KR20160032090A - 사이클 아데노신 모노포스페이트-결핍 아데닐일 사이클라아제 및 심부전 치료와 심기능 향상을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

사이클 아데노신 모노포스페이트-결핍 아데닐일 사이클라아제 및 심부전 치료와 심기능 향상을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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에이치. 커크 함몬드
메이 후아 가오
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 심장병 또는 심부전, 또는 감소된 심기능을 갖고 있거나 또는 위험을 갖고 있는 개인 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호(예방)하기 위한 방법을 제공하며, 하기를 포함한다: 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-결핍(cAMP-incompetent) 아데닐일 사이클라아제 타입 6(AC6) 단백질 또는 폴리펩티드(“AC6mut”라고 불림), 또는 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 포함하는 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물을 제공하며, 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물이 세포 또는 in vivo에서 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 발현할 수 있고; 전사 조절 서열, 또는 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물에 작동적으로 연결된 상기 AC6mut, 또는 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를, 개인 또는 이를 필요로 하는 환자에게 투여 또는 전달하여, 심장병 또는 감소된 심기능을 갖는 개인 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호(예방)한다. 일 구현예에 있어서, 상기 AC6mut는 상기 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드의 촉매적 코어에서 하전된 또는 산성의 아미노산을 하전되지 않거나 또는 비-극성 아미노산으로 치환된 AC 폴리펩티드를 포함한다.

Description

사이클 아데노신 모노포스페이트-결핍 아데닐일 사이클라아제 및 심부전 치료와 심기능 향상을 위한 조성물 및 방법{CYCLE ADENOSINE MONOPHOSPHATE-INCOMPETENT ADENYLYL CYCLASE AND COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HEART FAILURE AND INCREASING CARDIAC FUNCTION}
본 특허 협력 조약(PCT) 국제 출원은 2013년 6월 7일에 출원된, 미국 가출원 번호 61/832,759의 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권을 주장한다. 상기 전술된 출원은 명백하게 그 전체에서 및 모든 목적을 위해 참조로서 포함된다.
본 발명은 일반적으로 세포 및 분자 생물학, 유전자 치료 및 의학에 관한 것이며; 보다 구체적으로, 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-결핍(cAMP-incompetent) 아데닐일 사이클라아제 타입 6(adenylyl cyclase type 6, AC6) 단백질 또는 폴리펩티드(“AC6mut”라고 불림), 또는 AC6mut-인코딩 핵산 서열을 투여함으로써 심부전 또는 심장병을 갖고 있거나 위험을 갖고 있는 대상의 치료를 위한 조성물 및 제조 방법에 관한 것이다.
심근세포 및 다른 세포에서의 막관통 단백질인, 아데닐일 사이클라아제는, 세포내(intracellular) cAMP를 생성함으로써 p-아드레날린 시그널링을 변환하는 핵심 작동 분자이다. 사이클릭-AMP는 단백질 키나아제 A 활성화를 포함하는 다운스트림 이벤트들(downstream events)에 대한 2 차 전달자이다. 심부전은 심기능과 밀접하게 연관되어 있는, 손상된 cAMP 생성과 관련된다. 이것은 포유류 심근세포에서 발현되는 우성 동형 AC인, 증가된 심장의 AC 타입 6(AC6)이, 좌심실(left ventricle, LV) 부전에서 변화무쌍한 유익한 효과를 가진다는 것을 나타냈다. 이들은 다음을 포함한다: 1) 심근병증 및 급성 심근경색증에서의 증가된 생존, 2) AV 블록의 감소와 연관된 감소된 활동 전위 기간 및 방실계 전도의 촉진, 3) LV 팽창 및 병적 비대 모두의 감소, 4) 개선된 SERCA2a 활성, 증가된 포스포람반 활성을 통한 칼슘 처리의 유용한 효과, 및 5) 증가된 심장 트로포닌 I 인산화.
따라서, cAMP의 세포내 레벨을 증가시키는 몇몇 약물들이 생성되었으며, 및 심부전을 가진 환자들에게 테스트되었다. 그러나, 이러한 약물들은 일반적으로 사망률을 증가시킨다. 현재 정설은 세포내 cAMP의 레벨을 증가시키는 약물 및 단백질은 심부전에 해로우며, 따라서, 상기 약물 및 단백질은 심부전의 치료에 대해 적합하지 않다는 것을 나타낸다.
일 구현예에 있어서, 본원은 심장병 또는 감소된 심기능에 대한 개인 또는 환자의 치료, 개선 또는 보호(예방)를 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 하기를 포함한다: 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-결핍(cAMP-incompetent) 아데닐일 사이클라아제 타입 6(AC6) 단백질 또는 폴리펩티드(“AC6mut”라고 불림), 또는 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 포함하는 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물을 제공하며, 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물이 세포 또는 in vivo에서 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 발현할 수 있고, 전사 조절 서열, 또는 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물에 작동적으로 연결된 상기 AC6mut, 또는 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를, 개인 또는 이를 필요로 하는 환자에게 투여 또는 전달하여 심장병 또는 감소된 심기능을 갖는 개인 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호(예방)한다. 일 구현예에 있어서, 상기 AC6mut는 상기 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드의 촉매적 코어에서 하전된 또는 산성의 아미노산을 하전되지 않거나 또는 비-극성 아미노산으로 치환된 AC 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본원은
(1) 심장병 또는 심부전을 갖고 있거나 또는 위험을 갖고 있는 대상의 치료;
(2) 심장병,
심부전,
심기능 또는 심박출량의 감소,
심장 감염 또는 심장 질환(heart condition)에 의한 심기능 또는 심박출량의 감소
에 대한 개인 또는 환자의 치료, 개선, 효과의 반전(reverse), 보호 또는 예방:
(3) 근육세포질세망(sarcoplasmic reticulum, SR) Ca2 + 흡수(uptake) 및/또는 무손상 심근세포에서 감소된 이완 시간을 갖는 증가된 Ca2 + 과도 현상(transients)의 증가에 의한 무손상 심근세포에서의 칼슘 처리 향상,
(4) 심근세포에서 세포내 cAMP 레벨의 생성의 억제,
(5) 세포예정사(세포사멸) 신호로부터 심근세포의 보호, 또는 세포사멸 신호 이후 세포예정사(세포사멸) 신호를 받는 심근세포의 수의 감소, 또는
(6) 심부전 환자 또는 심기능 또는 심박출량의 저하를 야기하는 심장 감염 또는 심장 질환을 갖고 있는 개인에서: 심기능 또는 심박출량 향상, 증상 감소 및/또는 사망률 감소; 또는 심부전에 대한 입원의 빈도 감소의 방법 또는 이를 위한 in vivo 방법 또는 이의 방법들로서,
상기 방법은
(a) 하기 (i) 또는 (ii)를 제공하고:
(i) 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-결핍(cAMP-incompetent) 아데닐일 사이클라아제 타입 6(AC6) 단백질 또는 폴리펩티드(“AC6mut”라고 불림)로서,
여기서 선택적으로 상기 AC6mut는 재조합, 합성, 펩티드유사(peptidomimetic) 또는 단리된(isolated) AC6mut 폴리펩티드 또는 펩티드이고; 또는
(ii) AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자:
여기서 선택적으로 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 전사 조절 서열에 작동적으로(operatively) 연결되어 있으며, 여기서 선택적으로 상기 전사 조절 서열은 프로모터 및/또는 인핸서(enhancer), 또는 심장세포-특이 프로모터 또는 근세포-특이 프로모터이거나; 또는
여기서 선택적으로 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 전사 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있으며, 선택적으로 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물(equivalents)에 함유되며, 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물은, 세포 또는 in vivo에서 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 발현할 수 있으며,
여기서 선택적으로 상기 세포는 심장 세포 또는 근세포이고;
여기서 상기 AC6mut는 ATP의 cAMP로의 분해를 촉매화하지 않거나, 또는 ATP의 cAMP로의 분해를 촉매화하는 것에 대한 손상된 활성을 가지며, 및 선택적으로 상기 ATP의 cAMP로의 분해를 촉매화하는 것에 대한 손상된 활성은 상기 AC6mu가 야생형 AC6의 ATP에서 cAMP로의 촉매적 활성의 약 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%만을 갖는 것으로서 정의되며,
상기 AC6mut가 in vivo 심근세포에서 발현될 때 좌심실(LV) 기능은 영향을 받지 않거나 감소되지 않거나 또는 LV 기능은 실질적으로 영향을 받지 않거나 감소되지 않으며,
선택적으로 심근세포에서 AC6mut 발현은 근육세포질세망 Ca2 + 흡수(uptake)를 증가시키며,
선택적으로 심근세포에서 AC6mut 발현은 SERCA2a 활성화에 대한 EC50을 감소시키며,
선택적으로 심근세포에서 AC6mut 발현은 포스포람반(phospholamban) 단백질의 발현을 감소시키며,
선택적으로 상기 치환(substitution)은 Mg2 + 결합을 억제하고 상기 촉매적 코어의 Gsα-매개 활성화의 효율을 변화시킴;
(b) 상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를, 심장 세포 또는 심근세포에 전달 또는 투여하거나, 또는 심장 세포 또는 심근세포에서 상기 AC6mut를 발현시키거나, 또는 심장 세포 또는 심근세포에서 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 발현시키는 것
을 포함하며,
여기서 선택적으로 상기 AC6mut-인코딩 핵산은 전사 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있거나, 또는 선택적으로 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물이, 심근세포, 또는 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게 전달 또는 투여되며,
선택적으로 상기 심장 세포 또는 근세포로의 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자의 in vivo 전달 또는 투여는 심장 근육 또는 심근세포로의 표적화된 전달이거나, 또는 심장으로의 직접 전달 또는 투여를 포함하거나, 또는 심장 주사 또는 주입을 포함하며,
이에 의하여:
심장병 또는 심부전을 갖고 있거나 또는 위험을 갖고 있는 대상을 치료하거나,
심장병, 심부전, 심기능 또는 심박출량을 감소, 또는 심장 감염 또는 심장 질환에 의한 심기능 또는 심박출량의 감소에 대해 개인 또는 환자를 치료하거나, 개선 또는 보호(예방)하거나,
근육세포질세망(SR) Ca2 + 흡수 및/또는 무손상 심근세포에서 감소된 이완 시간을 갖는 증가된 Ca2 + 과도 현상의 증가에 의한 무손상 심근세포(cardiac myocytes)에서의 칼슘 처리를 강화하거나,
심근세포에서 세포내(intracellular) cAMP 레벨의 생성을 억제하거나,
세포예정사(세포사멸) 신호로부터 심근세포를 보호하거나, 또는 세포사멸 신호 이후 세포예정사(세포사멸) 신호를 받는 심근세포의 수를 감소시키거나, 또는
심부전 환자 또는 심기능 또는 심박출량의 저하를 야기하는 심장 감염 또는 심장 질환을 갖고 있는 개인에서: 심기능 또는 심박출량의 향상, 증상 감소 및/또는 사망률을 감소시킬 수 있음.
일 구현예에 있어서, 상기 AC6mut은 상기 AC 폴리펩티드의 상기 촉매화 코어에서 하전된 또는 산성의 아미노산이 하전되지 않은 또는 비-극성의 아미노산에 의해 치환된 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드를 포함하며,
여기서 선택적으로 상기 하전되지 않은 또는 비-극성의 아미노산은 알라닌(Ala)이고, 선택적으로 상기 산성의 아미노산은 아스파르트산(aspartic acid, Asp)이거나, 선택적으로 상기 하전되지 않은 또는 비-극성의 아미노산은 Ala이고 및 상기 산성의 아미노산은 Asp이다.
일 구현예에 있어서, 상기 AC6mut은:
SEQ ID NO:16에 기반한 상기 AC 폴리펩티드의 상기 촉매적 코어에서 426 위치에서 Asp를 Ala로 치환한 뮤린(murine) 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 SEQ ID NO:17는 상기 D=>A 치환 후의 폴리펩티드 아미노산 서열(SEQ ID NO:16는 상기 D=>A 치환 전의 아미노산 서열임)이며; 또는
SEQ ID NO:11에 기반한 상기 AC 폴리펩티드의 상기 촉매적 코어의 436 위치에서 Asp를 알라닌, 또는 Ala로 치환한 뮤린 AC6mut 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 SEQ ID NO:12는 D=>A 치환 후의 폴리펩티드 아미노산 서열(SEQ ID NO:11은 상기 D=>A 치환 전의 아미노산 서열임)인 것을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 AC6은 포유류 AC6 폴리펩티드이거나, 상기 AC6은 인간 AC6 폴리펩티드이다. 일 구현예에 있어서, 상기 인간 AC6 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10에 기반한 상기 AC 폴리펩티드의 상기 촉매적 코어의 426 위치에서 Asp를 Ala로 치환한 인간 AC6 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 SEQ ID NO:13은 D=>A 치환 후의 폴리펩티드 아미노산 서열(SEQ ID NO:10은 상기 D=>A 치환 전의 아미노산 서열임)이다.
상기 방법의 일 구현예에 있어서,
(a) 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 세포의 염색체(chromosome) 내부로 안정하게 삽입되거나;
(b) 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은 하기이거나 하기를 포함하는 것이거나: 아데노-연관 바이러스(AAV); 재조합 AAV 바이러스 또는 벡터; AAV 비리온(virion), 또는 아데노바이러스 벡터, 또는 이것의 임의의 슈도타입(pseudotype), 하이브리드;
(c) 상기 (b)의 방법에서, 상기 아데노-연관 바이러스(AAV), 재조합 AAV 바이러스 또는 벡터, AAV 비리온(virion), 또는 아데노바이러스 벡터는 하기이거나 하기를 포함하는 것이거나: AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9; 히말라야 원숭이 AAV(AAVrh), 또는 AAVrh10; 또는 이것의 임의의 하이브리드 또는 유도체;
(d) 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 조절된 또는 유도성(inducible) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결되거나;
(e) 상기 (d)의 방법에서, 상기 조절되거나 또는 유도성 전사 조절 서열은 조절되거나 또는 유도성 프로모터이거나;
(f) 상기 (a) 내지 상기 (e) 중 어느 한 방법에서, 전사 조절 서열, 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물에 작동적으로 연결된 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 개인 또는 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것은: 심근세포에서의 AC6mut의 표적화된 전달 또는 발현, 또는 AC6mut가 혈류 또는 일반적인 순환 내로 방출되는 것을 야기하거나; 또는
(g) 상기 (a) 내지 상기 (f) 중 어느 한 방법에서, 향상된 AC6mut in vivo 레벨에 반응하는 질병, 감염 또는 질환은 심수축성 기능장애; 울혈성 심부전(CHF); 심장 섬유증; 심근세포 질환; 심근세포 기능장애 또는 심근세포 사멸이다.
상기 방법의 일 구현예에 있어서,
(a) 전사 조절 서열; 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물에 작동적으로 연결된 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는, 개인 또는 이를 필요로 하는 환자에게, 경구 투여, 근육(IM) 주사, 정맥(IV) 주사, 피하(SC) 주사, 피부 내(intradermal) 주사, 경막 내 주사, 동맥(IA) 주사, 관상동맥 또는 심장 주사, 안구(intraocular) 주사 또는 도포(application), 흡입, 또는 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템, 또는 "유전자 총(gene gun)", 공기 피스톨 또는 HELIOS™ 유전자 총(Rad Laboratories, Hercules, CA)의 사용에 의하여 투여 또는 전달되며,
여기서 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 선택적으로 AAV 벡터, 또는 AAV-9 벡터의 정맥(IV) 주사에 의하여 전달되며; 또는
(b) 전사 조절 서열; 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물에 작동적으로 연결된 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는, 개인 또는 이를 필요로하는 환자들에게, 혈류에 인접하거나 또는 혈류에 의해 배출된 상기 체내의 임의의 세포, 기관, 조직 또는 유체 공간 내부로 도입되어 상기 인코딩된 AC6mut 단백질이 상기 조직의 세포로부터 분비되고 혈류 내로 방출될 수 있도록 하는 것에 의하여 투여 또는 전달된다.
상기 방법의 일 구현예에 있어서:
(a) 개인, 환자 또는 대상은 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나 상기 발현을 유도하거나 상향-조절하는 프로모터(예를 들어, 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터)를 유도 또는 활성화하는 자극 또는 신호가 투여되거나;
(b) 상기 개인, 환자, 또는 대상은 프로모터의 활성화제의 합성을 유도하는 자극 또는 신호가 투여되거나, 여기서 상기 프로모터는 선택적으로 AC 유전자 프로모터, 또는 근세포-특이 프로모터이며;
(c) 상기 개인, 환자, 또는 대상은 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자-특이 프로모터의 천연 또는 합성 활성화제의 합성을 유도하는 자극 또는 신호가 투여되거나,
여기서 선택적으로 상기 천연 활성화제는 내인성 전사 인자이며;
(d) 상기 (c)의 방법에 있어서, 상기 합성 활성화제는 특이적 및 선택적으로 내인성 또는 외인성 표적 유전자를 작동시키도록(turn on) 설계된 아연-핑거(zinc-finger) DNA 결합 단백질이거나, 여기서 선택적으로 상기 내인성 표적은 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자 또는 AC6mut의 활성화제, 또는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성화제이며;
(e) 상기 (a) 내지 (c) 중 하나의 방법에 있어서, 상기 자극 또는 신호는 생물학적, 광학적, 화학적 또는 약학적 자극 또는 신호를 포함하거나;
(f) 상기 개인, 환자, 또는 대상은 AC6mut의 사후-전사 활성화제, 또는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성화제의 발현을 자극 또는 유도하는 자극 또는 신호가 투여되거나, 또는
(g) 상기 개인, 환자, 또는 대상은 AC6-발현 핵산 또는 유전자의 전사 저해제 또는 사후-전사 억제제의 저해를 억제하거나 유도하는 자극 또는 신호가 투여되는 것이다.
일 구현예에 있어서: 상기 AC6mut, 또는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 조절된 또는 유도성 프로모터의 발현을 유도하는 화학 물질 또는 약학 물질은, 경구 항생제, 독시사이클린(doxycycline) 또는 라파마이신(rapamycin)이거나 이를 포함하며; 또는 독시사이클린을 이용한 tet-조절 시스템이, 상기 AC6mut 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 이의 동등물의 발현을 유도하는 데 사용된다.
일 구현예에 있어서: 상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, 동결건조물(lyophilate), 액체, 젤, 하이드로젤, 분말, 스프레이, 연고, 또는 수성 또는 식염수 제형 내에서 또는 그 형태로서 제형화된다.
일 구현예에 있어서: 상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, 부형제(vesicle), 하이드로젤, 젤, 리포좀, 나노리포좀, 나노입자 또는 나노리피드 입자(NLP)를 포함하거나, 또는 이로서 제형화된다.
일 구현예에 있어서: 상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, 단리되거나 배양된 세포에서 제형화되며, 선택적으로 상기 세포는 포유류 세포, 심장 세포, 또는 인간 세포, 비-인간 영장류 세포, 원숭이 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 기니피그 세포, 토끼 세포, 햄스터 세포, 염소 세포, 소 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포 또는 고양이 세포이다.
일 구현예에 있어서: 상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, 약학 제형 또는 멸균 제형으로서 제형화된다.
일 구현예에 있어서: 상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, 제품, 인공 장기 또는 임플란트와 함께, 이들 상에, 또는 이들과 결합시켜 제형화 또는 전달된다.
일 구현예에 있어서: 상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 동등물은, AC6mut 폴리펩티드를 in vitro 또는 ex vivo 발현한다.
일 구현예에 있어서, 본원은 본 발명의 방법을 실시하는 것을 포함하는, AC6mut-반응 병리학, 감염, 질병, 질환, 또는 상태(condition)에 대해 개인 또는 환자를 치료, 개선, 반전(reversing), 보호 또는 예방하기 위한 방법들을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 방법을 실시하는 것을 포함하는, 개인 또는 이를 필요로 하는 환자의 심장병증 또는 심혈관 질환의 치료, 개선, 반전(reversing), 보호 또는 예방을 위한 방법을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 상기 심장병증 또는 심혈관 질환은: 관상 동맥 질환(CAD); 죽상동맥경화증; 혈전증; 재협착; 혈관염, 자가 면역 또는 바이러스성 혈관염; 결절성 다발 동맥염; 초그-스트라우스 증후군(Churg-Strass syndrome); 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis); 가와사키병(Kawasaki Disease); 리케챠 혈관증(Rickettsial vasculitis); 동맥경화성 동맥류; 심근 비대; 선천성 심질환(CHD); 허혈성 심질환; 협심증; 후천성 판막 또는 심장 내막 질환; 원발성 심근 질환; 심근염; 부정맥; 이식 거부; 대사성 심근 질환; 심근증; 울혈성 심근병증, 비대심근병증 또는 제한심근병증; 및/또는, 심장 이식을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본원은 청구항 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 기재된 바와 같은, AC6mut; AC6mut-발현 핵산 또는 유전자; 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물; 아데노-연관 바이러스(AAV); 재조합 AAV 바이러스 또는 벡터; 아데노바이러스 벡터; 또는 이것의 임의의 슈도타입, 하이브리드 또는 유도체의 약제 제조 시의 용도를 제공하는 것으로,
여기서 선택적으로 상기 AAV 또는 재조합 AAV 바이러스 또는 벡터는 AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9; 히말라야 원숭이 AAV(AAVrh), 또는 AAVrh10; 또는 이것의 임의의 하이브리드 또는 유도체, 또는 AC6mut-발현 세포 또는 심근세포이며,
상기 약제는:
(1) 심장병 또는 심부전을 갖고 있거나 위험을 갖고 있는 대상의 치료;
(2) 심장병,
심부전,
심기능 또는 심박출량의 감소,
심장 감염 또는 심장 질환에 의한 심기능 또는 심박출량의 감소:
에 대한 환자 또는 개인의 치료, 개선, 효과의 반전(reverse), 보호 또는 예방,
(3) 근육세포질세망(SR) Ca2 + 흡수 및/또는 무손상 심근세포에서 감소된 이완 시간을 갖는 증가된 Ca2 + 과도 현상의 증가에 의한 무손상 심근세포(cardiac myocytes)에서의 칼슘 처리 향상,
(4) 심근세포에서 세포내 cAMP 레벨의 생성의 억제,
(5) 세포예정사(세포사멸) 신호로부터 심근세포의 보호, 또는 세포사멸 신호 이후 세포예정사(세포사멸) 신호를 받는 심근세포의 수의 감소,
(6) 심부전 환자 또는 심기능 또는 심박출량의 저하를 야기하는 심장 감염 또는 심장 질환을 갖고 있는 개인에서: 심기능 또는 심박출량 향상, 증상 감소 및/또는 사망률 감소; 또는 심부전에 대한 입원의 빈도 감소;
(7) 심장 질환 또는 심혈관 질환; 또는
(8) 관상 동맥 질환(CAD); 죽상동맥경화증; 혈전증; 재협착; 혈관염, 자가 면역 또는 바이러스성 혈관염; 결절성 다발 동맥염; 초그-스트라우스 증후군(Churg-Strass syndrome); 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis); 가와사키병(Kawasaki Disease); 리케챠 혈관증(Rickettsial vasculitis); 동맥경화성 동맥류; 심근 비대; 선천성 심질환(CHD); 허혈성 심질환; 협심증; 후천성 판막 또는 심장 내막 질환; 원발성 심근 질환; 심근염; 부정맥; 이식 거부; 대사성 심근 질환; 심근증; 울혈성 심근병증, 비대심근병증 또는 제한심근병증; 및/또는, 심장 이식
을 위한 것이다.
일 구현예에 있어서,
(1) 심장 질환, 심부전, 심기능 또는 심박출량의 감소, 심장 감염 또는 심장 질환에 의한 심기능 또는 심박출량의 감소,
(2) 근육세포질세망(SR) Ca2 + 흡수 및/또는 무손상 심근세포에서 감소된 이완 시간을 갖는 증가된 Ca2 + 과도 현상의 증가에 의한 무손상 심근세포(cardiac myocytes)에서의 칼슘 처리 강화,
(3) 심근세포에서 세포내 cAMP 레벨의 생성의 억제,
(4) 세포예정사(세포사멸) 신호로부터 심근세포의 보호, 또는 세포사멸 신호 이후 세포예정사(세포사멸) 신호를 받는 심근세포의 수의 감소,
(5) 심부전 환자 또는 심기능 또는 심박출량의 저하를 야기하는 심장 감염 또는 심장 질환을 갖고 있는 개인에서: 심기능 또는 심박출량 향상, 증상 감소 및/또는 사망률 감소; 또는 심부전에 대한 입원의 빈도 감소;
(6) 심장 질환 또는 심혈관 질환; 또는
(7) 관상 동맥 질환(CAD); 죽상동맥경화증; 혈전증; 재협착; 혈관염, 자가 면역 또는 바이러스성 혈관염; 결절성 다발 동맥염; 초그-스트라우스 증후군(Churg-Strass syndrome); 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis); 가와사키병(Kawasaki Disease); 리케챠 혈관증(Rickettsial vasculitis); 동맥경화성 동맥류; 심근 비대; 선천성 심질환(CHD); 허혈성 심질환; 협심증; 후천성 판막 또는 심장 내막 질환; 원발성 심근 질환; 심근염; 부정맥; 이식 거부; 대사성 심근 질환; 심근증; 울혈성 심근병증, 비대심근병증 또는 제한심근병증; 및/또는, 심장 이식:
을 위하거나 치료에 사용하기 위한, 본원의 어느 방법에 따르거나, 또는 여기에서 기재된 바와 같이 사용되는 치료학적 제형이다.
본원의 하나 또는 그 이상의 구현예의 세부 사항을 첨부한 도면 및 하기 발명의 상세한 설명에서 상세히 설명한다. 본원의 다른 특징, 목적, 및 이점은 발명의 상세한 설명 및 도면, 및 청구 범위로부터 명백할 것이다.
여기서 인용된 모든 출판물, 특허, 특허 출원은 모든 목적에 대하여 참조로서 명확히 통합된다.
도 1은 하기 실시예 1에 상세하게 논의된 바와 같이, 본원의 모범적인 AC6mut의 설계, 발현, 활성 및 세포 분포를 도시한다:
도 1A는 본원의 모범적인 뮤린 AC6mut의 구성에서 C1 도메인(세포내 루프)의 426 위치(위치 숫자는 SEQ ID NO:17에 기반되며, 여기서 SEQ ID NO:16은 D=>A 치환 이전의 서열임)에서 아스파르트산(Asp)에 대한 알라닌(Ala)의 치환 위치(D=>A 치환)를 도시하는 다이어그램을 식적으로 나타내며;
도 1B는 내인성 AC6 및 전이유전자(transgene) AC6mut에 공통된 프라이머를 이용한 qRT-PCR에 의해 평가된 AC6mut mRNA 발현을 그래프로 나타내며;
도 1C는 항-AC5/6 항체를 이용하며 항-AU1 태그 항체를 사용하여 AC6mut 단백질의 면역블롯을 나타내며;
도 1D는 아이소프로테레놀 자극 이전(기저) 및 이후, cAMP 효소 면역분석에 의하여 측정된, AC6mut 및 대조군 마우스로부터 단리된 심세포에서 사이클릭 AMP 생성을 그래프로 나타내며;
도 1E는 항-AU1 항체(적색); 항-카베올린 3(Cav-3) 항체(카베올라에 대하여, 녹색); 항-단백질 이황화물-이성화효소(PDI) 항체(근육세포질세망에 대하여, 녹색); 항-라민 A 항체(핵막에 대하여, 녹색), 및 항-전압 의존성 음이온 선택적 채널 단백질(VDAC) 항체(미토콘드리아 대하여, 녹색)를 이용하여 AC6mut 대 대조군 마우스로부터 단리된 심근세포들에서 AC6mut 단백질의 이중 면역형광 염색을 나타낸 것으로; 핵은 청색이다.
도 2는 하기 실시예 1에 상세하게 논의된 바와 같이, PKA, PKS 및 PDE의 활성 및 발현을 도시한다:
도 2A 상부 그래프는 자극 없이(기저) 또는 아이소프로테레놀 또는 NKH477로 자극된 단리된 심근세포에서 PKA 활성의 레벨을 그래프로 나타내며; 도 2A 하부 도면은 좌심실(LV) 균질 현탁액에서 PKA 단백질을 나타내는 젤 면역블롯을 나타내며;
도 2B는 AC6mut 및 대조군 마우스로부터 좌심실 균질 현탁액을 이용한 주요 시그널링 단백질의 인산화를 나타내는 면역블롯을 나타내며; 인(P) 및 전체(T) PKA 조절 서브유닛 II-a 및 II-b, PKCa, 포스포-디에스테라아제 타입 3A(PDE3A), 포스포-트로포닌 I(P22/23-TnI), 및 전체 TnI를 나타내며;
도 2C는 각 그룹으로부터 단리되어 배양된 심근세포에서 평가된 아이소프로테레놀 자극 이전 및 이후에 RyR2, PLB 및 Tnl의 인산화를 나타내는 면역블롯을 나타내며;
도 2D는 AC6mut 마우스에서 아이소프로테레놀 자극이 심근세포에서 RyR2, PLB, 및 TnI의 증가된 인산화와 관련되었음을 나타내는 도 2C로부터의 데이터를 그래프로 나타내며; 데이터는 로딩을 위해 정규화되었다(GAPDH).
도 3은 하기 실시예 1에서 상세하게 논의된 바와 같이, 좌심실 수축 기능을 그래프로 나타낸다: AC6mut TG 마우스(검은 원)로부터 단리된 심장은 넓은 범위의 아이소프로테레놀 투여량을 통해 아이소프로테레놀 자극에 대한 반응에서 보존된 LV dP/dt을 나타내며; 흰 원은 전이유전자 음성 대조군 마우스를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에서 상세하게 논의된 바와 같이 SR Ca2 + 흡수, Ca2 + 시그널링 단백질, 및 전사 요소를 나타낸다:
도 4A의 상부 그래프는, AC6mut 및 TG 음성 형제(sibling) 대조군 마우스로부터 풀링된(pooled) LV 샘플에서 Ca2 + 흡수 활성을 그래프로 나타내며; 도 4A 하부 그래프는, AC6mut 의 발현은 Ca2 +에 대한 SERCA2a 친화성을 감소시킴을 그래프로 나타내며;
도 4B의 상부 그래프는 감소된 LV 포스포람반(PLB) 발현과 관련된 AC6mut 발현을 그래프로 나타내며; 도 4B 하부 그래프는 증가된 LV CREM-1 단백질 발현과 관련된 AC6mut 발현을 그래프로 나타내며; 도 4B 하부 도면은 단백질 레벨을 나타내는 젤의 면역블롯을 나타내며; 데이터는 로딩을 위하여 정규화되었으며(GAPDH);
도 4C 상부 그래프는 증가된 LV S100A1 단백질 발현과 연관된 AC6mut 발현을 그래프로 나타내며; 도 4C 하부 그래프는 증가된 LV P133-CREB 단백질 발현과 연관된 AC6mut 발현을 그래프로 나타내며; 도 4C 하부 도면은 단백질 레벨을 나타내는 젤의 면역블롯을 나타내며; 데이터는 로딩을 위하여 정규화되었으며(GAPDH);
도 4D는 AC6mut 발현이 ERCA2a, 칼레티쿨린(calreticulin), 칼세퀘스트린(calsequestrin) 또는 포스포-S16-PLB 단백질의 LV 발현에 영향을 미치지 않음을 나타내는 젤의 면역블롯을 나타내며;
도 4E는 항-AU1 항체(적색) 및 항-CREM-1 항체(녹색) 또는 항-AU1 및 항-포스포-CREB(S133, 녹색)을 이용한 AC6mut 및 대조군 마우스로부터 단리된 심근세포에서 AC6mut 단백질의 이중 면역형광 염색을 나타내는 것으로; 핵은 청색을 나타낸다.
도 5는 하기 실시예 1에 상세하게 논의된 바와 같이, AC6mut 및 대조군 마우스로부터 단리된 심근세포에서 사이토졸 Ca2 + 과도 현상을 나타낸다:
도 5A는 AC6mut 및 대조군 간에서 그룹 차이가 없음을 나타내는 방출된 기저 Ca2 +를 나타내는 데이터를 그래프로 나타내며;
도 5B는 아이소프로테레놀로 자극된 심근세포에서 대표 Indo-1 Ca2 + 과도 현상 기록들은 AC6munt 마우스로부터의 심근세포에서 더 높았음을 나타내는 데이터를 그래프로 나타내며; 요약 데이터는 도 5C에 나타났으며;
도 5C는 아이소프로테레놀의 존재 하에 방출된 Ca2 +가 AC6mut 마우스로부터의 심근세포에서 증가되었음을 나타내는 데이터를 그래프로 나타내며;
도 5D는 아이소프로테레놀의 존재 하에 시간-대-피크 Ca2 + 과도 현상이 AC6mut 마우스로부터의 심근세포에서 감소되었음을 나타내는 데이터를 그래프로 나타내며;
도 5E는 아이소프로테레놀의 존재 하에 50% 이완(tau)의 시간이 AC6mut 마우스로부터의 심근세포에서 감소되었음을 나타내는 데이터를 그래프로 나타낸다.
다양한 도면에서 동일한 도면 부호는 동일한 요소를 나타낸다.
본원은 심장병, 감소된 심기능 또는 심박출량, 또는 감소된 cAMP에 대해 반응한 심장 감염 또는 질환, 증가된 근육세포질세망(SR) Ca2 + 흡수 및/또는 in vivo 무손상 심근세포에서 감소된 이완 시간을 갖는 증가된 Ca2 + 과도 현상을 갖는 개인의 치료, 개선 또는 보호(예방 또는 예방법으로서)를 위해 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-결핍(cAMP-incompetent) 아데닐일 사이클라아제 타입 6(AC6) 단백질 또는 폴리펩티드(“AC6mut”라고 불림), 또는 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자의 투여를 포함하는 조성물, 및 in vivo 및 ex vivo 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본원은 세포내 cAMP을 방해하거나 이의 양을 실질적으로 감소시키거나, 또는 세포내 cAMP의 생성을 촉매화하지 않는 AC6mut을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 본원의 상기 AC6mut는, 1) 무손상 심근세포에서의 칼슘 처리 강화, 2) 심근세포에서 세포내 cAMP 레벨의 생성 방해, 및 3) 세포예정사(세포사멸)로부터 심근세포를 보호하는 방식으로 세포내 시그널링을 변경한다. 일 구현예에 있어서, 상기 AC6mut가 환자의 부전 증상을 갖는 심장에서 발현되거나 전달될 경우, 심기능이 향상하고, 증상이 감소하며, 사망률이 감소한다. 따라서, 심장으로의 본원의 상기 AC6mut의 전달은 cAMP 생성으로 인한 유해한 효과 없이 심기능을 향상시킨다. 그러므로, 일 구현예에 있어서, 본원은 심부전 및 심기능 감소에 대한 이상적인 치료법을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 본원은 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 포함하는(이를 함유하는) 발현 매개체(예를 들어, 벡터, 재조합 바이러스 등)의 전달 및 발현(예를 들어, 조절된 발현)을 위한 조성물 및 방법을 제공하며, 이는 AC6mut 단백질이 심근세포에서 선택적으로 발현되거나, 또는 심근세포로만 전달되거나, 또는 그 대신에, 예를 들어, 심혈관 질환의 치료의 경우에서의 심장에서와 같이, 인체에 유익한 효과를 가질 수 있는 혈류 또는 대순환 내부로 방출되도록한다.
일 구현예에 있어서, 본원은 본원의 방법을 실시하기 위한 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자의 in vivo 발현을 위해 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스 등을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 상기 AC6mut 또는 상기 AC6mut 핵산 또는 유전자를 발현하는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스 등은 근육(IM) 주사, 심장 직접 주사, 정맥(IV) 주사, 피하 주사, 흡입, 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템(예를 들어, "유전자 총"이라고 통상 불림) 등을 예를 들어, 외래 환자에게, 예를 들어 외래 방문 동안 전달될 수 있다.
일 실시예에 있어서, AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자(예를 들어, 전달 매개체(예를 들어, 리포좀과 같음), 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스 및 "페이로드"와 같이 이들을 운반하는 기타의 것)는 근세포, 심근세포를 표적으로 하거나 또는 직접 cAMP-결핍 AC 발현, 또는 표적 심장 기관에서 직접적인 발현을 위해 심근세포로 직접 전달된다.
일 구현예에 있어서, 전달의 이러한 "주변(peripheral)" 모드, 예를 들어, 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스 등은, IM 또는 IV로 주입되며, 유전자 또는 핵산이 기관(예를 들어, 심장, 폐 또는 신장) 그 자체에서 직접적으로 발현될 때 접하는 문제를 피할 수 있다. 혈류 또는 대순환에서, 원하는 AC6mut 단백질(들), 또는 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스 등의 지속적인 분비는 또한 주입에 의한 단백질, 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스 등의 투여의 어려움 및 비용을 피하는 것으로, 이것은 많은 단백질, 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스 등에 대하여 특히 문제가 될 수 있고, 이것은 체내에서 매우 짧은 반감기를 나타낸다.
일 구현예에 있어서, 본원은 맞춤형 치료 및 최적의 안전 보험에 있어서 쉽고 효율적으로 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자 발현을 켜고 끌 수 있게 하는 방법을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 심지어 그들의 위치 또는 활동의 위치로부터 거리가 있는(예를 들어, 해부학적으로 멀리 떨어진) 혈액 또는 대순환 내부로 분비되었을 때에도 AC6mut-발현 핵산(들) 또는 유전자(들)에 의하여 발현되는 상기 AC6mut 단백질 또는 단백질은 조직 또는 기관, 예를 들어 심장, 혈관, 폐, 신장, 또는 기타 표적들에 대해 유용하거나 유리한 효과(예를 들어, 치료적 또는 예방적인)를 갖는다.
본원의 일 구현예에 있어서, cAMP-결핍 AC를 인코딩하는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자는 본원의 발명의 방법을 실시하기 위해 사용되며, 예를 들어 심장병, 심부전, 울혈성 심부전(CHF), 심박출량 또는 심기능의 감소, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 일 구현예에 있어서, 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스 등, 예를 들어 장기(long-term) 바이러스 또는 바이러스 벡터는, 예를 들어, 체정맥에서(예를 들어, IV), 또는 근육(IM) 주사, 흡입, 또는 바이오리스틱 입자 전달 시스템(예를 들어, "유전자 총")에 의하여, 예를 들어, 외래 환자에게, 예를 들어 의사의 사무실에서 주입될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 몇 일 또는 몇 주 후(예를 들어, 4 주 후), 상기 개인, 환자 또는 대상에게, AC6mut-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하는 화학 물질 또는 약학 물질이 투여된다(예를 들어, 흡입, 주입 또는 삼킴); 예를 들어, 경구 항생제(예를 들어, 독시사이클린 또는 라파마이신)이 하루에 한 번(또는 그 이상 또는 그 이하) 투여되며, 이것은 상기 유전자의 발현을 활성화할 것이다. 일 구현예에 있어서, 상기 "활성화", 또는 상기 핵산 또는 유전자의 발현의 유인(예를 들어, 유도성 프로모터에 의하여) 이후, AC6mut 단백질은 대상의 순환계(예를 들어, 혈류 내로) 내부로 합성 및 방출되며, 그 후에 유용한 생리학적 효과, 예를 들어, 치료학적 또는 예방적인 효과를 가지며, 이는 개인 또는 환자에게 이득이다(예를 들어, 심기능 이득). 상기 의사 또는 대상이 치료의 중단을 원하는 경우, 상기 대상은 활성화 화학 물질 또는 약학 물질, 예를 들어 항생제의 복용을 단순히 중지한다.
일 구현예에 있어서, 본원의 적용은: 심각한, 저박출량의 심부전의 치료; 폐 고혈압(pulmonary hypertension)의 치료; 보존된 박출률을 갖는 심부전의 치료; 폐 고혈압 및 심부전의 치료를 위해 입원 및 혈관활성(vasoactive) 펩티드의 지속적인 정맥 내 주입을 요하는 현 치료법의 대체 요법; 및, 인체에서 유리한 효과를 증진시키기 위한 AC6mut 또는 AC6mut 핵산 또는 유전자의 발현이 조절된 다른 질병의 치료를 포함한다.
핵산의 생성 및 조작
본원의 방법을 실시하기 위한, 일 구현예에 있어서, 본원은 AC6mut 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 및/또는 재조합 핵산 또는 유전자를 제공한다. 본원의 방법을 실시하기 위한, 일 구현예에 있어서, 본원은 in vivo 발현을 위한 발현 매개체, 예를 들어, 벡터, 예를 들어, AAV, 또는 이것의 임의의 슈도타입, 하이브리드 또는 유도체, 또는 재조합 바이러스의 재조합 형태로, 예를 들어 내부로 절단된, AC6mut-발현 핵산 또는 유전자를 제공한다.
일 구현예에 있어서, 포유류, 예를 들어 인간 또는 뮤린(murine, 쥐과의 동물) AC6mut는 본원을 실시하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 상기 AC6mut는 상기 AC 폴리펩티드의 촉매적 코어에서 하전된 또는 산성의 아미노산이 하전되지 않거나 또는 비-극성의 아미노산에 의해 치환된 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드를 포함한다. 인간 AC6 폴리펩티드(SEQ ID NO:10)의 상기 촉매적 코어[촉매적 영역 1 (C1)이라 불림]는 아미노산 잔기 307에서 675까지이다. 상기 뮤린 AC6 폴리펩티드(SEQ ID NO:11)의 상기 촉매적 코어는 아미노산 잔기 315에서 683까지이다.
일 구현예에 있어서, 상기 하전되지 않거나 비-극성의 아미노산은 알라닌(Ala)이며, 및 선택적으로 상기 산성의 아미노산은 아스파르트산(Asp)이거나, 또는 선택적으로 상기 하전되지 않은 또는 비-극성의 아미노산은 Ala이고 상기 산성의 아미노산은 Asp이다.
일 구현예에 있어서, 본원은 상기 AC 폴리펩티드의 촉매적 코어의 436 위치에서 아스파르트산, 또는 Asp(또는 "D")이 알라닌, 또는 Ala(또는 "A")로 치환된 뮤린 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드를 포함하는 (뮤린) AC6mut 폴리펩티드(SEQ ID NO:12)를 제공한다; 즉, 이러한 구현예에 있어서, 상기 뮤린 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드는 상기 뮤린 AC 폴리펩티드의 촉매적 코어의 436 위치에서, D=>A, 또는 Asp에 대한 Ala의 치환을 갖는다(SEQ ID NO:11는 상기 D=>A 치환 전의 아미노산 서열임).
일 구현예에 있어서, 본원은 상기 AC 폴리펩티드의 촉매적 코어의 426 위치에서 아스파르트산, 또는 Asp(또는 "D")이 알라닌, 또는 Ala(또는 "A")로 치환된(즉, D=>A 치환) 뮤린 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드를 포함하는 (뮤린) AC6mut 폴리펩티드(SEQ ID NO:17)를 제공한다. 상기 SEQ ID NO:17 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12 폴리펩티드의 첫 번째 열 개의 아미노산들 누락된 것이라는 점에서 상기 SEQ ID NO:17 폴리펩티드와 상기 SEQ ID NO:12 폴리펩티드는 상이하다; 그 외에는 상기 폴리펩티드들은 동일하다. SEQ ID NO:16은 상기 D=>A 치환 전의 뮤린 아미노산 서열이다. 상기 아미노 말단이 결여된 동형체는 SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:12의 첫 번째 열 개의 아미노산이 미번역된, 야생형 뮤린 폴리펩티드로 여겨진다.
일 구현예에 있어서, 본원은 상기 AC 폴리펩티드의 상기 촉매적 코어의 428 위치에서 아스파르트산, 또는 Asp(또는 "D")가 알라닌, 또는 Ala(또는 "A")로 치환된 인간 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드를 포함하는 (인간) AC6mut 폴리펩티드(SEQ ID NO:13)를 제공한다; 즉, 이러한 구현예에 있어서, 상기 인간 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드는 상기 인간 AC 폴리펩티드의 상기 촉매적 코어의 428 위치에서, D=>A , 또는 Asp에 대한 Ala의 치환을 갖는다.
인간 AC6 핵산 코딩 서열(SEQ ID NO:14) 대(vs) 뮤린 코딩 서열: 86% 상동성(SEQ ID NO:15). 아미노산 레벨에서 인간 AC6 폴리펩티드(SEQ ID NO:10) 대(vs) 뮤린 AC6 폴리펩티드(SEQ ID NO:11): 94% 상동성.
상기 AC6mut D => A 치환은 하기 나타낸 바와 같이, 뮤린 AC6mut에서와 같이 상기 인간 AC6mut의 촉매적 코어에서 정확히 동일한 상대적 구조적 위치에 있다(하기 밑줄친 바와 같이, 상기 야생형은 아스파르트산, 또는 "D" 잔기를 여전히 갖고 있는 것을 나타냄):
Figure pct00001
Figure pct00002
일 구현예에 있어서, 하기 나타낸 바와 같이, 상기 인간 ACmut 핵산 코딩 서열(SEQ ID NO:13) 및 상기 뮤린 ACmut 핵산 코딩 서열(SEQ ID NO:12) 모두 아데노신(또는 “A”)을 사이토신(또는 “C”)으로 변경함으로써 제조되었으며, "C"로 변경 이전의 상기 "A" 잔기는 하기에 밑줄이 그어져 있으며; 예를 들어, 하기 나타낸 것은 야생형 인간 AC6(SEQ ID NO:10) 및 야생형 뮤린 AC6(SEQ ID NO:11)이다:
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
일 구현예에 있어서, 본원의 핵산은 제조되었으며, 예를 들어, cDNA 라이브러리의 클로닝(cloning) 및 발현, PCR 등에 의한 메시지 또는 유전체 DNA의 증폭에 의해 제조, 단리 및/또는 조절되었다. DNA, RNA, iRNA, 안티센스 핵산, cDNA, 유전체 DNA, 벡터, 바이러스 또는 이것의 하이브리드를 포함하는, 이러한 본원을 실시하는 데 사용된 상기 핵산 및 유전자는, 다양한 소스로부터 단리될 수 있고, 유전적으로 설계될 수 있으며, 증폭될 수 있고, 및/또는 발현되고/재조합으로 생성될 수 있다. 이러한 핵산으로부터 생성된 재조합 폴리펩티드(예를 들어, 이러한 본원을 실시하는 데 사용된 cAMP-결핍 AC 키메라 단백질)는 개별적으로 단리되거나 클로닝되거나 원하는 활성을 위하여 테스트될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 포유류, 효모, 곤충 또는 식물 세포 발현 시스템 또는 발현 매개체를 포함하는, 임의의 재조합 발현 시스템이 사용될 수 있다.
대안적으로, 이러한 본원을 실시하는 데 사용되는 핵산은, 예를 들어, Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; 미국 특허 출원번호 4,458,066에 기재된 바와 같은, 잘 알려진 화학적 합성 기술에 의하여 in vitro로 합성될 수 있다.
이러한 본원을 실시하는 데 사용되는 핵산의 조절을 위한 기술, 예를 들어, 서브 클로닝, 표지 프로브[예를 들어, Klenow 중합효소, 틈(nick) 번역, 증폭을 이용한 랜덤-프라이머 표지 프로브], 서열결정, 하이브리드화 등은, 과학 문헌 및 특허 문헌, 예를 들어, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)에서 잘 기술되어있다.
본원의 방법을 실시하는 데 사용되는 핵산을 수득하고 증폭하는 다른 유용한 수단은 유전체 샘플들로부터 클로닝하는 것이며, 만약 원하는 경우, 예를 들어, 유전체 클론들 또는 cDNA 클론들로부터 단리 또는 증폭된 삽입물들은 스크리닝하고 재-클로닝하는 것이다. 본원의 방법에서 사용되는 핵산의 소스들은, 예를 들어, 포유류 인공 염색체들(MACs), 참조로, 예를 들어, 미국 특허 출원번호 5,721,118; 6,025,155; 인간 인공 염색체들, 참조로, 예를 들어, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335; 이스트 인공 염색체들(YAC); 박테리아 인공 염색체들(BAC); P1 인공 염색체들, 참조로, 예를 들어, Woon (1998) Genomics 50:306-316; P1-유래 벡터들(PACs), 참조로, 예를 들어, Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; 코스미스들, 재조합 바이러스들, 파아지들 또는 플라스미드들에 함유된 유전체 또는 cDNA를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본원의 방법을 실시하기 위해, AC6mut 융합 단백질들 및 이들을 인코딩하는 핵산들이 사용된다. 임의의 AC6mut 폴리펩티드가 이러한 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 AC6mut 단백질은, 폴리펩티드가 심근세포와 같은, 원하는 세포 타입을 표적으로 하기 위한 펩티드와 같은, 이종 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 단백질에 결합 또는 융합된 이종 펩티드 또는 폴리펩티드는 형광 검출, 향상된 안정성 및/또는 단순한 정제와 같은, 원하는 특성을 부여하는 N-말단 확인 펩티드가 될 수 있다. 본원을 실시하는 데 사용되는 펩티드들 또는 폴리펩티드들은 또한 더 많은 면역성 펩티드 생성을 위해 여기에 결합된 하나 또는 그 이사의 추가적인 도메인들을 갖는 융합 단백질로서 합성 또는 발현될 수 있어 재조합으로 합성된 펩티드를 더 쉽게 단리하고, 그리고 항체들 및 항체-발현 B 세포들 등을 확인 및 단리할 수 있다. 도메인을 용이하게 하는 검출 및 정제는 예를 들어, 고정된 금속에서 정제를 가능하게 하는 폴리히스티딘 트랙 및 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이팅 펩티드들, 고정된 면역글로불린에서 정제를 가능하게하는 단백질 A 도메인들, 및 상기 FLAGS 확장/친화 정제 시스템(Immunex Corp, Seattle WA)에서 활용된 상기 도메인을 포함한다. 정제 도메인 및 정제를 용이하게 하는 상기 모티프-함유 펩티드 또는 폴리펩티드 사이에 Xa 인자 또는 엔테로키나아제(Invitrogen, San Diego CA)와 같은 절단 가능한 링커 서열을 포함한다. 예를 들어, 발현 벡터는 티오레독신 및 엔테로키나아제 절단 위치가 뒤를 잇는 6 개의 히스티딘 잔기들에 연결된 에피토프-인코딩 핵산 서열을 포함할 수 있다[Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414 참조]. 상기 엔테로키나아아제 절단 위치가 상기 융합 단백질의 나머지로부터 에피토프를 정제하기 위한 수단을 제공하며 상기 히스티딘 잔기들은 검출 및 정제를 용이하게 한다. 융합 단백질들을 인코딩하는 벡터들에 관련된 기술 및 융합 단백질들의 적용은 과학 문헌 또는 특허 문헌, 예를 들어, 참고 Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53에 잘 기술되어 있다.
본원을 실시하는 데 사용되는 핵산 및 핵산 서열, 예를 들어, AC6mut-인코딩 핵산들은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 단편, 단일-가닥 또는 이중-가닥이 될 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 유전체 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 폴리펩티드 핵산(PNA), 또는 임의의 기원에서 천연 또는 합성된 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질이 될 수 있다. 본원을 실시하는 데 사용되는 화합물들은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 단편을 포함하는 "핵산" 또는 "핵산 서열"을 포함하며; 및 단일-가닥 또는 이중-가닥이 될 수 있는 유전체 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA, iRNA)를 포함하며; 및 센스 또는 안티센스 가닥, 또는 펩티드 핵산(PNA), 또는 예를 들어, iRNA, 리보핵산단백질들(예를 들어, 이중가닥 iRNAs, 예를 들어, iRNPs)을 포함하는, 기원에서 천연 또는 합성인 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사물질이 될 수 있다. 본원을 실시하는 데 사용되는 화합물들은, 천연 뉴클레오티드의 알려진 유사체를 함유하는, 핵산, 즉, 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원을 실시하는 데 사용되는 화합물들은, 합성 백본들(backbones)을 갖는 핵산-유사 구조를 포함하며, 참조는 예를 들어, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156이다. 본원을 실시하는 데 사용되는 화합물들은 화학적으로 합성될 수 있는 단일 가닥 폴리디옥시뉴클레오티드 또는 두 개의 상동인 폴리디옥시뉴클레오티드 가닥들을 포함하는 "올리고뉴클레오티드"를 포함한다. 본원을 실시하는 데 사용되는 화합물들은 5' 인산염을 가지지 않는 합성 올리고뉴클레오티드를 포함하므로 키나아제의 존재 하에서 ATP와 인산염의 첨가 없이 다른 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않는다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈인산화 되지 않은 절편과 연결될 수 있다.
대안적인 측면에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 화합물은 AC6mut 폴리펩티드의 제조에 관련된 유전자들 또는 DNA의 임의의 절편을 포함한다; 적용 가능한 곳에, 개별 코딩 절편(엑손) 사이에 중간 서열(인트론)뿐만 아니라 상기 코딩 영역의 이전 및 이후의 영역들을(리더 또는 트레일러) 포함한다. "작동 가능하게 연결된" 것은 둘 이상의 핵산(예를 들어, DNA) 절편 사이의 기능적 관계를 나타낼 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 이것은 전사된 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 만약 이것이 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극 또는 조절한다면, 프로모터는 본원을 실시하는 데 사용되는 핵산과 같은, 상기 코딩 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 프로모터 전사 조절 서열은 그들이 전사된 서열에 물리적으로 근접할 수 있는, 즉 시스-활성화될 수 있는 상기 전사된 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 인핸서와 같은, 전사 조절 서열은 그들이 전사를 향상시키는 코딩 서열에 물리적으로 근접하거나 밀접하게 위치할 필요가 없다.
대안적인 측면에 있어서, 본원은 본원을 실시하는 데 사용되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 "발현 카세트(expression cassettes)"의 사용을 포함하며, 이것은 핵산, 예를 들어, 이러한 서열과 호환되는 숙주에서 구조적 유전자 또는 전사(예를 들어, AC6mut 단백질을 인코딩)의 발현에 영향을 줄 수 있다. 발현 카세트는 적어도 폴리펩티드 코딩 서열 또는 억제 서열과 작동적으로 연결되는 프로모터를 포함할 수 있으며; 일 측면에서는, 다른 서열, 예를 들어 전사 종결 신호와 작동적으로 연결되는 프로모터를 포함할 수 있다. 발현에 영향을 주는데 필요하거나 도움을 주는 추가적인 인자들, 예를 들어 인핸서가 또한 사용될 수 있다.
대안적인 측면에 있어서, 본원은 본원을 실시하는 데 사용되는 발현 카세트는 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 재조합 "네이키드 DNA" 벡터의 임의의 형태 등을 포함한다. 대안적인 측면에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 "벡터"는 세포를 감염, 형질 주입, 일시적 또는 영구적으로 형질에 도입할 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 벡터는 네이키드 핵산, 또는 단백질 또는 지질과 복합된 핵산을 포함할 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 벡터는 바이러스 또는 박테리아성 핵산 및/또는 단백질, 및/또는 막(예를 들어, 세포막, 바이러스 지질막 등)을 포함할 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 벡터는 DNA의 단편이 부착되거나 및 복제될 수 있는 레플리콘(예를 들어, RNA 레플리콘, 박테리오파지)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 따라서, 벡터는 RNA, 자율 자가-복제 원형 또는 선형 DNA 또는 RNA(예를 들어, 플라스미드, 바이러스 등; 예를 들어 미국 특허 출원번호 5,217,879참조)를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 발현 또는 비-발현 플라스미드 모두를 포함할 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 상기 벡터는 자율적 구조와 같이 체세포분열 동안 세포에 의해 안정하게 복제될 수 있거나 숙주의 유전자 내부로 혼입될 수 있다.
대안적인 측면에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 "프로모터"는 세포, 예를 들어 심장, 폐, 근육, 신경 또는 뇌세포와 같은 포유류 세포에서 코딩 서열의 전사를 구동할 수 있는 모든 서열을 포함한다. 그러므로, 본원의 구조물에 사용되는 프로모터는 유전자의 전사 시기 및/또는 속도를 제어 또는 조절하는데 관련된 시스-활성화 전사 조절 요소 및 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원을 실시하는 데 사용되는 프로모터는 시스-활성화 전사 조절 요소가 될 수 있으며, 이것은 전사 조절에 관련된 인핸서, 프로모터, 전사 종결자, 복제의 기원, 염색체 통합 서열, 5' 및 3’ 미번역 부위, 또는 인트론 서열을 포함한다. 이러한 시스-활성화 서열은 일반적으로 단백질 또는 다른 생물분자들과 전사를 수행[턴 온/오프(turn on/off), 제어, 조절, 등]하기 위해 상호 작용한다.
일 구현예에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 "구성적" 프로모터는 개선 또는 세포 분화에서 대부분의 환경적 조건 또는 상태 하에 발현을 연속적으로 구동하는 것들이 될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 "유도성" 또는 "조절성" 프로모터는 환경 조건, 투여된 화학 물질, 또는 개선 조건의 영향 하에서 본원의 핵산의 발현을 지시할 수 있다.
아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달
일 구현예에 있어서, 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은 아데노-연관 바이러스(AAV); 재조합 AAV 바이러스, 벡터 또는 비리온; 또는 아데노바이러스 벡터이거나 또는 포함한다. 일 구현예에 있어서, 상기 AAV, 재조합 AAV 바이러스 또는 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터는 AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 또는 AAV9; 히말라야 원숭이 AAV((AAVrh), 또는 AAVrh10; 또는 임의의 슈도타입, 이들의 하이브리드 또는 유도체이거나 포함한다.
일 구현예에 있어서, 이러한 임의의 벡터(또는 본원의 임의의 전달 매개체)는 특정 세포, 조직 또는 기관을 지향(tropic)하거나 이들로의 특이적 전달을 위해 설계된다. 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 AAV(또는 본원을 실시하는 데 사용되는 임의의 벡터 또는 전달 매개체)는 심장을 지향[또는 지향성(tropism)을 갖음]한다. 일 구현예에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 AAV(또는 본원을 실시하는 데 사용되는 임의의 벡터 또는 전달 매개체)는 지향하거나, 또는 다른 조직 또는 기관, 예를 들어 간을 지향하거나 이들로의 특이 수송을 위해 설계되었다. 일 구현예에 있어서, IM 또는 IV로 주입되는, 전달의 "주변(peripheral)” 모드, 예를 들어, 전달 매개체, 벡터, 재조합 바이러스 등은, 유전자 또는 핵산 자체가 장기 내에서 직접적으로 발현될 때 맞닥뜨리는 문제들을 회피할 수 있다. 예를 들어, AAV5, AAV6, 및 AAV9는 심장을 지향하는 것으로 밝혀졌으며, 예를 들어 Fang et al., Hum Gene Ther Methods 2012 Oct 17; Zincarelli, et al., Clin Transl Sci. 2010 Jun;3(3):81-9을 참고하라.
본원을 실시하는 데 사용되는 아데노-연관 바이러스(AAV)는 작은, 비-외피성의, 단일 가닥 DNA 동물 바이러스의 파르보바이러스 패밀리(Parvoviridae family)의 임의의 비병원성 멤버일 수 있다. AAV는 복제를 위해 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스)를 필요로 하므로, 본원을 실시하는 데 사용되는 AAV는 대상에게 투여 시 복제하지 않는다. AAV는 비교적 넓은 부위의 세포 유형들을 감염시키며 특히 아데노바이러스와 같은, 다른 바이러스와 비교하여 약한 면역 반응을 자극한다. 본원을 실시하는 데 사용되는 AAV 혈청형은, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12를 포함한다. 본원을 실시하는 데 사용되는 AAV는; 예를 들어, 조류(예를 들어, 조류의 AAV, 또는 AAAV), 소(예를 들어, 소의 AAV, 또는 BAAV), 개, 말, 양 및 돼지를 포함하는 다른 동물들로부터 나온 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용되는 AAV 벡터는 적어도 상기 AAV의 한 부분이 이종의 핵산 분자에 의해 치환된 재조합 핵산 분자이다; 하나의 벡터는 예를 들어, 바이러스 복제 및 캡시드 유전자를 제거함으로써, AAV 유전체 DNA의 약 4.7 킬로베이스(kb)를 치환할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 이종의 핵산 분자는 각 말단에서 AAV 뒤집힌 말단 반복(interted terminal repeats, ITRs)에 의하여 측면에 위치한다. 상기 ITRs는 복제의 기원으로서 역할을 하며 클로닝 벡터, 및 패키징으로부터 구조, 통합, 절단에 필요한 시스 활성화 요소를 포함한다. 일 구현예에 있어서 본원의 실시에 사용되는 AAVs는 발현을 조절하기 위해 이종의 핵산 분자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다.
AAV 벡터는 AAV 비리온을 수득하기 위해 세포에서 발현된 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 기능의 도움과 함께 in vitro로 AAV 캡시드로 패키징될 수 있다. AAV 비리온의 상기 혈청형 또는 세포 지향성(tropism)은 상기 바이러스 캡시드 단백질의 특성에 의해 수여된다. AAV 벡터 및 AAV 비리온은 분할 및 비-분할 세포 모두를 포함하는 세포를 능률적으로 형질 도입 시킨다. AAV 벡터 및 비리온은 안전하며 다양한 세포 유형에서 장기적인 in vivo 지속성 및 발현을 이끄는 것으로 밝혀졌다.
일 구현예에 있어서, ITRs는 AC6mut-인코딩 핵산 분자의 5' 말단으로 결합되며, ITRs는 AC6mut-인코딩 핵산 분자의 3' 말단으로 결합된다. ITRs의 예들은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAAV, BAAV, 및 본 분야의 당업자에게 공지된 다른 AAV ITRs을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에 있어서, AAV ITR은 AAV2 ITR, AAV5 ITR, AAV6 ITR, 및 BAAV ITR로부터 선택된다. 일 구현예에 있어서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일 구현예에 있어서, AAV ITR은 AAV5 ITR이다. 일 구현예에 있어서, AAV ITR은AAV6 ITR이다. 일 구현예에 있어서, AAV ITR은 BAAV ITR이다.
일 구현예에 있어서, 본원의 실시에 사용되는 AAV 벡터(및 다른 벡터, 재조합 바이러스 등)는 발현 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 리프레서, 리보좀 결합 위치, RNA 절단 위치, 폴리아데닐화 위치, 전사 종결 서열, 및 microRNA 결합 서열과 같은 다른 서열을 포함한다. 프로모터의 예는, p5, p19 또는 p40 프로모터, 아데노바이러스 주요 사후 프로모터(adenoviral major later promoter)와 같은 AAV 프로모터, 사이토메갈로바이러스(cyromegalovirus CMV) 프로모터, 유두종 바이러스 프로모터, 폴리오마(polyoma) 바이러스 프로모터, 호흡기세포융합 바이러스(RSV) 프로모터, 육종 바이러스 프로모터, SV40 프로모터, 기타 바이러스 프로모터, 액틴 프로모터, 아밀라아제 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 칼리크레인(kallikrein) 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, 열 충격(heat shock) 프로모터, 내인성 프로모터, 라파마이신 또는 기타 소형 분자에 의하여 조절된 프로모터, 다른 세포성 프로모터, 및 당업계에 알려진 다른 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일 구현예에 있어서, 상이한 혈청형의 AAV 벡터(이러한 벡터 내에 상기 ITRs의 혈청형에 의해 결정된 바와 같음)가, 예를 들어, AAV1 벡터, AAV2 벡터, AAV3 벡터, AAV4 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV8 벡터, AAV9 벡터, AAV10 벡터, AAV11 벡터, AAV 12 벡터, AAAV 벡터, 및 BAAV 벡터에 사용된다. 일 구현예에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV2 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터 또는 BAAV 벡터로 사용된다.
일 구현예들에 있어서, 키메라, 뒤섞인(shupffled) 또는 캡시드-변형 AAV 유도체는 바이러스 벡터에 대해 하나 또는 그 이상의 원하는 기능성을 제공하기 위해 사용된다. 구현예들에 있어서, 이러한 유도체들은 천연 발생 AAV 유전체를 포함하는 AAV 바이러스 벡터와 비교하여 유전자 전달의 향상된 효율성, 감소된 면역원성(인간 또는 세포), 변형된 지향성 범위 및/또는 개선된 특정 세포 유형의 표적화를 나타낼 수 있다. 구현예들에 있어서, 유전자 전달의 향상된 효율성은 세포 표면에 결합한 개선된 수용체 또는 공동-수용체, 개선된 내재화, 개선된 세포 및 핵 내부로 물질수송(trafficking), 바이러스 입자의 개선된 비코팅 및/또는 단일-가닥 유전자에서 이중-가닥 형태로 개선된 전환에 의해 달성된다. 구현예들에 있어서 변형된 지향성 범위 또는 특이 세포 집단의 표적화는 향상된 효율성을 야기하여, 벡터 투여량이 투여를 원하지 않는 조직에 투여되어 희석되지 않는다.
일 구현예에 있어서, 캡시드-프리 AAV 벡터는 예를 들어, 미국 특허 출원번호 20140107186에 기재된 바와 같이 사용된다. 일 구현예에 있어서, 심장- 또는 간-지향인 AAV9 벡터는 예를 들어, 미국 특허 출원번호 20140056854에 기재된 바와 같이 사용된다. 일 구현예에 있어서, 예를 들어, 미국 특허 출원번호 20130310443; 20130136729에 기재된 AAV 벡터는 본원의 실시에 사용된다.
일 구현예에 있어서, AAV 벡터는, 예를 들어 미국 특허 출원번호 20120220492에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 상기 바이러스의 상기 지향성 또는 상기 특징들을 변화시키기 위해 예를 들어 개선 또는 변화된 성능에 대해 슈도타입이 된다. 예를 들어, 특이적 또는 개선된 표적화는 상기 전달 매개체(예를 들어, AAV 바이러스 입자)가 감염되도록 유도된 세포들에게만 치료 핵산(예를 들어, AC6mut)을 감염 또는 전달하도록 하여 유전자 치료로부터 원치않는 부작용의 위험을 감소시키며 유전자 치료의 효율성을 향상시킨다.
일 구현예에 있어서, 상기 바이러스 벡터의 투여량은 치료되는 환자의 상태, 나이, 몸무게 및 건강과 같은 조건과 같은 요소에 의해 결정되며, 환자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터의 치료적으로 유효한 인간의 투여량은 일반적으로 약 1 x109 내지 1 x1016의 게놈 바이러스 벡터의 농도를 함유하는 용액의 약 0.1 ml 내지 약 100 ml의 범위이다. 대형 기관(예를 들어, 간, 근육, 심장 및 폐)으로의 전달을 위한 예시적인 인간의 투여량은 약 1 내지 100 mL의 부피, 1 kg 당 약 5 x 1010 내지 5 x 1013 AAV 게놈이 될 수 있다. 상기 투여량은 임의의 부작용에 대하여 치료적인 이익의 균형을 조절하며 이러한 투여량은 상기 제조합 벡터가 사용되는 치료적 적용에 따라 달라질 수 있다. 트랜스유전자의 발현의 레벨은 예를 들어, AAV 벡터인 바이러스 벡터를 야기하는 투여량의 빈도를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다.
제형화
일 구현예에 있어서, 본원은 심근세포에서 AC6mut의 in vivo 전달 및 발현을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 이러한 조성물은 이러한 목적들을 위해 제형화된 AC6mut-인코딩 핵산, 예를 들어, 버퍼 내에서, 식염수 내에서, 분말에서, 에멀젼에서, 부형제에서, 리포좀에서, 나노입자에서, 나노리포입자 등에서 제형화된 발현 매개체 또는 AC6mut-인코딩 핵산을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 임의의 방식으로 제형화될 수 있으며 원하는 in vivo 또는 ex vivo 투여 방법 등을 포함하는 원하는 in vivo 또는 ex vivo 조건에 따라 다양한 농도 및 형태로 적용될 수 있다. in vivo 또는 ex vivo 제형화 및 투여에 대한 상세 기술은 과학 문헌 또는 특허 문헌에 잘 기술되어 있다.
본원의 실시에 사용되는 상기 AC6mut-인코딩 핵산의 제형 및/또는 담체(carrier)는 당업계에 잘 알려져 있다. 본원의 실시에 사용되는 제형 및/또는 담체는 정제, 환제, 분말, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등과 같은, in vivo 또는 ex vivo 적용에 대하여 적합한 형태가 될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본원의 실시에 사용되는 AC6mut-인코딩 핵산은 수용액 및/또는 버퍼 용액 또는 예를 들어, 소듐 카복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(hydroxypropylmethylcellulose), 소듐 알지네이트(sodium alginate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 검 트리가칸스(gum tragacanth) 및 검 아카시아(gum acacia)와 같은 현탁제, 및, 자연적으로 발생하는 인지질(예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합체(예를 들어, 헵타데카에틸렌 옥시세타놀), 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노-올레이트), 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노-올레이트)와 같은 분산액(dispersing) 또는 습윤제(wetting agents)를 포함하는, 수성 현탁액 또는 버퍼 현탁액과 혼합될 수 있다. 상기 수성 현탁액은 또한 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트와 같은 하나 이상의 방부제를 포함할 수 있다. 제형들은 예를 들어, 적합한 버퍼를 사용함으로써, 삼투압에 대해 조정될 수 있다.
본원의 실시에 있어서, 본원의 상기 화합물들(예를 들어, 제형들)은 약학적으로 허용된 담체, 예를 들어, 물 및 Ringer's 수용액, 등장성(isotonic) 소듐 클로라이드를 포함하여 사용될 수 있는 사용 가능한 부형제 및 용매에 용해된 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자의 수용액을 포함할 수 있다. 또한, 멸균 고정유(fixed oil) 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위한 임의의 고정유는 합성 모노- 또는 다이글리세라이드, 또는 올레산과 같은 지방산을 포함하여 사용될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 본원의 실시에 사용되는 용액 또는 제형은 멸균되며 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 없도록 제조될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 용액 및 제형은 ?통적인 주지의 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다.
본원의 실시에 사용되는 상기 용액 및 제형은 pH 조정 및 완충제, 독성 조절제, 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 락테이트 등과 같이 적합한 생리학적 조건에 요구되는 것과 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 이러한 제형들에서 활성제(active agent, 예를 들어, AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자)의 농도는 광범위하게 변화할 수 있으며, 및 선택된 in vivo 또는 ex vivo 투여의 특정 모드 및 원하는 결과, 예를 들어, in vivo AC6mut 발현의 증가에 따라, 유체의 부피, 점도 등에 기반하여 우선적으로 선택될 수 있다.
본원의 실시에 사용되는 상기 용액 또는 제형은 동결건조될 수 있다; 예를 들어, 본원은 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 함유하는 안정한 동결 건조 제형을 제공한다. 일 측면에서, 이러한 제형은 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자 및 증량제(bulking agent), 예를 들어, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 및 수크로오스 또는 이것의 혼합물을 함유하는 용액을 동결 건조함으로써 제조된다. 안정한 동결 건조 제형의 제조를 위한 방법은 약 2.5 mg/mL의 단백질, 약 15 mg/mL의 수크로오스, 약 19 mg/mL의 NaCl, 및 5.5 보다 크지만 6.5보다 낮은 pH를 갖는 소듐 시트레이트 버퍼의 동결 건조 용액을 포함할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 출원번호 20040028670를 참조하라.
본원의 상기 조성물 및 제형은 리포좀(하기 논의 또한 참조)의 사용에 의하여 전달될 수 있다. 리포좀, 특히 리포점 표면이 표적 세포, 예를 들어 심근세포에 특이적인 리간드를 나르는 리포좀을 사용함으로써 특이 조직 또는 기관 타입, 예를 들어, 심장에 우선적으로 전달하며, 이것은 in vivo 또는 ex vivo 적용에서, 표적 세포, 예를 들어 심근세포 내로의 상기 활성제의 전달에 집중할 수 있다.
나노입자, 나노리포입자 및 리포좀
본원은 예를 들어, in vivo 또는 ex vivo에서 AC6mut 또는 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 심근세포로 전달하기 위해 본원을 실시하기 위해 사용되는 화합물들(예를 들어, AC6mut 또는 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자)을 포함하는 나노입자, 나노리포입자, 부형제 및 리포좀 막을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 이러한 조성물은 예를 들어, 포유류 심장 세포, 심근세포 등의 원하는 세포 유형을 표적으로 하기 위해, 세포 표면 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 같은, 생물 분자를 포함하는, 특이 분자를 표적으로 하도록 설계된다.
본원은 본원을 실시하는데 사용되는 화합물, 예를 들어, Park, et al., 미국 특허 출원번호 20070082042에 기재된 것과 같은 것을 포함하는 다층 리포좀을 제공한다. 상기 다층 리포좀은 약 200 내지 5,000 nm의 입자 크기로, 예를 들어, cAMP-결핍 AC-인코딩 핵산 또는 유전자를 가두기 위해, 스쿠알렌류, 스테롤류, 세라마이드류, 중성 지질류 또는 오일류, 지방산류 또는 레시틴류를 포함하는 오일-상 성분의 혼합물을 이용하여 제조될 수 있다.
리포좀은 예를 들어, Park, et al., 미국 특허 출원번호 20070042031에 기술된 것과 같은, 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 이는 활성제(예를 들어, AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자)를 인캡슐레이션 함으로써 리포좀을 제조하는 방법을 포함하고, 이 방법은 제 1 저장소(first reservoir) 형태로 수용액을 제공하고; 제 2 저장소(second reservoir) 형태로 유기 지질 용액을 제공한 후 제 1 혼합 영역(first mixing region)에서 상기 수용액과 상기 유기 지질 용액을 혼합하여 리포좀 용액을 제조하고, 여기서 상기 유기 지질 용액은 상기 수용액과 혼합하여 실질적으로 즉각 상기 활성제를 인캡슐레이션하는 리포좀을 제조하며; 그 후 즉시 상기 리포좀 용액을 버퍼 용액과 혼합하여 희석된 리포좀 용액을 제조하는 것을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본원의 실시에 사용되는 리포좀 조성물은 예를 들어, 미국 특허 출원번호 20070110798에 기재된 것과 같이, 예를 들어, 본원의 실시에 사용되는 화합물을 원하는 세포 유형으로의 전달을 표적화 하기 위해, 치환된 암모늄 및/또는 폴리음이온을 포함한다.
본원은 또한 예를 들어, 미국 특허 출원번호 20070077286에 기재된 바와 같이, 활성제-함유 나노입자의 형태(예를 들어, 2 차 나노입자)로, 본원의 실시에 사용되는 화합물(예를 들어, AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자)를 포함하는 나노입자를 제공한다. 일 구현예에 있어서, 본원은 본원의 지방-용해 활성제 또는 2가 또는 3가의 금속 염과 함께 작용하는 지질 용해 수용성 활성제를 포함하는 나노입자를 제공한다.
일 구현예에 있어서, 고체 지질 현탁액은 예를 들어, 미국 특허 출원번호 20050136121에 기재된 바와 같이, in vivo 또는 ex vivo에서 포유류 세포로 본원을 실시하는데 사용되는 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 제형화하고 전달하기 위해 사용될 수 있다.
전달 매개체
대안적인 구현예들에 있어서, 임의의 전달 매개체는, 예를 들어, in vivo 또는 ex vivo에서 본원의 방법을 실시하기 위한 AC6mut 또는 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 전달하기 위해 본원의 방법 또는 조성물을 실시하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리양이온(polycations), 양이온 중합체(cationic polymers) 및/또는, 폴리에틸렌이민 유도체와 같은 양이온 펩티드(cationic peptides)를 포함하는 전달 매개체는, 예를 들어, 미국 특허 출원번호 20060083737에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 건조된 폴리펩티드-계면활성제 복합체는 본원의 조성물을 제형화하는 데 사용되며, 계면활성제는 예를 들어, 미국 특허 출원번호 20040151766에 기재된 바와 같이 비-공유결합을 통해 핵산과 연관된다.
일 구현예에 있어서, 본원의 실시에 사용되는 핵산은 예를 들어, 미국 특허 출원번호 7,413,739에 기재된 바와 같이, 고분자 하이드로젤류 또는 수용성 공중합체류로서 세포에 적용될 수 있다; 예를 들어, 핵산은 친핵체 첨가에 의한 강한 친핵체 및 불포화 공액 결합 또는 불포화 공액 그룹 사이의 반응을 통해 중합될 수 있으며, 각각의 전구체 성분은 적어도 두개의 강한 친핵체 또는 적어도 두 개의 불포화 공액 결합 또는 불포화 공액 그룹을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 핵산은 예를 들어, 미국 특허 출원번호 7,306,783; 6,589,503에 기재된 바와 같이, 부형제와 함께 세포 막-투과 펩티드 접합체를 이용하여 세포에 적용된다. 일 측면에서, 상기 핵산 그 자체는 세포막-투과 펩티드와 결합된다. 일 구현예에 있어서, 핵산 및/또는 상기 전달 매개체는 예를 들어, 수송-매개 펩티드는 강한 염기성이며 폴리-포스포이노시티드(poly-phosphoinositides)에 결합하는 것을 기술하는, 미국 특허 출원번호 5,846,743에 기재된 바와 같이, 수송-매개 펩티드에 결합된다.
일 구현예에 있어서, 전기-투과화(electro-permeabilization)는 예를 들어, 미국 특허 출원번호 7,109,034; 6,261,815; 5,874,268에 기재된 바와 같이, 임의의 전기천공법 시스템(electroporation system)을 사용하여, AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 세포에 전달하기 위한 주요 또는 보조 수단으로서 사용된다.
in vivo 세포 이식
일 구현예에 있어서, 본원의 방법들은 또한 본원의 실시에 사용되는 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 포함하거나 발현하는 세포, 예를 들어 심장 또는 심근세포를 이식하거나 병합(engrafting)하는 것을 포함한다. 일 측면에서, 본원의 방법들은 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 혈관, 조직, 또는 기관, 예를 들어 심장 또는 심근세포에 ex vivo 또는 in vivo 로 이식 또는 병합 하는 것을 포함하거나, 또는 이를 필요로 하는 개인에서 재-프로그램된 분화된 세포를 이식 또는 병합하는 것을 포함한다.
세포는 본원의 상기 조성물들 및/또는 방법들을 이용하여 처리된 개인으로부터 제거될 수 있으며, 임의의 알려진 기술 또는 프로토콜을 이용하여, 조직, 기관 또는 개인에게 재주입(예를 들어, 주입 또는 병합)될 수 있다. 예를 들어, 역-분화 재-프로그램된 세포류, 줄기세포류, 또는 재-프로그램된 분화 세포류는, 예를 들어, 미국 특허 출원번호 7,442,389에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 마이크로스피어를 이용하여, 재-이식(예를 들어, 주입 또는 병합)될 수 있다; 예를 들어, 일 측면에 있어서, 상기 세포 담체는 혼합 및 전달 시스템과 이러한 세포들을 포함하는 자가유래의 담체(autologous carrier) 내부로 미리 로딩된 둥글고 매끄러운 폴리메틸메타크릴레이트 미세입자를 포함하는 증량제를 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 상기 세포는 예를 들어, 미국 특허 출원번호 20050027070에 기재된 바와 같이, 생체적합성 가교 매트릭스 형태로 조직, 기관, 예를 들어 심장, 및/또는 이를 필요로 하는 개인에게 재-투여될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 본원의 상기 세포(예를 들어, 본원의 방법들을 실시함에 따라 제조된 세포)는 예를 들어, AC6mut이 일차 아미노 또는 티올 그룹과 같은, 다중 친핵체 그룹을 함유하기 위해 변형된 폴리에틸렌 글리콜에 결합될 수 있는 프로토콜을 기술하는, 미국 특허 출원번호 6,969,400에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 합성 임플란트의 표면 상으로서 생체 적합적 비면역 코팅 내에서 또는 이에 의해 보호되어 조직, 기관 및/또는 이를 필요로 하는 개인에게 재-투여(예를 들어, 주입 또는 병합)될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본원의 상기 세포(예를 들어, 본원의 방법을 실시함에 따라 제조된 세포)는 예를 들어, 미국 특허 출원번호 7,442,390; 5,733,542에 기재된 이식 방법을 이용하여 조직, 기관 및/또는 이를 필요로 하는 개인에게 재-투여(예를 들어, 주입 또는 병합)된다.
폴리펩티드, 핵산 및/또는 세포를 조직 또는 기관(예를 들어, 심근세포, 심장)에 전달하기 위한 임의의 방법들이 사용되며, 및 이러한 프로토콜들은 예를 들어, 미국 특허 출원번호(USPN) 7,514,401에 기재된 바와 같이, 당업계에 잘 공지되어 있으며, 이들은 예를 들어, 폴리펩티드, 핵산 및/또는 세포를 심장으로 관상 동맥(IC), 정맥(IV), 및/또는 in situ 국소 전달을 이용하는 것을 기술한다. 예를 들어, 다른 대안적인 구현예들에 있어서, 폐 및 혈류로의 에어로졸 약물 입자, 유전자 치료, 연속 주입, 반복 주입 및/또는 서방성 고분자는 폴리펩티드, 핵산 및/또는 세포를 조직 또는 기관(예를 들어, 폐, 신장, 심장)으로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 핵산 및/또는 세포는 카테터를 통하여 관상동맥(coronary arteries)으로 전달될 수 있으며 또는 제한된 개흉술을 통하여 좌심방 또는 심실의 심근으로 직접 주입될 수 있으며; 또는 심장 카테터 설치(cardiac catheterization) 동안 통과되는 카테터를 통하여 심근으로 전달될 수 있으며; 또는 심낭 공간(pericardial space)으로 전달될 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 본원을 실시하는 데 사용된 핵산, 본원을 실시하는 데 사용되는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 아데노바이러스-연관 바이러스 또는 벡터(AAV), 또는 아데노바이러스 유전자 치료 벡터), 또는 본원의 부형제, 리포좀, 나노입자 또는 나노지질입자(NLP) 등을; 예를 들어, 미국 특허 출원번호 7,501,486에 기재된 바와 같이 조직 또는 기관으로 전달한다.
본원을 실시하는 데 사용되는 조성물은 다른 치료제, 예를 들어 혈관 형성제, 항-혈전제, 항-염증제, 면역 억제제, 항-부정맥제, 종양괴사인자 억제제, 엔도텔린 저해제, 안지오텐신-전환 효소 억제제, 칼슘 길항제, 항생제, 항 바이러스제 및 바이러스 벡터와 병용하여 사용될 수 있다.
본원을 실시하는 데 사용되는 조성물은 임의의 다양한 심장 질환 또는 심혈관 질환, 예를 들어, 심장 질환 또는 심혈관 질환, 예를 들어, 관상 동맥 질환(CAD); 죽상동맥경화증; 혈전증; 재협착; 결절성 다발 동맥염과 같은 초그-스트라우스 증후군(Churg-Strass syndrome), 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 가와사키병(Kawasaki Disease) 및 리케챠 혈관증(Rickettsial vasculitis)과 같은 자가 면역 또는 바이러스성 혈관염을 포함하는 혈관염; 동맥경화성 동맥류; 심근 비대; 선천성 심질환(CHD); 허혈성 심질환 및 협심증; 후천성 판막/심장 내막 질환; 심근염을 포함하는 원발성 심근 질환; 부정맥; 및 이식 거부; 울혈성 심근병증, 비대심근병증 또는 제한심근병증과 같은 대사성 심근 질환 및 심근증, 및/또는 심장 이식의 개선 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
키트 및 설명
본원은 조성물들 및 방법들을 포함하며 이것의 사용을 위한 설명을 포함하는, 키트들을 제공한다. 예컨대, 본원의 세포, 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스 등이 또한 제공될 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에 있어서, 본원은 (a) AC6mut-인코딩 핵산, (b) 본원의, 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스 등, (c) 본원의 액체 또는 수용액 제형, 또는 (d) 본원의 상기 부형제, 리포좀, 나노입자 또는 나노지질 입자를 포함하는, 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일 측면에서, 상기 키트는 또한 예를 들어, 원하는 AC6mut 또는 AC6mut-인코딩 핵산, 벡터 등을, 심근세포로 전달하기 위한 in vitro 또는 ex vivo 방법인, 본원의 임의의 방법을 실시하기 위한 설명을 포함한다.
본원은 하기 실시예를 참조하여 또한 설명될 것이다; 그러나, 본원은 이러한 실시예에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1: cAMP -결핍 AC의 전달은 심기능을 증가시킨다
이 실시예는 본 발명의 예시적인 구현예의 유효성을 입증한다: 심부전의 치료를 위한 심근세포들로의 cAMP-결핍 AC의 전달. 이 연구에서, 발명자는 LV cAMP 생산을 감소시키는 AC 돌연변이 분자가 Ca2 + 처리 단독에서의 이의 효과들에 의해 좌심실 (LV) 기능에 유리한 효과를 가질 것인지를 문의하였다.
양성 변력성 제제(positive inotropes)의 많은 임상 시도가 실패하였으므로, cAMP를 증가시키는 제제가 심장을 부전시켜 유해한 것임이 현재 자명하다. 대안적인 전략은 cAMP에 영향을 주지 않는 제제를 사용하여 심근 Ca2 + 처리 또는 Ca2 + 에 대한 근필라멘트 반응을 바꾸는 것이다. 좌심실(LV) 기능이 아데닐일 사이클라아제(AC) 활성에 밀접하게 연결되어 있지만, AC의 이로운 효과가 cAMP와는 관계없을 수 있으며 대신에 Ca2 + 처리에서의 효과들로부터 기인할 수 있다.
이 연구에서, 발명자는 "AC6 돌연변이", 또는 "AC6mut"로도 불리는 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-결핍(cAMP-incompetent) 아데닐일 사이클라아제 타입 6 (AC6) 폴리펩티드의 심장-직접 발현을 갖는 트렌스제닉 마우스들을 생산하였다. 이러한 AC6mut 트렌스제닉 마우스들의 심근세포들은 아이소프로테레놀에 대한 반응에서 손상된 cAMP 생산을 보였으나(74% 감소; p<0.001), LV 크기 및 기능은 정상이었다. 단리된 심장은 아이소프로테레놀 자극에 대한 반응에서 보존된 LV 기능을 보였다. AC6mut 발현은 증가된 근육세포질세망 Ca2 + 흡수에 관련되며 SERCA2a 활성화에 대한 상기 EC50은 감소되었다. AC6mut 마우스들로부터 단리된 심근세포들은 아이소프로테레놀에 대한 반응에서 Ca2 + 과도 현상의 증가된 진폭을 보였다(p=0.0001). AC6mut 발현은 또한 LV S100A1의 증가된 발현(p=0.03) 및 포스포람반 단백질의 감소된 발현(p=0.01)에 관련되었다. 이 연구는 LV AC 돌연변이 발현이 손상된 cAMP 생산에도 불구하고 정상 심기능에 관련되어 있음을 확인하였다. 상기 메커니즘은 Ca2+ 처리에서의 효과들을 통해 나타난다 - 감소된 cAMP에도 불구하고 나타나는 효과들이다.
이전 연구들로부터의 데이터는 포유동물 심근세포들에서 발현된 우성 AC 동종체인 증가된 심장 AC 타입 6(AC6)[6]이 좌심실(LV) 부전에서 변화무쌍한 이로운 효과들을 가짐을 나타냈다[7],[8],[9],[10],[11],[12]. 이러한 예상하지 못했던 이로운 효과들은 베타(β) 아드레날린 수용체(βAR) 자극 및 세포내 cAMP에서의 증가의 심장에서의 엄청난 결과들이 조화된 것이다[13],[14],[15],[16],[17],[18]. 실제로, 심장의 부전에서의 AC6 발현의 분명한 이점은 역설적이다. 약리학적 저해제들을 사용하여, 이전 연구들로부터의 데이터는 증가된 심장 AC6 발현의 이로운 효과들 중 일부는 증가된 cAMP 생산에 의존하지 않음을 제안한다[2],[3]. 배양된 심근세포들에서의 약리학적 저해를 사용하는 연구들의 내재적 제한들 때문에, 발명자들은 촉매적 코어의 426 위치에서(426 위치: SEQ ID NO:16에 근거한 위치 번호) Asp를 Ala로 치환한 촉매적으로 불활성인 뮤린 AC6 돌연변이(AC6mut) 분자를 발생시켰으며, 이러한 변화는 G-단백질 동역학에 영향을 주지 않고 Mg2 + 결합을 변경하는 것으로 예측되었다[4]. 이러한 뮤린 AC6mut 분자는, in vitro에서 연구될 때, cAMP 생산을 현저하게 손상시키나, AC6와 연관된 세포 분포 패턴은 유지한다[4]. 이러한 in vitro 연구들은 어떻게 이러한 분자가 in vivo 심기능에 영향을 미칠 수 있는지를 수립하는 데에 훨씬 미치지 못한다.
그러므로, 발명자들은 심장-직접 발현을 갖는 트렌스제닉 뮤린 라인들을 생산하였다. 발명자의 희망은 이러한 라인들이 손상되지 않은 정상 심장의 기능에서 cAMP 대 Ca2 + 처리 효과들의 구별에 대한 추가 통찰력을 제공하는 것이다. 게다가, 이러한 연구들은 AC6mut가 증가된 cAMP의 잠재적인 해로운 효과들로부터 자유로운 근육 수축 자극을 제공하는지 여부를 나타낼 것이다. 발명자의 가설은 cAMP 생산 능력에서의 현저한 감소에도 불구하고, LV 기능이 Ca2 + 처리에서 AC6에 의해 부여된 이로운 균형 잡힌 효과들을 통해 정상으로 유지된다는 것이다.
방법들
AC6mut 트렌스제닉 마우스들의 생산(도 1A). 동물들의 사용은 국제실험동물관리평가인증협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)의 가이드라인에 따랐으며 버지니아 샌디에고 헬스케어 시스템(VA San Diego Healthcare System)의 동물실험관리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. AC6mut의 심장-직접 발현을 갖는 마우스들을 생산하기 위해, C-말단에 AU1 태그를 갖는 상기 뮤린 AC6mut cDNA [4]를 a-미오신 중쇄 프로모터 및 SV40 polyA 사이에 서브클로닝하였다. 상기 발현 카세트를 포함하는 9.2-kb 단편을 전핵(pronuclear) 주사를 위해 사용하였으며, 이는 샌디에고 유니버시티 오브 캘리포니아(University of California)의 트렌스제닉 마우스 시설(동계 교배 C57BL/6)에서 실시하였다. 파운더(founder) 마우스들을 꼬리 끝으로부터 제조된 게놈 DNA의 폴리머라아제 사슬 작용(PCR)으로 확인하였다.
상기 AC6mut 유전자를 α-MHC 프로모터에 상동인 프라이머(포워드: 5' CACATAGAAGCCTAGCCCACACC) (SEQ ID NO:1)를 사용하여 검출하였다; 리버스 프라이머는 AC6 영역에 대한 것이다(5' CAGGAGGCCACTAAACCATGAC) (SEQ ID NO:2).
AC6mut mRNA를 하기 프라이머들을 사용하여 검출하였다: 내인성 AC6 mRNA에 비해 배수로 증가하는 AC6mut mRNA를 정량할 수 있는 포워드: 5' TGGGCCTCTCTACTCTGCAT (SEQ ID NO:3); 리버스: 5' TGGATGTAACCTCGGGTCTC) (SEQ ID NO:4).
내인성 AC6 mRNA를 이의 3'-비번역 영역에 상동인 프라이머들을 사용하여 검출하였다(포워드: 5' ggcattgagtgggactttgt (SEQ ID NO:5); 리버스: 5' tctgcatccaaacaaacgaa) (SEQ ID NO:6). 이러한 3' 비번역 영역은 내인성 AC6를 정량할 수 있는, AC6mut cDNA 내에 존재하지 않는다.
파운더 동물들을 동종의 야생형 마우스들과 이종 교배시키고, 선별한 동물들을 심장 전이유전자 발현의 분석에 사용하였다. 발명자들은 독립된 라인에서 다양한 전이유전자 발현을 기록하고 본 연구에서 AC6mut 단백질 발현(내인성 AC6에 비해)에서 17-배 증가를 갖는 라인을 선별하였다. AC 타입 2 - 9의 LV 발현 레벨을 이전에 기술된 바와 같이 정량적 RT-PCR을 사용하여 확인하였다[5].
심장 초음파. (1 L/min 산소의 유속에서) 5% 아이소플루레인으로 마취를 유도하고 산소 중 1% 아이소플루레인으로 유지하였다. 이전에 보고된 바와 같이[7], 16L MHz 라이너 프로브 및 Sonos 5500® Echocardiograph system (Philips Medical Systems, Bothell , WA )을 사용하여 이미지를 수득하였다. 데이터를 획득하고 그룹의 정체를 모르는 상태에서 분석하였다.
단리된 관류된 심장들: LV 수축 기능. LV 수축 기능을 평가하기 위해 이전에 보고된 바와 같이[7], 반사 활성화(reflex activation) 또는 마취에 의해 영향을 받지 않는 방식으로 단리된 관류된 심장에서 심기능을 평가하였다. 심실내 벌룬 카테터를 배치하여 등용성 LV 압력(LV 확장기말 압력 10 mmHg; 1.7 mM 이온화 Ca2 +)을 측정하였다. LV 압력이 기록됨에 따라, 5 분 간격으로 아이소프로테레놀을 볼러스(bolus) 투여량(0.1 nM 내지to 300 nM)으로 전달하였다. 그런 다음, LV 압력의 첫 번째 파생물(LV dP/dt)이 파생되어 \LV 수축 기능의 대리로서 사용되었다. 데이터를 획득하고 그룹의 정체를 모르는 상태에서 분석하였다.
칼슘 흡수. LV 균질 현탁액들 중의 ATP-의존 근육세포질세망(SR) Ca2 + 흡수의 초기 비율을 이전에 기술된 바와 같이[11] 변형된 Millipore 여과 기술로 측정하였다.
칼슘 과도 현상. 사이토졸 칼슘 과도 현상을 이전에 기술된 바와 같이[19], Indo-1을 사용하여 측정하였다. 심근세포들을 라미닌-코팅 글라스 커버 슬립들 상으로 플레이팅하고 indo-1/AM (3 μM, Calbiochem, La Jolla CA) 및 분산제, pluronic F-127 (0.02 mg/ml, Calbiochem, La Jolla CA)와 함께 30 분 동안 로딩시켰다. 염료 로딩 후에, 커버 슬립들을 과융합(superfusion) 챔버 내에 고정시키고 과량의 indo-1/AM을 제거하기 위해 세척하고, 모노크로메이터(monochromator)를 통해 365 nm로 여기 파장이 설정된 Photon Technologies photometry system (Birmingham NJ)에 접속된 40x 대물렌즈를 갖춘 Nikon Diaphot™ 표면형광(epifluorescence) 현미경 상에 고정시켰다. 형광 방출은 분열되어 각각 405 및 485 nm에 집중된 20-nm 대역 통과 필터들을 통해 두 개의 광전자증배광(photomultiplier) 튜브로 향하게 했다. 비율 F405/F485는 [Ca2 +]i에 대한 측정을 나타낸다. 이러한 측정들 동안, 심근세포들은 2 mM CaCl2 함유 25 mM HEPES(pH 7.3)과 과융합(superfused)되었다. 근세포들은 0.3 Hz에서 필드-자극되었다(field-stimulated). 아이소프로테레놀-자극 Ca2 + 과도 현상을 버퍼에 아이소프로테레놀(10 mM)을 첨가하여 확인하였다. 칼슘 과도 현상을 심장 당 적어도 20 개의 세포로부터, 그리고 그룹 당 적어도 3 개의 심장에 대해서 기록하였다. 확장기 및 수축기 세포내 Ca2 + 레벨을 각각 사이클 당 기저 및 최대 F405/F485 비율로부터 수득하였다.
심근세포 단리. 심근세포 단리를 이전에 기술된 바와 같이[4] 실시하였다.
사이클릭 AMP 측정 . 단리된 심근세포들을 아이소프로테레놀(10 μM, 10 분) 또는 수용성 포스콜린 유사체 NKH477 (10 μM, 10 분)로 자극시킨 후, 용해시켰다(2.5% 도데실트리메틸암모늄 브로마이드, 0.05 M 아세트산나트륨, pH 5.8, 및 0.02% 우혈청 알부민). 이전에 보고된 바와 같이[4], cAMP Biotrak™ 효소 면역검정 시스템(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)을 사용하여 사이클릭 AMP을 측정하였다.
PKA 활성 검정 . 단리된 심근세포들을 아이소프로테레놀 (10 μM, 10 분) 또는 NKH477 (10 μM, 10 분)으로 자극시켰다. 심근세포들을 버퍼 A(20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.5 mM EGTA, 0.5 mM EDTA, 및 Invitrogen으로부터의 프로테아제 저해제 칵테일)에 균질화시키고 원심분리하였다(14,000 x g, 5 분, 4°C). 상청액을 [g-32P]ATP의 존재 하에서 PKA 비오틴화 펩티드 기질(SignaTECT® (SignaTECT®) cAMP-Dependent Protein Kinase Assay System (Promega, Madison WI))과 함께 인큐베이션하였다. 32P-표지된 비오틴화 기질을 스트렙타비딘 매트릭스와 함께 회수하고, PKA에 대한 특이 활성을 확인하였다.
심근세포들 내의 리아노딘 수용체-2, PLB , 및 트로포닌 I의 아이소프로테레놀 -자극 인산화 . 핵심적인 Ca2 + 조절 단백질들의 동역학적 인산화를 확인하기 위해, 발명자들은 각 그룹으로부터 단리된 배양된 심근세포들에서의 RyR2, PLB 및 TnI의 기저 및 아이소프로테레놀-자극 인산화의 연구를 구성하였다(도 2C). 배양된 심근세포들(웰 당 100,000 개 세포들)을 이러한 연구들에 사용하였으며 아이소프로테레놀(10 μM, 10 분)과의 인큐베이션 전 및 후에 면역블로팅을 실시하였다. 세포들을 용해 버퍼(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM 피로인산나트륨, 1 mM b-글리세로포스페이트, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml 류펩틴)에 용해시켰다. 단백질 농도를 Bradford 방법을 사용하여 측정하였다. 면역블롯들을 GAPDH에 대해서 표준화하고 비교하였다(도 2D).
PDE 활성 검정 . 포스포디에스테라아제 활성을 사이클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라아제 검정 키트(Enzo)를 사용하여 평가하였다. LV 조직들을 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM PMSF, 10 mM 활성화 오르소바나데이트(orthovanadate), 1x 프로테아제 저해제 칵테일(Life Sciences)을 함유하는 버퍼 내에 균질화시키고 마이크로퓨즈(microfuge) 내에서 10,000 rpm(10 분)에서 원심분리하였다. 조직 균질 현탁액들을 Desalting Column Resin(Enzo)을 사용하는 겔 여과에 의해 탈염시켰다. 20 μg의 단백질(Bradford)을 각 웰에 첨가하고 PDE 활성을 측정하였다.
면역형광. 단리된 심근세포들을 라미닌 코팅된 2-웰 챔버 슬라이드에 1 시간 동안 부착시키고, 세척하고, 고정하고(10% 포르말린, 15 분, 23°C), 정상 염소 혈청으로 차단하고(1시간) 항-AU1 항체(Fitzgerald, 1:300; AC6mut 전이유전자 단백질 검출용); 항-Cav3 항체(BD Pharmagen, 1:100; 카베올라(caveolae) 검출용); 항-PDI 항체(Invitrogen, 1:1000; SR 검출용); 항-라민 A (Abcam, 1:200; 핵막 검출용); 항-CREM-1 항체(Santa Cruz, 1:50); 또는 항-포스포-CREB 항체(Upstate, 1:100)와 함께 인큐베이션하였다(4°C, 밤새). 심근세포들을 PBS로 세척한 후 이차 항체들(Alexia Fluo 488 또는 594 접합, 1:1000 희석)과 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포핵을 확인하기 위해, 세포들을 Hoechst 염료(1:1000 희석, 20 분)과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음, 심근세포들을 이전에 기술된 바와 같이[2] 이미지화하였다.
mRNA의 검출 및 면역블롯팅 . mRNA를 정량하기 위해 정량적 역전사 폴리머라아제 사슬 작용(RT-qPCR)을 사용하고 단백질 정량을 정량하기 위해 면역블롯팅을 사용하였다[4]. RyR2에 대한 프라이머들은 포워드: 5'AACCTACCAGGCTGTGGATG) (SEQ ID NO:7); 및 (리버스: 5' GACTCGATGGGCAAGTCAAT) (SEQ ID NO:8)를 포함한다.
발명자들은 내인성 AC6 및 AC6mut을 확인하기 위해 항-AC5/6 항체를 사용하였다(Santa Cruz, 1:200 희석). 상기 AC5/6 항체에 대한 에피토프는 AC6 및 AC6mut의 C-말단에 있다(서열: KGYQLECRGVVKVKGKGEMTTYFLNGGPSS (SEQ ID NO:9); 단백질 수탁번호 #O43306 및 #Q01234). 발명자들은 AC6mut 단백질을 검출하기 위해 AU1 항체 (Fitzgerald, 1:2,000)를 사용하였다. 사용된 추가 항체들은 하기를 포함한다: 칼레티쿨린(calreticulin)(ABR Affinity, 1:1,000); 칼세퀘스트린(calsequestrin)(Novus Biologicals, 1:1,000); GAPDH(Fitzgerald, 1:20,000); PDE3A(Advam); PKA 촉매 서브유닛(BD Transduction, 1:1,000); p-PKA 촉매 서브유닛(Cell Signaling, 1:1,000); PKA-RIIα 및 PKA-RIIβ(BD Transduction, 1:1,000); 포스포-PKA-RIIα(S96) 및 포스포-PKA-RIIβ(S114)(Santa Cruz, 1:200); PKCα 촉매 서브유닛(Santa Cruz, 1:200); PLB(Affinity Bioreagents, 1:5,000); 포스포 S16-PLB(Badrilla, 1:3,000 희석); 포스포-RyR2(S2808)(Abcam, 1:1,000); S100A1(Epiyomics, 1:1,000); SERCA2a(Enzo, 1:1,000); 트로포닌 I 및 포스포-TnI(S22/23)(Cell Signaling, 각각 1:1,000).
통계 분석. 데이터는 평균±SE를 나타낸다; 그룹 차이는 ANOVA를 사용한 후, Bonferroni t-테스팅을 사용하거나, 또는 적절할 때, Student's t 테스트(unpaired, 2-tailed)를 사용하여 통계적 유의도에 대해 테스트되었다. 귀무 가설(null hypothesis)은 p < 0.05일 때 거절되었다.
결과
AC6mut 트렌스제닉 마우스들 . AC6mut　마우스들은 이들의 전이유전자 음성 형제들(negative siblings)로부터 신체적으로 구분되지 않았다. 성년 마우스들의 해부는 체중, 경골 길이, LV 중량, 및 폐 중량에서 그룹 차이가 없음을 보였다(표 1).
AC6mut의 LV 발현 . 내인성 AC6의 레벨에 비해 AC6mut mRNA은 62-배 증가하였으며 단백질은 17-배 증가하였으며, 이는 RT-PCR 및 면역블롯팅에서 내인성 AC6 및 전이유전자 AC6mut 둘 다에서의 공동 영역에 대한 프라이머들 및 항체를 사용하여 검출되었다(도 1B 및 1C).
내인성 AC 타입들의 LV 발현 . 내인성 AC 타입들 2 - 9의 mRNA는 그룹 차이를 보이지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
LV cAMP 생산 . AC6mut 마우스들의 LV 샘플은 아이소프로테레놀 (74% 감소; p<0.001) 또는 수용성 포스콜린 유사체인 NKH477(52% 감소; p = 0.05) 로 자극하였을 때 감소된 cAMP 생산을 보였다(도 1D); 기저 cAMP 생산은 변동하지 않았다. 그러므로, 상기 트렌스제닉 라인은 LV 기능에서 증가된 AC6mut 발현의 존재 시 감소된 βAR-자극 cAMP 생산의 전체 효과를 테스트하는데 적합하였다.
PKA 활성 및 발현 . AC6mut 마우스들로부터 단리된 심근세포들은 기저 PKA 활성에서 48% 감소를 보였다(p=0.01). 게다가, 아이소프로테레놀(38% 감소; p=0.006); 및 NKH477(38% 감소; p=0.001)에 의해 자극된 PKA 활성에서의 감소들이 있었다(도 2A, 상부). AC6mut 발현은 상기 PKA 촉매 서브유닛의 LV 발현(도 2A, 하부) 또는 PKA-RII-a 및 b의 발현 또는 인산화(포스포-PKA-RIIα: AC6mut, 0.32±0.04 du; Con, 0.30±0.03 du, p=0.7; 포스포-PKA-RIIβ: AC6mut, 7.1±1.1 du; Con, 10.6±01.4 du; p=0.09; 도 2B)를 변경시키지 않았다. PKC 촉매 서브유닛 발현은 또한 그룹 차이를 보이지 않았다(PKCα: AC6mut, 0.8±0.1 du; Con, 0. 7±0.1 du, p=0.4; 도 2B)
심근세포들에서의 리아노딘 수용체-2, PLB 및 트로포닌 I의 아이소프로테레놀 -자극 인산화. RyR2, PLB 및 TnI의 기저 인산화는 그룹 차이를 보이지 않았다(P-RyR2: AC6mut, 4.4±0.6 대 Con, 2.4±0.5 du, p=0.06; P-PLB: AC6mut, 0.3±0.03 대 Con, 0.2±0.1 du, p=0.8; P-TnI: AC6mut, 0.8±0.2 대 Con, 1.0±0.01 du, p=0.24, 도 2C). 아이소프로테레놀 자극은 두 그룹들 모두에서 RyR2, PLB, 및 TnI의 증가된 인산화에 관련되어 있으나(비-자극에 비해), 인산화 정도는 일반적으로 AC6mut 마우스들로부터의 LV보다 더 크다(P-RyR2: AC6mut, 30.0±1.1vs Con, 7.4±1.1 du, p=0.001,; P-PLB: AC6mut, 16.8±2.4 vs Con, 5.3±0.1 du, p=0.01; P-TnI: AC6mut, 5.8±1.4 vs Con, 2.2±0.7 du, p=0.07; 도 2C). TnI 단백질 발현은 그룹 사이에 차이가 없었다(AC6mut, 0.9±0.1 vs Con, 0.7±0.2 du; p=0.5; 도 2B). RyR2 mRNA 발현은 그룹 차이를 보이지 않았다.
PDE 활성 및 PDE3A 발현 . LV 샘플들에서 PDE 활성에서의 그룹 차이는 없었다(AC6mut: 1252±23 Units/mg, n=7; 대조: 1293±39 Units/mg, n=6; p=0.38). LV PDE3A 단백질 발현은 그룹 차이를 보이지 않았다 (AC6mut: 0.3±0.1 vs Con, 0.4±0.1 du, p=0.6. 도 2B).
AC6mut의 세포내 분포 . AC6mut 단백질을 카베올라(주로 혈장 막에 관련됨), SR, 및 핵막과 관련하여 확인하였다(도 1E).
심장 초음파 . 심장 초음파는 기저 심장 구조 및 기능이 AC6mut의 심장-직접 발현에 의해 변하지 않았음을 보였다. LV 면적은 그룹들 사이에 차이가 없었으며, 기저 LV 방출 분획 및 원주형 섬유 수축 속도(velocity of circumferential fiber shortening)는 유사했다(표 2). 그러므로, AC6mut 마우스들에서 LV cAMP 생산 능력의 현저한 감소에도 불구하고, LV 구조 및 기저 기능은 변경되지 않았다.
아이소프로테레놀에 대한 반응에서의 LV 수축 기능. 자율 신경 영향, 내인성 카테콜아민류, 및 마취와 관계없는 방식으로 심장 수축성을 평가하기 위해, LV 압력 발달을 단리된　관류된 심장들에서 측정하였다. 기저 및 아이소프로테레놀-자극 LV dP/dt는 LV cAMP 생산 능력에서의 현저한 감소에도 불구하고 그룹 차이를 보이지 않았다(도 3).
Ca 2 + 흡수 및 Ca 2 + 관련 단백질들 . AC6mut 및 전이유전자-음성 형제 대조 마우스들로부터의 풀링된(pooled) LV 균질 현탁액들에서의 ATP-의존 SR Ca2 + 흡수 비율을 확인하였다. 증가된 AC6mut 발현은 증가된 SR Ca2 + 흡수에 관련되었다(도 4A, 상부 패널). 게다가, Ca2 +에 대한 SERCA2a의 증가된 친화성은 절반 최대 효과(half maximal effect)에서 요구되는 감소된 Ca2 + 농도에서 반영되었다(EC50: AC6mut 1.1 mmol/L; 대조 3.7 mmol/L, n=6, 도 4A, 하부 패널).
Ca2 + 처리에서의 이러한 생리학적 변화들에 관련된 것은 SR Ca2 + 흡수를 조절하는 단백질의 LV 발현을 변경시켰다. 예를 들어, AC6mut 발현은 LV PLB 단백질 발현에서 43% 감소(p=0.01), 및 LV S100A1 단백질 함량에서 73% 증가(p=0.03)와 관련되었다 (도 4B 및 4C). LV SERCA2a, 칼레티쿨린, 및 칼세퀘스트린의 함량들은 변화가 없었으며, Ser16에서의 PLB 인산화는 변화가 없었다(도 4D).
전사 인자들. AC6mut 발현은 CREM-1의 LV 발현에서 2 배 증가(p=0.03, 도 4B) 및 Ser133에서 CREB의 인산화에서의 1.7 배 증가(p=0.01, 도 4C) 와 관련되었다; 총 CREB 단백질 함량은 변하지 않았다. 증가된CREM-1 및 포스포-CREB가 세포핵 내에 존재하는지 여부를 확인하기 위해, 단리된 심근세포들의 면역형광염색을 항-CREM-1 및 항-포스포-CREB (S133) 항체들을 사용하여 실시하였다. 발명자들은 AC6mut 마우스들에서 CREM-1 및 포스포-CREB의 증가된 핵 국재화(nuclear localization)를 검출하였다(도 4E).
칼슘 과도 현상 : AC6mut 발현과 관련된 증가된 SR Ca2 + 흡수가 사이토졸 [Ca2 +]i에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, 심근세포 실시간 [Ca2 +]i를 레이셔미터(ratiometric) 염료 Indo-1를 사용하여 평가하였다. 수축 동안의 기저 Ca2 + 방출은 변하지 않았다(도 5A). 그러나, AC6mut 발현은 아이소프로테레놀 자극 후의 증가된 피크 수축기 Ca 2 + 과도 현상 진폭에 관련되었으며(p=0.0001, 도 5B 및 5C), 피크 진폭에 대한 시간은 감소되었다(p=0.03, 도 5D). 게다가, AC6mut 마우스들로부터의 심근세포들에서 50% 완화(tau)에 대한 시간은 감소되었다(p=0.04)(도 5E). 그러므로, SERCA2a 활성, PLB 및 S100A1의 발현, 및 아이소프로테레놀-자극 Ca2 + 과도 현상 모두는 LV 기능에 유리하게 영향을 주는 방식으로 AC6mut 발현에 의해 변하였다.
논의
이 연구의 가장 놀랍고도 중요한 발견은 bAR-자극 cAMP 생산을 현저하게 손상시키는 돌연변이 AC6 분자의 심장-직접 발현이 아이소프로테레놀 자극에 대한 반응에서 보호된 LV 기능에 관련된다는 것이다. 이것은 단리된 관류된 심장들의 심장 초음파 및 수축 기능의 연구에 의해 확인되었다. 다른 설정들에서의 심장 cAMP 생산의 현저한 감소는 LV 수축 기능에서의 비례 감소와 관련된다. 예를 들어, cAMP 장애가 일반적으로 50% 감소된 심부전 모델 대부분에서, LV dP/dt에서 및 bAR-반응성에서 유사한 감소가 있다[10],[11],[12],[13],[14]. 게다가, cAMP 생산 능력에서의 60% 감소에 관련된 AC6의 결실은 또한 LV 수축 기능에서 유사한 감소에 관련되었다 [5]. 아이소프로테레놀-자극 LV 수축 기능의 보존을 무엇으로 설명할 수 있나
AC6mut 라인에서의 현저하게 손상된 cAMP 생산에도 불구하고 보존된 LV 기능에 대한 근접한 메카니즘들은 Ca2 + 처리에서의 유리한 변화였다. 발명자들은 AC6의 심장-직접 발현이 부전된 심장의 기능을 증가시킴을 이전에 보고하였으나, bAR 시그널링에서의 AC6의 확연한 효과 때문에, 이러한 이로운 효과들이 증가된 bAR 시그널링 그 자체 대 Ca2 + 처리를 반영하는 정도를 확인하는 것이 불가능하였다[10],[11]. Ca2+ 처리에 대한 AC6의 연결을 지지하는 것은 AC6 결실이 Ca2 + 처리에 두드러진 부작용들을 갖는다는[5] 관찰이지만, cAMP-생산 능력이 AC6 결실 후 감소되었기 때문에, Ca2 + 처리에서의 AC6의 독립된 효과는 확인하기 어렵다. 그러나, 본 연구에서의 새로운 것은 AC6 돌연변이 분자가 Ca2 + 처리에서 모(parent) 분자의 유리한 효과를 모방하여 나타나, cAMP 생산 능력이 현저하게 감소했을 때에도 LV 기능을 보호한다는 것을 TG 마우스들에서 입증한 것이다. 이는 Ca2+ 처리에서의 AC6의 상기 효과들이 상기 cAMP 생산을 요구하지 않고, 이에 따라 대안적인 메커니즘들을 통해 발생해야 한다는 것을 나타낸다.
발명자들은 AC6mut 발현이 LV 균질 현탁액들에서의 증가된 SR Ca2 + 흡수 및 무손상 심근세포들에서 감소된 완화 시간을 수반하는 증가된 Ca2 + 과도 현상에 관련됨을 발견하였다. AC6mut 발현에서 이러한 생리학적 유리한 효과들과 관련된 것은 SERCA2a 활성을 저해하는 Ca2 + 조절제인 감소된 PLB 발현이다. Ser16에서의 감소된 PLB 함량 또는 증가된 PLB 인산화는 SERCA2a 활성을 증가시키는 이의 저해 효과들의 감소와 관련된다[20],[21],[22]. 발명자들은 이전에 PLB 발현이 AC6 또는 AC6mut를 발현하는 배양된 심근세포들에서 감소되었음을 발견하였으나[4], 현재 연구는 이러한 효과가 in vivo에서도 보여지는 것을 최초로 입증한 것이다(도 4B). AC6mut 마우스들로부터 단리된 심근세포들에서 RyR2, PLB, 및 더 적은 정도로, TnI(도 2C)의 아이소프로테레놀-자극 인산화의 정도에서의 증가는 또한 LV 수축 기능을 증가시킬 것으로 예측될 것이다.
AC6mut 발현은 CREB/ATF 패밀리에서의 전사 억제자인[23] CREM-1의 증가된 발현 및 핵내 이동에 관련되었다(도 3B 및 3E). 발명자들은 이전에 AC6 발현의 설정에서, 상기 PLB 프로모터가 상기 PLB 프로모터에서 CRE 부위를 통해 신생아 랫 심근세포들에서의 증가된 ATF3에 의해 음성적으로 조절되었음을 확인하였다[2]. 본 연구에서 발명자들은 AC6mut 발현과 관련된 증가된 ATF3를 보지 않았다. 그러나, ATF3 및 CREM-1 둘 다 CRE 부위들을 인지하므로, AC6mut-관련 증가된 CREM-1은 감소된 PLB 발현에서 메커니즘적으로 중요한 것임이 타당하다. 이는 추가 연구를 필요로 할 것이다.
AC6mut 발현은 RyR2 및 SERCA2a의 조절을 통해 수축 기능을 증가시키는 Ca2 + 민감성 단백질인 S100A1의 LV 발현에서 예상하지 못한 증가에 관련되어 있다[24]. AC6mut 발현이 어떻게 증가된 LV S100A1 발현에 연결될 수 있는가? AC6mut 발현은 CREB 활성화를 위해 요구되는 과정인 CREB의 증가된 인산화 및 핵내 이동에 관련되었다(도 4C 및 4E). CREB는 그들의 프로모터들에서 CRE 부위(들)을 통해 많은 유전자들을 조절하는 전사 활성자이다[25]. 상기 S100A1 프로모터는 CRE 부위를 포함하며[26], 이는 S100A1 발현이 AC6mut 발현에 의해 활성화되는 것이 타당할 수 있음을 나타내는 것이다. 게다가, PKA 및 cAMP의 구획화(compartmentalization) 또한 요소들일 수 있다[27],[28].
Ca2 + 처리에서의 상당한 개선은 cAMP 생산에서의 현저한 감소에도 불구하고 LV 기능을 보호하는 것으로 나타났다. 증가된 양의 AC6mut이 심근세포들의 전사 조절 및 궁극적으로 생리학적 거동 및 LV 기능에 영향을 주는 경로는 추가 연구가 필요할 것이다. 조직학적 연구들(도 1E)로 상당한 양의 전이유전자 AC6mut이 혈장 막이 아니라 다중 세포내 구획들 내에 존재함을 확인하였다. 이것은 AC6mut 단백질이 세포내 시그널링에 영향을 주고 이로 인해 생리학적 기능에 영향을 미치는 중요한 세포내 단백질들과 상호작용할 수 있도록 한다.
Ca2 + 처리에 대한 AC6의 중요성은 최근에 AC6 결실에 의해 강조되었다[5]. 이러한 설정에서, cAMP 생산 능력은, 본 연구에서만큼은 아니지만 감소되었으나, Ca2 + 처리는 현저하게 손상되었다. 본 연구에서, 발명자들은 cAMP 생산의 더욱 현저한 손상을 보았으나, Ca2 + 처리는 감소되지 않고 증가되었다. 이것은, AC6 결실과는 달리, cAMP 생산 능력에서의 하나의 결핍에도 불구하고, 상기 AC6 분자가 Ca2 + 처리에 영향을 미칠 수 있는 세포질 내에 존재한다는 것 때문이다.
발명자들은 생리학적 효과들이 AC6mut 발현의 레벨에 비례하는지를 확인하기 위해 감소된 양의 AC6mut를 발현하는 트렌스제닉 라인들을 시험하지 않았다. 누군가는AC6mut 단백질(내인성 AC6에 비해)에서의 17 배 증가가 비-특이적 방식으로 시그널링에 영향을 미칠 것이라고 주장할 수 있다. 발명자의 데이터가 이러한 가능성을 무시할 수는 없지만, 내인성 AC6가 극도의 로우 어번던스(low abundance) 단백질로서 - 예를 들어, Gsa보다 대략 100 배 적은 어번던트(abundant)를 갖는 것임을 인지하는 것이 중요하다[29]. 그러므로, 내인성 AC6보다 17 배 더 높은 레벨에서 발현되어도, 이는 여전히 Gsa보다 상당히 낮은 어번던트를 갖는다. 게다가, 촉매적으로 활성인(정상) AC6에서의 유사한 증가는 구성 가능한 cAMP 생산에서의 현저한 증가와 관련된다[30]. 이러한 관찰들은 이러한 발견들이 특이적임을 제안한다.
결론 . Ca2 + 처리에서의 상당한 개선은, cAMP 생산에서의 현저한 감소에도 불구하고 LV 기능을 보전하는 것을 나타낸다. 면역형광은 AC6mut가 핵 막 상에 위치하여 AC6mut가 전사 인자 발현 및 기능에 영향을 미치는 기회를 제공함을 나타낸다. 전사 억제제인 증가된 CREM-1 및 증가된 포스포-CREB (도 4E)는 각각 PLB 및 S100A1의 변경된 발현에 관련될 수 있다. 발명자들은 AC6mut가, 감소된 cAMP 생산에도 불구하고, 증가된 Ca2 + 처리 및 변경된 단백질 발현을 통해 심기능을 보호한다고 결론을 내렸다. 이러한 결과들은 LV 기능에 대한 Ca2 + 처리 및 bAR 시그널링 사이의 상호작용에 관한 통찰력을 제공하며, AC6mut가 증가된 cAMP의 잠재적인 유해한 효과들로부터 자유로운 근육 수축 자극을 제공할 수 있음을 나타낸다. 데이터는 부전된 심장에서 AC6mut 발현과 관련된 감소된 심근세포 세포사멸을 나타냈으며, 이는 발명자의 연구실에서 진행 중인 연구의 초점이다.
도면 설명
도 1. AC6mut 설계, 발현, 활성 및 세포 분포
A. AC6mut의 구성에서 C1 도메인(세포내 루프) 내의 426 위치(SEQ ID NO:1에 근거한 위치 번호)에서 아스파르트산(asp)을 알라닌(ala)으로 치환하는 부위를 나타낸 도면이다. 이러한 치환은 Mg2 + 결합을 저해하고 촉매적 코어의 Gsa-매개 활성화의 효율을 변경시키며, 이는AC6의 효소 활성을 손상시켜, cAMP 생산을 감소시킨다. AC6의 막관통 도메인인 M1 및 M2; 상기 촉매적 코어를 형성하는, AC6의 세포질 도메인인 C1 및 C2; b-아드레날린성 수용체인 bAR; 구아노신 5'-트리포스페이트(GTP)-결합 단백질, Gs의 요소인 βY 및 α.
B. AC6mut mRNA 발현은 내인성 AC6 및 전이유전자 AC6mut에 공통인 프라이머들을 사용하는 qRT-PCR에 의해 평가되었다. GAPDH mRNA를 검출하기 위한 프라이머들은 qRT-PCR 반응의 내부 대조로 사용하였다. AC6mut mRNA는 내인성 AC6이 비해 62 배 증가하였다. 그래프 막대에서의 동물 수+SE; Student's t-테스트, unpaired, 2 tails.
C. AC6mut 단백질은 항-AC5/6 항체를 사용하는 면역블롯에서 검출되거나 항-AU1 태그 항체를 사용하여 확인되었다. AC6mut 단백질은 내인성 AC6에 비해 17 배 증가하였다.
D. 아이소프로테레놀(Iso; 10 mM, 10 분) 또는 NKH477 (NKH; 10 mM, 10 분)으로의 자극 전(기저) 및 후의 AC6mut 및 대조 마우스들로부터 단리된 심근세포들에서의 사이클릭 AMP 생산; cAMP 효소면역검정. AC6mut 마우스들로부터의 심근세포들(M vs C, 대조)은 포스콜린 유사체인 Iso 및 NKH477에 대한 반응에서 손상된 cAMP 생산을 보였다. 그래프의 막대들은 평균+SE를 나타낸다; 1-way ANOVA 후 Bonferroni 포스트 테스트로부터의 P 수치들(n=6, 각 그룹).
E. 항-AU1 항체(적색); 항-카베올린 3 (Cav-3) 항체(카베올라에 대해 녹색); 항-단백질 이황화물-이성화효소(PDI) 항체(근육세포질세망에 대해 녹색); 항-라민 A 항체(핵막에 대해 녹색), 및 항-전압 의존성 음이온 선택적 채널 단백질(VDAC) 항체(미토콘드리아에 대하여 녹색)를 사용한 AC6mut 대 대조 마우스들로부터 단리된 심근세포들에서의 AC6mut 단백질의 이중 면역형광 염색. 핵은 청색이다. AC6mut 전이유전자는 카베올라, SR, 및 핵 막에서 검출되었으나, 미토콘드리아에 관련되지는 않았다.
도 2. PKA, PKS 및 PDE의 활성 및 발현
A. 상부 그래프: 아이소프로테레놀(Iso; 10 mM, 10 분) 또는 NKH477(NKH; 10 mM, 10 분)으로 자극 없이(기저) 또는 자극한 단리된 심근세포들에서의 PKA 활성. AC6mut 발현은 기저 PKA 활성(p=0.01)을 감소시키고 Iso (p=0.001) 및 NKH (p=0.001) 활성 둘 다 역시 감소되었다(n=3, 각 그룹). 하부 젤: LV 균질 현탁액들에서의 PKA 단백질. LV PKA 촉매 서브유닛 단백질 발현은 AC6mut 발현에 의해 변하지 않았다.
B. 핵심 시그널링 단백질들의 발현 및 이들의 인산화가 AC6mut 및 대조 마우스들로부터의 좌심실 균질 현탁액들을 사용한 면역블롯들에서 보여졌다. 그룹 차이는 관찰되지 않았다. 인산(P) 및 전체(T) PKA 조절 서브유닛 II-a 및 II-b, PKCa, 포스포디에스테라아제 타입 3A (PDE3A), 포스포-트로포닌 I (P22/23-TnI), 및 전체 TnI을 나타냈다.
C. 아이소프로테레놀 자극 전 및 후의 RyR2, PLB 및 TnI의 인산화를 각 그룹으로부터 단리되어 배양된 심근세포들에서 평가하였다. RyR2, PLB 및 TnI의 기저 인산화는 그룹 차이를 보이지 않았다. 아이소프로테레놀 자극은 그룹 둘 다에서 RyR2, PLB, 및 TnI의 증가된 인산화에 관련되었으나, AC6mut마우스들로부터의 심근세포들에서 더 대규모였다(도 2C).
D. 아이소프로테레놀 자극이 AC6mut 마우스들로부터의 심근세포들에서 RyR2, PLB, 및 TnI의 증가된 인산화와 관련되었음을 나타내는 도 2C로부터의 데이터는 로딩에 대해 표준화된, 그래프 포맷으로 나타냈다(GAPDH). TnI 인산화에서의 증가는 통계학적으로 유효하지 않았다(p=0.07).
도 3. 좌심실 수축 기능
AC6mut TG 마우스들로부터 단리된 심장들(검은 원; n=11)은 광범위한 아이소프로테레놀 투여량을 통해 아이소프로테레놀 자극에 대한 반응에서 보호된 LV dP/dt를 보였다. 데이터를 획득하고 그룹의 정체를 모르는 상태에서 분석하였다. 흰 원들은 전이유전자 음성 대조 마우스들이다(n=12). 여기서 그룹 차이는 없었다(2-way ANOVA). 데이터 포인트들은 평균±SE로 나타냈다.
도 4. SR Ca 2+ 흡수, Ca 2+ 시그널링 단백질들, 및 전사 인자
A. 상부: AC6mut 및 TG 음성 형제 대조 마우스들로부터의 풀링된 LV 샘플에서의 Ca2+ 흡수 활성 (n=6, 두 그룹 모두)
하부: AC6mut의 발현은 Ca2 +에 대한 SERCA2a 친화성을 감소시켰다. 50% 최대 효과(EC50)에 대한 Ca2 +의 유효 농도를 다른 유리 Ca2 + 농도들에서 초기 ATP-의존 Ca2+ 흡수 비율로부터 계산하였다.
B. 상부: AC6mut 발현은 감소된 LV 포스포람반 (PLB) 발현에 관련되었다.
하부: AC6mut 발현은 증가된 LV CREM-1 단백질 발현에 관련되었다.
C. 상부: AC6mut 발현은 증가된 LV S100A1 단백질 발현에 관련되었다.
하부: AC6mut 발현은 증가된 LV P133-CREB 단백질 발현에 관련되었다. 전체 CREB 발현은 두 그룹들 모두에서 유사하였다.
D. AC6mut 발현은 SERCA2a, 칼레티쿨린, 칼세퀘스트린 또는 포스포-S16-PLB 단백질들의 LV 발현에 영향을 미치지 않았다(n=4, 두 그룹들 모두).
E. 항-AU1 항체(적색) 및 항-CREM-1 항체 (녹색) 또는 항-AU1 및 항-포스포-CREB (S133, 녹색)을 이용한 AC6mut 및 대조 마우스들로부터의 단리된 심근세포들에서 AC6mut 단백질의 이중 면역형광 염색. 핵은 청색으로 보여졌다. AC6mut 발현은 CREM-1 및 포스포-CREB의 핵내 이동을 증가시켰다.
그래프에서(A,B,C), 막대들은 평균+SE를 나타낸다; 막대들에서의 수는 그룹 크기를 나타낸다; 막대 위의 수는 Student's t-테스트(unpaired, 2 tailed)로부터의 p 수치를 나타낸다.
도 5. AC6mut 및 대조 마우스들로부터의 단리된 심근세포들에서의 사이토졸 Ca 2 + 과도 현상
A. 기저 Ca2+ 방출(수축기-확장기 Ca2+)은 그룹 차이를 보이지 않았다.
B. 아이소프로테레놀(Iso; 10 mM)로 자극된 심근세포들에서의 대표적인 Indo-1 Ca2+ 과도 현상 기록들은 AC6mut 마우스들로부터의 심근세포들에서보다 더 높았다. 요약 데이터는 C 패널에 나타냈다.
C. 아이소프로테레놀의 존재 시 방출된 Ca2 +는 AC6mut 마우스들로부터의 심근세포들에서 증가되었다.
D. 아이소프로테레놀의 존재 시 시간-대-피크 Ca2 + 과도 현상은 AC6mut 마우스들로부터의 심근세포들에서 감소되었다.
E. 아이소프로테레놀의 존재 시 50% 완화(tau)에 대한 시간은 AC6mut 마우스들로부터의 심근세포들에서 감소되었다.
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본 발명의 다수의 구현예들이 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형들이 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어나지 않고 만들어질 수 있다. 따라서, 다른 구현예들은 하기 청구항들의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> CYCLIC ADENOSINE MONOPHOSPHATE-INCOMPETENT ADENYLYL CYCLASE AND COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HEART FAILURE AND INCREASING CARDIAC FUNCTION <130> 00015-253WO1/SD-2013-027-1 PCT <140> to be assigned <141> 2014-05-26 <150> 61/832,759 <151> 2013-06-07 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 cacatagaag cctagcccac acc 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 caggaggcca ctaaaccatg ac 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 tgggcctctc tactctgcat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 tggatgtaac ctcgggtctc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 ggcattgagt gggactttgt 20 <210> 6 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Ser Lys Ala Phe Arg Gln Met Gly Ile Asp Asp Ser Ser Lys Asp 595 600 605 Asn Arg Gly Ala Gln Asp Ala Leu Asn Pro Glu Asp Glu Val Asp Glu 610 615 620 Phe Leu Gly Arg Ala Ile Asp Ala Arg Ser Ile Asp Gln Leu Arg Lys 625 630 635 640 Asp His Val Arg Arg Phe Leu Leu Thr Phe Gln Arg Glu Asp Leu Glu 645 650 655 Lys Lys Tyr Ser Arg Lys Val Asp Pro Arg Phe Gly Ala Tyr Val Ala 660 665 670 Cys Ala Leu Leu Val Phe Cys Phe Ile Cys Phe Ile Gln Leu Leu Val 675 680 685 Phe Pro Tyr Ser Thr Leu Ile Leu Gly Ile Tyr Ala Ala Ile Phe Leu 690 695 700 Leu Leu Leu Val Thr Val Leu Ile Cys Ala Val Cys Ser Cys Gly Ser 705 710 715 720 Phe Phe Pro Lys Ala Leu Gln Arg Leu Ser Arg Asn Ile Val Arg Ser 725 730 735 Arg Val His Ser Thr Ala Val Gly Ile Phe Ser Val Leu Leu Val Phe 740 745 750 Ile Ser Ala Ile Ala Asn Met Phe Thr Cys Asn His Thr Pro Ile Arg 755 760 765 Thr Cys Ala Ala Arg Met Leu Asn Leu Thr Pro Ala Asp Val Thr Ala 770 775 780 Cys His Leu Gln Gln Leu Asn Tyr Ser Leu Gly Leu Asp Ala Pro Leu 785 790 795 800 Cys Glu Gly Thr Ala Pro Thr Cys Ser Phe Pro Glu Tyr Phe Val Gly 805 810 815 Asn Val Leu Leu Ser Leu Leu Ala Ser Ser Val Phe Leu His Ile Ser 820 825 830 Ser Ile Gly Lys Leu Ala Met Thr Phe Ile Leu Gly Phe Thr Tyr Leu 835 840 845 Val Leu Leu Leu Leu Gly Pro Pro Ala Ala Ile Phe Asp Asn Tyr Asp 850 855 860 Leu Leu Leu Gly Val His Gly Leu Ala Ser Ser Asn Glu Thr Phe Asp 865 870 875 880 Gly Leu Asp Cys Pro Ala Val Gly Arg Val Ala Leu Lys Tyr Met Thr 885 890 895 Pro Val Ile Leu Leu Val Phe Ala Leu Ala Leu Tyr Leu His Ala Gln 900 905 910 Gln Val Glu Ser Thr Ala Arg Leu Asp Phe Leu Trp Lys Leu Gln Ala 915 920 925 Thr Gly Glu Lys Glu Glu Met Glu Glu Leu Gln Ala Tyr Asn Arg Arg 930 935 940 Leu Leu His Asn Ile Leu Pro Lys Asp Val Ala Ala His Phe Leu Ala 945 950 955 960 Arg Glu Arg Arg Asn Asp Glu Leu Tyr Tyr Gln Ser Cys Glu Cys Val 965 970 975 Ala Val Met Phe Ala Ser Ile Ala Asn Phe Ser Glu Phe Tyr Val Glu 980 985 990 Leu Glu Ala Asn Asn Glu Gly Val Glu Cys Leu Arg Leu Leu Asn Glu 995 1000 1005 Ile Ile Ala Asp Phe Asp Glu Ile Ile Ser Glu Glu Arg Phe Arg 1010 1015 1020 Gln Leu Glu Lys Ile Lys Thr Ile Gly Ser Thr Tyr Met Ala Ala 1025 1030 1035 Ser Gly Leu Asn Ala Ser Thr Tyr Asp Gln Val Gly Arg Ser His 1040 1045 1050 Ile Thr Ala Leu Ala Asp Tyr Ala Met Arg Leu Met Glu Gln Met 1055 1060 1065 Lys His Ile Asn Glu His Ser Phe Asn Asn Phe Gln Met Lys Ile 1070 1075 1080 Gly Leu Asn Met Gly Pro Val Val Ala Gly Val Ile Gly Ala Arg 1085 1090 1095 Lys Pro Gln Tyr Asp Ile Trp Gly Asn Thr Val Asn Val Ser Ser 1100 1105 1110 Arg Met Asp Ser Thr Gly Val Pro Asp Arg Ile Gln Val Thr Thr 1115 1120 1125 Asp Leu Tyr Gln Val Leu Ala Ala Lys Gly Tyr Gln Leu Glu Cys 1130 1135 1140 Arg Gly Val Val Lys Val Lys Gly Lys Gly Glu Met Thr Thr Tyr 1145 1150 1155 Phe Leu Asn Gly Gly Pro Ser Ser 1160 1165 <210> 17 <211> 1166 <212> PRT <213> mus musculus <400> 17 Met Ser Trp Phe Ser Gly Leu Leu Val Pro Lys Val Asp Glu Arg Lys 1 5 10 15 Thr Ala Trp Gly Glu Arg Asn Gly Gln Lys Arg Pro Arg His Ala Asn 20 25 30 Arg Ala Ser Gly Phe Cys Ala Pro Arg Tyr Met Ser Cys Leu Lys Asn 35 40 45 Ala Glu Pro Pro Ser Pro Thr Pro Ala Ala His Thr Arg Cys Pro Trp 50 55 60 Gln Asp Glu Ala Phe Ile Arg Arg Ala Gly Pro Gly Arg Gly Val Glu 65 70 75 80 Leu Gly Leu Arg Ser Val Ala Leu Gly Phe Asp Asp Thr Glu Val Thr 85 90 95 Thr Pro Met Gly Thr Ala Glu Val Ala Pro Asp Thr Ser Pro Arg Ser 100 105 110 Gly Pro Ser Cys Trp His Arg Leu Val Gln Val Phe Gln Ser Lys Gln 115 120 125 Phe Arg Ser Ala Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Gln Arg Tyr Phe Phe Gln 130 135 140 Met Asn Gln Ser Ser Leu Thr Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Leu 145 150 155 160 Met Ala Val Leu Leu Thr Phe His Ala Ala Pro Ala Gln Pro Gln Pro 165 170 175 Ala Tyr Val Ala Leu Leu Thr Cys Ala Ser Val Leu Phe Val Val Leu 180 185 190 Met Val Val Cys Asn Arg His Ser Phe Arg Gln Asp Ser Met Trp Val 195 200 205 Val Ser Tyr Val Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala Val Gln Val Gly Gly 210 215 220 Ala Leu Ala Ala Asn Pro His Ser Pro Ser Ala Gly Leu Trp Cys Pro 225 230 235 240 Val Phe Phe Val Tyr Ile Thr Tyr Thr Leu Leu Pro Ile Arg Met Arg 245 250 255 Ala Ala Val Leu Ser Gly Leu Gly Leu Ser Thr Leu His Leu Ile Leu 260 265 270 Ala Trp Gln Leu Asn Ser Ser Asp Pro Phe Leu Trp Lys Gln Leu Gly 275 280 285 Ala Asn Val Val Leu Phe Leu Cys Thr Asn Ala Ile Gly Val Cys Thr 290 295 300 His Tyr Pro Ala Glu Val Ser Gln Arg Gln Ala Phe Gln Glu Thr Arg 305 310 315 320 Gly Tyr Ile Gln Ala Arg Leu His Leu Gln His Glu Asn Arg Gln Gln 325 330 335 Glu Arg Leu Leu Leu Ser Val Leu Pro Gln His Val Ala Met Glu Met 340 345 350 Lys Glu Asp Ile Asn Thr Lys Lys Glu Asp Met Met Phe His Lys Ile 355 360 365 Tyr Ile Gln Lys His Asp Asn Val Ser Ile Leu Phe Ala Asp Ile Glu 370 375 380 Gly Phe Thr Ser Leu Ala Ser Gln Cys Thr Ala Gln Glu Leu Val Met 385 390 395 400 Thr Leu Asn Glu Leu Phe Ala Arg Phe Asp Lys Leu Ala Ala Glu Asn 405 410 415 His Cys Leu Arg Ile Lys Ile Leu Gly Ala Cys Tyr Tyr Cys Val Ser 420 425 430 Gly Leu Pro Glu Ala Arg Ala Asp His Ala His Cys Cys Val Glu Met 435 440 445 Gly Val Asp Met Ile Glu Ala Ile Ser Leu Val Arg Glu Val Thr Gly 450 455 460 Val Asn Val Asn Met Arg Val Gly Ile His Ser Gly Arg Val His Cys 465 470 475 480 Gly Val Leu Gly Leu Arg Lys Trp Gln Phe Asp Val Trp Ser Asn Asp 485 490 495 Val Thr Leu Ala Asn His Met Glu Ala Gly Gly Arg Ala Gly Arg Ile 500 505 510 His Ile Thr Arg Ala Thr Leu Gln Tyr Leu Asn Gly Asp Tyr Glu Val 515 520 525 Glu Pro Gly Arg Gly Gly Glu Arg Asn Ala Tyr Leu Lys Glu Gln Cys 530 535 540 Ile Glu Thr Phe Leu Ile Leu Gly Ala Ser Gln Lys Arg Lys Glu Glu 545 550 555 560 Lys Ala Met Leu Ala Lys Leu Gln Arg Thr Arg Ala Asn Ser Met Glu 565 570 575 Gly Leu Met Pro Arg Trp Val Pro Asp Arg Ala Phe Ser Arg Thr Lys 580 585 590 Asp Ser Lys Ala Phe Arg Gln Met Gly Ile Asp Asp Ser Ser Lys Asp 595 600 605 Asn Arg Gly Ala Gln Asp Ala Leu Asn Pro Glu Asp Glu Val Asp Glu 610 615 620 Phe Leu Gly Arg Ala Ile Asp Ala Arg Ser Ile Asp Gln Leu Arg Lys 625 630 635 640 Asp His Val Arg Arg Phe Leu Leu Thr Phe Gln Arg Glu Asp Leu Glu 645 650 655 Lys Lys Tyr Ser Arg Lys Val Asp Pro Arg Phe Gly Ala Tyr Val Ala 660 665 670 Cys Ala Leu Leu Val Phe Cys Phe Ile Cys Phe Ile Gln Leu Leu Val 675 680 685 Phe Pro Tyr Ser Thr Leu Ile Leu Gly Ile Tyr Ala Ala Ile Phe Leu 690 695 700 Leu Leu Leu Val Thr Val Leu Ile Cys Ala Val Cys Ser Cys Gly Ser 705 710 715 720 Phe Phe Pro Lys Ala Leu Gln Arg Leu Ser Arg Asn Ile Val Arg Ser 725 730 735 Arg Val His Ser Thr Ala Val Gly Ile Phe Ser Val Leu Leu Val Phe 740 745 750 Ile Ser Ala Ile Ala Asn Met Phe Thr Cys Asn His Thr Pro Ile Arg 755 760 765 Thr Cys Ala Ala Arg Met Leu Asn Leu Thr Pro Ala Asp Val Thr Ala 770 775 780 Cys His Leu Gln Gln Leu Asn Tyr Ser Leu Gly Leu Asp Ala Pro Leu 785 790 795 800 Cys Glu Gly Thr Ala Pro Thr Cys Ser Phe Pro Glu Tyr Phe Val Gly 805 810 815 Asn Val Leu Leu Ser Leu Leu Ala Ser Ser Val Phe Leu His Ile Ser 820 825 830 Ser Ile Gly Lys Leu Ala Met Thr Phe Ile Leu Gly Phe Thr Tyr Leu 835 840 845 Val Leu Leu Leu Leu Gly Pro Pro Ala Ala Ile Phe Asp Asn Tyr Asp 850 855 860 Leu Leu Leu Gly Val His Gly Leu Ala Ser Ser Asn Glu Thr Phe Asp 865 870 875 880 Gly Leu Asp Cys Pro Ala Val Gly Arg Val Ala Leu Lys Tyr Met Thr 885 890 895 Pro Val Ile Leu Leu Val Phe Ala Leu Ala Leu Tyr Leu His Ala Gln 900 905 910 Gln Val Glu Ser Thr Ala Arg Leu Asp Phe Leu Trp Lys Leu Gln Ala 915 920 925 Thr Gly Glu Lys Glu Glu Met Glu Glu Leu Gln Ala Tyr Asn Arg Arg 930 935 940 Leu Leu His Asn Ile Leu Pro Lys Asp Val Ala Ala His Phe Leu Ala 945 950 955 960 Arg Glu Arg Arg Asn Asp Glu Leu Tyr Tyr Gln Ser Cys Glu Cys Val 965 970 975 Ala Val Met Phe Ala Ser Ile Ala Asn Phe Ser Glu Phe Tyr Val Glu 980 985 990 Leu Glu Ala Asn Asn Glu Gly Val Glu Cys Leu Arg Leu Leu Asn Glu 995 1000 1005 Ile Ile Ala Asp Phe Asp Glu Ile Ile Ser Glu Glu Arg Phe Arg 1010 1015 1020 Gln Leu Glu Lys Ile Lys Thr Ile Gly Ser Thr Tyr Met Ala Ala 1025 1030 1035 Ser Gly Leu Asn Ala Ser Thr Tyr Asp Gln Val Gly Arg Ser His 1040 1045 1050 Ile Thr Ala Leu Ala Asp Tyr Ala Met Arg Leu Met Glu Gln Met 1055 1060 1065 Lys His Ile Asn Glu His Ser Phe Asn Asn Phe Gln Met Lys Ile 1070 1075 1080 Gly Leu Asn Met Gly Pro Val Val Ala Gly Val Ile Gly Ala Arg 1085 1090 1095 Lys Pro Gln Tyr Asp Ile Trp Gly Asn Thr Val Asn Val Ser Ser 1100 1105 1110 Arg Met Asp Ser Thr Gly Val Pro Asp Arg Ile Gln Val Thr Thr 1115 1120 1125 Asp Leu Tyr Gln Val Leu Ala Ala Lys Gly Tyr Gln Leu Glu Cys 1130 1135 1140 Arg Gly Val Val Lys Val Lys Gly Lys Gly Glu Met Thr Thr Tyr 1145 1150 1155 Phe Leu Asn Gly Gly Pro Ser Ser 1160 1165

Claims (21)

  1. (1) 심장병 또는 심부전을 갖고 있거나 또는 위험을 갖고 있는 대상의 치료;
    (2) 심장병,
    심부전,
    심기능 또는 심박출량의 감소,
    심장 감염 또는 심장 질환(heart condition)에 의한 심기능 또는 심박출량의 감소
    에 대한 개인 또는 환자의 치료, 개선, 효과의 반전(reverse), 보호 또는 예방:
    (3) 근육세포질세망(SR) Ca2 + 흡수 및/또는 무손상 심근세포에서 감소된 이완 시간을 갖는 증가된 Ca2 + 과도 현상(transients)의 증가에 의한 무손상 심근세포에서의 칼슘 처리 향상,
    (4) 심근세포에서 세포내 cAMP 레벨의 생성의 억제,
    (5) 세포예정사(세포사멸) 신호로부터 심근세포의 보호, 또는 세포사멸 신호 이후 세포예정사(세포사멸) 신호를 받는 심근세포의 수의 감소, 또는
    (6) 심부전 환자 또는 심기능 또는 심박출량의 저하를 야기하는 심장 감염 또는 심장 질환을 갖고 있는 개인에서: 심기능 또는 심박출량 향상, 증상 감소 및/또는 사망률 감소; 또는 심부전에 대한 입원의 빈도 감소
    의 방법, 또는 이를 위한 in vivo 방법 또는 이의 방법으로서,
    상기 방법은
    (a) 하기 (i) 또는 (ii)를 제공하고:
    (i) 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-결핍(cAMP-incompetent) 아데닐일 사이클라아제 타입 6(AC6) 단백질 또는 폴리펩티드(“an AC6mut”라고 불림)로서,
    여기서 선택적으로 상기 AC6mut는 재조합, 합성, 펩티드유사(peptidomimetic) 또는 단리된(isolated) AC6mut 폴리펩티드 또는 펩티드이고; 또는
    (ii) AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자:
    여기서 선택적으로 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 전사 조절 서열에 작동적으로(operatively) 연결되어 있으며, 여기서 선택적으로 상기 전사 조절 서열은 프로모터 및/또는 인핸서(enhancer), 또는 심장세포-특이 프로모터 또는 근세포-특이 프로모터이거나; 또는
    여기서 선택적으로 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 전사 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있으며, 선택적으로 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 전달 매개체(delivery vehicle), 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물(equivalent)에 함유되며, 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물은, 세포 또는 in vivo에서 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 발현할 수 있으며,
    여기서 선택적으로 상기 세포는 심장 세포 또는 근세포이고;
    여기서 상기 AC6mut는 ATP의 cAMP로의 분해를 촉매화하지 않거나, 또는 ATP의 cAMP로의 분해를 촉매화하는 것에 대한 손상된 활성을 가지며, 및 선택적으로 상기 ATP의 cAMP로의 분해를 촉매화하는 것에 대한 손상된 활성은 상기 AC6mu가 야생형 AC6의 ATP에서 cAMP로의 촉매적 활성의 약 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%만을 갖는 것으로서 정의되며,
    상기 AC6mut가 in vivo 심근세포에서 발현될 때 좌심실(LV) 기능은 영향을 받지 않거나 감소되지 않거나 또는 LV 기능은 실질적으로 영향을 받지 않거나 감소되지 않으며,
    선택적으로 심근세포에서 AC6mut 발현은 근육세포질세망 Ca2 + 흡수(uptake)를 증가시키며,
    선택적으로 심근세포에서 AC6mut 발현은 SERCA2a 활성화에 대한 EC50을 감소시키며,
    선택적으로 심근세포에서 AC6mut 발현은 포스포람반(phospholamban) 단백질의 발현을 감소시키며,
    선택적으로 상기 치환(substitution)은 Mg2 + 결합을 억제하고 상기 촉매적 코어의 Gsα-매개 활성화의 효율을 변화시킴;
    (b) 상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를, 심장 세포 또는 심근세포에 전달 또는 투여하거나, 또는 심장 세포 또는 심근세포에서 상기 AC6mut를 발현시키거나, 또는 심장 세포 또는 심근세포에서 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 발현시키는 것
    을 포함하며,
    여기서 선택적으로 상기 AC6mut-인코딩 핵산은 전사 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있거나, 또는 선택적으로 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물이, 심근세포, 또는 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게 전달 또는 투여되며,
    선택적으로 상기 심장 세포 또는 근세포로의 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자의 in vivo 전달 또는 투여는 심장 근육 또는 심근세포로의 표적화된 전달이거나, 또는 심장으로의 직접 전달 또는 투여를 포함하거나, 또는 심장 주사 또는 주입을 포함하며,
    이에 의하여:
    심장병 또는 심부전을 갖고 있거나 또는 위험을 갖고 있는 대상을 치료하거나,
    심장병, 심부전, 심기능 또는 심박출량을 감소, 또는 심장 감염 또는 심장 질환에 의한 심기능 또는 심박출량의 감소에 대해 개인 또는 환자를 치료하거나, 개선 또는 보호(예방)하거나,
    근육세포질세망(SR) Ca2 + 흡수 및/또는 무손상 심근세포에서 감소된 이완 시간을 갖는 증가된 Ca2 + 과도 현상의 증가에 의한 무손상 심근세포(cardiac myocytes)에서의 칼슘 처리를 강화하거나,
    심근세포에서 세포내(intracellular) cAMP 레벨의 생성을 억제하거나,
    세포예정사(세포사멸) 신호로부터 심근세포를 보호하거나, 또는 세포사멸 신호 이후 세포예정사(세포사멸) 신호를 받는 심근세포의 수를 감소시키거나, 또는
    심부전 환자 또는 심기능 또는 심박출량의 저하를 야기하는 심장 감염 또는 심장 질환을 갖고 있는 개인에서: 심기능 또는 심박출량의 향상, 증상 감소 및/또는 사망률을 감소시키는 것인
    방법, 또는 이를 위한 in vivo 방법 또는 이의 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 AC6mut은 상기 AC 폴리펩티드의 상기 촉매화 코어에서 하전된 또는 산성의 아미노산이 하전되지 않은 또는 비-극성의 아미노산에 의해 치환된 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드를 포함하며,
    여기서 선택적으로 상기 하전되지 않은 또는 비-극성의 아미노산은 알라닌(Ala)이고, 선택적으로 상기 산성의 아미노산은 아스파르트산(aspartic acid, Asp)이거나, 선택적으로 상기 하전되지 않은 또는 비-극성의 아미노산은 Ala이고 및 상기 산성의 아미노산은 Asp인 것인, 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 AC6mut은
    SEQ ID NO:16에 기반한 상기 AC 폴리펩티드의 상기 촉매적 코어에서 426 위치에서 Asp를 Ala로 치환한 뮤린(murine) 아데닐일 사이클라아제(AC) 폴리펩티드를 포함하며,
    여기서 SEQ ID NO:17는 상기 D=>A 치환 후의 폴리펩티드 아미노산 서열(SEQ ID NO:16는 상기 D=>A 치환 전의 아미노산 서열임)이며; 또는
    SEQ ID NO:11에 기반한 상기 AC 폴리펩티드의 상기 촉매적 코어의 436 위치에서 Asp를 알라닌, 또는 Ala로 치환한 뮤린 AC6mut 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 SEQ ID NO:12는 D=>A 치환 후의 폴리펩티드 아미노산 서열 (SEQ ID NO:11은 상기 D=>A 치환 전의 아미노산 서열임)인 것인, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 AC6은 포유류 AC6 폴리펩티드인 것인, 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 AC6은 인간 AC6 폴리펩티드인 것인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 인간 AC6 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10에 기반한 상기 AC 폴리펩티드의 상기 촉매적 코어의 426 위치에서 Asp를 Ala로 치환한 인간 AC6 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 SEQ ID NO:13은 D=>A 치환 후의 폴리펩티드 아미노산 서열(SEQ ID NO:10은 상기 D=>A 치환 전의 아미노산 서열임)인 것인, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    (a) 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 세포의 염색체(chromosome) 내부로 안정하게 삽입되거나;
    (b) 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은 하기이거나 하기를 포함하는 것이거나: 아데노-연관 바이러스(AAV); 재조합 AAV 바이러스 또는 벡터; AAV 비리온(virion), 또는 아데노바이러스 벡터, 또는 이것의 임의의 슈도타입(pseudotype), 하이브리드;
    (c) 상기 (b)의 방법에서, 상기 아데노-연관 바이러스(AAV), 재조합 AAV 바이러스 또는 벡터, AAV 비리온(virion), 또는 아데노바이러스 벡터는 하기이거나 하기를 포함하는 것이거나: AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9; 히말라야 원숭이 AAV (AAVrh), 또는 AAVrh10; 또는 이것의 임의의 하이브리드 또는 유도체;
    (d) 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 조절된 또는 유도성(inducible) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결되거나;
    (e) 상기 (d)의 방법에서, 상기 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열은 조절된 또는 유도성 프로모터이거나;
    (f) 상기 (a) 내지 상기 (e)중 어느 한 방법에서, 전사 조절 서열, 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물에 작동적으로 연결된 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자를 개인 또는 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것은: 심근세포에서의 AC6mut의 표적화된 전달 또는 발현, 또는 AC6mut가 혈류 또는 일반적인 순환 내로 방출되는 것을 야기하거나; 또는
    (g) 상기 (a) 내지 상기 (f)중 어느 한 방법에서, 향상된 AC6mut in vivo 레벨에 반응하는 질병, 감염 또는 질환은 심수축성 기능장애; 울혈성 심부전(CHF); 심장 섬유증; 심근세포 질환; 심근세포 기능장애 또는 심근세포 사멸인 것인,
    방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    (a) 전사 조절 서열; 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물에 작동적으로 연결된 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는, 개인 또는 이를 필요로 하는 환자에게, 경구 투여, 근육(IM) 주사, 정맥(IV) 주사, 피하(SC) 주사, 피부(intradermal) 주사, 경막 내 주사, 동맥(IA) 주사, 관상동맥 또는 심장 주사, 안구(intraocular) 주사 또는 도포(application), 흡입, 또는 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템, 또는 "유전자 총(gene gun)" 사용, 공기 피스톨 또는 HELIOS™ 유전자 총(Rad Laboratories, Hercules, CA) 사용에 의하여 투여 또는 전달되며,
    여기서 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는 선택적으로 AAV 벡터, 또는 AAV-9 벡터의 정맥(IV) 주사에 의하여 전달되며; 또는
    (b) 전사 조절 서열; 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 이의 동등물에 작동적으로 연결된 상기 AC6mut-인코딩 핵산 또는 유전자는, 개인 또는 이를 필요로 하는 환자들에게, 혈류에 인접하거나 또는 혈류에 의해 배출된 상기 체내의 임의의 세포, 기관, 조직 또는 유체 공간 내부로 도입되어 상기 인코딩된 AC6mut 단백질이 상기 조직의 세포로부터 분비되고 혈류 내로 방출될 수 있도록 하는 것에 의하여 투여 또는 전달되는 것인,
    방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서:
    (a) 개인, 환자 또는 대상은 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나 상기 발현을 유도하거나 상향-조절하는 프로모터(예를 들어, 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터)를 유도 또는 활성화하는 자극 또는 신호가 투여되거나;
    (b) 상기 개인, 환자, 또는 대상은 프로모터의 활성화제의 합성을 유도하는 자극 또는 신호가 투여되거나, 여기서 상기 프로모터는 선택적으로 AC 유전자 프로모터, 또는 근세포-특이 프로모터이며;
    (c) 상기 개인, 환자, 또는 대상은 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자-특이 프로모터의 천연 또는 합성 활성화제의 합성을 유도하는 자극 또는 신호가 투여되거나,
    여기서 선택적으로 상기 천연 활성화제는 내인성 전사 인자이며;
    (d) 상기 (c)의 방법에 있어서, 상기 합성 활성화제는 특이적 및 선택적으로 내인성 또는 외인성 표적 유전자를 작동시키도록(turn on) 설계된 아연-핑거(zinc-finger) DNA 결합 단백질이거나, 여기서 선택적으로 상기 내인성 표적은 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자 또는 AC6mut의 활성화제, 또는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성화제이며;
    (e) 상기 (a) 내지 상기 (c) 중 하나의 방법에 있어서, 상기 자극 또는 신호는 생물학적, 광학적, 화학적 또는 약학적 자극 또는 신호를 포함하거나;
    (f) 상기 개인, 환자, 또는 대상은 AC6mut의 사후-전사 활성화제, 또는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성화제의 발현을 자극 또는 유도하는 자극 또는 신호가 투여되거나, 또는
    (g) 상기 개인, 환자, 또는 대상은 AC6-발현 핵산 또는 유전자의 전사 저해제 또는 사후-전사 억제제의 저해를 억제하거나 유도하는 자극 또는 신호가 투여되는 것인, 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 AC6mut, 또는 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 조절된 또는 유도성 프로모터의 발현을 유도하는 화학적 또는 약학적인 것은, 경구 항생제, 독시사이클린(doxycycline) 또는 라파마이신(rapamycin)이거나 이를 포함하며; 또는 독시사이클린을 이용한 tet-조절 시스템이, 상기 AC6mut 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 이의 동등물의 발현을 유도하는 데 사용되는 것인, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, 동결건조물(lyophilate), 액체, 젤, 하이드로젤, 분말, 스프레이, 연고, 또는 수성 또는 식염수 제형 내에서 또는 그 형태로서 제형화되는 것인, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, 부형제(vesicle), 하이드로젤, 젤, 리포좀, 나노리포좀, 나노입자 또는 나노리피드 입자(NLP)를 포함하거나, 또는 그 중에서 제형화되는 것인, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, 단리되거나 배양된 세포에서 제형화되며, 선택적으로 상기 세포는 포유류 세포, 심장 세포, 또는 인간 세포, 비-인간 영장류 세포, 원숭이 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 기니피그 세포, 토끼 세포, 햄스터 세포, 염소 세포, 소 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포 또는 고양이 세포인 것인, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, 약학 제형 또는 멸균 제형으로서 제형화 되는 것인, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, 제품, 인공 장기 또는 임플란트와 함께, 이들 상에, 또는 이들과 결합시켜 제형화 또는 전달되는 것인, 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AC6mut, 또는 상기 AC6mut-발현 핵산 또는 유전자, 또는 상기 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물은, AC6mut 폴리펩티드를 in vitro 또는 ex vivo 발현하는 것인, 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 방법의 실시를 포함하는, AC6mut-반응 병리학, 감염, 질병, 질환, 또는 상태(condition)에 대해 개인 또는 환자를 치료, 개선, 반전(reversing), 보호 또는 예방하기 위한 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 방법의 실시를 포함하는, 개인 또는 이를 필요로 하는 환자의 심장병증 또는 심혈관 질환의 치료, 개선, 반전(reversing), 보호 또는 예방을 위한 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 심장병증 또는 심혈관 질환은: 관상 동맥 질환(CAD); 죽상동맥경화증; 혈전증; 재협착; 혈관염, 자가 면역 또는 바이러스성 혈관염; 결절성 다발 동맥염; 초그-스트라우스 증후군(Churg-Strass syndrome); 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis); 가와사키병(Kawasaki Disease); 리케챠 혈관증(Rickettsial vasculitis); 동맥경화성 동맥류; 심근 비대; 선천성 심질환(CHD); 허혈성 심질환; 협심증; 후천성 판막 또는 심장 내막 질환; 원발성 심근 질환; 심근염; 부정맥; 이식 거부; 대사성 심근 질환; 심근증; 울혈성 심근병증, 비대심근병증 또는 제한심근병증; 및/또는, 심장 이식을 포함하는 것인, 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 기재된, AC6mut; AC6mut-발현 핵산 또는 유전자; 전달 매개체, 벡터, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 동등물; 아데노-연관 바이러스(AAV); 재조합 AAV 바이러스 또는 벡터; 아데노바이러스 벡터; 또는 이것의 임의의 슈도타입, 하이브리드 또는 유도체의 약제 제조 시의 용도로서,
    여기서 선택적으로 상기 AAV 또는 재조합 AAV 바이러스 또는 벡터는 AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9; 히말라야 원숭이 AAV (AAVrh), 또는 AAVrh10; 또는 이것의 임의의 하이브리드 또는 유도체, 또는 AC6mut-발현 세포 또는 심근세포이며,
    상기 약제는:
    (1) 심장병 또는 심부전을 갖고 있거나 위험을 갖고 있는 대상의 치료;
    (2) 심장병,
    심부전,
    심기능 또는 심박출량의 감소,
    심장 감염 또는 심장 질환(heart condition)에 의한 심기능 또는 심박출량의 감소:
    에 대한 환자 또는 개인의 치료, 개선, 효과의 반전(reverse), 보호 또는 예방,
    (3) 근육세포질세망(SR) Ca2 + 흡수 및/또는 무손상 심근세포에서 감소된 이완 시간을 갖는 증가된 Ca2 + 과도 현상의 증가에 의한 무손상 심근세포(cardiac myocytes)에서의 칼슘 처리 향상,
    (4) 심근세포에서 세포내 cAMP 레벨의 생성의 억제,
    (5) 세포예정사(세포사멸) 신호로부터 심근세포의 보호, 또는 세포사멸 신호 이후 세포예정사(세포사멸) 신호를 받는 심근세포의 수의 감소,
    (6) 심부전 환자 또는 심기능 또는 심박출량의 저하를 야기하는 심장 감염 또는 심장 질환을 갖고 있는 개인에서: 심기능 또는 심박출량 향상, 증상 감소 및/또는 사망률 감소; 또는 심부전에 대한 입원의 빈도 감소;
    (7) 심장 질환 또는 심혈관 질환; 또는
    (8) 관상 동맥 질환(CAD); 죽상동맥경화증; 혈전증; 재협착; 혈관염, 자가 면역 또는 바이러스성 혈관염; 결절성 다발 동맥염; 초그-스트라우스 증후군(Churg-Strass syndrome); 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis); 가와사키병(Kawasaki Disease); 리케챠 혈관증(Rickettsial vasculitis); 동맥경화성 동맥류; 심근 비대; 선천성 심질환(CHD); 허혈성 심질환; 협심증; 후천성 판막 또는 심장 내막 질환; 원발성 심근 질환; 심근염; 부정맥; 이식 거부; 대사성 심근 질환; 심근증; 울혈성 심근병증, 비대심근병증 또는 제한심근병증; 및/또는, 심장 이식
    을 위한 것인, 용도.
  21. 심장 질환, 심부전, 심기능 또는 심박출량의 감소, 심장 감염 또는 심장 질환에 의한 심기능 또는 심박출량의 감소,
    (2) 근육세포질세망(SR) Ca2 + 흡수 및/또는 무손상 심근세포에서 감소된 이완 시간을 갖는 증가된 Ca2 + 과도 현상의 증가에 의한 무손상 심근세포(cardiac myocytes)에서의 칼슘 처리 향상,
    (3) 심근세포에서 세포내 cAMP 레벨의 생성의 억제,
    (4) 세포예정사(세포사멸) 신호로부터 심근세포의 보호, 또는 세포사멸 신호 이후 세포예정사(세포사멸) 신호를 받는 심근세포의 수의 감소,
    (5) 심부전 환자 또는 심기능 또는 심박출량의 저하를 야기하는 심장 감염 또는 심장 질환을 갖고 있는 개인에서: 심기능 또는 심박출량 향상, 증상 감소 및/또는 사망률 감소; 또는 심부전에 대한 입원의 빈도 감소;
    (6) 심장 질환 또는 심혈관 질환; 또는
    (7) 관상 동맥 질환(CAD); 죽상동맥경화증; 혈전증; 재협착; 혈관염, 자가 면역 또는 바이러스성 혈관염; 결절성 다발 동맥염; 초그-스트라우스 증후군(Churg-Strass syndrome); 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis); 가와사키병(Kawasaki Disease); 리케챠 혈관증(Rickettsial vasculitis); 동맥경화성 동맥류; 심근 비대; 선천성 심질환(CHD); 허혈성 심질환; 협심증; 후천성 판막 또는 심장 내막 질환; 원발성 심근 질환; 심근염; 부정맥; 이식 거부; 대사성 심근 질환; 심근증; 울혈성 심근병증, 비대심근병증 또는 제한심근병증; 및/또는, 심장 이식
    을 위하거나 치료에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재되거나 사용된 바와 같은 치료학적 제형.
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