WO2002090545A2 - Acide nucleique codant le polypeptide cgl1 et application de cet acide nucleique et du polypeptide cgl1 au diagnostic et en therapeutique - Google Patents

Acide nucleique codant le polypeptide cgl1 et application de cet acide nucleique et du polypeptide cgl1 au diagnostic et en therapeutique Download PDF

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WO2002090545A2
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nucleotide
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Jocelyne Magre
Jacqueline Capeau
Mark Lathrop
Marc Delepine
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Centre National De Genotypage
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to the field of prevention and treatment of pathologies such as lipodystrophies, very particularly congenital lipodystropy (CGL) as well as diabetes (type .1 and type 2).
  • pathologies such as lipodystrophies, very particularly congenital lipodystropy (CGL) as well as diabetes (type .1 and type 2).
  • CGL congenital lipodystropy
  • diabetes type .1 and type 2
  • Lipodystrophies are defined as alterations in the distribution of body fat which can be decreased or increased. They include obesity and metabolic syndrome (or insulin resistance syndrome or syndrome X).
  • CGL Generalized congenital lipodystrophy
  • GL Generalized lipodystrophy
  • Lipodystrophy syndromes have been classified according to the extent of lipoatrophy, whether it is local or generalized.
  • generalized lipodystrophies GL
  • Two GL subtypes have been distinguished according to the age of onset of lipoatrophy.
  • the first subtype is congenital generalized lipodystrophy (CGL), also called "BERARDINELLI-SEIP syndrome” for which an absence of adipose tissue is observed at birth or early in early childhood.
  • CGL congenital generalized lipodystrophy
  • LAWRENCE syndrome generalized acquired lipodystrophy
  • IGF-1 insulin growth factor-1
  • PIGF-1 is a substance with great anabolic power and which is known to stimulate cell growth in certain tissues. IGF-1 is therefore likely to dangerously deteriorate cardiomyopathy in patients with CGL thus treated.
  • CGL congenital generalized lipodystrophy syndrome
  • the pathologies preferentially targeted by the invention are the following:
  • the cgl1 gene can also be designated “BSCL2”.
  • the CGL1 protein can also be designated “Seipine”.
  • nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide of amino acid sequence SEQ ID No. 1 or alternatively fragments or variants of the CGL1 polypeptide.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid as defined above for the manufacture of a probe or of a nucleotide primer specific for the normal cgll gene or for the mutated cgll gene.
  • the invention also relates to methods for detecting a mutation in a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide, said methods using one or more nucleotide probes or primers specific for the mutated cgll gene, as well as kits or kits for the detection of 'a mutation in the cgll gene.
  • the invention also relates to recombinant vectors comprising a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide, especially recombinant vectors useful in gene therapy methods, as well as recombinant host cells transfected or transformed by such a nucleic acid or by a vector. as defined above.
  • a subject of the invention is also the use of a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of lipodystrophy of diabetes or obesity, and any particularly lipodystrophy associated with CGL syndrome.
  • compositions intended for the prevention or treatment of lipodystrophy or of diabetes characterized in that they comprise a nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide or else a recombinant vector or a recombinant host cell. as defined above, in combination with one or more physiologically compatible excipients.
  • a subject of the invention is also the CGL1 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1 or else a fragment or a variant of the CGL1 polypeptide.
  • the invention also relates to the use of the CGL1 polypeptide for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of lipodystrophy or of diabetes as well as to a pharmaceutical composition comprising a CGL1 polypeptide.
  • the invention also relates to an antibody directed against the CGL1 polypeptide, or alternatively a fragment or a variant of the CGL1 polypeptide, as well as to detection methods and kits or kits using such an antibody.
  • the invention also relates to methods for screening a candidate compound interacting with the CGL1 polypeptide as well as kits or kits for screening such candidate compounds.
  • It also relates to methods for screening a candidate compound modulating the expression of the cgl1 gene as well as to kits or kits for screening such candidate compounds.
  • FIG. 1A illustrates the CGL families of two geographically distinct groups, respectively Lebanese and Norwegian, which were studied in the linkage analysis carried out on the whole genome. Solid symbols represent affected individuals and empty symbols represent unaffected individuals. The pedigrees have been simplified and show only the affected progeny which has been effectively genotyped.
  • the individual annotated with a star (*) has the same name as the last three families of the pedigree, respecting the recessive mode of transmission of the disease for patients # 4.
  • the haplotype analysis is represented schematically by the bars located under the individuals who have been genotypes: the solid bars correspond to the respective carrier allele, which segregates with the disease and reveals a "founding" effect in each population.
  • the numbering of the affected individuals corresponds to that used in Figure 2, in which fine mapping details are presented.
  • Figure 1B illustrates a multi-point analysis of families
  • genotypes are presented for the patients after estimation of the haplotypes in each family originating from Lebanon or Norway.
  • the characters in italics represent the genotypes for patients 4, 12, 13, 24 and 25, who were inferred from the other parents in the family, due to the absence of DNA for the study; x represents a haplotype for the disease not identified in the available DNAs.
  • the microsatellite markers are indicated in the left column; the arrows indicate the markers used for mapping the entire genome. The full boxes indicate the regions of homozygosity.
  • Figure 3 illustrates the haplotype analysis in families of various ethnic origins co-segregating at locus 11q13. The individuals were genotyped with six markers covering an interval of approximately 10cM. For each family, the ethnic origin is indicated when it differs from the country of residence. In the CGL-16 family, the letter d as genotype with the CA10 marker corresponds to a deletion.
  • FIG. 4A illustrates deletions in the cgl1 gene, human homolog of the mouse gene ⁇ 3ng3lg.
  • the eleven exons were amplified as seven fragments in each member of the CGL-16 inbred family, including affected children (monozygotic twins).
  • Figure 4B illustrates the distribution of mutations in the cgl1 gene. The mutations are represented according to their type: large deletion (-), a false sense mutation (O), nonsense mutation (X), mutation in the splicing site (I), mutation of reading frame change due to a insertion (), deletion (*) or deletion / insertion (0).
  • FIG. 5 illustrates the expression profile of the cgl1 gene.
  • FIG. 5 illustrates the expression profile of the cgl1 gene.
  • 5A is an autoradiographic photograph showing the hybridization of a cDNA probe covering exons 1 to 11 against poly (A) + mRNA gels (approximately 2 ⁇ g) of different tissues, showing the existence of transcription of approximately 2.4 kb and approximately 1.8 kb and approximately 2 kb respectively.
  • FIG. 5B presents autoradiography photographs showing the hybridization of a cDNA probe covering exons 1 to 11 on a gel containing total human RNA (20 ⁇ g) originating from the abdominal and visceral subcutaneous tissues, by comparison to brain, heart and liver tissue.
  • Figure 5C illustrates the quantification of autoradiography images obtained after hybridization of a cDNA probe covering exons 1 to 11 on poly (A) + RNA of various tissues. The results show that the highest levels of expression were observed for the brain and the testes.
  • FIG. 6 illustrates an alignment of the sequences of the CGL1 protein with the Gng3lg protein of mus musculus and the CG9904 protein of Drosophila melanogaster, respectively. Preserved amino acid residues are shown in full boxes. Putative transmembrane domains are underlined.
  • isolated in the sense of the present invention designates a biological material (nucleic acid or protein) which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located).
  • a polynucleotide naturally occurring in a plant or animal is not isolated.
  • the same polynucleotide separated from adjacent nucleic acids within which it is naturally inserted into the genome of the plant or animal is considered to be "isolated”.
  • Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and remain nevertheless in the isolated state of the fact that the vector or the composition does not constitute its natural environment.
  • purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
  • a polynucleotide is in the "purified” state after purification of the starting material or of the natural material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably 4 or 5 orders of magnitude.
  • the expression “nucleotide sequence” can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • the term “nucleotide sequence” encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
  • oligonucleotide or “nucleotide sequence” include sequences of RNA, DNA, cDNA or hybrid sequences RNA / DNA of more than one nucleotide, either in the single chain form or in the form of duplex .
  • nucleotide refers to both natural nucleotides
  • modified nucleotides which comprise at least one modification such as (1) an analog of a purine, (2) an analog of a pyrimidine, or (3) an analogous sugar, examples of such modified nucleotides being described for example in PCT application No. WO 95/04 064.
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the base complementary to the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary bases are A and T (or A and U), or C and G.
  • variant of a nucleic acid according to the invention is meant a nucleic acid which differs by one or more bases with respect to the reference polynucleotide.
  • a variant nucleic acid may be of natural origin, such as an allelic variant found naturally, or may also be an unnatural variant obtained for example by mutagenesis techniques.
  • the differences between the reference nucleic acid and the variant nucleic acid are reduced so that the nucleotide sequences of the reference nucleic acid and the variant nucleic acid are very close and, in many regions , identical.
  • the nucleotide modifications present in a variant nucleic acid can be silent, which means that they do not alter the amino acid sequences encoded by said variant nucleic acid.
  • nucleotide changes in a variant nucleic acid can also result in substitutions, additions, deletions in the polypeptide encoded by the variant nucleic acid compared to the peptides encoded by the reference nucleic acid.
  • modifications of nucleotides in the coding regions can produce substitutions, conservative or non-conservative in the amino acid sequence.
  • the variant nucleic acids according to the invention encode polypeptides which retain substantially the same biological function or activity as the polypeptide of the reference nucleic acid or else the ability to be recognized by antibodies directed against the polypeptides encoded by the initial nucleic acid.
  • nucleic acids will thus code for mutated forms of polypeptides whose systematic study will make it possible to deduce structure activity relationships from the proteins in question.
  • fragment will be understood to mean a reference nucleic acid according to the invention, a nucleotide sequence of reduced length compared to the reference nucleic acid and comprising, on the part common, a nucleotide sequence identical to the reference nucleic acid.
  • Such a “fragment” of nucleic acid according to the invention may, where appropriate, be included in a larger polynucleotide of which it is constitutive.
  • Such fragments comprise, or alternatively consist of, oligonucleotides of length ranging from 8, 10, 12, 15, 18, 20 to 25,
  • variant of a polypeptide according to the invention is mainly meant a polypeptide whose amino acid sequence contains one or more substitutions, additions or deletions of at least one amino acid residue, relative to the sequence amino acids of the reference polypeptide, it being understood that the amino acid substitutions can be either conservative or non-conservative.
  • a “variant” of a polypeptide according to the invention has an N-terminal amino acid sequence identical to the reference polypeptide.
  • preferred variants of the CGL1 polypeptide have an N-terminal sequence starting with the amino acid sequence "Met-Val-Asn-Asp-Pro" or "Met-Val-Asn-Asp-Pro-
  • fragment of a polypeptide according to the invention, is meant a polypeptide whose amino acid sequence is shorter than that of the reference polypeptide and which comprises over the entire part common with these reference polypeptides, a sequence in identical amino acids.
  • Such fragments may, if appropriate, be included within a larger polypeptide of which they are part.
  • Such fragments of a polypeptide according to the invention can have a length of 10, 15, 20, 30 to 40, 50, 100, 200 or 300 amino acids.
  • the "percentage of identity" between two nucleotide or amino acid sequences can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by 100 to obtain the percentage of sequence identity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be achieved by computer using known algorithms contained in the package of the company WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.
  • the percentage of sequence identity may be carried out using the BLAST software (BLAST versions 1.4.9 of March 1996, BLAST 2.0.4 of February 1998 and BLAST 2.0.6 of September 1998), using only the default parameters (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402).
  • the query sequence and the databases used can be peptide or nucleic, any combination being possible.
  • hybridization conditions described above are suitable for hybridization under high stringency conditions, of a nucleic acid molecule of variable length from 20 nucleotides to several hundred nucleotides.
  • hybridization conditions described above can be adapted as a function of the length of the nucleic acid for which hybridization is sought or of the type of labeling chosen, according to techniques known to those skilled in the art. .
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (1985) or also in the work of F. AUSUBEL et al (1989). DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the inventors carried out a marker association mapping and a homozygosity mapping in individuals from nine families with CGL originating from two distinct geographic isolates, respectively from Riverside and Norway, which enabled them to isolate one of the Causal genes for congenital generalized lipodystrophy syndrome in a small region of the chromosomal locus 11q13.
  • the inventors carried out a first genome-wide association study, the results of which showed that two adjacent markers, respectively the markers D11S4191 and D11S987 located on the chromosomal locus 11q13 were homozygous in most patients.
  • the inventors then characterized 25 additional microsatellite markers, twelve of which are located between the marker D11S4191 and D11S987.
  • a second association study carried out with these markers made it possible to determine that the locus carrying the causative genetic determinant of CGL was located in a region of approximately 2.5 Mb located between the markers D11S4076 and D11S480.
  • Some of the patients included in the study were homozygous for a zero allele corresponding to the CA10 marker. This result enabled the inventors to identify a causative gene for congenital generalized lipodystrophy among the 27 genes studied in the interval D11S4076-D11S480.
  • This gene is contained in the DNA insert of a BAC vector designated RP11-83H9, the partial nucleotide sequences of which are referenced in the GenBanK database under the access number AP001458.
  • the causal gene for CGL has been designated "cgll gene” by the inventors.
  • the inventors have identified numerous mutations inducing the coding of mutated CGL1 polypeptides, in particular polypeptides
  • CGL1 congenital generalized lipodystrophy syndrome
  • the subject of the invention is first of all a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide of amino acid sequence SEQ ID No. 1 or a fragment or a variant of the CGL1 polypeptide.
  • the nucleic acids according to the present invention are in an isolated or purified form.
  • the genomic sequence of the cgl1 gene is entirely contained in the DNA insert of the BAC vector designated RT11-831 H9, of which unordered sequences have been referenced under the access number AP001458 of the database.
  • GenBank The inventors have determined that the cgl1 gene comprises 11 exons and 10 introns. Based on the numbering in nucleotides of the genomic sequence n ° AP001458 of GenBank, the sequences of the different exons of the cgll gene were determined as follows:
  • Exon 1 which does not include an open reading frame, corresponds to the nucleotide sequence complementary to the sequence going up to the nucleotide at position 35294 of the sequence AP001458.
  • Exon 2 is the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 161282 to the nucleotide at position 161598 of the sequence AP001458.
  • the base A of the translation initiation codon is located at position 161387.
  • Exon 3 is the nucleotide sequence from nucleotide at position 158346 to nucleotide at position 158427 of the genomic sequence AP001458.
  • Exon 4 is the sequence complementary to the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 153740 to the nucleotide at position 153597 of the genomic sequence AP001458.
  • Exon 5 is the sequence complementary to the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 66927 to the nucleotide at position 66793 of the genomic sequence AP001458.
  • Exon 6 is the sequence complementary to the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 66603 to the nucleotide at position 66506 of the genomic sequence AP001458.
  • Exon 7 is the sequence complementary to the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 65551 to the nucleotide at position 65410 of the genomic sequence AP001458.
  • Exon 8 is the sequence complementary to the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 65271 to the nucleotide at position 65.205 of the genomic sequence AP001458.
  • Exon 9 is the sequence complementary to the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 64997 to the nucleotide at position 64917 of the genomic sequence AP001458.
  • Exon 10 is the sequence complementary to the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 64822 to the nucleotide at position 64742 of the genomic sequence AP001458.
  • Exon 11 is the sequence complementary to the nucleotide sequence going from the nucleotide in position 64651 of the genomic sequence AP001458. The A base of the TGA codon for stopping the translation of the cgl1 gene located at nucleotide 64497 of the genomic sequence AP001458.
  • Table 1 below presents the intron-exon junction sequences of the cgl1 gene.
  • Exon 1 which does not have an open reading frame, corresponds to the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 134 035 to the nucleotide at position 134 273 of the sequence AC 090306.
  • Exon 2 is the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 135 765 to the nucleotide at position 136 081 of the sequence AC 090306.
  • Exon 3 is the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 138 833 to the nucleotide at position 138 914 of the genomic sequence AC 090306.
  • Exon 4 is the nucleotide sequence going from the nucleotide in position 146 670 to the nucleotide in position 146 813 of the genomic sequence AC 090306.
  • Exon 5 is the nucleotide sequence going from the nucleotide in position 148 584 to the nucleotide in position 148 718 of the genomic sequence AC 090306.
  • Exon 6 is the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 148 908 to the nucleotide at position 149 005 of the genomic sequence AC 090306.
  • Exon 7 is the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 149 960 to the nucleotide at position 150 101 of the genomic sequence AC 090306.
  • Exon 8 is the nucleotide sequence going from the nucleotide at position 150 240 to the nucleotide at position 150 306 of the genomic sequence AC 090306.
  • Exon 9 is the nucleotide sequence going from the nucleotide in position 150 514 to the nucleotide in position 150 594 of the genomic sequence AC 090306.
  • Exon 10 is the nucleotide sequence going from the nucleotide in position 150 689 to the nucleotide in position 150 769 of the genomic sequence AC 090306.
  • Exon 11 is the nucleotide sequence going from the nucleotide in position 150 860 to the nucleotide in position 151 106 of the genomic sequence AC 090306.
  • the marker of the invention designated “CA10” is located from the nucleotide at position 145 136 to the nucleotide at position 145 016 of the genomic sequence AC 090306.
  • the cgl1 gene can be isolated by a person skilled in the art from the BAC vector designated RP11-83H9 and referenced under the access number AP00 1458 and AC 090 306 from the GenBanK database.
  • a person skilled in the art can again isolate the genomic nucleic acid from the cgl1 gene from a sample of human DNA, using the pair of primers with respective sequences SEQ ID No. 17 and SEQ ID No. 18.
  • the invention relates to a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide, characterized in that it comprises the cgl1 gene contained in the BAC vector designated RP-11-83H9, the partial nucleotide sequences of which are referenced in the GENBANK database under the number n Access number n ° AP001458 or whose nucleotide sequences are referenced in the GenBanK database under the n ° D4ACC7S AC 090 306.
  • the cDNA encoding the CGL1 polypeptide has been identified by the inventors as being a nucleic acid having complete identity with the nucleic acid referenced in the GenBanK database under the access number 9 AF052149, this sequence also being referenced as the sequence SEQ ID No. 14 of the sequence listing.
  • sequence no AF052,149 is simply identified as originating from a human messenger RNA randomly sequenced from a human mRNA library.
  • GenBanK reference AF052149 does not contain any information regarding the existence of an open reading frame in the sequence described, let alone the position of a possible open reading frame. As a result, no information is given on a polypeptide that could be encoded by this sequence.
  • the cDNA sequence coding for the CGL1 polypeptide referenced as the sequence SEQ ID No. 14 of the sequence listing, has an open reading frame which begins at the base A of the ATG codon, in position 345 and ends at the base A of the codon TGA in position 1541 of the sequence SEQ ID No. 14.
  • the open reading frame of the sequence SEQ ID No. 14 codes for the polypeptide CGL1 of amino acid sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention therefore also relates to a nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide, characterized in that it comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 14.
  • nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide characterized in that it comprises the polynucleotide ranging from the nucleotide in position 345 to the nucleotide in position 1541 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 14.
  • a nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide of a variant or of a fragment of such a nucleic acid for the purpose of diagnosis or preventive or curative therapy of a pathology associated with a mutation or defect in the expression of the gene coding for the CGL1 polypeptide, in particular a pathology listed in the "SUMMARY" section, including lipodystrophy, preferentially generalized congenital lipodystrophy (CGL1), or type 1 or type 2 diabetes.
  • a pathology associated with a mutation or defect in the expression of the gene coding for the CGL1 polypeptide in particular a pathology listed in the "SUMMARY" section, including lipodystrophy, preferentially generalized congenital lipodystrophy (CGL1), or type 1 or type 2 diabetes.
  • the inventors have identified numerous mutations in the cgl1 gene in patients suffering from congenital generalized lipodystrophy.
  • the cgl1 gene affected by this mutation codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2.
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No 2 has a truncated amino acid sequence with respect to the normal CGL1 polypeptide of sequence SEQ ID No 1 and also has the C-terminal sequence "RDCAFLLQDRL" which is not found in the polypeptide CGL1 normal, due to a change of reading frame induced by the mutation.
  • the cgl1 gene carrying this mutation codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 3.
  • the amino acid sequence polypeptide SEQ ID No. 3 is truncated, relative to the normal CGL1 polypeptide and has the C-terminal sequence "KCMDSRIVLP" which is not found in the normal CGL1 polypeptide, due to a change in the reading frame induced by the mutation.
  • the cgl1 gene carrying this mutation codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 4.
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No. 4 is truncated relative to the normal CGL1 polypeptide and has the C-terminal sequence "SCYLRA" which is not found in the normal CGL1 peptide, due to a change in the reading frame induced by mutation.
  • the cgl1 gene carrying this mutation codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 5, which is truncated relative to the normal CGL1 polypeptide and which has a C-terminal sequence "CYLRA" which is not found in the normal CGL1 polypeptide, due to a change of reading frame induced by the mutation.
  • Mutation F108 fsX113 codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 5, which is truncated relative to the normal CGL1 polypeptide and which has a C-terminal sequence "CYLRA" which is not found in the normal CGL1 polypeptide, due to a change of reading frame induced by the mutation.
  • the cgll gene carrying this mutation codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 6 which is truncated relative to the normal CGL1 polypeptide and which has a C-terminal sequence "NLRA" which is not found in the normal CGL1 polypeptide, made of a change of reading frame induced by the mutation.
  • the cgl1 gene carrying this mutation codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 7, the amino acid sequence of which is truncated relative to the normal CGL1 polypeptide.
  • the cgl1 gene carrying this mutation codes for a polypeptide comprising an amino acid deletion and codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 8. More specifically, it is a mutation of the first base of the alternative intron 4 splicing site, which induces the excision of exon 4. The excision of exon 4 causes the deletion of 48 amino acids, with conservation of the reading frame.
  • a 212P mutation The cgll gene carrying the A 212P mutation codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 9, resulting from a “false sense” mutation in exon 6 inducing the substitution of the alanine residue at position 212 with a praline residue .
  • the cgll gene carrying this mutation codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 10 which is truncated relative to the normal CGL1 polypeptide and which has a C-terminal sequence "TSASTRTSLGSDTCY TTSR" which is not found in the normal CGL1 polypeptide, due to a change in the reading frame.
  • variants of the CGL1 polypeptide of sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 10 form part of the invention. Also forming part of the invention are the nucleic acids coding for the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 10, as well as their complementary sequences.
  • Table 2 summarizes the different mutations of the cgll gene found by the inventors.
  • fragments of the CGL1 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1.
  • the fragments of the CGL1 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1 are preferably at least 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 2550, 300, in length.
  • the fragments of the CGL1 polypeptide are useful in particular for the preparation of antibodies directed specifically against this protein.
  • the fragments of the preferred CGL1 polypeptide are the polypeptides of amino acid sequences, respectively SEQ ID No 11, SEQ ID No 12 and SEQ ID No 13.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid encoding a fragment of the CGL1 polypeptide as defined above.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide or a fragment of the CGL1 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1 for the manufacture of a probe or of a nucleotide primer specific for the cgl1 gene.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid encoding a variant of the CGL1 polypeptide for the manufacture of a probe or of a nucleotide primer specific for the mutated cgl1 gene.
  • the subject of the invention is also a probe or a nucleotide primer hybridizing, under conditions of high stringency defined in the present description, specifically with the mutated cgl1 gene.
  • nucleotide probes or primers according to the invention are preferably those characterized in that they specifically hybridize with a nucleic acid coding for one of the polypeptides of sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 10, these polypeptides being coded by the mutated cgll gene.
  • the probes and the nucleotide primers hybridize specifically with the cgl1 gene carrying a mutation chosen from the mutations F63fsX75, F100fsX1 11,
  • probes and primers which hybridize with an unmutated nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide, but do not hybridize, under the specified hybridization conditions, with a nucleic acid carrying one of the mutations ci -above.
  • the invention also relates to a pair of nucleotide primers for the detection of a mutation in the cgll gene, characterized in that it is the pair of primers comprising the nucleotide sequences SEQ ID No. 15 and SEQ ID N ° 16 which define the CA10 microsatellite marker.
  • a second pair of primers according to the invention comprises the primers of sequences SEQ ID No. 17 and SEQ ID No. 18.
  • a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as the method to the phosphodiester of Narang et al. (1979) or Brown et al. (1979), the diethylphosphoramidite method of Beaucage et al. (1980) or the technique on solid support described in patent EU N ⁇ P 0 707
  • Each of the nucleic acids according to the invention can be labeled, if desired, by incorporating a marker detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
  • markers can consist of radioactive isotopes (32P, 33P, 3H, 35S), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin) or also ligands such as biotin.
  • the labeling of the probes is preferably done by incorporating labeled molecules within the polynucleotides by extension of primers, or else by adding to the 5 ′ or 3 ′ ends.
  • the probes according to the invention may have structural characteristics such as to allow amplification of the signal, such as the probes described by Urdea et al. (1991) or in European patent n ° EP-0 225 807 (CHIRON).
  • oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in Southern type hybridizations with genomic DNA or also in hybridizations with the corresponding messenger RNA when the expression of the corresponding transcript is sought in a sample.
  • the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
  • Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
  • solid supports are well known to those skilled in the art and include surfaces microtiter plate wells, polystyrene beds, magnetic beds, nitrocellulose strips, or microparticles such as latex particles.
  • the present invention also relates to a method for detecting a mutation in a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide, characterized in that it comprises the steps of: a) bringing one or more nucleotide probes as defined above into contact with the sample to be tested; b) detecting the complex possibly formed between the probe (s) and the nucleic acid present in the sample.
  • the oligonucleotide probe (s) are immobilized on a support.
  • the oligonucleotide probes include a detectable marker.
  • the invention further relates to a kit or kit for the detection of a mutation in the cgl1 gene, characterized in that it comprises: a) one or more nucleotide probes as defined above; b) where appropriate, the reagents necessary for the hybridization reaction.
  • the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
  • the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • such a kit will comprise a plurality of oligonucleotide probes capable of detecting distinct mutations in the cgl1 gene.
  • the probes according to the invention immobilized on a support can be ordered in matrices such as "DNA chips". Such ordered matrices have been described in particular in US Patent No. 5,143,854 and in PCT Applications No. WO 90/15070 net 92/192. Support matrices on which the oligonucleotide probes have been immobilized at a high density are for example described in US Pat. Nos. 5,412,087 and in PCT application No. WO 95/11 995.
  • the nucleotide primers according to the invention are preferably used to detect a mutation in a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide, and therefore selectively amplified all or part of a nucleic acid carrying a mutation in the cgll gene.
  • Another object of the invention relates to a method for detecting a mutation in a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide, characterized in that it comprises the steps of: a) bringing the test sample into contact with one or more nucleotide primers as defined above; b) detecting the amplified nucleic acids.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for detecting a mutation in a nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide, characterized in that it comprises: a) one or more nucleotide primers as defined above; b) where appropriate, the reagents necessary for the amplification reaction.
  • the nucleotide primers according to the invention are particularly useful in the context of process and genotyping of subjects and / or genotyping of populations, in particular in the context of studies of association between the particular allelic forms or forms of groups of particular alleles for genotyping subjects and / or genotyping populations, particularly in the context of studies of association between the particular allelic forms or forms of groups of particular alleles (haplotypes) in subjects suffering from CGL and the existence of a phenotype (character) particular in these subjects, for example the predisposition of these subjects to develop pathologies linked to generalized dystrophy, diabetes or obesity.
  • nucleotide probes and primers according to the invention are also useful as detection means for the diagnosis of pathologies linked to CGL1, in particular the pathologies listed in the "SUMMARY" part of this description, including lipoatrophic diabetes, especially as part of a prenatal diagnosis.
  • the invention would also relate to a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide of amino acid sequence SEQ ID No. 1 or a fragment or a variant of the CGL1 polypeptide.
  • a recombinant vector comprising a nucleic acid coding for a variant of the CGL1 polypeptide will comprise a nucleic acid coding for a polypeptide chosen from the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 10.
  • a recombinant vector comprising a nucleic acid coding for a fragment of the CGL1 polypeptide will comprise a nucleic acid coding for a polypeptide chosen from the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID No 11 to SEQ ID No 13.
  • the nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide comprises the cgl1 gene contained in the BAC vector designated RP11-831H9 whose partial nucleotide sequences are referenced in the GENBANK database under the access number n ° AP001458.
  • the nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide is a nucleic acid comprising the nucleotide sequence SEQ ID No. 14.
  • the nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide comprises the polynucleotide ranging from the nucleotide at position 345 to the nucleotide at position 1541 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 14.
  • vector in the sense of the present invention, is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in the form of single strand or double strand.
  • a recombinant vector according to the invention is used in order to amplify the nucleic acid which is inserted therein after transformation or transfection of the desired cellular host.
  • these are expression vectors comprising, in addition to a nucleic acid according to the invention, regulatory sequences making it possible to direct their transcription and / or translation.
  • a recombinant vector according to the invention will notably comprise the following elements:
  • elements for regulating the expression of the nucleic acid to be inserted such as promoters and activator sequences ("enhancers");
  • the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of replication in cellular hosts in which their amplification or expression is sought, markers or selection markers.
  • the bacterial promoters may be the Lad, LacZ promoters, the promoters of the RNA polymerase of bacteriophage T3 or T7, the PR or PL promoters of phage lambda.
  • Promoters for eukaryotic cells will include the HSV virus thymidine kinase promoter or the mouse metallothionein-L promoter.
  • bacteriophage vectors such as bacteriophage P1 vectors such as the vector p158 or even the vector p158 / neo8 described by Sternberg (1992, 1994), will preferably be used.
  • the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the vectors pBR322 (ATCC37017) or also vectors such as pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden), and pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, USA). Mention may also be made of other commercially available vectors such as the vectors pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
  • baculovirus type vectors such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used to transfect the cells of the Sf9 line (ATCC No. CRL 1711) derived from Spodoptera frugiperda.
  • a recombinant vector according to the invention can also be a retroviral vector or also an adeno-associated vector (AAV).
  • AAV adeno-associated vector
  • Such adeno-associated vectors are for example described by Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), or even McLaughlin BA et al. (1996).
  • the latter must be introduced into a host cell.
  • the introduction of the polynucleotides according to the invention into a host cell can be carried out in vitro, according to techniques well known to those skilled in the art for transforming or transfecting cells, either in primary culture or in the form of cell lines. It is also possible to carry out the introduction of the polynucleotides according to the invention in vivo, for the prevention or treatment of pathologies associated with lipodystrophy, diabetes or obesity, such as the pathologies listed in the “SUMMARY” section of this document. description.
  • a person skilled in the art may advantageously refer to different techniques, such as the calcium phosphate precipitation technique (Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), DEAE Dextran (Gopal, 1985), electroporation (Tur-Kaspa, 1896; Potter et al., 1984), direct microinjection (Hariand et al., 1985), Liposomes loaded with DNA (Nicolau et al., 1982, Fraley et al., 1979).
  • the polynucleotide Once the polynucleotide has been introduced into the host cell, it can be stably integrated into the genome of the cell. Integration can be carried out at a specific location in the genome, by homologous recombination, or can be integrated at random. In certain embodiments, the polynucleotide can be maintained stably in the host cell in the form of an episome fragment, the episome comprising sequences allowing the maintenance and the replication of the latter, either independently, either synchronized with the cell cycle.
  • a method for introducing a polynucleotide according to the invention into a host cell comprises a step during which a preparation comprising a vector is introduced pharmaceutically compatible and a “naked” polynucleotide according to the invention, placed under the control of appropriate regulatory sequences, by local injection into the chosen tissue, for example smooth muscle tissue, the “naked” polynucleotide being absorbed by the cells of this fabric.
  • compositions for in vitro and in vivo use comprising “naked” polynucleotides are for example described in PCT application No. WO 95/11307 (Institut Pasteur, Inserm, University of Ottawa) as well as in the articles by Tacson and al. (1996) and de Huygen et al. (1996).
  • composition for the in vivo production of the CGL1 polypeptide there is provided a composition for the in vivo production of the CGL1 polypeptide.
  • composition comprises a polynucleotide coding for the CGL1 polypeptide placed under the control of appropriate regulatory sequences, in solution in a physiologically acceptable vector.
  • the amount of vector that is injected into the chosen host organism varies depending on the site of the injection. As an indication, it can be injected between approximately 0.1 and approximately 100 ⁇ g of the polynucleotide encoding the polypeptide CGL1 in the body of an animal, preferably a patient likely to develop lipodystrophy, diabetes or obesity, in particular CGL syndrome, or having already developed this disease.
  • the subject of the invention is also the use of a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide or the use of a recombinant vector comprising such a nucleic acid for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of lipodystrophy, and preferably congenital generalized lipodystrophy (CGL), or even Lawrence syndrome or obesity.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide or the use of a recombinant vector comprising such a nucleic acid for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of a diabetes, obesity, or insulin resistance syndrome.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of lipodystrophy, preferably congenital generalized lipodystrophy (CGL), or even Lawrence syndrome or obesity, comprising a nucleic acid encoding the polypeptide CGL1, or comprising a recombinant vector comprising such a nucleic acid, in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of lipodystrophy, preferably congenital generalized lipodystrophy (CGL), or even Lawrence syndrome or obesity, comprising a nucleic acid encoding the polypeptide CGL1, or comprising a recombinant vector comprising such a nucleic acid, in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes or insulin resistance syndrome, comprising a nucleic acid encoding the polypeptide.
  • CGL1 or comprising a recombinant vector comprising such a nucleic acid, in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • Vectors useful in somatic gene therapy methods and compositions containing such vectors also relates to a new therapeutic approach for the treatment of the pathologies listed in the “SUMMARY” section, in particular the pathologies associated with lipodystrophy, diabetes or obesity. It offers an advantageous solution to the drawbacks of the prior art, by demonstrating the possibility of treating the pathologies associated with lipodystrophy or with diabetes, in particular congenital generalized lipodystrophy (CGL) by gene therapy, by transfer and expression. in vivo of a gene coding for the CGLL polypeptide
  • Gene therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) or ensuring the expression of a protein of therapeutic interest by introducing genetic information into the affected cell or organ.
  • This genetic information can be introduced either ex vivo in a cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the organism, or directly in vivo in the appropriate tissue.
  • different techniques exist, among which various transfection techniques involving complexes of DNA and DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol.
  • the present invention therefore also relates to a new therapeutic approach for the treatment of pathologies associated with a mutation or a deficit in the expression of the CGL1 gene, preferably the pathologies listed in the “SUMMARY” part of this description, more particularly the pathologies associated with CGL, consisting in transferring and expressing in vivo genes coding for CGL1.
  • the present invention also results from the demonstration that adenoviruses constitute particularly efficient vectors for the transfer and expression of a nucleic acid encoding the CGLL polypeptide.
  • the present invention shows that the use of recombinant adenoviruses as vectors makes it possible to obtain sufficiently high expression levels of this gene to produce the desired therapeutic effect.
  • Other viral vectors such as retroviruses or adeno-associated viruses (AAV) allowing stable expression of the gene are also objects of the invention.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the invention therefore also relates to a defective recombinant virus comprising a nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide involved in CGL syndrome.
  • the invention also relates to the use of such a defective recombinant virus for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment and / or prevention of diseases exhibiting lipodystrophy, diabetes, Lawrence syndrome, obesity, insulin resistance syndrome.
  • the present invention also relates to the use of cells genetically modified ex vivo by a virus as described above, or of cells producing such viruses, implanted in the organism, allowing prolonged and efficient expression in vivo of the CGLL polypeptide.
  • a DNA sequence coding for the CGL1 polypeptide into a viral vector, and that these vectors make it possible to efficiently express a mature, biologically active form.
  • the invention shows that the in vivo expression of the CGL1 polypeptide can be obtained by direct administration of an adenovirus or by implantation of a producer or genetically modified cell by an adenovirus or by a retrovirus incorporating such a DNA.
  • the present invention is particularly advantageous because it makes it possible to induce a controlled expression and without harmful effect of CGL1 in organs which are not normally concerned with the expression of this protein.
  • a significant release of the CGL1 polypeptide is obtained by implantation of cells producing vectors of the invention, or infected ex vivo with vectors of the invention.
  • the nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide can be a cDNA, a genomic DNA (gDNA), a RNA (in the case of retroviruses) or a hybrid construct consisting for example of a cDNA in which one or more introns would be inserted. They can also be synthetic or semi-synthetic sequences. Particularly advantageously, a cDNA or a gDNA is used. In particular, the use of a gDNA allows better expression in human cells. To allow their incorporation into a viral vector according to the invention, these sequences are advantageously modified, for example by site-directed mutagenesis, in particular for the insertion of suitable restriction sites.
  • the nucleic acid coding for a polypeptide coded by a gene orthologous to the cgl1 gene can originate from another mammal, for example from the mouse.
  • use will preferably be made of the nucleic acids described in the GenBank database under the access numbers AF069954, AB041588 and AB030196 or the genomic sequence.
  • a derivative of the CGL1 polypeptide comprises for example any sequence obtained by mutation, deletion and / or addition with respect to the native sequence, and coding for a product. retaining the preventive or curative activity of the CGL.
  • derivatives are in particular molecules having a greater affinity for their binding sites, molecules exhibiting greater resistance to proteases, molecules having greater therapeutic efficacy or less side effects, or possibly new biological properties.
  • the derivatives also include the modified DNA sequences allowing improved expression in vivo.
  • the present invention relates to a defective recombinant virus comprising a cDNA sequence coding for the CGL1 polypeptide.
  • the DNA sequence is a gDNA sequence.
  • the vectors of the invention can be prepared from different types of virus.
  • vectors derived from adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), viruses of herpes (HSV) or retroviruses It is very particularly advantageous to use an adenovirus, for direct administration or for the ex vivo modification of cells intended to be implanted, or a retrovirus, for the implantation of producer cells.
  • the viruses according to the invention are defective, that is to say that they are unable to replicate autonomously in the target cell.
  • the genome of the defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • adenoviruses various serotypes, whose structure and properties vary somewhat, have been characterized.
  • serotypes it is preferred to use, in the context of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO94 / 26914).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan or A26 / 61 strain (ATCC VR-800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise ITRs, a sequence allowing the packaging and the sequence coding for the CGLL polypeptide.
  • at least the region E1 is made non-functional.
  • the E1 gene and at least one of the E2, E4, L1-L5 genes are non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered.
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the E1 and E4 regions and the sequence coding for the CGL1 polypeptide is inserted at the level of the inactivated E1 region.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line we can mention the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome of an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the functions E1 and E4 as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697.
  • the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the AAV genome has been cloned, sequenced and characterized. It comprises approximately 4,700 bases, and contains at each end an inverted repeat region (ITR) of approximately 145 bases, serving as the replication source for the virus.
  • ITR inverted repeat region
  • the rest of the genome is divided into 2 essential regions carrying the packaging functions: the left part of the genome, which contains the rep gene involved in viral replication and the expression of viral genes; the right part of the genome, which contains the cap gene coding for the capsid proteins of the virus.
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by co-transfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing the sequence coding for the CGL1 polypeptide bordered by two inverted repeat regions (ITR) from AAV, and a plasmid carrying the packaging genes (rep and cap genes) from AAV.
  • a human helper virus for example an adenovirus
  • ITR inverted repeat regions
  • rep and cap genes packaging genes
  • retroviruses are integrative viruses, infecting dividing cells.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
  • the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus”), HaSV ("harvey sarcoma virus”) ; SNV ("spleen necrosis virus”); RSV ("rous sarcoma virus”) or the Friend virus.
  • MoMuLV murine moloney leukemia virus
  • MSV murine moloney sarcoma virus
  • HaSV human moloney sarcoma virus
  • SNV spleen necrosis virus
  • RSV rous sarcoma virus
  • Friend virus Friend virus
  • a plasmid comprising in particular the LTRs, the packaging sequence and said coding sequence is generally constructed, then used for transfect a cell line known as packaging, capable of providing trans deficient retroviral functions in the plasmid.
  • packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861,719); the PsiCRIP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150).
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences, comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
  • the recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • adenoviral vectors according to the invention are particularly advantageous for direct administration in vivo of a purified suspension, or for the ex vivo transformation of cells, in particular autologous, with a view to their implantation.
  • the adenoviral vectors according to the invention also have significant advantages, such as in particular their very high infection efficiency, making it possible to carry out infections from small volumes of viral suspension.
  • a line producing retroviral vectors containing the sequence coding for the CGL1 polypeptide is used for implantation in vivo.
  • the lines which can be used for this purpose are in particular the cells PA317 (US4,861,719), PsiCrip (WO90 / 02806) and GP + envAm-12 (US5,278,056), modified to allow the production of a retrovirus containing a nucleic sequence coding for CGL1 polypeptide according to the invention.
  • totipotent stem cells, precursors of blood cell lines can be removed and isolated from the subject.
  • These cultured cells can then be transfected with the retroviral vector containing the sequence coding for the CGL1 polypeptide under the control of viral, non-viral, non-viral and macrophage-specific promoters or even under the control of its own promoter.
  • the sequence coding for the CGL1 polypeptide is placed under the control of signals allowing its expression in the infected cells.
  • They may be homologous or heterologous expression signals, that is to say signals different from those naturally responsible for the expression of the CGLL II polypeptide.
  • They may in particular be sequences responsible for the expression of other proteins, or synthetic sequences.
  • they may be sequences of eukaryotic or viral genes or derived sequences, stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not and in an inducible way or not.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect, or from the genome of a virus, and in particular, the promoters of the E1A, MLP genes of adenovirus, the CMV promoter, LTR-RSV, etc.
  • eukaryotic promoters include ubiquitous promoters (HPRT, vimentin, -actin, tubulin, etc.), promoters of intermediate filaments (desmin, neurofilaments, keratin, GFAP, etc.) promoters of therapeutic genes (MDR type, CFTR, factor VIII, etc.) tissue specific promoters (pyruvate kinase, villin, promoter of the intestinal fatty acid binding protein, promoter of actin ⁇ of smooth muscle cells, specific promoters for the liver; Apo A1, Apo AH, Human albumin, etc.) or promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, etc.).
  • HPRT ubiquitous promoters
  • promoters of intermediate filaments include vermin, neurofilaments, keratin, GFAP, etc.
  • promoters of therapeutic genes MDR type, CFTR, factor VIII, etc.
  • tissue specific promoters pyruvate kinase, villin,
  • sequences expression can be modified by adding activation sequences, regulation, etc.
  • the inserted gene when it does not contain expression sequences, it can be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence.
  • the invention relates to a defective recombinant virus comprising a nucleic sequence coding for the CGL1 polypeptide under the control of a promoter chosen from LTR-RSV or the early promoter of CMV.
  • the present invention also relates to any use of a virus as described above for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment and / or prevention of pathologies presenting lipodystrophy or diabetes.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant viruses as described above.
  • These pharmaceutical compositions can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the pharmaceutical compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for an intravenous injection, such as for example in the patient's portal vein.
  • injectable formulation in particular for an intravenous injection, such as for example in the patient's portal vein.
  • They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • Direct injection into the patient's portal vein is advantageous because it makes it possible to target the infection in the liver and thus to concentrate the therapeutic effect in this organ.
  • the doses of defective recombinant virus used for injection can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the viral vector, of the mode of administration used, of the pathology concerned or also of the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 ⁇ and 10 ⁇ 4 pfu / ml, and preferably 10 ⁇ to 1 ⁇ 0 pfu / ml.
  • pfu plaque forming unit
  • plaque forming unit corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 48 hours, the number of plaques of infected cells.
  • the techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • compositions according to the invention can directly comprise the producer cells, with a view to their implantation.
  • another subject of the invention relates to any mammalian cell infected with one or more defective recombinant viruses as described above. More particularly, the invention relates to any population of human cells infected with these viruses. They may in particular be cells of blood origin (totipotent stem cells or precursors), fibroblasts, myoblasts, hepatocytes, keratinocytes, smooth and endothelial muscle cells, glial cells, etc.
  • the cells according to the invention can come from primary cultures. These can be removed by any technique known to those skilled in the art, then cultured under conditions allowing their proliferation. As regards more particularly fibroblasts, these can be easily obtained from biopsies, for example according to the technique described by Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. These cells can be used directly for infection by viruses, or stored, for example by freezing, for the establishment of autologous banks, for later use. The cells according to the invention can also be secondary cultures, obtained for example from pre-established banks (see for example EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
  • the cultured cells are then infected with the recombinant viruses, to give them the capacity to produce the CGL1 polypeptide.
  • the infection is carried out in vitro according to techniques known to those skilled in the art. In particular, according to the type of cells used and the number of copies of virus per cell desired, a person skilled in the art can adapt the multiplicity of infection and possibly the number of infection cycles carried out. It is understood that these steps must be carried out under conditions of appropriate sterility when the cells are intended for administration in vivo.
  • the doses of recombinant virus used for infection of the cells can be adapted by a person skilled in the art according to the aim sought.
  • the conditions described above for administration in vivo can be applied to infection in vitro. For infection with retroviruses, it is also possible to co-cultivate the cells which it is desired to infect with cells producing the recombinant retroviruses according to the invention. This makes it possible to dispense with the purification of retroviruses.
  • Another subject of the invention relates to an implant comprising mammalian cells infected with one or more defective recombinant viruses as described above or cells producing recombinant viruses, and an extracellular matrix.
  • the implants according to the invention comprise 10 ⁇ to 10 0 cells. More preferably, they include 10 6 to 10 8 .
  • the extracellular matrix comprises a gelling compound and optionally a support allowing the anchoring of the cells.
  • gelling agents are used for the inclusion of cells in a matrix having the constitution of a gel, and to promote the anchoring of the cells on the support, if necessary.
  • Different cell adhesion agents can therefore be used as gelling agents, such as in particular collagen, gelatin, glycosaminoglycans, fibronectin, lectins, etc.
  • collagen is used. It can be collagen of human, bovine or murine origin. More preferably, type I collagen is used.
  • compositions according to the invention advantageously comprise a support allowing the anchoring of the cells.
  • anchoring designates any form of biological and / or chemical and / or physical interaction resulting in the adhesion and / or fixing of the cells on the support.
  • the cells can either cover the support used, or penetrate inside this support, or both. It is preferred to use within the framework of the invention a solid, non-toxic and / or biocompatible support.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the present invention thus provides a very effective means for the treatment or prevention of pathologies associated with CGL, such as lipodystrophy or diabetes.
  • this treatment can concern both humans and any animal such as sheep, cattle, domestic animals (dogs, cats, etc.), horses, fish, etc.
  • the invention also relates to a recombinant host cell characterized in that it is transfected or transformed by an acid. nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide or a fragment of the CGL1 polypeptide, or alternatively by a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide or a fragment of the CGLL polypeptide
  • the preferred host cells according to the invention are for example the following: a) host cells prokaryotes: strains of Escherichia coli (strain DH5- ⁇ ), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, or strains of species such as Pseudomonas, Streptomyces and Staphylococus; b) eukaryotic host cells: HeLa cells (ATCC No.
  • CCL2 Cv 1 cells
  • COS cells ATCC No. CRL 1650
  • Sf-9 cells ATCC No. CRL 1711
  • CHO cells ATCC N ° CCL-61) or 3T3 cells (ATCC N ° CRL-6361).
  • pituitary cells cells of the central nervous system, such as neuronal cells or even pre-adipocyte cells.
  • a subject of the invention is also the use of a recombinant host cell as defined above for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of lipodystrophy, preferably congenital generalized lipodystrophy (CGL ).
  • CGL congenital generalized lipodystrophy
  • the invention also relates to the use of a recombinant host cell as defined above for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of diabetes.
  • the subject of the invention is also a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of lipodystrophy, preferably congenital generalized lipodystrophy (CGL) comprising a recombinant host cell as defined above, in association with one or more physiologically compatible excipients. It also relates to a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of diabetes comprising a recombinant host cell as defined above, in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • CGL congenital generalized lipodystrophy
  • the subject of the invention is also the CGL1 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1. It also relates to a fragment of the CGL1 polypeptide as described previously in the description.
  • the preferred variants of the CGL1 polypeptide according to the invention are the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 10.
  • the subject of the invention is also a polypeptide having at least 90%, advantageously at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
  • the preferred fragments of the CGL1 polypeptide are the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID No. 11 to SEQ ID No. 13.
  • the invention also relates to the use of the CGL1 polypeptide for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of lipodystrophy, preferably congenital generalized lipodystrophy (CGL).
  • CGL congenital generalized lipodystrophy
  • the invention also relates to the use of the CGL1 polypeptide for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of diabetes.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of a pathology linked to a mutation or a defect in expression of the gene encoding the CGL1 polypeptide, preferably a pathology listed in the "SUMMARY" part of the present description, including a lipodystrophy, preferably a congenital generalized lipodystrophy (CGL), Lawrence syndrome or obesity comprising a CGL1 polypeptide in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of diabetes or insulin resistance syndrome comprising a CGL1 polypeptide in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • polypeptides according to the present invention are in an isolated or purified form.
  • nucleic acids according to the present invention are in an isolated or purified form.
  • compositions comprise a therapeutically effective amount of the CGL1 polypeptide, in particular of the CGL1 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1.
  • Such pharmaceutical compositions are advantageously suitable for the administration, for example parenterally, of an amount of CGL1 polypeptide ranging from 1 ⁇ g / kg / day to 10 mg / kg / day, preferably at least 0.01 mg / kg / day and very preferably between 0.01 and 1 mg / kg / day.
  • the invention also relates to a process for the production of a CGL1 polypeptide or of a fragment of the CGL1 polypeptide or of a variant of the latter, said method comprising the steps of: a) inserting a nucleic acid encoding said polypeptide in an appropriate vector; b) cultivating, in an appropriate culture medium, a host cell previously transformed or transfected with the recombinant vector of step a); c) recovering the conditioned culture medium or lysing the host cell, for example by sonication or by osmotic shock; d) separating and purifying from said culture medium or from the cell lysates obtained in step c) said polypeptide; e) where appropriate, characterize the recombinant polypeptide produced.
  • the peptides according to the invention can be characterized by attachment to an immunoaffinity chromatography column on which the antibodies directed against this polypeptide or against a fragment or a variant of the latter have been immobilized beforehand.
  • a recombinant polypeptide according to the invention can be purified by passage through an appropriate series of chromatography columns, according to the methods known to those skilled in the art and described for example in F. Ausubel et al (1989 ).
  • a polypeptide according to the invention can also be prepared by conventional techniques of chemical synthesis either in homogeneous solution or solid phase.
  • a polypeptide according to the invention may be prepared by the technique or in a homogeneous solution described by Houben Weyl (1974) or also the solid phase synthesis technique described by Merrifield (1965a; 1965b). Also part of the invention are so-called polypeptides.
  • Such homologous polypeptides have amino acid sequences having one or more substitutions of an amino acid with an equivalent amino acid, relative to the reference polypeptides.
  • the equivalent amino acid according to the present invention will be understood, for example replacement of a residue in the L form with a residue in the D form or alternatively the replacement of a glutamic acid (E) by a pyro-glutamic acid according to techniques well known to those skilled in the art.
  • E glutamic acid
  • two amino acids belonging to the same class are also considered to be equivalent amino acids, that is to say two amino acids, basic, non-polar or even uncharged polar.
  • polypeptides comprising at least one non-peptide bond such as a retro-inverso bond (NHCO), a carba bond (CH 2 CH 2 ) or even a ketomethylene bond (CO-CH 2 ).
  • NHCO retro-inverso bond
  • CH 2 CH 2 carba bond
  • CO-CH 2 ketomethylene bond
  • the polypeptides according to the invention comprising one or more additions, deletions, substitutions of at least one amino acid will retain their capacity to be recognized by antibodies directed against the unmodified polypeptides.
  • Fragments of the CGL1 polypeptide in particular the polypeptides of sequences SEQ ID No 11 to SEQ ID No 13, as well as variants of the CGL1 polypeptide, more particularly the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID No 2 to SEQ ID N ° 10, as well as the homologous peptides can be used for the preparation of antibodies, in particular in order to detect the production of normal form or on the contrary of mutated form of the CGL1 polypeptide in a patient.
  • preferred antibodies according to the invention are the antibodies directed against the polypeptides of sequences SEQ ID No. 11 to SEQ ID No. 13.
  • the preferred antibodies are the antibodies directed against the polypeptides of sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 10.
  • the antibodies intended to detect the presence of a mutated CGL1 polypeptide are antibodies directed against the mutated regions of the CGL1 polypeptide, as described in detail above in the description, and more specifically the C-terminal regions. mutated CGL1 peptides which are not found in the normal CGL1 polypeptide.
  • the antibodies according to the invention are used for: - tissue and cellular localization of the CGL1 protein
  • antibody within the meaning of the present invention, is meant in particular polyclonal or monoclonal antibodies or fragments (for example fragments F (ab) ' 2 , Fab) or any polypeptide comprising a domain of the initial antibody recognizing the polypeptide or the target polypeptide fragment according to the invention.
  • Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas using the technique described by Kohler and Milstein (1975).
  • the present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide as described above or a fragment or a variant thereof, as produced in the trioma technique or also the hybridoma technique described by Kozbor et al. (1983).
  • the invention also relates to fragments of single chain Fv antibody (ScFv) as described in US Patent No. 4,946,778 or by Martineau et al. (1998).
  • the antibodies according to the invention also comprise fragments of antibodies obtained using phage banks Ridder et al., (1995) or also humanized antibodies Reinmann et al. (1997); Léger et al., (1997).
  • the antibody preparations according to the invention are useful in immunological detection tests intended to identify the presence and / or the quantity of antigens present in a sample.
  • An antibody according to the invention may also comprise an detectable isotopic or non-isotopic marker, for example fluorescent or also be coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • a subject of the invention is also a method for detecting the presence of a normal or mutated CGL1 polypeptide in a sample, said method comprising the following steps: a) bringing an antibody as defined above into contact with the sample to test; b) detecting the polypeptide-antibody complexes possibly formed.
  • the invention also relates to a kit or kit for the detection of a normal or mutated CGL1 polypeptide in a sample, said kit or kit comprising: a) an antibody as defined above; b) where appropriate, the reagents necessary for the detection of the polypeptide-antibody complexes possibly formed.
  • the subject of the invention is also the use of a nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide, a recombinant vector containing such a nucleic acid or a recombinant host cell as defined above for the manufacture of a medicament.
  • the invention also relates to the use of the CGL1 polypeptide or a fragment of the CGL1 polypeptide for the manufacture of a medicament intended for the prevention, or treatment of a pathology linked to a mutation or a defect in the expression of the gene encoding the CGL1 polypeptide, preferably of a pathology listed in the “SUMMARY” part of this description, including lipodystrophy or diabetes as well as pharmaceutical compositions comprising a CGL1 polypeptide or a fragment of the CGL1 polypeptide, in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • the subject of the invention is also a method of preventive or curative therapeutic treatment of diseases associated with lipodystrophy, preferentially to congenital generalized lipodystrophy (CGL), such a method comprising a step during which is administered to a patient a nucleic acid capable of modifying the expression of the CGL1 polypeptide in said patient, said nucleic acid being, where appropriate, associated with one or more physiologically compatible vehicles and / or excipients.
  • CGL congenital generalized lipodystrophy
  • the patient will be administered a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid, as defined in the present description.
  • the invention also relates to a method of preventive or curative therapeutic treatment of diseases associated with lipodystrophy, preferentially generalized or congenital lipodystrophy (CGL), or with diabetes, such a method comprising a step during which is administered to a patient a therapeutically effective amount of the CGL1 polypeptide in said patient, said polypeptide being, where appropriate, associated with one or more physiologically compatible vehicles and / or excipients.
  • CGL congenital lipodystrophy
  • the demonstration according to the invention of the fact that the cgl1 gene is a causal gene of CGL makes it possible to develop screening methods for candidate compounds of therapeutic interest in order to prevent or treat a pathology linked to a mutation or to a defect in the expression of the gene coding for the CGL1 polypeptide, including lipodystrophy in particular CGL or diabetes.
  • the CGL1 polypeptide constitutes a polypeptide target of compounds of therapeutic interest preventive or curative of pathologies associated with CGL.
  • ligand means a molecule, such as a protein, a peptide, an antibody or any synthetic chemical compound capable of binding to the CGL1 polypeptide or one of its fragments.
  • a biological sample or a structurally defined molecule to be tested is brought into contact with the purified CGL1 polypeptide, for example the purified recombinant CGL1 polypeptide produced by a recombinant host cell as defined in the present description, in order to form a complex between the CGL1 polypeptide or a fragment thereof and the putative ligand that constitutes the candidate compound to be tested.
  • the purified CGL1 polypeptide for example the purified recombinant CGL1 polypeptide produced by a recombinant host cell as defined in the present description
  • microdialysis techniques coupled to HPLC will be used. described by WANG et al. (1997) or the capillary electrophoresis technique described by BUSH et al. (1997).
  • candidate compounds which may be peptides, fatty acids, lipoproteins or small molecules that interact with the CGL1 polypeptide, or a fragment of this polypeptide
  • a detectable marker such as a fluorescent, radioactive or enzymatic marker
  • CGL1 or a fragment thereof can also be screened using techniques using an optical biosensor such as those described by Edwards and Leatherbarrow (1997) or also by SZABO et al. (1995).
  • the invention therefore also relates to a method for screening a candidate compound interacting with the CGL1 polypeptide or with a fragment of the CGL1 polypeptide, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing the candidate compound into contact with the CGL1 polypeptide or the fragment of the CGL1 polypeptide; b) detecting the complexes possibly formed between the CGL1 polypeptide or the fragment of the CGL1 polypeptide, on the one hand, and the candidate compound, on the other hand.
  • the invention also relates to a kit or kit for screening a candidate compound interacting with the CGL1 polypeptide or with a fragment of the CGL1 polypeptide, characterized in that it comprises: a) a CGL1 polypeptide or a fragment of the polypeptide CGL1; b) where appropriate, the reagents necessary for the detection of the complexes possibly formed between the CGL1 polypeptide or the fragment of the CGL1 polypeptide, on the one hand, and the candidate compound, on the other hand.
  • Another object of the invention consists in a method for screening a candidate compound modulating the expression of the cgl1 gene, characterized in that it comprises the following steps: a) cultivating a host cell expressing, naturally or after genetic recombination, the cgll gene; b) bringing the host cell cultivated in step a) into contact with a candidate compound to be tested: c) determining the capacity of the candidate compound to modulate the expression of the cgl1 gene by the host cell.
  • step c) consists of a step of quantifying the expression of the cgl1 gene by the host cell.
  • the quantification of the expression of the cgl1 gene can be carried out either by quantification of the cgl1 messenger RNA produced or by quantification of the CGL1 polypeptide produced.
  • antibodies can be used as defined above in the description in order to quantify the quantities of CGL1 polypeptides which have been produced, for example using an enzyme immunoassay or by immunoradioactivity.
  • the present invention also relates to a method for screening candidate compounds capable of increasing, or on the contrary decreasing, the level of expression of the cgl1 gene.
  • a process allows those skilled in the art to select compounds having a regulatory effect on the level of expression of the cgll gene, a compound potentially useful as an active ingredient in pharmaceutical compositions for treating patients predisposed or suffering from lipodystrophy, preferably lipodystrophy generalized or congenital (CGL) or diabetes.
  • lipodystrophy preferably lipodystrophy generalized or congenital (CGL) or diabetes.
  • Quantitative analysis of the expression of the cgl1 gene can be performed using templates or "DNA chips" which can contain a plurality of nucleic acids derived from the cgl1 gene or the corresponding cDNA.
  • the quantitative analysis of the expression of the cgl1 gene can be carried out using a DNA chip such as that described by SCHENA et al. (1995 and 1996).
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the screening of a candidate compound modulating the expression of the cgl1 gene, characterized in that it comprises: a) a host cell expressing, naturally or after genetic recombination , the cgll gene; b) where appropriate, the means necessary for determining the capacity of the candidate compound to modulate the expression of the candidate cgl1 gene to modulate the expression of the cgl1 gene by the host cell.
  • the means necessary for determining the capacity of the candidate compound to modulate the expression of the cgl1 gene by the host cell are one or more probes specific for the cgl1 gene, more specifically the probes as defined previously in the description.
  • the invention also relates to two types of transgenic animal models, respectively a model for inactivation of the orthologous cgll gene in animals, and a model allowing controlled overexpression of the cgll gene in animals. These two models of transgenic animals are useful in particular for the screening of candidate compounds of therapeutic interest.
  • candidate compounds modulating the expression of a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide according to the invention can be identified in vivo, in non-human transgenic animals.
  • a candidate compound of interest according to the invention consists of a compound which increases the level of expression of a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide.
  • transgenic animal within the meaning of the invention is meant a non-human animal, preferably a mammal, in which one or more cells contain a heterologous nucleic acid introduced by human intervention, such as by transgenic techniques. well known to those skilled in the art.
  • the heterologous nucleic acid is introduced directly or indirectly into the cell or the precursor of the cell, by genetic manipulation such as microinjection or infection with a recombinant virus.
  • the heterologous nucleic acid may be integrated into the chromosome, or may be in the form of DNA replicating extra-chromosomally.
  • a transgenic animal comprises, in a form artificially inserted into its genome, a nucleic acid coding for a CGL1 polypeptide as defined previously in the description.
  • a transgenic animal according to the invention comprises, in a form artificially inserted into its genome, a nucleic acid inserted in place of the orthologous gene of cgll and blocking the production of the corresponding polypeptide.
  • the invention relates to a non-human transgenic animal whose somatic cells or somatic cells and germ cells have been transformed by a nucleic acid, in a targeted manner, and in the genome of which said nucleic acid is inserted so as to inactivate the corresponding gene. to cgll, in said transgenic animal.
  • the gene corresponding to cgl1 is inactivated by the partial or total replacement of its sequence by said exogenous nucleic acid. In the event of partial replacement of the sequence of the gene corresponding to cgl1, this gene is inactivated by interruption of its sequence by the sequence of said exogenous nucleic acid.
  • the inactivated target gene no longer expresses itself, or expresses itself by producing an inactive polypeptide.
  • Targeted insertion of exogenous nucleic acid is carried out by homologous recombination, according to bine techniques known to those skilled in the art.
  • a polynucleotide construct comprising the CGL1 gene modified to prevent production of the CGL1 polypeptide is specifically inserted in place of the endogenous homologous gene by homologous recombination in the 129sv mouse embryonic stem cell line.
  • the insertion of the polynucleotide construct is preferably carried out by electroporation, as described by Thomas et al. (1987, Cell, Vol51.503-512).
  • the genomic sequence of a fragment including CGL1 was obtained from DNA of the mouse 129sv line, making it possible to define a strategy of inactivation and screening of embryonic stem cells having carried out homologous recombination.
  • the introduction of the transgene will reproduce a deletion inducing a reading frame shift, already described in humans as causing generalized congenital lipodystrophy syndrome.
  • the transfection, by the appropriate recombinant vector, of the embryonic stem cells and the injection into blastocysts are carried out.
  • the screening of the clones and the genotyping of the animals are then carried out.
  • Such a transgenic animal of the invention comprises, in a form artificially inserted into its genome, a nucleic acid coding for a CGL1 polypeptide as defined previously in the description.
  • the nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide is inserted in a targeted manner into the genome of the animal, and even more preferentially this nucleic acid is inserted at the location where the gene orthologous to cgll is located in the genome of said animal, by homologous recombination, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the CGL1 controlled overexpression model consists in creating a transgenic mouse by targeted insertion into its genome of a copy of the complete complementary DNA of CGL1
  • This technique also uses the property of homologous recombination of cells embryonic strains of the mouse 129sv line. It consists in subcloning the complete complementary DNA of CGL1 downstream of a ubiquitous or tissue-specific mammalian promoter, into a vector containing positive and negative selection systems, as well as the sequence of a locus allowing a optimum expression of target complementary DNA. The rest of the technique is identical to that of gene knockout.
  • This technique makes it possible to control the number of copies inserted into the genome of the transgenic animal and thus to obtain a large number of animals absolutely identical by the number of copies of the transgene.
  • This makes it possible to overcome the problems encountered with the technique of random transgenesis, where it is difficult to compare the results of physiological experiments because of the variable number of copies of the transgene from one animal to another.
  • the other advantage of this technique is the efficiency and the control of the expression of the transgene, because it is specifically inserted in an open chromatin locus where the transcription rate is high, and it is possible to determine the localization of its expression by a judicious choice of the promoter.
  • the invention therefore also relates to a non-human transgenic animal whose somatic and / or germ cells have been transformed by a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide.
  • the transcription of the CGL1 gene has been characterized by different techniques and a complete complementary DNA has been cloned into a mammalian expression vector to verify the integrity of the polypeptide derived from this complementary DNA.
  • the subcloning of this complementary DNA into a "knock-in" vector with a ubiquitous promoter, the transfection of embryonic stem cells and the injection into a blastocyst are carried out.
  • a non-human transgenic animal for example a mouse
  • a candidate molecule or substance to be tested for example a candidate substance or molecule previously selected by an in vitro screening method as defined above.
  • the level of expression of the nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide is determined and compared with the expression of this nucleic acid in an identical non-human transgenic animal, for example an identical transgenic mouse, which has no not received the candidate molecule or substance.
  • the level of expression of the nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide can be determined by quantification of the corresponding messenger RNA produced by cells taken from animals or by detection and quantification of the CGL1 polypeptide produced in these cells, according to techniques known to those skilled in the art or described previously in the description. Measuring the levels of messenger RNA corresponding to the nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide by Northern type hybridization, or even by in situ hybridization.
  • the measurement of the expression levels of the CGL1 polypeptide can be carried out by immunohistochemistry.
  • non-human mammals such as mice, rats or guinea pigs are preferred. or rabbits which have their genome modified by the insertion of a polynucleotide construct comprising a nucleic acid according to the invention.
  • the transgenic animals according to the invention comprise the transgene, that is to say the above-mentioned polynucleotide construct, in a plurality of their somatic and / or germ cells.
  • the construction of transgenic animals according to the invention can be carried out according to conventional techniques well known to those skilled in the art. Those skilled in the art will in particular be able to refer to the production of transgenic animals, and particularly to the production of transgenic mice, as described in US patents No. 4,873,191 (issued October 10, 1989), US No. 5,464,764 ( issued November 7, 1995) and US 5,789,215 (issued August 4, 199/8) the content of these documents being incorporated herein by reference.
  • a polynucleotide construct comprising a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide is inserted into an ES type stem cell line.
  • the insertion of the polynucleotide construct is preferably carried out by electroporation, as described by Thomas et al. (1987, Cell, Vol. 51: 503-512).
  • the cells which have undergone the electroporation step are then screened for the presence of the polynucleotide construct (for example by selection using markers, or by PCR or by analysis on DNA electrophoresis gel Southern blot) in order to select the positive cells which have integrated the exogenous polynucleotide construct into their genome, if appropriate following a homologous recombination event.
  • a technique is for example described by MANSOUR et al. (1988, Nature, Vol. 336: 348-352).
  • ES type cells are brought into contact with 2.5-day embryos at an 8-16 cell stage (morulae) as described by WOOD et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90: 4582-4585) or by NAGY et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90: 8424-8428), the ES cells being internalized in order to colonize the blastocyst extensively, including the cells giving rise to the germ line.
  • the transgenic animals are then tested to determine those who have integrated the polynucleotide construct (the transgene).
  • the transgenic animals according to the invention are homozygous for the transgene.
  • the invention therefore also relates to a non-human transgenic animal whose somatic and / or germ cells have been transformed by a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide.
  • the invention also relates to a non-human transgenic animal whose somatic and / or germ cells have been transformed by a nucleic acid encoding a fragment or a variant of a CGL1 polypeptide, for example one of the CGL1 polypeptides mutates described previously in the description.
  • Such transgenic animals are useful in particular for verifying the selectivity of the candidate compounds active on the non-mutated CGL1 polypeptide.
  • the nucleic acid coding for the CGL1 polypeptide comprises a polynucleotide regulating transcription and / or translation under the control of which the coding region containing the open reading frame is placed, said polynucleotide being functional in the transgenic animal considered.
  • the above regulatory polynucleotide contains sequences called activators "enhancers” allowing high level expression of the CGL1 polypeptide in the cells of the transgenic animal.
  • the invention also relates to recombinant host cells obtained from a transgenic animal as described above.
  • Recombinant cell lines from a transgenic animal according to the invention can be established in long-term culture from any tissue of such a transgenic animal, for example by transfection of primary cell cultures with vectors expressing oncogenes such as the large T antigen of SV40, as described for example by CHOU (1989, Mol. Endocrinol. Vol. 3: 1511-1514) and SCHAY et al. (1991, Biochem. Biophys. Acta, vol. 1072: 1-7).
  • the invention also relates to a method for the in vivo screening of a molecule or of a candidate substance modulating the expression of a nucleic acid encoding the CGL1 polypeptide mutated or not mutated according to the invention, comprising the steps consisting at : a) administering the candidate substance or molecule to a transgenic animal as defined above; b) detecting the level of expression of the nucleic acid coding for the mutated or non-mutated CGL1 polypeptide; c) compare the results obtained in b) with the results obtained in a transgenic animal which has not received the candidate substance or molecule.
  • the invention also relates to a method for the in vivo screening of a molecule or of a candidate substance modulating the expression or the activity of the CGL1 polypeptide using the two animal models of the invention, comprising the steps consisting in: a) Administering the substance or the candidate molecule to the transgenic animals corresponding to the models described above. b) Detecting the localization and the level of expression of the CGL1 polypeptide by means of the antibodies as defined in the invention, characterizing the clinical, biological and molecular phenotype of the model animals. c) Compare the results obtained with those obtained in an animal which has not received the candidate substance or molecule. Observe in particular a possible modification of the localization or the level of expression of the polypeptide, or a possible reversion of the phenotype.
  • kits or necessary for the in vivo screening of a molecule or of a candidate substance modulating the expression or the activity of the CGL1 polypeptide comprising: a) a transgenic animal "knock in” or “knock out ”as defined above; b) where appropriate, the means for detecting the location or the level of expression of the CGL1 polypeptide.
  • the animals used during the implementation of the above process are sacrificed at the end of this process, for example during a step d) of the process.
  • the above method is a method of screening for candidate compounds, a small number of which are capable of exerting a measurable activity in the modulation of the expression of the nucleic acid encoding the CGLL polypeptide Ledit process does not in any way aim at the therapeutic treatment of animals used and can therefore in no way be assimilated to a therapeutic or surgical treatment process applied to the human or animal body.
  • the invention also relates to a kit or kit for the in vivo screening of a candidate molecule or substance modulating the expression of a nucleic acid coding for the mutated or non-mutated CGL1 polypeptide, comprising: a) a transgenic animal such as defined above; b) where appropriate, the means for detecting the level of expression of the nucleic acid coding for the mutated or non-mutated CGL1 polypeptide.
  • Genomic DNA was obtained from white peripheral blood cells using standard protocols (SAMBROOK et al., 1989).
  • the genotyping of markers was carried out using the panel of microsatellite markers LMS II-MD2 (PERKIN Biosystems) and a DNA sequencer of type ABI 377 equipped with software GENESCAN 3.0 AND GENOTYPER (version 2.1, marketed by the company APPLIED BISYSTEMS) .
  • LMS II-MD2 PERKIN Biosystems
  • GENESCAN 3.0 AND GENOTYPER version 2.1, marketed by the company APPLIED BISYSTEMS
  • new repeaters of CA type have been identified in the genomic sequences predicted to be located in the locus studied and tested for their polymorphism.
  • the probable order of these markers on the chromosome was then determined using the panel of irradiation hybrids designated Stanford GB3 (STEWART, 1997).
  • CGL exons were screened for mutations after amplification of seven fragments (exon 1, exon 2, exon3, exon 4, exons 5-6, exons 7-8 and exons 9-11).
  • the sequence of these intronic primers can be obtained on request. In patients for whom only very small amounts of DNA were accessible (extracted from old pituitary tissue and sera), two amplifications were performed in one pass.
  • the PCR products were purified on a column of the SEPHADEX type and sequenced using the “BIG DYE TERMINATOR” ABI technique.
  • RNA was isolated from abdominal adipose tissue subcutaneous and visceral from the skin and colon after surgery, using the QUIAGEN kit. A Neosy maxi kit.
  • RNA The total RNA (20 ⁇ g) was separated on a 1% agarose, 2.2 M formaldehyde / MOBS gel and transferred to a nylon membrane of Hybond-N type (Amersham). The membranes were hybridized with a probe of approximately 1700 bp covering exons 1 to 11 of the cgl1 gene including the starting AUG codon and the STOP codon. This probe was obtained by amplification of the total cDNA of the brain using the advantage kit 2 (CLONTECH) and the pair of primers (exon 1F: 5'-CCCC TGCAGTGGAGTCTGTA-3 'SEQ ID N ° 17; exon 11 R: 5'- AGTCAGGTGGGAAAGTGCTG-3 '(SEQ ID N ° 18).
  • the PCR amplification conditions were as follows: 95 ° C for one minute, followed by 30 compound cycles of 95 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 2 minutes, and a final step d extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the identity of the probe was confirmed after a further amplification with 5 pairs of internal primers, then partial sequencing.
  • the quantification of the signals was carried out using the Imager phosphor apparatus (Storm 860, Amersham Pharmacia Biotech) using the software Image Quant, Version 5.0.
  • genomic sequences included in the chromosomal range of interest were sought in the sites "http // www.ncbi. nlm.gov/genome/central "and” httt // hgrep.ims.u- tokyo.ac.jp/ ".
  • BLAST software available on the site "httt // www.ncbi. nlm.gov/cgi-bin/BLAST ”.
  • Multiple alignments were carried out using the CLUSTAL software available on the site
  • CGL2 a new locus was identified, designated CGL2 (designated CGL), within the range of approximately 8cM (DIB et al., 1996 bounded by the markers D11S4191 and D11S987 on chromosome 11q13 .
  • the inventors have characterized twenty five additional microsatellite markers near the CGL locus in families, including twelve markers located in the critical interval D11S4191-D11S987.
  • Lebanese families all affected individuals were homozygous for the same allele for nine contiguous markers within the D11S4076-PIGM interval, with some affected individuals who were heterozygous for end markers as well as another marker outside the interval ( Figure 2).
  • the presence of a common carrier allele in the five Lebanese families revealed a "founding" effect in the Lebanese population, since the CGL-04 and CGL-05 families were not known to be related to the other families.
  • inbreeding coefficient 0.00195 it was therefore possible that a second disease-related allele had been introduced, or that recombination events leading to a small homozygosity interval had remained undetected at this level of marker resolution.
  • cgll is homologous to the murine gene Gng3lg (for “Gng3-linked gene, described by DOWNES et al., 1998), which resides in a conserved region between murine chromosome 19 and human chromosome 11q.
  • the inventors have determined that the human gene, which covers at least 14 kb of genomic sequences, contains 11 exons.
  • the open reading frame begins in exon 2 and the intron-exon junctions show strong similarity to the consensus 5 'and 3' splice site sequences.
  • the amplification of these exons in patients of the CGL-16 family revealed the presence of a deletion including exons 4, 5 and 6 of the gene (del Ex4-6) (FIG. 4A).
  • the CA10 marker could be located either in intron 4 or in a small region of intron3.
  • the cgll gene has been sequenced in patients from all previously studied families. In addition, 27 patients were analyzed including 16 isolated patients and 11 patients from small families who had not been studied previously. Twelve alterations Different molecules were found among 41 patients from 22 families. These molecular alterations include a deletion of 258 bp (del E5-6) six small insertions and / or deletions less than 10 bp, and five substitutions of a single nucleotide ( Figure 4b and Table 2). Eleven of these mutations resulted in a change in reading frame, the introduction of an early STOP codon or could affect a sequence at a splicing site, all of the mutations being potentially null mutations.
  • the chromosomes associated with the disease carried unique variants at or near the splicing site.
  • the variant present in the Vietnamese family CGL-14 consists of a transition to the first base of intron 4 which belongs to a strictly conserved nucleotide consensus sequence for RNA (splicing donor site, HODGES et al., 1994) .
  • the other variants affect a nucleotide located after the consensus sequence of each splice acceptor site (intron 4: third base before exon 5; CGL-40) or of the splice donor site (intron 6: 5th base; paternal allele CGL-12).
  • Tissue specific expression of CGL1 was sought by hybridization of mRNA (Northern Blots and Dot Blot) using a probe covering exons 1 to 11. Analysis by “Northern Blot” revealed two species RNA of approximately 2.4 kb and approximately 1.8 kb expressed in a variable manner in all tissues, as well as an additional intermediate transcript of approximately 2 kb found as a single transcript in the brain and in association with the others transcribed in the testes ( Figure 5). Expression levels vary depending on the tissue, these levels being strong in the brain and testes, intermediate in adipose tissue (visceral and subcutaneous), pancreas, kidney, skeletal muscle, liver, ovary , prostate and heart and weak in the remaining tissue.
  • the cgl1 gene codes for a protein of 398 amino acids with a calculated mass of 43.8 kD which has also been designated "SEIPIN”.
  • amino acid sequence shows strong identity with the protein encoded by mouse Gng3lg (87% identity) and partial homology with a Drosophila melanogaster protein (40% identity between residues 22 and 257). Analysis did not reveal similarity with other known proteins
  • the CGL1 protein is a membrane protein having at least two transmembrane domains (Figure 6).
  • the numbering of the nucleotides begins at the nucleotide at position 345 of the sequence SEQ ID N ⁇ 4, this nucleotide being numbered 1 in the table.
  • the patient of the CGL35 family is a composite heterozygote with deletion (258bp) / insertion (12bp) in exons 5-6.
  • het composite heterozygote
  • hom homozygote for the mutation, Por, Portuguese; Tur, of Turkish origin
  • Vigouroux C. et al. Genetic exclusion of 14 candidate genes in lipoatropic diabetes using linkage analysis in 10 consanguineous families. J Clin Endocrinol Metab 82, 3438-3444 (1997). • • Vigouroux, C. et al. Human peroxisome proliferator-activated receptor- gamma2: genetic mapping, identification of a variant in the coding sequence, and exclusion as the gene responsible for diabetic lipoatrophy. Diabetes 47, 490-492 (1998). • Vigouroux, C. et al. Lamin AC gene: sex-determined expression of mutations in Dunnigan-type familial partial lipodystrophy and absence of coding mutations in congenital and acquired generalized lipoatrophy. Diabetes 49, 1958-1962 (2000).

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Abstract

Il est ainsi fourni selon l'invention un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID N°1 ou encore des fragments ou des variants du polypeptide CGL1. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus pour la fabrication d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique spécifique du gène cgl1 normal ou du gène cgl1 muté. L'invention a aussi pour objet des procédés de criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1 ou modulant l'expression du gène cgl1 ainsi que des nécessaires ou kits pour le criblage de tels composés candidats.

Description

Acide nucléique codant le polypeptide CGL1 et application de cet acide nucléique et du polypeptide CGL1 au diagnostic et en thérapeutique
La présente invention se rapporte au domaine de la prévention et du traitement des pathologies telles que les lipodystrophies, tout particulièrement la lipodystrop ie généralisée congénitale (CGL) ainsi que les diabètes (de type .1 et de type 2).
Les lipodystrophies se définissent comme des altérations de répartition du tissu adipeux corporel qui peut être diminué ou augmenté. Elles incluent l'obésité et le syndrome métabolie (ou syndrome d'insulino- résistance ou syndrome X).
ETAT DE LA TECHNIQUE
La lipodystrophie congénitale généralisée (CGL) a été décrite pour la première fois (dans les années 50) par BERARDINELLI (1954) et par SEIP (1959) . Cette pathologie a été revue en détail par SEIP, en 1996.
La lipodystrophie généralisée (GL) appartient au groupe hétérogène de syndromes dans lesquels sont présentes simultanément des altérations dans la distribution de la masse grasse corporelle ainsi qu'une résistance à l'insuline.
Les syndromes de lipodystrophie ont été classés en fonction de l'étendue de lipoatrophie, selon qu'elle soit locale ou généralisée. Dans les lipodystrophies généralisées (GL), on observe un appauvrissement sévère à la fois des tissus adipeux sous cutanés ou des tissus adipeux viscéraux. Deux sous-types de GL ont été distingués selon l'âge d'apparition de la lipoatrophie. Le premier sous-type est la lipodystrophie généralisée congénitale (CGL), désignée aussi « syndrome de BERARDINELLI-SEIP » pour laquelle est observée une absence de tissu adipeux à la naissance ou précoce au début de l'enfance précoce. Le second type, est désigné lipodystrophie généralisée acquise ou encore « syndrome de LAWRENCE » dans laquelle la lipoatrophie est observée seulement durant l'enfance ou la vie adulte. Basée sur l'observation d'une incidence à la fois chez les hommes et chez les femmes, sur la récurrence fréquente de la pathologie dans la descendance, ainsi que sur l'observation d'un taux de consanguinité parentale jusqu'à 50% chez les patients atteints, la transmission du caractère CGL de manière autosomale récessive était considérée comme très probable.
Une étude de ségrégation de marqueurs réalisés chez six familles norvégiennes atteintes de CGL a permis d'observer, chez deux de ces familles, un phénomène hétérochromatique sur le bras 9q du chromosome 9 (GEDDE-DAHL,1996). Dans cette étude, les auteurs avaient explicitement exclu l'hypothèse d'une association allélique entre le marqueur APOA11 , localisé sur le locus 11q 23.3 du chromosome 11 , et le déterminant génétique causal de la CGL.
Une autre étude avait également localisé le déterminant génétique causal de la CGL sur le chromosome 9. Ainsi, GARG et al. (1999), en réalisant une étude de clonage positionnel, ont identifié, chez une majorité de famille, un locus associé à la CGL sur le chromosome 9q34, dans un intervalle de 8,7 c bordé respectivement par les marqueurs D9S1818 et D9S1826. Toutefois, ces auteurs n'ont pas identifié, dans cet intervalle de 8,7 cM, le gène causal.
A l'heure actuelle, peu de traitements de patients atteints de CGL sont disponibles. La part la plus importante des traitements actuels consiste à fournir aux patients la qualité et la quantité optimales d'énergie nécessaire à leur métabolisme immédiat. Mais il est très difficile pour les patients de maintenir un régime alimentaire suffisamment rigide durant leur vie entière. Malgré l'administration de hautes doses d'insuline afin de surmonter la résistance à l'insuline observée lors de la CGL le contrôle du diabète reste mauvais et les patients développement des complications diabétiques graves. On a également eu recours au pimozide, un médicament bloquant la dopamine, du fait de l'observation de quantités accrues des facteurs de libération des hormones hypophysaires dans le sang des patients atteints de CGL. On a aussi utilisé le fenfluramine, qui a un effet anorexiant et qui réduit en particulier la consommation d'hydrates de carbone facilement digestibles. Il s'agit d'un composé agoniste sérotonergique augmentant le taux de sérotonine dans le système nerveux central. Toutefois, l'administration de fenfluramine était suivie de nombreux effets indésirables, notamment de somnolence, de diarrhée et de bouche sèche. On a également utilisé l'IGF-1. Toutefois, PIGF-1 est une substance à grand pouvoir anabolique et qui est connue pour stimuler la croissance cellulaire dans certains tissus. L'IGF-1 est donc susceptible de détériorer dangereusement une cardiomyopathie chez les patients atteints de CGL ainsi traités.
Il existe donc un besoin, dans l'état des connaissances actuelles, de moyens efficaces destinés à la prévention ou au traitement de lipodystrophies, notamment de CGL, qui puissent être utilisés à long terme chez les patients et qui entraînent des effets indésirables les plus réduits possibles. De tels moyens préventifs ou curatifs spécifiques ne peuvent être mis au point de manière ciblée sans avoir au préalable identifié le déterminant génétique causal de ce syndrome.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
Le demandeur a désormais identifié un gène causal du syndrome de lipodystrophie généralisée congénitale (CGL), localisé sur le locus 11q13 du chromosome 11 humain. Le gène causal de la CGL a été désigné cgll par le demandeur, qui a également identifié la protéine codée par ce gène, désignée CGL1.
Les pathologies préférentiellement visées par l'invention sont les suivantes :
- la lipodystrophie congénitale généralisée, ou diabète lipoatrophique, ou syndrome de Berardinelli-Seip ou lipodystrophie congénitale de Berardinelli-Seip,
- le syndrome de Lawrence, - la lipodystropie acquise ou lipodystropie secondaire,
- la lipodystrophie partielle,
-la lipodystropie secondaire (ou acquise) au traitement antirétroviral des patients infectés par le virus VI H,
- le diabète de type 1 , - le diabète de type 2, - l'obésité,
- le syndrome métabolique ou syndrome d'insulino-résistance au syndrome X.
Selon l'invention, le gène cgll peut être aussi désigné « BSCL2 ».
Selon l'invention, la protéine CGL1 peut être aussi désignée « Seipine ».
Il est ainsi fourni selon l'invention un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID N°1 ou encore des fragments ou des variants du polypeptide CGL1.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus pour la fabrication d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique spécifique du gène cgll normal ou du gène cgll muté.
L'invention est également relative à des procédés pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 , lesdits procédés mettant en oeuvre une ou plusieurs sondes ou amorces nucléotidiques spécifiques du gène cgll muté, ainsi que des nécessaires ou kits pour la détection d'une mutation dans le gène cgll.
L'invention a également trait à des vecteurs recombinants comprenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 , tout particulièrement des vecteurs recombinants utiles dans des procédés de thérapie génique, ainsi que des cellules hôtes recombinantes transfectées ou transformées par un tel acide nucléique ou par un vecteur tel que défini ci-dessus. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un acide nucléique codant pour le polypeptide CGL1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie d'un diabète ou d'une obésité, et tout particulièrement d'une lipodystrophie associée au syndrome CGL. Elle est également relative à des compositions pharmaceutiques destinées à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie ou d'un diabète, caractérisée en ce qu'elles comprennent un acide nucléique codant pour le polypeptide CGL1 ou encore un vecteur recombinant ou une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
L'invention a également pour objet le polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1 ou encore un fragment ou un variant du polypeptide CGLl
Elle est également relative à l'utilisation du polypeptide CGL1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie ou d'un diabète ainsi qu'à une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide CGL1. L'invention concerne aussi un anticorps dirigé contre le polypeptide CGL1 , ou encore un fragment ou un variant du polypeptide CGL1, ainsi qu'à des procédés de détection et des nécessaires ou kits mettant en oeuvre un tel anticorps.
L'invention a aussi pour objet des procédés de criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1 ainsi que des nécessaires ou kits pour le criblage de tels composés candidats.
Elle est également relative à des procédés de criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgll ainsi qu'à des nécessaires ou kits pour le criblage de tels composés candidats.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure !
La figure 1A illustre les familles CGL de deux groupes géographiquement distincts, respectivement Libanaise et Norvégienne, qui ont été étudiées dans l'analyse de liaison réalisée sur le génome entier. Les symboles pleins représentent les individus affectés et les symboles vides représentent les individus non affectés. Les pedigrees ont été simplifiés et ne montrent que la descendance affectée qui a été effectivement génotypée. Dans le groupe CGL-01, l'individu annoté par une étoile (*) possède le même nom que les trois dernières familles du pedigree respectant le mode de transmission récessif de la maladie pour les patients #4. Pour le chromosome 11q13, l'analyse d'haplotype est représentée schématiquement par les barres localisées sous les individus qui ont été génotypes: les barres pleines correspondent à l'allèle porteur respectif, qui ségrège avec la maladie et révèle un effet « fondateur » dans chaque population. La numérotation des individus affectés correspond à celle utilisée dans la figure 2, dans laquelle des détails de cartographie fine sont présentés. La figure 1B illustre une analyse multipoints des familles
Libanaises et Norvégiennes au locus 11q13. La localisation des marqueurs est indiquée en bas du graphe. Le lod score de 15.2 indique que le locus de la maladie CGL est localisé dans l'intervalle D1 154191- D115997. La figure 2 illustre la cartographie d'homozygotie au locus
11q13. Les génotypes sont présentés pour les patients après estimation des haplotypes dans chaque famille originaire du Liban ou de Norvège. Les caractères en italique représentent les génotypes pour les patients 4, 12, 13, 24 et 25, qui ont été inférés à partir des autres parents de la famille, du fait de l'absence d'ADN pour l'étude; x représente un haplotype à la maladie non identifié dans les ADN disponibles. Les marqueurs microsatellites sont indiqués dans la colonne de gauche; les flèches indiquent les marqueurs utilisés pour la cartographie du génome entier. Les boîtes pleines indiquent les régions d'homozygotie. La figure 3 illustre l'analyse d'haplotype dans des familles d'origine ethnique variée co-ségrégeant au locus 11q13. Les individus ont été génotypes avec six marqueurs couvrant un intervalle d'environ 10cM. Pour chaque famille, l'origine ethnique est indiquée lorsqu'elle diffère du pays d'habitation. Dans la famille CGL-16, la lettre d comme génotype au marqueur CA10 correspond à une délétion.
La figure 4A illustre des délétions dans le gène cgll, homologue humain du gène murin <3ng3lg. Les onze exons ont été amplifiés sous la forme de sept fragments dans chaque membre de la famille consanguine CGL-16, y compris les enfants affectés (jumeaux monozygotes). La figure 4B illustre la distribution des mutations dans le gène cgll. Les mutations sont représentées selon leur type : large délétion (-), une mutation faux sens (O), mutation non sens (X), mutation dans le site d'épissage (I), mutation de changement de cadre de lecture due à une insertion ( ), délétion (*) ou délétion/insertion (0). La figure 5 illustre le profil d'expression du gène cgll. La figure 5A est un cliché autoradiographique montrant l'hybridation d'une sonde d'ADNc couvrant les exons 1 à 11 contre des gels d'ARNm poly(A)+(environ 2μg) de différents tissus, montrant l'existence de produits de transcription respectivement d'environ 2,4 kb et environ 1 ,8 kb et environ 2 kb.
La figure 5B présente des clichés d'autoradiographie montrant l'hybridation d'une sonde d'ADNc couvrant les exons 1 à 11 sur un gel contenant de l'ARN humain total (20μg) provenant des tissus sous- cutanés abdominales et viscérales, par comparaison aux tissus du cerveau, du coeur et du foie.
La figure 5C illustre la quantification des clichés d'autoradiographie obtenus après hybridation d'une sonde d'ADNc couvrant les exons 1 à 11 sur de l'ARN poly(A)+ de divers tissus. Les résultats montrent que les niveaux d'expression les plus forts étaient observés pour le cerveau et les testicules.
La figure 6 illustre un alignement des séquences de la protéine CGL1 avec respectivement la protéine Gng3lg de mus musculus et la protéine CG9904 de Drosophila melanogaster. Les résidus d'acides aminés conservés sont représentés dans les boîtes pleines. Les domaines transmembranaires putatifs sont soulignés.
DEFINITIONS GENERALES
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Par exemple un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et preferentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur. Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel de génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence. Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ",
" oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucleotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex. Le terme " nucleotide " désigne à la fois les nucléotides naturels
(A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1 ) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04 064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucleotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G. Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucléotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturel, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagenèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquences d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.
Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi résulter dans des substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre, des modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d'aminoacides.
De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent pour des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial.
Certains acides nucléiques variants coderont ainsi pour des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question.
On entendra par " fragment " un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à l'acide nucléique de référence.
Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucléotide plus grand duquel il est constitutif.
De tels fragments comprennent, ou alternativement consistent en, des oligonucléotides de longueur allant de 8, 10, 12, 15, 18, 20 à 25,
30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 ou 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention. Par " variant " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra principalement un polypeptide dont la séquence d'acides aminés contient une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'aminoacides peuvent être indifféremment conservatives ou non conservatives.
Preferentiellement, un « variant » d'un polypeptide selon l'invention possède une séquence d'acides aminés N-terminale identique au polypeptide de référence. Ainsi, des variants préférés du polypeptide CGL1 possèdent une séquence N-terminale débutant par la séquence d'acides aminés « Met-Val-Asn-Asp-Pro » ou « Met-Val-Asn-Asp-Pro-
Pro-Val-Pro-Ala ».
Par " fragment " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est plus courte que celle du polypeptide de référence et qui comprend sur toute la partie commune avec ces polypeptides de référence, une séquence en acides aminés identique.
De tels fragments peuvent, le cas échéant, être compris au sein d'un polypeptide plus grand duquel ils font partie. De tels fragments d'un polypeptide selon l'invention peuvent avoir une longueur de 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 100, 200 ou 300 acides aminés.
Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison, WISCONSIN. À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4.9 de mars 1996, BLAST 2.0.4 de février 1998 et BLAST 2.0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990 215 : 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25 : 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence " requête " de référence, à l'aide de l'algorithme d'AltschuI et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.
Par " conditions d'hybridation de forte stringence " au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes :
1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION :
- Mélanger : 40μl ADN sperme de saumon (10mg/ml) + 40 μl ADN placentaire humain (10mg/ml)
- Dénaturer 5 mn à 96CC, puis plonger dans la glace le mélange.
- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.
- Incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde marquée :
- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 μl ADN Cot l, selon la quantité de repeats.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95°C.
- Incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures.
3- HYBRIDATION : - Oter le mix de pré hybridation.
- Mélanger 40 μl ADN sperme de saumon + 40 μl ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace. - Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation.
4- Lavages :
- Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1% à 65°C.
- 2 fois 15 minutes à 65°C SSC 1X et SDS 0,1% à 65°C.
Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de F.AUSUBEL et al (1989). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont réalisé une cartographie d'association de marqueurs et une cartographie d'homozygotie chez des individus de neuf familles atteintes de CGL originaires de deux isolats géographiques distincts, respectivement du Liban et de Norvège, ce qui leur a permis d'isoler un des gènes causals du syndrome de lipodystrophie généralisée congénitale dans une petite région du locus chromosomique 11q13.
Les inventeurs ont réalisé une première étude d'association sur l'ensemble du génome dont les résultats ont montré que deux marqueurs adjacents, respectivement les marqueurs D11S4191 et D11S987 localisés sur le locus chromosomique 11q13 étaient homozygotes chez la plupart des patients. Une analyse d'association avec deux marqueurs additionnels, respectivement les marqueurs D11S1765 et D11S1883 localisés à l'intérieur de l'intervalle précité, ont confirmé les premières observations et révélé la présence d'allèles identiques chez dix huit patients des familles libanaises pour le marqueur D11S1883.
Les inventeurs ont alors caractérisé 25 marqueurs microsatellites additionnels, dont douze sont localisés entre le marqueur D11S4191 et D11S987. Une seconde étude d'association réalisée avec ces marqueurs a permis de déterminer que le locus portant le déterminant génétique causal de la CGL était localisé dans une région d'approximativement 2,5 Mb localisée entre les marqueurs D11S4076 et D11S480. Certains des patients inclus dans l'étude étaient homozygotes pour un allèle nul correspondant au marqueur CA10. Ce résultat a permis aux inventeurs d'identifier un gène causal de la lipodystrophie généralisée congénitale parmi les 27 gènes étudiés dans l'intervalle D11S4076-D11S480. Ce gène est contenu dans l'insert d'ADN d'un vecteur BAC désigné RP11-83H9 dont des séquences nucléotidiques partielles sont référencées dans la base de données GenBanK sous le numéro d'accès n°AP001458. Le gène causal de la CGL a été désigné « gène cgll » par les inventeurs.
Par séquençage du gène cgll chez des patients affectés de
CGL, les inventeurs ont identifié de nombreuses mutations induisant le codage de polypeptides CGL1 mutés, en particulier des polypeptides
CGL1 tronqués.
L'identification par les inventeurs du gène CGL1 , responsable du syndrome de lipodystrophie généralisée congénitale (CGL) leur permet de mettre au point des outils de détection du gène cgll normal et du gène cgll muté chez des patients, des outils d'expression du gène cgll normal afin de suppléer au défaut d'expression de ce gène chez les patients, de préférence des patients CGL, des moyens préventifs ou curatifs de la CGL ainsi que des outils de criblage de composés pharmaceutiquement efficaces pour prévenir ou traiter les différentes pathologies et preferentiellement les pathologies indiquées dans la section « SOMMAIRE » ci-dessus.
Ainsi, l'invention a tout d'abord pour objet un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID N°1 ou un fragment ou un variant du polypeptide CGL1. De manière générale, les acides nucléiques selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Acides nucléiques génomiques codant le polypeptide CGL1
Comme exposé précédemment, la séquence génomique du gène cgll est entièrement contenue dans l'insert d'ADN du vecteur BAC désigné RT11-831 H9 dont des séquences non-ordonnées ont été référencées sous le n° d'accès AP001458 de la base de données GenBank. Les inventeurs ont déterminé que le gène cgll comprend 11 exons et 10 introns. En se basant sur la numérotation en nucléotides de la séquence génomique n°AP001458 de GenBank, les séquences des différents exons du gène cgll ont été déterminées comme suit :
L'exon 1 , qui ne comporte pas de cadre de lecture ouvert, correspond à la séquence nucléotidique complémentaire de la séquence allant jusqu'au nucleotide en position 35294 de la séquence AP001458.
L'exon 2 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 161282 jusqu'au nucleotide en position 161598 de la séquence AP001458. La base A du codon d'initiation de la traduction est localisée en position 161387.
L'exon 3 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 158346 jusqu'au nucleotide en position 158427 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 4 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 153740 jusqu'au nucleotide en position 153597 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 5 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 66927 jusqu'au nucleotide en position 66793 de la séquence génomique AP001458. L'exon 6 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 66603 jusqu'au nucleotide en position 66506 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 7 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 65551 jusqu'au nucleotide en position 65410 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 8 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 65271 jusqu'au nucleotide en position 65,205 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 9 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 64997 jusqu'au nucleotide en position 64917 de la séquence génomique AP001458.
L'exon 10 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 64822 jusqu'au nucleotide en position 64742 de la séquence génomique AP001458. L'exon 11 est la séquence complémentaire de la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 64651 de la séquence génomique AP001458. La base A du codon TGA d'arrêt de la traduction du gène cgll localisée au nucleotide 64497 de la séquence génomique AP001458.
Le tableau 1 ci-après présente les séquences de jonction intron- exon du gène cgll.
TABLEAU 1
Jonctions intron-exon du gêne cgll
Exon Taille Site d'ëpissage 3' Site d'ëpissage 5"
(bp)
1 ND CAAAGAGGAGgtaggggcccttg
2 317 accctctctttccagGAACCACCAG TCTACTACAGg gagaggggcct
3 82 tccaatctcatttagGACCGACTGT ACGTGATCGGgtgagtatgggaa
4 144 ggctacctttggcagGTGCTGATGT TTCGCGTTCGgtaagtgttggtg
5. 135 tcccacccccggcagGTGATGCTGC AGAGAACTCGgtgagtgaggtga,
6 98 cccaccccctcacagTACGTGCCGA CTGGGCTCAGgtgaggggccaac
7 142 tacttcctgcctcagATACCTGCTA CTCTTTGCAGgtcgaaaggggca
8 61 gtttttcctccacagGTTAACATCC CATCAGCCAGgt aaggtgttgg
9 81 tctttggaggtgcagGGCCTGAAGG TCAGGGACAGgtatggcgcagcc
10 81 cccttttggctgcagAGGGTCAGCT GCCAGTGATGgtgaggggcatcc
11 >155 cctttcctggcccagGTTCAGGCTC
En se basant sur la numérotation en nucléotides d'une seconde séquence génomique, accessible dans la base de données GenBank sous le n° AC 090306 (gi 14595862, clone RP11683Hg), les séquences des différents exons du gène cgll ont été déterminées comme suit :
L'exon 1, qui ne comporte pas de cadre de lecture ouvert, correspond à la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 134 035 jusqu'au nucleotide en position 134 273 de la séquence AC 090306. L'exon 2 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 135 765 jusqu'au nucleotide en position 136 081 de la séquence AC 090306.
L'exon 3 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 138 833 jusqu'au nucleotide en position 138 914 de la séquence génomique AC 090306.
L'exon 4 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 146 670 jusqu'au nucleotide en position 146 813 de la séquence génomique AC 090306. L'exon 5 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 148 584 jusqu'au nucleotide en position 148 718 de la séquence génomique AC 090306.
L'exon 6 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 148 908 jusqu'au nucleotide en position 149 005 de la séquence génomique AC 090306.
L'exon 7 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 149 960 jusqu'au nucleotide en position 150 101 de la séquence génomique AC 090306.
L'exon 8 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 150 240 jusqu'au nucleotide en position 150 306 de la séquence génomique AC 090306.
L'exon 9 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 150 514 jusqu'au nucleotide en position 150 594 de la séquence génomique AC 090306. L'exon 10 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 150 689 jusqu'au nucleotide en position 150 769 de la séquence génomique AC 090306.
L'exon 1 1 est la séquence nucléotidique allant du nucleotide en position 150 860 jusqu'au nucleotide en position 151 106 de la séquence génomique AC 090306. Le marqueur de l'invention désigné « CA10 » est localisé du nucleotide en position 145 136 jusqu'au nucleotide en position 145 016 de la séquence génomique AC 090306.
Au vu de la description de l'ensemble des caractéristiques structurales du gène cgll, l'homme du métier est capable d'accéder à l'ensemble de l'acide nucléique génomique codant le gène cgll par des techniques de biologie moléculaire courantes. Notamment, le gène cgll peut être isolé par l'homme du métier à partir du vecteur BAC désigné RP11-83H9 et référencé sous le n° d'accès AP00 1458 et AC 090 306 de la base de donnée GenBanK.
Avantageusement, l'homme du métier peut à nouveau isoler l'acide nucléique génomique du gène cgll à partir d'un échantillon d'ADN humain, à l'aide de la paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID N°17 et SEQ ID N°18. L'invention est relative à un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 caractérisé en ce qu'il comprend le gène cgll contenu dans le vecteur BAC désigné RP-11-83H9 dont des séquences nucléotidiques partielles sont référencées dans la base de données GENBANK sous le n° d'accès n°AP001458 ou dont les séquences nucléotidiques sont référencées dans la base de données GenBanK sous le n°D4ACC7S AC 090 306.
AD Ne codant le polypeptide CGL1
L'ADNc codant le polypeptide CGL1 a été identifié par les inventeurs comme étant un acide nucléique présentant une identité complète avec l'acide nucléique référencé dans la base de données GenBanK sous le numéro d'accès n9AF052149, cette séquence étant également référencée comme la séquence SEQ ID N°14 du listage de séquences.
Dans la base de données GenBanK, la séquence n°AF052,149 est simplement identifiée comme provenant d'un ARN messager humain séquence au hasard à partir d'une banque d'ARNm humain. La référence AF052149 de GenBanK ne contient aucune information concernant l'existence d'un cadre de lecture ouvert dans la séquence décrite, ni a fortiori la position d'un éventuel cadre de lecture ouvert. En conséquence, aucune information n'est donnée sur un polypeptide qui pourrait être codé par cette séquence.
Il est montré selon l'invention que la séquence d'ADNc codant pour le polypeptide CGL1, référencé comme la séquence SEQ ID N°14 du listage de séquences, possède un cadre ouvert de lecture qui débute à la base A du codon ATG, en position 345 et se termine à la base A du codon TGA en position 1541 de la séquence SEQ ID N°14.
Le cadre de lecture ouvert de la séquence SEQ ID N°14 code pour le polypeptide CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID N°1.
L'invention est donc également relative à un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°14.
Elle a aussi pour objet un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 caractérisé en ce qu'il comprend le polynucléotide allant du nucleotide en position 345 jusqu'au nucleotide en position 1541 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°14.
Elle est aussi relative à toute utilisation d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 , d'un variant ou d'un fragment d'un tel acide nucléique en vue du diagnostic ou de la thérapie préventive ou curative d'une pathologie associée à une mutation ou à un défaut dans l'expression du gène codant le polypeptide CGL1 , en particulier une pathologie listée dans la section « SOMMAIRE », y inclus d'une lipodystrophie, preferentiellement d'une lipodystrophie congénitale généralisée (CGL1), ou d'un diabète de type 1 ou de type 2.
Acides nucléiques codant un variant du polypeptide CGL1
Comme déjà exposé précédemment dans la description, les inventeurs ont identifié de nombreuses mutations dans le gène cgll chez des patients atteints de lipodystrophie généralisée congénitale.
Les protéines mutées ou tronquées codées par le gène cgll portant différentes mutations sont décrites ci-après, en référence à la désignation des différentes mutations détectées. Mutation F63 fsX75
Le gène cgll affecté par cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°2. Le polypeptide de séquence SEQ ID N°2 possède une séquence en acides aminés tronquée par rapport au polypeptide CGL1 normale de séquence SEQ ID N°1 et possède en outre la séquence C-terminale « RDCAFLLQDRL » qui n'est pas retrouvée dans le polypeptide CGL1 normal, du fait d'un changement de cadre de lecture induit par la mutation.
Mutation F100fsX111
Le gène cgll portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°3. Le polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°3 est tronqué, par rapport au polypeptide CGL1 normal et possède la séquence C-terminale « KCMDSRIVLP » qui n'est pas retrouvée dans le polypeptide CGL1 normal, du fait d'un changement du cadre de lecture induit par la mutation.
Mutation F105 fsX112
Le gène cgll portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°4. Le polypeptide de séquence SEQ ID N°4 est tronqué par rapport au polypeptide CGL1 normal et possède la séquence C-terminale « SCYLRA » qui n'est pas retrouvée dans le peptide CGL1 normal, du fait d'un changement du cadre de lecture induit par la mutation.
Mutation F105fs X111
Le gène cgll portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°5, qui est tronqué par rapport au polypeptide CGL1 normal et qui possède une séquence C-terminale «CYLRA » qui n'est pas retrouvée dans le polypeptide CGL1 normal, du fait d'un changement de cadre de lecture induit par la mutation. Mutation F108 fsX113
Le gène cgll portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°6 qui est tronqué par rapport au polypeptide CGL1 normal et qui possède une séquence C-terminale «NLRA » qui n'est pas retrouvée dans le polypeptide CGL1 normal, du fait d'un changement de cadre de lecture induit par la mutation.
Mutation R138X
Le gène cgll portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°7 dont la séquence en acides aminés est tronquée par rapport au polypeptide CGL1 normal.
Mutation « excision de l'exon 4 »
Le gène cgll portant cette mutation code pour un polypeptide comprenant une délétion d'acides aminés et code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°8. Plus spécifiquement, il s'agit d'une mutation de la première base du site d'épissage alternatif de l'intron 4, qui induit l'excision de l'exon 4. L'excision de l'exon 4 provoque la délétion de 48 acides aminés, avec conservation du cadre de lecture.
Mutation A 212P Le gène cgll portant la mutation A 212P code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°9, résultant d'une mutation «faux sens » dans l'exon 6 induisant la substitution du résidu alanine en position 212 par un résidu praline.
Mutation F 213fsX232
Le gène cgll portant cette mutation code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°10 qui est tronqué par rapport au polypeptide CGL1 normal et qui possède une séquence C-terminale « TSASTRTSLGSDTCY TTSR » qui n'est pas retrouvée dans le polypeptide CGL1 normal, du fait d'un changement du cadre de lecture.
Les variants du polypeptide CGL1 de séquences SEQ ID N°2 à SEQ ID N°10 font partie de l'invention. Font également partie de l'invention les acides nucléiques codant pour les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N°2 à SEQ ID N°10, ainsi que leurs séquences complémentaires.
Le tableau 2 ci-après résume les différentes mutations du gène cgll retrouvées par les inventeurs.
Fragments du polypeptide CGL1
Font aussi partie de l'invention des « fragments » du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1. Les fragments du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1 ont de préférence une longueur d'au moins 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 2550, 300,
350 ou 380 acides aminés.
Les fragments du polypeptide CGL1 sont utiles notamment pour la préparation d'anticorps dirigés spécifiquement contre cette protéine. Les fragments du polypeptide CGL1 préférés sont les polypeptides de séquences en acides aminés respectivement SEQ ID N°11 , SEQ ID N°12 et SEQ ID N°13.
L'invention a également pour objet un acide nucléique codant pour un fragment du polypeptide CGL1 tel que défini ci-dessus.
SONDES ET AMORCES NUCLEOTIDIQUES
L'invention est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1 pour la fabrication d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique spécifique du gène cgll.
L'invention a également trait à l'utilisation d'un acide nucléique codant un variant du polypeptide CGL1 pour la fabrication d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique spécifique du gène cgll muté. L'invention a également pour objet une sonde ou une amorce nucléotidique hybridant, dans des conditions de forte stringence définie dans la présente description, spécifiquement avec le gène cgll muté.
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention sont preferentiellement celles caractérisées en ce qu'elles hybrident spécifiquement avec un acide nucléique codant pour l'un des polypeptides de séquences SEQ ID N°2 à SEQ ID N°10, ces polypeptides étant codés par le gène cgll muté.
De manière tout à fait préférée, les sondes et les amorces nucléotidiques hybrident spécifiquement avec le gène cgll portant une mutation choisie parmi les mutations F63fsX75, F100fsX1 11 ,
F105fsX1 12, F105fsX111 , F108fsX113, R138X, A212P, F213fsX232, del/ins E5-6 et del E-6, représentées dans le tableau 2.
Font aussi partie de l'invention des sondes et des amorces qui hybrident avec un acide nucléique non muté codant le polypeptide CGL1 , mais n'hybrident pas, dans les conditions d'hybridation spécifiées, avec un acide nucléique portant l'une des mutations ci-dessus.
L'invention a également trait à un couple d'amorces nucléotidiques pour la détection d'une mutation dans le gène cgll, caractérisé en ce qu'il s'agit du couple d'amorces comprenant les séquences nucléotidiques SEQ ID N°15 et SEQ ID N°16 qui définissent le marqueur microsatellite CA10.
Un second couple d'amorces selon l'invention comprend les amorces de séquences SEQ ID N°17 et SEQ ID N°18. Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EU NΕP 0 707
592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodeoxyuridine, fluorescéine , acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine. Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n° FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (1988) ou Sanchez-pescador et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al. (1991 ) ou encore dans le brevet européen n° EP-0 225 807 (CHIRON).
Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou encore dans des hybridations à l'ARN messager correspondant lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
La présente invention concerne aussi un procédé pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus avec l'échantillon à tester; b) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection d'une mutation dans le gène cgll, caractérisé en ce qu'il comprend: a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que définies ci- dessus; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support. Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques capables de détecter des mutations distinctes dans le gène cgll. Les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les « puces à ADN ». De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet us N°5,143,854 et dans les demandes PCT N°WO 90/15070 net 92/192. Des matrices support sur lesquelles les sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N°5,412,087 et dans la demande PCT N°WO 95/11 995.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention sont preferentiellement utilisées pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, et donc amplifié sélectivement tout ou partie d'un acide nucléique portant une mutation du gène cgll.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon à tester avec une ou plusieurs amorces nucléotidiques telles que définies ci-dessus; b) détecter les acides nucléiques amplifiés.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend: a) une ou plusieurs amorces nucléotidiques telles que définies ci-dessus; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention sont particulièrement utiles dans le cadre de procédé et de génotypage de sujets et/ou de génotypages de populations, notamment dans le cadre d'études d'association entre les formes alléliques particulières ou des formes de groupes d'allèles particulières de génotypage de sujets et/ou de génotypages de populations, notamment dans le cadre d'études d'association entre les formes alléliques particulières ou des formes de groupes d'allèles particulières (haplotypes) chez des sujets atteints de CGL et l'existence d'un phénotype (caractère) particulier chez ces sujets, par exemple la prédisposition de ces sujets à développer des pathologies liées à une dystrophie généralisée, un diabète ou l'obésité.
Les sondes et amorces nucléotidiques selon l'invention sont utiles aussi en tant que moyens de détection en vue d'un diagnostic de pathologies liées à CGL1 notamment les pathologies listées dans la partie « SOMMAIRE » de la présente description, y inclus le diabète lipoatrophique, notamment dans le cadre d'un diagnostic prénatal.
VECTEURS RECOMBINANTS
L'invention serait également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID N°1 ou un fragment ou un variant du polypeptide CGL1.
Avantageusement, un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant un variant du polypeptide CGL1 comprendra un acide nucléique codant pour un polypeptide choisi parmi les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N°2 à SEQ ID N°10.
Avantageusement, un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant un fragment du polypeptide CGL1 comprendra un acide nucléique codant un polypeptide choisi parmi les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N°11 à SEQ ID N°13.
Selon un premier mode de réalisation préféré, l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 comprend le gène cgll contenu dans le vecteur BAC désigné RP11-831H9 dont des séquences nucléotidiques partielles sont référencées dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accès n°AP001458. Selon un deuxième mode de réalisation préféré, l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 est un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID N°14.
Selon un troisième mode de réalisation préféré, l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 comprend le polynucléotide allant du nucleotide en position 345 jusqu'au nucleotide en position 1541 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°14.
Par " vecteur " au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.
Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique conforme à l'invention, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants :
(1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des séquences activatrices (" enhancers ") ;
(2) la séquence codante comprise dans l'acide nucléique conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits aux (1) ; et
(3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées. En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection. A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lad, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.
Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996). Lorsque l'expression de la séquence génomique du gène cgll sera désirée, on aura preferentiellement recours à des vecteurs capables d'inclure de grandes séquences d'insertion. Dans ce mode de réalisation particulier, on utilisera de préférence des vecteurs de bactériophages, tels que les vecteurs de bactériophage P1 comme le vecteur p158 ou encore le vecteur p158/neo8 décrits par Sternberg (1992, 1994).
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322(ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, ETATS-UNIS). On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N°CRL 1711) dérivées de Spodoptera frugiperda.
Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5. Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno-associés sont par exemple décrits par Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), ou encore McLaughlin BA et al. (1996).
Pour permettre l'expression des polynucléotides selon l'invention, ces derniers doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires. On peut aussi réaliser l'introduction des polynucléotides selon l'invention in vivo, pour la prévention ou le traitement de pathologies associées à la lipodystrophie, au diabète ou à une obésité, telles que les pathologies listées dans la section « SOMMAIRE » de la présente description. Pour introduire les polynucléotides ou les vecteurs dans une cellule hôte, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à différentes techniques, comme la technique de précipitation au phosphate de calcium (Graham et al., 1973 ; Chen et al., 1987), le DEAE Dextran (Gopal, 1985), l'électroporation (Tur-Kaspa, 1896 ; Potter et al., 1984), la microinjection directe (Hariand et al., 1985), Les liposomes chargés en ADN (Nicolau et al., 1982, Fraley et al., 1979).
Vecteurs utiles dans la mise en oeuyre de procédés de thérapie génique. Une fois que le polynucléotide a été introduit dans la cellule hôte, il peut être intégré de manière stable dans le génome de la cellule. L'intégration peut être réalisée à un endroit précis du génome, par recombinaison homologue, ou peut être intégré au hasard. Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide peut être maintenu de manière stable dans la cellule hôte sous la forme d'un fragment d'épisome, l'épisome comprenant des séquences permettant le maintien et la réplication de ce dernier, soit de manière indépendante, soit de manière synchronisée avec le cycle cellulaire. Selon un mode de réalisation particulier, une méthode pour introduire un polynucléotide selon l'invention dans une cellule hôte, en particulier une cellule hôte provenant d'un mammifère, in vivo, comprend une étape au cours de laquelle on introduit une préparation comprenant un vecteur pharmaceutiquement compatible et un polynucléotide " nu " selon l'invention, placé sous le contrôle de séquences de régulation appropriées, par injection locale au niveau du tissus choisi, par exemple un tissu musculaire lisse, le polynucléotide " nu " étant absorbé par les cellules de ce tissu.
Des compositions pour l'utilisation in vitro et in vivo comprenant des polynucléotides " nus " sont par exemples décrites dans la demande PCT N° WO 95/11307 (Institut Pasteur, Inserm, Université d'Ottawa) ainsi que dans les articles de Tacson et al. (1996) et de Huygen et al. (1996) .
Selon un mode de réalisation spécifique de l'invention, il est fourni une composition pour la production in vivo du polypeptide CGL1.
Cette composition comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide CGL1 placé sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, en solution dans un vecteur physiologiquement acceptable.
La quantité de vecteur qui est injecté à l'organisme hôte choisi varie selon le site de l'injection. A titre indicatif, il peut être injecté entre environ 0,1 et environ 100 μg du polynucléotide codant le polypeptide CGL1 dans le corps d'un animal, de préférence d'un patient susceptible de développer une lipodystrophie, un diabète ou une obésité, en particulier un syndrome CGL, ou ayant déjà développé cette maladie.
L'invention a en outre pour objet l'utilisation d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 ou l'utilisation d'un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, et preferentiellement d'une lipodystrophie généralisée congénitale (CGL), ou encore du syndrome de Lawrence ou de l'obésité. L'invention est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 ou l'utilisation d'un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un diabète, d'une obésité, ou du syndrome d'insulino-résistance. L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, preferentiellement d'une lipodystrophie généralisée congénitale (CGL), ou encore du syndrome de Lawrence ou de l'obésité, comprenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 , ou comprenant un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'un diabète ou d'un syndrome d'insulino-résistance, comprenant un acide nucléique codant le polypeptide. CGL1 , ou comprenant un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Vecteurs utiles dans des procédés de thérapie génique somatique et compositions contenant de tels vecteurs La présente invention concerne aussi une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies listées dans la partie « SOMMAIRE », en particulier les pathologies associées à la lipodystrophie, au diabète ou à l'obésité. Elle propose une solution avantageuse aux inconvénients de l'art antérieur, en démontrant la possibilité de traiter les pathologies associées à la lipodystrophie ou au diabète, en particulier la lipodystrophie généralisée congénitale (CGL) par la thérapie génique, par le transfert et l'expression in vivo d'un gène codant pour le polypeptide CGLL
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Feigner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
La présente invention est donc également relative à une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies associées à une mutation ou un déficit dans l'expression du gène CGL1, preferentiellement des pathologies listées dans la partie « SOMMAIRE » de la présente description, plus particulièrement les pathologies associées au CGL, consistant à transférer et à exprimer in vivo des gènes codant pour CGL1.
La présente invention résulte également de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression d'un acide nucléique codant le polypeptide CGLL En particulier, la présente invention montre que l'utilisation d'adénovirus recombinants comme vecteurs permet d'obtenir des niveaux d'expression suffisamment élevés de ce gène pour produire l'effet thérapeutique recherché. D'autres vecteurs viraux tels que les rétrovirus ou les virus adéno-associés (AAV) permettant une expression stable du gène sont aussi des objets de l'invention. La présente invention offre ainsi une nouvelle approche pour le traitement et la prévention notamment des pathologies associées à une lipodystrophie ou un diabète.
L'invention a donc aussi pour objet un virus recombinant défectif comprenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 impliqué dans le syndrome CGL.
L'invention a également trait à l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies présentant une lipodystrophie, un diabète, le syndrome de Lawrence, l'obésité, le syndrome d'insulino-résistance.
La présente invention concerne également l'utilisation de cellules modifiées génétiquement ex vivo par un virus tel que décrit ci-dessus, ou de cellules productrices de tels virus, implantées dans l'organisme, permettant une expression in vivo prolongée et efficace du polypeptide CGLL Selon l'invention, on peut incorporer une séquence d'ADN codant pour le polypeptide CGL1 dans un vecteur viral, et que ces vecteurs permettent d'exprimer efficacement une forme mature, biologiquement active. Plus particulièrement, l'invention montre que l'expression in vivo du polypeptide CGL1 peut être obtenue par administration directe d'un adénovirus ou par implantation d'une cellule productrice ou génétiquement modifiée par un adénovirus ou par un rétrovirus incorporant un tel ADN. La présente invention est particulièrement avantageuse car elle permet d'induire une expression contrôlée et sans effet nocif de CGL1 dans des organes qui ne sont pas normalement concernés par l'expression de cette protéine. En particulier, une libération significative du polypeptide CGL1 est obtenue par implantation de cellules productrices de vecteurs de l'invention, ou infectées ex vivo par des vecteurs de l'invention.
L'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), un ARN (dans le cas des rétrovirus) ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, l'utilisation d'un ADNg permet une meilleure expression dans les cellules humaines. Pour permettre leur incorporation dans un vecteur viral selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mutagenèse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des expressions importantes. Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une séquence nucléique codant pour un polypeptide CGL1 humain.
Selon d'autres modes de réalisation, l'acide nucléique codant un polypeptide codé par un gène orthologue au gène cgll peut être originaire d'un autre mammifère, par exemple de la souris. On utilisera dans ce dernier cas preferentiellement les acides nucléiques décrits dans la base de données GenBank sous les numéros d'accès AF069954, AB041588 et AB030196 ou la séquence génomique.
Par ailleurs, il est également possible d'utiliser une construction codant pour un dérivé du polypeptide CGLL Un dérivé du polypeptide CGL1 comprend par exemple toute séquence obtenue par mutation, délétion et/ou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un produit conservant l'activité préventive ou curative du CGL. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci- après).
Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement de nouvelles propriétés biologiques. Les dérivés incluent également les séquences d'ADN modifiées permettant une expression améliorée in vivo.
Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le polypeptide CGL1.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg.
Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Preferentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus, des virus adéno-associés (AAV), des virus de l'herpès (HSV) ou des rétrovirus. Il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus, pour une administration directe ou pour la modification ex vivo de cellules destinées à être implantées, ou un rétrovirus, pour l'implantation de cellules productrices. Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence nucléique codant le polypeptide CGLL Preferentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus preferentiellement un adénovirus CAV2 [souche Manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Preferentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour le polypeptide CGLL Avantageusement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est rendue non fonctionnelle. Encore plus preferentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagenes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en œuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4 et la séquence codant pour le polypeptide CGL1 est insérée au niveau de la région E1 inactivée. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans la région E1 au niveau de laquelle sont insérées la région E4 et la séquence codant pour le polypeptide CGL1 (Demande de brevet Français FR94 13355). Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991 ) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à
ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Toutefois, aucun de ces documents ne décrit ni ne suggère l'utilisation d'un AAV recombinant pour le transfert et l'expression in vivo ou ex vivo du polypeptide CGL1 , ni les avantages d'un tel transfert. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant le polypeptide CGL1 bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bemstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc.
En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant le polypeptide CGL1 selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4.861.719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. Les résultats donnés ci-après démontrent en effet les propriétés particulièrement intéressantes des adénovirus pour l'expression in vivo d'une protéine ayant une activité de transport de cholestérol. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale. Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en œuvre de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux contenant la séquence codant le polypeptide CGL1 , pour une implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont notamment les cellules PA317 (US4.861.719), PsiCrip (WO90/02806) et GP+envAm-12 (US5,278,056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant le polypeptide CGL1 selon l'invention. Par exemple des cellules souches totipotente, précurseurs des lignées cellulaires sanguines, peuvent être prélevées et isolées chez le sujet. Ces cellules mises ne culture peuvent être alors transfectées par le vecteur rétroviral contenant la séquence codant le polypeptide CGL1 sous le contrôle de promoteurs viraux, non viraux, non viraux et spécifiques des macrophages ou encore sous le contrôle de son propre promoteur.
Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant le polypeptide CGL1 est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules infectées. Il peut s'agir de signaux d'expression homologues ou hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression du polypeptide CGLL II peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon inductible ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes E1A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, -actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofilaments, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CFTR, facteur VIII, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (pyruvate kinase, villine, promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, promoteur de l'actine α des cellules du muscle lisse, promoteurs spécifiques pour le foie ; Apo Al, Apo AH, Albumine humaine etc) ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc,). En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Dans un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence nucléique codant pour le polypeptide CGL1 sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi le LTR-RSV ou le promoteur précoce du CMV.
Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des pathologies présentant une lipodystrophie ou un diabète.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection intraveineuse, telle que par exemple dans la veine porte du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la veine porte du patient est avantageuse car elle permet de cibler l'infection au niveau du foie et ainsi, de concentrer l'effet thérapeutique au niveau de cet organe. Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et 10^4 pfu/ml, et de préférence 10^ à 1θ 0 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectée par ces virus. Il peut s'agir en particulier de cellules d'origine sanguine (cellules souche totipotente ou précurseurs), fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules musculaires lisses et endothéliales, cellules gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les virus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
Les cellules en culture sont ensuite infectées par les virus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire le polypeptide CGL1. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro. Pour l'infection par des rétrovirus, il est également possible de co- cultiver les cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus recombinants selon l'invention. Ceci permet de s'affranchir de la purification des rétrovirus.
Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules de mammifères infectées par un ou plusieurs virus récombinants défectifs telles que décrites ci-dessus ou des cellules productrices de virus recombinants, et une matrice extracellulaire. Preferentiellement, les implants selon l'invention comprennent 10^ à 10 0 cellules. Plus preferentiellement, ils en comprennent 106 à 108.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules. Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus preferentiellement, on utilise du collagène de type I.
Comme indiqué ci avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entraînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies associées au CGL, telles que la lipodystrophie ou un diabète.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
CELLULES HOTES RECOMBINANTES
L'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle est transfectée ou transformée par un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide CGL1, ou encore par un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide CGLL Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont par exemple les suivantes : a) cellules hôtes procaryotes: souches d'Escherichia coli (souche DH5-α), de Bacillus subtilis, de Salmonella typhimurium, ou encore des souches d'espèces telles que Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococus ; b) cellules hôtes eucaryotes: cellules HeLa (ATCC N°CCL2), cellules Cv 1 (ATCC N°CCL70), cellules COS (ATCC N°CRL 1650), cellules Sf-9 (ATCC N°CRL 1711), cellules CHO (ATCC N°CCL-61) ou encore cellules 3T3 (ATCC N°CRL-6361). On peut aussi utiliser selon l'invention des ce'llules hypophysaires, des cellules du système nerveux central, telles que les cellules neuronales ou encore des cellules pré-adipocytaires.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, preferentiellement d'une lipodystrophie généralisée congénitale (CGL).
L'invention concerne aussi l'utilisation d'une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un diabète.
L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, preferentiellement d'une lipodystrophie généralisée congénitale (CGL) comprenant une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles. Elle a également trait à une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'un diabète comprenant une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
POLYPEPTIDES SELON L'INVENTION
L'invention a encore pour objet le polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1. Elle est également relative à un fragment du polypeptide CGL1 tel que décrit précédemment dans la description.
Elle concerne aussi un variant du polypeptide CGL1 tel que décrit précédemment dans la présente description.
Les variants préférés du polypeptide CGL1 selon l'invention sont les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N°2 à SEQ ID N°10.
L'invention a également pour objet un polypeptide possédant au moins 90%, avantageusement au moins 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% ou au moins 99,5% d'identité en acides aminés avec le polypeptide CGL1 ou encore avec un fragment ou un variant du polypeptide CGL1.
Les fragments préférés du polypeptide CGL1 sont les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N°11 à SEQ ID N°13. L'invention a également trait à l'utilisation du polypeptide CGL1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, preferentiellement d'une lipodystrophie généralisée congénitale (CGL).
Elle est également relative à l'utilisation du polypeptide CGL1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un diabète. L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une pathologie liée à une mutation ou un défaut d'expression du gène codant le polypeptide CGL1 , de préférence une pathologie listée dans la partie « SOMMAIRE » de la présente description, y inclus d'une lipodystrophie, preferentiellement d'une lipodystrophie généralisée congénitale (CGL), du syndrome de Lawrence ou de l'obésité comprenant un polypeptide CGL1 en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles. L'invention a également trait à une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'un diabète ou du syndrome d'insulino-résistance comprenant un polypeptide CGL1 en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
De manière générale, les acides nucléiques selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Les compositions pharmaceutiques ci-dessus comprennent une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide CGL1 , en particulier du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1.
De telles compositions pharmaceutiques sont avantageusement adaptées pour l'administration, par exemple par voie parentérale, d'une quantité de polypeptide CGL1 allant de 1 μg/kg/jour à 10mg/kg/jour, de préférence au moins 0,01 mg/kg/jour et de manière tout à fait préférée entre 0,01 et 1 mg/kg/jour.
L'invention est également relative à un procédé pour la production d'un polypeptide CGL1 ou d'un fragment du polypeptide CGL1 ou encore d'un variant de ce dernier, ladite méthode comprenant les étapes de : a) insérer un acide nucléique codant pour ledit polypeptide dans un vecteur approprié; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur recombinant de l'étape a); c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lyser la cellule hôte, par exemple par sonication ou par choc osmotique; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des lysats cellulaires obtenus à l'étape c) ledit polypeptide; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit. Les peptides selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ce polypeptide ou contre un fragment ou un variant de ce dernier ont été préalablement immobilisés.
Selon un autre aspect, un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (1989).
Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique ou en solution homogène décrite par Houben Weyl (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par Merrifield (1965a; 1965b). Font également partie de l'invention des polypeptides dits
" homologues " à l'un quelconque des polypeptides de séquences d'acides aminés SEQ ID NO 1 à 13, ou de leurs fragments ou variants.
De tels polypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, par rapport aux polypeptides de référence. On entendra par acide aminé équivalent selon la présente invention, par exemple remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, la synthèse de peptide contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par Koch (1977).
Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acide, basique, non polaire ou encore polaire non chargé.
Font également partis de l'invention des polypeptides comprenant au moins une liaison non peptidique telle qu'une liaison rétro-inverso (NHCO), une liaison carba (CH2CH2) ou encore une liaison cétométhylène (CO-CH2). De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conserveront leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides non modifiés.
ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE POLYPEPTIDE CGL1 DE SEQUENCE SEQ ID N°1
Les fragments du polypeptide CGL1 , en particulier les polypeptides de séquences SEQ ID N°11 à SEQ ID N°13, ainsi que les variants du polypeptide CGL1 , plus particulièrement les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N°2 à SEQ ID N°10, ainsi que les peptides homologues peuvent être utilisés pour la préparation d'anticorps, notamment en vue de détecter la production de forme normale ou au contraire de forme mutée du polypeptide CGL1 chez un patient. Pour détecter la présence du polypeptide CGL1 normale, des anticorps préférés sont selon l'invention sont les anticorps dirigés contre les polypeptides de séquences SEQ ID N°11 à SEQ ID N°13.
Pour détecter la présence d'un polypeptide CGL1 muté, les anticorps préférés sont les anticorps dirigés contre les polypeptides de séquences SEQ ID N°2 à SEQ ID N°10.
De manière tout à fait préférée, les anticorps destinés à détecter la présence d'un polypeptide CGL1 muté sont des anticorps dirigés contre les régions mutées du polypeptide CGL1 , telles que décrites en détail précédemment dans la description, et plus spécifiquement les régions C-terminales des peptides CGL1 mutés qui ne sont pas retrouvées dans le polypeptide CGL1 normal.
Selon un autre aspect, les anticorps selon l'invention sont utilisés pour: - localisation tissulaire et cellulaire de la protéine CGL1
(comparaison entre cellules d'un contrôle (protéine normale) et des patients (protéine mutée);
- déterminer le rôle physiologique de la protéine, ses mécanismes d'activation ou d'inactivation et ses partenaires naturels. Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F (ab)'2, Fab) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention . Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein (1975).
La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tels que produits dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par Kozbor et al. (1983). L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N° 4,946,778 ou encore par Martineau et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages Ridder et al., (1995) ou encore des anticorps humanisés Reinmann et al. (1997); Léger et al., (1997).
Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'antigènes présents dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non-isotopique, par exemple fluorescent ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. L'invention a également pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide CGL1 normal ou muté dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: a) à mettre en contact un anticorps tel que défini ci-dessus avec l'échantillon à tester; b) détecter les complexes polypeptides-anticorps éventuellement formés.
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit pour la détection d'un polypeptide CGL1 normal ou muté dans un échantillon, ledit nécessaire ou kit comprenant: a) un anticorps tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes polypeptides-anticorps éventuellement formés.
COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES ET METHODES DE TRAITEMENT THERAPEUTIQUE. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, d'un vecteur recombinant contenant un tel acide nucléique ou d'une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une pathologie liée à une mutation ou à un défaut dans l'expression du gène codant le polypeptide CGL1, preferentiellement d'une pathologie listée dans la partie « SOMMAIRE » de la présente description, y inclus d'une lipodystrophie ou d'un diabète, ainsi qu'à des compositions pharmaceutiques contenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 , un vecteur recombinant contenant un tel acide nucléique ou encore une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
L'invention a aussi trait à l'utilisation du polypeptide CGL1 ou d'un fragment du polypeptide CGL1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention, ou au traitement d'une pathologie liée à une mutation ou à un défaut dans l'expression du gène codant le polypeptide CGL1, preferentiellement d'une pathologie listée dans la partie « SOMMAIRE » de la présente description, y inclus d'une lipodystrophie ou d'un diabète ainsi qu'à des compositions pharmaceutiques comprenant un polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide CGL1, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Les utilisations et compositions pharmaceutiques ci-dessus sont décrites en détail précédemment dans la présente description.
Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique préventive ou curative de maladies associées à la lipodystrophie, preferentiellement à la lipodystrophie généralisée congénitale (CGL), une telle méthode comprenant une étape au cours de laquelle est administré à un patient un acide nucléique capable de modifier l'expression du polypeptide CGL1 chez ledit patient, ledit acide nucléique étant, le cas échéant, associé à un ou plusieurs véhicules et/ou excipients physiologiquement compatibles.
De préférence, on administrera au patient une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique, tel que défini dans la présente description.
Selon encore un autre aspect, l'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique préventive ou curative de maladies associées à la lipodystrophie, preferentiellement à la lipodystrophie généralisée ou congénitale (CGL), ou à un diabète, une telle méthode comprenant une étape au cours de laquelle est administrée à un patient une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide CGL1 chez ledit patient, ledit polypeptide étant, le cas échéant, associé à un ou plusieurs véhicules et/ou excipients physiologiquement compatibles.
METHODES DE CRIBLAGE DE COMPOSES CANDIDATS D'INTERET THERAPEUTIQUE
La démonstration selon l'invention du fait que le gène cgll est un gène causal de la CGL rend possible la mise au point de méthodes de criblage de composés candidats d'intérêt thérapeutique pour prévenir ou traiter une pathologie liée à une mutation ou à un défaut dans l'expression du gène codant le polypeptide CGL1 , y inclus une lipodystrophie en particulier la CGL ou un diabète.
Procédé de criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1
En tant que polypeptide impliqué dans le développement de lipodystrophie, en particulier de lipodystrophie généralisée congénitale
(CGL) ou d'un diabète, le polypeptide CGL1 constitue un polypeptide cible de composés d'intérêt thérapeutique préventif ou curatif de pathologies associées au CGL.
De tels composés candidats d'intérêt thérapeutique se comportent donc comme des « ligands » du polypeptide CGL1. Au sens de l'invention, un « ligand » signifie une molécule, telle qu'une protéine, un peptide, un anticorps ou tout composé chimique synthétique capable de se fixer sur le polypeptide CGL1 ou l'un de ses fragments.
Dans un procédé de criblage de composés candidats conformes à l'invention, un échantillon biologique ou une molécule structuralement définie à tester est mise en contact avec le polypeptide CGL1 purifié, par exemple le polypeptide CGL1 recombinant purifié produit par une cellule hôte recombinante telle que définie dans la présente description, afin de former un complexe entre le polypeptide CGL1 ou un fragment de celui-ci et le ligand putatif que constitue le composé candidat à tester.
A titre illustratif, afin d'étudier l'interaction entre le polypeptide CGL1 ou un fragment de ce dernier avec des composés candidats, telles que des molécules obtenues grâce à des procédés de chimie combinatoire, on utilisera des techniques de microdialyse couplées à l'HPLC décrites par WANG et al. (1997) ou la technique d'électrophorèse capillaire décrite par BUSH et al. (1997).
Dans d'autres méthodes, des composés candidats, qui peuvent être des peptides, des acides gras, des lipoprotéines ou des petites molécules qui interagissent avec le polypeptide CGL1, ou un fragment de ce polypeptide, peuvent être identifiées en mettant en oeuvre des tests dans lesquels le composé candidat à tester est marqué à l'aide d'un marqueur détectable, tel qu'un marqueur fluorescent, radioactif ou enzymatique, puis mis en contact avec le polypeptide CGL1 immobilisé, ou un fragment de ce dernier, dans des conditions permettant la fixation spécifique du composé candidat sur le polypeptide CGLL Après élimination des molécules liées de manière non spécifique, les molécules fixées sont détectées à l'aide de moyens de détection appropriés.
Des composés candidats interagissant avec le polypeptide
CGL1 ou un fragment de ce dernier peuvent aussi être criblés en utilisant des techniques mettant en oeuvre un biocapteur optique tel que celles décrites par Edwards et Leatherbarrow (1997) ou encore par SZABO et al. (1995).
On peut aussi utiliser des systèmes de criblage de type double hybride tels que ceux décrits par FIELDS & SONG (1989) ou encore dans les brevets US N°5,667,973 et US N°5,283, 173 (FIELDS et al.).
Des procédés de criblage par des techniques de double hybride peuvent être également réalisés à l'aide des techniques décrites par HARPER et al. (1993) ou encore par CHO et al. (1998) ou FROMONT- RACINE et al. (1997). L'invention a donc également pour objet un procédé de criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1 ou avec un fragment du polypeptide CGL1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mettre en contact le composé candidat avec le polypeptide CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1 ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1 , d'une part, et le composé candidat, d'autre part.
L'invention a également trait à un nécessaire ou kit pour le criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1 ou avec un fragment du polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend: a) un polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide CGL1 ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes éventuellement formés entre le polypeptide CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1, d'une part, et le composé candidat, d'autre part.
Procédé de criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgll.
Un autre objet de l'invention consiste en un procédé pour le criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgll, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) cultiver une cellule hôte exprimant, de manière naturelle ou après recombinaison génétique, le gène cgll; b) mettre en contact la cellule hôte cultivée à l'étape a) avec un composé candidat à tester: c) déterminer la capacité du composé candidat à moduler l'expression du gène cgll par la cellule hôte.
De manière préférée, l'étape c) consiste en une étape de quantification de l'expression du gène cgll par la cellule hôte.
La quantification de l'expression du gène cgll peut être réalisée indifféremment par quantification de l'ARN messager cgll produit ou par quantification du polypeptide de CGL1 produit.
Dans ce dernier cas, on peut utiliser des anticorps tels que définis précédemment dans la description afin de quantifier les quantités de polypeptides CGL1 qui ont été produites, par exemple à l'aide d'un test immunoenzymatique ou par immunoradioactivité. Dans un mode de réalisation préféré, la quantification de l'ARNm produit et réalisée par amplification PCR quantitative de l'ADNc obtenu après transcription inverse de l'ARNm total de la cellule hôte cultivée, en utilisant une paire d'amorces spécifiques du gène cgll.
La présente invention concerne aussi un procédé pour cribler des composés candidats capables d'augmenter, ou au contraire de diminuer, le niveau d'expression du gène cgll . Un tel procédé permet à l'homme du métier de sélectionner des composés exerçant un effet régulateur sur le niveau d'expression du gène cgll, composé potentiellement utile comme principe actif dans des compositions pharmaceutiques pour traiter des patients prédisposés ou atteints d'une lipodystrophie, preferentiellement d'une lipodystrophie généralisée ou congénitale (CGL) ou d'un diabète.
L'analyse quantitative de l'expression du gène cgll peut être réalisée en utilisant des matrices ou « puces à ADN » qui peuvent contenir une pluralité d'acides nucléiques dérivés du gène cgll ou de l'ADNc correspondant.
Par exemple, l'analyse quantitative de l'expression du gène cgll peut être réalisée à l'aide d'une puces à ADN telle que celle décrite par SCHENA et al. (1995 et 1996).
L'invention a également pour objet un nécessaire ou kit pour le criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgll, .caractérisé en ce qu'il comprend: a) une cellule hôte exprimant, de manière naturelle ou après recombinaison génétique, le gène cgll ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détermination de la capacité du composé candidat à moduler l'expression du gène cgll candidat à moduler l'expression du gène cgll par la cellule hôte.
Dans un mode de réalisation préféré du nécessaire ou kit ci- dessus, celui-ci est caractérisé en ce que les moyens nécessaires à la détermination de la capacité du composé candidat à moduler l'expression du gène cgll par la cellule hôte sont une ou des sondes spécifiques du gène cgll, plus spécifiquement les sondes telles que définies précédemment dans la description.
Procédé de criblage in vivo L'invention est également relative à deux types de modèles d'animaux transgéniques, respectivement un modèle d'inactivation du gène orthologue à cgll chez l'animal, et un modèle permettant une surexpression contrôlée du gène cgll chez l'animal. Ces deux modèles d'animaux transgéniques sont utiles notamment pour le criblage de composés candidats d'intérêt thérapeutique.
Selon un autre aspect de l'invention, des composés candidats modulant l'expression d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 selon l'invention peuvent être identifiés in vivo, dans des animaux transgéniques non humains.
De manière tout à fait préférée, un composé candidat d'intérêt selon l'invention consiste en un composé qui augmente le niveau d'expression d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1.
Par " animal transgénique " au sens de l'invention, on entend un animal non humain, de préférence un mammifère, dans lequel une ou plusieurs cellules contiennent un acide nucléique hétérologue introduit grâce à l'intervention humaine, tel que par des techniques de transgénèse bien connues de l'homme du métier. L'acide nucléique hétérologue est introduit directement ou indirectement dans la cellule ou le précurseur de la cellule, par manipulation génétique telle que microinjection ou infection par un virus recombinant. L'acide nucléique hétérologue peut être intégré dans le chromosome, ou peut se présenter sous la forme d'ADN se répliquant de manière extra-chromosomique.
Selon un premier aspect, un animal transgénique selon l'invention comprend, sous une forme artificiellement insérée dans son génome, un acide nucléique codant un polypeptide CGL1 tel que défini précédemment dans la description.
Selon un second aspect, un animal transgénique selon l'invention comprend, sous une forme artificiellement insérée dans son génome, un acide nucléique inséré à la place du gène orthologue de cgll et bloquant la production du polypeptide correspondant. A. Animal transgénique « knock-out » pour cgll
L'invention concerne un animal transgénique non humain dont les cellules somatiques ou les cellules somatiques et les cellules germinales on été transformées par un acide nucléique, de manière ciblée, et dans le génome desquelles ledit acide nucléique est inséré de manière à inactiver le gène correspondant à cgll, chez ledit animal transgénique. Le gène correspondant à cgll est inactivé par le remplacement partiel ou total de sa séquence par ledit acide nucléique exogène. En cas de remplacement partiel de la séquence du gène correspondant à cgll, ce gène est inactivé par interruption de sa séquence par la séquence dudit acide nucléique exogène.
En d'autres termes, le gène cible inactivé ne s'exprime plus, ou s'exprime en produisant un polypeptide inactif. L'insertion ciblée de l'acide nucléique exogène est réalisée par recombinaison homologue, selon des techniques bine connues de l'homme du métier.
Inactivation génique de CGL1 par transgénèse chez la souris
En bref, une construction polynucléotidique comprenant le gène CGL1 modifié de façon empêcher la production du polypeptide CGL1 est insérée spécifiquement a la place du gène homologue endogène par recombinaison homologue dans la lignée de cellules embryonnaires souches de souris 129sv. L'insertion de la construction polynucléotidique est réalisée de préférence par electroporation, telle que décrite par Thomas et al. (1987, Cell, Vol51.503-512).
La séquence génomique d'un fragment incluant CGL1 a été obtenue a partir d'ADN de la lignée 129sv de souris, permettant de définir une stratégie d'inactivation et de criblage des cellules embryonnaires souches ayant réalisé la recombinaison homologue. L'introduction du transgène reproduira une délétion induisant un décalage du cadre de lecture, déjà décrite chez l'homme comme causant le syndrome de lipodystrophie congénitale généralisée La transfection, par le vecteur recombinant approprié, des cellules embryonnaires souches et l'injection en blastocystes sont réalisées. Le criblage des clones et le génotypage des animaux sont ensuite effectués.
B. Animal transgénique « knock-in » pour cgll.
Un tel animal transgénique de l'invention comprend, sous une forme artificiellement insérée dans son génome, un acide nucléique codant un polypeptide CGL1 tel que défini précédemment dans la description. De manière préférée, l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 est inséré de manière ciblée dans le génome de l'animal, et encore plus preferentiellement cet acide nucléique est inséré à l'endroit où est localisé le gène orthologue à cgll dans le génome dudit animal, par recombinaison homologue, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Surexpression contrôlée de CGL1 chez la souris
Le modèle de surexpression contrôlée de CGL1 consiste a créer une souris transgénique par insertion ciblée dans son génome d'une copie de l'ADN complémentaire complet de CGLl Cette technique, appelée "knock-in", utilise aussi la propriété de recombinaison homologue des cellules embryonnaires souches de la lignée 129sv de souris. Elle consiste à sous-cloner l'ADN complémentaire complet de CGL1 en aval d'un promoteur mammifère ubiquitaire ou spécifique d'un tissu, dans un vecteur contenant des systèmes de sélection positive et négative, ainsi que la séquence d'un locus permettant une expression optimum de l'ADN complémentaire cible. Le reste de la technique est identique à celle de l'inactivation génique par "knock-out".
Cette technique permet de contrôler le nombre de copies insérées dans le génome de l'animal transgénique et d'obtenir ainsi un nombre important d'animaux absolument identiques par le nombre de copies du transgène. Cela permet de s'affranchir des problèmes rencontrés avec la technique de transgénèse aléatoire, où il est difficile de comparer les résultats d'expériences physiologiques à cause du nombre variable de copies du transgène d'un animal à l'autre. L'autre avantage de cette technique est l'efficacité et le contrôle de l'expression du transgène, car il est inséré spécifiquement dans un locus à chromatine ouverte où le taux de transcription est élevé, et il est possible de déterminer la localisation de son expression par un choix judicieux du promoteur.
L'invention a donc également pour objet un animal transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou germinales ont été transformées par un acide nucléique codant le polypeptide CGL1. La transcription du gène CGL1 a été caractérisée par différentes techniques et un ADN complémentaire complet a été clone dans un vecteur d'expression mammifère pour vérifier l'intégrité du polypeptide issu de cet ADN complémentaire. Le sous-clonage de cet ADN complémentaire dans un vecteur de "knock-in" avec un promoteur ubiquitaire, la transfection de cellules embryonnaires souches et l'injection en blastocyste sont réalisées.
Selon une telle méthode, un animal transgénique non humain, par exemple une souris, est traité avec une molécule ou une substance candidate à tester, par exemple une substance ou molécule candidate auparavant sélectionnée par un procédé de criblage in vitro tel que défini ci-dessus.
Après une durée déterminée, le niveau d'expression de l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 est déterminé et comparé à l'expression de cet acide nucléique chez un animal transgénique non humain identique, par exemple une souris transgénique identique, qui n'a pas reçu la molécule ou la substance candidate.
Le niveau d'expression de l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 peut être déterminé par quantification de l'ARN messager correspondant produit par de cellules prélevées chez l'animal ou encore par détection et quantification du polypeptide CGL1 produit dans ces cellules, selon des techniques connues de l'homme du métier ou décrites précédemment dans la description. La mesure des niveaux d'ARN messager correspondant à l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 par hybridation de type Northern, ou encore par hybridation in situ.
La mesure des niveaux d'expression du polypeptide CGL1 peut être réalisé par immunohistochimie.
Pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule candidate modulant l'expression d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, on préférera des mammifères non humains tels que des souris, des rats ou des cobayes ou des lapins qui ont leur génome modifié par l'insertion d'une construction polynucléotidique comprenant un acide nucléique selon l'invention.
Les animaux transgéniques selon l'invention comprennent le transgène, c'est-à-dire la construction polynucléotidique précitée, dans une pluralité de leurs cellules somatiques et/ou germinales. La construction d'animaux transgéniques selon l'invention peut être réalisée selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra en particulier se référer à la production d'animaux transgéniques, et particulièrement à la production de souris transgéniques, telles que décrites dans les brevets US N°4,873,191 (délivré le 10 Octobre 1989), US N°5,464,764 (délivré le 7 Novembre 1995) et US 5,789,215 (délivré le 4 Août 199/8) le contenu de ces documents étant ici incorporé par référence.
En bref, une construction polynucléotidique comprenant un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 est insérée dans une lignée de cellules souches de type ES. L'insertion de la construction polynucléotidique est réalisée de préférence par electroporation, telle que décrite par Thomas et al. (1987, Cell, Vol.51:503-512).
Les cellules ayant subi l'étape d'électroporation sont ensuite criblées pour la présence de la construction polynucléotidique (par exemple par sélection à l'aide de marqueurs, ou encore par PCR ou par analyse sur gel d'électrophorèse d'ADN Southern blot ) afin de sélectionner les cellules positives ayant intégré la construction polynucléotidique exogène dans leur génome, le cas échéant à la suite d'un événement de recombinaison homologue. Une telle technique est par exemple décrite par MANSOUR et al. (1988, Nature, Vol.336: 348- 352).
Ensuite, les cellules sélectionnées positivement sont isolées, clonées et injectées dans des blastocystes de souris de 3,5 jours, comme cela est décrit par BRADLEY (1987, Production and Analysis of Chimaeric mice. In: E. J. ROBERTSON (Ed., teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. IRL press, Oxford, page 113). Des blastocystes sont ensuite introduits dans un animal hôte femelle pseudo-gestante et le développement de l'embryon est poursuivi jusqu'au terme.
Selon une alternative, des cellules de type ES sélectionnées positivement sont mises en contact avec des embryons de 2,5 jours à un stade 8-16 cellules (morulae) comme décrit par WOOD et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90: 4582-4585) ou par NAGY et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90: 8424-8428), les cellules ES étant internalisées afin de coloniser extensivement le blastocyste, y compris les cellules donnant naissance à la lignée germinale.
Les descendants sont ensuite testés afin de déterminer ceux qui ont intégré la construction polynucléotidique (le transgène). Par croisement entre eux des animaux transgéniques de la première génération, des animaux transgéniques homozygotes pour l'intégration du transgène sont obtenus d'une manière connue de l'homme du métier. Preferentiellement, les animaux transgéniques selon l'invention sont homozygotes pour le transgène.
L'invention a donc également pour objet un animal transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou germinales ont été transformées par un acide nucléique codant le polypeptide CGL1. Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi un animal transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou germinales ont été transformées par un acide nucléique codant un fragment ou un variant d'un polypeptide CGL1 , par exemple l'un des polypeptides CGL1 mutés décrits précédemment dans la description. De tesl animaux transgéniques sont utiles notamment pour vérifier la sélectivité des composés candidats actifs sur le polypeptide CGL1 non muté.
Selon un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 comprend un polynucléotide régulateur de la transcription et/ou de la traduction sous le contrôle duquel la région codante contenant le cadre ouvert de lecture est placée, ledit polynucléotide régulateur étant fonctionnel chez l'animal transgénique considéré.
Selon un mode de réalisation particulier, le polynucléotide régulateur ci-dessus contient des séquences dites activatrices " enhancers " permettant une expression à haut niveau du polypeptide CGL1 dans les cellules de l'animal transgénique..
L'invention a également trait à des cellules hôtes recombinantes obtenues à partir d'un animal transgénique tel que décrit ci-dessus. Des lignées de cellules recombinantes provenant d'un animal transgénique selon l'invention peuvent être établies en culture à long terme à partir de n'importe quel tissu d'un tel animal transgénique, par exemple par transfection des cultures de cellules primaires avec des vecteurs exprimant des oncogènes tels que le grand antigène T de SV40, tel que décrit par exemple par CHOU (1989, Mol. Endocrinol. Vol.3: 1511-1514) et SCHAY et al. (1991 , Biochem. Biophys. Acta, vol. 1072: 1-7).
L'invention est également relative à un procédé pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'expression d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 muté ou non muté selon l'invention, comportant les étapes consistant à : a) administrer la substance ou la molécule candidate à un animal transgénique tel que défini ci-dessus; b) détecter le niveau d'expression de l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 muté ou non muté; c) comparer les résultats obtenus au b) avec les résultats obtenus chez un animal transgénique n'ayant pas reçu la substance ou la molécule candidate.
L'invention est également relative a un procédé pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'expression ou l'activité du polypeptide CGL1 grâce aux deux modèles d'animaux de l'invention, comportant les étapes consistant a: a) Administrer la substance ou la molécule candidate aux animaux transgéniques correspondant aux modèles décrits ci-dessus. b) Détecter la localisation et le niveau d'expression du polypeptide CGL1 grâce aux anticorps comme définis dans l'invention, caractériser le phénotype clinique, biologique et moléculaire des animaux modèles. c) Comparer les résultats obtenus avec ceux obtenus chez un animal n'ayant pas reçu la substance ou la molécule candidate. Observer notamment une éventuelle modification de la localisation ou du niveau d'expression du polypeptide, ou une éventuelle reversion du phénotype.
Elle est aussi relative à un kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'expression ou l'activité du polypeptide CGL1 , comprenant : a) un animal transgénique « knock in » ou « knock out » tel que défini précédemment ; b) le cas échéant, les moyens de détection de la localisation ou du niveau d'expression du polypeptide CGL1. Dans tous les cas, les animaux utilisés lors de la mise en œuvre du procédé ci-dessus sont sacrifiés à la fin de ce procédé, par exemple lors d'une étape d) du procédé. En effet, le procédé ci-dessus est un procédé de criblage de composés candidats, dont un faible nombre d'entre eux sont susceptibles d'exercer une activité mesurable dans la modulation de l'expression de l'acide nucléique codant le polypeptide CGLL Ledit procédé ne vise aucunement au traitement thérapeutique des animaux mis en œuvre et ne peut donc en aucun cas être assimilé à un procédé de traitement thérapeutique ou chirurgical appliqué au corps humain ou animal.
L'invention se rapporte aussi à un kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant l'expression d'un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 muté ou non muté, comprenant : a) un animal transgénique tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, les moyens de détection du niveau d'expression de l'acide nucléique codant le polypeptide CGL1 muté ou non muté.
La présente invention est en outre illustrée sans pour autant être limitée, par les exemples suivants:
EXEMPLES
A. Matériels et méthodes des exemples A.1 Patients.
31 familles atteintes de GL et 27 patients additionnels (patients isolés ou appartenant à des petites familles) , représentant un total de 83 patients atteints de GL ont été étudiés. Tous les patients présentaient une forme généralisée de lipoatrophie et une hypertrophie musculaire. La plupart d'entre eux présentaient des acromegaloïdes, un acanthosis nigricans, une hépatomégalie, un hirsutisme, une résistance à l'insuline avec parfois un diabète et une hypertriglycéridémie . Les caractéristiques biologiques et cliniques de certains des patients avaient été précédemment documentées (SEIP et al., 1996; VAN DER VORM et al. (1993); KROOK et al.K, 1994; VIGOUROUX et al. , 1997; SEIP , 1959, HUSEMAN, 1978; PANZ, 1997; et VAN MALDERJEM et al. , 1996). Tous les patients ainsi que leurs familles ont donné leur consentement informé et éclairé en vue des études génétiques, qui ont été approuvées par un Comité Institutionnel.
A.2.Génotypage
L'ADN génomique a été obtenu à partir de cellules blanches du sang périphérique à l'aide de protocoles standards (SAMBROOK et al., 1989). Le génotypage de marqueurs a été réalisé en utilisant le pannel de marqueurs microsatellites LMS II- MD2 (PERKIN Biosystems) et un séquenceur d'ADN de type ABI 377 équipé du logiciel GENESCAN 3.0 ET GENOTYPER (version 2.1, commercialisé par la Société APPLIED BISYSTEMS). Pour la cartographie fine, de nouveaux marqueurs répétés de type CA ont été identifiés dans les séquences génomiques prédites pour être localisés dans le locus étudié et testés pour leur polymorphisme. L'ordre probable de ces marqueurs sur le chromosome a ensuite été déterminé en utilisant le pannel d'hybrides d'irradiation désigné Stanford GB3 (STEWART, 1997).
A.3 ANALYSE GENETIQUE
L'analyse d'association paramétrique a été réalisée à l'aide d'algorithmes décrits précédemment (SOBEL et al., 1996) qui ont été implémentés dans le programme SIMWALK 2. La fréquence allélique de la maladie a été fixée à 0,001 et on a postulé un mode de transmission purement récessif avec un taux de pénetrance de 0,99 pour le génotype de la maladie. Les configurations d'haplotypes les plus probables ont également été déterminées avec le programme SIMWALK2. Des fréquences d'allèles marqueurs ont été estimées à partir des données observées pour des familles utilisées dans le criblage du génome. Pour l'analyse des familles additionnelles, les fréquences alléliques des marqueurs ont été à nouveau estimées à partir des données de ces familles. Un nouveau calcul du lod score avec d'autres estimations de fréquences alléliques des marqueurs n'ont pas modifié les conclusions .
A.4 CRIBLAGE DE MUTATIONS
On a construit des amorces spécifiques pour amplifier les exons et les jonctions d'épissage en utilisant les données contenues dans le site WEB du MIT (http//ww-genome.wi. mit.edu/cgi-bin/primer3-ww.cgi.).
Les exons CGL ont été criblés pour des mutations après amplification de sept fragments (exon 1, exon 2, exon3, exon 4, exons 5- 6, exons 7-8 et exons 9-11). La séquence de ces amorces introniques peut être obtenue sur demande. Chez des patients pour lesquels seules de très faibles quantités d'ADN étaient accessibles (extraites à partir de tissus hypophysaires anciens et de sérums), deux amplifications ont été réalisées en une passe. Les produits PCR ont été purifiés sur une colonne de type SEPHADEX et séquences en utilisant la technique « BIG DYE TERMINATOR » ABI.
Les comparaisons de séquence ont été réalisées en utilisant le logiciel PHRED PHRAP CONSED décrit par EWING et al. (1998).
A.5 Analyse de gel d'électrophorèse d'ARNm.
On a utilisé des gels d'ARNm de divers tissus humains ainsi que l'ARN total de cerveaux, de coeur et de foie humain, (CLONTECH ). De plus, on a isolé l'ARN total à partir des tissus adipeux abdominaux sous-cutanés et viscéraux provenant de la peau et du colon après opération chirurgicale, en utilisant le kit QUIAGEN. A Neosy maxi kit.
L'ARN total (20 μg) a été séparé sur un gel à 1% d'agarose, 2,2 M formaldéhyde/ MOBS et transféré sur une membrane de nylon de type Hybond-N (Amersham). Les membranes ont été hybridées avec une sonde d'environ 1700 bp couvrant les exons 1 à 11 du gène cgll incluant le codon AUG de départ et le codon STOP. Cette sonde a été obtenue par amplification de l'ADNc total de cerveau à l'aide du kit avantage 2 (CLONTECH) et le couple d'amorces (exon 1F: 5'-CCCC TGCAGTGGAGTCTGTA-3' SEQ ID N°17; exon 11 R: 5'- AGTCAGGTGGGAAAGTGCTG-3' (SEQ ID N°18).
Les conditions d'amplification PCR ont été les suivantes: 95°C pendant une minute, suivie de 30 cycles composés de 95°C pendant 30 secondes, 65°C pendant 45 secondes et 72°C pendant 2 minutes, et une étape finale d'extension à 72°C pendant 10 minutes. L'identité de la sonde a été confirmée après une nouvelle amplification avec 5 paires d'amorces internes, puis séquençage partiel. La quantification des signaux a été réalisée en utilisant l'appareil phosphore Imager (Storm 860, Amersham Pharmacia Biotech) à l'aide du logiciel Image Quant, Version 5.0.
A.6 Analyse de séquences
Les séquences génomiques comprises dans l'intervalle chromosomique d'intérêt ont été recherchées dans les sites « http//www.ncbi. nlm.gov/genome/central » et « httt//hgrep.ims.u- tokyo.ac.jp/ ». Pour les recherches d'homologie, on a utilisé le logiciel BLAST disponible sur le site « httt//www.ncbi. nlm.gov/cgi-bin/BLAST ». Les alignements multiples ont été réalisés en utilisant le logiciel CLUSTAL disponible sur le site
«http//www.infobiogen.fr/services/analyseq/cgi-bin/clustalw-out.pl ». La protéine CGL1 a été analysée en utilisant les programmes d'ordinateurs suivants: Expasy PROTEOMIC TOOLS, qui contient les logiciels profiles Scan ainsi que le logiciel PROSITE, disponible sur le site « http//www.expasy.ch » pour la recherche d'hélices transmembranaires de motifs consensus. On a utilisé le logiciel BLOCKS pour la recherche de domaine de consensus, disponible sur le site « http//bioinformatics.weismeinn.ac.il/blocks/ ».
EXEMPLE 1: Identification du gène causal du CGL
1.1 Cartographie du déterminant génétique de la maladie au locus chromosomique 11α13.
Un ensemble de familles libanaises et norvégiennes a été choisi pour les études initiales en vue de localiser le gène responsable de la CGL (figure 1 A). Dans les cinq familles libanaises, l'ADN était accessible pour dix huit parents affectés et 66 parents non affectés. Toutes les familles étaient consanguines et trois d'entre elles (CGL-01 , CGL-02 et CGL-03) étaient originaires du même village, ce qui était indicatif d'un groupe géographique. Parmi les quatre familles du Sud Ouest de la Norvège (SEIP, 1996; SEIP, 1959), l'ADN était accessible à partir de trois parents affectés et vingt six parents non affectés (GEDDE-DAHL et al. (1996)). Deux des familles avaient une co-sanguinité détectée et parmi deux des familles non consanguines, l'une d'entre elle possédait une descendance affectée dans deux de ses branches (GEDDE-DAHL, 1996).
Une analyse de liaison et d'homozygotie couvrant l'ensemble du génome a été entreprise en utilisant le pannel LMS II-MD2 avec des microsatellites espacés en moyenne d'environ 10 cM. Aucune preuve de liaison n'a été trouvée sur le locus 9q34 (CGL1), région précédemment documentée (GARG et al. , 1999), dans laquelle on a ajouté les marqueurs de criblage génomique (D9S164 et D9S1836) avec les marqueurs D9S1818 ET D9S1826 qui bornent l'intervalle. Le lod score multilocus maximal dans cet intervalle a été d'environ -22,5 dans les familles libanaises et de -0,13 dans les familles norvégiennes.
L'inspection des données de génotype pour le génome entier a révélé deux marqueurs adjacents, les marqueurs D11S4191 et D11S987 sur le chromosome 11q13 qui étaient homozygotes dans beaucoup de patients. Une analyse avec deux marqueurs additionnels, D11S1765 et D11S1883, à l'intérieur de cet intervalle, ont confirmé ces observations et a révélé la présence d'allèles identiques dans l'ensemble des dix huits patients du Liban au marqueur D11S1883. La preuve d'une liaison était hautement significative, avec un lod score multilocus maximal de 13,2 (figure 1B) pour lequel la majorité des preuves provenait des familles libanaises (lod score 11 ,3) alors que le lod score à partir de l'ensemble des familles norvégiennes était de 2,1. Aucune autre région chromosomique n'a donné de valeur de lod score significative. A partir de ces résultats, un nouveau locus a été identifié, désigné CGL2 (désigné CGL), à l'intérieur de l'intervalle d'environ 8cM (DIB et al., 1996 borné par les marqueurs D11S4191 et D11S987 sur le chromosome 11q13.
1.2 Cartographie fine des familles libanaises et norvégiennes
Les inventeurs ont caractérisés vingt cinq marqueurs microsatellites additionnels à proximité du locus CGL chez les familles, incluant douze marqueurs localisés dans l'intervalle critique D11S4191- D11S987. Dans les familles libanaises, tous les individus affectés étaient homozygotes pour le même allèle pour neuf marqueurs contigus à l'intérieur de l'intervalle D11S4076-PIGM, avec certains individus affectés qui étaient hétérozygotes pour les marqueurs d'extrémité ainsi qu'un autre marqueur en dehors de l'intervalle (figure 2). La présence d'un allèle porteur commun dans les cinq familles libanaises a révélé un effet « fondateur » dans la population libanaise, du fait que les familles CGL- 04 et CGL-05 n'étaient pas connues pour être liées aux autres familles. Pour la population norvégienne, on a noté une homozygotie pour les patients des familles CGL-06, CGL-07 et potentiellement CGL-08 par déduction à partir des parents. Ils portaient le même allèle pour les marqueurs consécutifs D11S1765-D11S40766CA10-CA9, confirmant l'effet « fondateur » dans ces familles regroupées dans la région Sud-Ouest de la Norvège où ils ne pouvaient pas avoir d'ancêtre commun antérieur à 400 ans (GEDDE & DAHL et al. 1996). L'individu affecté de la quatrième famille (patient # 26, CGL-09) était hétérozygote pour les marqueurs dans cet intervalle mais avec un haplotype similaire aux autres familles norvégiennes du Sud-Ouest. En dépit de la consanguinité (coefficient de consanguinité 0,00195), il était dès lors possible qu'un second allèle lié à la maladie ait été introduit, ou que des événements de recombinaison conduisant à un petit intervalle d'homozygotie soient restés indétectés à ce niveau de résolution des marqueurs.
Aucun des enfants non affectés des familles libanaises et norvégiennes n'était hompozygote dans ces intervalles d'homozygotie (figure 1). Puisque la région commune d'homozygotie des deux populations se recouvrait au marqueur adjacent CA10 et CA9 borné par les marqueurs D11S4076 et D11S480 (figure 3), il a été inféré que le locus CGL2 résidait dans l'intervalle D11S4076-D11S480 qui couvre approximativement 2,5 MB comme déterminé à l'aide des données de cartographies physiques et d'hybrides d'irradiation. Des haplotypes associés à la maladie chez les familles libanaises et norvégiennes portaient des allèles différents aux deux marqueurs microsatellites GA10 et CA9, suggérant que des mutations différentes pourraient être présentes dans les deux groupes géographiques.
1.3 FAMILLES D'ORIGINES ETHNIQUES VARIEES LIEES au locus 11q13.
Des patients et des parents dans vingt-deux familles additionnelles d'origine ethnique variée ont été testés avec six marqueurs couvrant un intervalle d'environ 10 cM (DIB et al. 1996; STEWART et al., 1997) au locus 11q13 (D11S986, D11S4191, D11S1765, CA10, D11S1883, PYGM). L'homozygotie et le partage d'haplotype chez les descendants affectés et non affectés a suggéré une co-ségrégation avec la maladie dans onze familles parmi lesquelles six étaient d'origine portugaise (figure 3). Tous les patients de ces familles ont été diagnostiqués comme étant atteints de CGL. Dans les onze familles restantes, la maladie ne ségrégeait pas avec le locus 11q13, pour une ou plusieurs des raisons suivantes:
1. les parents consanguins ne partageaient pas des allèles communs pour les marqueurs dans la région cible;
2. les patients nés de parents consanguins ont été retrouvés hétérozygotes;
3. un enfant affecté avait le même haplotype que la descendance normale; ou 4. les descendants affectés de la même famille avaient hérités d'haplotypes différents.
1.4.ldentification d'une délétion dans le gène humain homologue du gène murin Gnq3lq.
En criblant les bases de données dans l'intervalle D11S4076- D11S480, vingt-six gènes potentiels ont été identifiés, à partir de séquences d'ADNg, d'ADNc ou d'EST. La structure génomique de ces 26 gènes a été déterminée par recherche de similarité avec les séquences genomiques humaines et des amorces spécifiques ont été dessinées afin d'analyser la région codante et les jonctions introniques flanquantes. L'analyse de séquence de ces vingt-six gènes n'a pas révélée d'altération moléculaire significative dans un ensemble de sept individus incluant quatre patients des familles liées à 11q13. Au cours de ces études, des patients (jumeaux monozygotes) de l'une des familles dans lesquelles la maladie était liée potentiellement au locus 11q13 (CGL-16) ont été trouvés comme étant homozygotes pour un allèle nul au marqueur microsatellite CA10(figure 3). D'autres gènes localisés à proximité et d'autres marqueurs, y compris le marqueur microsatellite CA9 qui réside à 100 kb du marqueur CA10, ont amplifiés correctement à partir de l'ADN de ces patients. En conséquence, il était inféré que les patients étaient susceptibles de porter une délétion dans un segment d'ADN contenant le marqueur CA10. L'analyse de bases de données de séquences publiques a permis l'identification d'un ARNm inconnu (AF052149) correspondant à un nouveau gène humain, le gène cg/ qui est contenu dans la séquence du BAC AP001458 à partir duquel le marqueur CA10 avait été isolé à l'origine, cgll est homologue du gène murin Gng3lg (pour « Gng3-linked gène, décrit par DOWNES et al., 1998), qui réside dans une région conservée entre le chromosome murin 19 et le chromosome humain 11q. Les inventeurs ont déterminé que le gène humain, qui couvre au moins 14 kb de séquences genomiques, contient 11 exons. Le cadre de lecture ouvert (ORF) commence dans l'exon 2 et les jonctions introns- exons présentent une forte similarité avec les séquences consensus de site d'épissage 5' et 3'. L'amplification de ces exons chez les patients de la famille CGL-16 a révélé la présence d'une délétion incluant les exons 4, 5 et 6 du gène (del Ex4-6) (figure 4A). Basé sur l'étendue de la délétion et de la séquence accessible AP001458, le marqueur CA10 pourrait être localisé soit dans l'intron 4, soit dans une petite région de l'intron3.
EXEMPLE 2 : Criblage de mutations dans le gène call.
Le gène cgll a été séquence chez des patients de toutes les familles précédemment étudiées. De plus, on a analysé 27 patients y compris 16 patients isolés et 11 patients originaires de petites familles qui n'avaient pas été étudiés précédemment. Douze altérations moléculaires différentes ont été retrouvées parmi 41 patients provenant de 22 familles. Ces altérations moléculaires incluent une délétion de 258 bp (del E5-6) six petites insertions et/ou délétions inférieures à 10 bp, et cinq substitutions d'un seul nucleotide (figure 4b et tableau 2). Onze de ces mutations ont résulté dans un changement de cadre de lecture, l'introduction d'un codon STOP précoce ou pourrait affecter une séquence d'un site d'épissage, toutes les mutations étant potentiellement des mutations nulles. Les patients, qui présentaient une forme précoce de lipoatrophie, ont été trouvés homozygotes pour une mutation spécifique, ou hétérozygote composite pour des mutations distinctes. Ces variants ont été retrouvés à l'état hétérozygote chez les parents et certains descendants non affectés, mais étaient absents des 96 témoins des familles du CEPH, indiquant que ces mutations étaient susceptibles de représenter des mutations associées à la maladie selon un mode de transmission récessif.
Cinq mutations ont été trouvées dans plus d'un pedigree. Comme cela était attendu du fait des données d'haplotypes, les dix neufs patients (un patient nouveau-né ajouté pour analyse de mutation). Des familles libanaises de la figure 1 ont été retrouvées comme étant homozygotes pour la même mutation, une délétion de 5bp dans l'exon 4, qui induit un changement du cadre de lecture ouvert après l'acide aminé 105 et introduit un codon STOP précoce à la position 111 (F105 fsXW111). De manière similaire, les cinq patients (trois patients ajoutés pour l'analyse de mutation) des trois familles du Sud-Ouest de la Norvège (CGL-06, CGL-07, CGL-08) étaient homozygotes pour une mutation faux-sens dans l'exon 6 provoquant une substitution du résidu alanine en position 212 par un résidu praline (A212P). A nouveau, comme prévu dans l'analyse haplotypique le patient provenant de la quatrième famille norvégienne (patient # 26, CGL-09) hétérozygote composite avec la mutation A212P hérité de son père et une mutation différente induisant un changement de cadre de lecture (F63fsX75) provenant de sa mère. Il est intéressant de noter que la dernière mutation F63fsX75 a été également retrouvée dans les familles CGL-10 de l'Est de la Norvège, CGL-11 de l'Italie et CGL-12 du Royaume-Uni. Deux familles consanguines d'origine portugaise (CGL-1 et CGL-18) portaient la même mutation R138X. Egalement, deux familles d'origine portugaise vivants en Afrique du Sud (CGL-19 et CGL-20) présentaient une mutation commune (F108fsX113). Lorsque la même mutation était présente dans des familles apparemment non apparentées, les haplotypes associés à la maladie portaient le même allèle au marqueur CA10, suggérant l'apparition des mêmes événements mutationnels (figure 3).
Dans trois cas, les chromosomes associés à la maladie portaient des variants uniques au niveau ou à proximité du site d'épissage. Le variant présent dans la famille turque CGL-14 consiste en une transition à la première base de l'intron 4 qui appartient à une séquence consensus nucléotidique strictement conservée pour l'ARN (site donneur d'épissage, HODGES et al., 1994). Les autres variants affectent un nucleotide localisé après la séquence consensus de chaque site accepteur d'épissage (intron 4: troisième base avant l'exon 5; CGL- 40) ou du site donneur d'épissage (intron 6: 5ème base ; allèle paternel CGL-12). Ces deux nucléotides sont généralement conservés (environ 80%) aux jonctions des sites d'épissage, et des mutations dans ces nucléotides dans d'autres gènes ont été identifiés comme induisant l'excision d'un exon ou l'activation de sites cryptiques d'épissage (HODGES et al., 1994; BIENVENU et al., 1994). Aucun autre variant n'a été détecté dans les exons ou dans les régions introniques flanquantes chez ces individus. Ainsi, les altérations sont très probablement des mutations d'épissage provoquant une dislocation de la protéine.
Le séquençage systématique des onze exons du gène cgll n'a pas révélé de mutation chez les patients provenant de onze familles non liées au locus chromosomique 11q13, à l'exception du second individu affecté de la famille CGL-28. Ce patient porte une mutation hétérozygote faux-sens, qui est absente chez son frère et sa soeur qui sont atteints et qui donc ne ségrège pas avec la maladie. Egalement, aucune mutation n'a été trouvée chez les vingt-cinq patients restants, qu'ils soient isolés ou issus de petites familles, qui sont affectés soit par la forme congénitale (14 patients) ou par la forme retardée (11 patients) de la maladie.
Ces résultats indiquent qu'un gène distinct de CGL1 ou que d'autres facteurs non génétiques sont responsables de la maladie chez ces patients.
EXEMPLE 3: Profil d'expression de cgll
L'expression spécifique de tissu de CGL1 a été recherchée par hybridation d'ARNm (Northern Blots et Dot Blot) à l'aide d'une sonde couvrant les exons 1 à 11. L'analyse par « Northern Blot » a révélé deux espèces d'ARN d'environ 2,4 kb et d'environ 1,8 kb exprimées de manière variable dans tous les tissus, ainsi qu'un transcrit supplémentaire intermédiaire d'environ 2 kb retrouvé comme transcrit unique dans le cerveau et en association avec les autres transcrits dans les testicules (figure 5). Les niveaux d'expression varient selon les tissus, ces niveaux étant forts dans le cerveau et les testicules, intermédiaires dans les tissus adipeux (viscéraux et sous-cutanés), le pancréas, le rein, le muscle squelettique, le foie, l'ovaire, la prostate et le coeur et faible dans les tissus restants. L'analyse par hybridation sur des gels « Dot Blot » réalisée avec de multiples tissus humains, les quantités ayant été ajustées au niveau d'expression de huit gènes ubiquitaires « House keeping gènes », a révélé que l'expression de CGL1 dans les tissus foetaux et les hauts niveaux d'expression dans la plupart des régions du système nerveux central, en particulier dans l'hypophyse. EXEMPLE 4: Polypeptide CGL1
Le gène cgll code pour une protéine de 398 acides aminés ayant une masse calculée de 43,8 kD qui a aussi été désignée « SEIPIN ».
La séquence d'acides aminés montre une forte identité avec la protéine codée par Gng3lg de souris (87% d'identité) et une homologie partielle avec une protéine de drosophila melanogaster (40% d'identité entre les résidus 22 et 257). L'analyse n'a pas révélée de similarité avec d'autres protéines connues
Toutefois, les résultats suggèrent que la protéine CGL1 est une protéine membranaire possédant au moins deux domaines transmembranaires (figure 6).
TABLEAU 2
Figure imgf000083_0001
TABLEAU 2 (Suite)
Petites mutations retrouvées dans le gène cgll
Gène Altération Changement Familles Patients localisa Nucléotidique d'acide aminé # Origine Consanguinité Etat Age d' apparition tion
| Intron 4 639/+1G→A ΔV99-S146 14 Turquie hom naissance (excision Exon 4) (Délétion 48 aa)
Exon 6 978G→C. A212P 06 Norvège (S.O.) hom naissance 07 Norvège (S.O.) hom naissance 08 Norvège (S.O.) hom naissance 09 Norvège (S.O.) + het " naissance
980delC F213fsX232 13 Pakistan + hom naissance
, Intron 6 1015/+5G→A Mutation 12 Royaume Uni het naissance d'épissage ?
1016/-3C→G 40 France (Tur) hom naissance (excision exon 7) F224 àY225-
Figure imgf000084_0001
a La numérotation des nucléotides débute au nucleotide en position 345 de la séquence SEQ ID Nσ4, ce nucleotide étant numéroté 1 dans le tableau. Le patient de la famille CGL35 est un hétérozygote composite présentant une délétion (258bp)/insertion (12bp) dan les exons 5-6. het: hétérozygote composite, hom : homozygote pour la mutation, Por, Portuguais ; Tur, d'origine turque
Tableau 3 : Séquences d'acide nucléique et d'acides aminés
Figure imgf000085_0001
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Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique codant le polypeptide CGL1 de séquence en acides aminés SEQ ID N°1 ou un fragment ou un variant du polypeptide CGLL
2. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le variant du polypeptide CGL1 est choisi parmi les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N° 2 à SEQ ID N° 10.
3. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le fragment du polypeptide CGL1 est choisi parmi les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N° 11 à SEQ ID N°13.
4. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend le polynucléotide allant du nucleotide en position 345 jusqu'au nucleotide en position 1541 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°14.
5. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend le gène cgll contenu dans le vecteur BAC désigné RP11- 831 H9 dont des séquences nucléotidiques sont référencées dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès n°AP001458, ou N°AC 090306.
6. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 3 à 6 pour la fabrication d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique spécifique du gène cgll.
7. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 2 pour la fabrication d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique spécifique du gène cgll muté.
8. Sonde ou amorce nucléotidique hybridant spécifiquement avec le gène cgll muté.
9. Sonde ou amorce selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle hybride spécifiquement avec un acide nucléique selon la revendication 2.
10. Sonde ou amorce nucléotidique selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle hybride spécifiquement avec le gène cgll portant une mutation choisie parmi les mutations F63fsX75, F100fsX111, F105fsX112, F105fsX111, F108fsX113, R138X, A212P, F213fsX232, del/ins E5-6 et del E4-6.
11. Couple d'amorces nucléotidiques pour la détection d'une mutation dans le gène cgll, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 15 et SEQ ID N°16, et SEQ ID N°17 et SEQ ID N°18.
12. Procédé pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'une des revendications 8 à 10 avec l'échantillon à tester ; b) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
13. Procédé de détection selon la revendication 12, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
14. Nécessaire ou kit pour la détection d'une mutation dans le gène cgll, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'une des revendications 8 à 10 ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
15. Procédé pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mise en contact de l'échantillon à tester avec une ou plusieurs amorces selon l'une des revendications 8 à 11 ; b) détection des acides nucléiques amplifiés.
16. Nécessaire ou kit pour détecter une mutation dans un acide nucléique codant le polypeptide CGL1, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une ou plusieurs amorces nucléotidiques selon l'une des revendications 8 à 11 ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
17. Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5. .
18. Cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle est transfectée ou transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 17.
19. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 3 à 5, d'un vecteur recombinant selon la revendication 17 ou d'une cellule hôte recombinante selon la revendication 18 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, du syndrome de Lawrence ou de l'obésité.
20. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 3 à 5, d'un vecteur recombinant selon la revendication 17 ou d'une cellule hôte recombinante selon la revendication 18 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un diabète, ou du syndrome d'insulino-résistance.
21. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, du syndrome de Lawrence ou de l'obésité comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 3 à 5, un vecteur recombinant selon la revendication 17 ou une cellule hôte recombinante selon la revendication 18, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
22. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'un diabète ou du syndrome d'insulino-résistance, comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 3 à 5, un vecteur recombinant selon la revendication 17 ou une cellule hôte recombinante selon la revendication 18, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
23. Polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1 ou d'un fragment ou d'un variant du polypeptide CGLL
24. Polypeptide selon la revendication 23, caractérisé en ce que le variant du polypeptide CGL1 est choisi parmi les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N° 2 à SEQ ID N° 10.
25. Polypeptide selon la revendication 23, caractérisé en ce que le fragment du polypeptide CGL1 est choisi parmi les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N° 11 à SEQ ID N°13.
26. Utilisation du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie, du syndrome de Lawrence ou de l'obésité.
27. Utilisation du polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un diabète ou du syndrome d'insulino-résistance.
28. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une lipodystrophie du syndrome de Lawrence ou de l'obésité, comprenant un polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
29. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'un diabète ou du syndrome d'insulino-résistance, comprenant un polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
30. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 23 à 25.
31. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 23 à 25 dans un échantillon, comprenant les étapes de : a) mettre en contact un anticorps selon la revendication 31 avec l'échantillon à tester ; b) détecter les complexes polypeptide-anticorps éventuellement formés.
32. Nécessaire ou kit pour la détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 23 à 25 dans un échantillon, comprenant : a) un anticorps selon la revendication 30 ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes polypeptide-anticorps éventuellement formés.
33. Procédé de criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1 ou avec un fragment du polypeptide CGL1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact le composé candidat avec le polypeptide CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1 ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1 , d'une part, et le composé candidat, d'autre part.
34. Nécessaire ou kit pour le criblage d'un composé candidat interagissant avec le polypeptide CGL1 de séquence SEQ ID N°1 ou avec un fragment du polypeptide CGL1 , caractérisé en ce qu'il comprend : a) un polypeptide CGL1 ou un fragment du polypeptide CGL1. b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes éventuellement formés entre le polypeptide CGL1 ou le fragment du polypeptide CGL1 , d'une part, et le composé candidat, d'autre part.
35. Procédé pour le criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgll, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver une cellule hôte exprimant, de manière naturelle ou après recombinaison génétique, le gène cgll ; b) mettre en contact la cellule hôte cultivée à l'étape a) avec un composé candidat ; c) déterminer la capacité du composé candidat à moduler l'expression du gène cgllpar la cellule hôte.
36. Nécessaire ou kit pour le criblage d'un composé candidat modulant l'expression du gène cgll, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une cellule hôte exprimant, de manière naturelle ou après recombinaison génétique, le gène cgll ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détermination de la capacité du composé candidat à moduler l'expression du gène cg/7par la cellule hôte.
37. Nécessaire ou kit selon la revendication 36, caractérisé en ce que les moyens nécessaires à la détermination de la capacité du composé candidat à moduler l'expression du gène cgllpar la cellule hôte sont une ou des sondes spécifiques du gène cg/
38. Animal transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou germinales ont été transformées par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5.
39. Animal transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou germinales ont été transformées par un acide nucléique qui est inséré dans le génome de manière à inactiver le gène correspondant à cgll, chez ledit animal transgénique.
40. Procédé pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'expression d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 comportant les étapes consistant à : a) administrer la substance ou la molécule candidate à un animal transgénique selon la revendication 38; b) détecter le niveau d'expression de l'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5; c) comparer les résultats obtenus au b) avec les résultats obtenus chez un animal transgénique n'ayant pas reçu la substance ou la molécule candidate.
4L Kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou substance candidate modulant l'expression d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 comprenant : a) un animal transgénique selon la revendication 38; b) le cas échéant, les moyens de détection du niveau d'expression de l'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5.
42. Procédé pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'expression ou l'activité du polypeptide CGL1 , comportant les étapes consistant à : a) administrer la substance ou la molécule candidate à un animal transgénique selon l'une des revendications 38 et 39 ; b) détecter la localisation et le niveau d'expression du polypeptide CGL1 grâce à un anticorps selon la revendication 30 ; c) comparer les résultats obtenus avec ceux obtenus chez un animal n'ayant pas reçu la substance ou la molécule candidate.
43. Kit ou nécessaire pour le criblage in vivo d'une molécule ou d'une substance candidate modulant l'expression ou l'activité du polypeptide CGL1 , comprenant : a) un animal transgénique selon l'une des revendications 38 et
39 ; b) le cas échéant, les moyens de détection de la localisation ou du niveau d'expression du polypeptide CGL1.
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