DK172424B1 - IL-1alfa-Derivater, farmaceutisk præparat omfattende sådanne derivater, anvendelse af IL-1alfa-derivater, DNA sekvenser kod - Google Patents

Description

DK 172424 B1 i

Opfindelsen angår IL-1 -derivater, farmaceutisk præparat omfattende sådanne derivater, anvendelse af IL-1 -derivater, DNA sekvenser kodende for IL-1 -derivater, rekombinant plasmid og transformeret værtcelle.

5 Teknologien ved cancerterapi har i de senere år udviklet sig. Bemærkelsesværdige fremskridt er gjort ikke blot i henseende til konventionelle kirurgiske operationer, men også inden for kemoterapi, radioterapi og immunoterapi. Imidlertid har navnlig fordelene ved 10 kemoterapi og radioterapi en tendens til at være ledsaget af alvorlige bivirkninger.

Det ideale kemoterapimiddel er et sådant, der udøver en carcinostatisk effekt, men kun har små eller ingen ugunstige virkninger på normale væv. Da konven-15 tionelle kemoterapeutiske midler inducerer stærk inhi- — bition af benmarven ledsaget af fald i leukocyter og blodplader, er det imidlertid umuligt at anvende dem efter hinanden over en lang perdiode, og anvendelsen af medikamentet må afbrydes som følge af disse bivirknin-20 ger. Bestråling med røntgenstråler eller y-stråler ved radioterapi har ligeledes ugunstige virkninger på hema-togene væv, såsom benmarv. Navnlig hvis leukocyter, blodplader osv. er faldet betydeligt, skal bestrålingen afbrydes.

25 Transfusion er en af de konventionelle metoder til at mindske eller afhjælpe reduktioner i blodplader osv., der tjener som dosis-begrænsende faktorer. Da imidlertid blodceller, såsom blodplader og leucocyter, har en kort levetid, skal friske blodceller hyppigt 30 tilføres. Når der er alvorlig benmarvsygdom, må der foretages benmarvtransplantation. Sådan benmarvtrans-plantation har til formål at overføre hematogene stamceller af benmarven til legemet og således producere blodplader i legemet. Denne metode har haft en epoke-35 gørende indvirkning på behandling af visse typer af tumorer og er således blevet en fundamental terapi for 2 DK 172424 B1 ondartede tumorer. Ovennævnte benmarvtransplantation medfører imidlertid følgende problemer:

Det er meget vanskeligt at tilvejebringe donorer af benmarv, der passer til patienterne. Selvom en do-5 nor findes, er transplantationsoperationen vanskelig, og det tager i almindelighed adskillige uger for den transplanterede benmarv at begynde hematogenesis og derefter producere leukocyter, blodplader osv. i perifert blod. Under denne periode kan patienten derfor 10 svinge mellem liv og død.

Selvom transfusion og benmarv-transplantation, som ovenfor beskrevet, er metoder til at forbedre fald i blodplader og lignende bivirkninger, der forekommer ved kemoterapi, radioterapi og lignende cancerterapier, 15 er benmarvtransplantation forbundet med forskellige problemer. For at afhjælpe sådanne problemer skal patienterne selv have en forbedret hematogenisk funktion.

Det er derfor ønskeligt på det farmaceutiske område at udvikle et hidtil ukendt medikament med den aktivitet 20 at fremme hematogenesis. Navnlig er det helt ukendt at have et medikament med den aktivitet at fremme produktion af blodplader.

Den foreliggende opfindelse har haft til formål at tilvejebringe et hidtil ukendt medikament til lin-25 dring af sådanne symptomer som thrombocytopenia, osv. for at opfylde det ovenfor beskrevne behov.

Et andet formål for opfindelsen har været at tilvejebringe et iL-la-derivat, der er anvendeligt som aktiv komponent i medikamentet til behandling af 30 thrombocytopenia.

Ovennævnte formål er nået gennem et medikament til behandling af thrombocytopenia, der indeholder mindst ét IL-1 -derivat.

Opfinderne har gennemføret en omfattende forsk-35 ning med henblik på ovennævnte situation og fundet, at IL-1 -derivater, der tidligere har vist sig at have 3 DK 172424 B1 forskellige effekter omfattende den effekt at aktivere lymphocyter og den effekt at fremme produktion af interleukin-2 (IL-2), antistoffer, osv. og de hidtil ukendte IL-l -derivater, der er udviklet af opfinderne, 5 har overraskende bemærkelsesværdig effekt i henseende til at inhibere reduktion af blodplader og er meget anvendelige som medikamenter for thrombocytopenia med henblik på at opfylde ovennævnte formål. Opfindelsen blev gjort på basis af disse fund.

10 Det omhandlede medikament til behandling af thrombocytopenia, hvilket medikament indeholder IL-l eller et derivat deraf som aktiv komponent, har den bemærkelsesværdige effekt at forøge blodpladeproduktion og er derfor meget anvendeligt til behandling af throm- 15 bocytoper.ia.

IL-l-forbindelser, der er aktive komponenter til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse, omfatter IL-Ια med en sekvens på 159 aminosyrer (Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 7907-7911 (1984); Nature, 20 315, 641 (1985); Nucleic Acid Research, 3^3 (16), 5869 (1985)). Aminosyresekvensen er identificeret ud fra den gen-sekvens, der koder for polypeptidet med LAF(lym-phocytaktiverende faktor)-aktivitet. Disse interleuki-ner kan være native interleukiner isoleret på konven-tionel måde fra celler, der producerer dem, eller re-kombinante interleukiner fremstillet ved genteknik.

Den primære aminosyresekvens af det native IL-la er repræsenteret ved følgende formel (A): 30 5 10

Ser - Ala - Pro - Phe - Ser - Phe - Leu - Ser - Asn - Val 15 20

Lys - Tyr - Asn - Phe - Met - Arg - Ile - Ile - Lys - Tyr - 35 25 30

Glu - Phe ~ Ile - Leu - Asn - Asp - Ala - Leu - Asn - Gin - 4 DK 172424 Bl 35 40

Ser - Ile - Ile - Arg - Ala - Asn - Asp - Gin - Tyr - Leu - 45 50 5 Thr - Ala - Ala - Ala - Leu - His - Asn - Leu - Asp - Glu - 55 60

Ala - Val - Lys - Phe - Asp - Met - Gly - Ala - Tyr - Lys - 65 70

Ser - Ser - Lys - Asp - Asp - Ala - Lys - Ile - Thr - Val - 10 75 80

Ile - Leu - Arg - Ile - Ser -> Lys - Thr - Gin - Leu - Tyr - 85 90

Val - Thr - Ala - Gin - Asp.- Glu - Asp - Gin - Pro - Val - 95 100 15 Leu - Leu - Lys - Glu - Met - Pro - Glu - Ile - Pro - Lys - 105 110

Thr - Ile - Thr - Gly - Ser - Glu - Thr - Asn - Leu - Leu - 115 120

Phe - Phe - Trp - Glu - Thr - His - Gly - Thr - Lys - Asn - 20 125 130

Tyr - Phe - Thr - Ser - Val - Ala - His - Pro - Asn - Leu - 135 140

Phe - Ile - Ala - Thr - Lys - Gin - Asp - Tyr - Trp - Val - 145 150 25 Cys - Leu - Ala - Gly - Gly - Pro - Pro - Ser - Ile - Thr - 155

Asp - Phe - Gin - Ile - Leu - Glu - Asn - Gin - Ala (A) 30 IL-lorDerivaterne omfatter forskellige derivater. Typiske eksempler på sådanne IL-la-derivater med forskellige aminosyresekvenser, er anført i ansøgerens tidligere patentpublikationer (europæiske patentpubli- 35 kationer nr. 187 991, nr. 237 967 og nr. 237 073).

Ovennævnte IL-la-derivat har aminosyresekvensen med formlen (A), der er således modificeret, at mindst 5 DK 172424 B1 den ene af Asn ved 36-stillingen og Cys ved 141-stil-lingen er udeladt eller erstattet med en anden aminosy-rerest.

Aminosyrer og polypeptider er heri omtalt ved 5 forkortelser ifølge nomenklaturen eller reglerne anbefalet af IUPAC ig IUPAC-IUB, eller ved forkortelser, der konventionelt anvendes. Nucleinsyrerne i basesekvenserne er udtrykt på tilsvarende måde.

Aminosyrenumrene eller -stillingerne er baseret 10 på aminosyresekvenserne med formlen (A) (IL-Ια), med mindre andet er anført, også i det tilfælde, hvor der er en deletion eller tilknytning.

Den aminosyrerest, der skal forbindes til eller substitueres med en særlig aminosyrerest ved en særlig 15 position i en aminosyresekvens af IL-la-derivatet, kan være en hvilken som helst blandt α-aminosyrerester, der udgør humane proteiner. Navnlig foretrækkes neutrale aminosyrerester. Imidlertid er Cys tilbøjelig til at danne en disulfid-binding intra- eller inter-molekylært 20 med dens SH-gruppe. Af denne grund er de ønskelige aminosyrerester dem, der er forskellige fra Cys.

I tilfælde af Il-la-derivatet er eksempler på mere foretrukne α-aminosyrerester, der udgør humant protein, Asp til erstatning af Asn ved 36-stillingen og 25 ser til erstatning af Cys ved 141-stillingen.

Det lykkedes opfinderne at tilvejebringe et hidtil ukendt IL-la-derivat, der kan anvendes som en aktiv komponent i det omhandlede medikament til behandling af thrombocytopenia. Dette IL-la-derivat har følgende 30 træk.

Nærmere angivet har nævnte IL-la-derivat ifølge opfindelsen en aminosyresekvens repræsenteret ved følgende formel (α): 6 DK 172424 B1 5 10

Ser - Ala - Pro - Phe - Ser - Phe - Leu - Ser - Asn - Val - 15 20

Lys - Tyr - Asn - Phe - Met - Arg - Ile - Ile - Lys - Tyr - 5 25 30

Glu - Phe - Ile - Leu - Asn - Asp - Ala - Leu - Asn - Gin· - 35 40

Ser - Ile - Ile - Arg - Ala - X - Asp - Gin - Tyr - Leu - 45 50 10 Thr - Ala - Ala - Ala - Leu - His - Asn - Leu - Asp - Glu - 55 60

Ala - Val - Lys - Phe - Asp - Met - Gly - Ala - T-yr - Lys - 65 70

Ser - Ser - Lys - Asp - Asp - Ala - Lys - Ile - Thr - Val - 15 75 80

Ile - Leu - Arg - Ile - Ser - Lys - Thr - Gin - Leu - Tyr - 85 90

Val - Thr - Ala - Gin - Asp - Glu - Asp - Gin - Pro - Val - 95 100 20 Leu - Leu - Lys - Glu - Met - Pro - Glu - Ile - Pro - Lys - 105 110

Thr - Ile - Thr - Gly - Ser - Glu - Thr - Asn - Leu - Leu - 115 120

Phe - Phe - Trd - Glu - Thr - His - Gly - Thr - Lys - Asn - 25 125 130

Tyr - phe - Thr - Ser - Val - Ala - His - Pro - Asn - Leu - 135 140

Phe - Ile - Ala - Thr - Lys - Gin - Asp - Tyr - Trp - Val - 145 150 30 Y - Leu - Ala - Gly - Gly - Pro - Pro - Ser - Ile - Thr - 155

Asp - Phe - Gin - Ile - Leu - Glu - Asn - Gin - Ala hvor X og Y er a-aminosy reres ter, der indgår i humane 35 proteiner, med det forbehold, at Y ikke er Cys, når X er Asn, og hvilken sekvens er således modificeret, at der opfyldes mindst ét af kravene: deletion af Arg 7 DK 172424 B1 i 16-stillingen, udskiftning af Arg i 16-stillingen med en anden aminosyrerest, deletion af aminosyresekvensen fra Ser ved l-stillingen til Phe ved 14-stillingen, og deletion af aminosyresekvensen fra Ser ved l-stillingen 5 til Met ved 15-stillingen.

I formlen (a) er Asp eksempel på en mere foretrukket aminosyrerest repræsenteret ved X ved 36-stil-lingen, og Ser er eksempel på en mere foretrukket aminosyrerest repræsenteret ved Y ved 141-stillingen. Gly 10 er eksempel på en mere foretrukket α-aminosyrerest, der indgår i humant protein, til at erstatte Arg i 16-stillingen.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer derfor et Il-la-derivat med den ovennævnte modificerede 15 aminosyresekvens.

IL-la-derivaterne ifølge opfindelsen har blod-plade-forøgende effekt (hematogenisk effekt) og er anvendelige som medikament ved behandling af thrombocytopenia. Nævnte IL-la-derivater har også, i lighed med 20 konventionelle IL-l-derivater, for eksempel fysiologisk aktivitet, såsom LAF-aktivitet, aktivitet i henseende til at inhibere væksten af tumorceller (GIF-aktivitet), aktivitet til at fremme produktion af forskellige cyto-kiner, såsom kolonistimulerende faktor (CSF), interfe-25 ron (IFN), interleukin-2(IL-2) og interleukin-3 (IL-3), anti-inflammetorisk aktivitet og aktivitet til at forebygge strålingsskade, og de er følgelig anvendelige som immunosystem-stimulerende midler, for eksempel til at fremme produktion af antistoffer og forøge effekten af 30 vacciner, antitumormidler, midler til at fremme produktion af cytokiner, såsom CSF, IFN, IL-2 og IL-3, anti-inflammetoriske midler, midler til at forebygge strålingsskader og andre lignende medicinske midler. Medens feber kan opstå som en bivirkning ved konventio-35 nelle IL-l-derivater, fremkalder IL-la-derivaterne ifølge opfindelsen så at sige ikke sådan feber og har lav toxicitet.

8 DK 172424 B1

Det omhandlede IL-la-derivat kan fremstilles for eksempel ved genteknik under anvendelse af et gen, der koder for det specifikke polypeptid, dvs. ved at inkorporere genet i en mikroorganismevektor til tilvejebrin-5 gelse af replikation, transkription og translation inden i mikroorganismens celle og således opnå det ønskede derivat. Denne proces er fordelagtig derved, at den er egnet til masseproduktion.

Selv om det gen, der skal anvendes ved denne 10 proces, helt kan syntetiseres ved kemisk syntese af nucleinsyrer ved en sædvanlig fremgangsmåde, for eksempel ved phosphittriestermetoden (Nature, 310, 105 (1984)) eller lignende, er det hensigtsmæssigt at anvende det gen, der koder for IL-1 eller en precursor 15 derfor. Ved en konventionel fremgangsmåde, der indebærer ovennævnte kemiske syntese, modificeres genet til en sekvens af nucleinsyrer, der koder for den foregående specifikke aminosyresekvens, hvorved det ønskede gen let kan fremstilles.

20 Det gen, der koder for IL-1 eller en precursor for dette, er allerede kendt (se ikke-undersøgt japansk patentansøgning nr. 174022/1987).

Ovennævnte modificerede sekvens af nucleinsyrer (baser) fremstilles også ved en kendt proces, der gen-25 nemføres svarende til aminosyresekvensen af det ønskede polypeptid (se Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory (1982)).

For eksempel kan kløvning, ligering, phosphory-lering osv. af DNA gennemføres ved sædvanlige metoder 30 omfattende behandling med enzymer, såsom restriktionsenzymer, DNA-ligase, polynucleotidkinase og DNA-polyme-rase, der er let tilgængelige handelsprodukter. Isoleringen og rensningen af genet og nucleinsyrerne, inkluderet i disse metoder, foregår også på sædvanlig måde, 35 for eksempel ved agarosegelelektroforese. Som delvis beskrevet nedenfor bliver det opnåede gen replikeret ved anvendelse af en sædvanlig vektor. Det DNA-frag- 9 DK 172424 B1 ment, der koder for den ønskede aminosyresekvens, og syntetiske linkere kan også let fremstilles ved ovennævnte kemiske syntese. Den codon, der svarer til den ønskede aminosyre, og som skal anvendes ved ovennævnte 5 metoder, er kendt og udvælges efter ønske. En sædvanlig metode kan anvendes til dette formål, for eksempel med henblik på codonens anvendelseshyppighed hos den vært, der skal anvendes (Nucl. Acids Res., 9, 43-73 (1981)). Endvidere kan der med henblik på modifikatio-10 nen af codonen i den pågældende nucleinsyresekvens for eksempel anvendes stedspecifik mutagenese (Proc.

Natl. Acad. Sci., jn, 5662-5666 (1984)), som det er almindeligt, hvortil der gøres brug af en primer omfattende et syntetisk oligonucleotid på ca. 15-30 mer, der 15 koder for den ønskede modificerede sekvens.

Det ved ovennævnte proces opnåede ønskede gen — kan undersøges for dets basesekvens, for eksempel ved den kemiske Maxam-Gilbert-modifikationsmetode (Meth. Enzym., 65, 499-560 (1980)) eller ved dideoxynucleotid-20 kædeterminationsmetoden, der gør brug af Ml3 Phag (Messing, J. og Vieira, J., Gene, 19., 269-276 (1982)).

Ovennævnte fremgangsmåde og metoder for denne vil blive beskrevet i nedenstående eksempler, men fremgangsmåden er ikke specifikt begrænset, og enhver på 25 området allerede kendt fremgangsmåde kan anvendes.

Det ønskede gen, der koder for et polypeptid med ovennævnte specificerede aminosyresekvens med formlen (a), tilvejebringes herved. (Genet vil i det følgende blive omtalt som det "foreliggende gen").

30 Polypeptidet ifølge opfindelsen kan fremstilles ved sædvanlige kendte genrekombinationsteknikker under anvendelse af det foreliggende gen. Nærmere angivet fremstilles det ved at fremstille et rekombinant DNA, der kan eksprimere det foreliggende gen i værtsceller, 35 transformere DNA'et ind i værtcellen og inkubere trans-formanten.

Anvendelige værtceller kan være enten eucaryoti-ske eller procaryotiske celler. De eucaryotiske celler 10 DK 172424 B1 omfatter celler fra hvirveldyr, gærarter osv. Almindeligt anvendt som celler fra hvirveldyr er for eksempel COS-celler, der er celler fra aber (Y. Gluzman, Cell., 23, 175-182 (1981)), dihydrofolatreduktase-defekt stam-5 me af kinesisk-hamster-ovariecelle (G. Urlaub og L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., TJ_, 4216-4220 (1980)), osv., men anvendelige celler er ikke begrænset til nævnte celler. Anvendelige ekspressionsvektorer til hvirveldyrceller er dem, der har en promotor belig-10 gende opstrøms fra det gen, der skal eksprimeres, RNA-kløvningssteder, polyadenyleringssted, transkrip-tionssekvens, osv. Disse vektorer kan yderligere have et replikations-origin, om krævet. Eksempler på anvendelige ekspressionsvektorer omfatter pSV2dhfr med en 15 oprindelig promotor fra SV40 (S. Subramani, R. Mulligan og P. Berg, Mol. Cell. Biol., j,(9), 854-864 (1981), der ikke er begrænsende.

Gærarter finder vid anvendelse som eucaryotiske mikroorganismer, og blandt disse er gærarter af slægten 20 Saccharomyces almindeligvis anvendelige. Eksempler på populære ekspressionsvektorer for gærarter og lignende eucaryotiske mikroorganismer omfatter pAM82 med en promotor for syrephosphatasegen (A. Miyanohara et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., jiO, 1-5 (1983)), osv.

25 E. coli og Bacillus subtilis er almindeligt an vendt som procaryotiske værter. Den foreliggende opfindelse anvender for eksempel plasmidvektorer, der har evnen til replikation i værten. Til at eksprimere genet i vektoren kan der anvendes ekspressionsplasmider, 30 der har en promotor og SD(Shine-Dalgarno)-basesekvens opstrøms fra genet og ATG krævet til initiering af proteinsyntese. Meget anvendt som E. coli-vært er E. coli K12-stamme, osv. Som vektor anvendes almindeligvis pBR322. Disse er imidlertid ikke begrænsende, og der 35 kan anvendes forskellige kendte stammer og vektorer. Eksempler på anvendelige promotorer er tryptophan-pro-motor, PL-promotor, lac-promotor, lpp-promotor, osv.

1 1 DK 172424 B1

Genet kan eksprimeres ved anvendelse af enhver af disse promotorer.

Til beskrivelse af processen med henvisning til det tilfælde, hvor der anvendes tryptophan-promotor, 5 anvendes som ekspressionsvektor vektor pTMl (Fumio Imamoto, Taisha, Vol. 22, 289 (1985)) med tryptophan-promotor og SD-sekvens. Et gen, der koder for et ønsket polypeptid og har ATG, om krævet, forbindes til stedet for restriktionsenzym Clal, hvilket sted findes 10 nedstrøms fra SD-sekvensen. Undertiden kan der ikke blot anvendes det direkte ekspressionssystem, men også et fusionsproteinekspressionssystem, der anvender for eksempel β-galactosidase, β-lactamase eller lignende.

Den således opnåede ekspressionsvektor indføres 15 i værtsceller og transformeres derved ved sædvanlige metoder. Por eksempel indsamles celler hovedsageligt i den logaritmiske vækstfase, behandles med CaCl2 og bringes derved til let at acceptere DNA, hvorefter vektoren indføres i cellen. Ved denne metode kan MgCl2 20 eller RbCl bringes til stede samtidigt med vektoren, således at der opnås en forbedret transformationseffektivitet, som det er almindeligt kendt. Cellen kan omdannes til sfæroplast eller protoplast forud for transformation.

25 Den således opnåede ønskede transformant kan in kuberes på sædvanlig måde, hvorved det ønskede polypeptid produceres og akkumuleres. Inkubationsmediet kan være ethvert af de medier, der er almindeligt anvendt til at inkubere celler, såsom L-medium, E-medium, 30 M9-medium, osv. Forskellige carbonkilder, nitrogenkilder, uorganiske salte, vitaminer, osv., der er almindeligt kendt, kan blandes med disse medier. Når der anvendes tryptophan-promotoren, kan der for eksempel anvendes M9-minimummedium, hvori der er blandet casamino-35 syre til at bevirke promotorens aktion. Et kemikalium, såsom indolacrylsyre, til fremme af tryptophan-promoto-rens aktion, kan sættes til mediet på et egnet inkubationstrin.

12 DK 172424 B1

Det ønskede polypeptid kan isoleres fra den resulterende kultur indeholdende et aktivt stof og renses ved sædvanlige metoder. Det er ønskeligt at ekstrahere polypeptidet fra værten under milde betingelser, såsom 5 ved osmotisk chok, således at der for polypeptidet opretholdes strukturen af højere orden.

Ovennævnte isolerings- og rensningsmetode gennemføres hovedsageligt ved forskellige processer, der gør brug af de fysiske og kemiske egenskaber hos det 10 ønskede polypeptid. (Se for eksempel "Biological Data Book II", side 1175-1259, 1. udgave, 1. tryk, 23. juni 1980, udgivet af Kabushiki Kaisha Tokyo Kagakudojin). Eksempler på anvendelige processer er behandling ved anvendelse af et sædvanligt proteinfældningsmiddel, ul-15 trafiltrering, molekularsigte-chromatografi (gelfiltrering), væskechromatografi, centrifugering, elektrofore-se, affinitets-chromatografi, dialyse og kombinationer af sådanne processer.

Ovennævnte proces kan for eksempel gennemføres 20 ved følgende fremgangsmåde. Det ønskede polypeptid fraskilles fra supernatanten i delvis renset tilstand.

Denne partielle rensning gennemføres for eksempel ved en behandlng, der som proteinfældningsmiddel anvender et organisk opløsningsmiddel, såsom acetone, methanol, 25 ethanol, propanol eller dimethylformamid (DMF), eller en syre, såsom eddikesyre, perchlorsyre (PCA) eller trichloreddikesyre (TCA), en behandling, der gør brug af et udsaltningsmiddel, såsom ammoniumsulfat, natriumsulfat eller natriumphosphat, og/eller ultrafiltering 30 under anvendelse af en dialysemembran, flad membran, hulfibermembran eller lignende. Disse behandlinger gennemføres på samme måde som almindeligt under sædvanlige betingelser.

Det herved opnåede groft rensede produkt under-35 kastes derefter gelfiltrering, hvorved der indsamles en fraktion, der udviser aktiviteten af det ønskede stof. Anvendelige gelfiltreringsmidler er ikke specifikt be- 13 DK 172424 B1 grænsede. Sådanne midler omfatter dem, der er lavet af dextrangel, polyacrylamidgel, agarosegel, polyacryl-amid-agarosegel, cellulose eller lignende. Eksempler på anvendelige midler, der er kommercielt tilgængelige, 5 er Sephadex G-type, Sephadex LH-type, Sepharose-type, Sephacryl-type (alle produkter fra Pharmacia), Cellofine (Chisso Corporation), Biogel P-type, Biogel A-type (begge produkt fra Bio-Rad Lab.), Ultro gel (LKB), TSK-G-type (produkt fra Tosch Corporation), osv.

10 Det ovenfor specificerede polypeptid, dvs.

IL-la-derivat, kan isoleres fra fraktionen som et homogent stof, for eksempel ved at underkaste den ved gelfiltrering opnåede aktive fraktion affinitetschromato-grafi under anvendelse af en hydroxyapatit-søjle, ion-15 byttersøjlechromatografi, såsom ved DEAE-, CM- eller SP-metoden, chromatofokuseringsmetode, reversfase-HPLC eller lignende, eller en kombination af sådanne metoder.

Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen 20 til behandling af thrombocytopenia kræver tilstedeværelse af IL-Ια, eller et derivat deraf som aktiv komponent og kan yderligere indeholde farmaceutiske bestanddele, der anvendes i sædvanlige medikamenter. Farmaceutiske præparater kan fremstilles på sædvanlig måde 25 ved at blande den aktive komponent med andre komponenter og konventionelle farmaceutiske excipienser, som ønsket, og kan foreligge i en hvilken som helst af forskellige dosisformer svarende til det tilsigtede behandlingsformål.

30 Nærværende opfindelse angår også anvendelsen af et IL-la-derivat til fremstilling af et medikament til behandling af thrombocyt.

Navnlig med henblik på stabilisering af den aktive IL-l-forbindelse foretrækkes som andre komponenter 35 til anvendelse sammen med det aktive stof for eksempel albuminer, såsom humant serumalbumin (HSA), sædvanligvis L-aminosyrer, såsom cystein og glycin, osv.

14 DK 172424 B1 Mængden af en sådan komponent, der skal anvendes, er ikke specifikt begrænset, men ligger sædvanligvis på ca. 0,01 til ca. 10 mg pr. mikrogram af den aktive IL-l-forbindelse i tilfælde af albumin, og ca. 0,001 5 til ca. 10 mg pr. 1 yg af den aktive forbindelse i tilfælde af aminosyre (beregnet som den totale mængde aminosyrer i tilfælde, hvor der anvendes mindst 2 aminosyrer). Om krævet, kan det farmaceutiske præparat indeholde for eksempel sukkerarter omfattende monosacchari-10 der, såsom glucose, mannose, galactose og fructose, sukkeralkoholer, såsom mannitol, inositol og xylitol, disaccharider, såsom sucrose, maltose og lactose, po-lysaccharider, såsom dextran og hydroxypropylstivelse (af de ovennævnte sukkerarter foretrækkes sucrose, mal-15 tose, mannitol, inositol, dextran osv.), ioniske eller ikke-ioniske overfladeaktive midler, såsom overfladeak- -------- tive midler af polyoxyethylenglycol-sorbitanalkylester-type, polyoxyethylenalkylether-type, sorbitanmonoacyl-ester-type og fedtsyreglycerid-type. Sukkerarterne som 20 sådanne iblandes sædvanligvis i en mængde på mindst ca.

0,1 mg, fortrinsvis ca. l til ca. 100 mg, pr. yg af den aktive IL-l-forbindelse. Det overfladeaktive middel iblandes sædvanligvis i en mængde på mindst ca. 0,0001 mg, fortrinsvis ca. 0,001 til ca. 0,1 mg, pr. yg af den 25 aktive IL-l-forbindelse.

Medicinske præparater sammensættes sædvanligvis i form af farmaceutiske kompositioner indeholdende en farmakologisk effektiv mængde af iL-la-derivatet og, om krævet, en passende bærer. Eksempler på anvendelige 30 farmaceutiske bærere omfatter fortyndingsmidler og ex-cipienser, såsom fyldstoffer, strækmidler, bindemidler, befugtningsmidler og desintegrationsmidler, der almindeligvis anvendes til fremstilling af farmaceutiske produkter af den ønskede form. Formen af de farmaceu-35 tiske kompositioner er ikke specifikt begrænset, blot kompositionerne effektivt indeholder den foreliggende aktive IL-l-forbindelse som den aktive komponent, men 15 DK 172424 B1 former kan være for eksempel tabletter, pulvere, granuler, piller eller lignende faste præparater. Det er imidlertid sædvanligvis egnet, at kompositionen foreligger i form af en opløsning, suspension, emulsion el-5 ler lignende til injektion. Alternativt kan en sådan komposition være et tørt produkt, der kan bringes i væskeform ved tilsætning af en passende bærer forud for anvendelse. De farmaceutiske kompositioner omtalt ovenfor kan fremstilles ved sædvanlige metoder.

10 Puffere anvendes også som bærere. Pufferne er ikke specifikt begrænsede og omfatter fortrinsvis ci-tronsyre-natriumphosphat, citronsyre-natriumcitrat, eddikesyre-natriumacetat, natriumhydrophosphat-natrium-dihydrophosphat, citronsyre-borax og lignende puffere 15 med pH 4-8, fortrinsvis 5-6.

Svarende til formen af den opnåede farmaceutiske komposition anvendes kompositionen ad en passende vej. Eksempelvis anvendes kompositionerne til injektion intravenøst, intramuskulært, subcutant, intracutant, in-20 traperitonealt eller på anden måde. Den faste komposition gives oralt eller intrasectalt. Mængden af den aktive komponent i kompositionen og dosen af kompositionen bestemmes passende svarende til anvendelsesmåde og -form, anvendelsesformål, patientens symptomer, osv.

25 og kan ikke fastlægges definitivt. Det er i almindelighed ønskeligt at inkorporere ca. 0,00001 til ca. 80 vægt% af den aktive komponent i det farmaceutiske præparat og at give præparatet i en daglig dosis på ca.

0,01 yg til ca. 10 mg, beregnet som den aktive kompo-30 nent, til voksne. Præparaterne behøver ikke altid kun at anvendes én gang dagligt, men kan gives i tre til fire subdoser dagligt.

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende fremstillingseksempler og eksempler.

35 I disse eksempler er den fysiologiske aktivitet bestemt ved følgende metode.

16 DK 172424 B1 (1) Bestemmelse af IL-1-aktlvitet

Udtrykt som LAF-aktivitet målt ved metoden ifølge J.J. Oppenheim et al., (J. Immunol., 116, 5 1466 (1976)) ved anvendelse af thymusceller fra en mus af C3H/HeJ-stammen.

(2) Bestemmelse af GIF-aktivitet 10 Portioner (0,1 ml) af testopløsningen fortyndet til varierende koncentrationer blev anbragt i rummene af en 96-rums mikroplade (Corning Co., Ltd.), 0,1 ml Eagle's MEM-suspension indeholdende 10% FCS omfattende humane melanomaceller A375 15 i en mængde på 2 x 104 celler/ml blev derefter anbragt i hvert rum, og cellerne blev inkuberet i en C02-inkubator (Napco Co., Ltd.) i fire dage. Efter inkubationen blev der i hvert rum anbragt 0,05 ml af 0,05% Neutral Red (Wako Junyaku

O

20 Co., Ltd.) efterfulgt af inkubation ved 37 C i to timer. Efter fjernelse af supernatanten blev der forsigtigt i hvert rum hældt 0,3 ml phos-phatpuffer-saltopløsning med henblik på vask.

Efter fjernelse af vaskevæsken blev der i hvert 25 rum anbragt 0,1 ml blanding af natriumdihydro- phosphat og ethanol i lige mængder, pladen blev rystet i flere minutter med en mikroblander, og mængden af pigment, der var optaget i cellen, blev målt ved 540 my ved anvendelse af et foto-30 meter til 96-rums mikrotitreringsplader (Titer check multiscane, Flow Lab.) for at bestemme vækstinhibitionsaktiviteten. GIF-Aktivitetsen- heden blev sat til den reciproke værdi af antallet af fortyndingsgange, når testgruppen udviste 35 50% af kontrolgruppens cellevækst-inhibition, dvs. testgruppen udviste 1/2 af absorptionsevnen målt for kontrolgruppen. Når for eksempel GIF- 17 DK 172424 B1 aktiviteten er på 10 enheder, har følgelig testopløsningen, selv ved ti-fold fortynding, stadig aktivitet til at inhibere cellevækst 50%.

I eksemplerne henvises til tegningerne, på hvil-5 ke:

Fig. 1 og 2 viser resultaterne opnået ved at teste forskellige IL-l-produkters effekt i henseende til at inhibere pyretogenesis.

10 Fremstlllinqseksempel 1

Fremstilling af IL-la-derivat (16G.36D.141S) (1) Fremstilling af plasmid til ekspression af IL-la-derivat_ 15 Plasmid ptrp IL-la-141S anvendt i dette eksempel blev fremstillet på samme måde som beskrevet i europæisk patentpublikation nr. 237 073, ved stedspecifik mu-tagenesemetode (Proc. Natl. Acad. Sci., 81^, 5662-5666 (1984)), idet der anvendtes plasmid ptrp IL-la-113 op-20 nået fra pTMl (Fumio Imamoto, Taisha 22, 289 (1985)) og plasmid pcD-GIF-207 (båret af E.coli x1776/pcD-GIF-207 (FERM BP-1294)), der har cDNA, som koder for et IL-la-precursorprotein. Plasmid ptrp IL-la-141S bærer et gen, der koder for et IL-la-derivat, som har aminosyre-25 sekvensen med formlen (A), hvor Cys ved 141-stillingen er erstattet med Ser.

Clal/BamHI DNA-fragment (527 bp) blev isoleret fra plasmid ptrp IL-la-141S og ligeret med stort Clal/ BamHI-fragment af vektor fl.IL.ip lppT for IL-Ιβ sted-30 specifik-mutagenese (Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 1106-1114 (1988)), hvorved der blev opnået fl.Il-la-l41S. Hjælper-phag M13K07 (Takara Shuzo Co. Ltd.) blev inficeret med ovennævnte produkt til opnåelse af enkeltstrenget (ss) DNA, der derefter anvendtes som en 35 mutagenese-template.

Ved som primer at anvende et syntetisk oligonu-cleotid [51-ACTTTATGGGGATCATCA-3'] 5'-phosphoryleret 18 DK 172424 B1 med T4 polynucleotid-kinase gennemførtes stedspecifik mutagenese ved oligonucleotid-styret in vitro-mutagene-se (Amersham UK, code RPN. 2322).

Et ss-DNA blev opnået ud fra klonen, der var 5 transformeret ind i E. coli MV1304 (Takara Shuzo Co. Ltd.), og underkastet DNA-sekvensbestemmelse ved deoxy-kædetermination, hvorved der blev opnået rekombinant (transformant) fl.IL-la-16G.141S/E.coli MV1304.

Dette plasmid er ekspressionsplasmidet for poly-10 peptid med formlen (a), hvor Arg ved 16-stillingen var erstattet med Gly, X ved 36-stillingen var Asn, og Y ved 141-stillingen var Ser.

Transformanten er deponeret under navnet Escherichia coli MVl304/fl.Il-la.16G.141S og løbenummer 15 FERM BP-2434 hos Fermentation Research Institute, Agency of industrial^ScTShce and Technology.

(2) Inkubation af transformant.

20 Den under (1) opnåede transformant, dvs. E. coli MV1304/fl.IL-la-16G.141S blev inkuberet natten over ved

O

37 C med rystning i 600 ml LB-medium (med følgende sammensætning) indeholdende 100 yg/ml af ampicillin til opnåelse af en præ-dyrkningsopløsning.

25

Sammensætning af LB-medium:

Bacto-trypton (produkt fra Difco) 10 g/1

Bacto-gærekstrakt (ibid.) 5 g/1 30 NaCl (Wako Pure Chemical Inc. Ltd.) 10 g/1.

En portion på 600 ml af præ-dyrkningsopløsningen blev inokuleret i 30 liter af et produktionsmedium med nedenstående sammensætning og inkuberet ved 36,5°C i 14 35 timer i et 50. liters forgæringskar (produkt fra Hitachi Ltd.) med rysteluftning på 0,5 VVM ved 120 rpm.

1 9 DK 172424 B1

Sammensætning af produktlonbsmedium:

Na2HP04,12H20 6 g/1 kh2po4 3 g/1 5 NaCl 0,5 g/1 NH4C1 1 g/l

Bacto-casaminosyre 10 g/1

Bacto-gærekstrakt 0,5 g/1 L-cystein, HC1 75 mg/1 10 L-prolin 75 mg/1 L-leucin 75 mg/1.

(Mediet blev indstillet på pH 7,4 med 4N NaOH

0 efterfulgt af behandling i en autoklav ved 121 C i 30 15 minutter eller ved behandling med damp-opvarmning ved 123°C i 20 minutter. Den steriliserede opløsning med nedenstående sammensætning blev aseptisk sat til mediet efter inokulering.

20

Sammensætning af steriliseret opløsning: 1M MgS04,4H20 2 ml/1 1M CaCl2,2H20 0,1 ml/1 25 7,5 mg/1 Thiamin,HCl 1 ml/1 40% Glucose 18,75 ml/1).

Efter inkubation blev suspensionen af E.coli i 300 ml 1M Na2HP04 henstillet natten over i køleskab og 30 dialyseret mod 10 mM tris HCl-puffer (pH 8,0) i to dage i samme køleskab. Dialysatet blev centrifugeret ved 16000 xg for at skille en supernatant fra et bundfald.

(3) Rensning af iL-la-derivat.

Celleekstrakt-supernatanten fremstillet som ovenfor under (2) blev indstillet på pH 3 med 2 M eddi- 35 20 DK 172424 B1 kesyre og renset ved anvendelse af SP-HPLC (TSK Gel SP-5PW-søjle, 5,5 cm i diameter og 20 cm i længde, produkt fra Tosoh Corporation) under følgende betingelser.

5 Søjle: TSK Gel SP-5PW (5,5 x 20 cm,

Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 50 mM natriumacetat (pH 4,5)

Elueringsmiddel B: 50 mM natriumacetat (pH 5,5)

Strømningshastighed: 30 ml/min.

1 0

Koncentrationsgradident: Tid (min) % B

0 0 30 0 130 100 15 160 100 165 0 195 0

Ovenstående proces resulterede i en GIF-aktiv 20 fraktion med en retentionstid på 114 til 131 minutter.

Den opnåede aktive fraktion blev underkastet SP-HPLC igen under de samme betingelser som ovenfor beskrevet, hvorved der blev opnået en GIF-aktiv fraktion.

Den indsamlede aktive fraktion blev renset ved 25 ionbytterchromatografi (DEAE-HPLC) under følgende betingelser : søjle: TSK Gel DEAE-5PW (5,5 X 20 cm,

Tosoh Corporation) 30 Elueringsmiddel A: 20 mM Tris HCl-puffer (pH 8,0)

Elueringsmiddel B: 20 mM Tris HCl-puffer (pH 8,0) + 0,5M Nacl

Strømningshastighed: 30 ml/min 21 DK 172424 B1

Koncentrationsgradient: Tid (min) % B

0 0 30 0 150 60 5 155 100 185 100 190 0

Ovenstående fremgangsmåde resulterede i en 10 GIF-aktiv fraktion med en retentionstid på 98,8 til 102,8 minutter.

Den indsamlede aktive fraktion blev derefter underkastet ultrafiltrering (YM-5 membran, produkt fra Amikon), hvorved der blev fremstillet et koncentreret 15 produkt med et isoelektrisk punkt (PI) på 5,0. Under ovennævnte ultrafiltrering blev portioner af pufferen udskiftet, således at pufferen til slut havde samme sammensætning som 20 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,0).

20 (4) Identifikation af Il-la-derivat

Aminosyresammensætning

Det koncentrerede produkt (30 μΐ), opnået under 25 (3), blev forsigtigt anbragt i bunden af et hårdt tyk- vægget testrør, 6 mm x 50 mm, og testrøret blev anbragt i en lille reaktionsbeholder og tørret i et vakuum med Pico Tag Work Station (produkt fra Warters). En portion på 200 μΐ 6N HCl (indeholdende 1% phenol) blev an-30 bragt i testrøret inden i beholderen. Det indre af beholderen blev forsigtigt afluftet og derefter forseglet 0 for at tilvejebringe hydrolyse ved 130 C over en periode på fire timer.

Efter åbning af røret blev 400 μΐ 0,02 N Sassy'S C

re sat til hydrolysatet, og den resulterende blanding anvendtes som en prøveopløsning til aminosyreanalyse.

En portion af prøveopløsningen på 250 μΐ anvendtes til aminosyreanalyse ved hjælp af en aminosyreana- 22 DK 172424 B1 lysator (Model HITACHI 835, produkt fra Hitachi Ltd.)·

De adskilte aminosyrer blev påvist ved o-phthalaldehyd-metoden og bestemt kvalitativt ved reference til kalibreringskurver frembragt ved anvendelse af autentiske 5 aminosyrer.

Tabel I viser resultaterne udtrykt i molforhold for indgående aminosyrer baseret på Phe (10 mol). Under ovennævnte analysebetingelser er Pro, Cys og Trp ikke bestemmelige.

10

TABEL I

Aminosyre_Molforhold 15 Asp og/eller Asn 21,1

Thr 11,2 ------

Ser 11,5

Glu og/eller Gin 18,3

Gly 8,8 20 Ala 14,3

Val 6,8

Met 2,0

Ile 10,4

Leu 15,2 25 Tyr 6,7

Phe (10)

Lys 11,1

His 3,2

Arg 2,7 30

Amlnosyresekvens

En portion på 50 μΐ (298 pmol) af det koncentrerede produkt opnået under (3) blev analyseret med en 35 protein-sekvensbestemmer, Model 470A (Applied Biosystems Inc.). Hver resulterende PTH-aminosyre blev passende fortyndet med 100 til 500 μΐ 33% vandig aceto- 23 DK 172424 B1 nitrilopløsning, og en 5 yl's portion af fortyndingen blev injiceret i en chromatografisk søjle med et auto-prøveorgan, Waters 710B. For det chromatografiske system fungerede to pumper, Beckman Model 112, ved hjælp 5 af en kontrolanordning, Model 421. Den anvendte søjle, der målte 2 mm x 250 mm og var pakket med Ultrasphere ODS-5 ym, holdtes ved 55 C ved hjælp af en søjleopvarmer. Strømningshastigheden var 0,3 ml/minut. En blanding af 20 mM natriumacetat og acetonitril anvendtes 10 til gradienteluering. Absorptionsevnen fulgtes ved 269 nm. Analyse gennemførtes i 45 minutter.

Analyseresultaterne viste, at det ved fremgangsmåden (3) opnåede koncentrerede produkt havde følgende sekvens af 36 aminosyrer ved N-terminalen.

1 5

Ser-Ala-Pro-Phe-Ser-Phe-Leu-Ser-Asn-Val-

Lys-Tyr-Asn-Phe-Met-Gly-Ile-Ile-Lys-Tyr-

Glu-Phe-Ile-Leu-Asn-Asp-Ala-Leu-Asn-Gln- 20

Ser-Ile-Ile-Arg-Ala-Asp

Ovenstående resultat bekræfter, at det opnåede 25 rensede produkt er et polypeptid med formlen (a) (IL-la), der er modificeret ved, at Arg ved 16-stillin-gen er erstattet med Gly.

Selvom aminosyren i 36-stillingen var Asn i genet, var den Asp i det rensede produkt. Dette lader 30 formode, at det derivat, hvori aminosyren i 36-stillingen er Asp, er et stabilt derivat, som observeret i na-tivt IL-la, og at den samme mutagenese forekommer i dette IL-la-derivat som i nativt IL-la.

24 DK 172424 B1

Fremstlllinqseksempel 2

Fremstilling af IL-la-derivat (Δ(1-14).36D.141S).

(1) Fremstilling af plasmid til ekspression af IL-5 _la-derivat_

Ved anvendelse af plasmid ptrp IL-la.36D.141S (europæisk patentpublikation nr. 237 073, båret af Escherichia coli HB101/IL-la-36D.141S (FERM BP-1295)) 10 blev processen gennemført ved den stedspecifikke muta-genesemetode.

ClAI/BamHI DNA-fragment (527 bp) blev isoleret fra plasmid ptrp IL-la-36D.141S og ligeret med samme store ClAI-BamHI-fragment af vektor fl.IL-Ιβ lppT som i 15 fremstillingseksempel 1, hvorved der blev opnået fl.IL-la-36D.141S. Med det opnåede produkt blev hjæl-per-phag M13K07 (Takara Shuzo Co. Ltd.) inficeret, hvorved der blev opnået enkeltstrenget (ss) DNA, der derefter anvendtes som en mutagenese-template.

20 Ved som primer at anvende et syntetisk oligonu- cleotid [5'-AAGGGTATCGATTATGATGAGGATCATC-31] gennemførtes sted-specifik mutagenese ved oligonucleotid-styret in vitro-mutagenese på samme måde som i fremstillingseksempel l.

25 Et ss DNA opnået ud fra klonen, der var trans formeret ind i E.coli MV1184 (Takara Shuzo Co., Ltd.) blev underkastet DNA-sekvensbestemmelse ved dideoxykæ-determination, hvorved der blev opnået rekombinant (transforment) fl.IL-la-A(l-14).36D.141S/E. coli 30 MV1184.

Dette plasmid er ekspressionsplasmidet for poly-peptid med formlen (a), der er modificeret ved, at sekvensen af aminosyrer fra 1- til 14- stillingen er udeladt, X i 36-stillingen er Asp, og Y i 141-stillingen 35 er Ser.

Transformanten er deponeret under navnet

Escherichia coli MVll84/fl.IL-la.A(l-14)36D.141S og lø- 25 DK 172424 B1 benummer FERM BP-2433 hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.

Ekspression og rensning af det ønskede IL-la-de-rivat foregik i det væsentlige på samme måde som i 5 Fremstillingseksempel 1.

Det ønskede derivat (IL-Ια-Δ(1-14).36D.141S) blev herved opnået.

Den specifikke aktivitet var 1,0 x 106 GIF-en-heder/mg protein.

1 o (2) Identifikation af IL-la-derivat

Aminosyresammensætning IL-la-Derivatet opnået under (1) blev underka-15 stet aminosyreanalyse på samme måde som i fremstillingseksempel l. ‘ ~

Tabel II viser resultaterne udtrykt som molforhold for indgående aminosyrer baseret på Phe (9 mol).

26

TABEL II

DK 172424 B1

Aminosyre_Molforhold 5 Asp 19,0

Thr 11,0

Ser 7,1

Glu 16,3

Gly 5,3 10 Ala 13,2

Val 5,8

Met 4,0

Ile 10,3

Leu 13,8 15 Tyr 5,7

Phe ---- (7)

Lys 10,0

His 3,2 20 Aminosyresekvens

Aminosyresekvensen ved N-terminalen af IL-la-de-rivatet opnået under (1) blev analyseret på samme måde som i Fremstillingseksempel 1.

25 Resultatet viste følgende sekvens på 15 aminosy rer ved N-terminalen.

Met-Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-lle-

Leu-Asn-Asp-Ala-Leu 30

Ovenstående resultat bekræfter, at det opnåede derivat har en sekvens som IL-Ια med formlen (a), der er modificeret ved, at aminosyresekvensen fra l- til 14-stillingen er udeladt.

27 DK 172424 B1

Fremstlllinqseksempel 3

Fremstilling af IL-la-derivat (Δ(1-15)).

(1) Fremstilling af plasmid til ekspression af 5 IL-la-derivat._

Vektor fl.IL-Ιβ lppT til IL-Ιβ stedspecifik-mu-tagenese (Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 1106 -1114 (1988)) anvendtes i dette eksempel. Først blev 10 denne vektor digereret med EcoRI, behandlet med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og underkastet selv-ligering, hvorved der blev opnået fl.IL-Ιβ lppTARI, hvori EcoRI-sted var udeladt. Af dette plasmid blev stort Hpal/BamHI-fragment udskåret.

15 Lille EcoRI/BamHI DNA-fragment blev udskåret fra plasmid ptrp IL-la-113 (europæisk patentpublikation nr.

237 073) og ligeret med ovennævnte store Hpal/BamHl-fragment ved anvendelse af en syntetisk linker (5'AACT AGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTTAATATTATGAGAATCATCAAATACG-3' 20 og 5'-AATTCGTATTTGATGATTCTCATAATATTAAACCTCCTTACGTGAACTT GCGTACTAGTT-3')/ hvorved der blev opnået den ønskede rekombinant (transformant) fl.IL-laA(l-15)/E.coli MV1184.

Dette plasmid er et ekspressionsplasmid for det 25 foreliggende IL-la-derivat med en aminosyresekvens med formlen (a), hvori aminosyresekvensen fra 1- til 15-stillingen er udeladt, X i 36-stillingen er Asn, og Y i 141-stillingen er Cys.

30 (2) Fremstilling af Il-la-derlvat

Ved anvendelse af det ovenfor opnåede plasmid blev ekspression og rensning af det ønskede Il-la-deri-vat gennemført i det væsentlige på samme måde som i 35 Fremstillingseksempel 1.

E. coli HB101 med plasmid fl.IL-la.A(1-15) blev dyrket under de samme betingelser som i Fremstillings- 28 DK 172424 B1

eksempel 1. Cellerne blev indhøstet ved centrifugering ved 16000 xg og suspenderet i 1M phosphatpuffer (pH

6,0). Suspensionen blev henstillet natten over i et koldt rum og dialyseret mod 0,01 M phosphatpuffer (pH 5 6,0) i to dage. Dialysatet blev centrifugeret ved 16000 xg for at adskille en supernatant og et bundfald.

Det resulterende bundfald blev to gange underkastet samme operation som beskrevet ovenfor. De to opnåede supernatanter blev sammenblandet, og blandingen 10 blev underkastet rensning på følgende måde.

(3) Rensning af Il-la-derivat

Supernatanten fremstillet ovenfor under (2) blev 15 renset ved anvendelse af DEAE-HPLC (TSK Gel DEAE-5PW-søjle, 5,5 cm i diameter og 20 cm i længde, produkt fra Tosoh Corporation) under følgende betingelser.

Søjle: TSK Gel DEAE-5PW (5,5 x 20 cm, 20 Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 20 mM Tris HC1 (pH 8,0)

Elueringsmiddel B: 20 mM Tris HCl (pH 8,0) inde holdende 0,5M NaCl Strømningshastighed: 30 ml/min.

25 Koncentrationsgradient: Tid (min) %B

0 0 30 0 150 60 155 100 30 185 100 190 0

Fraktionen med en retentionstid på 88 til 93 minutter (fraktion A) og fraktionen med en retentionstid 3 5 på 99 til 103 minutter (fraktion B) blev opsamlet og derefter underkastet ultrafiltrering (YM-5 membran, produkt fra Amikon) med henblik på koncentrering. Kon- 29 DK 172424 B1 centratet blev renset ved gelfiltrerings-HPLC (TSK Gel G-2000 SWG-søjle, 21,5 x 600 mm, Tosoh Corporation, elueringsmiddel: PBS-).

Fraktion A, renset som ovenfor, blev indstillet 5 på pH 4,0 med 2 M eddikesyre og underkastet SP-HPLC (TSK Gel SP-5PW-søjle, 21,5 x 150 mm, Tosoh Corporation) under følgende betingelser.

Søjle: TSK Gel SP-5PW (21,5 x 150 cm,

Tosoh Corporation) 10 Elueringsmiddel A: 50mM natriumacetat (pH 5,0)

Elueringsmiddel B: 50mM natriumacetat (pH 5,0) indeholdende 0,5M NaCl Strømningshastighed: 3 ml/min.

Koncentrationsgradient: Tid (min) %B

15 0 0 20 0 110 45 115 100 130 100 20 135 0

Fraktionen med en retentionstid på 87 til 93 minutter blev indsamlet og derefter koncentreret ved ultrafiltrering (YM-5 membran, produkt fra Amikon).

25 Under ultrafiltreringen blev pufferen udskiftet i begrænsede mængder, således at der til slut forelå den samme sammensætning som af 20 mM natriumphosphat-kon-centrat (pH 6,0).

30 (4) Identiflkatioin af IL-la-derlvat (Fraktion A)

Amlnosyresammensætninq 35 Det rensede koncentrat opnået under (3) blev un derkastet aminosyreanalyse på samme måde som i Frem-stillingseksempel 1.

30 DK 172424 B1

Tabel III viser resultaterne udtrykt i molforhold af indegående aminosyrer baseret på Phe (7 mol).

TABEL III

5

Aminosyre_Molforhold

Asp 18,0

Thr 11,2 10 Ser 6,8

Glu 17,1

Gly 5,8

Ala 13,1

Val 5,7 15 Met 2,8

Ile 10,9

Leu 14,1

Tyr 5,9

Phe (7) 20 Lys 10,2

His 3,0

Arg 3,1

Aminosyresekvens 25

Aminosyresekvensen ved N-terminalen af IL-la-de-rivatet fremstillet under (3) blev analyseret på samme måde som i Fremstillingseksempel l.

Analyseresultaterne viste følgende sekvens for 30 23 aminosyrer ved N-terminalen.

35

Ovenstående resultat bekræfter, at det opnåede derivat har en sekvens med formlen (α) (IL-Ια), hvori 31 DK 172424 B1 aminosyresekvensen fra 1- til 15-stillingen er udeladt, og X er Asn.

(Fraktion B) 5

Amlnosyresammensætninq

Det rensede produkt blev fremstillet og underkastet aminosyreanalyse på samme måde, som beskrevet for 10 Fraktion A.

Tabel IV viser resultaterne udtrykt i molforhold af indgående aminosyrer baseret på Phe (7 mol).

TABEL IV

15

Aminosyre_Molforhold

Asp 18,3

Thr 11,3 20 Ser 6,7

Glu 17,2

Gly 5,7

Ala 13,2

Val 5,8 25 Met 2,9

Ile 10,9

Leu 14,1

Tyr 5,9

Phe (7) 30 Lys 9,9

His 3,0

Arg 3,1

Aminosyresekvens 35

Aminosyresekvensen ved N-terminalen af det rensede produkt fra fraktion B blev analyseret på samme 32 DK 172424 B1 måde som i Fremstillingseksempel 1. Sekvensen af 23 aminosyrer ved N-terminalen var følgende.

Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu- 5 Asn-Asp-Ala-Leu-Asn-Gln-Ser-Ile-Ile-Arg-

Ala-Asp-Asp-

Resultatet bekræfter, at det opnåede derivat har sekvensen med formlen (a), hvor aminosyresekvensen fra 10 i- til 15-stillingen er udeladt, og X er Asp.

Fremstllllnqseksempel 4

Fremstilling af IL-la-derivat (Δ(1-15). 36D.141S).

15 (i) Fremstilling af ekspressionsvektor pAT-IL-ΙαΔ- (1-15)36S.141S_

Ved anvendelse af plasmid ptrp IL-la-36D.141S (europæisk patentpublikation nr. 237073, båret af 20 Escherichia coli HB101/IL-la-36D.141S (FERM BP-1295)) blev processen gennemført ved metoden med stedspecifik mutagenese.

Clal/BamHI DNA-fragment (527 bp) blev udskåret fra plasmid ptrp IL-la-36D.141S og ligeret med stort 25 Clal/BamHI-fragment af vektor fl.IL-Ιβ lppT for IL-Ιβ stedspecifik mutagenese (Biochem. Biophys. Res. Commun., 150 1106-1114 (1988)), hvorved der blev opnået fl.IL-la-36D.14lS. Hjælper-phag M13K07 (Takara Shuzo Co., Ltd.) blev inficeret med ovennævnte plasmid, hvor-30 ved opnåedes enkeltstrenget (ss) DNA, der derefter anvendtes som mutagenese-template.

Ved som primer at anvende et syntetisk oligonu-cleotid [ 5 1 -GTATTCGATAATGAGAATCATC-3 ' ], blev der gennemført stedspecifik mutagenese med "Oligonucleoide-35 directed in vitro Mutagenesis KIT" (produkt fra Amersham UK).

Et ss-DNA opnået fra klonen transformeret ind i E. coli MV1184 (Takara Shuzo Co., Ltd.) blev underka 33 DK 172424 B1 stet DNA-sekvensbestemmelse ved dideoxykædetermination, hvorved der blev opnået rekombinant (transformant) fl.IL-ΙαΔ(1-15).36D.141S/E.coli MV1184.

Ekspressionsvektor til storvolumen-fermentatio-5 nen blev fremstillet på følgende måde.

Først blev fl.IL-Ιβ lppT digereret med Mlul og Sall, behandlet med DNA polymerase (Klenow fragment) og ligeret med T4 DNA-ligase, hvorved der blev opnået fl.IL-Ιβ lppTAMS. Dette produkt blev behandlet med 10 EcoRl og derefter DNA-polymerase (Klenow-fragment), underkastet selvligering og yderligere behandlet med Aatll, T4DNA-polymerase og Bglll-linker (pGAAGATCTTC) i nævnte rækkefølge for at omdanne Aatll-sted til Bglll-sted. Plasmidet blev yderligere behandlet med Sall, 15 DNA-poly-merase (Klenow-fragment) og Xbal-linker (pGCTCTAGAGC) for at omdanne Sall-sted til Xbal-sted.

Stort Clal/BamHI DNA-fragment (5,5 Kb) blev udskåret fra det resulterende plasmid og ligeret med Clal/BamHI DNA-fragment (482 bp) af fl.IL-ΙαΔ(1-15J36D.141S, hvor-20 ved der blev opnået fl.IL-aA(l-15)36D.141S (Aatll-» Bglll, SalI-»Xbal), fra hvilket Bglll/Xbal DNA-fragment (1109 bp) blev udskåret.

Yderligere blev plasmid pATl53 behandlet for at omdanne Clal-sted til Bglll—sted og Dral-sted til 25 Xbal-sted og digereret med Bglll og Xbal, hvorved der blev opnået stort Bglll/Xbal-fragment (2514 bp). Det store fragment blev ligeret med ovennævnte Bglll/Xbal-fragment (1109 bp), hvilket gav den ønskede transformant pAT.IL-ΙαΔ(1-15)36D.141S.

30 Denne transformant er ekspressionsplasmidet, der har den aminosyresekvens med formlen (a), hvori amino-syresekvensen fra 1- til 15-stillingen er udeladt (det protein, der opnås ud fra denne transformant, kan imidlertid, da Met stammende fra initierings-codonen er 35 forbundet til proteinets N-terminal, være det polypep-tid, hvori aminosyresekvensen fra 1- til 14-stillingen er udeladt), X ved 36-stillingen er Asp, og Y ved 141-stillingen er Ser.

34 DK 172424 B1

Transformanten er deponeret under navnet Escherichia coli HB101/pAT Ι1-1αΔ(1-ΐ5)36D.141S og løbenummer FERM BP 2483 hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.

5 (2) Inkubation af transformant

Transformanten opnået under (l), dvs. E.coli HB101/pAT.IL-αΔ(1-15)36D.141S blev inkuberet natten

O

10 over ved 37 C under rystning i 600 ml LB-medium med ne-denstående sammensætning indeholdende 10 pg/ml tetra-cyclin, hvilket gav en prædyrkningsopløsning.

Sammensætning af LB-medium: 1 5

Bacto-trypton (produkt fra Difco) 10 g/1 —

Bacto-gærekstrakter (ibid) 5 g/1

NaCl (Wako Pure Chemical Inc. Ltd.) 10 g/1.

20 En portion på 600 ml af prædyrknings-opløsningen blev inokuleret i 30 liter af et produktionsmedium med 0 følgende sammensætning og inkuberet ved 36,5 C i 16 timer i et 50 liter fermenteringskar (produkt fra Hitachi Ltd.) med rystningsluftning på 1,0 WM ved 300 rpm.

35 DK 172424 B1

Sammensætning af produktionsmiddel

Na2HP04/12H20 6 g/1 KH2P04 3 g/1 5 NaCl 0,5 g/1 NH4C1 1 g/1

Syrehydrolysat af casein (produkt fra Sigma) 10 g/1

Bacto-gærekstrakt 0,5 g/1 10 MnCl2,4H20 2,5 mg/1 L-cystein, HC1 75 mg/1 L-prolin 75 mg/1 L-leucin 75 mg/1.

15 (Mediet blev indstillet på pH 7,4 med 4N NaOH

o efterfulgt af behandling i en autoklav ved 121 C i 30 minutter. Den steriliserede opløsning med nedenstående sammensætning blev aseptisk sat til mediet efter inoku-lation.

20

Sammensætning af steriliseret opløsning: 1M MgS04,4H20 2 ml/1 1M CaCl2,2H20 0,1 ml/1 25 7,5 mg/1 Thiamin,HCl 1 ml/1 40% Glucose 18,75 ml/1).

Efter inkubation blev celler indhøstet ved centrifugering ved 16000 xg. Suspensionen af cellerne i 1 30 m phosphatpuffer (pH 6,0) blev henstillet natten over i køleskab og dialyseret mod 10 mM tris HCl-puffer (pH

8,0) i to dage. Dialysatet blev centrifugeret ved 16000 xg for at skille en supernatant fra et bundfald. Bundfaldet blev behandlet ved samme operation som oven-35 for, hvorved der blev opnået en supernatant. De således opnåede supernatanter blev sammenblandet, og blandingen blev underkastet følgende rensningsproces.

36 DK 172424 B1 (3) Rensning af Il-la-derlvat

Celleekstrakt-supernatanten, fremstillet som ovenfor under (2), blev indstillet på pH 3 med 2 M ed-5 dikesyre og renset ved anvendelse af SP-HPLC (TSK Gel SP-5PW-søjle, 5,5 cm i diameter og 20 cm i længde, produkt fra Tosoh Corporation) under følgende betingelser.

Søjle: TSK Gel SP-5PW (5,5 x 20 cm, 10 Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 50 mM natriumacetat (pH 5,0)

Elueringsmiddel B: 50 mM natriumacetat (pH 5,0) + 0,5 M NaCl

Strømningshastighed: 30 ml/min.

1 5

Koncentrationsgradient: Tid (min) % B

0 0 30 0 90 30 20 95 100 125 100 130 0

De aktive fraktioner med retentionstid på 70 til 25 75 minutter blev samlet og indstillet på pH 8,1 med 1 M

Tris HCl-puffer. Fraktionen blev anbragt på en DEAE-HPLC-søjle (TSK GEL DEAE-5PW-søjle, 5,5 x 20 cm, produkt fra Tosoh Corporation) efterfulgt af eluering under følgende betingelser.

30 Søjle: TSK Gel DEAE-5PW (5,5 x 20 cm,

Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 20 mM Tris HCl-puffer (pH 8,0)

Elueringsmiddel B: 20 mM Tris HC1 (pH 8,0) + 0,5M

3 5 NaCl

Strømningshastighed: 30 ml/min 37 DK 172424 B1

Koncentrationsgradient: Tid (min) % B

0 0 20 0 140 60 5 145 100 165 100 170 0

De aktive fraktioner med retentionstid på 92 til 10 96 minutter blev samlet, koncentreret ved ultrafiltre ring (YM-5 membran) og renset ved gelfiltrerings-HPLC (TSK-Gel G-2000SWG-søjle, 21,5 x 600 mm, produkt fra Tosoh Corporation, elueringsmiddel: PBS").

Det rensede produkt blev indstillet på pH 4 med 15 2 M eddikesyre og anbragt på en SP-HPLC-søjle (TSK-GEL

SP-5PW-søjle, 21,5 x 150~mm, produkt fra Tosoh Corpora- — tion) efterfulgt af eluering under følgende betingelser.

20 Søjle: TSK Gel SP-5PW (21,5 x 150 mm,

Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 50 mM natriumacetat (pH 5,0)

Elueringsmiddel B: 50 mM natriumacetat (pH 5,0) +0,5 25 M NaCl

Strømningshastighed: 3 ml/min.

Koncentrationsgradident: Tid (min) % B

30 0 0 20 0 110 45 115 100 130 100 35 135 0

De aktive fraktioner med retentionstid på 87 til 90 minutter blev samlet og derefter underkastet ultra- 38 DK 172424 B1 filtrering (YM-5 membran, produkt fra Amikon), hvorved der blev fremstillet et koncentreret produkt. Under ovennævnte ultrafiltrering blev små portioner af pufferen udskiftet, således at pufferen til slut havde samme 5 sammensætning som 20 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,0).

(4) Identifikation af IL-la-derivat

Amlnosyresammensætnlnq 10

Det rensede produkt opnået under (3) blev underkastet aminosyre-analyse på samme måde som i Fremstillingseksempel l.

Tabel V viser resultatet udtrykt i molforhold af 15 indgående aminosyrer baseret på Phe (7 mol).

TABEL V

Aminosyre_Molforhold 20

Asp 18,6

Thr 11,4

Ser 7,7

Glu 17,2 25 Gly 5,7

Ala 13,2

Val 5,8

Met 2,8

Ile 10,9 30 Leu 14,1

Tyr 5,9

Phe (7)

Lys 9,9

His 3,0 35 Arg 3,1 DK 172424 B1 39

Aminosyresekvens

Aminosyresekvensen ved N-terminalen af IL-la-de-rivatet fremstillet under (3) blev analyseret.

5 Analyseresultaterne viste følgende sekvens for 15 aminosyrer ved N-terminalen.

Met-Arg-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-

Asn-Asp-Ala-Leu-Asn-

Ovenstående resultat bekræfter, at derivatet har 10 en sekvens med formlen (a) (Il-la), hvori aminosyresekvensen fra l- til 15-stillingen var udeladt.

Eksempel 1 15 Fremstilling af medikament til behandling af thrombocytopenia_

Til en saltopløsning af polypeptidet (IL-la.A(l- 14).36D141S) fremstillet i Fremstillingseksempel 2, der 20 havde GIF-aktivitet på 1 x 106 enheder/ml, blev der sat humant serumalbumin (HSA) til en koncentration på 0,5%. Blandingen blev filtreret med et membranfilter (0,22 ym), og 1 ml's portioner af filtratet blev aseptisk anbragt i 1 ml's medicinflasker og lyofiliseret, hvorved 25 der blev opnået et farmaceutisk præparat til injektion.

Det således opnåede præparat blev anvendt opløst i 1 ml destilleret vand.

Eksempel 2 30

Farmakologisk test I

Den farmakologiske effekt af den aktive komponent af det omhandlede medikament til behandling af 35 thrombocytopenia blev vurderet i dette eksempel.

De som aktive komponenter ved testen anvendte polypeptider var følgende: * IL-la (36D.141S) 40 DK 172424 B1

Derivat af IL-Ια, hvor Asn ved 36-stillingen er erstattet med Asp, og Cys ved 141-stillingen er erstattet med Ser (europæisk patentpublikation nr. 237073).

* Derivat IL-Ια (Δ(1-14).36D.141S) 5 Derivat af IL-ΐα (opnået i Fremstillingseksempel 2), hvor aminosyresekvensen fra 1-stilling til 14-stil-ling er udeladt, og Asn i 36-stillingen er erstattet med Asp, og Cys i 141-stillingen er erstattet med Ser.

10 * IL-lg (16G.36D.141S)

Derivat af IL-Ια (opnået i Fremstillingseksempel 1), hvor Arg i 16-stillingen er erstattet med Gly, Asn i 36-stillingen er erstattet med Asp, og Cys i 141-stillingen er erstattet med Ser.

15 * IL-Ιβ (natlvt IL-13)

Polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (β) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 147(1), 315-321 (1987) ) .

Testen blev gennemført ved anvendelse af ni uger 20 gamle BALB/c-hanmus (Experimental Animal Corporation Association of Shizuoka Prefecture, Japan).

Hvert af ovennævnte polypeptider (aktive komponenter) blev fortyndet til den foreskrevne koncentration med en fysiologisk saltopløsning til injektion in-25 deholdende 100 pg/ml af museserumalbumin (fremstillet af Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.).

På den indledende dag (dag 0) blev dyrene systematisk bestrålet med 400 Rad af røntgenstråler ved anvendelse af et røntgenstråle-bestrålingskammer til små 30 forsøgsdyr (Hitachi MBR-1505R) for at inducere thrombocytopenia .

Fra den følgende dag blev testlægemidlet indgivet subcutant 13 gange hver dag.

På dag 14 blev musene anæsteseret med ether.

35 Blod blev taget fra den nedre vena cava efter laparoto-mi og opsamlet i en mikrobeholder (fremstillet af Becton Dickinson). Blodcellerne blev analyseret ved 41 DK 172424 B1 anvendelse af en automatisk blodcelle-analysator (ELT/8, Ortho Diagnostic System, Inc.)

Forsøget blev foretaget ved anvendelse af fem mus pr. gruppe.

5 Antallet af blodplader (gennemsnit ± S.E., x 103/mm3) på dag 14 er vist i nedenstående Tabel VI.

TABEL VI

10 Test-Polypeptid Dosis (pg/kg) 0,1 1 10 15 IL-1 a [36D. 141S] 969±40* 1211±32* 1446±37* 20 IL-1 a [Δ d-14) .36D.141S] 872±17* 1253±15* 1374±69* IL-1 a [16G.36D.141S] 715±23* 911±28* 1220±68*

Kontrol-opløsnings- 447±52 25 middelgruppe 1164±10

Ubehandlet normal gruppe 30 Testen vedrørende signifikant differens gennem førtes ifølge Student's t-test under anvendelse af værdien fra opløsningsmiddelgruppen som kontrol. I ovenstående Tabel betyder * p£0,001.

Som vist i Tabel VI faldt antallet af blodplader 35 til 447 ± 52 i kontrolgruppen, selvom det var 1164 ± 10 hos den ubehandlede normalgruppe. På den anden side begyndte hos gruppen med den foreliggende aktive kompo- 42 DK 172424 B1 nent (IL-1 og dets derivat) bemærkelsesværdig dosisafhængig stigning i blodplader fra dosen på 0,1 pg/kg. Resultatet viser, at de omhandlede aktive komponenter er anvendelige ved behandling af thrombocytopenia.

5

Eksempel 3 Farmakologisk test II

10 Testen gennemførtes på samme måde som ved farma kologisk test I under anvendelse af følgende IL-la-de-rivater: * IL-la (nativ form) * IL-la (36D.141S) 15 * IL-la (A(l-15))

Derivat af IL-la, hvori aminosyresekvensen fra l-stillingen til 15-stillingen er udeladt (opnået i Fremstillingseksemperl 3).

* IL-la (Δ(1-15).36D) 20 Derivat af IL-la, hvori aminosyresekvensen fra l-stillingen til 15-stillingen er udeladt, og Asn i 36-stillingen er erstattet med Asp (opnået i Fremstillingseksempel 3).

* IL-la (A(l-15).36D.141S) 25 Derivat af IL-la, hvori aminosyresekvensen fra 1- til 15-stillingen er udeladt, Asn i 36-stillingen er erstattet med Asp, og Cys i 141-stillingen er erstattet med Ser (opnået i Fremstillingseksempel 4).

* IL-la (A(l-14).36D.141S) 30 Derivat af IL-la, hvori aminosyresekvensen fra 1- til 14-stillingen er udeladt, Asn i 36-stillingen er erstattet med Asp, og Cys i 141-stillingen er erstattet med Ser (opnået i Fremstillingseksempel 2). Antallet af blodplader (gennemsnit ± S.E., 35 x io3/mm3) på dag 14 for hver af doserne er vist i nedenstående Tabel vil, og antallet af neutrophiler (gennemsnit ± S.E., x 103 1/mm3) er vist i Tabel VIII.

Test-Polypeptid Dosis (yg/kg) 0,1 1 10 5 __ DK 172424 B1 43

TABEL VII

IL-la 794,0 ±99,7* 940,3 ±80,7* 1225,8 ± 55,5* 1Q IL-la [36D.141S] 818,8 ±13,2* 1071,0 ±36,0* 1327,5±28,8* IL-la [ Δ (1-15) ] 778,0 ±62,6* 1077,3 ±13,8* 1347,5 ± 54,5* IL-la [ Δ (1-15).36D] 844,7 ±56,6* 932,3 ± 132,6* 1218,8± 194,3* 1 5 IL-1 a [Δ d-15) .36D.141S] 862,7 ±65,9* 961,0 ±12,1* 1262,0± 4,4* IL-la [Δ (1-14) .36D.141S] 637,8 ± 8,9* 1022,5 ±21,3* 1158,0± 9,3* 20 Kontrol-opløsnings- 661j3 ±332 middelgruppe

Ubehandlet normal 967,8 ±13,l gruppe 44

TABEL VIII

Test-Polypeptid Dosis (pg/kg) 0,1 1 10 5 ___ DK 172424 B1 IL-la 0,2 ± 0,0* 1,7 ± 0,3* 5,6 ± 1,0* 1L-1n [36D · 141S] 0,7 ± 0,1* 2,3 .± 0,5* 4,7 ± 0,5* 10 IL-l a [Δ (1-15)] 0,1 ± 0,0* 1,5 ± 0,0* 4,1 ± 0,6* IL-l a [ Δ (1-15) .36D] 0,4 ± 0,1* 1,5 ±0,2* 3,3 ±1,2* IL-l a [Δ (1-15) .36D.141S] 0,1 ±0,1* 0,8 ± 0,1* 2,3 ± 0,4* IL-l a [ Δ (1-14) .36D.141S] 0,4 ±0,0* 1,4 ±0,2* 2,0 ±0,5* 20 Kontrol-opløsnings- i 4 ±0,2 middelgruppe Ubehandlet normal gruppe DK 172424 B1 45

Eksempel 4 Fysiologisk aktivitet 5 GIF-Aktiviteten af IL-la-derivatet er vist i ne denstående Tabel IX.

TABEL IX

10 Test-Polypeptid GIF-Aktivitet

Specifik aktivitet Relativ (U/mg)-gennemsnit aktivi-til S.D. tet 15 IL-la 8,90±0,802 χ 106 1,00 7 1L-1 a [36D. 141S] 1,09±0,0836 χ 10 1,22 20 6 IL-la [ Δ (1-15)] 1,86±0,148 χ10 0,21 IL-1 a. [Δ (1-15)-36D] 2,42±0,215 χΙΟ6 0,27 IL-l a [Δ d-15) .36D.141S] 8,83±0,526 χ 105 0,10 25 5 IL-l a [ Δ (1-14)36D. 1415j 6,97±0,782 χ10 0,08

Eksempel 5

Test for pyroqenicitet IL-l og derivater deraf blev testet for pyroge-35 nicitet ved anvendelse af rotter som nedenfor beskrevet.

SD-Hanrotter (6-10 uger gamle, 160 til 250 g i legemsvægt, Japan Charles River) anvendtes til forsø- 46 DK 172424 B1

Hvert af de foreliggende derivater og de andre testforbindelser til sammenligning blev fortyndet til en specifik koncentration med phosphat-saltvandspuffer indeholdende 100 pg/ml rotteserumalbumin til opnåelse 5 af en testopløsning, og som kontrolopløsning anvendtes fortyndingen af humant serumalbumin (HSA).

De foreskrevne mængder af testopløsningen og kontrolopløsningen blev indgivet subcutant på rotterne, der forud var vejet. Rottens rectale temperatur blev 10 bestemt med Thermister Temperature Recorder K293 (Takara Thermistor Instruments Co., Ltd.) forud for indgift og 2, 4 og 6 timer efter indgift.

Som testforbindelser anvendtes de omhandlede derivater fremstillet i fremstillingseksemplerne, sammen-15 ligningsforbindelse IL-Ιβ (nativ form, Biochem.

Biophys. Res. Commun., 147(1), 315-321 (1987)) og ------ — IL-la-sammenligningsderivatet (derivatet med formlen (A) modificeret ved, at Asn i 36-stillingen er erstattet med Asp, og Cys i 141-stillingen er erstattet med 20 ser, europæisk patentpublikation nr. 237073). Resultatet (de rectale temperaturer målt fire timer efter indgift, hvor temperaturen stiger til et maksimum) er vist i fig. 1.

I fig. 1 er dosen (pg/kg) af testforbindelsen 25 afsat som abscisse, og ændringen i rectal temperatur (å6C) fra temperaturen (0) umiddelbart før indgift er afsat som ordinat. Linie (1) viser resultatet opnået med det omhandlede derivat fra Fremstillingseksempel 1 (IL-la.16G.141S), linie (2) viser resultatet opnået med 30 det omhandlede derivat opnået i Fremstillingseksempel 2 (Ι1-1α.Δ(1-14).36D.141S), linie (3) viser resultatet opnået med det native IL-Ιβ, linie (4) viser resultatet opnået med IL-la-derivatet omtalt i ovennævnte europæiske patentpublikation (IL-la.36D.141S), og linie (5) 35 viser resultatet opnået med kontrollen (HSA).

Fig. 1 viser, at derivatet ifølge den foreliggende opfindelse ikke i væsentlig grad inducerer feber 47 DK 172424 B1 ved nogen dosis, og således udviser en bemærkelsesværdig inhibition af pyrogenicitet. På den anden side inducerede IL-Ιβ feber ved en dosis på 0,1 yg/kg, og legemstemperaturen steg med stigende dosis. Med 5 IL-la.36D.141S inducerede en dosis på 100 yg/kg feber, medens doser på 0,1, 1 og 10 yg/kg ikke inducerede feber .

Forsøg gennemførtes på samme måde som ovenfor ved anvendelse af IL-la-derivaterne fremstillet i Frem-10 stillingseksemplerne 3 og 4.

Resultatet er vist i fig. 2. Linierne (l) til (4) viser resultaterne opnået med de omhandlede derivater: (1) med IL-la(Δ(1-15)), 15 (2) med IL-la(Δ(l—15).36D), (3) med IL-la(Δ(1—15).36D.141S) og (4) med IL-la(A(l-14).36D.141S).

Linierne (5) til (8) viser resultaterne opnået med sammenligningsforbindelsen IL-1: 20 (5) med IL-la, (6) med IL-la(36D), (7) med IL-la(36D.141S) og (8) med [71Ser]-IL-ip (europæisk patentpublikation nr. 187991).

25

Eksempel 6

Hemopoletin-1-aktivitetstest 30 Hemopoietin-l-aktivitet blev bestemt ved metoden ifølge Stanley, R. et al., (Cells, 45, 667-674, 1986).

150 mg/kg 5-Fluoruracil blev indgivet intravenøst på en BALB/c-hanmus (Cooperative Association of Shizuoka Prefecture Japan), og benmarvceller (5-FU behandlede 35 marvceller) blev isoleret fra femur tre dage efter indgift. En specifik koncentration (200 U/ml) af muse-M-CSF og forskellige koncentrationer af IL-la eller DK 172424 Bl 48 IL-la-derivat blev sat til 1,5 x 10^ celler af de 5-FU-behandlede marvceller. Blandingen blev inkuberet i et blødt agarmedium, og antallet af dannede kolonier på kulturmediet blev talt på dag 7. Det anvendte muse-M-5 CSF var fremstillet ud fra L-cellekultur-supernatant. Resultatet er vist i nedenstående Tabel X.

TABEL X

10 Test-Polypeptid Hemopoietin- aktivitet ed50 H-l-akti- (ng/ml) vitet 15 IL—lo 0,1 10 IL-Ια(36D.141S) 0,1 10 20 IL-la{Δ(1-15) ) 2,3 1 IL-la (Δ (1-15) .36D) 2,3' 1 IL-lo(Ml-15) .36D.141S) 2,3 1

IL-la (Δ (1-14) .36D.141S) 5 _JLlJL

25

Claims (13)

1. IL-ld;-Derivatet med en aminosyresekvens repræ senteret ved formlen (o>) DK 172424 B1 5 10

2. IL-la-derivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Arg i 16-stillingen er erstattet med Gly.

3. IL-la-derivåt Hølge krav 1, kendeteg- 15. e t ved, at aminosyresekvensen fra Ser i 1-stil- lingen til Phe i 14-stillingen er udeladt.

4. IL-la-derivat ifølge krav 1, kendetegne t ved, at aminosyresekvensen fra Ser i 1-stil lingen til Met i 15-stillingen er udeladt.

5. IL-la-derivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at derivatet er IL-Ια.Δ (1-14).36D.141S eller IL-Ια.Δ (1-15).36D.141S.

5 Ser - Ala - Pro - Phe - Ser - Phe - Leu - Ser - Asn - Val - 15 20 Lys - Tyr - Asn - Phe - Met - Arg - Ile - Ile - Lys - Tyr - 2 5 30 Glu - Phe - Ile - Leu - Asn - Asp - Ala - Leu - Asn - Gin - 10 35 40 Ser - Ile - Ile - Arg - Ala X Asp - Gin - Tyr - Leu - 45 50 Thr - Ala - Ala - Ala - Leu - His - Asn - Leu - Asp - Glu - 55 60

15 Ala - Val - Lys - Phe - Asp - Met - Gly - Ala - Tyr - Lys - 65 70 Ser - Ser Lys - Asp - Asp - Ala - Lys - Ile - Thr - Val - 75 80 Ile - Leu - Arg - Ile - Ser - Lys - Thr - Gin - Leu - Tyr - 20 85 90 Val - Thr - Ala - Gin - Asp - Glu - Asp - Gin - Pro - Val - 95 100 Leu - Leu - Lys - Glu - Met - Pro - Glu - Ile - Pro - Lys - 105 110

25 Thr - Ile - Thr - Gly - Ser - Glu - Thr - Asn - Leu - Leu - 115 120 Phe - Phe - Trp - Glu - Thr - His - Gly - Thr - Lys - Asn - 125 130 Tyr - Phe - Thr - Ser - Val - Ala - His - Pro - Asn - Leu - 135 140 Phé - Ile Ala - Thr - Lys - Gin - Asp - Tyr - Trp - Val - 145 150 Y - Leu - Ala - Gly - Gly - Pro - Pro - Ser - Ile - Thr - 35 155 Asp - Phe - Gin - Ile - Leu - Glu - Asn - Gin - Ala DK 172424 B1 hvor X og Y er α-aminosyrerester, der indgår i humane proteiner, med det forbehold at Y ikke er Cys, når X er Asn, og hvilken sekvens er således modificeret, at den 5 opfylder mindst ét af følgende krav; deletion af Arg i 16-stillingen, erstatning af Arg i 16-stillingen med en anden aminosyrerest, deletion af sekvensen fra Ser i 1-stillingen til Phe i 14-stillingen, og deletion af aminosyresekvensen fra Ser i 1-stillingen til Met i 15-10 stillingen.

6. Farmaceutisk præparat omfattende et IL-la-derivat ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 5 og en 25 farmaceutisk acceptabel bærer.

7. Anvendelse af et IL-la-derivat ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 5 til fremstilling af et medikament til behandling af thrombocytopenia.

8. DNA sekvens kodende for et IL-la-derivat som 30 defineret i et vilkårligt af kravene 1 til 5.

9. Rekombinant plasmid indeholdende en DNA sekvens som defineret i krav 8.

10. Transformeret værtcelle bærende et rekombinant plasmid som defineret i krav 9.

11. Transformeret værtcelle som defineret i krav DK 172424 B1 10, hvilken er E. coli MV1304/fl.IL-Ια.16G.141S (FERM BP-2434).

12. Transformeret værtcelle som defineret i krav 10, hvilken er E. coli MV1184/fl.IL-Ια.Δ (1-14)36D.141S 5 (FERM BP-2433).

13. Transformeret værtcelle som defineret i krav 10, hvilken er E. coli HB10l/pAT IL-lor.A (1-15) 36D. 141S (FERM BP-2483).