CN105452458A - 用于治疗心力衰竭和增加心脏功能的不能产生环腺苷酸的腺苷酸环化酶和组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于治疗、改善或保护(预防)患有心脏疾病或心力衰竭或降低的心脏功能或具有患心脏疾病或心力衰竭或降低的心脏功能的风险的个体或患者的方法，其包括：提供不能产生环腺苷酸的(不能产生cAMP的)腺苷酸环化酶6型(AC6)蛋白质或多肽(也被称为“AC6mut”)或可操作地连接到转录调控序列的编码AC6mut的核酸或基因。
Description
相关申请
本专利合作条约(PCT)国际申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年6月7日提交的美国临时申请号61/832,759的优先权权益。上述申请的全文出于所有目的以引用方式明确并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及细胞和分子生物学、基因疗法和医学；且更具体地涉及通过施用不能产生环腺苷酸的(不能产生cAMP的)腺苷酸环化酶6型(AC6)蛋白质或多肽(也被称为“AC6mut”)或编码AC6mut的核酸序列治疗患有心力衰竭或心脏疾病或具有患心力衰竭或心脏疾病的风险的受试者的组合物方法。
背景技术
腺苷酸环化酶(心肌细胞和其它细胞中的跨膜蛋白质)是通过生成细胞内cAMP转导p-肾上腺素能信号传导的关键效应分子。环-AMP是包括蛋白质激酶A激活在内的下游事件的第二信使。心力衰竭与受损的cAMP产生相关，cAMP产生与心脏功能紧密关联。已显示增加的心AC6型(AC6)(在哺乳动物心肌细胞中表达的显性AC异型体)对衰竭的左心室(LV)具有多种有益作用。这些包括：1)在心肌病变和急性心肌梗塞中的延长存活、2)与AV阻滞降低相关的减少的动作电位时程和房室传导的易化、3)LV扩张和病理性肥大两者的减小、4)通过改善的SERCA2a活性、增加的受磷蛋白活性对钙处置的有效作用和5)增加的心肌肌钙蛋白I磷酸化。
因此，已经生成了增加细胞内cAMP水平的若干药物，并且已经在患有心力衰竭的患者中对其进行了测试。然而，这些药物通常增加死亡率。当前的看法认定增加细胞内cAMP水平的药物和蛋白质对衰竭的心脏有害，且因此不适于治疗心力衰竭。
发明内容
在替代性实施方案中，本发明提供针对心脏疾病或降低的心脏功能治疗、改善或保护(预防)个体或患者的方法，其包括：提供不能产生环腺苷酸的(不能产生cAMP的)腺苷酸环化酶6型(AC6)蛋白质或多肽(也被称为“AC6mut”)或可操作地连接到转录调控序列的编码AC6mut的核酸或基因；或其中含有编码AC6mut的核酸或基因的表达运载体、载体、重组病毒或等同物，并且所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物可以在细胞中或体内表达所述编码AC6mut的核酸或基因；和向需要其的个体或患者施用或递送所述AC6mut或所述可操作地连接到转录调控序列的编码AC6mut的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物，由此针对所述心脏疾病或降低的心脏功能治疗、改善或保护(预防)所述个体或患者。在替代性实施方案中，所述AC6mut包含在腺苷酸环化酶(AC)多肽的催化核心中具有不带电荷的氨基酸或非极性氨基酸对带电荷的氨基酸或酸性氨基酸的取代的AC多肽。
在替代性实施方案中，本发明提供用于以下的方法和体内方法或以下的方法：
(1)治疗患有心脏疾病或心力衰竭或具有患心脏疾病或心力衰竭的风险的受试者；
(2)针对以下来治疗、改善、逆转其效应、保护或预防个体或患者：
心脏疾病、
心力衰竭、
心脏功能或心输出量的降低、
由于心脏感染或心脏病况所致的心脏功能或心输出量的降低，
(3)通过增加完整心肌细胞中肌浆网(SR)Ca2+摄取和/或具有缩短的松驰时间的增加的Ca2+瞬变来增强完整心肌细胞中的钙处置，
(4)抑制心肌细胞中细胞内cAMP水平的生成，
(5)保护心肌细胞免受程序化细胞死亡(凋亡)信号影响，或降低在凋亡信号之后被信号传导至程序化细胞死亡(凋亡)的心肌细胞数量，或
(6)在心力衰竭患者中或在患有导致心脏功能或心输出量降低的心脏感染或心脏病况的个体中：增加心脏功能或心输出量，降低症状和/或降低死亡率；或降低心力衰竭的住院频率，
所述方法包括：
(a)提供：
(i)不能产生环腺苷酸的(不能产生cAMP的)腺苷酸环化酶6型(AC6)蛋白质或多肽(也被称为“AC6mut”),
其中任选地，所述AC6mut是重组的、合成的、拟肽的或分离的AC6mut多肽或肽；或
(ii)编码AC6mut的核酸或基因：
其中任选地，所述编码AC6mut的核酸或基因可操作地连接到转录调控序列，其中任选地，所述转录调控序列是启动子和/或增强子或心细胞特异性启动子或肌细胞特异性启动子；或
其中任选地，所述编码AC6mut的核酸或基因可操作地连接到转录调控序列，且任选地，所述编码AC6mut的核酸或基因被包含于递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物中，并且所述递送运载体、表达运载体、载体、重组病毒或等同物可以在细胞中或体内表达所述编码AC6mut的核酸或基因，
其中任选地，所述细胞是心细胞或肌细胞；
其中所述AC6mut不催化ATP分解为cAMP，或具有催化ATP分解为cAMP的受损能力，并且任选地，所述催化ATP分解为cAMP的受损能力被定义为所述AC6mut仅具有野生型AC6的ATP至cAMP的催化活性的约1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，
并且当所述AC6mut在体内心肌细胞中表达时，左心室(LV)功能不受影响或不降低，或LV功能基本上不受影响或基本上不降低,
并且任选地，心肌细胞中的AC6mut表达增加肌浆网Ca2+摄取，
并且任选地，心肌细胞中的AC6mut表达降低用于SERCA2a激活的EC50，
并且任选地，心肌细胞中的AC6mut表达降低受磷蛋白蛋白质的表达，
并且任选地，所述取代抑制Mg2+结合并且改变Gsα介导的催化核心的激活的效率；
(b)向心细胞或心肌细胞递送或施用所述AC6mut或所述编码AC6mut的核酸或基因，或在心细胞或心肌细胞中表达所述AC6mut，或在心细胞或心肌细胞中表达所述编码AC6mut的核酸或基因，
其中任选地，所述编码AC6mut的核酸可操作地连接到转录调控序列，或任选地，向心肌细胞或向需要其的个体或患者递送或施用所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物，
并且任选地，向体内心细胞或肌细胞递送或施用所述编码AC6mut的核酸或基因是向心肌或心肌细胞的靶向递送，或包括向心脏的直接递送或施用，或包括心内注射或输注，
由此：
治疗所述患有心脏疾病或心力衰竭或具有患心脏疾病或心力衰竭的风险的受试者，
针对心脏疾病、心力衰竭、心脏功能或心输出量的降低、由于心脏感染或心脏病况所致的心脏功能或心输出量的降低治疗、改善或保护(预防)个体或患者，
通过增加完整心肌细胞中肌浆网(SR)Ca2+摄取和/或具有缩短的松驰时间的增加的Ca2+瞬变来增强完整心肌细胞中的钙处置，
抑制心肌细胞中细胞内cAMP水平的生成，
保护心肌细胞免受程序化细胞死亡(凋亡)信号影响，或降低在凋亡信号之后被信号传导至程序化细胞死亡(凋亡)的心肌细胞数量，或
在心力衰竭患者中或在患有导致心脏功能或心输出量降低的心脏感染或心脏病况的个体中：增加心脏功能或心输出量，降低症状和/或降低死亡率。
在替代性实施方案中，所述AC6mut包含在腺苷酸环化酶(AC)多肽的催化核心中具有不带电荷的氨基酸或非极性氨基酸对带电荷的氨基酸或酸性氨基酸的取代的AC多肽，
其中任选地，所述不带电荷的氨基酸或非极性氨基酸是丙氨酸(Ala)，并且任选地，所述酸性氨基酸是天冬氨酸(Asp)，或任选地，所述不带电荷的氨基酸或非极性氨基酸是Ala并且所述酸性氨基酸是Asp。
在替代性实施方案中，所述AC6mut包含：
在基于SEQIDNO:16的腺苷酸环化酶(AC)多肽的催化核心中的第426位具有Ala对Asp的取代的鼠AC多肽，其中SEQIDNO:17是D＝>A取代之后的多肽氨基酸序列(SEQIDNO:16是D＝>A取代之前的氨基酸序列)；或
在基于SEQIDNO:11的AC多肽的催化核心中的第436位具有丙氨酸或Ala对Asp的取代的鼠AC6mut多肽，其中SEQIDNO:12是D＝>A取代之后的多肽氨基酸序列(SEQIDNO:11是D＝>A取代之前的氨基酸序列)。
在替代性实施方案中，所述AC6是哺乳动物AC6多肽，或所述AC6是人AC6多肽。在替代性实施方案中，所述人AC6多肽包含在基于SEQIDNO:10的AC多肽的催化核心中的第426位具有Ala对Asp的取代的人AC6多肽，其中SEQIDNO:13是D＝>A取代之后的多肽氨基酸序列(SEQIDNO:10是D＝>A取代之前的氨基酸序列)。
在所述方法的替代性实施方案中：
(a)将所述编码AC6mut的核酸或基因稳定地插入到细胞的染色体中；
(b)所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物是或包括：腺相关病毒(AAV)；重组AAV病毒或载体；AAV病毒粒子或腺病毒载体或其任何假型、杂合体或衍生物；
(c)(b)的方法，其中所述腺相关病毒(AAV)、重组AAV病毒或载体、AAV病毒粒子或腺病毒载体是或包括：AAV血清型AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9；恒河猴AAV(AAVrh)或AAVrh10；或其任何杂合体或衍生物；
(d)所述编码AC6mut的核酸或基因可操作地连接到受调控的或可诱导的转录调控序列；
(e)(d)的方法，其中所述受调控的或可诱导的转录调控序列是受调控的或可诱导的启动子；
(f)(a)到(e)中任一个的方法，其中向需要其的个体或患者施用可操作地连接到转录调控序列的所述编码AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物导致：所述AC6mut在心肌细胞中的靶向递送和表达、或AC6mut被释放到血流或全身循环中；或
(g)(a)到(f)中任一个的方法，其中响应体内增加的AC6mut水平的疾病、感染或病况是心脏收缩功能障碍；充血性心力衰竭(CHF)；心脏纤维化；心肌细胞疾病；心肌细胞功能障碍或心肌细胞凋亡。
在所述方法的替代性实施方案中：
(a)通过口服施用、通过肌内(IM)注射、通过静脉内(IV)注射、通过皮下(SC)注射、通过皮内注射、通过鞘内注射、通过动脉内(IA)注射、通过冠状动脉内或心内注射、通过眼内注射或施加、通过吸入或通过生物弹射击(biolistic)粒子递送系统或通过使用“基因枪”、气手枪或HELIOSTM基因枪(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，向需要其的所述个体或患者施用或递送可操作地连接到所述转录调控序列的所述编码AC6mut的核酸或基因；或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物，
其中任选地，通过静脉内(IV)注射AAV载体或AAV-9载体来递送所述编码AC6mut的核酸或基因；或
(b)通过引入到身体内邻接血流或被血流排放的任何细胞、器官、组织或流体空间中，向需要其的所述个体或患者施用或递送可操作地连接到所述转录调控序列的所述编码AC6mut的核酸或基因；或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物，使得被编码的AC6mut蛋白质可以从所述组织中的细胞被分泌并释放到所述血流中。
在所述方法的替代性实施方案中：
(a)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达AC6mut的核酸或基因的表达或诱导或激活(诱导或上调所述表达AC6mut的核酸或基因的表达的)启动子(例如，可操作地连接到所述表达AC6mut的核酸或基因的启动子)；
(b)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导启动子的激活子的合成，其中任选地，所述启动子是AC基因启动子或肌细胞细胞特异性启动子；
(c)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达AC6mut的核酸或基因或所述表达AC6mut的核酸或基因特异性启动子的天然激活子或合成激活子的合成，
其中任选地，所述天然激活子是内源性转录因子；
(d)(c)的方法，其中所述合成激活子是被设计成特异性地且选择性地开启内源性或外源性靶基因的锌指DNA结合蛋白质，其中任选地，所述内源性靶标是表达AC6mut的核酸或基因、或AC6mut或表达AC6mut的核酸或基因的激活子、或可操作地连接到表达AC6mut的核酸或基因的启动子的激活子；
(e)(a)到(c)中任一个的方法，其中所述刺激或信号包括生物剂刺激或信号、光刺激或信号、化学剂刺激或信号或药物刺激或信号；
(f)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号刺激或诱导AC6mut或表达AC6mut的核酸或基因的转录后激活子的表达、或可操作地连接到表达AC6mut的核酸或基因的启动子的激活子的表达，或
(g)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号抑制表达AC6的核酸或基因的转录阻遏物或转录后阻遏物、或诱导对表达AC6的核酸或基因的转录阻遏物或转录后阻遏物的抑制。
在替代性实施方案中：诱导所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因的表达、或诱导可操作地连接到所述表达AC6mut的核酸或基因的所述受调控的或可诱导的启动子的表达的所述化学剂或药物是或包括口服抗生素、强力霉素(doxycycline)或雷帕霉素(rapamycin)；或使用利用强力霉素的tet-调控系统来诱导所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或其等同物的表达。
在替代性实施方案中：所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物被配制在冻干制剂(lyophilate)、液体、凝胶、水凝胶、粉末、喷剂、软膏、或水性或盐水制剂中，或被配制为冻干制剂、液体、凝胶、水凝胶、粉末、喷剂、软膏、或水性或盐水制剂。
在替代性实施方案中：所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物包括囊泡、水凝胶、凝胶、脂质体、纳米脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子(NLP)或被配制在囊泡、水凝胶、凝胶、脂质体、纳米脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子(NLP)中。
在替代性实施方案中：所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物被配制在分离的细胞或培养的细胞中，并且任选地，所述细胞是哺乳动物细胞、心细胞、或人细胞、非人灵长类动物细胞、猴细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞、兔细胞、仓鼠细胞、山羊细胞、牛科动物细胞、马科动物细胞、绵羊细胞、犬科动物细胞或猫科动物细胞。
在替代性实施方案中：所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物被配制为药物或无菌的。
在替代性实施方案中：所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物与制品、人工器官或植入物被配制或递送，在制品、人工器官或植入物上被配制或递送，或结合制品、人工器官或植入物被配制或递送。
在替代性实施方案中：所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物在体外或离体表达AC6mut多肽。
在替代性实施方案中，本发明提供用于针对AC6mut响应性病理、感染、疾病、病患或病况治疗、改善、逆转、保护或预防个体或患者的方法，其包括实施本发明的方法。
在替代性实施方案中，本发明提供用于在需要其的个体或患者中治疗、改善、逆转、保护或预防心脏病变或心血管疾病的方法，其包括实施本发明的方法。在替代性实施方案中，所述心脏病变或心血管疾病包括：冠状动脉疾病(CAD)；动脉粥样硬化；血栓形成；再狭窄；血管炎、自身免疫性血管炎或病毒性血管炎；结节性多动脉炎；变应性肉芽肿血管炎(Churg-Strasssyndrome)；高安动脉炎(Takayasu'sarteritis)；川崎病(KawasakiDisease)；立克次体血管炎(Rickettsialvasculitis)；动脉粥样硬化性动脉瘤；心肌肥大；先天性心脏疾病(CHD)；缺血性心脏疾病；绞痛；获得性瓣膜疾病或心内膜疾病；原发性心肌病；心肌炎；心律不齐；移植排斥；代谢性心肌病；心肌病变(myocardiomyopathy)；充血性心肌病变、肥大性心肌病变或限制性心肌病变；和/或心脏移植。
在替代性实施方案中，本发明提供包括以下：
如权利要求1-16中任一项所述的AC6mut；表达AC6mut的核酸或基因；递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物；腺相关病毒(AAV)；重组AAV病毒或载体；或腺病毒载体或其任何假型、杂合体或衍生物，
其中任选地，所述AAV或重组AAV病毒或载体包括AAV血清型AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9；恒河猴AAV(AAVrh)或AAVrh10；或其任何杂合体或衍生物、或表达AC6mut的细胞或心肌细胞，
在制备用于以下目的的药物中的用途：
(1)治疗患有心脏疾病或心力衰竭或具有患心脏疾病或心力衰竭的风险的受试者；
(2)针对以下来治疗、改善、逆转其效应、保护或预防个体或患者：
心脏疾病、
心力衰竭、
心脏功能或心输出量的降低、
由于心脏感染或心脏病况所致的心脏功能或心输出量的降低，
(3)通过增加完整心肌细胞中肌浆网(SR)Ca2+摄取和/或具有缩短的松驰时间的增加的Ca2+瞬变来增强完整心肌细胞中的钙处置，
(4)抑制心肌细胞中细胞内cAMP水平的生成，
(5)保护心肌细胞免受程序化细胞死亡(凋亡)信号影响，或降低在凋亡信号之后被信号传导至程序化细胞死亡(凋亡)的心肌细胞数量，
(6)在心力衰竭患者中或在患有导致心脏功能或心输出量降低的心脏感染或心脏病况的个体中：增加心脏功能或心输出量，降低症状和/或降低死亡率；或降低心力衰竭的住院频率；
(7)心脏病变或心血管疾病；或
(8)冠状动脉疾病(CAD)；动脉粥样硬化；血栓形成；再狭窄；血管炎、自身免疫性血管炎或病毒性血管炎；结节性多动脉炎；变应性肉芽肿血管炎；高安动脉炎；川崎病；立克次体血管炎；动脉粥样硬化性动脉瘤；心肌肥大；先天性心脏疾病(CHD)；缺血性心脏疾病；绞痛；获得性瓣膜疾病或心内膜疾病；原发性心肌病；心肌炎；心律不齐；移植排斥；代谢性心肌病；心肌病变；充血性心肌病变、肥大性心肌病变或限制性心肌病变；和/或心脏移植。
在替代性实施方案中，如本文所用的或所述的或如本发明的任何方法中的治疗制剂，其用于治疗以下疾病或用于以下目的：
(1)心脏疾病、心力衰竭、心脏功能或心输出量的降低、由于心脏感染或心脏病况所致的心脏功能或心输出量的降低，
(2)通过增加完整心肌细胞中肌浆网(SR)Ca2+摄取和/或具有缩短的松驰时间的增加的Ca2+瞬变来增强完整心肌细胞中的钙处置，
(3)抑制心肌细胞中细胞内cAMP水平的生成，
(4)保护心肌细胞免受程序化细胞死亡(凋亡)信号影响，或降低在凋亡信号之后被信号传导至程序化细胞死亡(凋亡)的心肌细胞数量，
(5)在心力衰竭患者中或在患有导致心脏功能或心输出量降低的心脏感染或心脏病况的个体中：增加心脏功能或心输出量，降低症状和/或降低死亡率；或降低心力衰竭的住院频率；
(6)心脏病变或心血管疾病；或
(7)冠状动脉疾病(CAD)；动脉粥样硬化；血栓形成；再狭窄；血管炎、自身免疫性血管炎或病毒性血管炎；结节性多动脉炎；变应性肉芽肿血管炎；高安动脉炎；川崎病；立克次体血管炎；动脉粥样硬化性动脉瘤；心肌肥大；先天性心脏疾病(CHD)；缺血性心脏疾病；绞痛；获得性瓣膜疾病或心内膜疾病；原发性心肌病；心肌炎；心律不齐；移植排斥；代谢性心肌病；心肌病变；充血性心肌病变、肥大性心肌病变或限制性心肌病变；和/或心脏移植。
附图和下面的说明书中陈述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图并且根据权利要求书将显而易见本发明的其它特征、目标和优点。
本文所引用的所有出版物/公开、专利、专利申请在此出于所有目的均以引用方式明确地并入。
附图说明
图1说明本发明的示例性AC6mut的设计、表达、活性和细胞分布：
图1A示意性地说明描绘在本发明的示例性鼠AC6mut的构造中在C1结构域(细胞内环)中在第426位(位置编号基于SEQIDNO:17，其中SEQIDNO:16是D＝>A取代之前的序列)丙氨酸(ala)对天冬氨酸(asp)的取代(D＝>A取代)位点的图解；
图1B图解说明如通过qRT-PCR使用内源性AC6和转基因AC6mut共同的引物所评估的AC6mutmRNA表达；
图1C说明使用抗AC5/6抗体检测AC6mut蛋白质并且使用抗AU1标签抗体确认的免疫印迹；
图1D图解说明，用异丙肾上腺素刺激之前(基线)和刺激之后，如通过cAMP酶免疫测定所测量的AC6mut小鼠和对照小鼠分离的心肌细胞中的环AMP产生；
图1E说明使用抗AU1抗体(红色)；抗小窝蛋白3(Cav-3)抗体(绿色，对于细胞质膜微囊来说)；抗蛋白质二硫键异构酶(PDI)抗体(绿色，对于肌浆网来说)；抗核纤层蛋白A抗体(绿色，对于核膜来说)和抗电压依赖性阴离子选择性通道蛋白质(VDAC)抗体(绿色，对于线粒体来说)对从AC6mut小鼠和对照小鼠分离的心肌细胞中的AC6mut蛋白质的双重免疫荧光染色；细胞核是蓝色；
如下文的实施例1中所详细论述。
图2说明PKA、PKS和PDE的活性和表达：
图2A的上图图解说明没有刺激(基线)或用异丙肾上腺素或NKH477刺激的分离的心肌细胞中的PKA活性水平；并且图2A的下图说明显示左心室(LV)均质物中的PKA蛋白质的凝胶免疫印迹；
图2B说明使用来自AC6mut小鼠和对照小鼠的左心室均质物显示关键信号传导蛋白质的磷酸化的免疫印迹；显示了磷酸化(P)PKA和总(T)PKA调控亚单位II-α和II-β、PKCα、磷酸-二酯酶3A型(PDE3A)、磷酸化肌钙蛋白I(P22/23-TnI)和总TnI；
图2C说明显示在从各组分离的培养心肌细胞中评估异丙肾上腺素刺激之前和之后的RyR2、PLB和TnI的磷酸化的免疫印迹；
图2D图解说明来自图2C的数据，其表明AC6mut小鼠中的异丙肾上腺素刺激与心肌细胞中的RyR2、PLB和TnI的增加的磷酸化相关；数据针对载荷(GAPDH)被归一化；
如下文的实施例1中所详细论述。
图3图解说明左心室收缩功能：从AC6mutTG小鼠(实心圆)分离的心脏显示响应通过宽范围的异丙肾上腺素剂量进行的异丙肾上腺素刺激的保持的LVdP/dt；空心圆表示转基因阴性对照小鼠；如下文的实施例1中所详细论述。
图4说明SRCa2+摄取、Ca2+信号传导蛋白质和转录因子：
图4A的上图图解说明来自AC6mut小鼠和TG阴性同胞对照小鼠的混合LV样品中的Ca2+摄取活性；并且图4A的下图图解说明AC6mut的表达降低了SERCA2a对Ca2+的亲和力；
图4B的上图图解说明AC6mut表达与降低的LV受磷蛋白(PLB)表达相关；并且图4B的下图图解说明AC6mut表达与增加的LVCREM-1蛋白质表达相关；并且图4B的下图说明显示蛋白质水平的凝胶的免疫印迹；数据针对载荷(GAPDH)被归一化；
图4C的上图图解说明AC6mut表达与增加的LVS100A1蛋白质表达相关；并且图4C的下图图解说明AC6mut表达与增加的LVP133-CREB蛋白质表达相关；并且图4C的下图说明显示蛋白质水平的凝胶的免疫印迹；数据针对载荷(GAPDH)被归一化；
图4D说明显示AC6mut表达不影响SERCA2a、钙网织蛋白、肌集钙蛋白或磷酸化-S16-PLB蛋白质的LV表达的凝胶的免疫印迹；
图4E说明使用抗AU1抗体(红色)和抗CREM-1抗体(绿色)或抗AU1和抗磷酸化CREB(S133，绿色)对从AC6mut小鼠和对照小鼠分离的心肌细胞中的AC6mut蛋白质的双重免疫荧光染色；细胞核以蓝色显示；
如下文的实施例1中所详细论述。
图5说明从AC6mut小鼠和对照小鼠分离的心肌细胞中的细胞溶质Ca2+瞬变：
图5A图解说明显示释放的基线Ca2+(心脏收缩-心脏舒张Ca2+)未显示AC6mut与对照之间的组差异的数据；
图5B图解说明显示用异丙肾上腺素刺激的心肌细胞中的代表性Indo-1Ca2+瞬变记录在来自AC6mut小鼠的心肌细胞中更高的数据；总结数据展示于图5C中；
图5C图解说明显示在异丙肾上腺素存在下释放的Ca2+在来自AC6mut小鼠的心肌细胞中增加的数据；
图5D图解说明显示在异丙肾上腺素存在下达到峰值Ca2+瞬变的时间在来自AC6mut小鼠的心肌细胞中减少的数据；
图5E图解说明显示在异丙肾上腺素存在下达到50％松驰的时间(τ)在来自AC6mut小鼠的心肌细胞中减少的数据；如下文的实施例1中所详细论述。
各图中相同的附图标记指示相同的元件。
具体实施方式
本发明提供组合物以及体内和离体方法，其包括施用不能产生环腺苷酸的(不能产生cAMP的)腺苷酸环化酶6型(AC6)蛋白质或多肽(也被称为“AC6mut”)或编码AC6mut的核酸或基因以治疗、改善或保护(作为预防(preventative或prophylaxis))患有心脏疾病、降低的心脏功能或输出量或心脏感染或病况的个体，所述心脏感染或病况响应降低的cAMP、增加的肌浆网(SR)Ca2+摄取和/或体内完整心肌细胞中具有缩短的松驰时间的增加的Ca2+瞬变。
在替代性实施方案中，本发明提供抑制细胞内cAMP或显著降低细胞内cAMP的量或不催化产生细胞内cAMP的AC6mut。在替代性实施方案中，本发明的AC6mut以如下方式改变细胞内信号传导：1)增强完整心肌细胞中的钙处置、2)抑制心肌细胞中细胞内cAMP水平的生成和3)保护心肌细胞免于程序化细胞死亡(凋亡)。在替代性实施方案中，当AC6mut在患者的衰竭心脏中被表达或被递送到患者的衰竭心脏中时，心脏功能增加，症状减少并且死亡率降低。因此，本发明的AC6mut递送到心脏中增加心脏功能，而没有由于cAMP生成所致的有害效应。因此，在替代性实施方案中，本发明提供用于心力衰竭和降低的心脏功能的理想疗法。
在替代性实施方案中，本发明提供用于编码AC6mut的核酸或基因、或包含(其中含有)编码AC6mut的核酸或基因的表达运载体(例如，载体、重组病毒等)的递送和表达(例如，受控表达)的组合物和方法，所述递送和表达使得AC6mut蛋白质在心肌细胞中被选择性地表达或仅被递送到心肌细胞中，或供选择地，被释放到血流或全身循环中，其中所述AC6mut蛋白质可以对身体中的例如如在治疗心血管疾病的情况下的心脏具有有益作用。
在替代性实施方案中，本发明提供用于编码AC6mut的核酸或基因的体内表达的递送运载体、载体、表达载体、重组病毒等以实施本发明的方法。在替代性实施方案中，表达AC6mut的递送运载体、载体、表达载体、重组病毒等或所述AC6mut核酸或基因可以例如在门诊患者在例如诊所就诊期间通过肌内(IM)注射、直接注射到心脏中、通过静脉内(IV)注射、通过皮下注射、通过吸入、通过生物弹射击粒子递送系统(例如，被称为的“基因枪”)等被递送。
在替代性实施方案中，编码AC6mut的核酸或基因(例如，包括带有它们作为“有效载荷”的递送运载体(例如，脂质体)、载体、表达载体、重组病毒等)被靶向肌细胞、心肌细胞或直接递送到心肌细胞中用于不能产生cAMP的AC的定向表达或在靶心脏器官中直接表达。
在替代性实施方案中，这种“外周”递送模式，例如，递送运载体、载体、表达载体、重组病毒等被IM或IV注射，可以避免当基因或核酸在器官(例如，心脏、肺或肾脏)自身中被直接表达时所遇到的问题。期望的AC6mut蛋白质或递送运载体、载体、表达载体、重组病毒等在血流或全身循环中的持续分泌也避免了通过输注施用蛋白质、递送运载体、载体、表达载体、重组病毒等的困难和代价，所述施用对于在身体内展现非常短的半衰期的许多蛋白质、递送运载体、载体、表达载体、重组病毒等来说可能特别成问题。
在替代性实施方案中，本发明提供能够针对定制治疗和保证最佳安全性而容易且有效地开启和关闭表达AC6mut的核酸或基因表达的方法。
在替代性实施方案中，即使与它们的一个或多个作用位点相隔一定距离(例如，解剖学上的远端)而被分泌到血液或全身循环中，AC6mut蛋白质或由表达AC6mut的核酸或基因表达的蛋白质也对组织或器官(例如，心脏、血管、肺、肾脏或其它靶标)具有有益的或有利的作用(例如，治疗作用或预防作用)。
在本发明的示例性实施方案中，使用表达AC6mut的核酸或编码不能产生cAMP的AC的基因来实施本发明的方法，包括但不限于例如治疗心脏疾病、心力衰竭、充血性心力衰竭(CHF)、心输出量或功能的任何降低或其任何组合。
例如，在替代性实施方案中，递送运载体、载体、表达载体、重组病毒等(例如，长期病毒或病毒载体)可以在例如门诊患者在例如医生的办公室中例如在全身性静脉(例如，IV)中或通过肌内(IM)注射、通过吸入或通过生物弹射击粒子递送系统(例如，被称为的“基因枪”)被注射。在替代性实施方案中，数天或数周后(例如，4周后)，向所述个体、患者或受试者施用(例如，吸入、被注射或吞咽)诱导表达AC6mut的核酸或基因的表达的化学剂或药物；例如，每天一次(或更加频繁或更不频繁)施用口服抗生素(例如，强力霉素或雷帕霉素)，这将激活所述基因的表达。在替代性实施方案中，在所述核酸或基因的“激活”或诱导表达(例如，通过可诱导启动子)之后，AC6mut蛋白质被合成并释放到受试者的循环中(例如，进入血液中)，且随后具有有益于个体或患者(例如，有益于心脏功能)的有利生理作用，例如，治疗作用或预防作用。当医生或受试者期望终止治疗时，受试者仅仅停止服用激活的化学剂或药物，例如，抗生素。
在替代性实施方案中，本发明的应用包括：治疗重度低射血分数心力衰竭；治疗肺动脉高压；治疗射血分数正常性心力衰竭；替代需要住院和持续静脉内输注用于治疗肺动脉高压和心力衰竭的血管活性肽的现行疗法；和治疗其它病况，其中AC6mut或AC6mut核酸或基因的受控表达促进在身体内的有利作用。
生成和操作核酸
在替代性实施方案中，为了实施本发明的方法，本发明提供编码AC6mut多肽的被分离的核酸或基因、合成的核酸或基因和/或重组的核酸或基因。在替代性实施方案中，为了实施本发明的方法，本发明以重组形式在(例如，被剪接成的)用于体内表达的(例如，被剪接成的)表达运载体中，例如，在载体(例如，AAV或其任何假型、杂合体或衍生物)或重组病毒中提供表达AC6mut的核酸或基因。
在替代性实施方案中，哺乳动物(例如，人或鼠)AC6mut可以被用于实施本发明，其中所述AC6mut包含在腺苷酸环化酶(AC)多肽的催化核心中具有不带电荷的氨基酸或非极性氨基酸对带电荷的氨基酸或酸性氨基酸的取代的AC多肽。人AC6多肽(SEQIDNO:10)的催化核心(也被称为催化区域1(C1))是氨基酸残基307到675。鼠AC6多肽(SEQIDNO:11)的催化核心是氨基酸残基315到683。
在替代性实施方案中，所述不带电荷的氨基酸或非极性氨基酸是丙氨酸(Ala)，并且任选地，所述酸性氨基酸是天冬氨酸(Asp)，或任选地，所述不带电荷的氨基酸或非极性氨基酸是Ala并且所述酸性氨基酸是Asp。
在替代性实施方案中，本发明提供(鼠)AC6mut多肽(SEQIDNO:12)，其包含在鼠腺苷酸环化酶(AC)多肽的催化核心中的第436位具有丙氨酸或Ala(或“A”)对天冬氨酸或Asp(或“D”)的取代的鼠AC多肽；即，在该实施方案中，所述鼠腺苷酸环化酶(AC)多肽在所述鼠AC多肽的催化核心中的第436位具有取代D＝>A或Ala对Asp的取代(SEQIDNO:11是D＝>A取代之前的氨基酸序列)。
在替代性实施方案中，本发明提供(鼠)AC6mut多肽(SEQIDNO:17)，其包含在鼠腺苷酸环化酶(AC)多肽的催化核心中的第426位具有丙氨酸或Ala(或“A”)对天冬氨酸或Asp(或“D”)的取代(即，D＝>A取代)的鼠AC多肽。SEQIDNO:17多肽与SEQIDNO:12多肽的不同之处在于SEQIDNO:17多肽缺少SEQIDNO:12多肽的前10个氨基酸；所述多肽在其它方面是相同的。SEQIDNO:16是D＝>A取代之前的鼠氨基酸序列。缺乏氨基末端的该异型体被认为是SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的前10个氨基酸未翻译的野生型鼠多肽。
在替代性实施方案中，本发明提供(人)AC6mut多肽(SEQIDNO:13)，其包含在人腺苷酸环化酶(AC)多肽的催化核心中的第428位具有丙氨酸或Ala(或“A”)对天冬氨酸或Asp(或“D”)的取代的人AC多肽；即，在该实施方案中，所述鼠腺苷酸环化酶(AC)多肽在鼠AC多肽的催化核心中的第428位具有取代D＝>A或Ala对Asp的取代。
人AC6核酸编码序列(SEQIDNO:14)相对于鼠编码序列：86％同源性(SEQIDNO:15)。人AC6多肽(SEQIDNO:10)相对于鼠AC6多肽(SEQIDNO:11)在氨基酸水平下：94％同源性。
AC6mutD＝>A取代在人AC6mut的催化核心中的相对结构位置与在鼠AC6mut中完全相同，如下面所说明的(显示野生型仍然具有如下面加下划线的天冬氨酸或“D”残基：
在替代性实施方案中，人ACmut核酸编码序列(SEQIDNO:13)和鼠ACmut核酸编码序列(SEQIDNO:12)两者是通过将腺苷(或“A”)变为胞嘧啶(或“C”)而制得，如下文所示，其中“A”残基在其变为“C”之前在下面被加下线；即，下面说明的野生型人AC6(SEQIDNO:10)和野生型鼠AC6(SEQIDNO:11):
在替代性实施方案中，通过例如克隆和表达cDNA文库、通过PCR扩增信使DNA或基因组DNA等来制备、分离和/或操作本发明的核酸。用于实施本发明的核酸和基因(包括DNA、RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合体)可以从各种来源分离、经遗传改造、扩增和/或重组表达/生成。从这些核酸生成的重组多肽(例如，用于实施本发明的不能产生cAMP的AC嵌合蛋白质)可以被各自分离或克隆，并且测试其期望活性。可以使用任何重组表达系统，包括例如细菌、真菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统或表达运载体。
或者，用于实施本发明的核酸可以通过熟知的化学合成技术体外合成，如在例如Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661；Belousov(1997)NucleicAcidsRes.25:3440-3444；Frenkel(1995)FreeRadic.Biol.Med.19:373-380；Blommers(1994)Biochemistry33:7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859；美国专利号4,458,066中所述。
用于操作用于实施本发明的核酸的技术，如例如亚克隆、标记探针(例如，使用Klenow聚合酶的随机引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交等在科学和专利文献中有充分的描述，参见例如Sambrook编辑，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(第2版)，1-3卷，ColdSpringHarborLaboratory,(1989)；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,Ausubel编辑，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork(1997)；LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY:HYBRIDIZATIONWITHNUCLEICACIDPROBES,PartI.TheoryandNucleicAcidPreparation,Tijssen编辑，Elsevier,N.Y.(1993)。
获得和操作用于实施本发明的方法的核酸的另一有用手段是从基因组样品中克隆，并且如果期望的话，筛选和再克隆从例如基因组克隆或cDNA克隆分离或扩增的插入物。用于本发明的方法中的核酸的来源包括基因组或cDNA文库，所述文库包含在例如哺乳动物人工染色体(MAC)，参见例如美国专利号5,721,118；6,025,155；人类人工染色体，参见例如Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15:333-335；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，参见例如Woon(1998)Genomics50:306-316；源于P1的载体(PAC)，参见例如Kern(1997)Biotechniques23:120-124；粘粒、重组病毒、噬菌体或质粒中。
在替代性实施方案中，为了实施本发明的方法，使用AC6mut融合蛋白质和编码它们的核酸。任何AC6mut多肽均可用于实施本发明。在替代性实施方案中，AC6mut蛋白质可以被融合到异源肽或多肽，如用于将所述多肽靶向期望的细胞类型如心肌细胞的肽。
在替代性实施方案中，接合或融合到用于实施本发明的蛋白质的异源肽或多肽可以是赋予期望特性如荧光检测、增加的稳定性和/或简化的纯化的N-末端鉴别肽。用于实施本发明的肽和多肽还可以作为融合蛋白质被合成和表达，所述融合蛋白质中连接有一个或多个额外的结构域，用于例如用于产生免疫原性更强的肽、以便更易于分离重组合成的肽、以便鉴别和分离抗体和表达抗体的B细胞等。促进检测和纯化的结构域包括例如金属螯合肽，如允许在固定的金属上纯化的多组氨酸标签(polyhistidinetract)和组氨酸-色氨酸模块；允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域；和用于FLAGS延伸/亲和纯化系统(ImmunexCorp,SeattleWA)中的结构域。在纯化结构域与包含基序的肽或多肽之间包含可切割的连接体序列如Xa因子或肠激酶(Invitrogen,SanDiegoCA)以促进纯化。例如，表达载体可以包括编码表位的核酸序列，该核酸序列连接到六组氨酸残基，之后是硫氧还蛋白和肠激酶切割位点(参见例如Williams(1995)Biochemistry34:1787-1797；Dobeli(1998)ProteinExpr.Purif.12:404-414)。组氨酸残基促进检测和纯化，而肠激酶切割位点提供了从融合蛋白的剩余部分纯化表位的手段。关于编码融合蛋白质的载体的技术和融合蛋白质的应用在科学和专利文献中有充分的描述，参见例如Kroll(1993)DNACell.Biol.,12:441-53。
用于实施本发明的核酸或核酸序列(例如，编码AC6mut的核酸)可以是寡核苷酸、核苷酸、聚核苷酸；或者是指这些中的任何一种的片段；是指基因组的或合成来源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链，并且可以代表有义链或反义链；是指肽核酸(PNA)；或者是指天然或合成来源的任何DNA样或RNA样物质。用于实施本发明的化合物包括“核酸”或“核酸序列”，包括寡核苷酸、核苷酸、聚核苷酸或这些中的任一个的任何片段；并且包括基因组的或合成来源的DNA或RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA、iRNA)，它们可以是单链或双链；并且可以是有义链或反义链、或肽核酸(PNA)、或天然或合成来源的任何DNA样或RNA样物质，包括例如iRNA、核糖核蛋白质(例如，例如，双链iRNA，例如，iRNP)。用于实施本发明的化合物包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸。用于实施本发明的化合物包括具有合成骨架的核酸样结构，参见例如Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144:189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry36:8692-8698；Samstag(1996)AntisenseNucleicAcidDrugDev6:153-156。用于实施本发明的化合物包括“寡核苷酸”，其包括可以化学合成的单链聚脱氧核苷酸或两条互补的聚脱氧核苷酸链。用于实施本发明的化合物包括不具有5'磷酸盐的合成寡核苷酸，因此不是在激酶存在下用ATP添加磷酸的情况下，所述合成寡核苷酸将不连接到另一寡核苷酸。合成寡核苷酸可以连接到未被去磷酸化的片段。
在替代性方面，用于实施本发明的化合物包括参与产生AC6mut多肽的基因或任何DNA区段；它可以包括在编码区之前和之后的区域(前导区和非转录尾区)以及(适用时)各编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。“可操作地连接"可以指两个或更多个核酸(例如，DNA)区段之间的功能关系。在替代性方面，它可以指转录调控序列与被转录序列的功能关系。例如，如果启动子刺激或调节编码序列在适当的宿主细胞或其它表达系统中的转录，则其可以可操作地连接到该编码序列，如用于实施本发明的核酸。在替代性方面，当启动子转录调控序列可以与被转录序列物理地邻接，即它们可以顺式作用时，则它们可以可操作地连接到所述被转录序列。在替代性方面，转录调控序列如增强子无需物理地邻接被它们增强的编码序列或与所述编码序列极为接近地定位。
在替代性方面，本发明包括使用包含用于实施本发明的核苷酸序列的"表达盒"，其能够影响核酸(例如，结构基因或转录物(例如，编码AC6mut蛋白质))在与此类序列相容的宿主中的表达。表达盒可以包括至少一个启动子，该启动子与多肽编码序列或抑制序列可操作地连接；且一个方面，与其它序列(例如，转录终止信号)可操作地连接。还可以使用在影响表达方面有必要的或有帮助的额外因子，例如，增强子。
在替代性方面，用于实施本发明的表达盒还包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体等。在替代性方面，用于实施本发明的"载体"可以包含可以感染、转染、短暂地或永久地转导细胞的核酸。在替代性方面，用于实施本发明的载体可以是裸核酸或与蛋白质或脂质复合的核酸。在替代性方面，用于本发明的载体可以包含病毒或细菌核酸和/或蛋白质和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜等)。在替代性方面，用于实施本发明的载体可以包括但不限于复制子(例如，RNA复制子、噬菌体)，DNA片段可以与该复制子连接并被复制。载体因此包括但不限于RNA、自主自我复制的环状或线性DNA或RNA(例如，质粒、病毒等，参见例如美国专利号5,217,879)，并且可以包括表达质粒和非表达质粒两者。在替代性方面，用于实施本发明的载体可以在细胞有丝分裂期间作为自主结构被细胞稳定地复制，或可以被并入宿主基因组内。
在替代性方面，用于实施本发明的“启动子”包括能够驱动编码序列在细胞(例如哺乳动物细胞，如心脏、肺、肌肉、神经或脑细胞)中转录的所有序列。因此，用于本发明的构建体中的启动子包括参与调控或调节基因转录的时机和/或速率的顺式作用转录控制元件和调控序列。例如，用于实施本发明的启动子可以是顺式作用转录控制元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5'和3’非翻译区或内含子序列，它们参与转录的调控。这些顺式作用序列通常与蛋白质或其它生物分子相互作用来实施(打开/关闭、调控、调节等)转录。
在替代性实施方案中，用于实施本发明的“组成型”启动子可以是在多数环境条件和发育状态或细胞分化状态下连续地驱动表达的那些。在替代性实施方案中，用于实施本发明的“诱导型”或“可调控型”启动子可以在环境条件、所施用的化学剂或发育条件的影响下指导本发明的核酸的表达。
腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)的递送
在替代性实施方案中，递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物是或包括：腺相关病毒(AAV)；重组AAV病毒、载体或病毒粒子；或腺病毒载体。在替代性实施方案中，AAV、重组AAV病毒或载体或腺病毒载体是或包括AAV血清型AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9；恒河猴AAV(AAVrh)或AAVrh10；或其任何假型、杂合体或衍生物。
在替代性实施方案中，这些载体中的任何一种(或本发明的任何递送运载体)趋向于特定的细胞、组织或器官，或被设计用于特异性递送到特定的细胞、组织或器官。例如，在替代性实施方案中，用于实施本发明的AAV(或用于实施本发明的任何载体或递送运载体)趋向于心脏(或对心脏具有趋向性)。在其它实施方案中，用于实施本发明的AAV(或任何载体或递送运载体)趋向于另一组织或器官，例如，肝脏，或被设计用于特异性递送到另一组织或器官，例如，肝脏。在替代性实施方案中，这种“外周”递送模式，例如，递送运载体、载体、重组病毒等被IM或IV注射，可以避免当基因或核酸在器官(例如，心脏、肺或肾脏)自身中被直接表达时所遇到的问题。例如，已发现AAV5、AAV6和AAV9趋向于心脏，参见例如Fang等人，HumGeneTherMethods2012年10月17日；Zincarelli等人，ClinTranslSci.2010年6月；3(3):81-9。
用于实施本发明的腺相关病毒(AAV)可以是细小病毒科(Parvoviridae)的小的无包膜单链DNA动物病毒的任何非病原性成员。AAV需要辅助病毒(例如，腺病毒)用于复制，因此用于实施本发明的AAV在被向受试者施用时不复制。AAV可以感染相对宽范围的细胞类型并且仅刺激轻微的免疫应答，特别是相较于许多其它病毒如腺病毒来说。用于实施本发明的AAV血清型包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。用于实施本发明的AAV可以来自其它动物，包括：例如鸟类(例如，禽AAV或AAAV)、牛科动物(例如，牛科动物AAV或BAAV)、犬科动物、马科动物、绵羊和猪。
在替代性实施方案中，用于实施本发明的AAV载体是其中至少一部分AAV基因组被异源核酸分子置换的重组核酸分子；可以例如通过去除病毒复制和衣壳基因来置换约4.7千碱基(kb)的AAV基因组DNA。在替代性实施方案中，异源核酸分子仅仅在每个末端上侧翼有AAV反向末端重复(ITR)。ITR用作复制起点并且含有拯救、整合、从克隆载体切除和封装所需的顺式作用元件。在替代性实施方案中，用于实施本发明的AAV包含可操作地连接到异源核酸分子的启动子以控制表达。
AAV载体可借助于在细胞中表达的辅助病毒或辅助功能体(helperfunction)被体外包装到AAV衣壳中以获得AAV病毒粒子。AAV病毒粒子的血清型和细胞趋向性由病毒衣壳蛋白质的性质被赋予。AAV载体和AAV病毒粒子可以有效地转导细胞，包括分裂细胞和非分裂细胞。AAV载体和病毒粒子已被证明是安全的并且导致在各种细胞类型中的长期体内存留和表达。
在替代性实施方案中，一种ITR接合到编码AC6mut的核酸分子的5'末端，并且一种ITR接合到编码AC6mut的核酸分子的3'末端。ITR的示例包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAAV、BAAV和本领域技术人员已知的其它AAVITR。在一个实施方案中，AAVITR选自AAV2ITR、AAV5ITR、AAV6ITR和BAAVITR。在一个实施方案中，AAVITR是AAV2ITR。在一个实施方案中，AAVITR是AAV5ITR。在一个实施方案中，AAVITR是AAV6ITR。在一个实施方案中，AAVITR是BAAVITR。
在替代性实施方案中，用于实施本发明的AAV载体(和其它载体、重组病毒等)包含其它序列，如表达控制序列，例如，启动子、增强子、阻遏物(represssor)、核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点、转录终止子序列和微小RNA结合位点。启动子的示例包括但不限于AAV启动子(如p5、p19或p40启动子)、腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子)、巨细胞病毒(CMV)启动子、乳头瘤病毒启动子、多瘤病毒启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、肉瘤病毒启动子、SV40启动子、其它病毒启动子、肌动蛋白启动子、淀粉酶启动子、免疫球蛋白启动子、激肽释放酶启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、内源性启动子、由雷帕霉素或其它小分子调控的启动子、其它细胞启动子和本领域技术人员已知的其它启动子。在一个实施方案中，所述启动子是AAV启动子。在一个实施方案中，所述启动子是CMV启动子。本领域技术人员可以实现对于待包含的表达控制序列的选择。
在替代性实施方案中，使用不同血清型(如通过此类载体内的ITR的血清型所确定)的AAV载体，例如：AAV1载体、AAV2载体、AAV3载体、AAV4载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV7载体、AAV8载体、AAV9载体、AAV10载体、AAV11载体、AAV12载体、AAAV载体和BAAV载体。在替代性实施方案中，AAV载体是AAV2载体、AAV5载体、AAV6载体或BAAV载体。
在替代性实施方案中，使用嵌合的、穿梭的或衣壳改性的AAV衍生物向病毒载体提供一种或多种期望的功能。在替代性实施方案中，相较于包含天然存在的AAV基因组的AAV病毒载体，这些衍生物可以展示增加的基因递送效率、降低的免疫原性(体液免疫原性或细胞免疫原性)、改变的趋向性范围和/或对特定细胞类型的改进的靶向。在替代性实施方案中，通过以下方式实现增加的基因递送效率：细胞表面处的改进的受体或共受体结合、改进的内在化、在细胞内和向细胞核中的改进的运输、病毒粒子的改进的脱壳和/或单链基因组向双链形式的改进的转化。在替代性实施方案中，对特定细胞群体的改变的趋向性范围或靶向使效率增加，使得所述载体的剂量不被施用至不需要载体的组织而稀释。
在替代性实施方案中，使用如例如美国专利申请号20140107186中所述的无衣壳的AAV载体。在替代性实施方案中，使用如例如美国专利申请号20140056854中所述的趋向于心脏或肝脏的AAV9载体。在替代性实施方案中，使用描述于例如美国专利申请号20130310443；20130136729中的AAV载体来实施本发明。
在替代性实施方案中，针对例如改进或改变的性能将AAV载体假型化，例如，以改进或改变病毒的趋向性或其它特征，如例如美国专利申请号20120220492中所述。例如，特异性的靶向或改进的靶向允许递送运载体(例如，AAV病毒粒子)仅感染欲被感染的那些细胞并且仅将治疗性核酸(例如，AC6mut)递送至欲被感染的那些细胞，由此降低基因疗法的不需要的副作用的风险并增加基因疗法的功效。
在替代性实施方案中，病毒载体的剂量由诸如所治疗的病况、患者的年龄、体重和健康的因素来确定，因此可以随患者而变化。例如，病毒载体的治疗有效的人剂量通常在约0.1ml到约100ml的含有浓度为约1x109到1x1016个基因组的病毒载体的溶液的范围。用于递送到大器官(例如，肝脏、肌肉、心脏和肺)的示例性人剂量可以是每1kg约5x1010到5x1013个AAV基因组，体积为约1mL到100mL。调节所述剂量以使治疗益处与任何副作用保持平衡并且此类剂量可以根据采用所述重组载体的治疗应用而变化。可以监测转基因的表达水平以确定剂量频率，从而得到病毒载体，例如，AAV载体。
制剂
在替代性实施方案中，本发明提供用于在心肌细胞中体内递送和表达AC6mut的组合物和方法。在替代性实施方案中，这些组合物包含被配制用于这些目的的编码AC6mut的核酸，例如，在缓冲液、盐水溶液、粉末、乳液、囊泡、脂质体、纳米粒子、纳米脂质体粒子(nanolipoparticle)等中配制的表达运载体或编码AC6mut的核酸。
在替代性实施方案中，所述组合物可以任何方式被配制并且可以各种浓度和形式被应用，这取决于期望的体内或离体条件，包括期望的体内或离体施用方法等。关于用于体内或离体制剂和施用的技术的细节在科学和专利文献中有充分描述。
用于实施本发明的编码AC6mut的核酸的制剂和/或运送体(carrier)在本领域内众所周知。用于实施本发明的制剂和/或运送体可以呈适于体内或离体应用的诸如片剂、丸剂、粉末、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等的形式。
在替代性实施方案中，用于实施本发明的编码AC6mut的核酸可以与水溶液和/或缓冲溶液混合，或作为水性悬浮液和/或缓冲悬浮液，例如，包含悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；和分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、烯基氧化物与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七氧乙烯鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol))、氧化乙烯与衍生自脂肪酸与己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。可以通过例如使用适当的缓冲剂来调节制剂的渗透性(osmolarity)。
在实施本发明时，本发明的化合物(例如，制剂)可以包含溶解于药学上可接受的运送中的编码AC6mut的核酸或基因的溶液，例如可以采用的可接受的运载体和溶剂包括水和林格氏溶液(Ringer'ssolution)、等渗氯化钠。另外，可以采用无菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯或脂肪酸如油酸。在一个实施方案中，用于实施本发明的溶液和制剂是无菌的并且可以被制造成通常不含不期望的物质。在一个实施方案中，这些溶液和制剂通过常规的熟知灭菌技术灭菌。
用于实施本发明的溶液和制剂可以包含按要求接近生理条件的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。活性剂(例如，编码AC6mut的核酸或基因)在这些制剂中的浓度可以广泛地变化，并且可以主要基于流体体积、粘度等，根据所选的特定的体内或离体施用模式和期望的结果(例如，增加体内AC6mut表达)来选择。
用于实施本发明的溶液和制剂可以被冻干；例如，本发明提供包含编码AC6mut的核酸或基因的稳定冻干制剂。在一个方面，通过将包含编码AC6mut的核酸或基因和增量剂(例如，甘露醇、海藻糖、棉子糖和蔗糖或其混合物)的溶液冻干制得该制剂。用于制备稳定的冻干制剂的方法可以包括将约2.5mg/mL蛋白质、约15mg/mL蔗糖、约19mg/mLNaCl和pH大于5.5但小于6.5的柠檬酸钠缓冲液的溶液冻干。参见例如美国专利申请号20040028670。
本发明的组合物和制剂可以通过使用脂质体来递送(还参见下文的论述)。通过使用脂质体，特别是在脂质体表面带有对靶细胞(例如，心肌细胞)具有特异性或以其他方式优先针对特定组织或器官类型(例如，心脏)的配体时，可以在体内或离体施加中集中将活性剂递送到靶细胞(例如，心肌细胞)中。
纳米粒子、纳米脂质体粒子和脂质体
本发明还提供包含用于实施本发明方法的化合物(例如，AC6mut或编码AC6mut的核酸或基因)的纳米粒子、纳米脂质体粒子、囊泡和脂质体膜，例如，以在体内或离体将AC6mut或编码AC6mut的核酸或基因递送到心肌细胞。在替代性实施方案中，这些组合物被设计成靶向特定的分子，包括生物分子，如多肽，包括细胞表面多肽，例如，用于靶向期望的细胞类型，例如，哺乳动物心细胞、心肌细胞等。
本发明提供包含用于实施本发明的化合物的多层脂质体，例如，如Park等人，美国专利公开号20070082042中所述。多层脂质体可以使用包含角鲨烷、固醇、神经酰胺、中性脂质或中性油、脂肪酸和卵磷脂的油相组分的混合物制备成约200nm到5000nm的粒度，例如，以捕获编码不能产生cAMP的AC的核酸或基因。
脂质体可以使用例如如Park等人，美国专利公开号20070042031中所述的任何方法制得，包括通过包封活性剂(例如，编码AC6mut的核酸或基因)来产生脂质体的方法，所述方法包括在第一储器中提供水溶液；在第二储器中提供有机脂质溶液，然后在第一混合区中混合所述水溶液与所述有机脂质溶液以产生脂质体溶液，其中所述有机脂质溶液与所述水溶液混合以基本上瞬时地产生包封所述活性剂的脂质体；并且然后立即混合所述脂质体溶液与缓冲溶液以产生稀释的脂质体溶液。
在一个实施方案中，用于实施本发明的脂质体组合物包含被取代的铵和/或聚阴离子，例如，用于将用于实施本发明的化合物(例如，编码AC6mut的核酸或基因)靶向递送到期望的细胞类型，如例如美国专利公开号20070110798中所述。
本发明还提供包含用于实施本发明的化合物(例如，编码AC6mut的核酸或基因)的纳米粒子，其呈含活性剂的纳米粒子(例如，二级纳米粒子)的形式，如例如美国专利公开号20070077286中所述。在一个实施方案中，本发明提供包含本发明的脂溶性活性剂或脂溶解的水溶性活性剂的纳米粒子以与二价或三价金属盐作用。
在一个实施方案中，固体脂质悬浮液可以用于配制用于实施本发明的编码AC6mut的核酸或基因和将用于实施本发明的编码AC6mut的核酸或基因递送到体内或离体的哺乳动物细胞，如例如美国专利公开号20050136121中所述。
递送运载体
在替代性实施方案中，任何递送运载体均可以用于实施本发明的方法或组合物，例如，以递送AC6mut或编码AC6mut的核酸或基因以在体内或离体实施本发明的方法。例如，可以使用包含聚阳离子、阳离子型聚合物和/或阳离子型肽(如聚乙烯亚胺衍生物)的递送运载体，例如，如例如美国专利公开号20060083737中所述。
在一个实施方案中，干燥的多肽-表面活性剂复合体被用于配制本发明的组合物，其中表面活性剂通过非共价键与核酸缔合，例如如例如美国专利公开号20040151766中所述。
在一个实施方案中，用于实施本发明的核酸可以作为聚合水凝胶或水溶性共聚物被施加到细胞，例如，如美国专利号7,413,739中所述；例如，核酸可以通过亲核加成通过强亲核体和共轭不饱和键或共轭不饱和基团之间的反应来聚合，其中每种前体组分包含至少两种强亲核体或至少两个共轭不饱和键或共轭不饱和基团。
在一个实施方案中，使用带有细胞膜渗透性肽缀合物的运载体将核酸施加到细胞，例如，如美国专利号7,306,783；6,589,503中所述。在一个方面，核酸本身缀合到细胞膜渗透性肽。在一个实施方案中，核酸和/或递送运载体缀合到介导转运的肽，例如，如美国专利号5,846,743中所述，该美国专利描述了高度碱性且结合聚磷酸肌醇的介导转运的肽。
在一个实施方案中，电透化被用作主要手段或辅助手段以将编码AC6mut的核酸或基因递送到细胞，例如，使用如例如美国专利号7,109,034；6,261,815；5,874,268中所述的任何电穿孔系统进行。
体内植入细胞
在替代性实施方案中，本发明的方法还包括植入或移入细胞，例如，心细胞或心肌细胞，所述细胞包含或表达用于实施本发明的编码AC6mut的核酸或基因；并且在一个方面，本发明的方法包括在血管、组织或器官(例如，心脏或心肌细胞)中离体或体内植入或移入编码AC6mut的核酸或基因(或表达它们的细胞)，或在有此需要的个体中植入或移入再程序化的分化细胞。
可以从个体中移出细胞，使用本发明的组合物和/或方法对所述细胞进行处理，并且使用任何已知的技术或方案将其再插入(例如，注入或移入)到组织、器官或该个体中。例如，可以使用微球体再植入(例如，注入或移入)去分化的再程序化细胞、干细胞或再程序化的分化细胞，例如如美国专利号7,442,389中所述；例如，在一个方面，细胞运送体包括增量剂以及包含这些细胞的自体运送体，所述增量剂包含圆的光滑的聚甲基丙烯酸甲酯微粒(其被预加载在混合和递送系统内)。在另一实施方案中，向组织、器官(例如，心脏)和/或需要其的个体再施用于生物相容性交联基质中的所述细胞，如例如美国专利申请公开号20050027070中所述。
在另一实施方案中，向组织、器官和/或需要其的个体再施用(例如，注入或移入)于生物相容性非免疫原性涂层内或由生物相容性非免疫原性涂层所保护的本发明的细胞(例如，通过实施本发明方法制得的细胞)，所述涂层例如在合成植入体的表面上，例如如美国专利号6,969,400中所述，该美国专利描述了例如以下方案：其中AC6mut可以缀合到聚乙二醇，该聚乙二醇已被修饰而含有多个亲核基团，如伯氨基或硫醇基。
在一个实施方案中，使用如例如美国专利号7,442,390；5,733,542中所述的移植方法向组织、器官和/或需要其的个体再施用(例如，注入或移入)本发明的细胞(例如，通过实施本发明方法制得的细胞)。
可以使用用于向组织或器官(例如，心肌细胞、心脏)递送多肽、核酸和/或细胞的任何方法，并且这些方案在本领域内众所周知，例如，如美国专利号(USPN)7,514,401中所述，该美国专利描述了例如使用向心脏原位冠状动脉内(IC)、静脉内(IV)和/或局部递送(直接心肌注射)多肽、核酸和/或细胞。例如，在替代性实施方案中，气溶胶药物粒子进入肺以及进入血流中、基因疗法、连续输注、重复注射和/或缓释聚合物可以被用于向组织或器官(例如，肺、肾脏、心脏)递送多肽、核酸和/或细胞。在替代性实施方案中，核酸和/或细胞可以通过导管被给予冠状动脉中或通过有限的胸廓切开术进行直接注射被给予左心房或心室心肌中；或通过在心导管插入术期间通过的导管被递送到心肌中；或被递送到心包腔中。
在替代性实施方案中，用于实施本发明的核酸或包含用于实施本发明的核酸的载体(例如，腺病毒相关病毒或载体(AAV)、或腺病毒基因疗法载体)、或本发明的囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子(NLP)等，例如如USPN7,501,486中所述至组织或器官(例如，肺、肾脏、心脏)。
用于实施本发明的组合物可以与其它治疗剂组合使用，所述其它治疗剂例如血管生成剂、抗血栓剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素剂、抗病毒剂和病毒载体。
用于实施本发明的组合物可以用于改善或治疗各种心脏病变和心血管疾病中的任何一种，例如，心脏病变和心血管疾病，例如，冠状动脉疾病(CAD)；动脉粥样硬化；血栓形成；再狭窄；血管炎，包括自身免疫性血管炎和病毒性血管炎，如结节性多动脉炎、变应性肉芽肿血管炎、高安动脉炎、川崎病和立克次体血管炎；动脉粥样硬化性动脉瘤；心肌肥大；先天性心脏疾病(CHD)；缺血性心脏疾病和绞痛；获得性瓣膜疾病/心内膜疾病；原发性心肌病，包括心肌炎；心律不齐；和移植排斥；代谢性心肌病和心肌病变，如充血性心肌病变、肥大性心肌病变或限制性心肌病变；和/或心脏移植。
试剂盒和说明书
本发明提供包含本发明组合物和方法的试剂盒，包括其使用说明书。因此，还可提供本发明的细胞、递送运载体、载体、表达载体、重组病毒等。
例如，在替代性实施方案中，本发明提供包含组合物的试剂盒，所述组合物包含(a)编码AC6mut的核酸、(b)本发明的递送运载体、载体、表达载体、重组病毒等、(c)本发明的液体或水性制剂、或(d)本发明的囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子。在一个方面，所述试剂盒进一步包含用于实施本发明的任何方法的说明书，所述方法例如用于向心肌细胞递送期望的AC6mut或表达AC6mut的核酸、载体等的体外或离体方法。
将参考以下实施例来进一步描述本发明；然而，应当理解，本发明并不限于此类实施例。
实施例
实施例1：不能产生cAMP的AC的递送增加心脏功能
本实施例证实本发明的示例性实施方案的有效性：向心肌细胞递送不能产生cAMP的AC用于治疗心力衰竭。在本研究中，我们探问减少LVcAMP产生的AC突变分子是否会通过其单独对Ca2+处置的作用而对左心室(LV)功能具有有利的作用。
正性肌肉强缩剂(positiveinotrope)的如此多的临床试验已经失败，因此现在不言自明的是，增加cAMP的药剂对衰竭的心脏有害。一种替代策略是使用不影响cAMP的药剂改变心肌Ca2+处置或肌丝对Ca2+的响应。虽然左心室(LV)功能与腺苷酸环化酶(AC)活性紧密关联，但AC的有益作用可能与cAMP无关，而是源于对Ca2+处置的作用。
在本研究中，我们生成了具有不能产生环腺苷酸的(不能产生cAMP的)腺苷酸环化酶6型(AC6)多肽(被称为的“AC6突变”或“AC6mut”)的心脏定向表达的转基因小鼠。这些AC6mut转基因小鼠的心肌细胞显示响应异丙肾上腺素的受损的cAMP产生(74％降低；p<0.001)，但LV大小和功能正常。经分离的心脏显示响应异丙肾上腺素刺激的保持的LV功能。AC6mut表达与增加的肌浆网Ca2+摄取相关并且用于SERCA2a激活的EC50被降低。从AC6mut小鼠分离的心肌细胞显示响应异丙肾上腺素的Ca2+瞬变的增加的幅度(p＝0.0001)。AC6mut表达还与LVS100A1的增加的表达(p＝0.03)和受磷蛋白蛋白质的降低的表达(p＝0.01)相关。本研究确定LVAC突变表达与正常的心脏功能相关，尽管cAMP生成受损。所述机制似乎通过对Ca2+处置的作用—尽管cAMP降低但仍然发生的作用进行。
来自先前研究的数据表明增加的心AC6型(AC6)(在哺乳动物心肌细胞中表达的优势AC异型体[6])对衰竭的左心室(LV)具有多种有益作用[7],[8],[9],[10],[11],[12]。这些出乎意料的有益作用必须与对心脏的贝塔(beta)(β)肾上腺素能受体(βAR)刺激和细胞内cAMP的升高的可怕后果协调[13],[14],[15],[16],[17],[18]。实际上，衰竭的心脏中的AC6表达的明显益处是矛盾的。使用药理学抑制剂，来自先前研究的数据表明增加的心脏AC6表达的一些有益作用不取决于增加的cAMP生成[2],[3]。由于在被培养的心肌细胞中使用药理学抑制的研究的固有限制，因此我们通过在催化核心中的第426位(426位：位置编号基于SEQIDNO:16)进行Ala对Asp的取代生成了催化无活性的鼠AC6突变(AC6mut)分子，预测该变化改变Mg2+结合但不影响G-蛋白质动力学[4]。当被体外研究时，该鼠AC6mut分子显著地损害cAMP生成，但保持与AC6相关的细胞分布模式[4]。此类体外研究远未确定此类分子如何可能影响体内心脏功能。
因此，我们生成了具有AC6mut的心脏定向表达的转基因鼠系。我们希望这样的系会提供关于cAMP相对于Ca2+处置对完整正常心脏的功能的作用区别的额外了解。此外，此类研究可以表明AC6mut是否提供无增加的cAMP的潜在有害作用的影响肌肉收缩的刺激。我们假设，尽管cAMP生成能力显著降低，但通过AC6对Ca2+处置赋予的有益的平衡作用，LV功能仍会保持正常。
方法
AC6mut转基因小鼠的生成(图1A)。动物的使用依照实验室动物护理评估和认证协会(AssociationforAssessmentandAccreditationofLaboratoryAnimalCare)准则并且被VA圣地亚哥健康保健系统的公共机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeofVASanDiegoHealthcareSystem)批准。为了生成具有AC6mut的心脏定向表达的小鼠，在α-肌球蛋白重链启动子与SV40polyA之间亚克隆在C-末端具有AU1标签的鼠AC6mutcDNA[4]。含有表达盒的9.2-kb片段被用于在加利福尼亚大学圣地亚哥分校(UniversityofCalifornia,SanDiego)的转基因小鼠设施(近交C57BL/6)中实施的原核注射。通过从尾部尖端制备的基因组DNA的聚合酶链式反应(PCR)鉴别首建者(Founder)小鼠。
使用与α-MHC启动子同源的引物(正向：5'CACATAGAAGCCTAGCCCACACC)(SEQIDNO:1)来检测AC6mut基因；反向引物用于AC6区(5'CAGGAGGCCACTAAACCATGAC)(SEQIDNO:2)。
使用以下引物来检测AC6mutmRNA：(正向：5'TGGGCCTCTCTACTCTGCAT(SEQIDNO:3)；反向：5'TGGATGTAACCTCGGGTCTC)(SEQIDNO:4)，使得能够对AC6mutmRNA相对于内源性AC6mRNA的增加倍数进行定量。
使用与其3'-非翻译区同源的引物(正向：5'GGCATTGAGTGGGACTTTGT(SEQIDNO:5)；反向：5'TCTGCATCCAAACAAACGAA)(SEQIDNO:6)来检测内源性AC6mRNA。该3’非翻译区不存在于AC6mutcDNA中，使得能够对内源性AC6进行定量。
将首建者动物与相同品系的野生型小鼠杂交，并且将所选动物用于心脏转基因表达的分析。我们记录了独立系中可变转基因表达并且选择了AC6mut蛋白质表达17倍增加(相对于内源性AC6)的系用于我们的研究。如先前所述[5]使用定量RT-PCR来确定AC2-9型的LV表达水平。
超声心动描记术。利用5％异氟烷(以1L/min氧的流动速率)诱导麻醉并且利用氧中1％异氟烷维持。如先前所报道的[7]，使用16LMHz线性探针和Sonos超声心动描记器系统(PhilipsMedicalSystems,Bothell,WA)获得图像。在不了解群组特性的情况下获得数据并分析。
被分离的灌注心脏：LV收缩功能。如先前所报道的[7]，以不受反射激活或麻醉影响的方式在被分离的灌注心脏中评估心脏功能以评估LV收缩功能。采用心室内气囊导管来测量等容LV压力(LV舒张末期压10mmHg；1.7mM离子化Ca2+)。当记录LV压力时，以推注剂量(0.1nM到300nM)以5分钟间隔递送异丙肾上腺素。随后，推导出LV压力的一阶导数(LVdP/dt)并且将其用作LV收缩功能的替代物。在不了解群组特性的情况下获得数据并分析。
钙摄取。如先前所述[11]，通过经修改的Millipore过滤技术测量LV均质物中的ATP-依赖性肌浆网(SR)Ca2+摄取的初始速率。
钙瞬变。如先前所述[19]，使用Indo-1测量细胞溶质钙瞬变。将心肌细胞平铺到经层粘连蛋白涂覆的玻璃盖片上并且用indo-1/AM(3μM,Calbiochem,LaJollaCA)和分散剂pluronicF-127(0.02mg/ml,Calbiochem,LaJollaCA)加载30min。在加载染料后，将盖片安装在表面灌流室(superfusionchamber)上，冲洗以去除过量的indo-1/AM，并且安装在装配有40x物镜的NikonDIAPHOTTM落射荧光显微镜上，该物镜介接到通过单色仪将激发波长设定为365nm的PhotonTechnologies测光系统(BirminghamNJ)。通过分别以405nm和485nm为中心的20-nm带通滤波器将荧光发射分离并且引导到两个光电倍增管。比率F405/F485代表[Ca2+]i的量度。在这些测量期间，用含有2mMCaCl2的25mMHEPES(pH7.3)对心肌细胞进行表面灌流。在0.3Hz下对肌细胞进行场刺激。通过向缓冲液中添加异丙肾上腺素(10μM)来确定异丙肾上腺素刺激的Ca2+瞬变。从每个心脏至少20个细胞记录钙瞬变，并且每组至少3个心脏。每次循环分别从基线F405/F485比率和最大F405/F485比率获得心脏舒张细胞内Ca2+水平和心脏收缩细胞内Ca2+水平。
心肌细胞分离。如先前所述[4]进行心肌细胞分离。
环AMP测量。用异丙肾上腺素(10μM,10min)或水溶性福司柯林(forskolin)类似物NKH477(10μM,10min)刺激被分离的心肌细胞，然后将其溶解(2.5％十二烷基三甲基溴化铵、0.05M乙酸钠(pH5.8)和0.02％牛血清白蛋白)。如先前所报道的[4]，使用cAMPBIOTRAKTM酶免疫测定系统(GEHealthcare,Pittsburgh,PA)测量环AMP。
PKA活性测定。用异丙肾上腺素(10μM,10min)或NKH477(10μM,10min)刺激被分离的心肌细胞。将心肌细胞在缓冲液A(20mMTris-HCl(pH7.4)、0.5mMEGTA,0.5mMEDTA和蛋白酶抑制剂混合剂，来自Invitrogen)中均质化并且离心(14,000xg,5min,4℃)。将上清液与PKA生物素化的肽底物(cAMP-依赖性蛋白质激酶测定系统(Promega,MadisonWI))在[γ-32P]ATP存在下孵育。利用抗生蛋白链菌素基质回收32P-标记的生物素化的底物，并且确定PKA的比活性。
兰尼碱(Ryanodine)受体-2、PLB和肌钙蛋白I在心肌细胞中的被异丙 肾上腺素刺激的磷酸化。为了确定关键Ca2+调控蛋白质的动态磷酸化，我们在从各组分离的被培养的心肌细胞中进行了RyR2、PLB和TnI的基线磷酸化和异丙肾上腺素刺激的磷酸化的研究(图2C)。在这些研究中使用被培养的心肌细胞(每孔100,000个细胞)并且在与异丙肾上腺素(10μM,10min)孵育之前和之后进行免疫印迹。将细胞在溶解缓冲液中(20mMTris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl、1mMNa2EDTA、1mMEGTA、1％Triton、2.5mM焦磷酸钠、1mMβ-甘油磷酸盐、1mMNa3VO4、1μg/ml亮抑酶肽)溶解。使用Bradford方法测量蛋白质浓度。将免疫印迹归一化到GAPDH并且进行比较(图2D)。
PDE活性测定。使用环核苷酸磷酸二酯酶测定试剂盒(Enzo)测定磷酸二酯酶活性。将LV组织在含有10mMTris-HCl(pH7.4)、1mMPMSF、10mM激活的原钒酸盐、1x蛋白酶抑制剂混合剂(LifeSciences)的缓冲液中均质化并且在微量离心机中以10,000rpm(10min)离心。通过凝胶过滤使用脱盐柱树脂(Enzo)将组织均质物脱盐。向各孔中添加20μg蛋白质(Bradford)并且测量PDE活性。
免疫荧光。将被分离的心肌细胞附着到经层粘连蛋白涂覆的2孔室载玻片达1hr，进行洗涤，固定(10％福尔马林，15min，23℃)，用正常的山羊血清封闭(1hr)并且与以下孵育(4℃，过夜)：抗AU1抗体(Fitzgerald,1:300；用于检测AC6mut转基因蛋白质)；抗Cav3抗体(BDPharmagen,1:100；用于检测细胞质膜微囊)；抗PDI抗体(Invitrogen,1:1000；用于检测SR)；抗核纤层蛋白A(Abcam,1:200；用于检测核包膜)；抗CREM-1抗体(SantaCruz,1:50)；或抗磷酸化CREB抗体(Upstate,1:100)。将心肌细胞用PBS洗涤，然后与二级抗体(AlexiaFluo488或594缀合的，1:1000稀释)孵育1hr。为了鉴别细胞核，将细胞与Hoechst染料(1:1000稀释，20min)孵育。然后如先前所述[2]使心肌细胞成像。
mRNA和免疫印迹的检测。使用定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)对mRNA进行定量并且使用免疫印迹对蛋白质含量进行定量[4]。RyR2的引物包括(正向：5'AACCTACCAGGCTGTGGATG)(SEQIDNO:7)；和(反向：5'GACTCGATGGGCAAGTCAAT)(SEQIDNO:8)。
我们使用抗AC5/6抗体来鉴别内源性AC6和AC6mut(SantaCruz,1:200稀释)。AC5/6抗体的表位在AC6和AC6mut的C-末端(序列：KGYQLECRGVVKVKGKGEMTTYFLNGGPSS(SEQIDNO:9)；蛋白质登录号为O43306和Q01234)。我们使用AU1抗体(Fitzgerald,1:2,000)来检测AC6mut蛋白质。所用的额外抗体包括：钙网织蛋白(ABRAffinity,1:1,000)；肌集钙蛋白(NovusBiologicals,1:1,000)；GAPDH(Fitzgerald,1:20,000)；PDE3A(Advam)；PKA催化亚单位(BDTransduction,1:1,000)；p-PKA催化亚单位(CellSignaling,1:1,000)；PKA-RIIα和PKA-RIIβ(BDTransduction,1:1,000)；磷酸化PKA-RIIα(S96)和磷酸-PKA-RIIβ(S114)(SantaCruz,1:200)；PKCα催化亚单位(SantaCruz,1:200)；PLB(AffinityBioreagents,1:5,000)；磷酸化S16-PLB(Badrilla,1:3,000稀释)；磷酸化RyR2(S2808)(Abcam,1:1,000)；S100A1(Epiyomics,1:1,000)；SERCA2a(Enzo,1:1,000)；肌钙蛋白I和磷酸化TnI(S22/23)(CellSignaling，各1:1,000)
统计学分析。数据表示平均值±SE；使用ANOVA，之后使用邦弗朗尼(Bonferroni)t检验，或在适当时使用学生t检验(不成对的，双尾)测试群组差异的统计学显著性。当p<0.05时，拒绝零假设。
结果
AC6mut转基因小鼠。AC6mut小鼠与它们的转基因阴性同胞在身体上不可区分。对成年小鼠的尸体剖检显示体重、胫骨长度、LV重量和肺重量未显示群组差异。(表1)。
AC6mut的LV表达。相对于内源性AC6的水平，AC6mutmRNA增加了62倍并且蛋白质增加了17倍，它们是使用针对内源性AC6和转基因AC6mut两者上的共同区域的引物和抗体在RT-PCR和免疫印迹中检测的(图1B和图1C)。
内源性AC类型的LV表达。内源性AC2-9型的mRNA未显示群组差异(数据未显示)。
LVcAMP产生。来自AC6mut小鼠的LV样品显示当用异丙肾上腺素(74％降低；p<0.001)或NKH477(一种水溶性福司柯林类似物)(52％降低；p＝0.05)刺激时的降低的cAMP产生(图1D)；基线cAMP产生不变。因此，转基因系适于测试在增加的AC6mut表达存在下降低的被βAR刺激的cAMP产生对LV功能的总体作用。
PKA活性和表达。从AC6mut小鼠分离的心肌细胞显示基线PKA活性的48％降低(p＝0.01)。另外，存在通过异丙肾上腺素(38％降低；p＝0.006)；和NKH477(38％降低；p＝0.001)刺激的PKA活性的降低(图2A，上部)。AC6mut表达未改变PKA催化亚单位的LV表达(图2A，下部)或PKA-RII-α和PKA-RII-β的表达或磷酸化(磷酸化PKA-RIIα：AC6mut,0.32±0.04du；对照，0.30±0.03du,p＝0.7；磷酸化PKA-RIIβ：AC6mut,7.1±1.1du；对照，10.6±01.4du；p＝0.09；图2B)。PKC催化亚单位表达也未显示群组差异(PKCα：AC6mut,0.8±0.1du；对照，0.7±0.1du,p＝0.4；图2B)
兰尼碱受体-2、PLB和肌钙蛋白I在心肌细胞中的被异丙肾上腺素刺 激的磷酸化。RyR2、PLB和TnI的基线磷酸化未显示群组差异(P-RyR2：AC6mut,4.4±0.6，相对于对照，2.4±0.5du,p＝0.06；P-PLB：AC6mut,0.3±0.03，相对于对照，0.2±0.1du,p＝0.8；P-TnI：AC6mut,0.8±0.2，相对于对照，1.0±0.01du,p＝0.24，图2C)。异丙肾上腺素刺激与两组中RyR2、PLB和TnI的增加的磷酸化(相对未被刺激的)相关，但来自AC6mut小鼠的LV中的磷酸化程度通常更大(P-RyR2：AC6mut,30.0±1.1，相对于对照，7.4±1.1du,p＝0.001,；P-PLB：AC6mut,16.8±2.4，相对于对照，5.3±0.1du,p＝0.01；P-TnI：AC6mut,5.8±1.4，相对于对照，2.2±0.7du,p＝0.07；图2C)。组间的TnI蛋白质表达并无不同(AC6mut,0.9±0.1，相对于对照，0.7±0.2du；p＝0.5；图2B。RyR2mRNA表达未显示群组差异。
PDE活性和PDE3A表达。LV样品中的PDE活性没有群组差异(AC6mut：1252±23单位/mg,n＝7；对照：1293±39单位/mg,n＝6；p＝0.38)。LVPDE3A蛋白质表达未显示群组差异(AC6mut：0.3±0.1，相对于对照，0.4±0.1du,p＝0.6.图2B)。
AC6mut的细胞内分布。鉴别AC6mut蛋白质结合细胞质膜微囊(主要结合质膜)、SR和核包膜(图1E)。
超声心动描记术。超声心动描记术显示AC6mut的心脏定向表达未改变基本心脏结构和功能。组间的LV尺寸并无不同，且基线LV射血分数和周缘纤维缩短速度是相似的(表2)。因此，尽管AC6mut小鼠中的LVcAMP生成能力显著降低，但LV结构和基本功能不变。
响应异丙肾上腺素的LV收缩功能。为了以独立于自主神经影响、内源性儿茶酚胺和麻醉的方式评估心脏收缩性，在被分离的灌注心脏中测量LV压力发展。尽管LVcAMP生成能力显著降低，但基线LVdP/dt和异丙肾上腺素刺激的LVdP/dt未显示群组差异(图3)。
Ca 2+ 摄取和Ca 2+ 相关蛋白质。确定从AC6mut和转基因-阴性同胞对照小鼠汇集的LV均质物中的ATP依赖性SRCa2+摄取速率。增加的AC6mut表达与增加的SRCa2+摄取相关(图4A，上部图形)。另外，SERCA2a对Ca2+的增加的亲和力反映在实现一半最大效应所需的降低的Ca2+浓度上(EC50：AC6mut1.1μmol/L；对照3.7μmol/L,n＝6，图4A，下部图形)。
与Ca2+处置的这些生理变化相关的是调控SRCa2+摄取的蛋白质的改变的LV表达。例如，AC6mut表达与LVPLB蛋白质表达的43％降低(p＝0.01)和LVS100A1蛋白质含量的73％增加(p＝0.03)相关(图4B和图4C)。LVSERCA2a、钙网织蛋白和肌集钙蛋白的含量不变，并且Ser16处的PLB磷酸化不变(图4D)。
转录因子。AC6mut表达与CREM-1的LV表达的1倍增加(p＝0.03,图4B)和CREB在Ser133处的磷酸化的0.7倍增加(p＝0.01,图4C)相关；总CREB蛋白质含量不变。为了确定增加的CREM-1和磷酸化CREB是否存在于细胞核中，使用抗CREM-1和抗磷酸化CREB(S133)抗体进行被分离的心肌细胞的免疫荧光染色。我们检测到CREM-1和磷酸化CREB在AC6mut小鼠中的增加的核定位(图4E)。
钙瞬变：为了确定与AC6mut表达相关的增加的SRCa2+摄取是否会影响细胞溶质[Ca2+]i，使用参比(ratiometric)染料Indo-1评估心肌细胞实时[Ca2+]i。收缩期间的基线Ca2+释放不变(图5A)。然而，AC6mut表达与在异丙肾上腺素刺激后的增加的峰值心脏收缩Ca2+瞬变幅度相关(p＝0.0001，图5B和图5C)，并且达到峰值幅度的时间缩短(p＝0.03，图5D)。另外，来自AC6mut小鼠的心肌细胞中达到50％松驰的时间(τ)缩短(p＝0.04)(图5E)。因此，SERCA2a活性、PLB和S100A1的表达以及被异丙肾上腺素刺激的Ca2+瞬变全部通过AC6mut表达以会有利地影响LV功能的方式被改变。
讨论
本研究的最令人惊讶且重要的发现是显著地损害被βAR刺激的cAMP产生的突变AC6分子的心脏定向表达与响应异丙肾上腺素刺激的保持的LV功能相关。这是通过被分离的灌注心脏中的超声心动描记术和收缩功能研究确认的。在其它背景下心脏cAMP生成的显著降低与LV收缩功能的成比例降低相关。例如，在其中cAMP损害通常被降低50％的多数心力衰竭模型中，存在LVdP/dt和βAR-响应性的类似降低[10],[11],[12],[13],[14]。此外，与cAMP生成能力的60％降低相关的AC6缺失也与LV收缩功能的类似降低相关[5]。那么是什么解释被异丙肾上腺素刺激的LV收缩功能的保持？
AC6mut系中尽管显著地损害cAMP生成，但LV功能得以保持的最接近的机制是关于Ca2+处置的有利变化。我们先前报道AC6的心脏定向表达增加衰竭的心脏的功能，但由于AC6对βAR信号传导的显著作用，因此不可能确定这些有益作用所反映的增强的βAR信号传导自身相对于Ca2+处置的程度[10],[11]。以下观察支持AC6与Ca2+处置的联系：AC6缺失对Ca2+处置具有显著不利的作用[5]，但由于cAMP-生成能力在AC6缺失后降低，因此AC6对Ca2+处置的独立作用难以确定。然而，本研究中的新颖之处在于在TG小鼠中证实AC6突变分子似乎模拟了母体分子对Ca2+处置的有利作用，由此保持LV功能，即使在cAMP生成能力显著降低时。似乎AC6对Ca2+处置的作用无需cAMP生成，因此必定通过替代机制进行。
我们发现AC6mut表达与LV均质物中增加的SRCa2+摄取和完整心肌细胞中具有缩短的松驰时间的增加的Ca2+瞬变相关。与AC6mut表达的这些生理有利的作用相关的是降低的PLB表达，抑制SERCA2a活性的Ca2+调控因子。降低的PLB含量或Ser16处增加的PLB磷酸化与其抑制作用的降低相关，这增加了SERCA2a活性[20],[21],[22]。我们先前发现PLB表达在表达AC6或AC6mut的被培养的心肌细胞中降低[4]，但现行研究首次证实该作用也在体内见到(图4B)。从AC6mut小鼠分离的心肌细胞中RyR2、PLB和(在更小的程度上)TnI的被异丙肾上腺素刺激的磷酸化的程度的增加(图2C)也被预测会增加LV收缩功能。
AC6mut表达与CREM-1(图3B和图3E)的增加的表达和核转位相关，CREM-1是CREB/ATF家族中的转录抑制物[23]。我们先前鉴别，在AC6表达的背景下，PLB启动子在新生大鼠心肌细胞中由增加的ATF3通过PLB启动子中的CRE位点被负调控[2]。在本研究中，我们未见到与AC6mut表达相关的增加的ATF3表达。然而，ATF3和CREM-1两者均识别同一CRE位点，因此似乎合理的是，与AC6mut有关的增加的CREM-1可能在降低的PLB表达方面在机制上是重要的。这将需要额外的研究。
AC6mut表达与Ca2+敏化蛋白质S100A1的LV表达的未曾预料到的增加相关，该蛋白质通过调节RyR2和SERCA2a来增加收缩功能[24]。AC6mut表达如何可能与增加的LVS100A1表达关联？AC6mut表达与CREB的增加的磷酸化和核转位相关(图4C和图4E)，CREB的磷酸化和核转位是CREB激活所需的过程。CREB是通过基因的启动子中的CRE位点来调控许多基因的转录激活子[25]。S100A1启动子具有CRE位点[26]，表明S100A1表达似乎可能已被AC6mut表达激活。另外，PKA和cAMP的区室化也可能是因素[27],[28]。
尽管cAMP生成显著降低，但Ca2+处置的实质性改进似乎保持了LV功能。增加量的AC6mut借以影响转录调控并且最终影响心肌细胞的生理行为和LV功能的精确途径将需要额外的研究。组织学研究(图1E)确认大量的转基因AC6mut存在于多个细胞内区室中，而不是仅仅存在于质膜中。这使得AC6mut蛋白质能够与影响细胞内信号传导且因此影响生理功能的重要的细胞内蛋白质相互作用。
最近通过AC6缺失强调了AC6对于Ca2+处置的重要性[5]。在这一背景下，cAMP生成能力降低，虽然未达到与本研究中一样多的程度，但Ca2+处置显著受损。在本研究中，我们见到cAMP生成的更显著损害，但Ca2+处置增加，而非降低。这是因为，不同于在AC6缺失中，AC6分子虽然cAMP生成能力不足，但存在于胞质中，在此AC6分子可能影响Ca2+处置。
我们未检查表达降低量的AC6mut的转基因系以确定生理作用是否与AC6mut表达的水平成比例。有人可能认为AC6mut蛋白质的17倍增加(相对于内源性AC6)可能以非特异性方式影响信号传导。虽然我们的数据不能排除这种可能性，但重要的是认识到内源性AC6是超低丰度的蛋白质—丰度是例如Gsα的大约1/100[29]。因此，即使以内源性AC617倍高的水平表达，其丰度仍然比Gsα低。此外，催化活性(正常)AC6的类似增加与可恢复的cAMP产生的显著增加相关[30]。这些观察表明该发现是特异的。
结论。尽管cAMP生成显著降低，但Ca2+处置的实质性改进似乎保持了LV功能。免疫荧光表明AC6mut位于核膜上，为AC6mut影响转录因子的表达和功能提供机会。增加的CREM-1(转录抑制子)和增加的磷酸-CREB(图4E)可能分别参与PLB和S100A1的改变的表达。我们推断AC6mut通过增加的Ca2+处置和改变的蛋白质表达来保持心脏功能，尽管cAMP生成降低。这些结果提供了关于对于LV功能在Ca2+处置与βAR信号传导之间的相互作用的了解，并且表明AC6mut可以提供没有增加的cAMP的潜在有害作用的肌肉收缩刺激。数据表明与衰竭的心脏中的AC6mut表达相关的降低的心肌细胞凋亡，这是我们实验室中正在进行的研究的焦点。
附图说明
图1.AC6mut的设计、表达、活性和细胞分布
A.该图描绘了在AC6mut的构造中在C1结构域(细胞内环)中的第426位(位置编号基于SEQIDNO:16)丙氨酸(ala)对天冬氨酸(asp)的取代位点。该取代抑制Mg2+结合并且改变催化核心的由Gsα介导的激活的效率，这损害了AC6的酶促活性，从而导致降低的cAMP产生。M1和M2，AC6的跨膜结构域；C1和C2，AC6的胞质结构域，其形成催化核心；βAR，β-肾上腺素能受体；βΥ和α，鸟苷5'-三磷酸(GTP)-结合蛋白质Gs的组分
B.AC6mutmRNA表达是通过qRT-PCR使用内源性AC6和转基因AC6mut共同的引物评估的。用于检测GAPDHmRNA的引物用于qRT-PCR反应的内部对照。相对于内源性AC6，AC6mutmRNA增加了62倍。条形中的动物数+SE；学生t检验(不成对的，双尾)
C.以免疫印迹法使用抗AC5/6抗体检测AC6mut蛋白质并且使用抗AU1标签抗体确认。相对于内源性AC6，AC6mut蛋白质增加了17倍。
D.用异丙肾上腺素(Iso；10μM,10min)或NKH477(NKH；10μM,10min)刺激之前(基线)和刺激之后，从AC6mut小鼠和对照小鼠分离的心肌细胞中的环AMP产生；cAMP酶免疫测定。来自AC6mut小鼠的心肌细胞(M相对于C，对照)显示响应Iso和NKH477(福司柯林类似物)的受损的cAMP产生。条形表示平均值+SE；p值源于单因素ANOVA和之后的邦弗朗尼后检验(n＝6，各组)。
E.使用抗AU1抗体(红色)、抗小窝蛋白3(Cav-3)抗体(绿色，对于细胞质膜微囊来说)；抗蛋白质二硫键异构酶(PDI)抗体(绿色，对于肌浆网来说)；抗核纤层蛋白A抗体(绿色，对于核膜来说)和抗电压依赖性阴离子选择性通道蛋白质(VDAC)抗体(绿色，对于线粒体来说)对从AC6mut小鼠和对照小鼠分离的心肌细胞中的AC6mut蛋白质的双重免疫荧光染色。细胞核是蓝色。在细胞质膜微囊、SR和核膜中检测AC6mut转基因，但与线粒体无关。
图2.PKA、PKS和PDE的活性和表达
A.上图：无刺激(基线)或用异丙肾上腺素(Iso；10μM,10min)或NKH477(NKH；10μM,10min)刺激的被分离的心肌细胞中的PKA活性。AC6mut表达降低了基线PKA活性(p＝0.01)并且Iso(p＝0.001)和NKH(p＝0.001)二者活性也降低(n＝3，各组)。下部凝胶：LV均质物中的PKA蛋白质。AC6mut表达未改变LVPKA催化亚单位蛋白质表达。
B.使用来自AC6mut小鼠和对照小鼠的左心室均质物在免疫印迹中显示关键信号传导蛋白质的表达和它们的磷酸化。未观察到群组差异。显示了磷酸化(P)PKA和总(T)PKA的调控亚单位II-α和II-β、PKCα、磷酸二酯酶3A型(PDE3A)、磷酸-肌钙蛋白I(P22/23-TnI)和总TnI。
C.在从各组分离的被培养心肌细胞中评估异丙肾上腺素刺激之前和之后的RyR2、PLB和TnI的磷酸化。RyR2、PLB和TnI的基线磷酸化未显示群组差异。异丙肾上腺素刺激与两组中的RyR2、PLB和TnI的增加的磷酸化相关，但在来自AC6mut小鼠的心肌细胞中更加大量(图2C)。
D.来自图2C的数据以针对载荷(GAPDH)被归一化的图表形式显示，所述数据表明异丙肾上腺素刺激与来自AC6mut小鼠的心肌细胞中的RyR2、PLB和TnI的增加的磷酸化相关。TnI磷酸化的增加不是统计学显著的(p＝0.07)。
图3.左心室收缩功能
从AC6mutTG小鼠(实心圆；n＝11)分离的心脏显示响应通过宽范围的异丙肾上腺素剂量进行的异丙肾上腺素刺激的保持的LVdP/dt。在不了解群组特性的情况下获得数据并分析。空心圆，转基因阴性对照小鼠(n＝12)。没有群组差异(双因素ANOVA)。数据点表示平均值±SE。
图4.SRCa
2+
摄取、Ca
2+
信号传导蛋白质和转录因子
A.上部：来自AC6mut小鼠的混合LV样品和来自TG阴性同胞对照小鼠(n＝6，两组)混合LV样品中的Ca2+摄取活性
下部：AC6mut的表达降低了SERCA2a对Ca2+的亲和力。从不同的游离Ca2+浓度下的初始ATP依赖性Ca2+摄取速率计算Ca2+实现50％最大效应的有效浓度(EC50)。
B.上部：AC6mut表达与降低的LV受磷蛋白(PLB)表达相关。
下部：AC6mut表达与增加的LVCREM-1蛋白质表达相关。
C.上部：AC6mut表达与增加的LVS100A1蛋白质表达相关。
下部：AC6mut表达与增加的LVP133-CREB蛋白质表达相关。两组中的总CREB表达类似。
D.AC6mut表达不影响SERCA2a、钙网织蛋白、肌集钙蛋白或磷酸化S16-PLB蛋白质的LV表达；(n＝4，两组)。
E.使用抗AU1抗体(红色)和抗CREM-1抗体(绿色)或抗AU1和抗磷酸化CREB(S133，绿色)对从AC6mut小鼠和对照小鼠分离的心肌细胞中的AC6mut蛋白质的双重免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。AC6mut表达增加了CREM-1和磷酸化CREB的核定位。
在图(A、B、C)中，条形表示平均值+SE；条形中的数字指示群组大小；条形上方的数字表示来自学生t检验(不成对的，双尾)的p值
图5.从AC6mut小鼠和对照小鼠分离的心肌细胞中的细胞溶质Ca
2+
瞬变
A.基线Ca2+释放(心脏收缩-心脏舒张Ca2+)未显示组差异。
B.用异丙肾上腺素(Iso；10μM)刺激的心肌细胞中的代表性Indo-1Ca2+瞬变记录在来自AC6mut小鼠的心肌细胞中更高。总结数据展示于图C中。
C.在异丙肾上腺素存在下释放的Ca2+在来自AC6mut小鼠的心肌细胞中增加。
D.在异丙肾上腺素存在下达到峰值Ca2+瞬变的时间在来自AC6mut小鼠的心肌细胞中减少。
E.在异丙肾上腺素存在下达到50％松驰的时间(τ)在来自AC6mut小鼠的心肌细胞中减少。
将实验重复4次。条形表示平均值+SE；条形中的数字指示心肌细胞数；条形上方的数字指示来自学生t检验(不成对的，双尾)的p值。
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LV，左心室；TL，胫骨长度。值表示平均值±SE；学生t检验(不成对的，双尾)。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应当理解，可在不脱离本发明的精神和范围的前提下作出各种修改。因此，其它实施方案在所附权利要求书的范围内。
Claims (21)
1.一种用于以下的方法或体内方法或以下的方法：
(1)治疗患有心脏疾病或心力衰竭或具有患心脏疾病或心力衰竭的风险的受试者；
(2)针对以下来治疗、改善、逆转其效应、保护或预防个体或患者：
心脏疾病、
心力衰竭、
心脏功能或心输出量的降低、
由于心脏感染或心脏病况所致的心脏功能或心输出量的降低，
(3)通过增加完整心肌细胞中肌浆网(SR)Ca2+摄取和/或具有缩短的松驰时间的增加的Ca2+瞬变来增强完整心肌细胞中的钙处置，
(4)抑制心肌细胞中细胞内cAMP水平的生成，
(5)保护心肌细胞免受程序化细胞死亡(凋亡)信号影响，或降低在凋亡信号之后被信号传导至程序化细胞死亡(凋亡)的心肌细胞数量，或
(6)在心力衰竭患者中或在患有导致心脏功能或心输出量降低的心脏感染或心脏病况的个体中：增加心脏功能或心输出量，降低症状和/或降低死亡率；或降低心力衰竭的住院频率，
所述方法包括：
(a)提供：
(i)不能产生环腺苷酸的(不能产生cAMP的)腺苷酸环化酶6型(AC6)蛋白质或多肽(也被称为“AC6mut”),
其中任选地，所述AC6mut是重组的、合成的、拟肽的或分离的AC6mut多肽或肽；或
(ii)编码AC6mut的核酸或基因：
其中任选地，所述编码AC6mut的核酸或基因可操作地连接到转录调控序列，其中任选地，所述转录调控序列是启动子和/或增强子或心细胞特异性启动子或肌细胞特异性启动子；或
其中任选地，所述编码AC6mut的核酸或基因可操作地连接到转录调控序列，且任选地，所述编码AC6mut的核酸或基因包含于递送运载体、载体、表达载体、重组病毒，或等同物中，并且所述递送运载体、表达运载体、载体、重组病毒或等同物可以在细胞中或体内表达所述编码AC6mut的核酸或基因，
其中任选地，所述细胞是心细胞或肌细胞；
其中所述AC6mut不催化ATP分解为cAMP，或具有催化ATP分解为cAMP的受损能力，并且任选地，所述催化ATP分解为cAMP的受损能力被定义为所述AC6mut仅具有野生型AC6的ATP至cAMP的催化活性的约1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，
并且当所述AC6mut在体内心肌细胞中表达时，左心室(LV)功能不受影响或不降低，或LV功能基本上不受影响或基本上不降低,
并且任选地，心肌细胞中的AC6mut表达增加肌浆网Ca2+摄取，
并且任选地，心肌细胞中的AC6mut表达降低用于SERCA2a激活的EC50，
并且任选地，心肌细胞中的AC6mut表达降低受磷蛋白蛋白质的表达，
并且任选地，所述取代抑制Mg2+结合并且改变Gsα介导的催化核心的激活的效率；
(b)向心细胞或心肌细胞递送或施用所述AC6mut或所述编码AC6mut的核酸或基因，或在心细胞或心肌细胞中表达所述AC6mut，或在心细胞或心肌细胞中表达所述编码AC6mut的核酸或基因，
其中任选地，所述编码AC6mut的核酸可操作地连接到转录调控序列，或任选地，向心肌细胞或向需要其的个体或患者递送或施用所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物，
并且任选地，向体内所述心细胞或肌细胞递送或施用所述编码AC6mut的核酸或基因是向心肌或心肌细胞的靶向递送，或包括向心脏的直接递送或施用，或包括心内注射或输注，
由此：
治疗所述患有心脏疾病或心力衰竭或具有患心脏疾病或心力衰竭的风险的受试者，
针对心脏疾病、心力衰竭、心脏功能或心输出量的降低、由于心脏感染或心脏病况所致的心脏功能或心输出量的降低治疗、改善或保护(预防)个体或患者，
通过增加完整心肌细胞中肌浆网(SR)Ca2+摄取和/或具有缩短的松驰时间的增加的Ca2+瞬变来增强完整心肌细胞中的钙处置，
抑制心肌细胞中细胞内cAMP水平的生成，
保护心肌细胞免受程序化细胞死亡(凋亡)信号影响，或降低在凋亡信号之后被信号传导至程序化细胞死亡(凋亡)的心肌细胞数量，或
在心力衰竭患者中或在患有导致心脏功能或心输出量降低的心脏感染或心脏病况的个体中：增加心脏功能或心输出量，降低症状和/或降低死亡率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述AC6mut包含在腺苷酸环化酶(AC)多肽的所述催化核心中具有不带电荷的氨基酸或非极性氨基酸对带电荷的氨基酸或酸性氨基酸的取代的AC多肽，
其中任选地，所述不带电荷的氨基酸或非极性氨基酸是丙氨酸(Ala)，并且任选地，所述酸性氨基酸是天冬氨酸(Asp)，或任选地，所述不带电荷的氨基酸或非极性氨基酸是Ala并且所述酸性氨基酸是Asp。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述AC6mut包含：
在基于SEQIDNO:16的腺苷酸环化酶(AC)多肽的催化核心中的第426位具有Ala对Asp的取代的鼠AC多肽，其中SEQIDNO:17是D＝>A取代之后的多肽氨基酸序列(SEQIDNO:16是D＝>A取代之前的氨基酸序列)；或
在基于SEQIDNO:11的AC多肽的催化核心中的第436位具有丙氨酸或Ala对Asp的取代的鼠AC6mut多肽，其中SEQIDNO:12是D＝>A取代之后的多肽氨基酸序列(SEQIDNO:11是D＝>A取代之前的氨基酸序列)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述AC6是哺乳动物AC6多肽。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述AC6是人AC6多肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述人AC6多肽包含在基于SEQIDNO:10的腺苷酸环化酶(AC)多肽的催化核心中的第426位具有Ala对Asp的取代的人AC6多肽，其中SEQIDNO:13是D＝>A取代之后的多肽氨基酸序列(SEQIDNO:10是D＝>A取代之前的氨基酸序列)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中：
(a)将所述编码AC6mut的核酸或基因稳定地插入到细胞的染色体中；
(b)所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物是或包括：腺相关病毒(AAV)；重组AAV病毒或载体；AAV病毒粒子或腺病毒载体或其任何假型、杂合体或衍生物；
(c)(b)的方法，其中所述腺相关病毒(AAV)、重组AAV病毒或载体、AAV病毒粒子或腺病毒载体是或包括：AAV血清型AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9；恒河猴AAV(AAVrh)或AAVrh10；或其任何杂合体或衍生物；
(d)所述编码AC6mut的核酸或基因可操作地连接到受调控的或可诱导的转录调控序列；
(e)(d)的方法，其中所述受调控的或可诱导的转录调控序列是受调控的或可诱导的启动子；
(f)(a)到(e)中任一个的方法，其中向需要其的个体或患者施用可操作地连接到转录调控序列的所述编码AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物导致：所述AC6mut在心肌细胞中的靶向递送和表达、或AC6mut被释放到血流或全身循环中；或
(g)(a)到(f)中任一个的方法，其中响应体内增加的AC6mut水平的疾病、感染或病况是心脏收缩功能障碍；充血性心力衰竭(CHF)；心脏纤维化；心肌细胞疾病；心肌细胞功能障碍或心肌细胞凋亡。
8.根据权利要求1所述的方法，其中：
(a)通过口服施用、通过肌内(IM)注射、通过静脉内(IV)注射、通过皮下(SC)注射、通过皮内注射、通过鞘内注射、通过动脉内(IA)注射、通过冠状动脉内或心内注射、通过眼内注射或施加、通过吸入或通过生物弹射击粒子递送系统或通过使用“基因枪”、气手枪或HELIOSTM基因枪(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，向需要其的所述个体或患者施用或递送可操作地连接到所述转录调控序列的所述编码AC6mut的核酸或基因；或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物，
其中任选地，通过静脉内(IV)注射AAV载体或AAV-9载体来递送所述编码AC6mut的核酸或基因；或
(b)通过引入到身体内邻接血流或被血流排放的任何细胞、器官、组织或流体空间中，向需要其的所述个体或患者施用或递送可操作地连接到所述转录调控序列的所述编码AC6mut的核酸或基因；或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物，使得被编码的AC6mut蛋白质可以从所述组织中的细胞被分泌并释放到所述血流中。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中：
(a)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达AC6mut的核酸或基因的表达，或诱导或激活诱导或上调所述表达AC6mut的核酸或基因的表达的启动子(例如，可操作地连接到所述表达AC6mut的核酸或基因的启动子)；
(b)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导启动子的激活子的合成，其中任选地，所述启动子是AC基因启动子或肌细胞细胞特异性启动子；
(c)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达AC6mut的核酸或基因或所述表达AC6mut的核酸或基因特异性启动子的天然激活子或合成激活子的合成，
其中任选地，所述天然激活子是内源性转录因子；
(d)(c)的方法，其中所述合成激活子是被设计成特异性地且选择性地开启内源性或外源性靶基因的锌指DNA结合蛋白质，其中任选地，所述内源性靶标是表达AC6mut的核酸或基因、或AC6mut或表达AC6mut的核酸或基因的激活子、或可操作地连接到表达AC6mut的核酸或基因的启动子的激活子；
(e)(a)到(c)中任一个的方法，其中所述刺激或信号包括生物剂刺激或信号、光刺激或信号、化学剂刺激或信号或药物刺激或信号；
(f)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号刺激或诱导AC6mut或表达AC6mut的核酸或基因的转录后激活子的表达、或可操作地连接到表达AC6mut的核酸或基因的启动子的激活子的表达，或
(g)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号抑制表达AC6的核酸或基因的转录阻遏物或转录后阻遏物、或诱导对表达AC6的核酸或基因的转录阻遏物或转录后阻遏物的抑制。
10.根据权利要求9所述的方法，其中诱导所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因的表达、或诱导可操作地连接到所述表达AC6mut的核酸或基因的所述受调控的或可诱导的启动子的表达的所述化学剂或药物是或包括口服抗生素、强力霉素或雷帕霉素；或使用利用强力霉素的tet-调控系统来诱导所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或其等同物的表达。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物被配制在冻干制剂、液体、凝胶、水凝胶、粉末、喷剂、软膏、或水性或盐水制剂中，或被配制为冻干制剂、液体、凝胶、水凝胶、粉末、喷剂、软膏、或水性或盐水制剂。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物包括囊泡、水凝胶、凝胶、脂质体、纳米脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子(NLP)或被配制在囊泡、水凝胶、凝胶、脂质体、纳米脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子(NLP)。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物被配制在分离的细胞或培养的细胞中，并且任选地，所述细胞是哺乳动物细胞、心细胞、或人细胞、非人灵长类动物细胞、猴细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞、兔细胞、仓鼠细胞、山羊细胞、牛科动物细胞、马科动物细胞、绵羊细胞、犬科动物细胞或猫科动物细胞。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物被配制为药物或无菌的。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物与制品、人工器官或植入物被配制或递送，在制品、人工器官或植入物上被配制或递送，或结合制品、人工器官或植入物被配制或递送。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述AC6mut或所述表达AC6mut的核酸或基因或所述递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物在体外或离体表达AC6mut多肽。
17.一种用于针对AC6mut响应性病理、感染、疾病、病患或病况治疗、改善、逆转、保护或预防个体或患者的方法，其包括实施根据权利要求1-16中任一项所述的方法。
18.一种用于治疗、改善、逆转、保护或预防需要其的个体或患者的心脏病变或心血管疾病的方法，其包括实施根据权利要求1-16中任一项所述的方法。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述心脏病变或心血管疾病包括：冠状动脉疾病(CAD)；动脉粥样硬化；血栓形成；再狭窄；血管炎、自身免疫性血管炎或病毒性血管炎；结节性多动脉炎；变应性肉芽肿血管炎；高安动脉炎；川崎病；立克次体血管炎；动脉粥样硬化性动脉瘤；心肌肥大；先天性心脏疾病(CHD)；缺血性心脏疾病；绞痛；获得性瓣膜疾病或心内膜疾病；原发性心肌病；心肌炎；心律不齐；移植排斥；代谢性心肌病；心肌病变；充血性心肌病变、肥大性心肌病变或限制性心肌病变；和/或心脏移植。
20.如权利要求1-16中任一项所述的AC6mut；表达AC6mut的核酸或基因；递送运载体、载体、表达载体、重组病毒或等同物；腺相关病毒(AAV)；重组AAV病毒或载体；或腺病毒载体，或其任何假型、杂合体或衍生物，
其中任选地，所述AAV或重组AAV病毒或载体包括AAV血清型AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9；恒河猴AAV(AAVrh)或AAVrh10；或其任何杂合体或衍生物、或表达AC6mut的细胞或心肌细胞，
在制备用于以下目的的药物中的用途：
(1)治疗患有心脏疾病或心力衰竭或具有患心脏疾病或心力衰竭的风险的受试者；
(2)针对以下来治疗、改善、逆转其效应、保护或预防个体或患者：
心脏疾病、
心力衰竭、
心脏功能或心输出量的降低、
由于心脏感染或心脏病况所致的心脏功能或心输出量的降低，
(3)通过增加完整心肌细胞中肌浆网(SR)Ca2+摄取和/或具有缩短的松驰时间的增加的Ca2+瞬变来增强完整心肌细胞中的钙处置，
(4)抑制心肌细胞中细胞内cAMP水平的生成，
(5)保护心肌细胞免受程序化细胞死亡(凋亡)信号影响，或降低在凋亡信号之后被信号传导至程序化细胞死亡(凋亡)的心肌细胞数量，
(6)在心力衰竭患者中或在患有导致心脏功能或心输出量降低的心脏感染或心脏病况的个体中：增加心脏功能或心输出量，降低症状和/或降低死亡率；或降低心力衰竭的住院频率；
(7)心脏病变或心血管疾病；或
(8)冠状动脉疾病(CAD)；动脉粥样硬化；血栓形成；再狭窄；血管炎、自身免疫性血管炎或病毒性血管炎；结节性多动脉炎；变应性肉芽肿血管炎；高安动脉炎；川崎病；立克次体血管炎；动脉粥样硬化性动脉瘤；心肌肥大；先天性心脏疾病(CHD)；缺血性心脏疾病；绞痛；获得性瓣膜疾病或心内膜疾病；原发性心肌病；心肌炎；心律不齐；移植排斥；代谢性心肌病；心肌病变；充血性心肌病变、肥大性心肌病变或限制性心肌病变；和/或心脏移植。
21.如权利要求1-16中任一项所用的或所述的治疗制剂，其用于治疗以下疾病或用于以下目的：
(1)心脏疾病、心力衰竭、心脏功能或心输出量的降低、由于心脏感染或心脏病况所致的心脏功能或心输出量的降低，
(2)通过增加完整心肌细胞中肌浆网(SR)Ca2+摄取和/或具有缩短的松驰时间的增加的Ca2+瞬变来增强完整心肌细胞中的钙处置，
(3)抑制心肌细胞中细胞内cAMP水平的生成，
(4)保护心肌细胞免受程序化细胞死亡(凋亡)信号影响，或降低在凋亡信号之后被信号传导至程序化细胞死亡(凋亡)的心肌细胞数量，
(5)在心力衰竭患者中或在患有导致心脏功能或心输出量降低的心脏感染或心脏病况的个体中：增加心脏功能或心输出量，降低症状和/或降低死亡率；或降低心力衰竭的住院频率；
(6)心脏病变或心血管疾病；或
(7)冠状动脉疾病(CAD)；动脉粥样硬化；血栓形成；再狭窄；血管炎、自身免疫性血管炎或病毒性血管炎；结节性多动脉炎；变应性肉芽肿血管炎；高安动脉炎；川崎病；立克次体血管炎；动脉粥样硬化性动脉瘤；心肌肥大；先天性心脏疾病(CHD)；缺血性心脏疾病；绞痛；获得性瓣膜疾病或心内膜疾病；原发性心肌病；心肌炎；心律不齐；移植排斥；代谢性心肌病；心肌病变；充血性心肌病变、肥大性心肌病变或限制性心肌病变；和/或心脏移植。
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