DK172589B1 - Medikament indeholdende IL-1beta eller et derivat deraf til behandling af thrombocytopenia - Google Patents

Description

DK 172589 B1 i

Opfindelsen angår et medikament til behandling af thrombocytopenia og nærmere angivet et medikament indeholdende som aktiv komponent mindst én forbindelse valgt blandt interleukin-1S(IL-13) og derivater deraf.

5 Teknologien ved cancerterapi har i de senere år udviklet sig. Bemærkelsesværdige fremskridt er gjort ikke blot i henseende til konventionelle kirurgiske operationer, men også inden for kemoterapi, radioterapi og immunoterapi. Imidlertid har navnlig fordelene ved 10 kemoterapi og radioterapi en tendens til at være ledsaget af alvorlige bivirkninger.

Det ideale kemoterapimiddel er et sådant, der udøver en carcinostatisk effekt, men kun har små eller ingen ugunstige virkninger på normale væv. Da konven-15 tionelle kemoterapeutiske midler inducerer stærk inhibition af benmarven ledsaget af fald i leukocyter og blodplader, er det imidlertid umuligt at anvende dem efter hinanden over en lang perdiode, og anvendelsen af medikamentet må afbrydes som følge af disse bivirknin-20 ger. Bestråling med røntgenstråler eller y-stråler ved radioterapi har ligeledes ugunstige virkninger på hema-togene væv, såsom benmarv. Navnlig hvis leukocyter, blodplader osv. er faldet betydeligt, skal bestrålingen afbrydes.

25 Transfusion er en af de konventionelle metoder til at inhibere eller afhjælpe reduktioner i blodplader osv., der tjener som dosis-begrænsende faktorer. Da imidlertid blodceller, såsom blodplader og leucocyter, har en kort levetid, skal friske blodceller hyppigt 30 tilføres. Når der er alvorlig benmarvsygdom, må der foretages benmarvtransplantation. Sådan benmarvtrans-plantation har til formål at overføre hematogene stamceller af benmarven til legemet og således producere blodplader i legemet. Denne metode har haft en epoke- 2 DK 172589 B1 gørende indvirkning på behandling af visse typer af tumorer og er således blevet en fundamental terapi for ondartede tumorer. Ovennævnte benmarvtransplantation medfører imidlertid følgende problemer: 5 Det er meget vanskeligt at tilvejebringe donorer af benmarv, der passer til patienterne. Selvom en donor findes, er transplantationsoperationen vanskelig, og det tager i almindelighed adskillige uger for den transplanterede benmarv at få tag, begynde hematogene-10 sis og derefter producere leukocyter, blodplader osv. i perifert blod. Under denne periode kan patienten derfor svinge mellem liv og død.

Selvom transfusion og benmarv-transplantat ion, som ovenfor beskrevet, er metoder til at afhjælpe fald 15 i blodplader og lignende bivirkninger, der forekommer ved kemoterapi, radioterapi og lignende cancerterapier, er benmarvtransplantation forbundet med forskellige problemer. For at afhjælpe sådanne problemer skal patienterne selv have en forbedret hematogenisk funktion.

20 Det er derfor ønskeligt på det farmaceutiske område at udvikle et hidtil ukendt medikament med den aktivitet at fremme hematogenesis. Navnlig er det helt ukendt at have et medikament med den aktivitet at fremme produktion af blodplader.

25 Den foreliggende opfindelse har haft til formål at tilvejebringe et hidtil ukendt medikament til lindring af sådanne symptomer som thrombocytopenia, osv. for at opfylde det ovenfor beskrevne behov.

Et andet formål for opfindelsen har været at 30 tilvejebringe et iL-l-derivat, navnlig et IL-l/?-deri-vat, der er anvendeligt som aktiv komponent i medikamentet til behandling af thrombocytopenia.

Ovennævnte formål er nået gennem et medikament til behandling af thrombocytopenia, der indeholder 35 mindst ét polypeptid blandt IL-lS og lL-1S-derivater.

Opfinderne har gennemføret en omfattende forsk- 3 DK 172589 B1 ning med henblik på ovennævnte situation og fundet, at IL-18 og IL- 18-derivater, der tidligere har vist sig at have forskellige effekter omfattende den effekt at aktivere lymphocyter og den effekt at fremme produktion 5 af interleukin-2 (IL-2), antistoffer, osv. og de hidtil ukendte IL-l-derivater, der er udviklet af opfinderne, har overraskende bemærkelsesværdig effekt i henseende til at inhibere reduktion af blodplader (den effekt at forøge blodplader) og er meget anvendelige som medika-10 menter for thrombocytopenia med henblik på at opfylde ovennævnte formål. Opfindelsen blev gjort på basis af disse fund.

Det omhandlede medikament til behandling af thrombocytopenia, hvilket medikament indeholder IL-IS 15 eller et derivat deraf som aktiv komponent, har den bemærkelsesværdige effekt at forøge blodplader og er derfor meget anvendeligt til behandling af thrombocytopenia .

IL-lg-forbindelser, der er aktive komponenter til 20 anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse omfatter IL-16 med en sekvens På 153 aminosyrer (Proc. Natl.

Acad. Sci., 81., 7907-7911 (1984); Nature, 311, 641 (1985); Nucleic Acid Research, 1J3 (16). 5869 (1985)). Aminosyresekvensen er identificeret ud fra den gen-25 sekvens, der koder for polypeptidet med LAF(lymphocyt-aktiverende faktor)-aktivitet. Disse interleukiner kan være native interleukiner isoleret på konventionel måde fra celler, der producerer dem. eller rekombinante interleukiner fremstillet ved genteknik.

30 Den primære aminosyresekvens af det native IL-Ιβ er repræsenteret ved følgende formel (B): 5 10

Ala - Pro - Val - Arg - Ser - Leu - Asn - Cys - Thr - Leu 15 20 35 Arg - Asp - Ser - Gin - Gin - Lys - Ser - Leu - Val - Met- 4 DK 172589 B1 25 30

Ser - Gly - Pro - Tyr - Glu - Leu - Lys - Ala - Leu - His- 35 40 5 Leu - Gin - Gly - Gin - Asp - Met - Glu - Gin - Gin - Val- 45 50

Val - Phe - Ser - Met - Ser - Phe - Val - Gin - Gly - Glu- 55 60

Glu - Ser - Asn - Asp - Lys - Ile - Pro - Val - Ala - Léu- 10 65 70

Gly - Leu - Lys - Glu - Lys - Asn - Leu - Tyr - Leu - Ser- 75 80

Cys - Val - Leu - Lys - Asp - Asp - Lys - Pro - Thr - Leu- / 85 90 15 Gin - Leu - Glu - Ser - Val - Asp Pro - Lys - Asn - Tyr- 95 100

Pro - Lys - Lys - Lys - Met - Glu - Lys - Arg -* Phe r Val- 105 - 110

Phe - Asn - Lys - Ile - Glu - Ile - Asn - Asn - Lys - Leu- 20 115 120

Glu - Phe - Glu - Ser - Ala - Gin - Phe - Pro - Asn - Trp- 125 130

Tyr - Ile - Ser - Thr - Ser - Gin - Ala - Glu - Asn - Met- 135 140 25 Pro - Val - Phe - Leu - Gly - Gly - Thr - Lys - Gly - Gly- 145 150

Gin - Asp - Ile - Thr - Asp - Phe - Thr - Met - Gin - Phe-

Val - Ser - Ser (3) 30 35 IL-1B-Derivaterne omfatter forskellige derivater.

5 DK 172589 B1

Typiske eksempler på sådanne IL-I8-derivater med forskellige aminosyresekvenser, er anført i ansøgerens tidligere patentpublikationer {europæiske patentpublikationer nr. 187 991, nr. 237 967 og nr. 237 073.

5 IL-18-Derivatet har fortrinsvis den modificerede aminosyre- sekvens, der opfylder mindst ét af følgende krav a) til d) i aminosyresekvensen repræsenteret ved formlen (B): a) Mindst én aminosyrerest valgt blandt Ala ved l-stillingen, Val ved 3-stillingen, Arg ved 10 4-stillingen, Ser ved 5-stillingen, Cys ved 8- stillingen, Arg ved 11-stillingen, His ved 30- stillingen, Cys ved 71-stillingen, Lys ved 93- stillingen, Lys ved 97-stillingen, Arg ved 98- stillingen, Phe ved 99-stillingen, Lys ved 103- 15 stillingen, Trp ved 120-stillingen, Tyr ved 121- stillingen og Ser ved 153-stillingen er udeladt eller erstattet med en anden aminosyrerest.

b) Aminosyresekvensen for Ala ved l-stillingen til Thr ved 9-stillingen eller mindst én aminosyre- 20 rest i denne sekvens er udeladt (bortset fra at mindst én aminosyrerest valgt blandt Ala ved l-stillingen, val ved 3-stillingen, Arg ved 4-stillingen, Ser ved 5-stillingen og Cys ved 8-stillingen er udeladt, som anført under krav 25 a)).

c) Aminosyresekvensen for Lys ved 103-stillingen til Ser ved 153-stillingen eller mindst én aminosyrerest i denne sekvens er udeladt (bortset fra at mindst én aminosyrerest valgt blandt Lys 30 ved 103-stillingen, Trp ved 120-stillingen, Tyr 6 DK 172589 B1 ved 121-stillingen og Ser ved 153-stillingen er udeladt, som anført under krav a)).

d) En aminosyrerest, eller aminosyresekvensen for Met ved 1’-stillingen til Asp ved 116'-stillin-5 gen repræsenteret ved følgende formel (B1), el ler en del af nævnte sekvens orienteret mod C-terminalen er forbundet til N-terminalen af formlen (B).

10 Formel (B1): 5' 10’

Met - Ala - Glu - Val - Pro - Glu - Leu - Ala - Ser - Glu- 15' 20' 15 Met - Met - Ala - Tyr - Tyr - Ser - Gly - Asn - Glu - Asp- 25' 30’

Asp - Leu - Phe - Phe - Glu - Ala - Asp - Gly - Pro - Lys- 35’ 40’

Gin - Met - Lys - Cys - Ser - Phe - Gin - Asp - Leu - Asp- 20 45. 50·

Leu - Cys - Pro - Leu - Asp - Gly - Gly - Ile - Gin - Leu- 7 DK 172589 B1 55' 60'

Arg - Ile - Ser - Asp - His - His - Tyc - Ser - Lys - Gly- 65' 70'

Phe - Arg - Gin - Ala - Ala - Ser - Val - Val - Val - Ala- 5 75' 80'

Met - Asp - Lys - Leu - Arg - Lys - Met - Leu - Val - Pro- 85' ' 90’

Cys - Pro - Gin - Thr - Phe - Gin - Glu - Asn - Asp - Leu- 95' 100' 10 ger - Thr - Phe - Phe - Pro - Phe - Ile - Phe - Glu - Glu- 105’ 110'

Glu - Pro - Ile - Phe - Phe - Asp - Thr - Trp - Asp - Asn- t 115’

Glu - Ala - Tyr - Val - His - Asp 15

Aminosyrer og polypeptider er heri omtalt ved forkortelser ifølge nomenklaturen eller reglerne anbefalet af IUPAC ig IUPAC-IUB, eller ved forkortelser, der konventionelt anvendes. Nucleinsyrerne i basese-20 kvenserne er udtrykt på tilsvarende måde.

Aminosyrenumrene eller -stillingerne er baseret på aminosyresekvensen med formlen (B) (IL-1β), med mindre andet er anført, også i det tilfælde, hvor der er en deletion eller tilknyt-25 ning. Nummeret med en mærkeangivelse ( ' ) repræsenterende positionen af en aminosyrerest i IL-13-derivatet, er imidlertid baseret på aminosyresekvensen med formlen (B- ) .

Den aminosyrerest, der skal forbindes til eller 30 substitueres med en særlig aminosyrerest ved en særlig position i en aminosyresekvens af lL-1-derivatet, kan være en hvilken som helst blandt α-aminosyrerester, der udgør humane proteiner. Navnlig foretrækkes neutrale aminosyrerester. Imidlertid er Cys tilbøjelig til at 35 danne en disulfid-binding intra- eller inter-molekylært med dens SH-gruppe. Af denne grund er de ønskelige 8 DK 172589 B1 aminosyrerester dem, der er forskellige fra Cys.

I tilfælde af Ιΐ-ΐβ-derivatet er eksempler på mere foretrukne aminosyrerester Gly, Lys, Gin eller Asp til erstatning af Arg ved 4-stillingen, Ser eller 5 Ala til Cys i 8-stillingen, Gin til Arg i ll-stillin-gen. Tyr til His i 30-stillingen, Ser, Ala eller Val til Cys i 71-stillingen, Leu eller Asp til Lys i 93-stillingen, Leu til Arg i 98-stillingen, Gin til Lys i 103-stillingen, Arg til Trp i 120-stillingen og Gin 10 til Tyr i 121-stillingen, samt Met, Leu, Arg eller Asp til forbinding til N-terminalen.

lL-18-derivaterne ifølge opfindelsen har blod-plade-forøgende effekt (hematogenisk effekt) og er anvendelige som medikament ved behandling af thrombocyt-15 openia. Nævnte IL-lg-derivater har også, i lighed med konventionelle IL-l-derivater, for eksempel fysiologisk aktivitet, såsom LAF-aktivitet, aktivitet i henseende til at inhibere væksten af tumorceller (GIF-aktivitet), aktivitet til at fremme produktion af forskellige cyto-20 kiner, såsom kolonistimulerende faktor (CSF), interferon (IFN), interleukin-2(TL-2) og interleukin-3 (IL-3), anti-inflammetorisk aktivitet og aktivitet til at forebygge strålingsskade, og de er følgelig anvendelige som immunosystem-stimulerende midler, for eksempel til at 25 fremme produktion af antistoffer og forøge effekten af vacciner, antitumormidler, midler til at fremme produktion af cytokiner, såsom CSF, IFN, IL-2 og IL-3, anti-inflammetoriske midler, midler til at forebygge strålingsskader og andre lignende medicinske midler.

9 DK 172589 B1

Det omhandlede IL-18-derivat kan fremstilles for eksempel ved genteknik under anvendelse af et gen, der koder for det specifikke polypeptid, dvs, ved at inkorporere genet 1 en mikroorganismevektor til tilvejebrin-5 gelse af replikation, transkription og translation inden i mikroorganismens celle og således opnå det ønskede derivat. Denne proces er fordelagtig derved, at den er egnet til masseproduktion.

Selv om det gen, der skal anvendes ved denne 10 proces, helt kan syntetiseres ved kemisk syntese af nucleinsyrer ved en sædvanlig fremgangsmåde, for eksempel ved phosphittriestermetoden (Nature, 310, 105 (1984)) eller lignende, er det hensigtsmæssigt at anvende det gen, der koder for IL-1 eller en precursor 15 derfor, ved en konventionel fremgangsmåde, der indebærer ovennævnte kemiske syntese, modificeres genet til en sekvens af nucleinsyrer, der koder for den foregående specifikke aminosyresekvens, hvorved det ønskede gen let kan fremstilles.

20 Det gen, der koder for IL-1 eller en precursor for dette, er allerede kendt (se ikke-undersøgt japansk patentansøgning nr. 174022/1987).

Ovennævnte modificerede sekvens af nucleinsyrer (baser) fremstilles også ved en kendt proces, der gen-25 nemføres svarende til aminosyresekvensen af det ønskede polypeptid (se Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory (1982)).

For eksempel kan kløvning, ligering, phosphory-lering osv. af DNA gennemføres ved sædvanlige metoder 30 omfattende behandling med enzymer, såsom restriktionsenzymer, DNA-ligase, polynucleotidkinase og DNA-polyme-rase, der er let tilgængelige handelsprodukter. Isole- 10 DK 172589 B1 ringen og rensningen af genet og nucleinsyrerne, inkluderet i disse metoder, foregår også på sædvanlig måde', for eksempel ved agarosegelelektroforese. Som delvis beskrevet nedenfor bliver det opnåede gen replikeret 5 ved anvendelse af en sædvanlig vektor. Det DNA-frag-ment, der koder for den ønskede aminosyresekvens, og syntetiske linkere kan også let fremstilles ved ovennævnte kemiske syntese. Den codon, der svarer til den ønskede aminosyre, og som skal anvendes ved ovennævnte 10 metoder, er kendt og udvælges efter ønske. En sædvanlig metode kan anvendes til dette formål, for eksempel med henblik på codonens anvendelseshyppighed hos den vært, der skal anvendes (Nucl. Acids Res., 9, 43-73 (1981)). Endvidere kan der med henblik på modifikatio-15 nen af codonen i den pågældende nucleinsyresekvens for eksempel anvendes stedspecifik mutagenese (Proc.

Natl. Acad. Sci., £1, 5662-5666 (1984)), som det er almindeligt, hvortil der gøres brug af en primer omfattende et syntetisk oligonucleotid på ca. 15-30 mer, der 20 koder for den ønskede modificerede sekvens.

Det ved ovennævnte proces opnåede ønskede gen kan undersøges for dets basesekvens, for eksempel ved den kemiske Maxam-Gilbert-modifikationsmetode (Meth.

Enzym., 65, 499-560 (1980)) eller ved dideoxynucleotid-25 kædeterminationsmetoden, der gør brug af Ml 3 Phag (Messing, J. og Vieira, J., Gene, 1J9, 269-276 (1962 )).

Ovennævnte fremgangsmåde og metoder for denne vil blive beskrevet i nedenstående eksempler, men fremgangsmåden er ikke specifikt begrænset, og enhver på 30 området allerede kendt fremgangsmåde kan anvendes.

Det ønskede gen, der koder for et polypeptid med ovennævnte specificerede aminosyresekvens tilvejebringes hervéd. (Genet vil i det følgende blive omtalt som det "foreliggende gen").

35 Polypeptidet ifølge opfindelsen kan fremstilles ved sædvanlige kendte genrekombinationsteknikker under DK 172589 B1 1 i anvendelse af det foreliggende gen. Nærmere angivet fremstilles det ved at fremstille et rekombinant DNA', der kan eksprimere det foreliggende gen i værtsceller, transformere DNA’et ind i værtcellen og inkubere trans-5 formanten.

Anvendelige værtceller kan være enten eucaryoti-ske eller procaryotiske celler. De eucaryotiske celler omfatter celler fra hvirveldyr, gærarter osv. Almindeligt anvendt som celler fra hvirveldyr er for eksempel 10 COS-celler, der er celler fra aber (Y. Gluzman, Cell., 23, 175-182 (1981)), dihydrofolatreduktase-defekt stamme af kinesisk-hamster-ovariecelle (G. Urlaub og L.A.

Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 7J.· 4216-4220 (1980)), osv., men anvendelige celler er ikke begrænset 15 til nævnte celler. Anvendelige ekspressionsvektorer til hvirveldyrceller er dem, der har en promotor beliggende opstrøms fra det gen, der skal eksprimeres, RNA-kløvningssteder, polyadenyleringssted, transkrip-tionssekvens, osv. Disse vektorer kan yderligere have 20 et replikations-origin, om krævet. Eksempler på anvendelige ekspressionsvektorer omfatter pSV2dhfr med en oprindelig promotor fra SV40 (S. Subramani, R. Mulligan og P. Berg, Mol. Cell. Biol., 1(9), 854-864 (1981), der ikke er begrænsende.

25 Gærarter finder vid anvendelse som eucaryotiske mikroorganismer, og blandt disse er gærarter af slægten Saccharomyces almindeligvis anvendelige. Eksempler på populære ekspressionsvektorer for gærarter og lignende eucaryotiske mikroorganismer omfatter pAM82 med en pro-30 motor for syrephosphatasegen (A. Miyanohara et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80, 1-5 (1983)), osv.

E. coli og Bacillus subtilis er almindeligt anvendt som procaryotiske værter. Den foreliggende opfindelse anvender for eksempel plasmidvektorer, der har 35 evnen til repllkation i værten. Til at eksprimere genet i vektoren kan der anvendes ekspressionsplasmider, 12 DK 172589 B1 der har en promotor og SD(Shine-Dalgarno)-basesekvens opstrøms fra genet og ATG krævet til initiering af proteinsyntese. Meget anvendt som E. coli-vært er E. coli K12-stamme, osv. Som vektor anvendes almindeligvis 5 pBR322. Disse er imidlertid ikke begrænsende, og der kan anvendes forskellige kendte stammer og vektorer.

Eksempler på anvendelige promotorer er tryptophan-pro-motor, PL-promotor, lac-promotor, lpp-promotor, osv.

Genet kan eksprimeres ved anvendelse af enhver af disse 10 promotorer.

Til beskrivelse af processen med henvisning til det tilfælde, hvor der anvendes tryptophan-promotor, anvendes som ekspressionsvektor vektor pTMi (Fumio Imamoto, Taisha, Vol. 22, 289 (1985)) med tryptophan- 15 promotor og SD-sekvens. Et gen, der koder for et ønsket polypeptid og har ATG, om krævet, forbindes til stedet for restriktionsenzym Clal, hvilket sted findes nedstrøms fra SD-sekvensen. Undertiden kan der ikke blot anvendes det direkte ekspressionssystem, men også 20 et fusionsproteinekspressionssystem, der anvender for eksempel β-galactosidase, β-lactamase eller lignende.

Den således opnåede ekspressionsvektor indføres i værtsceller og transformeres derved ved sædvanlige metoder. For eksempel indsamles celler hovedsageligt i 25 den logaritmiske vækstfase, behandles med CaCl2 og bringes derved til let at acceptere DNA, hvorefter vektoren indføres i cellen. ved denne metode kan MgCl2 eller RbCl bringes til stede samtidigt med vektoren, således at der opnås en forbedret transformationseffek-30 tivitet, som det er almindeligt kendt. Cellen kan omdannes til sfæroplast eller protoplast forud for transformation.

Den således opnåede ønskede transformant kan inkuberes på sædvanlig måde, hvorved det ønskede polypep-35 tid produceres og akkumuleres. Inkubationsmediet kan være ethvert af de medier, der er almindeligt anvendt 1 3 DK 172589 B1 til at inkubere celler, såsom L-medium, E-medium, M9-medium, osv. Forskellige carbonkilder, nitrogenkilder, uorganiske salte, vitaminer, osv., der er almindeligt kendt, kan blandes med disse medier. Når der an-5 vendes tryptophan-promotoren, kan der for eksempel anvendes M9-minimummedium, hvori der er blandet casamino-syre til at bevirke promotorens aktion. Et kemikalium, såsom indolacrylsyre, til fremme af tryptophan-promoto-rens aktion, kan sættes til mediet på et egnet inkuba-10 tionstrin.

Det ønskede polypeptid kan isoleres fra den resulterende kultur indeholdende et aktivt stof og renses ved sædvanlige metoder. Det er ønskeligt at ekstrahere polypeptidet fra værten under milde betingelser, såsom 15 ved osmotisk chok, således at der for polypeptidet opretholdes strukturen af højere orden.

Ovennævnte isolerings- og rensningsmetode gennemføres hovedsageligt ved forskellige processer, der gør brug af de fysiske og kemiske egenskaber hos det 20 ønskede polypeptid. (Se for eksempel "Biological Data Book II", side 1175-1259, 1. udgave, 1. tryk, 23. juni 1980, udgivet af Kabushiki Kaisha Tokyo Kagakudojin).

Eksempler på anvendelige processer er behandling ved anvendelse af et sædvanligt proteinfældningsmiddel, ul-25 trafiltrering, molekularsigte-chromatografi (gelfiltrering), væskechromatografi, centrifugering, elektrofore-se, affinitets-chromatografi, dialyse og kombinationer af sådanne processer.

Ovennævnte proces kan for eksempel gennemføres 30 ved følgende fremgangsmåde. Det ønskede polypeptid fraskilles fra supernatanten i delvis renset tilstand.

Denne partielle rensning gennemføres for eksempel ved en behanding, der som proteinfældningsmiddel anvender et organisk opløsningsmiddel, såsom acetone, methanol, 35 ethanol, propanol eller dimethylformamid (DMF), eller en syre, såsom eddikesyre, perchlorsyre (PCA) eller 14 DK 172589 B1 trichloreddikesyre (TCA), en behandling, der gør brug af et udsaltningsmiddel, såsom ammoniumsulfat, natriumsulfat eller natriumphosphat, og/eller ultrafiltering under anvendelse af en dialysemembran, flad membran, 5 hulfibermembran eller lignende. Disse behandlinger gennemføres på samme måde som almindeligt under sædvanlige betingelser.

Det herved opnåede groft rensede produkt underkastes derefter gelfiltrering, hvorved der indsamles en 10 fraktion, der udviser aktiviteten af det ønskede stof. Anvendelige gelfiltreringsmidler er ikke specifikt begrænsede. Sådanne midler omfatter dem, der er lavet af dextrangel, polyacrylamidgel, agarosegel, polyacryl-amid-agarosegel, cellulose eller lignende. Eksempler 15 på anvendelige midler, der er kommercielt tilgængelige, er Sephadex G-type, Sephadex LH-type, Sepharose-type, Sephacryl-type (alle produkter fra Pharmacia), Cellofine (Chisso Corporation), Biogel P-type, Biogel A-type (begge produkt fra Bio-Rad Lab.), Ultro gel (LKB), 20 TSK-G-type (produkt fra Tosch Corporation), osv.

Det ovenfor specificerede polypeptid, dvs. iL-la-derivat, kan isoleres fra fraktionen som et homogent stof, for eksempel ved at underkaste den ved gelfiltrering opnåede aktive fraktion affinitetschromato-25 grafi under anvendelse af en hydroxyapatit-søjle, ionby ttersøj lechromatograf i , såsom ved DEAE-, CM- eller SP-metoden, chromatofokuseringsmetode, reversfase-HPLC eller lignende, eller en kombination af sådanne metoder .

30 Det foreliggende medikament til behandling af thrombocytopenia kræver tilstedeværelse af IL-Ιβ eller et derivat deraf som aktiv komponent og kan yderligere indeholde farmaceutiske bestanddele, der anvendes i sædvanlige medikamenter. Farmaceutiske præpa-35 rater kan fremstilles på sædvanlig måde ved at blande den aktive komponent med andre komponetner og konven- 15 DK 172589 B1 tionelle farmaceutiske excipienser, som ønsket, og kan foreligge i en hvilken som helst af forskellige dosisformer svarende til det tilsigtede behandlingsformål.

Navnlig med henblik på stabilisering af den ak-5 tive IL-13-forbindelse foretrækkes som andre komponenter til anvendelse sammen med det aktive stof for eksempel albuminer, såsom humant serumalbumin (HSA), sædvanligvis L-aminosyrer, såsom cystein og glycin, osv.

Mængden af en sådan komponent, der skal anvendes, er 10 ikke specifikt begrænset, men ligger sædvanligvis på ca. 0,01 til ca. 10 mg pr. mikrogram af den aktive IL-l-forbindelse i tilfælde af albumin, og ca. 0,001 til ca. 10 mg pr. 1 yg af den aktive forbindelse i tilfælde af aminosyre (beregnet som den totale mængde ami-15 nosyrer i tilfælde, hvor der anvendes mindst 2 aminosyrer). Om krævet, kan det farmaceutiske præparat indeholde for eksempel sukkerarter omfattende monosacchari-der, såsom glucose, mannose, galactose og fructose, sukkeralkoholer, såsom mannitol, inositol og xylitol, 20 disaccharider, såsom sucrose, maltose og lactose, po-lysaccharider, såsom dextran og hydroxypropylstivelse (af de ovennævnte sukkerarter foretrækkes sucrose, maltose, mannitol, inositol, dextran osv.), ioniske eller ikke-ioniske overfladeaktive midler, såsom overfladeak-25 tive midler af polyoxyethylenglycol-sorbitanalkylester-type, polyoxyethylenalkylether-type, sorbitanmonoacyl-ester-type og fedtsyreglycerid-type. Sukkerarterne som sådanne iblandes sædvanligvis i en mængde på mindst ca.

0,1 mg, fortrinsvis ca. 1 til ca. 100 mg, pr. yg af den 30 aktive IL-lS-forbindelse. Det overfladeaktive middel iblandes sædvanligvis i en mængde på mindst ca. 0,0001 mg, fortrinsvis ca. 0,001 til ca. 0,1 mg, pr. yg af den aktive IL-1Ø-forbindelse.

Medicinske præparater smmensættes sædvanligvis i 35 form af farmaceutiske kompositioner indeholdende en farmakologisk effektiv mængde af IL-1β-derivatet (dvs.

16 DK 172589 B1 IL-β og dets derivater) og, om krævet, en pas sende bærer. Eksempler på anvendelige farmaceutiske bærere omfatter fortyndingsmidler og excipienser, såsom fyldstoffer, strækmidler, bindemidler, befugtningsmid-5 ler og desintegrationsmidler, der almindeligvis anvendes til fremstilling af farmaceutiske produkter af den ønskede form. Formen af de farmaceutiske kompositioner er ikke specifikt begrænset, blot kompositionerne effektivt indeholder den foreliggende aktive IL-1β-forbin-10 delse som den aktive komponent, men former kan være for eksempel tabletter, pulvere, granuler, piller eller lignende faste præparater. Det er imidlertid sædvanligvis egnet, at kompositionen foreligger i form af en opløsning, suspension, emulsion eller lignende til in-15 jektion. Alternativt kan en sådan komposition være et tørt produkt, der kan bringes i væskeform ved tilsætning af en passende bærer forud for anvendelse. De farmaceutiske kompositioner omtalt ovenfor kan fremstilles ved sædvanlige metoder.

20 Puffere anvendes også som bærere. Pufferne er ikke specifikt begrænsede og omfatter fortrinsvis ci-tronsyre-natriumphosphat, citronsyre-natriumcitrat, eddikesyre-natriumacetat, natriumhydrophosphat-natrium-dihydrophosphat, citronsyre-borax og lignende puffere 25 med pH 4-8, fortrinsvis 5-6.

Svarende til formen af den opnåede farmaceutiske komposition anvendes kompositionen ad en passende vej . Eksempelvis anvendes kompositionerne til injektion intravenøst, intramuskulært, subcutant, intracutant, in-30 traperitonealt eller på anden måde. Den faste komposition gives oralt eller intrasectalt. Mængden af den aktive komponent i kompositionen og dosen af kompositionen bestemmes passende svarende til anvendelsesmåde og -form, anvendelsesformål, patientens symptomer, osv.

35 og kan ikke fastlægges definitivt. Det er i almindelighed ønskeligt at inkorporere ca. 0,00001 til ca. 80 17 DK 172589 B1 vægt% af den aktive komponent i det farmaceutiske præparat og at give præparatet i en daglig dosis på ca.

0,01 yg til ca. 10 mg, beregnet som den aktive komponent, til voksne. Præparaterne behøver ikke altid kun 5 at anvendes én gang dagligt, men kan gives i tre til fire subdoser dagligt.

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende fremstillingseksempler og eksempler.

I disse eksempler er den fysiologiske aktivitet 10 bestemt ved følgende metode.

(1) Bestemmelse af lL-1-aktivltet

Udtrykt som LAF-aktivitet målt ved metoden iføl-15 ge J.J. Oppenheim et al., (J. Immunol., 116, 1466 (1976)) ved anvendelse af thymusceller fra en mus af C3H/HeJ-stammen.

(2) Bestemmelse af GIF-aktivitet 20

Portioner (0,1 ml) af testopløsningen fortyndet til varierende koncentrationer blev anbragt i rummene af en 96-rums mikroplade (Corning Co. ,

Ltd.), 0,1 ml Eagle's MEM-suspension indeholden-25 de 10% FCS omfattende humane melanomaceller A375 i en mængde på 2 x 104 celler/ml blev derefter anbragt i hvert rum, og cellerne blev inkuberet i en C02-inkubator (Napco Co., Ltd.) i fire dage. Efter inkubationen blev der i hvert rum an-30 bragt 0,05 ml af 0,05% Neutral Red (Wako Junyaku

Co., Ltd.) efterfulgt af inkubation ved 37°C i to timer. Efter fjernelse af supernatanten blev der forsigtigt i hvert rum hældt 0,3 ml phos-phatpuffer-saltopløsning med henblik på vask.

35 Efter fjernelse af vaskevæsken blev der i hvert rum anbragt 0,1 ml blanding af natriumdihydro- 18 DK 172589 B1 phosphat og ethanol i lige mængder, pladen blev rystet i flere minutter med en mikroblander, og mængden af pigment, der var optaget i cellen, blev målt ved 540 mp ved anvendelse af et foto-5 meter til 96-rums mikrotitreringsplader (Titer check multiscane. Flow Lab.) for at bestemme vækstinhibitionsaktiviteten. GIF-Aktivitetsen heden blev sat til den reciproke værdi af antallet af fortyndingsgange, når testgruppen udviste 10 50% af kontrolgruppens cellevækst-inhibition, dvs. testgruppen udviste 1/2 af absorptionsevnen målt for kontrolgruppen. Kår for eksempel GIF-aktiviteten er på 10 enheder, har følgelig testopløsningen, selv ved ti-fold fortynding, stadig 15 aktivitet til at inhibere cellevækst 50%.

I eksemplerne henvises til tegningerne, på hvilke:

Fig. 1 viser resultaterne opnået ved at te ste forskellige IL-l-produkters effekt i henseende til 20 at inhibere pyretogenesis.

1 9 DK 172589 B1

Fremstillingseksemoel 1 (sammenligningseksemoel)

Fremstilling af iL-la-derivat (16G.36D.141S) (1) Fremstilling af plasmid til ekspression af IL-la- derivat^_________ 5

Plasmid ptrp IL-la-l41S anvendt i dette eksempel blev fremstillet på samme måde som beskrevet i europæisk patentpublikation nr. 237 073, ved stedspecifik mu-tagenesemetode (Proc. Natl. Acad. Sci., 81^, 5662-5666 10 (1984)), idet der anvendtes plasmid ptrp IL-la-113 op nået fra pTMl (Fumio Imamoto, Taisha 22, 289 (1985)) og plasmid pcD-GIF-207 (båret af E.coli x1776/pcD-GIF-207 (FERM BP-1294)), der har cDNA, som koder for et IL-la-precursorprotein. Plasmid ptrp IL-la-l41S bærer et 15 gen, der koder for et IL-la-derivat, som har aminosyre-sekvensen med formlen (A), hvor Cys ved 141-stillingen er erstattet med Ser.

Clal/BamHI DNA-fragment (527 bp) blev isoleret fra plasmid ptrp lL-la-141S og ligeret med stort Clal/ 20 BamHI-fragment af vektor fl.IL.lf3 IppT for IL-Ιβ sted- specifik-mutagenese (Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 1106-1114 (1988)), hvorved der blev opnået fl.Il-la-l41S. Hjælper-phag M13K07 (Takara Shuzo Co. Ltd.) blev inficeret med ovennævnte produkt til opnåelse af 25 enkeltstrenget (ss) DNA, der derefter anvendtes som en mutagenese-template.

Ved som primer at anvende et syntetisk oligonu-cleotid [5'-ACTTTATGGGGATCATCA-3'] 5’-phosphoryleret med T4 polynucleotid-kinase gennemførtes stedspecifik 30 mutagenese ved oligonucleotid-styret in vitro-mutagene-se (Amersham UK, code RPN. 2322).

Et ss-DNA blev opnået ud fra klonen, der var transformeret ind i E. coli MV1304 (Takara Shuzo Co.

Ltd.), og underkastet DNA-sekvensbestemmelse ved deoxy-35 kædetermination, hvorved der blev opnået rekombinant (transformant) fl.IL-la-16G.141S/E.coli MV1304.

20 DK 172589 B1

Dette plasmid er ekspressionsplasmidet for poly-peptid med formlen (a), hvor Arg ved 16-stillingen var erstattet med Gly, X ved 36-stillingen var Asn, og Y ved 141-stillingen var Ser.

5 Transformanten er deponeret under navnet

Escherichia coli MVi304/fl.Il-la .16G.141S og løbenummer FERM BP-2434 hos Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology.

10 (2) Inkubation af transformant.

Den under (1) opnåede transformant, dvs. E. coli MVI304/fl.IL-Ia-I6G.141S blev inkuberet natten over ved 0 37 C med rystning i 600 ml LB-medium (med følgende sam-15 mensætning) indeholdende 100 yg/ml af ampicillin til opnåelse af en præ-dyrkningsopløsning.

Sammensætning af LB-medium: 20 Bacto-trypton (produkt fra Difco) 10 g/1

Bacto-gærekstrakt (ibid.) 5 g/1

NaCl (Wako Fure Chemical Inc. Ltd.) ίο g/1.

En portion på 600 ml af præ-dyrkningsopløsningen 25 blev inokuleret i 30 liter af et produktionsmedium med nedenstående sammensætning og inkuberet ved 36,5°C i 14 timer i et 50 liters forgæringskar (produkt fra Hitachi Ltd.) med rysteluftning på 0,5 vvm ved 120 rpm.

21 DK 172589 B1

Sammensætning af produktionbsmedium:

Na2HP04,12H20 6 g/1 KH2P04 3 g/1 5 NaCl 0,5 g/1 NH4C1 1 g/1

Bacto-casaminosyre 10 g/1

Bacto-gærekstrakt 0,5 g/1 L-cystein, HCl 75 mg/1 iO L-prolin 75 mg/1 L-leucin 75 mg/1.

(Mediet blev indstillet på pH 7,4 med 4N NaOH

efterfulgt af behandling i en autoklav ved 121°C i 30 15 minutter eller ved behandling med damp-opvarmning ved 0 123 C i 20 minutter. Den steriliserede oplosning med nedenstående sammensætning blev aseptisk sat til mediet efter inokulering.

20

Sammensætning af steriliseret oplosning: 1M MgS04,4H20 2 ml/1 1M CaCl2,2H20 0,1 ml/1 25 7,5 mg/1 Thiamin,HCl 1 ml/1 40% Glucose 18,75 ml/1).

Efter inkubation blev suspensionen af E.coli i 300 ml 1M Na2HP04 henstillet natten over i køleskab og 30 dialyseret mod 10 mM tris HCl-puffer (pH 8,0) i to dage i samme køleskab. Dialysatet blev centrifugeret ved 16000 xg for at skille en supernatant fra et bundfald.

22 DK 172589 B1 ( 3) Rensning af iL-la-derlvat.

Celleekstrakt-supernatanten fremstillet som ovenfor under (2) blev indstillet på pH 3 med 2 M eddi-5 kesyre og renset ved anvendelse af SP-HPLC {TSK Gel SP-5PW-søjle, 5,5 cm i diameter og 20 cm i længde, produkt fra Tosoh Corporation) under følgende betingelser.

Søjle: TSK Gel SP-5PW (5,5 x 20 cm, 10 Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 50 mM natriumacetat (pH 4,5)

Elueringsmiddel B: 50 mM natriumacetat (pH 5,5)

Strømningshastighed: 30 ml/min.

15 Koncentrationsgradident: Tid (min) % B

0 0 30 0 130 100 160 100 20 165 0 195 0

Ovenstående proces resulterede i en GlF-aktiv fraktion med en retentionstid på 114 til 131 minutter.

25 Den opnåede aktive fraktion blev underkastet SP-HPLC igen under de samme betingelser som ovenfor beskrevet, hvorved der blev opnået en GIF-aktiv fraktion.

Den indsamlede aktive fraktion blev renset ved ionbytterchromatografi (DEAE-HPLC) under følgende be-30 tingelser: 23 DK 172589 B1 Søjle: TSK Gel DEAE-5PW (5,5 x 20 cm,

Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 20 mM Tris HCl-puffer (pH 8,0)

Elueringsmiddel B: 20 mM Tris HCl-puffer (pH 8,0) + 5 0,5M Nacl

Strømningshastighed: 30 ml/min

Koncentrationsgradient: Tid (min) % B

0 0 10 30 0 150 60 155 100 185 100 190 0 15

Ovenstående fremgangsmåde resulterede i en GIF-aktiv fraktion med en retentionstid på 98,8 til 102,8 minutter.

Den indsamlede aktive fraktion blev derefter un-20 derkastet ultrafiltrering (YM-5 membran, produkt fra

Amikon), hvorved der blev fremstillet et koncentreret produkt med et isoelektrisk punkt (PI) på 5,0. Under ovennævnte ultrafiltrering blev portioner af pufferen udskiftet, således at pufferen til slut havde samme 25 sammensætning som 20 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,0).

(4) Identifikation af Il-la-derivat

Aminosyresammensætning 30

Det koncentrerede produkt (30 μΐ), opnået under (3), blev forsigtigt anbragt i bunden af et hårdt tyk-vægget testrør, 6 mm x 50 mm, og testrøret blev anbragt i en lille reaktionsbeholder og tørret i et vakuum med 35 Pico Tag Work Station (produkt fra Warters). En portion på 200 μΐ 6N HCl (indeholdende 1% phenol) blev an- 24 DK 172589 B1 bragt i testrøret inden i beholderen. Det indre af beholderen blev forsigtigt afluftet og derefter forseglet 0 for at tilvejebringe hydrolyse ved 130 C over en periode på fire timer.

5 Efter åbning af røret blev 400 μΐ 0,02 N saltsy re sat til hydrolysatet, og den resulterende blanding anvendtes som en prøveopløsning til aminosyreanalyse.

En portion af prøveopløsningen på 250 μΐ anvendtes til aminosyreanalyse ved hjælp af en aminosyreana-10 lysator (Model HITACHI 835, produkt fra Hitachi Ltd.).

De adskilte aminosyrer blev påvist ved o-phthalaldehyd-metoden og bestemt kvalitativt ved reference til kalibreringskurver frembragt ved anvendelse af autentiske aminosyrer.

15 Tabel I viser resultaterne udtrykt i molforhold for indgående aminosyrer baseret på Phe (10 mol). Under ovennævnte analysebetingelser er Pro, Cys og Trp ikke bestemmelige.

25 DK 172589 B1

TABEL I

Aminosyre____Molforhold 5 Asp og/eller Asn 21,1

Thr 11,2

Ser 11,5

Glu og/eller Gin 18,3

Gly 8,8 10 Ala 14,3

Val 6,8

Met 2,0

Ile 10,4

Leu 15,2 15 Tyr 6,7

Phe (10)

Lys 11,1

His 3,2

Arg 2,7 20

Aminosyresekvens

En portion på 50 μΐ (298 pmol) af det koncentrerede produkt opnået under (3) blev analyseret med en 25 protein-sekvensbestemmer, Model 470A (Applied Biosystems Inc.)· Hver resulterende PTH-aminosyre blev passende fortyndet med 100 til 500 pi 33% vandig aceto-nitrilopløsning, og en 5 pi's portion af fortyndingen blev injiceret i en chromatografisk søjle med et auto-30 prøveorgan, Waters 710B. For det chromatografiske system fungerede to pumper, Beckman Model 112, ved hjælp af en kontrolanordning. Model 421. Den anvendte søjle, der målte 2 mm x 250 mm og var pakket med ultrasphere ODS-5 pm, holdtes ved 55°C ved hjælp af en søjleopvar-35 mer. Strømningshastigheden var 0,3 ml/minut. En blanding af 20 mM natriumacetat og acetonitril anvendtes 26 DK 172589 B1 til gradienteluering. Absorptionsevnen fulgtes ved 269 nm. Analyse gennemførtes i 45 minutter.

Analyseresultaterne viste, at det ved fremgangsmåden (3) opnåede koncentrerede produkt havde folgende 5 sekvens af 36 aminosyrer ved N-terminalen.

Ser-Ala-Pro-Phe-Ser-Phe-Leu-Ser-Asn-Val-

Lys-Tyr-Asn-Phe-Met-Gly-Ile-Ile-Lys-Tyr-' 10 Glu-Phe-Ile-Leu-Asn-Asp-Ala-Leu-Asn-Gln-

Ser-Ile-Ile-Arg-Ala-Asp 15 Ovenstående resultat bekræfter, at det opnåede rensede produkt er et polypeptid med formlen (a) (IL-la), der er modificeret ved, at Arg ved 16-stillin-gen er erstattet med Gly.

Selvom aminosyren i 36-stillingen var Asn i ge-20 net, var den Asp i det rensede produkt. Dette lader formode, at det derivat, hvori aminosyren i 36-stillingen er Asp, er et stabilt derivat, som observeret i na-tivt IL-la, og at den samme mutagenese forekommer i dette IL-la-derivat som i nativt IL-la.. — 25

Fremstillingseksempel 2 (sammenligninqseksempel)

Fremstilling af IL-la-derivat (Δ(1-14).36D.141S).

(1) Fremstilling af plasmid til ekspression af IL-30 _la-derivat_

Ved anvendelse af plasmid ptrp IL-la.36D.141S (europæisk patentpublikation nr. 237 073, båret af Escherichia coli HB101/IL-la-36D.141S (FERM BP-1295)) 35 blev processen gennemfort véd den stedspecifikke muta-genesemetode.

27 DK 172589 B1

ClAl/BamHI DNA-fragment (527 bp) blev isoleret fra plasmid ptrp IL-la-36D.141S og ligeret med samme store ClAI-BamHI-fragment af vektor fl.lL-13 lppT som i fremstillingseksempel l, hvorved der blev opnået 5 fl.IL-la-36D.14IS. Med det opnåede produkt blev hjæl-per-phag M13K07 (Takara Shuzo Co. Ltd.) inficeret, hvorved der blev opnået enkeltstrenget (ss) dna, der derefter anvendtes som en mutagenese-template.

Ved som primer at anvende et syntetisk oligonu-10 cleotid [51-AAGGGTATCGATTATGATGAGGATCATC-3'] gennemførtes sted-specifik mutagenese ved oligonucleotid-styret in vitro-mutagenese på samme måde som i fremstillings-eksempel l.

Et ss DNA opnået ud fra klonen, der var trans-15 formeret ind i E.coli MV1184 (Takara Shuzo Co., Ltd.) blev underkastet DNA-sekvensbestemmelse ved dideoxykæ-determination, hvorved der blev opnået rekombinant (transforment) fl.IL-la-A(l-14).36D.141S/E. coli MV1184.

20 Dette plasmid er ekspressionsplasmidet for poly- peptid med formlen (a), der er modificeret ved, at sekvensen af aminosyrer fra l- til 14- stillingen er udeladt, X i 36-stillingen er Asp, og Y i 141-stillingen er Ser.

25 Transformanten er deponeret under navnet

Escherichia coli MVH84/fl. IL-la.Δ (1-14 ) 36D. 14is og løbenummer FERM BP-2433 hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.

Ekspression og rensning af det ønskede iL-la-de-30 rivat foregik i det væsentlige på samme måde som i Fremstillingseksempel 1.

Det ønskede derivat (IL-la-A(l-l4).36D. 141S) blev herved opnået.

Den specifikke aktivitet var 1,0 x 106 GlF-en-35 heder/mg protein.

28 DK 172589 B1 (2) identifikation af IL-la-derivat

Aminosyresammensaetninq IL-la-Derivatet opnået under (i) blev underka-5 stet aminosyreanalyse på samme måde som i fremstillingseksempel 1.

Tabel II viser resultaterne udtrykt som molforhold for indgående aminosyrer baseret på Phe (9 mol).

10 TABEL II

Aminosyre_Molforhold

Asp 19,0 15 Thr 11,0

Ser 7,1

Glu 16,3

Gly 5,3

Ala 13,2 20 Val 5,8

Met 4,0

Ile 10,3

Leu 13,8

Tyr 5,7 25 Phe (7)

Lys 10,0

His 3,2

Aminosyresekvens 30

Aminosyresekvensen ved N-terminalen af IL-la-de-rivatet opnået under (1) blev analyseret på samme måde som i Fremstillingseksempel 1.

Resultatet viste følgende sekvens på 15 aminosy-35 rer ved N-terminalen.

29 DK 172589 B1

Met-Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-

Leu-Asn-Asp-Ala-Leu

Ovenstående resultat bekræfter, at det opnåede 5 derivat har en sekvens som IL-Ια med formlen (a), der er modificeret ved, at aminosyresekvensen fra 1- til 14-stillingen er udeladt.

30 DK 172589 B1

Fremstillingseksempel 3 (sammenligningseksemoel)

Fremstilling af iL-la-derivat (Δ(1—15)).

(1) Fremstilling af plasmid til ekspression af 5 IL-la-derivat.___

Vektor fl.IL-Ιβ lppT til IL-10 stedspecifik-mu-tagenese (Biochem. Biophys. Res. Commun., 150. 1106 - 1114 (1988)) anvendtes i dette eksempel. Først blev 10 denne vektor digereret med EcoRI, behandlet med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og underkastet selv-ligering, hvorved der blev opnået f1.IL-10 lppTARI, hvori EcoRI-sted var udeladt. Af dette plasmid blev stort Hpal/BamHI-fragment udskåret.

15 Lille EcoRI/BamHI DNA-fragment blev udskåret fra plasmid ptrp IL-la-113 (europæisk patentpublikation nr.

237 073) og ligeret med ovennævnte store Hpal/BamHl-fragment ved anvendelse af en syntetisk linker (5'AACT AGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTTAATATTATGAGAATCATCAAATACG-31 20 og 51-AATTCGTATTTGATGATTCTCATAATATTAAACCTCCTTACGTGAACTT GCGTACTAGTT-3'), hvorved der blev opnået den ønskede rekombinant (transformant) fl.iL-iaA(l-l5)/E.coli MV1184.

Dette plasmid er et ekspressionsplasmid for det 25 foreliggende IL-la-derivat med en aminosyresekvens med formlen (a), hvori aminosyresekvensen fra 1- til 15-stillingen er udeladt, X i 36-stillingen er Asn, og Y i 141-stillingen er Cys.

30 (2) Fremstilling af Il-la-derlvat ved anvendelse af det ovenfor opnåede plasmid blev ekspression og rensning af det ønskede Il-la-deri-vat gennemført i det væsentlige på samme måde som i 35 Fremstillingseksempel l.

E. coli HB101 med plasmid fl.IL-la.A(l-15) blev 31 DK 172589 B1

dyrket under de samme betingelser som i Fremstillingseksempel l. Cellerne blev indhøstet ved centrifugering ved 16000 xg og suspenderet i 1M phosphatpuf fer (pH

6.0) . Suspensionen blev henstillet natten over i et 5 koldt rum og dialyseret mod 0,01 M phosphatpuf fer (pH

6.0) i to dage. Dialysatet blev centrifugeret ved 16000 xg for at adskille en supernatant og et bundfald.

Det resulterende bundfald blev to gange underkastet samme operation som beskrevet ovenfor. De to op-10 nåede supernatanter blev sammenblandet, og blandingen blev underkastet rensning på følgende måde.

(3) Rensning af Il-la-derivat 15 Supernatanten fremstillet ovenfor under (2) blev renset ved anvendelse af DEAE-HPLC (TSK Gel DEAE-5PW-søjle, 5,5 cm i diameter og 20 cm i længde, produkt fra Tosoh Corporation) under følgende betingelser.

20 søjle: TSK Gel DEAE-5PW (5,5 X 20 cm,

Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 20 mM Tris HCl (pH 8,0)

Elueringsmiddel B: 20 mM Tris HCl (pH 8,0) inde holdende 0,5M NaCl 25 Strømningshastighed: 30 ml/min.

Koncentrationsgradient: Tid (min) %B

0 0 30 0 150 60 30 155 100 185 100 190 0

Fraktionen med en retentionstid på 88 til 93 mi-35 nutter (fraktion A) og fraktionen med en retentionstid på 99 til 103 minutter (fraktion B) blev opsamlet og 32 DK 172589 B1 derefter underkastet ultrafiltrering (YM-5 membran, produkt fra Amikon) med henblik på koncentrering. Koncentratet blev renset ved gelfiltrerings-HPLC {TSK Gel G-2000 SWG-søjle, 21,5 x 600 mm, Tosoh Corporation, 5 elueringsmiddel: PBS-).

Fraktion A, renset som ovenfor, blev indstillet på pH 4,0 med 2 M eddikesyre og underkastet SP-HPLC (TSK Gel SP-5PW-søjle, 21,5 x 150 mm, Tosoh Corporation) under følgende betingelser.

10 Søjle: TSK Gel SP-5PW (21,5 x 150 cm,

Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 50mM natriumacetat (pH 5,0)

Elueringsmiddel B: 50mM natriumacetat (pH 5,0) indeholdende 0.5M NaCl 15 Strømningshastighed: 3 ml/min.

Koncentrationsgradient: Tid (min) %B

0 0 20 0 110 45 20 115 100 130 100 135 0

Fraktionen med en retentionstid på 87 til 93 mi-25 nutter blev indsamlet og derefter koncentreret ved ultrafiltrering (YM-5 membran, produkt fra Amikon).

Under ultrafiltreringen blev pufferen udskiftet i begrænsede mængder, således at der til slut forelå den samme sammensætning som af 20 mM natriumphosphat-kon-30 centrat (pH 6,0).

33 DK 172589 B1 (4) Identifikatioln af IL-la-derivat (Fraktion A)

Amlnosyresammensaetninq 5

Det rensede koncentrat opnået under (3) blev underkastet aminosyreanalyse på samme måde som i Fremstillingseksempel l.

Tabel III viser resultaterne udtrykt i molfor-10 hold af indegående aminosyrer baseret på Phe (7 mol).

TABEL III

Aminosyre_Molforhold 15

Asp 18,0

Thr 11,2

Ser 6,8

Glu 17,1 20 Gly 5,8

Ala 13,1

Val 5,7

Met 2,8

Ile 10,9 25 Leu 14,1

Tyr 5,9

Phe (7)

Lys 10,2

HiS 3,0 30 Arg 3,1

Amlnosyresekvens

Aminosyresekvensen ved N-terminalen af IL-la-de-35 rivatet fremstillet under (3) blev analyseret på samme måde som i Fremstillingseksempel i.

34 DK 172589 B1

Analyseresultaterne viste følgende sekvens for 23 aminosyrer ved N-terminalen.

Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-5 Asn-Asp-Ala-Leu-Asn-Gln-Ser-Ile-Ile-Arg-

Ala-Asn-Asp

Ovenstående resultat bekræfter, at det opnåede derivat har en sekvens med formlen (a) (IL-la), hvori 10 aminosyresekvensen fra 1- til 15-stillingen er udeladt, og X er Asn.

(Fraktion B) 15 Aminosyresammensaetninq

Det rensede produkt blev fremstillet og underkastet aminosyreanalyse på samme måde, som beskrevet for Fraktion A.

20 Tabel IV viser resultaterne udtrykt i molforhold af indgående aminosyrer baseret på Phe (7 mol).

DK 172589 B1 35

TABEL IV

Aminosyre___Molforhold 5 Asp 18,3

Thr 11/3

Ser 6/7

Glu 17,2

Gly 5,7 10 Ala 13,2

Val 5,8

Met 2,9

Ile 10,9

Leu 14,1 15 Tyr 5,9

Phe (7)

Lys 9,9

His 3,0

Arg 3,1 20

Amlnosvresekvens

Aminosyresekvensen ved N-terminalen af det rensede produkt fra fraktion 3 blev analyseret på" samme 25 måde som i Fremstillingseksempel 1. Sekvensen af 23 aminosyrer ved N-terminalen var følgende.

Ket-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-

Asn-Asp-Ala-Leu-Asn-Gln-Ser-Ile-Ile-Arg- 30 Ala-Asp-Asp-

Resultatet bekrsfter, at det opnåede derivat har sekvensen med formlen (a), hvor aminosyresekvensen fra 1- til 15-stillingen er udeladt, og X er Asp.

36 DK 172589 B1

Fremstillinaseksempel 4 (sammenligningseksempel)

Fremstilling af IL-la-derivat (Δ(1-15). 36D.141S).

(1) Fremstilling af ekspressionsvektor pAT-IL-ΙαΔ-5 (1-15)36S.141S__

Ved anvendelse af plasmid ptrp IL-ia-36D.141S (europæisk patentpublikation nr. 237073, båret af Escherichia coli HB101/IL-la-36D.141S (FERM BP-1295)) 10 blev processen gennemført ved metoden med stedspecifik mutagenese.

Clal/BamHI DNA-fragment (527 bp) blev udskåret fra plasmid ptrp IL-la-36D.141S og ligeret med stort Clal/BamHI-fragment af vektor fl.IL-Ιβ lppT for IL-lp 15 stedspecifik mutagenese (Biochem. Biophys. Res.

Commun., 150 1106-1114 (1988)), hvorved der blev opnået fl.IL-Ia-36D.141S. Hjælper-phag M13K07 (Takara Shu2o Co., Ltd.) blev inficeret med ovennævnte plasmid, hvorved opnåedes enkeltstrenget (ss) DNA, der derefter an-20 vendtes som mutagenese-template.

Ved som primer at anvende et syntetisk oligonu-cleotid t5'-GTATTCGATAATGAGAATCATC-3'), blev der gennemført stedspecifik mutagenese med "Oligonucleoide-directed in vitro Mutagenesis KIT" (produkt fra 25 Amersham UK).

Et ss-DNA opnået fra klonen transformeret ind i E. coli MV1184 (Takara Shuzo Co., Ltd.) blev underkastet DNA-sekvensbestemmelse ved dideoxykædetermination, hvorved der blev opnået rekombinant (transformant) 30 fl.IL-ΙαΔ(1-15).36D.141S/E.coli MV1184.

Ekspressionsvektor til storvolumen-fermentatio-nen blev fremstillet på følgende måde.

Først blev fl.IL-Ιβ lppT digereret med Mlul og Sall, behandlet med DNA polymerase (Klenow fragment) og 35 ligeret med T4 DNA-ligase, hvorved der blev opnået fl.IL-Ιβ lppTiMS. Dette produkt blev behandlet med 37 DK 172589 B1

EcoRl og derefter DNA-polymerase (Klenow-fragment), underkastet selvligering og yderligere behandlet med Aatll, T4DNA-polymerase og Bglll-linker (pGAAGATCTTC) i nævnte rækkefølge for at omdanne Aatll-sted til Bglll-5 sted. Plasmidet blev yderligere behandlet med Sall, DNA-poly-merase (Klenow-fragment) og Xbal-linker (pGCTCTAGAGC) for at omdanne Sall-sted til Xbal-sted.

Stort Clal/BamHI DNA-fragment (5,5 Kb) blev udskåret fra det resulterende plasmid og ligeret med Clal/BamHI 10 DNA-fragment (482 bp) af fl.IL-ΙαΔ(1-15)36D. 141S, hvor ved der blev opnået fl.IL-αΔ(1-15)36D.141S (Aatll-»

Bglll, Sall-Xbal), fra hvilket Bglll/Xbal DNA-fragment (1109 bp) blev udskåret.

Yderligere blev plasmid pATl53 behandlet for at 15 omdanne Clal-sted til BglII--sted og Dral-sted til Xbal-sted og digereret med Bglll og Xbal, hvorved der blev opnået stort Bglll/Xbal-fragment (2514 bp). Det store fragment blev ligeret med ovennævnte Bglll/xbal-fragment (1109 bp), hvilket gav den ønskede 20 transformant pAT.iL-laA(i-l5)36D.i4lS.

Denne transformant er ekspressionsplasmidet, der har den aminosyresekvens med formlen (a), hvori amino-syresekvensen fra 1- til 15-stillingen er udeladt (det protein, der opnås ud fra denne transformant, kan imid-25 lertid, da Met stammende fra initierings-codonen er forbundet til proteinets N-terminal, være det polypep-tid, hvori aminosyresekvensen fra 1- til 14-stillingen er udeladt), X ved 36-stillingen er Asp, og Y ved 141-stillingen er Ser.

30 Transformanten er deponeret under navnet

Escherichia coli HBlOl/pAT Il-ΐαΔ(1-15)36D.141S og løbenummer FERM BP 2483 hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.

38 DK 172589 B1 (2) Inkubation af transformant

Transformanten opnået under (1), dvs. E.coli HB10I/pAT.IL-aA(l-15)36D.141S blev inkuberet natten 5 over ved 37 C under rystning i 600 ml LB-medium med nedenstående sammensætning indeholdende 10 yg/ml tetra-cyclin, hvilket gav en prædyrkningsopløsning.

Sammensætning af LB-medium: 10

Bacto-trypton (produkt fra Difco) 10 g/1

Bacto-gærekstrakter (ibid) 5 g/1

NaCl (Wako Pure Chemical Inc. Ltd.) 10 g/1.

15 En portion på 600 ml af prædyrknings-opløsningen blev inokuleret i 30 liter af et produktionsmedium med 0 følgende sammensætning og inkuberet ved 36,5 C i 16 ti-mer i et 50 liter fermenteringskar (produkt fra Hitachi Ltd.) med rystningsluftning på 1,0 vvm ved 300 rpm.

20

Sammensætning af produktionsmiddel

Na2HP04,12H20 6 g/1 KH2P04 3 g/1 25 NaCl 0,5 g/1 NH4C1 1 g/1

Syrehydrolysat af casein (produkt fra Sigma) 10 g/1

Bacto-gærekstrakt 0,5 g/1 30 MnCl2,4H20 2,5 mg/1 L-cystein, HC1 75 mg/1 L-prolin 75 mg/1 L-leucin 75 mg/1.

35 (Mediet blev indstillet på pH 7,4 med 4N NaOH

efterfulgt af behandling i en autoklav ved 121 C i 30 39 DK 172589 B1 minutter. Den steriliserede opløsning med nedenstående sammensætning blev aseptisk sat til mediet efter inoku-lation.

5 Sammensætning af steriliseret opløsning: 1M MgS04,4H20 2 ml/1 1M CaCl2,2H20 0,1 ml/1 7,5 mg/l Thiamin,HC1 1 ml/1 10 40% Glucose 18,75 ml/1).

Efter inkubation blev celler indhøstet ved centrifugering ved 16000 xg. Suspensionen af cellerne i 1 M phosphatpuffer (pH 6,0) blev henstillet natten over i 15 køleskab og dialyseret mod 10 mM tris HCl-puffer (pH 8,0) i to dage. Dialysatet blev centrifugeret ved 16000 xg for at skille en supernatant fra et bundfald.

Bundfaldet blev behandlet ved samme operation som ovenfor, hvorved der blev opnået en supernatant. De såle-20 des opnåede supernatanter blev sammenblandet, og blandingen blev underkastet følgende rensningsproces.

(3) Rensning af Il-ia-derivat 25 Celleekstrakt-supernatanten, fremstillet som ovenfor under (2), blev indstillet på pH 3 med 2 M eddikesyre og renset ved anvendelse af SP-HPLC (TSK Gel SP-5PW-søjle, 5,5 cm i diameter og 20 cm i længde, produkt fra Tosoh Corporation) under følgende betingelser.

40 DK 172589 B1 Søjle: TSK Gel SP-5PW (5,5 x 20 cm,

Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 50 mM natriumacetat (pH 5,0)

Elueringsmiddel B: 50 mM natriumacetat (pH 5,0) + 5 0,5 M NaCl

Strømningshastighed: 30 ml/min.

Koncentrationsgradient: Tid (min) % B

0 0 10 30 0 90 30 95 100 125 100 130 0 15

De aktive fraktioner med retentionstid på 70 til 75 minutter blev samlet og indstillet på pH 8,1 med 1 M Tris HCl-puffer. Fraktionen blev anbragt på en DEAE-HPLC-Søjle (TSK GEL DEAE-5PW-søjle, 5,5 x 20 cm, pro-20 dukt fra Tosoh Corporation) efterfulgt af eluering under følgende betingelser.

Søjle: TSK Gel DEAE-5PW (5,5 x 20 cm,

Tosoh Corporation) 25 Elueringsmiddel A: 20 mM Tris HCl-puffer (pH 8,0)

Elueringsmiddel B: 20 mM Tris HC1 (pH 8,0) + 0,5M

NaCl

Strømningshastighed: 30 ml/min

4 I

DK 172589 B1

Koncentrationsgradient: Tid (min) % B

0 0 20 0 140 60 5 145 100 165 100 170 0

De aktive fraktioner med retentionstid på 92 til 10 96 minutter blev samlet, koncentreret ved ultrafiltre ring (YM-5 membran) og renset ved gelfiltrerings-HPLC (TSK-Gel G-2000SWG-søjle, 21,5 x 600 mm, produkt fra Tosoh Corporation, elueringsmiddel: PBS-).

Det rensede produkt blev indstillet på pH 4 med 15 2 M eddikesyre og anbragt på en SP-HPLC-søjle (TSK-GEL

SP-5PW-søjle, 21,5 x 150 mm, produkt fra Tosoh Corporation) efterfulgt af eluering under følgende betingelser .

20 Søjle: TSK Gel SP-5PW (21,5 X 150 mm,

Tosoh Corporation)

Elueringsmiddel A: 50 mM natriumacetat (pH 5,0)

Elueringsmiddel B: 50 mM natriumacetat (pH 5,0) +0,5 25 M NaCl

Strømningshastighed: 3 ml/min.

Koncentrationsgradident: Tid (min) % B

30 0 0 20 0 110 45 115 100 130 100 35 135 0 42 DK 172589 B1

De aktive fraktioner med retentionstid på 87 til 90 minutter blev samlet og derefter underkastet ultrafiltrering (YM-5 membran, produkt fra Amikon), hvorved der blev fremstillet et koncentreret produkt. Under 5 ovennævnte ultrafiltrering blev små portioner af pufferen udskiftet, således at pufferen til slut havde samme sammensætning som 20 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,0).

43 DK 172589 B1 (4) Identifikation af IL-la-derlvat

Aminos y res ammensaetning 5 Det rensede produkt opnået under (3) blev under kastet aminosyre-analyse på samme måde som i Fremstillingseksempel 1.

Tabel v viser resultatet udtrykt i molforhold af indgående aminosyrer baseret på Phe (7 mol).

10

TABEL V

Aminosyre____Molforhold 15 Asp 18,6

Thr 11,4

Ser 7,7

Glu 17,2

Gly 5,7 20 Ala 13,2

Val 5,8

Met 2,8

Ile 10,9

Leu 14,1 25 Tyr 5,9

Phe (7)

Lys 9,9

His 3,0

Arg 3,1 30

Amlnosyresekvens

Aminosyresekvensen ved N-terminalen af IL-la-de-rlvatet fremstillet under (3) blev analyseret.

35 Analyseresultaterne viste følgende sekvens for 15 aminosyrer ved N-terminalen.

44 DK 172589 B1

Met-Arg-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-

Asn-Asp-Ala-Leu-Asn-

Ovenstående resultat bekræfter, at derivatet har en sekvens med formlen (α) (ll-ία), hvori aminosyrese-5 kvensen fra 1- til 15-stillingen var udeladt.

Fremstllllngseksempel 5 Fremstilling af IL-ip-derivat (24-153) 10 (1) Fremstilling af ekspresslonsplasmid ved anvendelse af plasmid ptrp GIF-α, der bærer et gen, som koder for humant IL-10 (dette plasmid er omtalt i europæisk patentpublikation nr. EPO 187 991, 15 og E.coli transformeret med dette plasmid er deponeret under navnet Escherichia coli x1776/ptrp GIF-α og løbenummer FERM BP-949 hos Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology siden 12.

December 1985), blev det ønskede ekspresslonsplasmid 20 for det ønskede polypeptid konstrueret.

Nærmere angivet blev ptrp GIF-α digereret med restriktionsenzymer Ndel og Sall, og derefter blev 781 bp af DNA-fragmentet, der bærer den region, som koder for aminosyresekvensen fra 24-stillingen til N-termina-25 len af IL-lp, isoleret ved agarosegel-elektroforese. DNA-Fragmentet blev behandlet med DNA-polymerase I (Klenowfragment) for at omdanne restriktioinsstederne tilvejebragt med restriktionsenzymerne Ndel og Sall til stumpe ender.

30 Linkerne (5-CGATAATG-3' og 5'-CATTAT-31) 5'- phosphoryleret med T4 polynucleotid-kinase blev ligeret med de stumpe ender af ovennævnte DNA-fragment ved anvendelse af T4 DNA-ligase, efterfulgt af digerering med restriktionsenzymer Clal og BamHI. Det resulterende 35 plasmid blev underkastet agarosegel-elektroforese, og DNAfragmentet (510 bp) blev isoleret.

45 DK 172589 B1

Plasmid pTMl blev kløvet med restriktionsenzymer Clal og BamHl og derefter underkastet agarosegel-elek-troforese for at isolere DNA-fragmentet (ca. 4,4 kbp), der bærer trp-promotor. Dette DNA-fragment blev ligeret 5 med ovennævnte 510 bp af Clal/BamHI-DNA-fragment ved anvendelse af T4 DNA-ligase, efterfulgt af transformation ind i E.coli HB101. Den ønskede transformant blev udvalgt ved restriktionsenzym-analyse af plasmid-DNA opnået ved kogningsmetoden (T. Maniatis, E.F. Fritsch og 10 J. Sambrook, Molecular Cloning, side 366, Cold Spring

Harbor Laboratory (1982)).

(2) Inkubation af transformant 15 Ovennævnte transformant (E.coli HB101/ptrp GIF-a- 24-153) blev inkuberet natten over ved 37 c med rystning i 10 ml LB-medium (1% trypton, 0,5% gærekstrakt og 0,5%

NaCl) indeholdende 50 yg/ml ampicillin og 20 yg/ml L- tryptophan. Af kulturen blev l ml inokuleret i 50 ml 20 M9 minimum medium (0,6% Na2HP04, 0,3% KH2P04, 0,05%

NaCl, 0,1% NH4C1, 2 mM MgS04, 0,2% glucose og 0,1 mM

CaCl2) indeholdende 50 yg/ml ampicillin og 1% casamino- 0 syre og inkuberet ved 37 C med rystning. Cellerne blev indhøstet, da absorptionsevnen (O.D.) ved 550 nm nåede 25 1,0, og blev suspenderet i 5 ml af en opløsning af 15% sucrose, 50 mM Tris HC1 (pH 8,0) og 50 mM EDTA (pH 8,0).

Der blev til suspensionen sat 500 yl 10 mg/ml lysozym (opløst i 10 mM Tris HC1 (pH 8,0)), og der blev til blandingen yderligere sat 5 ml af en opløsning af 0,3% 30 Triton X100, 187,5 mM EDTA (pH 8,0) og 150 mM Tris HC1 (pH 8,0). Blandingen blev henstillet ved rumtemperatur i 15 minutter, derefter omrørt grundigt og centrifugeret, hvorved der blev opnået en supernatant af celleekstrakt rr.ed GIF-aktivitet.

46 DK 172589 B1 {3) Rensning og Identifikation af lL-ip-derlvat.

Ovennævnte produkt blev renset ved chromatografi på samme måde som i Fremstillingseksempel 1. Det herved 5 opnåede koncentrerede produkt blev undersøgt for isoe-lektrisk punkt, aminosyresammensætning og aminosyresek-vens for at bekræfte, at produktet var polypeptidet med aminosyresekvensen fra 24- til 153-stillingen af IL-Ιβ repræsenteret ved formlen (B).

10

Fremstillingseksempel 6 Fremstilling af iL-ip-derivat (1-82) (1) Fremstilling af ekspressionsplasmld 15

Plasmid ptrp GIF-a (Fremstillingseksempel 5) blev digereret med restriktionsenzym PvuII, og derefter blev ca. 2,9 kbp af DNA-fragmentet, der bærer den region, som koder for aminosyresekvensen fra 1- til 82-20 stillingen af IL-Ιβ, isoleret ved agarosegel-elektrofo-rese.

Xbal Linker (5’-CTCTAGAG-3' ) blev 5'-phosphory-leret med T4 polynucleotid-kinase. Linkeren blev ligeret med ovennævnte DNA-fragment ved anvendelse af T4 25 DNA-ligase efterfulgt af digerering med restriktionsenzymer Clal og Xbal. DNA-Fragmentet (250 bp) blev således isoleret ved agarosegel-elektroforese.

Plasmid pTMl blev digereret med restriktionsenzym BamHI og behandlet med DNA-polymerase I (Klenow-30 fragment) for at omdanne BamHI-restriktionsstedet til stump ende. Ved anvendelse af T4 DNA-ligase blev dette DNA-fragment ligeret med Xbal-linker (5'-CTCTAGAG-3') 5'-phosphoryleret med T4 polynucleotid-kinase. Det resulterende produkt blev derefter digereret med restrik-35 tionsenzymer Clal og Xbal. Herved blev det DNA-fragment, der bærer trp-promotor, osv., udskåret og isole- 47 DK 172589 B1 ret og renset ved agarosegel-elektroforese.

Dette DNA-fragment blev ligeret med 250 bp af det ovenfor fremstillede DNA-fragment ved anvendelse af T4 DNA-ligase, efterfulgt af transformation ind i 5 E.coli HB101. Den ønskede transformant blev udvalgt ved restriktionsenzym-analyse af plasmid-DNA opnået ved kogningsmetoden.

(2) Inkubation af transformant 10

Ovennævnte transformant blev inkuberet og behandlet på samme måde som i Fremstillingseksempel 5, hvorved der blev opnået en supernatant af celleekstrakt med GIF-aktivitet.

15 (3) Rensning og identifikation af IL-lQ-derivat

Ovennævnte produkt blev renset på samme måde som i Fremstillingseksempel 5. Det således opnåede kon-20 centrerede produkt blev undersøgt for isoelektrisk punkt, aminosyresammensætning og aminosyresekvens for at bekræfte, at produktet var polypeptidet med aminosy-resekvensen for aminosyrerne i 1- til 82-stillingen af IL-ΐβ repræsenteret ved formlen (B).

25

Eksempel 1 Farmakologisk test I

30 Den farmakologiske effekt af den aktive kompo nent af det omhandlede medikament til behandling af thrombocytopenia blev vurderet i dette eksempel.

De som aktive komponenter ved testen anvendte polypeptider var følgende: 48 DK 172589 B1 * IL-Ια (36D.141S)

Derivat af IL-Ια, hvor Asn ved 36-stillingen er erstattet med Asp, og Cys ved 141-stillingen er erstattet med Ser (europæisk patentpublikation nr. 237073).

5 * Derivat IL-Ια (Δ(1-14).36D.141S)

Derivat af IL-Ια (opnået i Fremstillingseksempel 2, dansk patentansøgning nr. 3740/89), hvor aminosyrese-kvensen fra 1-stilling til 14-stilling er udeladt, og Asn i 36-stillingen er erstattet med Asp, og Cys i 10 141-stillingen er erstattet med Ser.

* IL-Ια (16G.36D.141S)

Derivat af IL-Ια (opnået i Fremstillingseksempel 1, dansk patentansøgning nr. 3740/89), hvor Arg i 16-stil-lingen er erstattet med Gly, Asn i 36-stillingen er er-15 stattet med Asp, og Cys i 141-stillingen er erstattet med Ser.

* IL-13 (nativt IL-Ιβ)

Polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (0) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 147(1), 315-321 20 (1987)).

Testen blev gennemført ved anvendelse af ni uger gamle BALB/c-hanmus (Experimental Animal Corporation Association of Shizuoka Prefecture, Japan).

49 DK 172589 B1

Hvert af ovennævnte polypeptider {aktive komponenter) blev fortyndet til den foreskrevne koncentration med en fysiologisk saltopløsning til injektion indeholdende 100 ug/ml af museserumalbumin (fremstillet 5 af Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.).

På den indledende dag (dag 0) blev dyrene systematisk bestrålet med 400 Rad af røntgenstråler ved anvendelse af et røntgenstråle-bestrålingskammer til små forsøgsdyr (Hitachi MBR-1505R) for at inducere thrombo-10 cytopenia.

Fra den følgende dag blev testlægemidlet indgivet subcutant 13 gange hver dag.

På dag 14 blev musene anæsteseret med ether.

Blod blev taget fra den nedre vena cava efter laparoto-15 mi og opsamlet i en mikrobeholder (fremstillet af Becton Dickinson). Blodcellerne blev analyseret ved anvendelse af en automatisk blodcelle-analysator (ELT/8, Ortho Diagnostic System, Inc.)

Forsøget blev foretaget ved anvendelse af fem 20 mus pr. gruppe.

Antallet af blodplader (gennemsnit ± S.E., x 103/mm3) på dag 14 er vist i nedenstående Tabel vi.

DK 172589 B1 50

TABEL VI

Test-Polypeptid Dosis (yg/kg) 0,1 1 10 5 _______________ 10 1076 + 41* 1316±54* 1710±47* IL-1 a [36D.141SJ 969±40* 1211;+32* 1446±37* H-Ία t Δ (1-14) .36D.141S] 872±17* 1253±15* 1374 + 69* 15 IL-la [16G.36D.141S] 715±23* 911±2B* 1220±68*

Kontrol-opløsnings- , 447±52 middelgruppe

Ubehandlet normal 1164±10 20 gruppe

Testen vedrørende signifikant differens gennemførtes ifølge Student’s t-test under anvendelse ef vær-25 dien fra opløsningsmiddelgruppen som kontrol. I ovenstående Tabel betyder * p£0,001.

Som vist i Tabel VI faldt antallet af blodplader til 447 i 52 i kontrolgruppen, selvom det var 1164 ± 10 hos den ubehandlede normalgruppe. På den anden side 30 begyndte hos gruppen med den foreliggende aktive komponent (IL-l og dets derivat) bemærkelsesværdig dosisafhængig stigning i blodplader fra dosen på 0,1 yg/kg. Resultatet viser, at de omhandlede aktive komponenter er anvendelige ved behandling af thrombocytopenia.

51 DK 172589 B1

Eksempel 2

Test for pyroqenicitet 5 IL-1 og derivater deraf blev testet for pyroge- f nicitet ved anvendelse af rotter som nedenfor beskre- . vet.

SD-Hanrotter (6-10 uger gamle, 160 til 250 g i legemsvægt, Japan Charles River) anvendtes til forsø-10 get.

Hvert af de foreliggende derivater og de andre testforbindelser til sammenligning blev fortyndet til en specifik koncentration med phosphat-saltvandspuffer indeholdende 100 pg/ml rotteserumalbumin til opnåelse 15 af en testopløsning, og som kontrolopløsning anvendtes fortyndingen af humant serumalbumin (HSA).

De foreskrevne mængder af testopløsningen og kontrolopløsningen blev indgivet subcutant på rotterne, der forud var vejet. Rottens rectale temperatur blev 20 bestemt med Thermister Temperature Recorder K293 (Takara Thermistor Instruments Co., Ltd.) forud for indgift og 2, 4 og 6 timer efter indgift.

Som testforbindelser anvendtes de omhandlede derivater fremstillet i fremstillingseksemplerne, sammen-25 ligningsforbindelse IL-Ιβ (nativ form, Biochem.

Biophys. Res. Commun., 147(1), 315-321 (1987)) og IL-la-sammenligningsderivatet (derivatet med formlen (A) modificeret ved, at Asn i 36-stillingen er erstattet med Asp, og Cys i 141-stillingen er erstattet med 30 ser, europæisk patentpublikation nr. 237073). Resultatet (de rectale temperaturer målt fire timer efter indgift, hvor temperaturen stiger til et maksimum) er vist i fig. l.

I fig. 1 er dosen (pg/kg) af testforbindelsen 35 afsat som abscisse, og ændringen i rectal temperatur 52 DK 172589 B1 (Δ°0) fra temperaturen (0) umiddelbart før indgift er afsat som ordinat. Linie (1) viser resultatet opnået med det omhandlede derivat fra Fremstillingseksempel 1 (IL-la.16G.141S), linie (2) viser resultatet opnået med 5 det omhandlede derivat opnået i Fremstillingseksempel 2 (Il-ία.Δ(1-14).36D.141S), linie (3) viser resultatet opnået med det native IL-Ιβ, linie (4) viser resultatet opnået med IL-la-derivatet omtalt i ovennævnte europæiske patentpublikation (IL-la.36D.l41S), og linie (5) 10 viser resultatet opnået med kontrollen (HSA).

Fig. 1 viser, at derivatet ifølge den foreliggende opfindelse ikke i væsentlig grad inducerer feber ved nogen dosis, og således udviser en bemærkelsesværdig inhibition af pyrogenicitet. På den anden side in-15 ducerede IL-Ιβ feber ved en dosis på 0,1 pg/kg, og legemstemperaturen steg med stigende dosis. Med IL-la.36D.141S inducerede en dosis på 100 pg/kg feber, medens doser på 0,1, 1 og 10 pg/kg ikke inducerede feber .

20 Forsøg gennemførtes på samme måde som ovenfor ved anvendelse af iL-la-derivaterne fremstillet i Fremstillingseksemplerne 3 og 4.

Resultatet er vist i fig. 2. Linierne (1) til (4) viser resultaterne opnået med de omhandlede deriva-25 ter: (1) med IL-la(Δ(1-15)), (2) med IL-la(A(1-15).36D), (3) med IL-la<A(1-15).36D.141S) og (4) med IL-la<A(l-14).36D.141S).

30 Linierne (5) til (8) viser resultaterne opnået med sammenligningsforbindelsen IL-1: (5) med IL-la, (6) med IL-la(36D), 35 (7) med IL-la(36D.141S) og (8) med [71Ser]-IL-Ιβ (europæisk patentpublikation nr. 187991).

DK 172589 B1 53

Eksempel 3 Klinisk test 5 En 41-årig kvinde, der led af gastrisk cancer, i stadium il med metastaser til leveren, lymfeknude osv., fik for at teste blodkomponenter subcutant én gang om dagen 1 x 104 GIF-enheder af ΙΙ,-Ιβ-derivatet med formlen (B), hvori Cys i 71-stillingen er erstattet med 10 Ser.

Som vist i Tabel XI steg antallet af blodplader en uge efter indgift, og var efter tre uger 1,7 gange værdien forud for indgift.

Antallet af hvide blodceller var forøget til 1,8 15 gange antallet forud for indgift.

TABEL XI

DK 172589 B1 54 Før 1 uge 2 uger 3 uger

5 RBC

(104/mm3) 377 359 374 352

Hb (g/dl) 10,8 10,2 10,8 10,2

Ht {%) 33,1 31,7 32,6 30,8

Blodplader 10 (104/mrn3) 14,9 16,4 21,2 25,8

Hvide blodceller (/mm3) 5200 5300 9200 9300

Claims (7)

1. Medikament til behandling af thrombocytopenia, kendetegnet ved, at det som aktiv komponent indeholder IL-1/3 eller et derivat deraf.

2. Medikament ifølge krav 1, kendeteg net ved, at IL-l/3-derivatet har en primær aminosyre-sekvens repræsenteret ved formlen (B): Ala - Pro - Val - Arg - Ser - Leu - Asn - Cys - Thr 10 15 Arg - Asp - Sir - Gin - Gin - tys - Ser - Leo 25 30 Ser - Gly - Pro - Tyr - Glu - Leu - Lys - Ala - Leu - His- 35 <0 Leu - Gin - Gly - Gin - Asp - Met - Glu - Gin - Gin - Val- 45 50 Val - ?he - Ser - Met - Ser - ?he - Val - Gin - Gly - Glu- 55 60 Glu - Ser - Asn - Asp - Lys - Ile - Pro - Val - Ala - Leu- 65 70

20 Gly - Leu - Lys - Glu - Lys - Asn - Leu - Tyr - Leu - Ser- 75 80 Cys - Val - Leu - Lys - Asp - Asp - Lys - Pro - Thr - Leu_- 85 90 Gin - Leu - Glu - Ser - Val - Asp - Pro - Lys - Asn - Tyr- 25 95 '· 100 Pro - Lys - Lys - Lys - Met - Glu - Lys - Arg -* Phe r Val- 105 · 110 Phe - Asn - Lys - Ile - Glu - Ile - Asn - Asn - Lys - Leu- ’ 115 - 120 Glu - Phe - Glu - Ser - Ala - Gin - Phe - Pro - Asn - Trp- 30 125 130 Tyr - Ile - Ser - Thr - Ser - Gin - Ala - Glu - Asn - M.et- 135 - 140 Pro - Val - Fke - Leu - Gly - Gly - Thr - Lys - Gly - Gly- 145 150

35 Gin - Asp - Ile - Thr - Asp - Phe - Thr - Met - Gin - Phe- Val - Ser - Ser (3) DK 172589 B1 hvilken aminosekvens (B) kan være modificeret således, at den opfylder mindst en af følgende betingelser a) til d): 5 a) Mindst én aminosyrerest valgt blandt Ala ved 1-stillingen, Val ved 3-stillingen, Arg ved 4-stillingen, Ser ved 5-stillingen, Cys ved 8-stillingen, Arg ved li-stillingen, His ved 30-stillingen, Cys ved 71-stillingen, Lys ved 93-10 stillingen, Lys ved 97-stillingen, Arg ved 98- stillingen, Phe ved 99-stillingen, Lys ved 103-stillingen, Trp ved 120-stillingen, Tyr ved 121-stillingen og Ser ved 153-stillingen er udeladt eller erstattet med en anden aminosyrerest, 15 b) aminosyresekvensen fra Ala ved 1-stillingen til Thr ved 9-stillingen eller mindst én aminosyrerest i denne sekvens er udeladt (bortset fra at mindst én aminosyrerest valgt blandt Ala ved 1-stillingen, Val ved 3-stillingen, Arg ved 4-20 stillingen, Ser ved 5-stilingen og Cys ved 8- stillingen er udeladt, som anført under betingelse a)), c) aminosyresekvensen fra Lys ved 103-stillingen til Ser ved 153-stillingen eller mindst én amino-25 syrerest i denne sekvens er udeladt (bortset fra at mindst én aminosyrerest valgt blandt Lys ved 103-stillingen, Trp ved 120-stillingen, Tyr ved 121-stillingen og Ser ved 153-stillingen er udeladt som anført under betingelse a)), 30 d) en aminosyrerest, eller aminosyresekvensen fra Met ved 1'-stillingen til Asp ved 116'-stillingen repræsenteret ved følgende formel (B'), eller en del af nævnte sekvens orienteret mod C-terminalen er forbundet til N-terminalen af formlen (B), 35 hvilken formel (B') er repræsenteret ved den DK 172589 B1 følgende aminosyresekvens: 5. 10'

5 Ket - Ala - Glu - Val - Pro - Glu - Leu - Ala - Ser - Glu- i5· , ;°· Met - Met - Ala - Tyr - Tyr - Ser - Gly - Asn - Glu Asp 25' 30' As? - Leu - ?ke - ?he - Glu - Ala - As? - Gly - Pro - Lys- 35' 40'

10 Gin - Met - Lys - Cys - Ser - rhe - Gin - As? - Leu - Asp- 45’ 50' Leu - Cys - ?:o - Leu - As? - Gly - Gly - Ile - Gin - Leu- 55' 60’ Arg - Ile - Ser - A-sp - His His - Tyr - Ser - Lys - Glv-15 65' 70- Phe - Arg - Gin - Ala - Ala - Ser - Val - Val - Val - Ala- 75' 80' y.et - Asp - Lys - Leu - Arg - Lys - Het - Leu - Val - ?ro- 85’ 90'

20 Cys ~ ?ro “ G1" " Thr - Phe - Gin - Glu - Asn - Asp - Leu- 95' ' 100' Ser - Thr - Phe - Phe - Pro - Phe - Ile - Phe - Glu - Glu- 105 ’ ι-ίο· Glu - Pro - Ile - Phe - Phe - As? - Thr - Trp - As? - Asn- / 25 115' · Glu - Ala - Tyr - Val - Kis - Asp '