FR2824332A1 - Acide nucleique codant le polypeptide cgl1 et application de cet acide nucleique et du polypeptide cgl1 au diagnostic et en therapeutique - Google Patents
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Abstract
Il est ainsi fourni selon l'invention un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID Ndegre1 ou encore des fragments ou des variants du polypeptide CGL1.L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus pour la fabrication d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique spécifique du gène cgl1 normal ou du gène cgl1 muté. L'invention a aussi pour objet des procédés de criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1 ou modulant l'expression du gène cgl1 ainsi que des nécessaires ou kits pour le criblage de tels composés candidats.
Description
18428-04/05/01-15/16
La présente invention se rapporte au domaine de la prévention et du traitement des pathologies telles que les lipodystrophies, tout particulièrement la lipodystrophie généralisée congénitale (CGL) ainsi que
les diabètes (de type 1 et de type 2).
s Les lipodystrophies se définissent comme des altérations de
répartition du tissu adipeux corporel qui peut être diminué ou augmenté.
Elles incluent l'obésité et le syndrome métabolie (ou syndrome d'insulino
résistance ou syndrome X).
o ETAT DE LA TECHNIQUE La lipodystrophie congénitale généralisée (CGL) a été décrite pour la première fois (dans les annses 50) par BERARDINELLI (1954) et par
SEIP (1959). Cette pathologie a été revue en détail par SEIP, en 1996.
s La lipodystrophie généralisée (GL) appartient au groupe hétérogène de syndromes dans lesquels sont présentes simultanément des altérations dans la distribution de la masse grasse corporelle ainsi qu'une
résistance à l'insuline.
Les syndromes de lipodystrophie ont été classés en fonction de o l'étendue de lipoatrophie, selon qu'elle soit locale ou généralisée. Dans les lipodystrophies généralisoes (GL), on observe un appauvrissement sévère
à la fois des tissus adipeux sous cutanés ou des tissus adipeux viscéraux.
Deux sous-types de GL ont été distingués selon l'âge d'apparition de la lipoatrophie. Le premier sous-type est la lipodystrophie généralisée s congénitale (CGL), désignée aussi " syndrome de BERARDINELLI-SEIP " pour laquelle est observée une absence de tissu adipeux à la naissance ou précoce au début de l'enfance précoce. Le second type, est désigné lipodystrophie généralisse acquise ou encore " syndrome de LAWRENCE " dans laquelle la lipoutrophie est observée seulement durant I'enfance ou la vie adulte. Basée sur l'observation d'une incidence à la fois chez les hommes et chez les femmes, sur la récurrence fréquente de la pathologie dans la descendance, ainsi que sur l'observation d'un taux de consanguinité parentale jusqu'à 50% chez les patients atteints, la transmission du caractère CGL de manière autosomale récessive était
ss considérce comme très probable.
Une étude de ségrégation de marqueurs réalisés chez six familles norvégiennes atteintes de CGL a permis d'observer, chez deux de ces familles, un phénomène hétérochromatique sur le bras 9q du chromosome 9 (GEDDE-DAHL,1996). Dans cette étude, les auteurs avaient s explicitement exclu l'hypothèse d'une association allélique entre le marqueurAPOAI1, localisé sur le locus 11q 23.3 du chromosome 11, et le
déterminant génétique causal de la CGL.
Une autre étude avait également localisé le déterminant génétique causal de la CGL sur le chromosome 9. Ainsi, GARG et al. (1999), en o réalisant une étude de clonage positionnel, ont identifié, chez une majorité de famille, un locus associé à la CGL sur le chromosome 9q34, dans un intervalle de 8,7 cM bordé respectivement par les marqueurs D9S1818 et D9S1826. Toutefois, ces auteurs n'ont pas identifié, dans cet intervalle de
8,7 cM, le gène causal.
s A l'heure actuelle, peu de traitements de patients atteints de CGL sont disponibles. La part la plus importante des traitements actuels consiste à fournir aux patients la qualité et la quantité optimales d'énergie nécessaire à leur métabolisme immédiat. Mais il est très difficile pour les patients de maintenir un régime alimentaire suffisamment rigide durant leur o vie entière. Malgré l'administration de hautes doses d'insuline afin de surmonter la résistance à l'insuline observée lors de la CGL le contrôle du diabète reste mauvais et les patients développement des complications
diabétiques graves.
On a également eu recours au pimozide, un médicament bloquant la dopamine, du fait de l'observation de quantités accrues des facteurs de libération des hormones hypophysaires dans le sang des patients atteints de CGL. On a aussi utilisé le fenfluramine, qui a un effet anorexiant et qui réduit en particulier la consommation d'hydrates de carbone facilement digestibles. Il s'agit d'un composé agoniste sérotonergique augmentant le - so taux de sérotonine dans le système nerveux central. Toutefois, I' administration de fenfluramine était suivie de nombreux effets
indésirables, notamment de somnolence, de diarrhée et de bouche sèche.
On a également utilisé l'IGF-1. Toutefois, I'IGF-1 est une substance à grand pouvoir anabolique et qui est connue pour stimuler la croissance ceilulaire dans certains tissus. L'IGF-1 est donc susceptible de détériorer dangereusement une cardiomyopathie chez les patients atteints de CGL
ainsi traités.
Il existe donc un besoin, dans l'état des connaissances actuelles, de moyens efficaces destinés à la prévention ou au traitement de s lipodystrophies, notamment de CGL, qui puissent être utilisés à long terme chez les patients et qui entranent des effets indésirables les plus réduits possibles. De tels moyens préventifs ou curatifs spécifiques ne peuvent être mis au point de manière ciblée sans avoir au préalable identifié le
déterminant génétique causal de ce syndrome.
SOMMAIRE DE L' INVENTION
Le demandeur a désormais identifié un gène causal du syndrome de lipodystrophie généralisce congénitale (CGL), localisé sur le locus 11q13 du chromosome 11 humain. Le gène causal de la CGL a été désigné cgl1 par le demandeur, qui a également identifié la protéine codée
par ce gène, désignse CGL1.
Il est ainsi fourni selon l'invention un acide nucléIque codant le polypeptide CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 1 ou encore
o des fragments ou des variants du polypeptide CGL1.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus pour la fabrication d'une sonde ou d'une amorce
nucléotidique spécifique du gène cgl1 normal ou du gène cgl1 muté.
L'invention est également relative à des procédés pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, lesdits procédés mettant en oeuvre une ou plusieurs sondes ou amorces nucléotidiques spécifiques du gène cgl1 muté, ainsi que des nécessaires
ou kits pour la détection d'une mutation dans le gène cgl1.
L'invention a également trait à des vecteurs recombinants so comprenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, tout particulièrement des vecteurs recombinants utiles dans des procédés de thérapie génique, ainsi que des cellules hôtes recombinantes transfectées ou transformées par un tel acide nuclélque ou par un vecteur tel que défini ci-dessus. L'invention a aussi pour objet l' utilisation d' un acide nucléique codant pour le polypeptide CGL1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie d'un diabète ou d'une obésité, et tout particulièrement d'une lipodystrophie associée au syndrome CGL. El le est également relative à des compositions ph arm aceutiq ues destinéss à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie ou d'un diabète, caractérisée en ce qu'elles comprennent un acide nucléique codant pour le polypeptide CGL1 ou encore un vecteur recombinant ou une o cellule hôte recombinante telle que définie cidessus, en association avec
un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
L'invention a également pour objet le polypoptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1 ou encore un fragment ou un variant du polypeptide CGL1. s Elle est également relative à l'utilisation du polypeptide CGL1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie ou d'un diabète ainsi qu'à une composition
pharmaceutique comprenant un polypeptide CGL1.
L'invention concerne aussi un anticorps dirigé contre le o polypeptide CGL1, ou encore un fragment ou un variant du polypeptide CGL1, ainsi qu'à des procédés de détection et des nécessaires ou kits
mettant en oeuvre un tel anticorps.
L'invention a aussi pour objet des procédés de criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1 ainsi que des
s nécessaires ou kits pour le criblage de tels composés candidats.
Elle est également relative à des procédés de criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgl1 ainsi qu'à des
nécessaires ou kits pour le criblage de tels composés candidats.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1.
La figure 1A illustre les familles CGL de deux groupes géographiquement distincts, respectivement Libanaise et Norvégienne, qui
ss ont été étudiées dans l'analyse de liaison réalisée sur le génome entier.
s Les symboles pleins représentent les individus affectés et les symboles vides représentent les individus non affectés. Les pedigrces ont été simplifiés et ne montrent que la descendance affectée qui a été effectivement génotypée. Dans le groupe CGL-01, I'individu annoté par une étoile (*) possède!e même nom que les trois dernières familles du pedigree respectant le mode de transmission récessif de la maladie pour les patients #4. Pour le chromosome 11q13, I'analyse d'haplotype est représentée schématiquement par les barres localisées sous les individus qui ont été génotypés: les barres pleines correspondent à l'allèle porteur respectif, qui o ségrège avec la maladie et révèle un effet "fondateur " dans chaque population. La numérotation des individus affectés correspond à celle utilisoe dans la figure 2, dans laquelle des détails de cartographie fine sont présentés. La figure 1 B illustre une analyse multipoints des familles Libanaises et Norvégiennes au locus 11q13. La localisation des marqueurs est indiquée en bas du graphe. Le lod score de 15.2 indique que le locus
de la maladie CGL est localisé dans l'intervalle D1 1541 91-D115997.
La figure 2 illustre la cartographie d'homozygotie au locus 11q13.
Les génotypes sont présentés pour les patients après estimation des o haplotypes dans chaque famille originaire du Liban ou de Norvège. Les caractères en italique représentent les génotypes pour les patients 4, 12, 13, 24 et 25, qui ont été inférés à partir des autres parents de la famille, du fait de l'absence d'ADN pour l'étude; x représente un haplotype à la maladie non identifié dans les ADN disponibles. Les marqueurs microsatellites sont indiqués dans la colonne de gauche; les flèches indiquent les marqueurs utilisés pour la cartographie du génome entier. Les
bo^'tes pleines indiquent les régions d'homozygotie.
La figure 3 illustre l'analyse d'haplotype dans des familles d'origine éthnique variée co-ségrégeant au locus 11q13. Les individus ont été so génotypés avec six marqueurs couvrant un intervalle d'environ 10cM. Pour chaque famille, I'origine ethnique est indiquée lorsqu'elle diffère du pays d'habitation. Dans la famille CGL-16, la lettre d comme génotype au
marqueur CA10 correspond à une délétion.
La figure 4A illustre des délétions dans le gène cgl1, homologue humain du gène murin Gng31g. Les onze exons ont été amplifiés sous la forme de sept fragments dans chaque membre de la famille consanguine
CGL-16, y compris les enfants affectés Qumeaux monozygotes).
La figure 4B illustre la distribution des mutations dans le gène cgl1. Les mutations sont représentées selon leur type: large délétion (-), s une mutation faux sens (O), mutation non sens (X), mutation dans le site d'épissage (I), mutation de changement de cadre de lecture due à une
insertion (), délétion () ou délétion/insertion (0).
La figure 5 illustre le profil d'expression du gène cgl1.
La figure 5A est un cliché autoradiographique montrant o l'hybridation d'une sonde d'ADNc couvrant les exons 1 à 11 contre des gels d'ARNm poly(A)+(environ 2'ug) de différents tissus, montrant l'existence de produits de transcription respectivement d'environ 2,4 kb et environ 1,8 kb
et environ 2 kb.
La figure 5B présente des clichés d'autoradiographie montrant I'hybridation d'une sonde d'ADNc couvrant les exons 1 à 11 sur un gel contenant de l'ARN humain total (20,ug) provenant des tissus sous-cutanés abdominales et viscérales, par comparaison aux tissus du cerveau, du
coeur et du foie.
La figure 5C illustre la quantification des clichés o d'autoradiographie obtenus après hybridation d'une sonde d'ADNc couvrant les exons 1 à 11 sur de l'ARN poly(A)+ de divers tissus. Les résultats montrent que les niveaux d'expression les plus forts étaient
observés pour le cerveau et les testicules.
La figure 6 illustre un alignement des séquences de la protéine s CGL1 avec respectivement la protéine Gng31g de mus musculus et la protéine CG9904 de DrosopElla melanogaster. Les résidus d'acides aminés conservés sont représentés dans les bo'^tes pleines. Les domaines
transmembranaires putatifs sont soulignés.
DEFINITIONS GENERALES
Le terme " isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (I'environnement dans lequel il est localisé
naturellement).
Par exemple un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nuclélques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré
dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur eVou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne
constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent o sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres
composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériei naturel d'au moins un ordre de grandeur,
de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, I'expression " séquence
nucléotidique" peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel de génétique lui-même et n'est donc pas
restreinte à l'information concernant sa séquence.
o Les termes " acide nucléique", " polynucléotide", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple
chane ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotlUe " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T. G. C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT
N WO 95/04 064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire" d'un second polynucléotide iorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base
complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G. Par " variant " d'un acide nuclélque selon l'invention, on entendra un acide nuclélque qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynocléotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturel, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi o un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagenèse. En général, les différences entre l'acide nuclélque de référence et l'acide nuclélque variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de.l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nuclélque variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les
séquences d'amincacides codées par ledit acide nucléique variant.
Cependant, les changements de nucléotides dans un acide o nuclélque variant peuvent aussi résulter dans des substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nuclélque variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre, des modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence
s d'aminoacides.
De préférence, les acides nuclélques variants selon l'invention codent pour des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés
so contre les polypeptides codés par l'acide nuclélque initial.
Certains acides nuclélques variants coderont ainsi pour des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de
déduire des relations structure activité des protéines en question.
On entendra par "fragment" un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à i'acide nuclélque de référence. Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le to cas échéant, compris dans un polynucléotide plus grand duquel il est constitutif. De tels fragments comprennent, ou alternativement consistent en, des oligonucléotides de longueur allant de 8, 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, , 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 ou 1500 nucléctides consécutifs d'un
acide nucléique selon l'invention.
Par " variant " d'u n polypeptide selon l' invention, on entend ra principalement un polypeptide dont la séquence d'acides aminés contient une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide o de référence, étant entendu que les substitutions d'aminoacides peuvent
être indifféremment conservatives ou non conservatives.
Par " fragment " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est plus courte que celle du polypeptide de référence et qui comprend sur toute la partie commune avec
ces polypeptides de référence, une séquence en acides aminés identique.
De tels fragments peuvent, le cas échéant, être compris au sein
d'un polypeptide plus grand duquel ils font partie.
De tels fragme nts d' u n polypeptide selon l' invention peuvent avoir
une longueur de 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 100, 200 ou 300 acides aminés.
o Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une
fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière
à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est o observé pour les deux séquences (nuclélque ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir
le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor,
Madison, WISCONSIN.
À titre d' illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4.9 de mars 1996, BLAST 2.0.4 de février 1998 et BLAST 2.0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402). Blast recherche des séquences similaireslLomologues à une séquence " requête " de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. La séquence requête et les bases de donnéss utilisées peuvent être
peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.
Par " conditions d'hybridation de forte stringence" au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes: 1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION: s - Mélanger: 40,ul ADN sperme de saumon (1 Omg/ml) + 40,ul ADN placentaire humain (1 Omg/ml)
- Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange.
o - Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube
d' hybrid ation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.
s - Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- ComPétition de la sonde marquce: - Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 ul ADN Cot I, selon la
quantité de repests.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C.
- Incuber à 65 C pendant 2 à 5 heures.
3- HYBRIDATION:
- Oter le mix de pré hybridation.
o - Mélanger 40 pl ADN sperme de saumon + 40 pl ADN placentaire humain;
dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace.
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- AJouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des
deux AD N et la sonde ma rquée/AD N Cot I dénatu rse.
- Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation.
s 4- Lavapes:
- Un lavage à température amblante dans du SSC 2X, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1% à 65 C.
o - 2 fois 15 minutes à 65 C SSC 1X et SDS 0,1% à 65 C.
Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à I'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs
centaines de nucléotides.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nuclélque dont I'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des
techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et
HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de F.AUSUBEL et al (1989).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont réalisé une cartographie d'association de marqueurs et une cartographie d'homozygotie chez des individus de neuf o familles atteintes de CGL originaires de deux isolats géographiques
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distincts, respectivement du Liban et de Norvège, ce qui leur a permis d'isoler un des gènes causals du syndrome de lipodystrophie généralisoe
congénitale dans une petite région du locus chromosomique 11q13.
Les inventeurs ont réalisé une première étude d'association sur s l'ensemble du génome dont les résultats ont montré que deux marqueurs adjacents, respectivement les marqueurs D11S4191 et D11S987 localisés sur le locus chromosomique 11q13 étaient homozygotes chez la plupart des patients. Une analyse d'association avec deux marqueurs additionnels, respectivement les marqueurs D11S1765 et D11S1883 localisés à o l'intérieur de l'intervalle précité, ont confirmé les premières observations et révélé la présence d'allèles Identiques chez dix huit patients des familles
libanaises pour le marqueur D11 S1883.
Les inventeurs ont alors caractérisé 25 marqueurs microsatellites additionnels, dont douze sont localisés entre le marqueur D11S4191 et D11 S987. Une seconde étude d'association réalisée avec ces marqueurs a permis de déterminer que le locus portant le déterminant génétique causal de la CGL était localisé dans une région d'approximativement 2,5 Mb localisée entre les marqueurs D11 S4076 et D11 S480. Certains des patients inclus dans l'étude étaient homozygotes pour un allèle nul o correspondant au marqueur CA10. Ce résultat a permis aux inventeurs d'identifier un gène causal de la lipodystrophie généralisée congénitale parmi les 27 gènes étudiés dans l'intervalle D11S4076-D11S480. Ce gène est contenu dans l'insert d'ADN d'un vecteur BAC désigné RP11-831H9 dont des séquences nucléotidiques partielles sont référencées dans la
base de données GenBanK sous le numéro d'accès n AP001458.
Le gène causal de la CGL a été désigné << gène cgl1 " par les inventeurs. Par séquençage du gène cgl1 chez des patients affectés de CGL, les inventeurs ont identifié de nombreuses mutations induisant le codage de polypeptides CGL1 mutés, en particulier des polypeptides CGL1 tronquyés. L'identification par les inventeurs du gène CGL1, responsable du syndrome de lipodystrophie généralisoe congénitale (CGL) leur permet de mettre au point des outils de détection du gène cgl1 normal et du gène cgl1 muté chez des patients, des outils d'expression du gène cgl1 normal afin de suppléer au défaut d'expression de ce gène chez les patients CGL, des moyens préventifs ou curatifs de la CGL ainsi que des outils de criblage de composés pharmaceutiquement efficaces pour prévenir ou traiter cette o pathologie. Ainsi, I'invention a tout d'abord pour objet un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 1 ou
un fragment ou un variant du polypeptide CGL1.
De manière générale, les acides nuclélques selon la présente
invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Acdes nacléiques génomiques codanf le polypeptide CGL1 Comme exposé précédemment, la séquence génomique du gène o cgl1 est entièrement contenue dans l'insert d'ADN du vecteur BAC désigné RT11-831 H9 dont des séquences non-ordonnées ont été référencées sous
le n d'accès AP001458 de la base de donnses GenBank.
Les inventeurs ont déterminé que le gène cgl1 comprend 11
exons et 10 introns.
En se basant sur la numérotation en nucléctides de la séquence génomique n AP001458 de GenBank, les séquences des différents exons du gène cgl1 ont été déterminées comme suit: L'exon 1, qui ne comporte pas de cadre de lecture ouvert, correspond à la séquence nucléotidique complémentaire de la séquence
so allant jusqu'au nucléotide en position 35294 de la séquence AP001458.
L'exon 2 est la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 161282 jusqu'au nucléotide en position 161598 de la séquence AP001458. La base A du codon d'initiation de la traduction est localisoe en
position 1 61387.
L'exon 3 est la séquence nucléotidique allant du nucléctide en position158346 jusqu'au nucléotide en position 158427 de la séquence
s génomique AP001458.
L'exon 4 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 153740 jusqu'au nucléotide
en position 153597 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 5 est la séquence complémentaire de la séquence o nucléotidique allant du nucléotide en position 66927 jusqu'au nucléotide en
position 66793 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 6 est la séquence complémentaire de la séquence nucléctidique allant du nucléotide en position 66603 jusqu'au nucléotide en
position 66506 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 7 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 65551 jusqu'au nucléotide en
position 65410 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 8 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nuciéotide en position 65271 jusqu'au nucléotide en
o position 65,205 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 9 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 64997 jusqu'au nucléctide en
position 64917 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 10 est la séquence complémentaire de la séquence s nucléotidique allant du nucléotide en position 64822 jusqu'au nucléotide en
position 64742 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 11 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nuciéotide en position 64651 de la séquence génomique AP001458. La base A du codon TGA d'arrêt de la traduction du o gène cgl1 localisée au nucléotide 64497 de la séquence génomique
AP001458.
Le tableau 1 ci-après présente les séquences de jonction intron-
exon du gène cgl1.
TABLEAU 1
Jonctions intron-exon du gène cgll Exon Taille Site d'épissage 3' Site d'épissage 5' (bp) 1 ND CAAAGAGGAGgtaggggccattgtg 2 317 accctctcUttccagGAACCACCAG TCTACTACAGgtgagaggggcchtc 3 82 tccaatctcatUtagGACCGACTGT ACGTGATCGGgtgagtaLgggaact 4 144 ggctacctUtggcagGTGCTGATGT TTCGCGTTCGgtaagtgttggtggc 135 tcccacccccggcagGTGATGCTGC AGAGAACTCGgtgagtgaggtgaac 6 98 cccaccccctcacagTACGTGCCGA CTGGGCTCAGgtgaggggccaactg 7 142 tachtcctgcctcagATACCTGCTA CTCTTTGCAGgtcgaaaggggcaag 8 67 gÉttttcctccacagGTTAACATCC CATCAGCCAGgtaaaggtgttggct 9 81 tchUtggaggtgcagGGCCTGAAGG TCAGGGACAGgtatggcgcagccac 1O 81 cccttttggaLgcagAGGGTCAGCT GCCAGTGATGgtgaggggcatcctg 11 >155 cctttcchggoccagGTTCAGGCTC
Au vu de la description de l'ensemble des caractéristiques
structurales du gène cgl1, I'homme du métier est capable d'accéder à l'ensemble de l'acide nucléique génomique codant le gène cgl1 par des techniques de biologie moléculaire courantes. Notamment, le gène cgl1 peut être isolé par l'homme du métier à partir du vecteur BAC désigné o RP11-83H9 et référencé sous le n d'accès APOO 1458 de la base de
donnée GenBanK.
Avantageusement, I'homme du métier peut à nouveau isoler l'acide nucléique génomique du géne cgl1 à partir d'un échantillon d'ADN humain, à l'aide de la paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID
N 17 et SEQ ID N 18.
L'invention est relative à un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 caractérisé en ce qu'il comprend le gène cgl1 contenu dans le vecteur BAC désigné RP-11-831H9 dont des séquences nucléotidiques partielles sont référencées dans la base de donnéss GENBANK sous le n
d'accès n AP001458.
ADNc codant le poypepfide CGL1 L'ADNc codant le polypeptide CGL1 a été identifié par les inventeurs comme étant un acide nucléique présentant une identité complète avec l'acide nuclélque référencé dans la base de données GenBanK sous le numéro d'accès n AF052149, cette séquence étant également référencée comme la séquence SEQ ID N 14 du listage de séquences. o Dans la base de données GenBanK, la séquence n AF052,149 est simplement identifiée comme provenant d'un ARN messager humain séquencé au hasard à partir d'une banque d'ARNm humain. La référence AF052149 de GenBanK ne contient aucune information concernant l'existence d'un cadre de lecture ouvert dans la séquence décrite, ni a s fortiori la position d'un éventuel cadre de lecture ouvert. En conséquence, aucune information n'est donnée sur un polypoptide qui pourrait être codé
par cette séquence.
Il est montré selon l'invention que la séquence d'ADNc codant pour le polypeptide CGL1, référencé comme la séquence SEQ ID N 14 du o listage de séquences, possède un cadre ouvert de lecture qui débute à la base A du codon ATG, en position 345 et se termine à la base A du codon
TGA en position 1541 de la séquence SEQ ID N 14.
Le cadre de lecture ouvert de la séquence SEQ ID N 14 code
pour le polypeptlde CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 1.
L'invention est donc également relative à un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence
nucléotIdique SEQ ID N 14.
Elle a aussi pour objet un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 caractérisé en ce qu'il comprend le polynucléotide allant du so nucléotide en position 345 jusqu'au nucléotide en position 1541 de la
séquence nucléotidique SEQ ID N 14.
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Acides nacléiques codant un varianf du polypeptide CGL1
Comme déjà exposé précédemment dans la description, les
inventeurs ont identifié de nombreuses mutations dans le gène cgl1 chez des patients atteints de lipodystrophie généralisée congénitale. Les protéines mutées ou tronquées codées par le gène cgl1 portant différentes mutations sont décrites ci-après, en référence à la
désignation des différentes mutations détectées.
o Mutafion F63 fsX75 Le gène cgl1 affecté par cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N 2. Le polypaptide de séquence SEQ ID N 2 possède une séquence en acides aminés tronquée par rapport au polypeptide CGL1 normale de séquence SEQ ID N 1 et possède en outre la séquence Cterminale " RDCAFLLQDRL " qui n'est pas retrouvée dans le polypeptide CGL1 normal, du fait d'un changement de cadre de lecture
induit par la mutation.
Mutation F100fsX111 Le gène cgl1 portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N 3. Le polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N 3 est tronqué, par rapport au polypeptide CGL1 normal et possède la séquence C-terminale " KCMDSRIVLP " qui n'est pas retrouvoe dans le polypeptide CGL1 normal, du fait d'un changement du cadre de lecture
induit par la mutation.
Mutation F105 fsX112 Le gène cgl1 portant cette mutation code pour le polypoptide de séquence SEQ ID N 4. Le polypeptide de séquence SEQ ID N 4 est tronqué par rapport au polypeptide CGL1 normal et possède la séquence C-terminale " SCYLRA " qui n'est pas retrouvée dans le peptide CGL1
normal, du fait d'un changement du cadre de lecture induit par la mutation.
Mutation F105fs X111 Le gène cgl1 portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N 5, qui est tronqué par rapport au polypeptide CGL1 normal et qui possède une séquence C-terminale "CYLRA " qui n'est pas retrouvoe dans le polypeptide CGL1 normal, du fait d'un changement de
cadre de lecture induit par la mutation.
o Matation F108 fsX113 Le gène cgl1 portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N 6 qui est tronqué par rapport au polypeptide CGL1 normal et qui possède une séquence C-terminale "NLRA " qui n'est pas retrouvée dans le polypeptide CGL1 normal, du fait d'un changement de
cadre de lecture induit par la mutation.
Mutation R138X Le gène cgl1 portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N 7 dont la séquence en acides aminés est tronquée par
rapport au polypeptide CGL1 normal.
Matation À excision de l'exon 4,, Le gène cgl1 portant cette mutation code pour un polypeptide comprenant une délétion d'acides aminés et code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N 8. Plus spécifiquement, il s'agit d'une mutation de la première base du site d'épissage alternatif de l'intron 4, qui induit l'excision de l'exon 4. L'excision de l'exon 4 provoque la délétion de 48 acides
aminés, avec conservation du cadre de lecture.
Mutation A 212P Le gène cgl1 portant la mutation A 212P code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N 9, résultant d'une mutation "faux sens " dans s l'exon 6 induisant la substitution du résidu alanine en position 212 par un
résidu proline.
Mutafion F. 213fsX232 o Le géne cgl1 portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N 10 qui est tronqué par rapport au polypeptide CGL1 normal et qui possède une séquence C-terminale " TSASTRTSLGSDTCY TTSR " qui n'est pas retrouvée dans le polypeptide CGL1 normal, du fait
d'un changement du cadre de lecture.
i5 Les variants du polypeptide CGL1 de séquences SEQ ID N 2 à
SEQID N 10 font partie de l'invention.
Font ég alement partie de l' inventio n les acid es n uclélq u es codant pour les polypeptides de séquences en acides aminés SEQID N 2 à SEQ
ID N 10, ainsi que leurs séquences complémentaires.
o Le tableau 2 ci-après résume les différentes mutations du gène
cgI1 retrouvoes par les inventeurs.
Fragments du polypeptIde CGL1 Font aussi partie de l'invention des " fragments " du polypeptide CGL1 de séquence SEQID N 1. Les fragments du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1 ont de préférence une longueur d'au moins 10, 15,
, 30, 40, 50, 75,100,150, 200, 2550, 300, 350 ou 380 acides aminés.
Les fragments du polypeptide CGL1 sont utiles notamment pour la
so préparation d'anticorps dirigés spécifiquement contre cette protéine.
Les fragments du polypeptide CGL1 préférés sont les polypeptides de séquences en acides aminés respectivement SEQ ID
N 11,SEQID N 12 et SEQ ID N 13.
* L'invention a également pour objet un acide nucléique codant pour
un fragment du polypoptide CGL1 tel que défini ci-dessus.
SONDES ETAMORCES NUCLEOTIDIQUES
L' i nvention est également relative à l' utilisation d ' u n acide nucléique codant le polypeptide CGL1 ou un fragment du polypaptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1 pour la fabrication d'une sonde ou d'une
amorce nucléotidique spécifique du gène cgl1.
L'invention a également trait à l'utilisation d'un acide nuclélque codant un variant du polypeptide CGL1 pour la fabrication d'une sonde ou
d'une amorce nucléotidique spécifique du gène cgl1 muté.
o L'invention a également pour objet une sonde ou une amorce nucléotidique hybridant, dans des conditions de forte stringence définie
dans la présente description, spécifiquement avec le gène cgl1 muté.
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention sont préférentiellement celles caractériséss en ce qu'elles hybrident spécifiquement avec un acide nuclélque codant pour l'un des polypeptides de séquences SEQ ID N 2 à SEQ ID N 10, ces polypeptides étant codés
par le gène cgl1 muté.
De manière tout à fait préférse, les sondes et les amorces nucléotidiques hybrident spécifiquement avec le gène cgl1 portant une o mutation choisie parmi les mutations F63fsX75, F100fsX111, F105fsX112, F105fsX111, F108fsX113, R138X, A212P, F213fsX232, dellins E5-6 et del
E-6, représentées dans le tableau 2.
Font aussi partie de l'invention des sondes et des amorces qui hybrident avec un acide nucléique non muté codant le polypeptide CGL1, mais n'hybrident pas, dans les conditions d'hybridation spécifiées, avec un
acide nucléique portant l'une des mutations ci-dessus.
L'invention a également trait à un couple d'amorces nucléotidiques pour la détection d'une mutation dans le gène cgl1, caractérisé en ce qu'il s'agit du couple d'amorces comprenant les séquences nucléotidiques SEQ
so ID N 15 et SEQ ID N 16 qui définissent le marqueur microsatellite CA10.
Un second couple d'amorces selon l'invention comprend les
amorces de séquences SEQ ID N 17 et SEQ ID N 18.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparce par toute méthode adaptée bien connue de i'homme du
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métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet
EU N EP 0 707 592.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des o moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques,
immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5bromodeoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine)
OU encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par
extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactifs de fragments o d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (1988) ou
Sanchez-pescador et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une s amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al.
(1991) ou encore dans le brevet européen n EP-0 225 807 (CHIRON).
Les sondes oligonucléotIdes selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou encore dans des hybridations à l'ARN messager so correspondant lorsque l'expression du transcrit correspondant est
recherchée dans un échantillon.
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Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements. Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immob i lisées sur u n support solid e. De tels su pports sol ides sont bien con n us de l' hom me d u métier et comp ren nent d es su rfaces des pu its de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des
particules de latex.
o La présente invention concerne aussi un procédé pour détecter une mutation dans un acide nuclélque codant le polypaptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus avec l'échantillon à tester; b) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les
sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisoes
sur un support.
o Selon un autre aspect, les sondes oligonucléctidiques
comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection d'une mutation dans le gène cgl1, caractérisé en ce qu'il comprend: a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que définies ci dessus; b) le cas échéant, ies réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation. Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est
so caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
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Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléctidiques comprennent un
marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit cidessus, un tei kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques
capables de détecter des mutations distinctes dans le gène cgl1.
Les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent étre ordonnées en matrices telles que les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnses ont été en particulier décrites dans le brevet us
o N 5,143,854 et dans les demandes PCT N WO 90/15070 net 92/192.
Des matrices support sur lesquelles les sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N 5,412,087 et dans la demande
PCT N WO 95/11 995.
s Les amorces nucléotidiques selon l'invention sont préférentiellement utiiisées pour détecter une motation dans un acide nuclélque codant le polypoptide CGL1, et donc amplifié sélectivement tout
ou partie d'un acide nucléique portant une mutation du gène cgl1.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend ies étapes de: a) mettre en contact l'échantillon à tester avec une ou plusieurs amorces nucléotidiques telles que définies ci-dessus;
b) détecter les acides nuclélques amplifiés.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour détecter une mutation dans un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend: a) une ou plusieurs amorces nucléotidiques telles que définies ci dessus; 2s 2824332 b) le cas échéant, les réactifs nocessaires à la réaction d'amplification. Les amorces nucléotidiques selon l'invention sont particulièrement utiles dans le cadre de procédé et de génotypage de sujets et/ou de s génotypages de populations, notamment dans le cadre d'études d'association entre les formes alléliques particulières ou des formes de groupes d'allèles particulières de génotypage de suiets eVou de génotypages de populations, notamment dans le cadre d'études d'association entre les formes alléliques particulières ou des formes de groupes d'allèles particulières (haplotypes) chez des sujets atteints de CGL et l'existence d'un phénotype (caractère) particulier chez ces sujets, par exemple la prédisposition de ces sujets à développer des pathologies liées
à une dystrophie généralisse, un diabète ou l'obésité.
s VECTEURS RECOMBINANTS L'invention serait également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 1 ou un fragment ou un variant du polypeptide
CGL1.
Avantageusement, un vecteur recombinant comprenant un acide nuclélque codant un variant du polypeptide CGL1 comprendra un acide nuclélque codant pour un polypeptide choisi parmi les polypeptides de
séquences en acides aminés SEQ ID N 2 à SEQ ID N 10.
s Avantageusement, un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant un fragment du polypeptide CGL1 comprendra un acide nucléique codant un polypeptide choisi parmi les polypeptides de
séquences en acides aminés SEQ ID N 11 à SEQ ID N 13.
Seion un premier mode de réalisation préféré, I'acide nucléique so codant le polypeptide CGL1 comprend le gène cgl1 contenu dans le
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vecteur BAC désigné RP11-831H9 dont des séquences nucléotidiques partielles sont référencées dans la base de données GENBANK sous le
numéro d'accès n AP001458.
Selon un deuxième mode de réalisation préféré, I'acide nucléique s codant le polypeptide CGL1 est un acide nucléique comprenant la
séquence nucléotidique SEQ ID N 14.
Selon un troisième mode de réalisation préféré, I'acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 comprend le polynucléotide allant du nucléotide en position 345 jusqu'au nucléotide en position 1541 de la
o séquence nucléotidique SEQ ID N 14.
Par " vecteur" au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous
forme de simple brin ou double brin.
Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré
après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique conforme à l'invention, des séquences réqulatrices permettant d'en diriger la transcription eVou la
traduction.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants: (1) des éléments de réqulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des séquences activatrices (" enhancers "); (2) la séquence codante comprise dans l'acide nuclélque conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de réqulation décrits aux (1); et o (3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription approprices.
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En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des
s marqueurs ou des marqueurs de sélection.
A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du
bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.
Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le o promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de
la métallothionéine-L de souris.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, I'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller
etal. (1996).
Lorsque i'expression de la séquence génomique du gène cgl1 sera désirée, on aura préférentiellement recours à des vecteurs capables d'inclure de grandes séquences d'insertion. Dans ce mode de réalisation particulier, on utilisera de préférence des vecteurs de bactériophages, tels o que les vecteurs de bactériophage P1 comme le vecteur p158 ou encore le
vecteur p158/neo8 décrits par Sternberg (1992,1994).
Les vecteurs bactériens préTérés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322(ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pM223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech,
s Madison, Wl, ETATS-UNIS).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stratagene). Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1302/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de
la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivées de Spodoptera frugiperda.
Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5. Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno-associés sont par exemple décrits par Flotte et al. (1992),
Samuiski et al. (1989), ou encore McLaughlin BA et al. (1996).
Pour permettre l'expression des polynucléotides selon l'invention, ces derniers doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour s transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires. On peut aussi réaliser liintroduction des polynucléotides selon l'invention in vivo, pour la prévention ou le traitement
de pathologies associces à la lipodystrophie, au diabète ou à une obésité.
Pour introduire les polynucléotides ou les vecteurs dans une o cellule hôte, I'homme du métier pourra avantageusement se référer à différentes techniques, comme la technique de précipitation au phosphate de calcium (Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), le DEAE Dextran (Gopal, 1985), I'électroporation (Tur-Kaspa, 1896; Potter et al., 1984), la microinjection directe (Harland et al., 1985), Les liposomes chargés en
ADN (Nicolau et al., 1982, Fraley et al., 1979).
Vecteurs utiles dans la mise en oeuvre de procédés de thérapie génque. Une fois que le polynucléotide a été introduit dans la cellule hôte, il
s peut être intégré de manière stable dans le génome de la cellule.
L'intégration peut être réalisée à un endroit précis du génome, par recombinaison homologue, ou peut être intégré au hasard. Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide peut être maintenu de manière stable dans la cellule hôte sous la forme d'un fragment d'épisome, o l'épisome comprenant des séquences permettant le maintien et la réplication de ce dernier, soit de manière indépendante, soit de manière
synchronisoe avec le cycle cellulaire.
Selon un mode de réalisation particulier, une méthode pour introduire un polynucléotide selon l'invention dans une cellule hôte, en particulier une cellule hôte provenant d'un mammifère, in vivo, comprend une étape au cours de laquelie on introduit une préparation comprenant un vecteur pharmaceutiquement compatible et un polynucléotide " nu" selon l'invention, placé sous le contrôle de séquences de réqulation appropriées, par injection locale au niveau du tissus choisi, par exemple un tissu o musculaire lisse, le polynucléotide " nu " étant absorbé par les cellules de
ce tissu.
Des compositions pour l'utilisation in vitro et in vivo comprenant des polynucléotides " nus " sont par exemples décrites dans la demande PCT N WO 95/11307 (Institut Pasteur, Inserm, Université d'Ottawa) ainsi
que dans ies articles de Tacson et al. (1996) et de Huygen et al. (1996).
Selon un mode de réalisation spécifique de l'invention, il est fourni une composition pour la production in vivo du polypeptIde CGL1. Cette composition comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide CGL1 placé sous le contrôle de séquences réqulatrices appropriées, en solution
so dans un vecteur physiologiquement acceptable.
La quantité de vecteur qui est injecté à l'organisme hôte choisi varie selon le site de l'injection. A titre indicatif, il peut être injecté entre environ 0,1 et environ 100,ug du polynucléotide codant le polypeptide CGL1 dans le corps d'un animal, de préférence d'un patient susceptible de développer une lipodystrophie, un diabète ou une obésité, en particulier un
syndrome CGL, ou ayant déjà développé cette maladie.
L'invention a en outre pour objet l'utilisation d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 ou l'utilisation d'un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique pour la fabrication d'un médicament o destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, et
préférentiellement d'une lipodystrophie généralisée congénitaie (CGL).
L'invention est ég alement relative à l' uti lisatio n d ' u n acid e nuclélque codant le polypeptide CGL1 ou l'utilisation d'un vecteur recombinant comprenant un tel acide nuclélque pour la fabrication d'unmédicament destiné à la prévention ou au traitement d'un diabète ou d'une obésité. L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique destince à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, préférentiellement d'une lipodystrophie généralisée congénitale (CGL), o comprenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, ou comprenant un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles. L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique s destince à la prévention ou au traitement d'un diabète, comprenant un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1, ou comprenant un vecteur recombinant comprenant un tel acide nuclélque, en association avec un ou
plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Vecteurs uWes dans des procédés de thérape génique somatique et compositions confenant de fels vecteurs La présente invention concerne aussi une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies associées à la s lipodystrophie, au diabète ou à l'obésité. Elle propose une solution avantageuse aux in convénients de l 'a rt antérieu r, en dé montrant la possibilité de traiter les pathologies associces à la lipodystrophie ou au diabète, en particulier ia lipodystrophie généralisée congénitale (CGL) par la thérapie génique, par le transfert et l'expression in vivo d'un gène codant
o pour le polypeptide CGL1.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique s peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413),1'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, I'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gèn es est apparu com me u ne alternative prom etteuse à ces s techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus
adéno-associés, et les adénovirus.
La présente invention est donc également relative à une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies associées au CGL, consistant à transférer et à exprimer in vivo des gènes codant pour CGL1. La présente invention résulte également de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1. En particulier, la présente invention montre que l'utilisation d'adénovirus recombinants comme vecteurs permet d'obtenir des niveaux o d'expression suffisamment élevés de ce gène pour produire l'effet thérapeutique recherché. D'autres vecteurs viraux tels que les rétrovirus ou les virus adéno-associés (MV) permettant une expression stable du gène
sont aussi des objets de l'invention.
La présente invention offre ainsi une nouvelle approche pour le s traitement et la prévention des pathologies associées à une lipodystrophie
ou un diabète.
L'invention a donc aussi pour objet un virus recombinant défectif comprenant un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 impliqué dans
le syndrome CGL.
o L'invention a également trait à l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destince au traitement et/ou à la prévention des maladies présentant une lipodystrophie
ou un diabète.
La présente invention concerne également l'utilisation de cellules modifiées génétiquement ex vivo par un virus tel que décrit ci-dessus, ou de cellules productrices de tels virus, implantées dans l'organisme, permettant une expression in vivo prolongée et efficace du polypeptide CGL1. Selon l'invention, on peut incorporer une séquence d'ADN codant pour le polypeptide CGL1 dans un vecteur viral, et que ces vecteurs permettent d'exprimer efficacement une forme mature, biologiquement active. Plus particulièrement, I'invention montre que l'expression in vivo du polypeptide s CGL1 peut être obtenue par administration directe d'un adénovirus ou par implantation d 'u ne cell u le p rod uctrice o u gé nétiq uement modifiée par u n
adénovirus ou par un rétrovirus incorporant un tel ADN.
La présente invention est particulièrement avantageuse car elle permet d'induire une expression contrôlée et sans effet nocif de CGL1 dans o des organes qui ne sont pas normalement concernés par l'expression de cette protéine. En particulier, une libération significative du polypeptide CGL1 est obtenue par implantation de ceilules productrices de vecteurs de
l'invention, ou infectées ex vivo par des vecteurs de l'invention.
L'acide nucléique codant le polypeptide CG! 1 peut être un ADNc, s un ADN génomique (ADNg), un ARN (dans le cas des rétrovirus) ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, I'utilisation
o d'un ADNg permet une meilleure expression dans les cellules humaines.
Pour permettre leur incorporation dans un vecteur viral selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mutagenèse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas s construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des expressions importantes. Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une
séquence nuclélque codant pour un polypeptide CGL1 humain.
Selon d'autres modes de réalisation, I'acide nucléique codant un so polypoptide codé par un gène orthologue au gène cgl1 peut être originaire d'un autre mammifère, par exemple de la souris. On utilisera dans ce dernier cas préférentiellement les acides nuclélques décrits dans la base de données GenBank sous les numéros d'accès AF069954, AB041588 et
AB030196 ou la séquence génomique.
Par ailleurs, il est également possible d'utiliser une construction codant pour un dérivé du polypeptide CGL1. Un dérivé du polypeptide CGL1 comprend par exemple toute séquence obtenue par mutation, délétion eVou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un produit conservant l'activité préventive ou curative du CGL. Ces o modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci après). Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement de nouvelles propriétés biologiques. Les dérivés incluent également les séquences d'ADN modifiées permettant une expression
améliorée in vivo.
o Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc
codant pour le polypeptide CGL1.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la
séquence d'ADN est une séquence d'ADNg.
Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus, des virus adéno-associés (MV), des virus de l'herpès (HSV) ou des rétrovirus. ll est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus, pour une administration directe ou pour la modification ex vivo so de cellules destinéss à être implantées, ou un rétrovirus, pour l'implantation
de cellules productrices.
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Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont
incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible.
Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences s nécessaires à la réplication dud it virus dans la cellule infectée. Ces régions
peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-
fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence nucléique codant le polypeptide CGL1. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont
o nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes,
dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés.
Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, I'adénovirus o d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche Manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour le polypeptide CGL1. Avantageusement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est rendue non fonctionnelle. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-LS sont non fonctionnels. Le so gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en _uvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4 et la séquence codant pour le o polypeptide CGL1 est insérée au niveau de la région E1 inactivoe. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans la région E1 au niveau de laquelle sont insérées la région E4 et la séquence codant
pour le polypoptide CGL1 (Demande de brevet Français FR94 13355).
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent s être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et
al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917).
En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant un acide nucléique codant le polypoptide CGL1. La recombinaison homologue se produit après co o transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignce cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans
les demandes n WO 94/26914 et W095/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme
illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (MV), il s'agit de virus à ADN s de taille relativement rébuite, qui s'intagrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des M\/ a o été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 47.00 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep s impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de
capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des MV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des MV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Toutefois, aucun de ces documents ne décrit ni ne suggère l'utilisation d'un MV recombinant pour le transfert et l'expression fn vivo ou ex vivo du polypeptide CGL1, ni les avantages d'un tel transfert. Les MV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co transfection, dans un lignce cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain so (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant
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le polypeptide CGL1 bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'MV, et d' u n p lasm ide portant les gènes d'encapsidati on (g ènes rep et cap) d'MV. Les MV recombinants produits sont ensuite purifiés par des
techniques classiques.
s Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. o En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et s remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être rénlisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous
sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant le polypeptide CGL1 selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite - séq uence cod ante est gén éralement constru it, p u is uti l isé p o u r tra nsfecte r s une lignce cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignce PA317 (US4,861,719); la lignce PsiCRIP so (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau
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des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants
p rod uits sont ens u ite pu rifiés par des tech niques classiq ues.
Pour la mise en _uvre de la présente invention, il est tout
particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif.
Les résultats donnés ci-après démontrent en effet les propriétés particulièrement intéressantes des adénovirus pour l'expression in vivo d'une protéine ayant une activité de transport de cholestérol. Les vecteurs o adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles
volumes de suspension virale.
Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en _uvre de l'invention, on utilise une lignce productrice de vecteurs rétroviraux contenant la séquence codant le polypeptide CGL1, pour une o implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont notamment les cellules PA317 (US4,861,719), PsiCrip (WO90/02806) et GP+envAm-12 (US5,278,056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant le polypeptide CGL1 selon l'invention. Par exemple des cellules souches totipotente, précurseurs des lignces cellulaires sanguines, peuvent être prélevées et isolées chez le sujet. Ces cellules mises ne culture peuvent être alors transfectées par le vecteur rétroviral contenant la séquence codant le polypeptide CGL1 sous le contrôle de promoteurs viraux, non viraux, non viraux et spécifiques des
macrophages ou encore sous le contrôle de son propre promoteur.
Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant le polypeptide CGL1 est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules infectées. Il peut s'agir de signaux d'expression homologues ou hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression du polypeptide CGL1. Il peut s'agir en particulier de séquences responsables
s de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques.
Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de fa,con spécifique ou non et de façon inductible ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que o l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes E1A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR- RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, a-actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofilaments, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CFTR, facteur Vl11, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (pyruvate kinase, villine, promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, promoteur de l'actine a des cellules du muscle lisse, promoteurs spécifiques pour le foie; Apo Al, Apo All, Albumine humaine etc) ou encore les promoteurs répondant à un o stimulus (récepteur des hormones stéroTdes, récepteur de l'acide rétinoque, etc.). En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifices par addition de séquences d'activation, de réqulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval
s d'une telle séquence.
Dans un mode particulier de réalisation, I'invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence nuclélque codant pour le polypeptide CGL1 sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi le
LTR-RSV ou le promoteur précoce du CMV.
Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention
des pathologies présentant une lipodystrophie ou un diabète.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, o intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection intraveineuse, telle que par exemple dans la veine porte du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment Iyophilisses, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisoe ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la veine porte du patient est avantageuse car elle permet de cibler l'infection au niveau du
foie et ainsi, de concentrer l'effet thérapeutique au niveau de cet organe.
Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la
pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 101 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure,
généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées.
so Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien
documentées dans la littérature.
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Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation. A cet égard, un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, I'invention concerne toute population de cellules humaines infectée par ces virus. Il peut s'agir en particulier de cellules d'origine sanguine (cellules souche totipotente ou précurseurs), fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules o musculaires lisses et endothéliales, cellules gliales, etc. Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les virus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention o peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP 228458, EP 289034,
EP 400047, EP 456640).
Les cellules en culture sont ensuite infectées par les virus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire le polypeptide CGL1. L'infection est réalisoe in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, I'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être o effectuces dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro. Pour I'infection par des rétrovirus, il est également possible de co-cultiver les cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus recombinants selon l'invention. Ceci permet de s'affranchir de la
purification des rétrovirus.
Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des o cellules de mammifères infectées par un ou plusieurs virus recombinants défectifs telles que décrites ci-dessus ou des cellules productrices de virus recombinants, et une matrice extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 105 à 1 o10 cellules. Plus
préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support
permettant l'ancrage des cellules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour o l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et
pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant.
Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférentiellement, on
utilise du collagène de type 1.
Comme indiqué ci avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le termeancrage désigne toute forme d'interaction biologique eVou chimique et/ou physique entranant l'adhésion eVou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On s préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou blo-com patible. En particul ier, on peut utilise r d es fib res de
polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies associées au CGL, telles que la
o lipodystrophie ou un diabète.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
CELLULES HOJES RECOMBINANTES
L'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle est transfectée ou transformoe par un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide o CGL1, ou encore par un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide CGL1. Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont par exemple les suivantes: s a) cellules hôtes procaryotes: souches d'Escherichia co/i (souche DH5-x), de Baci//us subti/is, de Sa/mone//a typhimurIum, ou encore des souches d'espèces telles que Pseudomonas, Streptomyces et Staphy/ococus; b) cellules hôtes eucaryotes: cellules HeLa (ATCC N CCL2), cellules Cv 1 (ATCC N CCL70), cellules COS (ATCC N CRL 1650), cellules Sf-9 (ATCC N CRL 1711), cellules CHO (ATCC N CCL-61) ou
encore cellules 3T3 (ATCC N CRL-6361).
s On peut aussi utiliser selon l'invention des ce'llules hypophysaires, des cellules du système nerveux central, telles que les cellules neuronales
ou encore des cellules pré-adipocytaires.
L'invention a également pour obiet l'utilisation d'une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus pour la fabrication d'un o médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie,
préférentiellement d'une lipodystrophie généralisée congénitale (CGL).
L'invention concerne aussi l'utilisation d'une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus pour la fabrication d'un
médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un diabète.
L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, préférentiellement d'une lipodystrophie généralisoe congénitale (CGL) comprenant une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles. Elle a également trait à une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'un diabète comprenant une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus, en association avec un ou
plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
POLYPEPTIDES SELON L'INVENTION
L'invention a encore pour objet le polypeptide CGL1 de séquence
*SEQ ID N 1.
Elle est également relative à un fragment du polypeptide CGL1 tel
que décrit précédemment dans la description.
Elle concerne aussi un variant du polypeptide CGL1 tel que décrit
précédemment dans la présente description.
s Les variants préférés du polypeptide CGL1 selon l'invention sont les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N 2 à SEQ ID N 10. L'invention a également pour objet un polypeptide possadant au moins 90%, avantageusement au moins 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, o 97%, 98%, 99% ou au moins 99,5% d'identité en acides aminés avec le polypeptide CGL1 ou encore avec un fragment ou un variant du
polypeptide CGL1.
Les fragments préférés du polypeptide CGL1 sont les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N 11 à SEQ ID s N 13. L'invention a également trait à l'utilisation du polypeptide CGL1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une iipodystrophie, préférentiellement d'une lipodystrophie
généralisée congénitale (CGL).
o Elle est également relative à l'utilisation du polypeptide CGL1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement
d'un diabète.
L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique destince à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, préférentiellement d'une lipodystrophie généralisée congénitale (CGL), comprenant un polypeptide CGL1 en association avec un ou plusieurs
excipients physiologiquement compatibles.
L'invention a également trait à une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'un diabète comprenant un o polypeptide CGL1 en association avec un ou plusieurs excipients
physiologiquement compatibles.
De manière générale, les polypeptides selon la présente invention
se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
De manière générale, les acides nuclélques selon la présente
invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Les compositions pharmaceutiques ci-dessus comprennent une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide CGL1, en particulier du
polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1.
De telles compositions pharmaceutiques sont avantageusement adaptéss pour l'administration, par exemple par voie parentérale, d'une o quantité de polypeptide CGL1 allant de 1,ug/kgljour à 10mg/kg/jour, de préférence au moins 0,01 mg/kg/jour et de manière tout à fait préférée
entre 0,01 et 1 mg/kg/jour.
L'invention est également relative à un procédé pour la production d'un polypeptide CGL1 ou d'un fragment du polypeptide CGL1 ou encore s d'un variant de ce dernier, ladite méthode comprenant les étapes de: a) insérer un acide nuclélque codant pour ledit polypeptide dans un vecteur approprié; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur recombinant de I'étape a); c) récupérer le milieu de culture conditionné ou Iyser la cellule hôte, par exemple par sonication ou par choc osmotique; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des Iysats cellulaires obtenus à l'étape c) ledit polypeptide;
e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Les peptides selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ce polypeptide ou contre un fragment ou un
variant de ce dernier ont été préalablement immobilisés.
so Selon un autre aspect, un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes con nues de l' homme de
l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (1989).
Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou phase solide. A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique ou en solution homogène décrite par Houben Weyl (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite
par Merrifield (1 965a; 1 965b).
o Font également partie de l'invention des polypeptides dits " homologues " à l'un quelconque des polypeptides de séquences d'acides
aminés SEQ ID NO 1 à 13, ou de leurs fragments ou variants.
De tels poiypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un
s acide aminé équivalent, par rapport aux polypeptides de référence.
On entendra par acide aminé équivalent selon la présente invention, par exemple remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide pyro-glutamique selon des techniques bien connues de o l' hom me d u métier. A titre il l ustratif, la synthèse de peptide contenant au
moins un résidu sous la forme D est décrite par Koch (1977).
Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acide, basique, non polaire ou
s encore polaire non chargé.
Font également partis de l'invention des polypeptides comprenant au moins une liaison non peptidique telle qu'une liaison rétro-inverso (NHCO), une liaison carba (CH2CH2) ou encore une liaison cétométhylène (Co-CH2) so De préférence, les polypeptid es selon l' invention co m pre n ant u ne ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conserveront leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre
les polypeptides non modifiés.
ANTICORPS DIRIGES CONJRE LE POLYPEPTIDE CGL1 DE
SEQUENCE SEQ /D N 1
Les fragments du polypeptide CGL1, en particulier les polypeptides de séquences SEQ ID N 11 à SEQ ID N 13, ainsi que les variants du polypeptide CGL1, plus particulièrement les polypeptides de o séquences en acides aminés SEQ ID N 2 à SEQ ID N 10, ainsi que les peptides homologues peuvent être utilisés pour la préparation d'anticorps, notamment en vue de détecter la production de forme normale ou au
contraire de forme mutée du polypeptide CGL1 chez un patient.
Pour détecter la présence du polypeptide CGL1 normale, des anticorps préférés sont selon l'invention sont les anticorps dirigés contre les
polypeptides de séquences SEQ ID N 11 à SEQ ID N 13.
Pour détecter la présence d'un polypeptide CGL1 muté, les anticorps préférés sont les anticorps dirigés contre les polypeptides de
séquences SEQ ID N 2 à SEQ ID N 10.
De manière tout à fait préférée, les anticorps destinés à détecter la présence d'un polypoptide CGL1 muté sont des anticorps dirigés contre les régions mutées du polypeptide CGL1, telles que décrites en détail
précédemment dans la description, et plus spécifiquement les régions C
terminales des peptides CGL1 mutés qui ne sont pas retrouvoes dans le
polypeptide CGL1 normal.
Selon un autre aspect, les anticorps selon l'invention sont utilisés pour: - localisation tissulaire et cellulaire de la protéine CGL1 (comparaison entre cellules d'un contrôle (protéine normale) et des patients so (protéine mutée); - déterminer le rôle physiologique de la protéine, ses mécanismes
d'activation ou d'inactivation et ses partenaires naturels.
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F (ab)'2, Fab) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide
ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir
d'hybridomes selon la technique décrite par Kohier et Milstein (1975).
o La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tels que produits dans la technique du trioma ou encore la
technique d'hybridome décrite par Kozbor et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chane Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N 4,946,778 ou
encore par Martineau et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages Ridder et al., (1995) ou encore des anticorps humanisés Reinmann et al. (1997); Leger
et al., (1997).
Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence
eVou de la quantité d'antigènes présents dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non-isotopique, par exemple fluorescent ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des
techniques bien connues de l'homme du métier.
L'invention a également pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide CGL1 normal ou muté dans un échantillon, ledit so procédé comprenant les étapes suivantes: a) à mettre en contact un anticorps tel que défini ci-dessus avec l'échantillon à tester; b) détecter les complexes polypeptides-anticorps éventuellement formés. s L'invention est également relative à un nécessaire ou kit pour la détection d'un polypeptide CGL1 normal ou muté dans un échantillon, ledit nécessaire ou kit comprenant: a) un anticorps tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, les réactifs nocessaires à la détection des
o complexes polypeptides-anticorps éventuellement formés.
COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES ET METHODES DE
TRAITEMENT THERAPEUTIQUE.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1, d'un vecteur recombinant contenant un tel acide nucléique ou d'une cellule hôte recombinante telle que définie cidessus pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie ou d'un diabète, ainsi qu'à des compositions o pharmaceutiques contenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, un vecteur recombinant contenant un tel acide nucléique ou encore une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus, en association
avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
L'invention a aussi trait à l'utilisation du polypeptide CGL1 ou d'un fragment du polypeptide CGL1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie ou d'un diabète ainsi qu'à des compositions pharmaceutiques comprenant un polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide CGL1, en association avec un ou plusieurs
excipients physiologiquement compatibles.
Les utilisations et compositions pharmaceutiques ci-dessus sont
décrites en détail précédemment dans la présente description.
Selon un autre aspect, I'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique préventive ou curative de maladies s associées à la lipodystrophie, préférentiellement à la lipodystrophie généralisée congénitale (CGL), une telle méthode comprenant une étape au cours de laquelle est administré à un patient un acide nucléique capable de modifier l'expression du polypeptide CGL1 chez led it patient, ladit acide nucléique étant, le cas échéant, associé à un ou plusieurs véhicules eVou
o excipients physiologiquement compatibles.
De préférence, on administrera au patient une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique, tel que défini dans la
présente description.
Selon encore un autre aspect, I'invention a également pour objet s une méthode de traitement thérapeutique préventive ou curative de maladies associées à la lipodystrophie, préférentiellement à la lipodystrophie généralisée ou congénitale (CGL), ou à un diabète, une telle méth ode comprenant u n e étape a u cours de laq uel le est ad m in istrce à u n patient une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide CGL1 chez ladit patient, ledit polypeptide étant, le cas échéant, associé à un ou
plusieurs véhicules etiou excipients physiologiquement compatibles.
METHODES DE CRIBLAGE DE COMPOSES CANDIDATS D'INTERET
THERAPEUTIQUE
La démonstration selon l'invention du fait que le gène c911 est un gène causal de la CGL rend possible la mise au point de méthodes de criblage de composés candidats d'intérêt thérapeutique pour prévenir ou
traiter une lipodystrophie en particulier la CGL ou un diabète.
Procédé de crb/age d3un composé candidaf interagissanf avec le polypeptide CGL1 En tant que polypeptide impliqué dans le développement de lipodystrophie, en particulier de lipodystrophie généralisée congénitale (CGL) ou d'un diabète, le polypeptide CGL1 constitue un polypeptide cible de composés d'intérêt thérapeutique préventif ou curatif de pathologies
associées au CGL.
De tels composés candidats d'intérêt thérapeutique se comportent to donc comme des " ligands " du polypeptide CGL1. Au sens de l'invention, un K ligand '> signifie une molécule, telle qu'une protéine, un peptide, un anticorps ou tout composé chimique synthétique capable de se fixer sur le
polypeptide CGL1 ou l'un de ses fragments.
Dans un procédé de criblage de composés candidats conformes à s l'invention, un échantillon biologique ou une molécule structuralement définie à tester est mise en contact avec le polypeptide CGL1 purifié, par exemple le polypeptide CGL1 recombinant purifié produit par une cellule
hôte recombinante telle que définie dans la présente description, afin de
former un complexe entre le polypeptide CGL1 ou un fragment de celui-ci
et le ligand putatif que constitue le composé candidat à tester.
A titre illustratif, afin d'étudier l'interaction entre le polypeptide CGL1 ou un fragment de ce dernier avec des composés candidats, telles que des molécules obtenues grâce à des procédés de chimie combinatoire, on utilisera des techniques de microdialyse couplées à l'HPLC décrites par WANG et al. (1997) ou la technique d'électrophorèse capillaire décrite par
BUSH et al. (1997).
Dans d'autres méthodes, des composés candidats, qui peuvent être des peptides, des acides gras, des lipoprotéines ou des petites molécules qui interagissent avec le polypeptide CGL1, ou un fragment de o ce polypeptide, peuvent être identifises en mettant en oeuvre des tests dans lesquels le composé candidat à tester est marqué à l'aide d'un marqueur détectable, tel qu'un marqueur fluorescent, radioactif ou enzymatique, puis mis en contact avec le polypeptide CGL1 immobilisé, ou un fragment de ce dernier, dans des conditions permettant la fixation spécifique du composé candidat sur le polypeptide CGL1. Après élimination des molécules liées de manière non spécifique, les molécules fixées sont
détectées à l'aide de moyens de détection appropriés.
Des composés candidats interagissant avec le polypoptide CGL1 ou un fragment de ce dernier peuvent aussi être criblés en utilisant des o techniques mettant en oeuvre un biocapteur optique tel que celles décrites
par Edwards et Leatherbarrow (1997) ou encore par SZABO et al. (1995).
On peut aussi utiliser des systèmes de criblage de type double hybride tels que ceux décrits par FIELDS & SONG (1989) ou encore dans
les brevets US N 5,667,973 et US N 5,283,173 (FIELDS et al.).
Des procédés de criblage par des techniques de double hybride peuvent être également réalisés à l'aide des techniques décrites par HARPER et al. (1993) ou encore par CHO et al. (1998) ou FROMONT
RACINE et al. (1997).
L'invention a donc également pour objet un procédé de criblage o d'un composé candidat interagissant avec ie polypeptide CGL1 ou avec un fragment du polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mettre en contact le composé candidat avec le polypeptide CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1, d'une part, et le
composé candidat, d'autre part.
L'invention a également trait à un nécessaire ou kit pour le criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1 ou so avec un fragment du polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend: a) un polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide CGL1; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes éventuellement formés entre le polypeptide CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1, d'une part, et le composé candidat, d'autre part. Procédé de crib/age d'un composé candidat modulant l'expresson du
gène cgl1.
Un autre objet de l'invention consiste en un procédé pour le to criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgl1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) cultiver une cellule hôte exprimant, de manière naturelle ou après recombinaison génétique, le gène cgl1; b) mettre en contact la cellule hôte cultivée à l'étape a) avec un composé candidat à tester: c) déterminer la capacité du composé candidat à moduler
l'expression du gène cgl1 par la cellule hôte.
De manière préférée, I'étape c) consiste en une étape de
quantification de l'expression du gène cgl1 par la cellule hôte.
o La quantiflcation de l'expression du gène cgl1 peut étre réalisoe indifféremment par quantification de l'ARN messager cgl1 produit ou par
quantification du polypoptide de CGL1 produit.
Dans ce dernier cas, on peut utiliser des anticorps tels que définis
précédemment dans la description afin de quantifier les quantités de
polypeptides CGL1 qui ont été produites, par exemple à l'aide d'un test
immunoenzymatique ou par immunoradioactivité.
Dans un mode de réalisation préféré, la quantiflcation de l'ARNm produit et réalisée par amplification PCR quantitative de l'ADNc obtenu après transcription inverse de l'ARNm total de la cellule hôte cultivée, en
so utilisant une paire d'amorces spécifiques du gène cgl1.
La présente invention concerne aussi un procédé pour cribler des com posés cand id ats capables d ' aug menter, ou au co ntraire de d im in uer, le niveau d'expression du gène cgl1. Un tel procédé permet à l'homme du métier de sélectionner des composés exerçant un effet réqulateur sur le s niveau d'expression du gène cgl1, composé potentiellement utile comme principe actif d ans d es compositions p h arm aceutiques pou r traiter d es patients prédisposés ou atteints d'une lipodystrophie, préférentiellement
d'une lipodystrophie généralisée ou congénitale (CGL) ou d'un diabète.
L'analyse quantitative de l'expression du gène cgl1 peut être o réalisée en utilisant des matrices ou a puces à ADN " qui peuvent contenir une pluralité d'acides nucléiques dérivés du gène cgl1 ou de l'ADNc correspondant. Par exemple, I'analyse quantitative de l'expression du gène cgl1 peut être réalisée à l'aide d'une puces à ADN telle que celle décrite par
s SCHENA et al. (1995 et 1996).
L'invention a également pour objet un nécessaire ou kit pour le criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgl1, caractérisé en ce qu'il comprend: a) une cellule hôte exprimant, de manière naturelle ou après o recombinaison génétique, le gène cgl1; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détermination de la capacité du composé candidat à moduler l'expression du gène cgl1
candidat à moduler l'expression du gène cgl1 par la cellule hôte.
Dans un mode de réalisation préféré du nocessaire ou kit ci s dessus, celui-ci est caractérisé en ce que les moyens nécessaires à la détermination de la capacité du composé candidat à moduler l'expression du gène cgl1 par la cellule hôte sont une ou des sondes spécifiques du gène cgl1, plus spécifiquement les sondes telles que définies
précédemment dans la description.
Procédé de criblaqe in vivo Selon un autre aspect de l'invention, des composés candidats modulant l'expression d'un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 s selon l'invention peuvent être identifiés in vivo, dans des animaux
transgéniques non humains.
De manière tout à fait préférée, un composé candidat d'intérêt selon l'invention consiste en un composé qui augmente le niveau
d'expression d'un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1.
oPar " animal transgénique " au sens de l'invention, on entend un animal non humain, de préférence un mummifère, dans lequel une ou plusieurs cellules contiennent un acide nuclélque hétérologue introduit -grâce à l'intervention humaine, tel que par des techniques de transgénèse bien connues de l'homme du métier. L'acide nucléique hétérologue est s introduit directement ou indirectement dans la cellule ou le précurseur de la cellule, par manipulation génétique telle que micro-injection ou infection par un virus recombinant. L'acide nuclélque hétérologue peut être intégré dans le chromosome, ou peut se présenter sous la forme d'ADN se répliquant de
manière extra-chromosomique.
oUn animal transgénique selon l'invention comprend, sous une forme artificiellement insérée dans son génome, un acide nuclélque codant
un polypeptide CGL1 tel que défini précédemment dans la description.
Selon une telle méthode, un animal transgénique non humain, par exemple une souris, est traité avec une molécule ou une substance candidate à tester, par exemple une substance ou molécule candidate auparavant sélectionnée par un procédé de criblage in vitro tel que défini ci-dessus. Après une durée déterminée, le niveau d'expression de l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 est déterminé et comparé à so l'expression de cet acide nuclélque chez un animal transgénique non humain identique, par exemple une souris transgénique identique, qui n'a
pas reçu la molécule ou la substance candidate.
Le niveau d 'exp ression de l 'acide n ucléiq ue cod ant le polypeptide CGL1 peut être déterminé par quantification de l'ARN messager correspondant produit par de cellules prélevées chez l'animal ou encore par détection et quantification du polypeptide CGL1 produit dans ces cellules, selon des techniques connues de l'homme du métier ou décrites
précédemment dans la description.
La mesure des niveaux d'ARN messager correspondant à l'acide o nuclélque codant le polypeptide CGL1 par hybridation de type Northern, ou
encore par hybridation in stu.
La mesure des niveaux d'expression du polypeptide CGL1 peut
être réalisé par immunohistochimie.
Pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule candidate modulant l'expression d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, on préférera des mammifères non humains tels que des souris, des rats ou des cobayes ou des lapins qui ont leur génome modifié par l'insertion d'une construction polynucléotidique
comprenant un acide nuclélque selon l'invention.
o Les animaux transgéniques selon l'invention comprennent le transgène, c'est-à-dire la construction polynucléotidique précitée, dans une
pluralité de leurs cellules somatiques eVou germinales.
La construction d'animaux transgéniques selon l'invention peut être réalisée selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra en particuiier se référer à la production d'animaux transgéniques, et particulièrement à la production de souris transgéniques, telles que décrites dans les brevets US N 4,873, 191 (délivré le 10 Octobre 1989), US N 5,464,764 (délivré le 7 Novembre 1995) et US ,789,215 (délivré le 4 Août 199/8) le contenu de ces documents étant ici
o incorporé par référence.
s9 En bref, une construction polynucléotidique comprenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 est insérée dans une lignée de cellules souches de type ES. L'insertion de la construction polynucléotidique est réalisée de préférence par électroporation, telleque décrite par Thomas et al. (1987, Cell, Vol.51:503-512). Les cellules ayant subi l'étape d'électroporation sont ensuite criblées pour la présence de la construction polynucléotidique (par exemple par sélection à l'aide de marqueurs, ou encore par PCR ou par analyse sur gel d'électrophorèse d'ADN Southern blot) afin de sélectionner les cellules o positives ayant intégré la construction polynucléotIdique exogène dans leur génome, le cas échéant à la suite d'un événement de recombinaison homologue. Une telle technique est par exemple décrite par MANSOUR et
al. (1988, Nature, Vol.336: 348-352).
Ensuite, les cellules sélectionnées positivement sont isolées, s clonées et injectées dans des blastocystes de souris de 3,5 jours, comme cela est décrit par BRADLEY (1987, Production and Analysis of Chimaeric mice. In: E. J. ROBERTSON (Ed., teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. IRL press, Oxord, page 113). Des blastocystes sont ens uite introd u its dans u n an imal hôte femelle pseudo-gestante et le
développement de l'embryon est poursuivi jusqu'au terme.
Selon une alternative, des cellules de type ES sélectionnées positivement sont mises en contact avec des embryons de 2,5 jours à un stade 8-16 cellules (morulae) comme décrit par WOOD et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90: 4582-4585) ou par NAGY et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90: 8424-8428), les cellules ES étant internalisées afin de coloniser extensivement le blastocyste, y compris les
cellules donnant naissance à la lignée germinale.
Les descendants sont ensuite testés afin de déterminer ceux qui ont intogré la construction polynucléctidique (le transgène). Par croisement so entre eux des animaux transgéniques de la première génération, des animaux transgéniques homozygotes pour l'intégration du transgène sont
obtenus d'une manière connue de l'homme du métier.
Préférentiellement, les animaux transgéniques selon l'invention
sont homozygotes pour le transpène.
L'invention a donc également pour objet un animal transgénique non humain dont les cellules somatiques eVou germinales ont été
transformées par un acide nucléique codant le polypeptide CGL1.
Selon un autre aspect, I'invention concerne aussi un animal transgénique non humain dont les cellules somatiques eVou germinales ont o été transformées par un acide nucléique codant un fragment ou un variant d'un polypeptide CGL1, par exemple l'un des polypeptides CGL1 mutés
décrits précédemment dans la description. De tesl animaux transgéniques
sont utiles notamment pour vérifier la sélectivité des composés candidats
actifs sur le polypeptide CGL1 non muté.
Selon un mode de réalisation particulier, I'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 comprend un polynucléotide réqulateur de la transcription eVou de la traduction sous le contrôle duquel la région codante contenant le cadre ouvert de lecture est placce, ledit polynucléotide réqulateur étant fonctionnel chez l'animal transgénique considéré. Selon un mode de réalisation particulier, le polynucléotide réqulateur ci-dessus contient des séquences dites activatrices " enhancers " permettant une expression à haut niveau du polypeptide CGL1 dans les cellules de l'animal transgénique L'invention a également trait à des cellules hôtes recombinantes
obtenues à partir d'un animal transgénique tel que décrit ci-dessus.
Des lignées de cellules recombinantes provenant d'un animal transgénique selon l'invention peuvent être établies en culture à long terme à partir de n'importe quel tissu d'un tel animal transgénique, par exemple so par transfection des cultures de cellules primaires avec des vecteurs exprimant des oncogènes tels que le grand antigène T de SV40, tel que décrit par exemple par CHOU (1989, Mol. Endocrinol. Vol.3: 1511-1514) et
SCHAY et al. (1991, Biochem. Biophys. Acta, vol. 1072: 1-7).
L'invention est également relative à un procédé pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'expression d'un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 muté ou non muté selon l'invention, comportant les étapes consistant à: a) administrer la substance ou la molécule candidate à un animal transgénique tel que défini ci-dessus; b) détecter le niveau d'expression de l'acide nucléique codant le o polypeptide CGL1 muté ou non muté; c) comparer les résultats obtenus au b) avec les résultats obtenus chez un animal transgénique n'ayant pas reçu la substance ou la molécule candidate. Dans tous les cas, les animaux utilisés lors de la mise en _uvre du procédé ci-dessus sont sacrifiés à la fin de ce procédé, par exemple lors d'une étape d) du procédé. En effet, le procédé ci-dessus est un procédé de criblage de composés candidats, dont un faible nombre d'entre eux sont susceptibles d'exercer une activité mesurable dans la modulation de o l'expression de l'acide nuclélque codant le polypeptide CGL1. Ledit procédé ne vise aucunement au traitement thérapeutique des animaux mis en _uvre et ne peut donc en aucun cas être assimilé à un procédé de traitement thérapeutique ou chirurgical appliqué au corps humain ou animal. L'invention se rapporte aussi à un kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant l'expression d'un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 muté ou non muté, comprenant: a) un animal transgénique tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, les moyens de détection du niveau d'expression
de l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 muté ou non muté.
La présente invention est en outre illustrée sans pour autant être s limitée, par les exemples suivants:
EXEMPLES
A. Matériels et méthodes des exemples
o A.1 Patients.
31 familles atteintes de GL et 27 patients additionnels (patients isolés ou appartenant à des petites familles), représentant un total de 83 patients atteints de GL ont été étudiés. Tous les patients présentaient une forme généralisée de lipoatrophie et une hypertrophie musculaire. La plupart d'entre eux présentaient des ?? acromegalodes, un acanthosis nigncans, une hapatomégalie, un hirsutisme, une résistance à l'insuline avec parfois un diabète et une hypertriglycéridémie. Les caractéristiques biologiques et cliniques de certains des patients avaient été précédemment o documentées (SEIP et al., 1996; VAN DER VORM et al. (1993); KROOK et al.K, 1994; VIGOUROUX et al., 1997; SEIP, 1959, HUSEMAN, 1978; PANZ, 1997; et VAN MALDERJEM et al., 1996). Tous les patients ainsi que leurs familles ont donné leur consentement informé et éclairé en vue
des études génétiques, qui ont été approuvées par un Comité Institutionnel.
A.2.Génotypage L'ADN génomique a été obtenu à partir de cellules blanches du sang périphérique à l'aide de protocoles standards (SAMBROOK et al., 1989). Le génotypage de marqueurs a été réalisé en utilisant le pannel de marqueurs microsatellites LMS II- MD2 (PERKIN Biosystems) et un
63 2824332
séquenceur d'ADN de type ABI 377 équipé du logiciel GENESCAN 3.0 ET GENOTYPER (version 2.1, commercialisé par la Société APPLIED BISYSTEMS). Pour la cartographie fine, de nouveaux marqueurs répétés de type CA ont été identifiés dans les séquences génomiques prédites pour
s être localisés dans le locus étudié et testés pour leur polymorphisme.
L'ordre probable de ces marqueurs sur le chromosome a ensuite été déterm iné en utilisant le pan nel d'hybrides d' irrad iation désig né Stanford
GB3 (STEWART, 1997).
o A.3 ANALYSE GENETIQUE L'analyse d'association paramétrique a été réalisée à l'aide d'algorithmes décrits précédemment (SOBEL et al., 1996) qui ont été implémentés dans le programme SiMWALK 2. La fréquence allélique de la s maladie a été fixée à 0,001 et on a postulé un mode de transmission purement récessif avec un taux de pénétrance de 0,99 pour le génotype de la maladie. Les configurations d'haplotypes les plus probables ont également été déterminées avec le programme SIMWALK2. Des fréquences d'allèles marqueurs ont été estimées à partir des données observées pour des familles utilisées dans le criblage du génome. Pour l'analyse des familles additionnelles, les fréquences alléliques des marqueurs ont été à nouveau estimées à partir des donnses de ces familles. Un nouveau calcul du lod score avec d'autres estimations de
fréquences alléliques des marqueurs n'ont pas modifié les conclusions.
A.4 CRIBLAGE DE MUTATIONS
On a construit des amorces spécifiques pour amplifier les exons et les jonctions d'épissage en utilisant les donnéss contenues dans le site
o WEB du MIT (http//ww-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3-ww.cOi.).
64 2824332
Les exons CGL ont été criblés pour des mutations après amplification de sept fragments (exon 1, exon 2, exon3, exon 4, exons 5-6, exons 7-8 et exons 9-11). La séquence de ces amorces introniques peut être obtenue sur demande. Chez des patients pour lesquels seules de très faibles quantités d'ADN étaient accessibles (extraites à partir de tissus hypophysaires anciens et de sérums), deux amplifications ont été réalisées en une passe. Les produits PCR ont été purifiés sur une colonne de type SEPHADEX et séquencés en utilisant la technique " BIG DYE
TERMINATOR " ABI.
o Les comparaisons de séquence ont été réalisées en utilisant le
logiciel PHRED PHRAP CONSED décrit par EWING et al. (1998).
A.5 Analyse de gel d'électrophorèse d'ARNm.
On a utilisé des gels d'ARNm de divers tissus humains ainsi que l'ARN total de cerveaux, de coeur et de foie humain, (CLONTECH). De plus, on a isolé l'ARN total à partir des tissus adipeux abdominaux sous cutanés et viscéraux provenant de la peau et du colon après opération
chirurgicale, en utilisant le kit QUIAGEN. A Neosy maxi kit.
L'ARN total (20,ug) a été séparé sur un gel à 1% d'agarose, 2,2 M formaldahydel MOBS et transféré sur une membrane de nylon de type HybondN (Amersham). Les membranes ont été hybridées avec une sonde d'environ 1700 bp couvrant les exons 1 à 11 du gène c911 incluant le codon AUG de départ et le codon STOP. Cette sonde a été obtenue par amplification de l'ADNc total de cerveau à l'aide du kit avantage 2 (CLONTECH) et le couple d'amorces (exon 1 F: 5'-CCCC TGCAGTGGAGTCTGTA-3' SEQ ID N 17; exon 11 R: 5'
AGTCAGGTGGGAAAGTGCTG-3' (SEQ ID N 18).
Les conditions d'amplification PCR ont été les suivantes: 95 C so pendant une minute, suivie de 30 cycles composés de 95 C pendant 30 secondes, 65 C pendant 45 secondes et 72 C pendant 2 minutes, et une étape finale d'extension à 72 C pendant 10 minutes. L'identité de la sonde a été confirmée après une nouvelle amplification avec 5 paires d'amorces internes, puis séquençage partiel. La quantification des signaux a été s réalisoe en utilisant l'appareil phosphore Imager (Storm 860, Amersham
Pharmacia Biotech) à l'aide du logiciel Image Quant, Version 5.0.
A.6 Analvse de séquences o Les séquences génomiques comprises dans l'intervalle chromosomique d'intérêt ont été recherchées dans les sites " http//www.ncbi.nim.govigenomelcentral " et " httWhgrep.ims.u tokyo.ac. jp/". Pour les recherches d'homologie, on a utilisé le logiciel BLAST disponible sur le site " httt//www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST ". Les s alignements multiples ont été réalisés en utilisant le logiciel CLUSTAL disponible sur le site "http//www.infoblogen.fr/services/analyseq/cgi bin/clustalw-out.pl ". La protéine CGL1 a été analysoe en utilisant les programmes d'ordinateurs suivants: Expasy PROTEOMIC TOOLS, qui contient les logIciels profiles Scan ainsi que le logiciel PROSITE, disponible sur le site " http//www.expasy.ch " pour la recherche d'hélices transmembranaires de motifs consensus. On a utIiisé le logIciel BLOCKS pour la recherche de domaine de consensus, disponible sur le site
" http//bloinformatics.weismeinn.ac.il/blocks/ ".
EXEMPLE 1:
Identification du çène causal du CGL 1.1 Cartoqraphie du déterminant qénétique de la maladie au locus
chromosomique 11q13.
Un ensemble de familles libanaises et norvégiennes a été choisi pour les études initiales en vue de localiser le gène responsable de la CGL (figure 1A). Dans les cinq familles libanaises, l'ADN était accessible pour dix huit parents affectés et 66 parents non affectés. Toutes les familles étaient consanguines et trois d'entre elles (CGL-01, CGL-02 et CGL-03) étaient originaires du même village, ce qui était indicatif d'un groupe géographique. Parmi les quatre familles du Sud Ouest de la Norvège (SEIP, 1996; SEIP, 1959), I'ADN était accessible à partir de trois parents
affectés et vingt six parents non affectés (GEDDE-DAHL et al. (1996)).
Deux des familles avaient une co-sanguinité détectée et parmi deux des familles non consanguines, I'une d'entre elle possébait une descendance
o affectée dans deux de ses branches (GEDDE-DAHL, 1996).
Une analyse de liaison et d'homozygotie couvrant l'ensemble du génome a été entreprise en utilisant le pannel LMS Il-MD2 avec des microsatellites espacés en moyenne d'environ 10 cM. Aucune preuve de liaison n'a été trouvée sur le locus 9q34 (CGL1)' région précédemment documentée (GARG et al., 1 999), dans laquelle on a ajouté les marqueurs de criblage génomique (D9S164 et D9S1836) avec les marqueurs D9S1818 ET D9S1826 qui bornent l'intervalle. Le lod score multilocus maximal dans cet intervalle a été d'environ -22,5 dans les familles
libanaises et de -0,13 dans les familles norvégiennes.
o L'inspection des données de génotype pour le génome entier a révélé deux marqueurs adjacents, les marqueurs D11S4191 et D11S987 sur le chromosome 11q13 qui étaient homozypotes dans beaucoup de patients. Une analyse avec deux marqueurs additionnels, D11S1765 et D11 S1883, à l'intérieur de cet intervalle, ont confirmé ces observations et a s révélé la présence d'allèles identiques dans l'ensemble des dix huits patients du Liban au marqueur D11S1883. La preuve d'une liaison était hautement significative, avec un lod score multilocus maximal de 13,2 (figure 1B) pour lequel la majorité des preuves provenait des familles libanaises (lod score 11,3) alors que le lod score à partir de l'ensemble des so familles norvégiennes était de 2,1. Aucune autre région chromosomique n'a donné de valeur de lod score significative. A partir de ces résultats, un nouveau locus a été identifié, désigné CGL2 (désigné CGL), à l'intérieur de l'intervalle d'environ 8cM (DIB et al., 1996 borné par les marqueurs
D11 S4191 et D11 S987 sur le chromosome 11 q13.
1.2 Cartographie fine des familles libanaises et norvéçiennes Les inventeurs ont caractérisés vingt cinq marqueurs microsatellites additionnels à proximité du locus CGL chez les familles,
s incluant douze marqueurs localisés dans l'intervalie critique D11S4191-
D11S987. Dans les familles libanaises, tous les individus affectés étaient homozygotes pour le même allèle pour neuf marqueurs contigus à l'intérieur de l'intervalle D11S4076-PIGM, avec certains individus affectés qui étaient hétérozygotes pour les marqueurs d'extrémité ainsi qu'un autre o marqueur en dehors de l'intervalle (figure 2). La présence d'un allèle porteur commun dans les cinq familles libanaises a révélé un effet " fondateur " dans la population libanaise, du fait que les familles CGL-04 et CGL-05 n'étaient pas connues pour être lises aux autres familles. Pour la population norvégienne, on a noté une homozygotie pour les patients des familles CGL-06, CGL-07 et potentiellement CGL-08 par déduction à
partir des parents.
Ils portaient le même allèle pour les marqueurs consécutifs D11S1765-D11 S40766CA10-CA9, confirmant l'effet " fondateur " dans ces familles regroupées dans la région Sud-Ouest de la Norvège o ils ne o pouvaient pas avoir d'ancètre commun antérieur à 400 ans (GEDDE & DAHL et al. 1996). L'individu affecté de la quatrième famille (patient # 26, CGL-09) était hétérozygote pour les marqueurs dans cet intervalle mais
avec un haplotype similaire aux autres familles norvégiennes du Sud-
Ouest. En dépit de la consanguinité (coefficient de consanguinité 0,00195) , ii était dès lors possible qu'un second allèle lié à la maladie ait été introduit, ou que des évènements de recombinaison conduisant à un petit intervalle d'homozygotie soient restés indétectés à ce niveau de résolution des marqueurs. Aucun des enfants non affectés des familles libanaises et so norvégiennes n'était hompozygote dans ces intervalles d'homozygotie (figure 1). Puisque la région commune d'homozygotie des deux populations se recouvrait au marqueur adjacent CA10 et CA9 borné par les marqueurs D11S4076 et D11S480 (figure 3), il a été inféré que le locus CGL2 résidait
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dans l'intervalle D11 S4076-D11 S480 qui couvre approximativement 2,5 MB comme déterminé à l'aide des donnces de cartographies physiques et d'hybrides d'irradiation. Des haplotypes associés à la maladie chez les familles libanaises et norvégiennes portaient des allèles différents aux deux marqueurs microsatellites CA10 et CA9, suggérant que des mutations différentes pourraient être présentes dans les deux groupes géographiques. 1.3 FAMILLES D'ORIGINES ETHNIQUES VARIEES LIEES au locus 11q13. Des patients et des parents dans vingt-deux familles additionnelles d'origine ethnique variée ont été testés avec six marqueurs couvrant un intervalle d'environ 10 cM (DIB et al. 1996; STEWART et al., 1997) au locus 11q13 (D11S986, D11S4191, D11S1765, CA10, D11 S1883, PYGM). L'homozygotie et le partage d'haplotype chez les descendants affectés et non affectés a suggéré une co-ségrégation avec la maladie dans onze familles parmi lesquelles six étaient d'origine portugaise (figure 3). Tous les patients de ces familles ont été diagnostiqués comme étant atteints de CGL. Dans les onze familles restantes, la maladie ne ségrégeait pas avec le locus 11q13, pour une ou plusieurs des raisons suivantes: 1. Ies parents consanguins ne partageaient pas des allèles communs pour les marqueurs dans la région cible; 2. Ies patients nés de parents consanguins ont été retrouvés hétérozygotes; 3. un enfant affecté avait le même haplotype que la descendance normale; ou 4. Ies descendants affectés de la même famille avaient hérités
so d'haplotypes différents.
1.4.1dentiflcation d'une délétion dans le uène humain homoloque du
gène murin Gnq31.
s En criblant les bases de données dans l'intervalle D11S4076 D11 S480, vingt-six gènes potentiels ont été identifiés, à partir de séquences d'ADNg, d'ADNc ou d'EST. La structure génomique de ces 26 gènes a été déterminée par recherche de similarité avec les séquences génomiques humaines et des amorces spécifiques ont été dessinées afin
o d'analyser la région codante et les jonctions introniques flanquantes.
L'analyse de séquence de ces vingt-six gènes n'a pas révélée d'altération moléculaire significative dans un ensemble de sept individus incluant quatre patients des familles liées à 11q13. Au cours de ces études, des patients aumeaux monozygotes) de l'une des familles dans lesquelles la maladie était liée potentiellement au locus 11q13 (CGL-16) ont été trouvés comme étant homozygotes pour un allèle nul au marqueur microsatellite CA10(figure 3). D'autres gènes localisés à proximité et d'autres marqueurs, y compris le marqueur microsatellite CA9 qui réside à 100 kb du marqueur CA10, ont amplifiés correctement à partir de l'ADN de ces patients. En o conséquence, il était inféré que les patients étaient susceptibles de porter
une délétion dans un segment d'ADN contenant le marqueur CA10.
L'analyse de bases de données de séquences publiques a permis l'identification d'un ARNm inconnu (AF052149) correspondant à un nouveau gène humain, le gène cgl1, qui est contenu dans la séquence du
BAC AP001458 à partir duquel le marqueur CA10 avait été isolé à l'origine.
cgl1 est homologue du gène murin Gng31g (pour " Gng3-linked gene, décrit par DOWNES et ai., 1998), qui réside dans une région conservée entre le
chromosome murin 19 et le chromosome humain 11q.
Les inventeurs ont déterminé que le gène humain, qui couvre au so moins 14 kb de séquences génomiques, contient 11 exons. Le cadre de
lectu re ouvert (O RF) commence dans l'exon 2 et l es jon ctio ns intro ns-
exons présentent une forte similarité avec les séquences consensus de site d'épissage 5' et 3'. L'amplification de ces exons chez les patients de la famille CGL-16 a révélé la présence d'une délétion incluant les exons 4, 5 et 6 du gène (del Ex4-6) (figure 4A). Basé sur l'étendue de la délétion et de la séquence accessible AP001458, le marqueur CA10 pourrait être localisé
soit dans l'intron 4, soit dans une petite région de l'intron3.
EXEMPLE 2: Criblane de mutations dans le nène cal1.
* Le gène cgl1 a été séquencé chez des patients de toutes les familles précédemment étudiées. De plus, on a analysé 27 patients y compris 16 patients isolés et 11 patients originaires de petites familles qui n'avaient pas été étudiés précédemment. Douze altérations moléculaires
s différentes ont été retrouvées parmi 41 patients provenant de 22 familles.
Ces altérations moléculaires incluent une délétion de 258 bp (del E5-6) six petites insertions eVou délétions inférieures à 10 bp, et cinq substitutions d'un seul nucléctide (figure 4b et tableau 2). Onze de ces mutations ont résulté dans un changement de cadre de lecture, I'introduction d'un codon STOP précoce ou pourrait affecter une séquence d'un site d'épissage, toutes ies mutations étant potentiellement des mutations nulles. Les patients, qui présentaient une forme précoce de lipoatrophie, ont été trouvés homozygotes pour une mutation spécifique, ou hétérozygote composite pour des mutations distinctes. Ces variants ont été retrouvés à I'état hétérozygote chez les parents et certains descendants non affectés, mais étaient absents des 96 témoins des famiiles du CEPH, indiquant que ces mutations étaient susceptibles de représenter des mutations associées
à la maladie selon un mode de transmission récessif.
Cinq mutations ont été trouvées dans plus d'un pedigree. Comme o cela était attendu du fait des données d'haplotypes, les dix neufs patients (un patient nouveau-né ajouté pour analyse de mutation). Des familles libanaises de la figure 1 ont été retrouvées comme étant homozygotes pour la même mutation, une délétion de 5bp dans l'exon 4, qui induit un changement du cadre de lecture ouvert après l'acide aminé 105 et introduit s un codon STOP précoce à la position 111 (F105 fsXW111). De manière similaire, les cinq patients (trois patients ajoutés pour l'analyse de mutation) des trois familles du Sud-Ouest de la Norvège (CGL- 06, CGL-07, CGL-08) étaient homozygotes pour une mutation faux-sens dans l'exon 6 provoquant une substitution du résidu alanine en position 212 par un résidu o proline (A212P). A nouveau, comme prévu dans l'analyse haplotypique le patient provenant de la quatrième famille norvégienne (patient # 26, CGL 09) hétérozypote composite avec la mutation A212P hérité de son père et une mutation différente induisant un changement de cadre de lecture (F63fsX75) provenant de sa mère. Il est intéressant de noter que la dernière mutation F63fsX75 a été également retrouvée dans les familles CGL-10 de l'Est de la Norvège, CGL-11 de l'ltalie et CGL-12 du Royaume Uni. Deux familles consanguines d'origine portugaise (CGL-17 et CGL-18) portaient la même mutation R138X. Egalement, deux familles d'origine portugaise vivants en Afrique du Sud (CGL-19 et CGL-20) présentaient une o mutation commune (F108fsX113). Lorsque la même mutation était présente dans des familles apparemment non apparentées, les haplotypes associés à la maladie portaient le même allèle au marqueur CA10,
suggérant l'apparition des mêmes événements mutationnels (figure 3).
Dans trois cas, les chromosomes associés à la maladie portaient des variants uniques au niveau ou à proximité du site d'épissage. Le variant présent dans la famille turque CGL-14 consiste en une transition à la première base de l'intron 4 qui appartient à une séquence consensus nucléotidique strictement conservée pour l'ARN (site donneur d'épissage, HODGES et al., 1994). Les autres variants affectent un nucléotide localisé après la séquence consensus de chaque site accepteur d'épissage (intron 4: troisième base avant l'exon 5; CGL-40) ou du site donneur d'épissage " (intron 6: Sème base; allèle paternel CGL-12). Ces deux nucléotides sont généralement conservés (environ 80%) aux jonctions des sites d'épissage, et des mutations dans ces nucléotides dans d'autres gènes ont été identifiés comme induisant l'excision d'un exon ou l'activation de sites
s cryptiques d'épissage (HODGES et al., 1994; BIENVENU et al., 19g4).
Aucun autre variant n'a été détecté dans les exons ou dans les régions introniques flanquantes chez ces individus. Ainsi, les altérations sont très probablement des mutations d'épissage provoquant une dislocation de la protéine. o Le séquençage systématique des onze exons du gène cgl1 n'a pas révélé de mutation chez les patients provenant de onze familles non liées au locus chromosomique 11q13, à l'exception du second individu affecté de la famille CGL-28. Ce patient porte une mutation hétérozygote faux-sens, qui est absente chez son frère et sa soeur qui sont atteints et qui s donc ne ségrège pas avec la maladie. Egalement, aucune mutation n'a été trouvée chez les vingt-cinq patients restants, qu'ils soient isolés ou issus de petites familles, qui sont affectés soit par la forme congénitale (14 patients)
ou par la forme retardée (11 patients) de la maladie.
Ces résultats indiquent qu'un gène distinct de CGL1 ou que o d'autres facteurs non génétiques sont responsables de la maladie chez ces patients. EXEMPLE 3: Profil d'expression de cul1 L'expression spécifique de tissu de CGL1 a été recherchée par hybridation d'ARNm (Northern Blots et Dot Blot) à l'aide d'une sonde couvrant les exons 1 à 11. L'analyse par " Northern Blot " a révélé deux espèces d'ARN d'environ 2,4 kb et d'environ 1,8 kb exprimées de manière variable dans tous les tissus, ainsi qu'un transcrit supplémentaire so intermédiaire d'environ 2 kb retrouvé comme transcrit unique dans le cerveau et en association avec les autres transcrits dans les testicules (figure 5). Les niveaux d'expression varient selon les tissus, ces niveaux étant forts dans le cerveau et les testicules, intermédiaires dans les tissus adipeux (viscéraux et sous- cutanés), le pancréas, le rein, le muscle squelettique, le foie, I'ovaire, la prostate et le coeur et faible dans les tissus restants. L'analyse par hybridation sur des gels " Dot Blot " réalisée avec de multiples tissus humains, les quantités ayant été ajustées au niveau d'expression de huit gènes ubiquitaires " House kesping genes ", a révélé que l'expression de CGL1 dans les tissus foetaux et les hauts niveaux o d'expression dans la plupart des régions du système nerveux central, en
particulier dans l'hypophyse.
EXEMPLE 4: Polvoeptide CGL1 s Le gène cgl1 code pour une protéine de 398 acides aminés ayant
une masse calculée de 43,8 kD qui a aussi été désignse " SEIPIN ".
La séquence d'acides aminés montre une forte identité avec la protéine codée par Gng31g de souris (87% d'identité) et une homologie partielleavec une protéine de drosophila melanogaster (40% d'identité
o entre les résidus 22 et 257).
L'analyse n'a pas révélée de similarité avec d'autres protéines connues Toutefois, les résultats suggèrent que la protéine CGL1 est une protéine membranaire possédant au moins deux domaines
transmembranaires (figure 6).
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Tableau 3:
Séquences d'acide nuclélque et d7acides aminés SEQ ID N Signification Polypeptides 1 Polypeptide CGL1 2 Polypeptide muté F63fsX75 3 Polypeptide muté F100fsX111 Polypeptide muté F105fsX112 Polypeptide muté F105fsX111 Polypeptide muté F108fsX113 Polypeptide muté R138X 8 Polypeptide muté (délétion exon 4) V99-S146 Polypeptide muté A212P Polypeptide muté F213fsX232 11 Fragment peptidique de CGL1 12 Fragment peptidique de CGL1 13 Fragment peptidique de CGL1 Acides nucléiques 14 ADNc codant le Polypeptide CGL1 Amorce CA10/F 16 Amorce CA10/R 17 Amorce Exon 1 18 Amorce R-1587 s
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Claims (41)
1. Acide nuclélque codant le polypeptide CGL1 de séquence en acides
aminés SEQ ID N 1 ou un fragment ou un variant du polypeptide CGL1.
2. Acide nuclélque selon la revendication 1, caractérisé en ce que le variant du polypeptide CGL1 est choisi parmi les polypoptides de
séquences en acides aminés SEQ ID N 2 à SEQ ID N 10.
o
3. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment du polypeptide CGL1 est choisi parmi les polypeptides de
séquences en acides aminés SEQ ID N 11 à SEQ ID N 13.
4. Acide nuclélque selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il
comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N 14.
5. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend le polynucléotide allant du nucléotide en position 345 jusqu'au
nucléotide en position 1541 de la séquence nucléotidique SEQ ID N 14.
6. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend le gène cgl1 contenu dans le vecteur BAC désigné RP11-831 H9 dont des séquences nucléotidiques partielles sont référencéss dans la
base de données GenBank sous le numéro d'accès n AP001458.
7. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 3 à 6
pour la fabrication d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique spécifique
du gène cgl1.
8. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 2 pour la fabrication d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique spécifique du gène
cgl1 muté.
s
9. Sonde ou amorce nucléotidique hybridant spécifiquement avec le gène
cgl1 muté.
10. Sonde ou amorce selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle
hybride spécifiquement avec un acide nuclélque selon la revendication 2.
11. Sonde ou amorce nucléctidique selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle hybride spécifiquement avec le gène cgl1 portant une mutation choisie parmi les mutations F63fsX75, F100fsX111, F105fsX112, F105fsX111, F108fsX113, R138X, A212P, F213fsX232, del/ins E5-6 et del
s E4-6.
12. Couple d'amorces nucléotidiques pour la détection d'une mutation dans le gène cgl1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N 15 et SEQ ID N 16, et SEQ ID N 17 et SEQ ID
N 18.
13. Procédé pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'une
s des revendications 9 à 11 avec l'échantillon à tester;
b) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et
l'acide nuclélque présent dans l'échantillon.
14. Procédé de détection selon la revendication 13, caractérisé en ce que
o la ou les sondes sont immobilisoes sur un support.
15. Nécessaire ou kit pour la détection d'une mutation dans le gène cgl1, caractérisé en ce qu'il comprend:
a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'une des revendications 9
s à 11;
b) le cas échéant, les résctifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
16. Procédé pour détecter une mutation dans un acide nuclélque codant le polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: o a) mise en contact de l'échantillon à tester avec une ou plusieurs amorces
selon l'une des revendications 9 à 12;
b) détection des acides nucléiques amplifiés.
17. Nécessaire ou kit pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend:
a) une ou plusieurs amorces nucléotidiques selon l'une des revendications
9 à 1 2;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
zo
18. Vecteur recombinant comprenant un acide nuclélque selon l'une des
revendications 1 à 6.
19. Cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle est transfectée ou
transformée par un acide nuclélque selon l'une des revendications 1 à 6 ou
par un vecteur recombinant selon ia revendication 18.
20. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 3 à
6, d'un vecteur recombinant selon la revendication 18 ou d'une cellule hôte recombinante selon la revendication 19 pour la fabrication d'un
o médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie.
88 2824332
21. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 3 à
6, d'un vecteur recombinant selon la revendication 18 ou d'une cellule hôte recombinante selon la revendication 19 pour la fabrication d'un
s médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un diabète.
22. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, comprenant un acide nucléique selon l'une des
revendications 1 et 3 à 6, un vecteur recombinant selon la revendication 18
o ou une cellule hôte recombinante selon la revendication 19, en association
avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
23. Composition pharmaceutique destinse à la prévention ou au traitement d'un diabète, comprenant un acide nuclélque selon l'une des
revendications 1 et 3 à 6, un vecteur recombinant selon la revendication 18
ou une cellule hôte recombinante selon la revendication 19, en association .
avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
24. PolypeptIde caractérisé en ce qu'il s'agit du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1 ou d'un fragment ou d'un variant du polypeptide CGL1.
25. Polypeptide selon la revendication 24, caractérisé en ce que le variant du polypeptide CGL1 est choisi parmi les polypeptides de séquences en
acides aminés SEQ ID N 2 à SEQ ID N 10.
26. Polypeptide selon la revendication 24, caractérisé en ce que le fragment du polypeptide CGL1 est choisi parmi les polypeptides de
séquences en acides aminés SEQ ID N 11 à SEQ ID N 13.
27. Utilisation du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie. s
28. Utilisation du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1 pour la fabrication d'un médicament destiné à ia prévention ou au traitement d'un diabète.
29. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement o d'une lipodystrophie, comprenant un polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
30. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'un diabète, comprenant un polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
31. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 24
à 26.
32. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des
revendications 24 à 26 dans un échantillon, comprenant les étapes de:
a) mettre en contact un anticorps selon la revendication 31 avec I'échantillon à tester;
b) détecter les complexes polypeptide-anticorps éventuellement formés.
33. Nécessaire ou kit pour la détection d'un polypeptide selon l'une des
revendications 24 à 26 dans un échantillon, comprenant:
o a) un anticorps selon la revendication 31; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes
polypeptide-anticorps éventuellement formés.
34. P rocédé de crib lage d' u n com posé cand id at i nterag issant avec le polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1 ou avec un fragment du polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mettre en contact le composé candidat avec le polypaptide CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide o CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1, d'une part, et le composé
candidat, d'autre part.
35. Nécessaire ou kit pour le criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N 1 ou avec un fragment du polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend:
a) un polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide CGL1.
b) le cas échéant, les réactifs nacessaires à la détection des complexes éventuellement formés entre le polypeptide CGL1 ou le fragment du
polypeptide CGL1, d'une part, et le composé candidat, d'autre part.
36. Procédé pour le criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgl1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) cultiver une cellule hôte exprimant, de manière naturelle ou après recombinaison génétique, le gène cgl1; b) mettre en contact la cellule hôte cultivée à l'étape a) avec un composé candidat; c) déterminer la capacité du composé candidat à moduler l'expression
du gène cgl1par la cellule hôte.
37. Nécessaire ou kit pour le criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgl1, caractérisé en ce qu'il comprend: a) une cellule hôte exprimant, de manière naturelle ou après recombinaison génétique, le gène cgl1; b) le cas échéant, les moyens nscessaires à la détermination de la capacité du composé candidat à moduler l'expression du gène cg/1par la
cellule hôte.
38. Nécessaire ou kit selon la revendication 37, caractérisé en ce que les o moyens nscessaires à la détermination de la capacité du composé candidat à moduler l'expression du gène cgl1par la cellule hôte sont une ou
des sondes spécifiques du gène cgl1.
39. Animal transgénique non humain dont les cellules somatiques eVou s germinales ont été transformées par un acide noclélque selon l'une des
revendications 1 à 6.
40. Procédé pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'expression d'un acide nucléique selon l'une des
revendications 1 à 6 comportant les étapes consistant à:
a) administrer la substance ou la molécule candidate à un animal transgénique selon la revendication 39; b) détecter le niveau d'expression de l'acide nucléique selon l'une
des revendications 1 à 6;
C) comparer les résultats obtenus au b) avec les résultats obtenus chez un animal transgénique n'ayant pas reçu la substance ou la molécule candidate.
41. Kit ou nAcessske pour le chblage W d'une molecule ou substance candidate modulant l'expssion d'un acme nuclAue salon l'une des vendicatons 1 O comprenant: a) un animal nsgAnue sewn Ending 39: b) le cas Achantes moyens de dAteion du bateau d'expressIon
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| WO2001028532A2 (fr) * | 1999-10-19 | 2001-04-26 | Kain Kevin C | Procedes et compositions pour prevoir, diagnostiquer et traiter la lipodystrophie |
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|---|---|---|---|
| TQ | Partial transmission of property |