JPS61197527A - インタ−ロイキン−２組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は医薬品などとして有用なインターロイキン−２
組成物に関する。

従来の技術 インターロイキン−２（以下ＩＬ−２と略称することが
ある）は生体内で免疫調節に中心的な役割をはたしてお
り直接的あるいは間接的に癌の排除や免疫失調からの回
復やその改善に働くと考えられているＴ細胞やナチュラ
ルキラー細胞の増加因子としての機能を有する蛋白質で
ある〔ネイチャー、第３０２巻、（０５−３１０頁Ｃ１
９８３）１かかる生理作用を有するためＩＬ−２は新し
い制癌剤あるいは免疫失調治療剤としての応用が強く期
待されている。

本発明者らは、ＩＬ−２が不安定であって水溶液の保存
、凍結あるいは凍結乾燥の操作および凍結乾燥後の保存
において、とりわけ凍結乾燥を行う際の乾燥操作におい
て容易に活性が減じ、また凍結乾燥品の再溶解した液に
濁りを認める等の間鮪点を有し、医療用等に用いる上で
はなはだ不都合であることを見い出した。

かかる事実に鑑み、本発明者らは鋭意研究を進めた結果
、安定な工Ｌ−２組成物の製造に成功し、本発明を完成
した。

問題点を解決するだめの手段 本発明は、ヒト血清アルブミンまたは（および）還元性
物質を配合し、溶液状態でｐａ　３〜６を示すように調
整したＩＬ−２組成物を提供するものである。

本発明のＩＬ−２は、咄乳動物のものであればいかなる
ものでもよいが、ヒトのものが好ましい。

まだＩＬ−２は、天然の、あるいは遺伝子組み換え技術
で得られるいずれのものでもよく、遺伝子組み換え技術
で得られるものが有利に用いられ、通常ＩＬ−２水溶液
として用いる。

好ましいＩＬ−２の例として式 ％式％ ］ 口式中、ＸはＭｅｔまたは水素を示す〕で表わされる遺
伝子組み換え技術で製造される非グリコジル化ヒ）工Ｌ
−２を挙げることができ、これらの混合物でもよい。

なお式（Ｉ）においてアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣ−Ｔ
ＵＢ　　コミッション　オン　バイオケミカル　ノメン
クレイチャによる略号で示した。

またＴＬ−２（１）比活性は２０，０００〜８０．００
０単位／■であることが望ましく、ＩＬ−２水溶液とし
て１〜ｇｏ、ｏｏｏ単位／　ｍｅ　、とりわけ１０〜５
０．０００単位／　ｍｌの活性を有するものが有利に用
いられる。上記本発明の原料としてのＩＬ−２水浴液は
食塩トの塩を含まないものが好ましく、ＩＬ−２のｖ４
製工程等で塩が混在した場合は、限外沖過等によシこれ
を除去して用いることが好ましい。

ヒト血清アルブミン（以下ＩＳＡと略記する）としては
、いかなるものでもよいが、本組成物を臨床応用するた
めには、非経口投与に用いる程度の品質のものが好まし
い。

例えば、健康人血漿を原料としてＣｏｈｎのエタノール
分画第６法によって、分画精製したものが用いられる。

また安定剤としてアセチルトリプトファンナトリウムや
、カプリル酸ナトリウムを含有するものであってもよい ＵＳＡは上記濃度ＩＬ−２水溶液に対し水溶液ｌ１当り
０．１η〜５０Ｍｇ、とりわけ０．５吋〜２０ｑ含有さ
せることが好ましい。

還元性物質としては、生理学的に許容しうる還元性物質
が好ましく、例えば、還元型グルタチオン（以下グルタ
チオンと略記する）、チオクト酸、Ｎ−アセチルシステ
ィン、Ｎ−アセチｐホモシヌテイン、チオジグリコーμ
、チオエタノ−μアミン、モノチオグリセロ−／Ｉ／、
ジチオスレイト−！及び炭素数１〜７のチオアルカン酸
（例、チオグリコール酸、チオリンゴ酸）などの還元性
硫黄化合物やアスコルビン酸およびこれらの塩などが挙
げられ、なかでもグルタチオン、チオクト酸。

Ｎ−アセチルシスティン及び炭素数１〜７のチオアルカ
ン（ｔ）、アメコルビン酸など酸性還元性物質が好まし
く、とシわけグルタチオンまたはアスコルビン酸が好ま
しい。

また上記還元性物質は、１種または２種以上併用するこ
ともできる。

これら還元性物質は、上記濃度ＩＬ−２水溶液に対し、
水溶液１　ｔｘｌ当り０．０１η以上、とりわけ０．０
５〜２０■含有させることが好ましい。

上記Ｈ３Ａまたは還元性物質は、上記所定量で両者掛川
してまたはＵＳＡもしくは還元性物質単独で用いること
ができ、とりわけＵＳＡが好ましい。

本発明のＩＩ、−２ｍｍ動物は前記Ｈ８Ａまたは（およ
び）還元性物質に加えグリシン、グルタミン酸、アヌパ
ヲギン酸、アヲニン、プロリンなどのアミノ酸とりわけ
モノアミノ脂肪族アミノ酸、もしくは環状アミノ酸、ブ
ドウ糖、マンノースなどの単糖類、ソルビット、マンニ
ット等の糖アμコール類、およびこれらの生理学的に許
容できる塩もしくは誘導体の１種または２＠以上を配合
してもよい。これら配合剤のうちでも、とシわけグリシ
ンが好ましい。

上記配合剤は、上記ＩＬ−２水溶液１　ｍｌｌクシ単糖
類または糖アルコーｐ類に関しては１０〜１００ダ、ア
ミノ酸に関しては５〜５０■／　ｍｌ配合することが好
ましい。

さらに本発明のＩＬ−２，ｍ放物は食塩などの等張化剤
、コハク酸、酒石酸、クエン酸等の緩衝剤、界面活性剤
などを含有していてもよい。しかし、凍結乾燥時の安定
化の観点からは、本発明のＩＬ−２組成物は食塩を含ま
ないものが好ましい。

本発明の工Ｌ−２組成物を溶液状態でＰＨａ〜６、好ま
しくはｐＨ３〜５．５、とりわけｐＨ８，ａ〜４．５を
示すように調整するために、酸性還元性物質やグルタミ
ン酸など酸性アミノ酸を配合する場合は該物質を上記所
定負加えることによシ、所定のｐＨに調製でき、また所
望により、または上記酸性物質を配合しない場合は塩酸
、リン酸等の拡酸、もしくはコハク酸、酒石酸、クエン
酸等の緩衝剤で所定のｐＨに調製する。

また上記工Ｌ−２組成物の容器の空間部を真空にするか
窒素ガス置換することによｆｉＩＬ−２組成物の安定性
をさらに高めることができる。

本発明のＩＬ−２組成物は、水溶液、凍結品。

凍結乾燥品の形態が好ましく、とりわけ凍結乾燥品が好
ましい。

本発明の組成物は、たとえは以下の方法により製造する
ことかできる。

■Ｌ−２を１〜８０，０００単位／　ｍｌ含有する水溶
液に、Ｈ８Ａ’！たけ（および）還元性物質を前記所定
の濃度になるように加え、前記した方法でｐＨ調整を行
なう。

単糖類、楯アルコー／Ｌ’知、アミノ酸などもそこに記
載した濃度として加えることもできる。また所望によシ
等俵化剤、界面活性剤なども加えることができる。なお
、Ｅ［ＳＡ以外の物質を添加する場合には、最終水溶液
のｐＨが前記ＰＲを示すように、前記した方法でｐＨ調
節を行う。かくして得られる水溶液としての工Ｌ−２組
成物は、下記の凍結および凍結乾燥品の原料としても用
いることができる。

凍結品としてのＩＬ−２組成物は、たとえば上記水溶液
を通常−８０〜−２０℃で凍結することにより製造でき
る。該凍結組成物は一８０°〜−１θ℃で保管すること
が好ましい。

凍結乾燥品としてのＩＬ−２組成物は、例えば上記凍結
組成物を常法により減圧乾燥するか上記水溶液または上
記凍結組成物の融解により得られる水溶液を、所望によ
シ小分けし、上記同様凍結した後、常法により減圧乾燥
することによシ製造することができる。

また前記の方法により製造し、工Ｌ−２，ＵＳＡまたは
（および）還元性物質及びｐＨ調節剤等を含有する凍結
乾燥品を、例えば前記した単糖類。

糖アルコー／Ｌ／類、アミノ酸等を含有し、所望により
塩酸等でｐｌ（調整された溶解液によって再溶解するこ
とによって溶液状愈としての本発明の工り一２組成物を
製造することができる。

注射用製剤をしての本発明の凍結乾燥したＩＬ−２組成
物を製造する場合は、ＩＬ−２を含有する水溶液および
配合剤含有水溶液をそれぞれ除菌濾過して混合するか、
これらの混合液を小分けする前に除菌濾過等によシ！＃
製し、無菌操作によシバイアｌｖ瓶等に分注小分けした
後上記凍結乾燥処理に付すことが好ましい。

また、アミノ酸や単糖＠あるいは糖ア〃コーρ類を含有
する水溶液で、凍結乾燥品を溶解する場合には、その水
溶液は除菌濾過し、無菌操作によりアンプル等に分注小
分後、常法により蒸気滅菌したものを用いることが好ま
しい。

作　　用 本発明のＩＬ−２組成物は、保存中および凍結や凍結乾
燥操作におけるＩＬ−２活性の低下が少なく、また凍結
乾燥品においてはその再溶解時の溶状がり明である点等
に優れた特徴を有するものである。

本発明のＩＬ−２組成物、とりわけその凍結乾燥品は、
その外観が向上し、その器壁への吸着が防止される効果
をも奏するものである。

さらにアミノ酸を配合した組成物は凍結乾燥品とした場
合にその外観が向上し、注射剤として投与する場合の疼
痛を軽減する効果をも奏する。

また単糖類を配合した組成物は注射剤として投与する場
合の疼痛を軽減する効果をも奏する。

本発明のＸ、Ｌ−２組成物の中で、とりわけ凍結乾燥品
は、安定化されたＩＬ−２の粉末として得られ、とシわ
け非経口投与製剤として有利に用いることができる。注
射用製剤として用いる場合には通常用時、凍結乾カイ千
組成物を０．５〜１００ｓ＋ｔの注射用蒸留水、生理食
塩液等に溶解するか、グリシン等のアミノ酸、ブドウ糖
等の単糖類、またはマンニット等の糖アｙニー／Ｌ／類
の必要であれはｐＨ調整された水溶液を凍結乾燥組成物
の専用の溶解液として添付する場合にはその溶解液０．
５〜１００ｍ１で溶解し、筋肉内あるいは静脈内に投与
する。

また適当な担体、賦型剤、希釈剤を用いて口腔内。

眼、耳、譚内投与用のハ１」形として用いることができ
る。

本発明のＩＬ−２組成物は、代街性で、公知の工Ｌ−２
と同様の目的に同様の用法により使用することができる
。

本題明細書中工Ｌ−２の活性としての単位（Ｕ）の算出
方法は以下のようにして行った。

すなわち、■Ｌ−２濃度に依存して増殖するマウス矧胞
株を浮遊した培地にＩＬ−２を含む検体を加えて培養し
、該細胞株の増殖をトリチウムチミジンの取込を指標と
して求めｆｃ。目的とする検体中のユニット（Ｕ）算出
のためには、常に橡準Ｉ−Ｌ−２（ｌＵ／＊ｔ）を並べ
てアッセイを夾万′！（シて、その比率からユニットを
算出した。

具体的には、ヒトエＬ−２を含有するコンディションド
メジウムを含む２０％ＦＣ３７ＪＩＲＰＭ１１６４０培
地中で、３７°Ｃで５％ＣＯ２の存在下に継代維持され
たＩＬ−２依存性マウス細胞株〔（Ｌｉ　Ｋ　Ｃ３）　
、　Ｈｉｎｕｍａら、バイオケミカル・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケイションス゛。

第１０９巻、３６３頁（１９８２年）〕を無血清ＲＰＭ
工　１６４０培地を用いて２回洗浄し、２０％ＦＣ８加
ＲＰＭＩ　　１６４０培地に６×ｌ♂個／＊ｌになるよ
うに再浮遊する。

ＩＬ−２を含む資料５０μｌを９６穴平底マイクロタイ
タープレート（ヌンク社、デンマーク）の第１列目の穴
に入れ、５０μｌずつの２０％ＦＣ８７１１１ＲＰＭ工
　１６４０培地を用いて第１２列目まで順次２倍段階希
釈系列を作成後、上記ＮＫＣ８細胞浮遊液を５０μｌず
つ各穴に分注し、８７℃で５％Ｃ０２の存在下に２４時
間培養する。培養２０時間目に、各穴に１μＣ１ずつト
リチウムチミジン（アマルシャム社、イギリス）を添加
してさらに４時間培養を継続後、セルハーペヌター（フ
ロー社、アメリカ）を使用して細胞をガラスフィルター
上に回収し、液体ンンチレーションカウンターを用いて
トリチウムチミジンの取込を測定する。測定に際しては
標準工Ｌ−２椋品について資料と同一の操作を行い、ト
リチウムチミジンの取込を測定する。

ユニット（Ｕ）の計算はリサーチｙ・オブ・イムノロジ
ー、第１２０巻、２０２７頁（１９７８年）に準じてプ
ロビット変換法により行う。すなわち、標準ＩＬ−２標
品（ヒト末梢血リンパ球を５×１０　個／　ｗｌとなる
ように１０％ＦＣ８７ＸＩＲＰＭ工　１６４０培地に浮
遊し、コンカナバリン−Ａ４０μｆおよび１２−０−テ
トフデカノイρホルボール−１３−アセテート１５　ｎ
ｇ　／ｍｅを添加して、３７℃で５％ＣＯ２の存在下に
４８時間培養した培ｇＩ液の遠心上前をＩＵ／言ｔと定
める）の希釈系列のうち最大値の取込を１００％として
、各希釈段階の取込値の割合（％）を計算する。得られ
た数値を正規確率紙にプロットし、５０％の取込を示す
希釈倍数を作図から求める。同様にして工Ｌ−２を含む
各資料についても５０％の取込を示す希釈倍数を求める
。

資料のＩＩ、−２ｆｉ度（Ｕ／５ｒｌ）は次式に従って
計算される： 資料が５０％取込を示す希釈倍数 標準工Ｌ−２標品が５０％の取込を示す希釈倍数下記参
考例に開示した形質転換体エシェリヒアコリ（Ｅａｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　ＤＨ１／　ｐ　Ｔ　Ｆ
　４は財団法人発醇研究所に工Ｆ　Ｏ−１４２９９とし
て、また昭和５９年４月６日から通商産業省工業技術院
会生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ−６２８として寄託されている。

実施例 以下の実施例および参考例によって本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

なお実施例において用いた原液は、参考例に記載の方法
で得られた非グリコジル化ヒ）ＩＬ−２蛋白質溶液であ
る。

実施例１ 原液を注射用蒸留水で希釈し除菌濾過して得たと）ＩＬ
−２２４５０単位を含有する水溶液それぞれ０．５　ｍ
ｌに、グルタチオン１０岬またはアスコルビン酸１０１
ｖを含有する除菌ｐ過液０．５　ｄを加え、得られた２
種の水溶液（それぞれｐＨ８，４゜ｐＨ８，５）おのお
の１　ｄをバイアルに分注して一４０℃で凍結し、乾燥
後バイアル空間部をＮ２　　ガスで置換し施栓巻締した
。

ＭｆＨ４としてグルタチオンおよびアスコルビン酸を含
まない同量の水溶液およびグルタチオンおよびアスコル
ビン酸のかわりに凍結乾燥製剤に繁用されるマンニット
２５■を含有する同量の水溶液を同様に凍結乾燥した。

これらの凍結乾燥品をいずれも注射用蒸留水１ｍｌで再
溶解し、これらの溶液の溶状（Ｐｊｌ明度）及び力価を
調べた。力価については凍結乾燥前の水溶液力価を１０
０％とした時の残存率を計算した。

その結果は、第１表に示されるとおり、本発明のＩＬ−
２組成物は対照と比較し溶状、力価残存率共に有意に優
れていた。

第　　１　　表 実施例２ 原液を注射用蒸留水で、希釈し除菌濾過して得たと）Ｉ
Ｌ−２７６８０単位を含有する水溶液それぞれ０．５ｔ
ｘｌＫ、グルタチオン２１１ｇまたはアスコルビン酸２
岬を含有する除菌−過液０．５　ｍｌを加え得られた２
種の水溶液（それぞれｐｉ　８．６．　ｐＨ３，７）お
のおの１　ｍｌを実施例１と同様に凍結乾燥し、実施例
１と同様の方法で製造直後に溶状を、２５℃で１力月保
存後に溶状及び力価残存率を調べた。

その結果は第２表に示す通シであった。

第２表 実施例３ 原液を注射用蒸留水で希釈し除菌濾過して得たヒト１Ｌ
−２７６８０単位を含有する水溶液それぞれ０．５　ｍ
ｌ　Ｋ、Ｈ８Ａ　５１１＃トゲ／にタチ、をン２ｍｇも
しくはアスコルビン酸２１１Ｉｇとを含有する除菌濾過
液０．５　ｇ／を加え、得られた２種の水溶液（それぞ
れＩ）Ｈ４，１、ｐＨ４，２）おのおのｌｌｌ１を実施
例１と同様に凍結乾燥し、実施例２と同様に溶状および
力価残存率を調べた。

その結果は第３表に示す通りであった。

第８表 実施例４ 原液を注射用蒸留水で希釈し除菌濾過して得たヒ）ＩＬ
−２７６８０単位を含有する水溶液それぞれ０．５　ｍ
ｌに、ｌ５Ａ５■および食塩９ｍｇとグルタチオン２＃
もしくはアスコμビン９２ｑとｔ含有する除菌濾過液０
．５　ｔｅｌを加え、得られた２種の水溶液（それぞれ
ｐＨ４，１、ｐＨ４，２）おのおのｌ　ｍｌを実施例１
と同様に凍結乾燥し、実施例２と同様に溶状および力価
残存率を調べた。

その結果は第４表に示す通りであった。

第４表 実施例５ 原液を注射用蒸留水で希釈し除菌濾過して得たヒトエＬ
−２７６８０単位を含有する水溶液０、５　ｍｌに、Ｙ
ンニ７）　５０１ｆとグＮｌ’ｆｙ？ン２ｑもしくはア
スコルビン酸２ｍｇとを含有する除菌濾過液０．５　ｍ
ｌを加え、得られた２種の水溶液（それぞれＰＨ８，４
、ｐＨ８，６）おのおの１ｄを実施例１と同様に凍結乾
燥し、実施例２と同様に溶状および力価残存率を調べた
。

その結果は第５表に示す通）であった。

実施例６ 原液を注射用蒸留水で希釈し除菌濾過して得たヒトエＬ
−２２３３５０単位を含有する水溶液０．５厘ｌに、グ
ルタチオン５■およびグリシン２３ダを含有する除菌濾
過した水溶液０．５　ｗｌ　ｔ−加え、得られた水溶液
（ｐＨ８，７）　１ｍ／を実施例１と同様に凍結乾燥し
実施例１と同様の方法で製造直後及び４０℃、ａ週間保
存後に溶状及び力価残存率を調べた。

その結果は第６表に示す通夛であった。

第６表 実施例７ 原液を注射用蒸留水で希釈し除菌濾過して得たヒトエＬ
−２を１７９０単位または１ａＯ単位を含有する水溶液
それぞれ０．５　ｍｌにグルタチオン２ｑ、Ｈ８Ａ３Ｍ
ｇおよび食塩９岬を含有する除菌濾過した水溶液０．５
　ｍｌを加えて、得られた２種の水溶液（それぞれｐＨ
８，９、ｐＨ８，９）おのおの１ｄを実施例１と同様に
凍結乾燥し実施例ユと同様の方法で製造直後および４０
℃１週間保存後に溶状及び力価残存率を調べた。

その結果は第７表に示す通りであった。

第７表 実施例８ 原液を注射用蒸留水で希釈し除菌か）ｔｅｌして得たと
トエＬ−２を１８６０単位または１１６単位を含有する
水酵液それぞれ０．５　ｍｌにグルタチオン２ＷｊＪ　
、　）ｌ　Ｓ　Ａ　Ｉ　Ｍｙおよびクリシン２３！！Ｖ
を含有する除菌濾過した水溶液０．５　ｍｌを加えて、
得られた２柚の水繻竣（それぞれｐＨ８，８、ｐＨ８，
９）おのおのｌゴを実施例１と同様に凍結乾燥し製造直
後および４０°Ｃ１週ｍｌ保存後に溶状および力価残存
率を調べた。

その結果は第８表に示す通シでめった。

第８表 実施例９ ＩＬ−２原液を注射用蒸留水で希釈し除菌濾過して得た
ヒ）ＩＬ−２１７６００単位を含有する水溶液それぞれ
０．５　ｖｔｌに、Ｈ８Ａ　５＃を含有し、塩酸でｐＨ
４に調整し除菌濾過した水溶液またはｌ５Ａ５■および
食塩９ｑを含有し塩酸でｐＨ４に調整し除菌濾過した水
溶液０．５　ｍｌを加え、得られた２種の水溶液おのお
の１ゴをバイアルに分注して一４０℃で凍結し、乾燥後
バイアル空四部をＮ２　　ガスで置換し施栓巻締した。

これらの凍結乾燥品を製造直後および４０℃で０．５力
月保存後に注射用蒸留水１篇ｌで再溶解し、これらの溶
液の溶状（澄明度）及び力価を調べた。

１　力価については凍結乾燥前の水溶液力価を１００％
とした時の残存率を計算した。その結果は、第９表に示
されるとおり、本発明の工Ｌ−２組成物は溶状、力価残
存率共に有意に優れていた。

第　　９　　表 実施例１Ｏ ろ水溶液０．５　ｍｌに、ＩＳＡ５ｍｇ、Ｈ８Ａ５Ｗと
食塩９Ｋｆ、ｌ５Ａ５■とグリシン２３岬またはＨ８Ａ
３１１とマンニット５０ｊｌＦを含有し、且つ塩酸でｐ
Ｈ４，９にＮ４整し、除ｇ沖過した各種添加剤水溶液お
のおの０．５　ｍｌを加え、得られた４種の水溶液おの
おのｌｌ１ｌ′＃バイアルに分注して一４０℃で凍結し
乾燥後、バイアμ空間部をＮ２　ガスで置換し、施栓巻
締した。対照としてと）ＩＬ−２のみの水溶液及びｐＨ
調節剤を含有しない同量の各種ＩＬ−２水溶液を同様に
凍結乾燥した。

これらの凍結乾燥品の外観を調べた後、注射用蒸留水、
０．９％　生理食塩液、５％グドツ糖水溶液、５％ソ、
ＴＩ／ヒツト水溶液、または５％マンニット水溶液のい
ずれか１　ｍｌで再溶解し、これらの溶液のｐｍ（及び
溶状（澄明度）を調べた。

その結果は第１０表に示される通シ、本発明のＩＬ−２
組成物は対照と比較し溶状即で有意に優れており、特に
ＩＳＡとグリシンが配合されｐＨが約４の凍結乾燥品の
溶状が優れていた。

（以　下金　白） 実施例１１ 実施例９と同様にして得たヒ）Ｉｎ−２として１６２０
単位または１２８単位、Ｈ３Ａを５１１１ｇ。

グリシンを２３η含有し、塩酸でｐＨを４．０に調節し
た除菌ｖ５過された２種の水溶液おのおの１　ｍｌを実
施例９と同様に凍結乾燥し、実施例９と同様の方法で製
造直後、及び４０℃１週間、２週間及び４週間保存後に
溶状及び力価残存率を調べた。

その結果は第１１表に示す通りであった。

（以下金　白） 実施例１２ 原液を注射用蒸留水で希釈し除菌濾過して得たヒトエＬ
−２２４５０単位を含有する水溶液それぞれ０．５　ｍ
ｌに、除菌濾過した注射用蒸留水０．５１１またはグル
タチオン、グルタチオン２ナトリウム塩、アスコルビン
酸もしくはアスコルビン酸ナトリウム塩を１０１１ｙ含
有する除菌濾過液０．５　ｊｌｌｌ　＠またはグルタチ
オン２すＦリウム塩またはアスコルビン酸ナトリウム塩
ｌＯＭＩｔ−溶解しｐＨを塩酸で酸性に調整し九除菌濾
過液０．５　ｍｌを加え得られた７種の水溶液おのおの
ｌ　ｍｌをバイアルに分注して一４０℃で凍結し乾燥後
バイアル空間部をＮ２ガスで置換し施栓巻締した。

これらの凍結乾燥品をいずれも注射用蒸留水ｌ　ｙｘｌ
で再溶解しこれらの溶液のｐＨおよび溶状（澄明度）を
調べた。その結果は第１２表に示される通υ本発明の工
Ｌ−２組成物は対照と比較し溶状が優れていた。

第　　１２　表 参考例　非グリコシル化とトｒＬ−２蛋白質溶液の製造 （Ｉ）　　特願昭５８−２２５０７９号（昭和５８年１
１月２８日出願）明細書の実施例３で得たヒトＩＬ−２
遺伝子を含有する形質転換体エシェリヒア　コリ（Ｅ、
ｃｏｌｌ）ＤＨＩ／ｐＴＦ４を２５０ｇ１容三角フラス
コ内のパクト・トリプトン（ディフコ・ラボラトリーズ
、アメリカ）１％、パクト・イーストエキス（ディフコ
・ラボラトリーズ。

アメリカ）０．５％１食塩０．５％およびテトラサイク
リン７μｆｌ　　ｙｘｌを含む液体培地（ｐＨ７，０）
　５０ｍｌに接拙して３７℃で１晩回転振舷培養した。

この培ｇＲ液をカザミノ酸０．５％、グルコース０．５
％およびテトラサイクリン７μｆ　／　ｍｅを含むＭ９
培地２．５１の入った５１容ジャーファーメンタ−に移
し３７°Ｃで４時間、ついでａ−β−インドリルアクリ
〜酸（２５μｇ／ｇｌ）を添加して、さらに４時間通気
攪拌培養して培養液２．５１を得た。この培養液を遠心
分離し、菌体を集め、−８０℃で凍結保存した。

（Ｉｆ）　　上記（Ｉｌで得た凍結保存菌体ａ　７．５
　ｆを７Ｍ塩酸グアニジン、　０．　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ
・ＨＣＩを含む抽出液（ｐＨ７，０）５００ｇ／に均一
に懸濁し、４℃で１時間攪拌した。この酵菌液を２８，
０００Ｘｆで２０分間遠心分離して上清４５ａｚｌｔ−
得た。

Ｃｍ）　　上記（ＩＩ）で得た上清を０．０１　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣ１緩衝液（ｐ）１８．５）に対して透析後
１９，０００Ｘｆで１０分間遠心分離して透析上清４５
８ｗ／を得た。

この透析上清を０．０１　Ｍ　Ｔｒｉｓ　・Ｉ（Ｃ１緩
衝液（ｐＨ８，５）で平衡化したＤＥ５２（Ｉ）ＥＡＥ
−セルロース、ワットマン社製、イギリス）カラム（５
０ｍｌ谷）に通して蛋白を吸Ｋｉさせ、ＮａＣ１７ｕ度
直線勾配（０〜０．１５Ｍ　　ＮａＣ］、　、１１　）
を作成してＩＬ−２を〆出させた。活性画分１０５ｇ／
をＹＭ−５メンプラン（アミコン社製、アメリカ）を用
いて１０．２　ｍｌに濃ＩＲ＋ｊし、０．　Ｉ　Ｍ　Ｔ
ｒｉｅ　・ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ
１緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファ〜
マシアａＪｔｋｌ　、　７　ｘ−テン）カラム（５００
ｇ／谷）を用いてゲ／Ｌ／Ｆｉ過を行った。

活性画分５６ｘｔをＹｌｌ＋−５メンプランで４．９　
ｍｌに濃縮した。得られた凝縮液をウルトラボアＲＰＳ
Ｃ（ア〜テックス社を１：、アメリカ）カラムに吸着さ
セ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒と
する高速液体クロマトグラフィーを行った。

カラム、つρトヲボアＲＰＳＣ（４，６Ｘ７５日）；カ
ラム温度、３０℃；溶出溶醸Ａ、０．１％トリフ〃オロ
酢酸−９９，９％水１溶出溶媒Ｂ、０．１％トリフルオ
ロ酢酸−９９，９％アセトニトリμ；溶出プログラム、
０分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）−２５分（５５％Ａ＋４５
％Ｂ）−、（５分（４５％Ａ＋５５％Ｂ）−４５分（ａ
Ｏ％Ａ＋７０％Ｂ）−４８分（１００％Ｂ）；溶出速度
、　０．８ｇ／／ｗｉｎ；検出波長、２ａＯｎｍ０本条
件下で保持時間約３９分の活性画分を集め、非グリコシ
μ化ヒトエＬ−２蛋白質７．５　＃　（比活性、３０，
０ＯＯＵ／■。

出発材料からの活性回収率、４８．２％；蛋白質の純度
、９９％（デンシトメトリーによる）〕を含む溶液１５
筐ｌを得た。

発明の効果 本発明のＩＬ−２組成物は、保存中および凍結や凍結乾
燥操作における工Ｌ−２活性の低下が少なく、また凍結
乾燥品においてはその外観が向上し、その器壁への吸着
が少なく、さらにその再溶解時の溶状が澄明である点等
の優れた特徴を有し、医薬品製剤等とりわけ非経口投与
製剤として有利に用いることができる。

手続補正書（鮭） 昭和６１年５月よシ日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト血清アルブミンまたは（および）還元性物質
   を配合し、溶液状態でｐＨ３〜６を示すように調整した
   インターロイキン−２組成物。
2. （２）さらにモノアミノ脂肪族アミノ酸を配合した特許
   請求の範囲第１項記載の組成物。
3. （３）凍結乾燥品である特許請求の範囲第１項または第
   ２項記載の組成物。