-Asp-Thr-Trp- Asp-Asn-Glu-Ala-Tyr-Val-His-Asp というa)〜d)の条件の少なくとも１つを充足することの
あるアミノ酸配列を有することにより特徴付けられる。

【００１０】上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸
及びポリペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＡＣ−
ＩＵＢによる命名法又は規則における略号乃至当該分野
で慣用されている略号による表示法に従うものとする。
また塩基配列における核酸の表示も同様とする。アミノ
酸の数又は位置は、欠落及び付加がある場合であって
も、全てＩＬ−１βのアミノ酸配列即ち前記式（Ａ）の
配列に従い表示する。但しアミノ酸の位置を示す数値の
内ダッシュを付したものは式（Ｂ）のアミノ酸配列に従
う。

【００１１】以下、上記ポリペプチド（ＩＬ−１β及び
その誘導体）につき詳述する。

【００１２】上記ＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−１βの前
記式（Ａ）に示されるアミノ酸配列において、上記a)〜
d)の要件の１つ又は２つ以上を組み合わせて充足するア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドである。好ましい誘
導体は前記要件a)〜c)の少なくとも１つを充足するアミ
ノ酸配列を有するもの及びa)〜c)の少なくとも１つの要
件とd)の要件とを同時に満足するアミノ酸配列を有する
ものである。該ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドの
好ましい具体例を挙げると次の通りである。

【００１３】1)少なくとも１位Ａlaが欠失されているか
又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド。

【００１４】2)少なくとも３位Ｖalが欠失されているか
又は他 のアミノ酸残基で置換されているポリペプチ
ド。

【００１５】3)少なくとも４位Ａrgが欠失されているか
又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド。

【００１６】4)少なくとも５位Ｓerが欠失されているか
又は他 のアミノ酸残基で置換されているポリペプチ
ド。

【００１７】5)少なくとも８位Ｃysが欠失されているか
又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド。

【００１８】6)少なくとも１１位Ａrgが欠失されている
か又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチ
ド。

【００１９】7)少なくとも３０位Ｈisが欠失されている
か又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチ
ド。

【００２０】8)少なくとも７１位Ｃysが欠失されている
か又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチ
ド。

【００２１】9)少なくとも９３位Ｌysが欠失されている
か又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチ
ド。

【００２２】10）少なくとも９７位Ｌysが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチ
ド。

【００２３】11）少なくとも９８位Ａrgが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチ
ド。

【００２４】12）少なくとも９９位Ｐheが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチ
ド。

【００２５】13）少なくとも１０３位Ｌysが欠失されて
いるか又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプ
チド。

【００２６】14）少なくとも１２０位Ｔrpが欠失されて
いるか又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプ
チド。

【００２７】15）少なくとも１２１位Ｔyrが欠失されて
いるか又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプ
チド。

【００２８】16）少なくとも１５３位Ｓerが欠失されて
いるか又は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプ
チド。

【００２９】17）１位のＡlaから３位のＶalに至るアミ
ノ酸配列、１位のＡlaから６位のＬeuに至るアミノ酸配
列又は１位のＡlaから９位のＴhrに至るアミノ酸配列が
少なくとも欠失されているポリペプチド。

【００３０】18）１５１位Ｖalから１５３位Ｓerに至る
アミノ酸配列、１４９位Ｇlnから１５３位Ｓerに至るア
ミノ酸配列、１４５位Ａspから１５３位Ｓerに至るアミ
ノ酸配列、１４１位Ｇlnから１５３位Ｓerに至るアミノ
酸配列、１２１位Ｔyrから１５３位Ｓerに至るアミノ酸
配列又は１０３位Ｌysから１５３位Ｓerに至るアミノ酸
配列が少なくとも欠失されているポリペプチド。

【００３１】19）式（Ａ）のＮ末端に、アミノ酸残基を
少なくとも有するポリペプチド。

【００３２】20）式（Ａ）のＮ末端に、式（Ｂ）で表わ
されるアミノ酸配列１１２′位Ａlaから１１６′位Ａsp
に至るアミノ酸配列、７７′位Ｍetから１１６′位Ａsp
に至るアミノ酸配列、７１′位Ｍetから１１６′位Ａsp
に至るアミノ酸配列、３２′位Ｍetから１１６′位Ｓer
に至るアミノ酸配列又は１′位Ｍetから１１６′位Ａsp
に至るアミノ酸配列を少なくとも有するポリペプチド。

【００３３】上記ＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−１βのア
ミノ酸配列の特定位置の特定アミノ酸残基が他のアミノ
酸残基で置換されたアミノ酸配列及び特定位置にアミノ
酸残基の付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド
を包含するが、この置換及び付加を行ない得るアミノ酸
残基は、人体蛋白質を構成するα−アミノ酸の残基であ
ればいずれでもよく、中性アミノ酸残基であるのが好適
である。但し、ＣysはそのＳＨ基に基づいて分子内又は
分子間ジスルフイド結合を形成することがあり、これを
考慮すれば該アミノ酸残基はＣys以外の上記アミノ酸残
基であるのが好ましい。特に好ましいものとして例えば
４位Ａrgの場合はＧly、Ｌys、Ｇln又はＡspを、８位Ｃ
ysの場合はＳer又はＡlaを、１１位Ａrgの場合はＧln
を、３０位Ｈisの場合はＴyrを、７１位Ｃysの場合はＳ
er、Ａla又はＶalを、９３位Ｌysの場合はＬeu又はＡsp
を、９８位Ａrgの場合はＬeuを、１０３位Ｌysの場合は
Ｇlnを、１２０位Ｔrpの場合はＡrgを、１２１位Ｔyrの
場合はＧlnを、またＮ末端への付加の場合は、Ｍet、Ｌ
eu、Ａrg又はＡspをそれぞれ例示できる。

【００３４】かかるＩＬ−１β誘導体及びＩＬ−１β
は、例えばＬＡＦ活性、腫瘍細胞増殖抑制活性（ＧＩＦ
活性）、即ち腫瘍細胞に対して特異的にその増殖を抑制
する活性、コロニー刺激因子（Colony stimulating fac
tor ：ＣＳＦ）、インターフエロン（interferon：ＩＦ
Ｎ）、インターロイキン２（interleukin-２：ＩＬ−
２）、インターロイキン３（interleukin-３：ＩＬ−
３）等の種々のサイトカイン（cytokine）類の産生促進
活性、即ち例えばヒト細胞に作用してそれらサイトカイ
ン類の産生を著しく促進させる活性、抗炎症活性、特に
例えば関節炎モデル動物に投与することによって関節炎
の進行を効果的に抑制する活性、放射線障害防止作用、
即ち骨髄移植時の放射線全身照射、癌治療等における放
射線照射、放射線事故時における生体障害乃至は重篤な
副作用等を予防する作用乃至防止する作用等を有してい
る。前記したＩＬ−１β誘導体は上記各活性のいずれか
少なくとも一つの点で優れているか、或いは（及び）よ
り毒性が低く副作用が少ない点で優れている。従って上
記ＩＬ−１β誘導体並びにＩＬ−１βは、例えば抗体産
生促進やワクチンの効果増強等の免疫系刺激剤、抗腫瘍
剤、例えばＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３等のサイトカイ
ン産生促進剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤等の医薬品
として有用である。

【００３５】殊に上記ＩＬ−１β及びその誘導体が関節
炎等の炎症に著効を示すという新たな知見は、ＩＬ−１
が炎症をメデイエートしその惹起に関与するとされてき
た事実によれば、驚くべきことである。また上記ＩＬ−
１β誘導体は上記各活性のいずれか少なくとも一つの点
で優れているか又は（及び）より毒性が低く副作用が少
ない点で優れている。

【００３６】とりわけ、上記ＩＬ−１β及びその誘導体
は、ＣＳＦ産生促進剤として有効であり、これをヒトに
投与するときには、ウィルス感染や抗原抗体反応等の危
険性を生じることなく、癌化学療法や放射線療法後の骨
髄低形成による顆粒球減少を有効に回復できる（顆粒球
減少治療剤）。上記ＣＳＦ産生促進剤はまたその本来の
ＣＳＦ産生促進作用により、ＣＳＦの作用に基づく各種
疾病の予防及び治療剤としても有効に利用できる。例え
ば、ＣＳＦは顆粒球やマクロファージの機能を促進させ
る作用がある〔ロペッツら（Lopez,A.F. et al., J.Imm
unol.,131,2983(1983)、ハンダムら（Handam，E.et a
l., 同122,1134(1979)及びバダスら（Vadas,M.A.et a
l., 同130,795(1983) 〕ので、種々の感染症の予防及び
治療剤として臨床応用が期待されており、上記ＣＳＦ産
生促進剤も同様に臨床応用が期待される。

【００３７】殊に、近年生体防御能が低下乃至障害され
た個体（compromised host）に、それまで無害であった
病原体が病原性を発揮して惹起される、所謂日和見感染
症（opportunistic infection 或いはterminal infecti
on）は、臨床的に問題となる病原体（起炎菌）がシュー
ドモナス(Pseudomonas) 、セラティア(Serratia)等のグ
ラム陰性桿菌、ヘルペス(Herpes simplex, HSV) 、バリ
セラ−ゾースタ(Varicella zoster, VZV) 、サイトメガ
ロウイルス(Cytomegalovirus, CMV)等のウイルス、キャ
ンディダ(Candida albicans)、アスペルギルス(Aspergi
llus fumigatus) 、ノカルディア(Nocardia asteroide
a) 等の真菌、カリニ原虫(Pneumocystiscarinii)、トキ
ソプラズマ(Toxoplasma gondii) 等の原虫等であり、現
用の抗生物質は、之等の病原菌に対して充分な効果を奏
し難く、該日和見感染症に対する新しい薬剤の研究開発
が切望されている。ＩＬ−１β誘導体は、かかる日和見
感染症の予防及び治療剤としても有用であり、特にかか
る日和見感染症が高頻度に見られる抗癌剤投与時、即ち
急性白血病の化学療法や骨髄移植時における各種の感染
症、例えばガンジダ症、クリプトコックス症、アスペル
ギルス症、接合菌症、黒色真菌感染症、ウィルス感染
症、サイトメガロウィルス肺炎、之等の合併症等の予防
及び治療剤として有用なものである。

【００３８】更にＩＬ−１β及びその誘導体は、上記医
薬用途以外に、そのサイトカイン産生促進活性に基づ
き、例えば細胞株からの各種有用サイトカインのインビ
トロ（in vitro）製造に際して極めて有効に使用し得
る。かかる細胞株からの天然型サイトカインの製造は、
殊に糖蛋白質であるサイトカインにおいて着目されてお
り、効率的に且つ大量に有用サイトカインを収得でき
る。

【００３９】上記したＩＬ−１β誘導体中、少なくとも
７１位Ｃysを置換乃至は欠失させたもの、特に上記Ｃys
を他のアミノ酸残基、例えばＳer、Ａla、Ｖal等で置換
したものは高活性を示す。

【００４０】また、少なくとも４位Ａrg、９３位Ｌys、
８位Ｃysを置換乃至は欠失させたＩＬ−１β誘導体、及
び少なくとも１０３位以降の少なくとも一つのアミノ酸
残基を欠失させた誘導体は、いずれもプロスタグランジ
ンＥ（ＰＧＥ）産生促進作用が弱く、従って発熱作用等
の副作用並びに毒性がより少ない特徴を有し、更に少な
くとも４位Ａrg又は９３位Ｌysを置換乃至は欠失させた
誘導体は、ＧＩＦ並びにＬＡＦ活性に比し、ＣＳＦ産生
促進活性及び抗炎症活性がより強い特徴を有している。

【００４１】更に、上記誘導体中、式（Ａ）のＮ末端に
少なくとも特定のアミノ酸残基もしくはポリペプチドが
付加したものは、ＧＩＦ活性及びＬＡＦ活性に比してＣ
ＳＦ産生促進作用及び抗炎症作用がより高い特徴を有
し、しかも毒性が低く且つ作用の持続性の点で医薬品と
して、殊に経口剤乃至は坐剤として利用する場合により
有効である。

【００４２】更に上記誘導体、殊に少なくとも８位Ｃys
及び／又は７１位Ｃysを置換乃至欠失させたもの、特に
上記Ｃysを他のアミノ酸残基例えばＳer、Ａla、Ｖal等
で置換したものは、種々の条件下におけるＩＬ−１受容
体への結合性において優れている。

【００４３】尚、上記誘導体の内でＩＬ−１βに比しそ
の分子中にＣysをより少なく含むか又は含まないもの
は、ＣysのＳＨ基に基づく分子内もしくは分子間結合の
不要な形成を考慮すればより好ましい。

【００４４】上記した特定のポリペプチド、即ちＩＬ−
１β及びその誘導体は、例えば遺伝子工学的手法により
製造することができる。即ち、前記特定のポリペプチド
をコードする遺伝子を利用し、これを微生物のベクター
に組込んで該微生物細胞内で、複製、転写、翻訳させる
ことによって製造することができる。この方法は、特に
大量生産が可能である点より有利である。

【００４５】上記方法において用いられる遺伝子は、通
常の方法、例えばホスフアイト トリエステル法〔ネイ
チヤー(Nature), 310,105(1984) 〕等の常法に従い、核
酸の化学合成により全合成することもできるが、ＩＬ−
１βもしくはその前駆体をコードする遺伝子を利用して
合成するのが簡便であり、例えば該遺伝子より上記化学
合成手段を含む常法に従い、前記特定のアミノ酸配列を
コードする核酸配列に改変すること等により容易に製造
できる。

【００４６】ＩＬ−１β又はその前駆体をコードする遺
伝子は公知であり、我々も先の出願（特願昭６０−１３
８２８１号、特開昭６２−１７４０２２号公報）に記載
したように、ＩＬ−１βをコードする遺伝子を得、これ
を用いて遺伝子工学的手法でＩＬ−１βを収得するに成
功している。

【００４７】上記核酸（塩基）配列の改変操作も公知方
法に従えばよく、目的とするポリペプチドのアミノ酸配
列に応じて実施される〔遺伝子工学的手法としては、例
えば、Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laborat
ory (1982)が参照される〕。例えば、ＤＮＡの切断、結
合、リン酸化等を目的とする制限酵素、ＤＮＡリガー
ゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等
の各種の酵素処理等の常套手段等が採用でき、それら酵
素は市販品として容易に入手できる。之等各操作におけ
る遺伝子乃至核酸の単離、精製も常法、例えばアガロー
ス電気泳動法等に従えばよい。また得られる遺伝子の複
製は、一部後述するように通常のベクターを利用する方
法に従えばよい。また、所望のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ断片や合成リンカーは上記した化学合成により
容易に製造できる。尚、上記において所望のアミノ酸に
対応するコドンは自体公知でありまたその選択は任意で
よく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮し
た常法に従えばよい〔Nucl.Acids.Res.,9,43-74(1981)
〕。また之等の核酸配列のコドンの一部改変には、例
えば常法通り、１５〜３０マー程度の、所望の改変をコ
ードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを
用いたサイト−スペシフィック ミュータジエネシス
（Site-Specific Mutagenesis)〔Proc.Natl.Acad.Sci.,
81,5662-5666(1984)〕等の方法を採用できる。

【００４８】上記方法により得られる所望の遺伝子は、
例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法〔Maxam-Gilb
ert, Meth.Enzym., 65,499-560(1980)〕やＭ１３フアー
ジを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法〔Messing,
J.and Vieira ,J., Gene, 1 9,269-276(1982)〕等によ
り、その塩基配列の決定及び確認を行ない得るが、之等
に限定されず当業界において周知の各種方法のいずれを
も採用できる。

【００４９】かくして、前記した特定のアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードする遺伝子が提供される
（以下この遺伝子を「目的遺伝子」という）。

【００５０】前記特定のポリペプチドは、上記目的遺伝
子を利用して公知の一般的な遺伝子組換え技術に従い製
造できる。より詳細には、上記目的遺伝子が宿主細胞中
で発現できるような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主
細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養すれば
よい。

【００５１】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれをも用い得る。該真核生物の細胞には、
脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞として
は、例えばサルの細胞であるＣos細胞〔Y.Gluzman, Cel
l,23,175-182(1981)〕やチヤイニーズ・ハムスター卵巣
細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔G.Urlaub and
L.A.Chasin, Proc.Natl.Acad.Sci., USA,77,4216-4220
(1980)）〕等がよく用いられるが之等に限定されない。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しよう
とする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡの
スプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列
等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複
製起源を保有していてもよい。該発現ベクターの例とし
てはＳＶ４０の初期プロモーターを保有するpSV2dhfr
〔S.Subramani,R.Mulligan and P.Berg, Mol．Cell.Bio
l.,1 (9),854-864〕等を例示できるが、これに限定され
ない。

【００５２】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いられ、その中でもサツカロミセス属酵母が有利に利
用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとして
は、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモー
ターを持つpAM82 〔A.Miyanohara et al., Proc.Natl.A
cad.Sci.,USA, 80,1-5(1983)〕等を好ましく利用でき
る。

【００５３】原核生物の宿主としては大腸菌や枯草菌が
一般によく用いられ、例えば該宿主菌中で複製可能なプ
ラスミドベクターを用い、このベクター中に目的遺伝子
が発現できるように、該遺伝子の上流にプロモーター及
びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更
に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した発現プラスミ
ドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌としては、
エシエリヒア・コリ（Ｅscherichia coli）Ｋ１２株等
がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２
がよく用いられるが、これに限定されず、公知の各種の
菌株及びベクターがいずれも利用できる。プロモーター
としては、例えばトリプトフアンプロモーター、Ｐ_L プ
ロモーター、lac プロモーター、lpp プロモーター等を
使用することができ、いずれの場合にも目的遺伝子を発
現させ得る。

【００５４】トリプトフアンプロモーターを用いる場合
を例にとり詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトフ
アンプロモーター及びＳＤ配列を持つベクターｐＴＭ１
〔今本文男、代謝、Vol.22,289(1985)〕を使用し、ＳＤ
配列の下流に存在する制限酵素ＣlaＩ部位に、必要に応
じてＡＴＧを付与した所望のポリペプチドをコードする
遺伝子を連結させればよい。

【００５５】尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラ
クトシダーゼやβ−ラクタマーゼ等を利用する融合蛋白
質発現系によることもできる。

【００５６】かくして得られる発現ベクターの宿主細胞
への導入及びこれによる形質転換の方法としては、一般
に用いられている方法、例えば主として対数増殖期にあ
る細胞を集め、ＣａＣｌ₂ 処理して自然にＤＮＡを取り
込みやすい状態にして、ベクターを取込ませる方法等を
採用できる。上記方法においては、通常知られているよ
うに形質転換の効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ₂
やＲｂＣｌを培地に更に共存させることも可能である。
また、宿主細胞をスフエロプラスト又はプロトプラスト
化してから形質転換させる方法をも採用できる。

【００５７】かくして得られる所望の形質転換株は、常
法に従い培養でき、該培養により、所望のポリペプチド
が生産、蓄積される。該培養に用いられる培地として
は、通常の細胞培養に慣用される各種の培地のいずれで
もよく、その具体例としては、例えばＬ培地、Ｅ培地、
Ｍ９培地等及び之等に通常知られている各種の炭素源、
窒素源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地を例示で
きる。尚、上記トリプトフアンプロモーターを用いた場
合には、一般にプロモーターが働くようにするためにカ
ザミノ酸を添加した、例えばＭ９最小培地を用いて培養
することができ、該培地中には培養の適当な時期にイン
ドールアクリル酸等のトリプトフアンプロモーターの働
きを強めるための薬剤を添加することもできる。

【００５８】かくして得られる活性物を含有する培養物
からの目的ポリペプチド、即ち前記特定のポリペプチド
の精製、単離は常法に従い行ない得る。尚、該ポリペプ
チドを宿主から抽出するに当っては、例えば浸透圧シヨ
ツク法等の温和な条件を採用するのがその高次構造保持
の面からより好ましい。

【００５９】上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチ
ドの物理、化学的性質を利用した各種の処理操作に従い
実施することができる〔例えば「生化学データーブツク
ＩＩ」pp1175-1259 、第１版第１刷、1980年 6月23日、
株式会社東京化学同人発行参照〕。該方法としては、具
体的には例えば通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾
過、分子ふるいクロマトグラフイー（ゲル濾過）、液体
クロマトグラフイー、遠心分離、電気泳動、アフイニテ
イクロマトグラフイー、透析法、之等の組合せ等を採用
できる。

【００６０】より具体的には、上記操作は例えば以下の
如くして実施できる。即ちまず培養上清より予め目的と
するポリペプチドを部分精製する。この部分精製は、例
えばアセトン、メタノール、エタノール、プロパノー
ル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒や酢
酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等
の酸を蛋白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用
いる処理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用
いる限外濾過処理等により行ない得る。之等の各処理の
操作及び条件は、通常のそれらと同様とすればよい。

【００６１】次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル濾
過に付すことにより目的物質の活性が認められる画分を
収得する。ここで用いられるゲル濾過剤としては、特に
限定はなく例えばデキストランゲル、ポリアクリルアミ
ドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロ
ースゲル、セルロース等を素材とするものをいずれも利
用できる。之等の具体例としては、セフアデックスＧタ
イプ、同ＬＨタイプ、セフアロースタイプ、セフアクリ
ルタイプ（以上、フアルマシア社）、セルロファイン
（チツソ社）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイ
オ−ラド社）、ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、ＴＳＫ−Ｇ
タイプ（トーソー社）等を例示できる。

【００６２】目的とするポリペプチドは、上記ゲル濾過
により得られる活性画分を、例えばハイドロキシアパタ
イトカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ー、ＤＥＡＥ法、ＣＭ法、ＳＰ法等のイオン交換カラム
クロマトグラフィー、クロマトフオーカシング法、逆相
高速液体クロマトグラフィー等に付すことにより、又は
之等各操作の組合せにより更に精製でき、均質な物質と
して単離できる。

【００６３】上記クロマトフオーカシング法は、公知の
各種方法により実施できる。カラムとしては例えばＰＢ
Ｅ９４（フアルマシア社製）等を、開始緩衝液としては
例えばイミダゾール−塩酸等を、溶出液としては例えば
ポリバツフアー７４（フアルマシア社製）−塩酸（ｐＨ
４．０）等を使用できる。

【００６４】上記逆相高速液体クロマトグラフイーは、
例えばＣ₄ ハイポアー逆相ＨＰＬＣカラム（バイオ−ラ
ド社（Bio-Rad Laboratories））等を用いて、移動剤と
してアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水
等及び之等の混合溶媒を用いて実施できる。

【００６５】かくしてＩＬ−１β及びその誘導体として
の前記特定のポリペプチドを単離、収得できる。

【００６６】以下、本発明方法により安定化される組成
物につき詳述する。

【００６７】該組成物は、例えば上記したＩＬ−１β及
びその誘導体等を包含するＩＬ−１β活性物と共に、人
血清アルブミン、又はこれに更に必要に応じて糖類、界
面活性剤等を含有させることを必須の要件とする。

【００６８】上記において糖類としては特に限定はな
く、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果
糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリト
ール等の糖アルコール類、ショ糖、マルトース、乳糖等
の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ
等の多糖類等を使用でき、之等は一種単独でも二種以上
混合しても用い得る。之等の中で特にショ糖、マルトー
ス、マンニトール、イノシトール、デキストラン等は好
ましい。

【００６９】界面活性剤としても特に限定はなく、イオ
ン性及び非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、就
中、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキル
エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、
ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系
等の界面活性剤を好ましく利用できる。

【００７０】上記糖類の添加量は、ＩＬ−１β活性物１
μｇ当たり約０．１ｍｇ程度以上、好ましくは約１〜１
００ｍｇ程度の範囲とするのが適当であり、界面活性剤
の添加量は、ＩＬ−１β活性物１μｇ当たり約０．００
０１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍ
ｇ程度の範囲とするのが適当である。また人血清アルブ
ミンの添加量はＩＬ−１β活性物１μｇ当たり約０．０
０１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ程
度の範囲とするのが適当である。

【００７１】本発明組成物は、上記特定の成分の配合を
必須要件として、他は通常のこの種医薬組成物と同様の
ものとすることができ、他の薬理的有効成分や製剤上の
慣用成分等を任意に配合してもよく、かくして得られる
組成物は、前述した各種の医薬用途、例えば抗体産生や
ワクチン効果の増強並びに免疫不全症の治療等の免疫刺
激剤、抗腫瘍剤、サイトカイン類の産生促進剤、抗炎症
剤、放射線障害防止剤、日和見感染症治療剤等に有効に
適用することができる。

【００７２】特に、本発明組成物に配合できる他の成分
としては、ＩＬ−１β活性物の安定化を更に増加させる
面より、通常の含硫還元剤が好ましい。該含硫還元剤と
しては、具体的にはシステイン、Ｎ−アセチルホモシス
テイン、チオクト酸、チオグリコール酸及び之等の塩
類、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオ硫
酸ナトリウム、チオ乳酸、ジチオスレイトール、グルタ
チオン等の比較的温和な還元剤等を好ましく例示でき、
之等は一種単独でも利用でき、２種以上併用することも
できる。之等の添加量は特に制限されないが、ＩＬ−１
β活性物１μｇ当たり約０．００１ｍｇ程度以上、好ま
しくは０．０１〜１０ｍｇ程度（２種以上を併用する場
合はそれらの合計量）とするのが適当である。

【００７３】本発明組成物は、また緩衝液で等張化して
安定な等張化製剤とされるのが適当である。ここで用い
られる緩衝液としては、例えば代表的には、クエン酸−
クエン酸ナトリウム、クエン酸−リン酸ナトリウム、酢
酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−ホウ砂等のｐＨ４〜８
程度、好ましくはｐＨ５〜６の各種緩衝液を例示でき
る。

【００７４】本発明組成物は、例えば通常薬理有効量の
ＩＬ−１β活性物及び前記特定の配合成分と共に、適当
な医薬製剤担体を配合して製剤組成物の形態に調製され
る。該製剤担体としては使用形態に応じた製剤の調製に
通常慣用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊
剤等の賦形剤乃至希釈剤をいずれも使用できる。製剤組
成物の形態は、これが有効成分であるＩＬ−１β活性物
を効果的に含有する状態であれば特に限定はなく、錠
剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤であってもよく、液
剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態であってもよい。また
これは使用前に適当な担体の添加により液状となし得る
乾燥品とすることもできる。之等の製剤組成物はいずれ
も常法に従い調製され得る。

【００７５】得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態
に応じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤
は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により
投与され、固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与
され得る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与
量は、該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適
用される患者の症状等に応じて適宜選択され、一定では
ないが、通常有効成分を約０．００００００１〜８０重
量％程度含有する製剤形態に調製して、この製剤をこれ
に含有される有効成分量が一日成人一人当り約０．００
１μｇ〜１００μｇ程度となる範囲で投与するのが望ま
しい。該投与は、一日１回である必要はなく３〜４回に
分けることもできる。

【００７６】

【発明の効果】本発明によれば、医薬品として注目さ
れ、期待されているＩＬ−１β活性物の安定化された組
成物が提供される。

【００７７】本発明組成物は、構成成分のＩＬ−１β活
性物の安定性の面で優れた特性を有し、例えば凍結処理
や凍結乾燥処理等の通常の医薬形態としての所望の調製
及びそれら医薬品の通常の保存条件下においても長期間
安定であり、かかる分野において極めて有用である。

【００７８】

【実施例】以下実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明す
る。

【００７９】各実施例において有効成分として用いられ
るＩＬ−１β活性物（ＩＬ−１β誘導体）の表示は、下
記第１表に示す略号にて行なうものとし、このうちポリ
ペプチドＩ〜ＸＸＸＸＶＩＩＩは特開昭６３−１５２３
９８号公報記載のものであり、ポリペプチドＸＸＸＸＩ
Ｘ〜ＸＸＸＸＸＶＩは上記に準じて以下の製造参考例に
より得られるものである。また之等のＩＬ−１活性及び
ＧＩＦ活性の測定は、同公開公報記載の方法に従う。

【００８０】

【表１】

【００８１】

【表２】

【００８２】

【表３】

【００８３】

【表４】

【００８４】

【表５】

【００８５】

【製造参考例１】 特開昭６３−１５２３９８号公報記載の製造例１−
に準じて、プラスミドp trp ＧＩＦ−αを利用したサ
イト−スペシフィックミュータジェネシスにより、下記
２表に示す各ポリペプチド（ＩＬ−１β誘導体）を得
た。

【００８６】尚、各ポリペプチドの発現、ＧＩＦ活性の
測定及び精製は、上記公開公報記載の方法に従うもので
あり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥも同様にその参考例２−（４）
に示す方法に準じた。以下の各例でも特筆しない限り同
様である。

【００８７】

【表６】

【００８８】

【表７】

【００８９】

【表８】

【００９０】

【製造参考例２】この例は、ＩＬ−１βのＮ末端に種々
のアミノ酸残基を付加したＩＬ−１β誘導体（ポリペプ
チドＸＸＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＸＸＶＩ）を製造した例
である。

【００９１】上記Ｎ末端領域付近には、蛋白質合成の開
始コドンＡＴＧの５塩基上流にＣlaＩ部位が存在する
が、それより下流には１１番目のＡrgのところにＭspＩ
部位が存在するだけであり、この２つの部位間にリンカ
ーＤＮＡを挿入しようとすると、該リンカーが長くなり
すぎるため、まず之等の制限酵素部位間のもっとＮ末端
に近いアミノ酸のところで適当な制限酵素部位の作成を
検討し、その結果、４番目のＡrgのコドンをＣＧＴから
ＡＧＡに代えて、次のＳerとの間にＡＧＡＴＣＴのＢgl
ＩＩ制限酵素部位を作成し、この作成されたＢglＩＩと
上記ＣlaＩ部位間に、予め合成された変異領域を含む各
種合成リンカーを入替えて所望の遺伝子を構築し、これ
を大腸菌で発現させて、目的のポリペプチドを得た。以
下、その方法を詳述する。

【００９２】（１）制限酵素ＢglＩＩ部位を持つＩＬ−
１β発現プラスミドの作成 trp プロモーターを用いたp trp ＧＩＦ−α：４９２１
bp）を、制限酵素ＣlaＩ及びＢamＨＩで消化して、５７
９bpと４３４２bpの２つのフラグメントＤＮＡを得た。
上記５７９bpフラグメントＤＮＡを更にＭspＩで消化し
て、５′末端にＭspＩ部位を、３′末端にＢamＨＩ部位
を持つ５４３bpのフラグメントＤＮＡを得た。次に、以
下の配列のリンカーＤＮＡを合成し、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼを用いてその５′末端をリン酸化した。

【００９３】

【表９】

【００９４】このリン酸化リンカーと、上記５４３bpの
フラグメントとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
て、５′末端にＣlaＩ部位、中間にＢglＩＩ、ＭspＩ部
位及び３′末端にＢamＨＩ部位を持つＤＮＡフラグメン
ト（５７９bp）を得た。

【００９５】最後に、上記で得た５７９bpのフラグメン
トと、先の４３４２bpのフラグメントとを、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結することにより、新たにＢglＩＩ
部位を持つＩＬ−１β発現プラスミド（p trp ＩＬ−１
β，Ｈ２：４９２１bp）を得た。

【００９６】得られたプラスミドをエシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１にトランスフォームし、得られるクローンを
ＤＮＡシークエンスした結果、目的通りＢglＩＩ部位を
有するＩＬ−１β発現遺伝子であることが確認された。

【００９７】（２）合成ＤＮＡリンカーによるＩＬ−１
βのＮ末端付加変異蛋白質の製造 上記（１）で得たプラスミドp trp ＩＬ−１β，Ｈ２の
ＣlaＩ−ＢglＩＩ制限酵素部位間で、合成ＤＮＡリンカ
ーとベクターＤＮＡとを置換させることにより、ＩＬ−
１βのＮ末端に所望のアミノ酸を付加した変異蛋白質を
作成した。

【００９８】上記付加するアミノ酸としてはＩＬ−１β
前駆体由来の５アミノ酸配列（Ａla−Ｔyr−Ｖal−Ｈis
−Ａsp；ＡＹＶＨＤ）、酸性アミノ酸（Ａsp；Ｄ）、中
性アミノ酸（Ｌeu；Ｌ）及び塩基性アミノ酸（Ａrg；
Ｒ）のそれぞれ１つずつを選んだ。之等の変位蛋白質を
それぞれ［ＡＹＶＨＤ］−ＩＬ−１β、［Ｄ］−ＩＬ−
１β、［Ｌ］−ＩＬ−１β及び［Ｒ］−ＩＬ−１βと略
記する。

【００９９】各合成リンカーＤＮＡ配列は次の通りであ
る。

【０１００】ＡＹＶＨＤを付加するためのリンカー

【０１０１】

【表１０】

【０１０２】Ｄを付加するためのリンカー

【０１０３】

【表１１】

【０１０４】Ｌを付加するためのリンカー

【０１０５】

【表１２】

【０１０６】Ｒを付加するためのリンカー

【０１０７】

【表１３】

【０１０８】まずＩＬ−β発現プラスミドp trp ＩＬ−
１β，Ｈ２をＣlaＩ及びＢglＩＩで消化して、４．９kb
p のフラグメントＤＮＡを得た。次いで上記〜の各
リンカーを合成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用
いてそれらの５′末端をリン酸化した。得られた５′末
端をリン酸化した合成リンカーのそれぞれと、上記４．
９kbp のフラグメントＤＮＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結させ、４種類のＩＬ−１βＮ末端付加変異蛋
白質発現プラスミドを構築した。

【０１０９】之等プラスミドのそれぞれをエシェリヒア
・コリＨＢ１０１にトランスフォームし、得られるクロ
ーンをＤＮＡシークエンスして、目的ＤＮＡシークエン
スを確認した。

【０１１０】（３）ＩＬ−１βＮ末端付加変異蛋白質の
発現及び精製 上記（２）で得た各発現プラスミドでトランスフォーム
されたＨＢ１０１株（Ｋ１２株）をＭ９培地中、３７℃
で振盪培養した。

【０１１１】遠心分離して集めた菌体を１Ｍリン酸水素
二ナトリウムで４℃にて処理した後、５ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、浸透圧ショック
にて破壊した。

【０１１２】透析液を酢酸にてｐＨ約４に調整した後、
生じた沈澱を遠心分離により除去し、上清液を陽イオン
交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、トーソー
社製、ＳＰ−５ＰＷカラム使用）にかけ、メインピーク
を再クロマトグラフィーにかけて更に精製した。上記陽
イオン交換ＨＰＬＣを２度行なうことにより得られる各
ＩＬ−１β変異蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で
ほぼ単一のバンドに精製された。

【０１１３】更に、アミコンＹＭ−５メンブランによる
限外濾過を行ない、溶媒を酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）か
ら水におきかえた。

【０１１４】得られた各変異蛋白質の諸性質を下記第３
表にまとめて示す。

【０１１５】

【表１４】

【０１１６】ＩＬ−１β（ポリペプチドＩ）及びその誘
導体につき、以下の活性試験を行なった。

【０１１７】尚、前記したポリペプチドＩに対する抗血
清を用いて、ＲＩＡ法により測定したポリペプチドＩ換
算蛋白量（ｍｇ）当りのＬＡＦ活性（Ｕ）は、下記第４
表に示す通りである。

【０１１８】

【表１５】

【０１１９】

【薬理試験例１】ポリペプチドＩのＣＳＦ産生促進効果
試験 ヒト肺細胞のＣＳＦ産生に対する促進効果試験 ＣＳＦ産生株として、ヒト肺細胞由来株ＨＦＬ−１（Hu
man Embryonic lung Fibroblasts, ＡＴＣＣ登録細胞株
Ｎo.ＣＣＬ−１５３）を用い、以下の試験を行なった。

【０１２０】まず、上記ＨＦＬ−１細胞を２×１０⁵ 個
／ｍｌの細胞濃度となるように、１０％ウシ胎児血清加
ハムスター１２Ｋ培養液〔Ham,R.G.,Proc.Natl. AcD>Sc
i.,５３，２８８（１９６５）〕に浮遊させた。次いで
上記細胞懸濁液中に、種々の濃度に調製した前記参考例
で得たポリペプチドＩを加え、炭酸ガス培養器内で３７
℃で２４時間、４８時間及び７２時間各々培養し、各培
養上清を集め、之等培養上清中に産生蓄積されたＣＳＦ
量を、マウス骨髄細胞を使用して測定した〔Lewis,I.C.
et al.,J.Immunol., 1 28,168(1982) 〕。

【０１２１】ポリペプチドＩを用いて得られた各培養時
間（ｈｒ）での結果を第１図に示す。図において、横軸
はポリペプチドＩの濃度（ＧＩＦ単位／ｍｌ）を、縦軸
はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ）を示す。

【０１２２】上記結果より、ポリペプチドＩの添加によ
れば、ＨＦＬ−１細胞株のＣＳＦ産生量は、該ポリペプ
チドの無添加に比べて実に数百倍にも亢進されることが
明らかである。

【０１２３】ヒト皮膚由来細胞のＣＳＦ産生に対する
ポリペプチドＩの促進効果試験 ヒト正常皮膚由来細胞株としてＣＲＬ−１４４５（ＡＴ
ＣＣ．Ｎo.）を用いて以下の試験を行なった。即ち、上
記細胞を２×１０⁵ 個／ｍｌの細胞濃度となるように１
０％ウシ胎児血清加ダルベッコＭＥＭ培養液〔Dulbeco,
R.and Freeman,G.，Virology, 8,396(1959) 〕に浮遊さ
せた。上記細胞浮遊液に、種々の濃度の参考例で得たポ
リペプチドＩを加え、炭酸ガス培養器内で３７℃で２
４、４８及び７２時間培養した後、培養上清を集め、産
生されたＣＳＦ量をマウス骨髄細胞を使用して上記試験
と同様にして測定した。

【０１２４】得られた結果を第１図と同様にして、第２
図に示す。

【０１２５】第２図より、ＧＩＦ活性として１単位／ｍ
ｌ以上のポリペプチドＩをヒト正常皮膚由来の原線維芽
細胞に加えることにより、該細胞のＣＳＦ産生能は著し
く促進されることが明らかである。

【０１２６】生体内でのＣＳＦ産生に対する促進効果
試験 ポリペプチドＩを生体内に投与した場合、生体内でのＣ
ＳＦ産生亢進作用が発現されることを以下の動物実験に
より試験した。

【０１２７】即ち、正常マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ系マウ
ス、静岡県実験動物協同組合より購入）に、種々の量の
参考例で得たポリペプチドＩ（ＧＩＦ活性として１０³
〜１０⁵ 単位／個体）を静脈内投与した。上記投与後
２、４、８、１２及び２４時間目に各実験動物より採血
し、血清中のＣＳＦ濃度をマウス骨髄細胞を用いて測定
した。

【０１２８】結果を第３図に示す。図において横軸は各
種濃度（ＧＩＦ単位／個体）のポリペプチドＩの投与後
時間（hr）を、縦軸はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ血清）を
各々示す。また図中（１）はポリペプチドＩの１０万Ｇ
ＩＦ単位／個体投与群を、（２）は同１万ＧＩＦ単位／
個体投与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ単位／個体投
与群を、また（４）は対照群（ＨＳＡ１０μｇ／個体投
与群）を示す。

【０１２９】第３図より、ポリペプチドＩを動物に与え
た場合、動物血清中のＣＳＦ濃度は著しく高くなってい
ることが判明した。即ち、ポリペプチドＩは注射された
量に比例して生体内でのＣＳＦ産生を著しく亢進させる
作用のあることが認められた。

【０１３０】

【薬理試験例２】ポリペプチドＩの抗関節炎試験 パースン〔Pearson,C.M., Proc.Soc.Exp. Biol.Me
d.,91,95(1956) 〕及びワードとジヨーンズ〔Ward,J.
R., Jones,R.S., Arthritis Rheumatism,5,557(1962)
〕の方法に準じて、アジュバント関節炎ラットを作製
した。即ち、雌性Ｓ．Ｄ．系ラットの尾根部皮内にミコ
バクテリウム・ブチリカム（Ｍycobacterium butyricu
m）死菌を流動パラフインに懸濁させたアジュバントを
０．０５ｍｌ注射した。１４日目に足腫脹に基づいて群
分けし（ｎ＝６）、その翌日より５日間に亘って、ポリ
ペプチドＩ又はその溶媒（生理食塩水；対照群）を、皮
内投与した。経日的に足容積を測定することにより、関
節炎に対する影響を評価した。

【０１３１】結果を第４図に示す。図において横軸はア
ジユバント投与後日数（日）を、縦軸は足体積（×０．
０１ｍｌ）を各々示す。また図中（１）はポリペプチド
Ｉの１０万ＧＩＦ単位／個体投与群を、（２）は同１万
ＧＩＦ単位／個体投与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ
単位／個体投与群を、（４）は同１００ＧＩＦ単位／個
体投与群を、（５）は対照群（生理食塩水投与群）を、
また（６）は正常ラット群を示す。

【０１３２】第４図より、対照群（グラフ（５））の足
腫脹は２３日目まで増悪したのに対し、ポリペプチドＩ
の投与群（グラフ（１）〜（４））においては、その投
与の４日目（アジュバンド投与後１８日目）より、足腫
脹の抑制作用が認められ、最終投与４日後（アジュバン
ド投与後２３日目）においても関節炎の進行を阻止でき
ることが確認された。

【０１３３】

【薬理試験例３】ＩＬ−１β誘導体のＣＳＦ産生促進効
果試験 細胞株Ｕ−３７３ＭＧ〔ＡＴＣＣ ＨＴＢ１７、Ｇliob
lastoma,Ａstrocytoma, Ｈuman〕を用いて、以下の試験
を行なった。

【０１３４】上記細胞を、２×１０⁵ 個／ｍｌの細胞濃
度となるように、１０％ＦＣＳ（GIBCO 社製）、ＭＥＭ
非必須アミノ酸（Flow社製）及びＭＥＭピルビン酸ナト
リウム（Ｆlow 社製）を添加したイーグルＭＥＭ培地
（日水社製）に浮遊させ、種々の濃度となるように被験
物質を加えて、炭酸ガス培養器内で３７℃で２４時間培
養した。

【０１３５】各培養上清を集め、之等培養上清中に産生
蓄積されたＣＳＦ量を、マウス骨髄細胞を使用して測定
した〔Lewis,I.C. et al., J.Immunol.,128,168(19
2)〕。

【０１３６】結果を第５図に示す。図において横軸は被
験物質の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸はＣＳＦ活性（Ｕ
／ｍｌ）を示す。また図中曲線（１）〜（７）は以下の
ポリペプチドを被験物質とした時の結果を示す。

【０１３７】曲線（１）…ポリペプチドＶＩ 曲線（２）…ポリペプチドＩＩ 曲線（３）…ポリペプチドＶＩＩＩ 曲線（４）…ポリペプチドＶ 曲線（５）…ポリペプチドＩＶ 曲線（６）…ポリペプチドＩＩＩ 曲線（７）…ポリペプチドＸＸＸ

【０１３８】

【薬理試験例４】ＩＬ−１β誘導体の抗炎症試験 ウインター(Winter ）らの方法〔Proc.Soc. Exptl.Bio
l.Med.,111,544-547(1962) 〕に準じてこの試験を行な
った。

【０１３９】即ち、６〜８週齢の雄ラット（Spraque Da
wley系、日本チャールスリバー社）を、実験前日に体重
に基づいて１群６〜８匹の各群に分けて用いた。起炎剤
としてカラゲニン（Marine Colloid社製）を、生理食塩
水に１％となるように懸濁させたものを使用し、ラット
の右後肢足蹠皮下に０．１ｍｌ注射して足浮腫を惹起さ
せた。足浮腫を評価するため、起炎剤注射の前後の一定
時間に、右後肢足蹠容積を、プレシモメーター（plethy
smometer，Ugo-Vasile社製）を用いて測定した。前値に
対する起炎剤注射後の容積増加率を浮腫率（swelling
％）として表わした。

【０１４０】被験物質は、ダルベッコのリン酸塩緩衝食
塩水(Dulbeco's phosphate buffered saline) に溶解希
釈し、ラットの背部皮内に０．１ｍｌ宛、起炎剤注射の
１時間前に注射した。尚対照群として溶媒投与群を作成
し、同一実験に供した。

【０１４１】結果を第６図に示す。

【０１４２】図において横軸は、起炎剤投与後時間（ｈ
ｒ）を、縦軸は浮腫率（％）を示す。また、図中、曲線
（１）は対照群を、曲線（２）はポリペプチドＶＩの
０．１μｇ投与群を、曲線（３）はポリペプチドＶＩの
１μｇ投与群を、曲線（４）はポリペプチドＶＩの１０
μｇ投与群をそれぞれ示す。

【０１４３】

【薬理試験例５】ＩＬ−１β誘導体の放射線障害防止作
用試験 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照射
する２０時間前に、ポリペプチドＶＩの１μｇ／マウス
又は０．３μｇ／マウスを腹腔内注射した。Ｘ線照射装
置（ＭＢＲ−１５０５Ｒ、日立メディコ社）を使用し、
８５０レントゲンのＸ線を、上記マウスに全身照射し、
以後、毎日その生存を確認した。尚、コントロールとし
てＰＢＳ投与群をおいた。

【０１４４】結果を第７図に示す。図において横軸はＸ
線照射後の日数（日）を、縦軸は供試動物の生存率
（％）を示し、曲線（１）はポリペプチドＶＩの１μｇ
投与群を、曲線（２）はポリペプチドＶＩの０．３μｇ
投与群を、また曲線（３）はコントロール群をそれぞれ
示す。

【０１４５】第７図より、コントロール群ではＸ線照射
後１８日目に全例死亡したのに対し、ポリペプチドＶＩ
投与群では、その投与量に依存して、放射線障害の防止
作用が認められ、１μｇ投与群では、約８割が放射線障
害による死亡から回避され、生存することが確認され
た。

【０１４６】

【薬理試験例６】ＩＬ−１β誘導体の日和見感染防御効
果試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施した。

【０１４７】ＩＣＲ系雄性マウス（６週齢）を供試動物
（１群７匹）とし、第１日目に５−フルオロウラシル
（５−Ｆｕ、協和醗酵社製）１００ｍｇ／ｋｇを静脈内
投与した。第２日目、第４日目及び第６日目にポリペプ
チドＶＩの１μｇ／マウスを皮下投与し、第７日目に、
緑膿菌（Ｐseudomonas aeruginosa Ｅ−２）の所定量を
腹腔内投与して感染させた。第１０日目に供試動物の生
存数を計数して、生存率（％）を求めた。

【０１４８】結果を第８図（１）〜（３）に示す。

【０１４９】第８図（１）は上記実験群の結果を、同
（２）はポリペプチドＶＩを投与しなかった（５−Ｆu
のみを投与した）対照群の結果を、また同（３）は５−
Ｆｕ及びポリペプチドＶＩのいずれも投与しなかった対
照群の結果をそれぞれ示す。

【０１５０】第８図中、縦軸は生存率（％）を、横軸は
下記各緑膿菌投与量を採用した群Ａ〜Ｅを各々示す。

【０１５１】Ａ群…１９０００菌数／マウス投与群 Ｂ群… ３８００菌数／マウス投与群 Ｃ群… ７５０菌数／マウス投与群 Ｄ群… １５０菌数／マウス投与群 Ｅ群… ３０菌数／マウス投与群 Ｆ群… ６菌数／マウス投与群 〈動物細胞からのサイトカインの製造方法〉 種々の濃度のポリペプチドＸＸＸＶＩＩ及び０．０
１％ＰＨＡ−Ｐ存在下に、ＨＢＳ−２Ｃ５Ｂ２細胞〔J.
Immunol., 131,1682-1689(1985) 〕を、２×１０⁵ 細胞
／ウェルにて培養した。培養２４時間後の上清を採取
し、そのＩＬ−２活性を、スミス（K.A.Smith ）らの方
法に従い、ＩＬ−２依存性マウスＴ細胞（ＣＴＬＬ２）
を用いて測定した〔J.Immunol., 120,2027(1978)〕。

【０１５２】結果を下記第５表に示す。

【０１５３】

【表１６】

【０１５４】 Ｕ−３７３ＭＧ細胞を、１０％ＦＣＳ
加ＲＰＭＩ−１６４０培地で集密的まで培養し、更に２
０ｎｇ／ｍｌのポリペプチドＸＸＸＶＩＩを含む又は含
まない（コントロール）上記培地中で１８時間インキュ
ベートした。

【０１５５】培地を除去した後、グアニジニウム／セシ
ウムクロライド法によりＲＮＡを抽出し、オリゴ(dＴ）
−セルロース クロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）
^* ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を収得した。ノザン・ブロッティ
ング法（Northern blotting）に従い、上記ポリ（Ａ）
^* ＲＮＡ１０μｇをアガロースゲル（１．２％）電気泳
動に付し分画後、ニトロセルロース・フィルターに転写
した。減圧下８０℃でベーキングし、２０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）中で１００℃下に、５分間処理後、
５０％フォルムアミド、５×ｓｓｃ、５０ｍＭソジウム
フォスフェート（ｐＨ６．５）、４×デンハード液（De
nhardt's solution ）及び２００μｇ／ｍｌの変性サル
モン スペラムＤＮＡ中で４２℃下にプリハイブリダイ
ゼーションを行なった。５時間後、ニックトランスレー
ションで放射能標識したＧＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ［Scienc
e, 228,810(1985)］のＰstＩ−ＮcoＩＤＮＡ断片又はＢ
ＳＦ−２ｃＤＮＡ［Nature, 324,73(1986)］のＫpnＩ−
ＢamＨＩＤＮＡ断片と、４２℃下に２０時間ハイブリダ
イゼーションを行なった。フィルターを０．１％ＳＤＳ
加２×ｓｓｃで室温下に１５分間、更に０．１％ＳＤＳ
加０．１×ｓｓｃで５０℃下に１時間洗浄した。オート
ラジオグラムは、増感紙を用いて、−７０℃下に一夜行
なった。

【０１５６】その結果、ＧＭ−ＣＳＦのＤＮＡ断片を用
いた場合も、ＢＳＦ−２のＤＮＡ断片を用いた場合も、
ＩＬ−１β誘導体の利用により、動物細胞からの天然サ
イトカイン類の生産が効率よく行ない得ることが判っ
た。

【０１５７】また、ＩＬ−１β誘導体の、かかる方法へ
の適用に際しては、極めて微量、通常１０ng／ｍｌ程度
の使用で十分であり、誘導されたサイトカイン類の精製
過程をも容易にする。

【０１５８】 動物細胞よりサイトカインを生産する
場合、産生誘引に使用するＩＬ−１β活性物がその条件
下において構造的に安定であり、細胞表面上のＩＬ−１
受容体に結合することが必須である。即ち、ＩＬ−１β
活性物がＩＬ−１受容体に結合し、サイトカイン産生に
必要なシグナルを細胞内に伝えることが重要である。そ
こで、線維芽細胞上のＩＬ−１受容体への結合に関し
て、以下の試験を行なった。即ち、６−ウェルプレート
上で、一面にほぼ均一にまで増殖したＢalb ／３Ｔ３細
胞（クローンＡ３１：ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１６３、１×
１０⁶ 細胞／ウェルに、 ¹²⁵Ｉで標識したポリペプチド
Ｉ（ＩＬ−１β）の５００００cpm ／ウェル及び事前に
１０％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭ中で３７℃下にインキユベー
トした２０ng／ｍｌのポリペプチドＩを加え、４℃で反
応させた。反応液をパスツールピペットで除き、１０％
ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭの１ｍｌを加えて静かに洗い上清を
捨てた。この洗浄操作を２回繰返した後、１ｍｌの１％
ＳＤＳ、０．２Ｎ ＮａＯＨで細胞を可溶化し、可溶化
液及び更にウエルを洗浄した可溶化液中の放射能（結合
放射能）をγ−カウンターにて測定した。

【０１５９】尚、上記 ¹²⁵Ｉ標識ポリペプチドＩは、ボ
ルトンとハンター（Bolton Hanter)の方法〔Biochem.
J., 13 3,529(1973) 〕に従い製造精製した（比活性；２
５０μＣｉ／μｇ蛋白以上）。

【０１６０】得られた結果を下記第６表に示す。

【０１６１】

【表１７】

【０１６２】尚、表中阻止能は次式により求めた。

【０１６３】 阻止能（％）＝（Ａ−Ｃ）／（Ａ−Ｂ）×１００ Ａ：未標識ポリペプチドＩが存在しない時の結合した放
射能 Ｂ：プレートに非特異的に吸着した放射能 Ｃ：結合した放射能の実測値 かかる指標は、共存させたポリペプチドＩのＩＬ−１受
容体への結合力を表わす。

【０１６４】上記第６表より、ポリペプチドＩ、即ちＩ
Ｌ−１β自体は、サイトカイン誘導条件下において、時
間の経過と共に、ＩＬ−１受容体への結合力が低下して
しまうことが明らかとなった。

【０１６５】上記において、２４時間の事前のインキュ
ベーションを行ったポリペプチドＩ、ポリペプチドＶＩ
又はポリペプチドＸＸＸＶＩＩを用いた同試験を行なっ
た結果を第６表と同様にして第７表に示す。

【０１６６】

【表１８】

【０１６７】上記結果より、動物細胞からのサイトカイ
ン類の製造に際しては、ＩＬ−１β誘導体の採用がより
好ましいことが判る。

【０１６８】

【実施例１】 ＧＩＦ活性［前記した方法において、ヒトメラノー
マ細胞としてＡ３７５Ｓ１株（微工研菌寄第９６７０
号）を用いて測定した］として４５０００単位／ｍｌ
（約１μｇ蛋白量／ｍｌ）のポリペプチドＶＩ、ツウィ
ーン８０（ポリソルベート８０：日本サーファクタント
社製）０．０１ｍｇ／ｍｌ及びマルトース１５ｍｇ／ｍ
ｌとなる量の各成分を、０．０１Ｍクエン酸−クエン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に加えて混合し、混合
物を濾過（０．２２μｍメンブラーフィルター使用）
後、濾液を無菌的に１ｍｌずつバイアル瓶に分注し、凍
結乾燥して、注射用製剤形態の本発明組成物を調製し
た。該製剤は、これを用時、生理食塩水１ｍｌに溶解し
て利用される。

【０１６９】 上記と同様にして、ポリペプチドＩ
Ｉ又はポリペプチドＸＸＶを有効成分として含有する注
射用製剤形態の本発明組成物を調製した。

【０１７０】他のＩＬ−１β活性物も略同様にして、注
射用製剤形態に調製できる。

【０１７１】 安定性試験 上記で得られた製剤を用いて、その安定性を下記方法
により試験した。

【０１７２】（Ｉ）方法Ｉ：凍結乾燥した上記製剤を、
ガラス瓶（気密、遮光）容器中、４℃又は室温下にそれ
ぞれ保存した。安定性の判定は、下記判定基準に基づい
て１、２、３及び６ケ月間それぞれ保存後に評価した。

【０１７３】〈判定基準〉 性状（外観）：試験開始時と同じく白色の塊である時
「変化なし」と判定した。

【０１７４】性状（溶状）：生理食塩水１ｍｌに溶かし
た溶液が無色透明である時に「変化なし」と判定した。

【０１７５】水素イオン濃度：開始時のｐＨ値（５．６
５）の±０．２の範囲を「変化なし」と判定した。

【０１７６】浸透圧比：開始時の値を１００％とした時
９５〜１０５％の範囲内にある時を「変化なし」と判定
した。

【０１７７】尚上記判定は１サンプルにつき３バイアル
の結果の平均をもって評価した。

【０１７８】（ＩＩ）結果：全ての保存温度及び全ての
保存期間において、本発明の製剤はいずれも上記基準に
より「変化なし」と判定された。上記試験における６ケ
月の保存後の測定データー（平均値）を第８表に示す。

【０１７９】

【表１９】

【０１８０】（ＩＩＩ）方法ＩＩ：凍結乾燥した上記製
剤を、生理食塩水１ｍｌに溶かした後、３日間、４℃又
は室温下に保存し、その溶状及び水素イオン濃度を、上
記方法Ｉに準じて測定評価した。

【０１８１】（ＩＶ）結果：上記試験ＩＩの結果を第８
表と同様にして第９表に示す。

【０１８２】

【表２０】

【０１８３】上記試験の結果（第８表及び第９表）よ
り、本発明組成物は、極めて安定であることが判る。

【０１８４】（Ｖ）方法ＩＩＩ：凍結乾燥した上記製剤
を、ガラス瓶（気密、遮光）容器中、４℃又は室温下に
それぞれ保存した。安定性の判定は、下記判定基準に基
づいて、１、２及び４週間保存後に評価した。

【０１８５】〈判定基準〉 含量（％）：試験開始後のＩＬ−１β活性物の含量を１
００％とした時、９５〜１０５％の範囲内にある時を
「変化なし」と判定した。

【０１８６】尚、ＩＬ−１β活性物の含量は、下記条件
の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：トーソー社
製ＨＰＬＣシステム）によって測定した。

【０１８７】カラム：ＴＳＫ ＯＤＳ−１２０Ｔ（４．
６φ×１５０ｍｍ：トーソー社製） 溶媒：Ａ液＝０．１％ＴＦＡ−水 Ｂ液＝０．１％ＴＦＡ−アセトニトリルグラジエントプ
ログラム 検 出：紫外線吸収（２２０nm） （ＶＩ）結果：全ての保存温度及び期間において、いず
れも「変化なし」と判定された。尚、４週間保存後の測
定データー（平均）を下記第１０表に示す。

【０１８８】

【表２１】

【０１８９】

【実施例２】 実施例１のにおいて、その配合成分を下記イ〜ホ
とする以外は同様にして、それぞれ注射用製剤形態の本
発明組成物を調製した。

【０１９０】 イ．ポリペプチドＶＩ １０μｇ／ｍｌ ツウィーン８０ ０．０１ｍｇ／ｍｌ デキストラン４０ １５ｍｇ／ｍｌ システイン ０．１ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ １ｍｇ／ｍｌ （同一緩衝液使用） ロ．ポリペプチドＶＩ １０μｇ／ｍｌ ツウィーン８０ ０．０１ｍｇ／ｍｌ ショ糖 １５ｍｇ／ｍｌ システイン ０．１ｍｇ／ｍｌ （同一緩衝液使用） ハ．ポリペプチドＶＩ １０μｇ／ｍｌ ツウィーン８０ ０．０１ｍｇ／ｍｌ マンニトール １５ｍｇ／ｍｌ システイン ０．１ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ １ｍｇ／ｍｌ （同一緩衝液使用） ニ．ポリペプチドＶＩ １０μｇ／ｍｌ ツウィーン８０ ０．０１ｍｇ／ｍｌ イノシトール １５ｍｇ／ｍｌ システイン ０．１ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ １ｍｇ／ｍｌ （同一緩衝液使用） ホ．ポリペプチドＶＩ １０μｇ／ｍｌ ツウィーン８０ ０．０１ｍｇ／ｍｌ マルトース １５ｍｇ／ｍｌ システイン ０．１ｍｇ／ｍｌ （０．０１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）使用） 上記で調製した各製剤の安定性を下記方法により
試験した。

【０１９１】（Ｉ）方法：上記製剤を、ガラス瓶（気
密、遮光）容器中、４℃又は２５℃下にそれぞれ保存
し、１、２及び４週間保存後に、前記安定性試験に示
した判定基準に従い、各製剤の性状（外観及び溶状）並
びに含量（％）を評価し安定性を調べた。

【０１９２】（ＩＩ）結果：全ての製剤（上記イ〜ホ）
において、全ての保存条件下で「変化なし」と判定され
た。尚、４週間保存後の測定データー（平均）を下記第
１１表に示す。

【０１９３】

【表２２】

【０１９４】以上の各試験結果より、本発明組成物は、
ＩＬ−１β活性物の安定化に極めて優れたものであるこ
とが判る。

【０１９５】

【実施例３】 ＩＬ−１β活性物［ポリペプチドＶＩ］０．１μｇ
／ｍｌ又は０．０１μｇ／ｍｌを含む下記組成の本発明
組成物をガラスバイアル瓶、シリコンコートガラスバイ
アル瓶、ポリプロピレン容器及びポリスチレン容器の各
々に入れて本発明組成物を調製した。

【０１９６】〈配合組成〉 ＩＬ−１β活性物 0.1又は 0.01 μｇ／ｍｌ ０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０） ショ糖 ５ｍｇ システイン ０．１ｍｇ 人血清アルブミン 0.01 〜10ｍｇ／ｍｌ 上記で調製した本発明組成物のそれぞれにつき、
以下の吸着防止試験を行なった。即ち、各組成物試料
を、２日間及び４日間それぞれ４℃に放置後、ＩＬ−１
活性物の残存量を以下のエンザイムイムノアッセイによ
り測定した。

【０１９７】〈エンザイムイムノアッセイ〉９６穴マイ
クロプレートにマウス抗ＩＬ−１β活性物モノクローナ
ル抗体１００μｌ／ウェルを加え、４℃で一夜放置す
る。洗浄後、１％ウシ血清アルブミン４００μｌを加
え、室温で３０分間放置し、ブロッキングを行なわせ
る。洗浄後、試料の段階希釈液１００μｌを加え、４℃
で一夜放置後、洗浄する。ウサギ抗ＩＬ−１β抗体〔Cl
inica Chimica Acta, vol.166, p237-246(1987) 及びEu
rop.J.Immunolog., vol.17,1527-1530(1987)参照〕の１
００μｌを加え、３７℃で２時間放置する。洗浄した
後、パーオキシダーゼ標識抗体ウサギグロブリン（バイ
オラッド社製）溶液１００μｌを加えて３７℃で２時間
放置する。洗浄後、基質溶液１００μｌを加えて室温で
２〜１５分間放置する。２Ｎ硫酸で反応を停止させ、４
９２nmの吸光度を測定する。別に、ＩＬ−１β活性物の
既知濃度の溶液で検量線を作成し、この検量線より試料
のＩＬ−１β活性物の濃度を求める。

【０１９８】得られた結果を第１２表に示す。

【０１９９】但し第１２表中、容器の種類^* の項におけ
る１はガラスバイアル瓶を、２はシリコンコートガラス
バイアル瓶を、３はポリプロピレン容器を、また４はポ
リスチレン容器をそれぞれ示す。

【０２００】この第１２表より、本発明組成物試料はい
ずれも容器へのＩＬ−１βの吸着が認められないことが
明らかである。

【０２０１】

【表２３】

【０２０２】

【表２４】

【０２０３】

【実施例４】 ＩＬ−１β活性物（ポリペプチドＶＩ）１μｇに人
血清アルブミン０．１ｍｇ、０．０１Ｍクエン酸−クエ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）及び下記第１３表
に示す各成分を加えて混合し、混合物を濾過（０．２２
μｍメンブランフィルター使用）後、濾液を無菌的に１
ｍｌずつガラスバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して、注
射用製剤形態の本発明組成物を調製した。

【０２０４】

【表２５】

【０２０５】 上記で調製した各本発明試料の安定
性を以下の試験により調べた。即ち、凍結乾燥した各試
料をガラスバイアル瓶（気密、遮光）中、２５℃、５０
℃又は７０℃下に各々１、２又は４週間保存した（但し
７０℃下では１週間のみ保存した）。

【０２０６】ＩＬ−１β活性物の残存量は、下記クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ：トーソー社製ＨＰＬＣシステ
ム）により測定した。

【０２０７】カラム：ＴＳＫ Ｃ₁₈−ＮＰＲ（４．６φ
×３５ｍｍトーソー社製） 溶媒：Ａ液＝０．１％ＴＦＡ−水 Ｂ液＝０．１％ＴＦＡ−アセトニトリルグラジエントプ
ロクラム 検出：紫外線吸収（２１０ｎｍ） 残存率（％）＝（所定時間経過後の残存量）／（初期
量）×１００ 得られた結果を第１４表に示す。

【０２０８】

【表２６】

【０２０９】上記第１４表に示す通り、４週間、２５℃
の保存では全ての本発明組成物試料において変化が見ら
れず、４週間、５０℃の保存では本発明組成物試料Ｎo.
チ及びワにおいて変化は認められず、１週間、７０℃の
保存では本発明組成物試料Ｎo.ワのみ変化が認められな
かった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ポリペプチドＩのＣＳＦ産生促進効果試験結果
を示すグラフである。

【図２】ポリペプチドＩのＣＳＦ産生促進効果試験結果
を示すグラフである。

【図３】ポリペプチドＩのＣＳＦ産生促進効果試験結果
を示すグラフである。

【図４】ポリペプチドＩの抗関節炎試験結果を示すグラ
フである。

【図５】ＩＬ−１β誘導体のＣＳＦ産生促進試験結果を
示すグラフである。

【図６】ＩＬ−１β誘導体の抗炎症試験結果を示すグラ
フである。

【図７】ＩＬ−１β誘導体の放射線障害防止作用試験の
結果を示すグラフである。

【図８】ＩＬ−１β誘導体の日和見感染症防止作用試験
の結果を示すグラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】インターロイキン−１β活性物と共に、人
   血清アルブミンを含有させることを特徴とするインター
   ロイキン−１β組成物の安定化方法。
2. 【請求項２】更に糖類を含有させる請求項１に記載の安
   定化方法。
3. 【請求項３】糖類がショ糖である請求項２に記載の安定
   化方法。
4. 【請求項４】インターロイキン−１β組成物がクエン酸
   −クエン酸ナトリウム緩衝液を含有する請求項１に記載
   の安定化方法。
5. 【請求項５】インターロイキン−１β活性物１μｇ当り
   ０．１〜１０ｍｇの人血清アルブミンを含有させる請求
   項１〜４のいずれかに記載の安定化方法。