WO1996005301A1 - Nouveau transporteur vesiculaire de l'acetylcholine - Google Patents

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WO1996005301A1
WO1996005301A1 PCT/FR1995/001073 FR9501073W WO9605301A1 WO 1996005301 A1 WO1996005301 A1 WO 1996005301A1 FR 9501073 W FR9501073 W FR 9501073W WO 9605301 A1 WO9605301 A1 WO 9605301A1
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vector
coding
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Stéphane BEJANIN
Sylvie Berrard
Riccardo Cervini
Jacques Mallet
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Rhone-Poulenc Rorer S.A.
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    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid sequence coding for a protein involved in the vesicular transport of acetylcholine and to the corresponding protein. It also relates to expression vectors integrating said sequence and the use of this sequence or of said vectors for therapeutic purposes.
  • Acetylcholine, ACh is a neurotransmitter synthesized by the enzyme choline acetyltransferase, ChAT. At the ends of the cholinergic neurons, the majority of ACh produced is transported from the cytoplasm inside the synaptic vesicles. The accumulation of ACh, at the level of these vesicles, passes through the activity of an ATPase which pumps H + ions which generates an electrochemical gradient (Anderson DCet al., (1982) Biochemistry 21, 3037-3043 ). This gradient is used by a transporter for the capture of ACh via a proton exchange (Parsons SM et al., (1993), Int. Rev. neurobiol. 35, 279-390). This type of mechanism is comparable to that involved in the transport of biogenic amines within synaptic vesicles. Understanding the different regulatory mechanisms involved in the expression of ACh would be particularly valuable from a therapeutic point of view.
  • transmembrane domains TM
  • TM transmembrane domains
  • TM2 transmembrane domains
  • TM2 the presence, in these transmembrane domains, of charged amino acid residues which are probably involved in the transport of substrate
  • TM1 and TM2 a localized glycosylated loop between TM1 and TM2
  • cytoplasmic terminal C and N ends which have less similarities than the rest of the protein.
  • the present invention relates more particularly to the isolation, sequencing and characterization of a region of the gene coding for ChAT, capable of expressing a vesicular ACh transporter as well as the identification of sequences promoters involved in the expression of this transporter. It also describes expression cassettes for this gene, vectors containing it and their use for directing the expression of this transporter.
  • the present invention relates to a nucleic sequence coding for a protein involved in the vesicular transport of ACh, characterized in that it is located within the first intron of the gene coding for ChAT, in the same transcriptional orientation. .
  • the inventors From the 5 ′ region of the gene coding for rat ChAT and more specifically from a restriction map of this region, the inventors isolated a HindIII-BamHI fragment carrying the first intron of this gene and partly the sequences of the first two R and N exons corresponding respectively to the 5 'and 3' ends of this fragment. Unexpectedly, the cloning and sequencing of this fragment revealed the presence of an open reading phase of 1590 bp, coding for a protein of the order of 530 amino acids, ie a mass of the order of 56 , 5kDa and having similarities in its sequence with proteins of the transporter type. This protein has been identified as a vesicular transporter of rat ACh and is hereinafter referred to as rVAT.
  • This DNA sequence is more precisely located within the first intron of the gene coding for ChAT, downstream of the type R promoter of the ChAT gene and in the same transcriptional orientation as the ChAT gene. It is not interrupted by any intron.
  • the present invention relates to a nucleic sequence coding for a vesicular ACh transporter, characterized in that it comprises all or part of SEQ ID No. 1 or one of its derivatives.
  • the term derivative designates any sequence differing from the sequence considered due to a degeneration of the genetic code, obtained by one or more modifications of a genetic and / or chemical nature, as well as any sequence hybridizing with these sequences or fragments thereof and the product of which has the indicated activity.
  • modification of genetic nature and / or chemical we can hear any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues.
  • Such derivatives can be generated for different purposes, such as in particular that of increasing the affinity of the corresponding polypeptide for its ligand (s), that of improving its production levels, that of increasing its resistance to proteases, that of increasing and / or modifying its activity, or that of giving it new pharmacokinetic and / or biological properties.
  • the chimeric nucleic sequences comprising an additional heterologous part linked at one end.
  • the term derivative also includes sequences homologous to the sequence considered, derived from other cellular sources and in particular from cells of human origin, or from other organisms, and having an activity of the same type. Such homologous sequences can be obtained by hybridization experiments. Hybridizations can be carried out from nucleic acid libraries, using the native sequence or a fragment thereof as probe, under conventional stringency conditions (Maniatis et al., See general techniques of molecular biology), or , preferably, under high stringency conditions.
  • the present invention also intends to cover the corresponding antisense sequences whose expression makes it possible to control the transcription of cellular mRNAs.
  • sequences can consist of all or part of the nucleic sequence considered, transcribed in the reverse orientation.
  • rVAT nucleic acid sequence coding for the rat ACh vesicular transporter
  • the inventors Given the location of the gene according to the invention, namely in the first intron of the gene coding for ChAT, downstream of the R type ChAT promoter and in the same transcriptional orientation, the inventors sought to know whether the ChAT mRNAs and VAT could be expressed from the same promoter.
  • the 5 'ends of the other two forms are located downstream of exon R.
  • the form which we designate VI has two 5' ends located at 426 bp and 402 bp upstream of the initiation codon of the translation of VAT (positions 949 and 972 respectively, on SEQ ID No. 1).
  • the form of VAT mRNA that we designate V2 has several 5 'ends situated between 863 bp and 888 bp upstream of the codon for initiating the translation of VAT (positions 486 to 51 1 of SEQ ID n ° l).
  • the present invention also relates to promoter regions involved in the expression of VAT and localized in the gene coding for ChAT.
  • promoter region comprising all or part of SEQ ID No. 3 or one of its derivatives and additional promoter regions located in SEQ ID No. 1.
  • promoter region designates the sequence or sequences responsible for the expression of VAT. They are in particular promoter, activation, regulation sequences and / or sequences allowing tissue-specific expression.
  • SEQ ID No. 3 is already known to control the expression of the ChAT gene (Bejanin et al. J. Neurochem. 58: 1580-1583 (1992)). Unexpectedly, this region has also been found to be responsible for the expression of the gene coding for VAT and more specifically for at least two types of VAT mRNA. It has thus been demonstrated that VAT and ChAT mRNAs can be produced from the same type R ChAT promoter. In addition, two promoter regions responsible for the production of VAT type VI and V2 mRNAs have been identified downstream of exon R in the first intron of the ChAT gene. Type VI VAT mRNA is produced from a promoter located between positions 584 and 1027 of SEQ ID No.
  • the present invention also relates to the use of these promoter regions to control and / or participate in the expression of genes. These promoter regions are also advantageous for targeting the expression of a protein in cholinergic neurons. Of course, these promoter regions are particularly useful for directing the expression of a vesicular transport protein of acetylcholine, expression coupled where appropriate with that of another gene.
  • the invention further relates to a polypeptide involved in the vesicular transport of ACh capable of being expressed by a nucleic sequence as described above.
  • polypeptides of the invention can be obtained by expression in a cellular host of a nucleotide sequence as described above, by chemical synthesis, on the basis of the sequence SEQ ID No. 2 using the techniques known in the art. skilled in the art, or by a combination of these techniques.
  • the comparison of this protein with proteins already known as ACh transporters, such as those of Torcherdo or Caenorhabditis elegans has made it possible to highlight certain similarities.
  • the protein according to the invention has approximately 77% homology with the protein Torcherdo and 56% homology with the protein Caenorhabditis elegans, on 352 amino acids.
  • the significant divergence between the protein according to the invention and the other known transporters exists at the level of the highly hydrophilic loop, located between the first two transmembrane domains and the N- and C-terminal ends. In the case of the present invention, the loop integrates two potential N-glycosylation sites.
  • rVAT vesicular transporter of rat ACh
  • the nucleic acid sequences according to the invention form part of a vector.
  • a vector in fact makes it possible to improve the administration of the acid. nucleic acid in the cells to be treated, and also to increase its stability in said cells, which makes it possible to obtain a lasting therapeutic effect.
  • the vector used can be of various origins, since it is capable of transforming animal cells, preferably human nerve cells.
  • a viral vector is used, which can be chosen from adenoviruses, retroviruses, adeno-associated viruses (AAV), herpes virus, cytomegalovirus (CMV ), vaccinia virus, etc.
  • Vectors derived from adenoviruses, retroviruses, or AAVs incorporating heterologous nucleic acid sequences have been described in the literature [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185,573, Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gai la Salle et al., Science 259 (1993) 988; Roemer and Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO91 / 18088].
  • the present invention therefore also relates to any recombinant virus comprising, inserted into its genome, a nucleic sequence as defined before.
  • the recombinant virus according to the invention is a defective virus.
  • the term "defective virus” denotes a virus incapable of replicating in the target cell.
  • the genome of the defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the nucleic acid of the invention.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome that are necessary for the packaging of viral particles.
  • nucleic acid sequences of the invention in the form incorporated into an adenovirus, an AAV or a defective recombinant retrovirus.
  • adenoviruses there are different serotypes, whose structure and properties vary somewhat, but which are not pathogenic for humans, and in particular non-immuno-depressed subjects. In addition, these viruses do not integrate into the genome of the cells they infect, and can incorporate large fragments of exogenous DNA.
  • type 2 or 5 adenoviruses Ad 2 or Ad 5
  • Ad 5 adenoviruses the sequences necessary for replication are the E1A and E1B regions.
  • the defective recombinant viruses of the invention can be prepared by homologous recombination between a defective virus and a plasmid carrying, inter alia, the nucleotide sequence as defined above (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J 3 (12) (1984) 2917). Homologous recombination occurs after co-transfection of said viruses and plasmid into an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective virus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line which can be used for the preparation of defective recombinant adenoviruses mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains, in particular, integrated in its genome, the left part of the genome of an Ad5 adenovirus (12%).
  • a line which can be used for the preparation of defective recombinant retroviruses mention may be made of the CRIP line (Danos and Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460).
  • viruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional molecular biology techniques.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one nucleotide sequence, a vector or a polypeptide according to the invention.
  • nucleic sequence coding for an acetylcholine transporter is furthermore particularly useful for screening new biologically active products and in particular involved in the expression and / or regulation of acetylcholine.
  • the present invention also relates to transgenic animals in the genome of which is inserted at least one nucleic sequence coding for an acetylcholine transporter as claimed.
  • FIG. 1 • Schematic representation of the 5 'region of the rat ChAT gene and of the various ChAT mRNAs
  • the white and black boxes indicate respectively, the coding and non-coding exons R, N and M are the 3 non-coding ChAT exons.
  • FIG. 2 Analysis by the Northern technique of the distribution of mRNA-rVAT in different rat tissues with a specific probe of the open reading phase (position 31-1724 as defined in FIG. 1)
  • Line 1 poly (A) RNA + spinal cord (1 ⁇ g); Lines 2-1 1 10 ⁇ g of
  • RNA blots are prepared in the presence of molecular weight markers of RNA (Gibco BRL). Lines 1 to 8 and 9 to 11 represent the results of the two independent experiments. The autoradiographies are exposed for 3 days at a temperature of -70 ° C with an intensifying screen.
  • Figure. 3 Diversity of the mRNA-rVAT in the rat spinal cord Y are shown the results of analysis by Southern blot of the cDNA amplification products (lines 1,2) and of the SLIC products (lines 3,4). The white and black boxes indicate the non-coding and coding exons respectively.
  • oligonucleotides used for the synthesis of the cDNA (P), for the amplification (two primers sense 1.2 upstream and a common antisense primer L) and for the hybridization of the Southern (H), are shown diagrammatically by arrows .
  • Poly (A) + RNA is subjected to first strand cDNA synthesis with / or as control without reverse transcriptase.
  • the amplifications of the cDNA (+) or of the controls (-) with the pair of oligonucleotides L and 1 or 2 are shown respectively, in lines 1 and 2.
  • the amplifications with oligonucleotides L and A5'l of the cDNA (+) or controls (-), ligated or not, are presented respectively in lines 3 and 4.
  • the vertical bars in the exons R and rVAT represent the splicing sites deduced from the sequences of the two DNA fragments obtained online 1.
  • the 5 'splice site in exon R corresponds to that shown in Figure 1.
  • the consensus sequence of the 3' splice site is underlined.
  • the position of the nucleotide located furthest 5 'for the sequenced SLIC products is indicated by an asterisk.
  • RNA is extracted from rat spinal cord using the RNAzol method (System Bioprobe).
  • the poly (A) + RNA is purified using the Dynabeads® kit (Dynal).
  • the first strand of cDNA is synthesized from 1 ⁇ g of poly (A) + RNA in reverse transcription buffer in the presence of 100 ⁇ g / ml BSA, 15 units of RNasin
  • the cDNAs and SLIC products are amplified in a Techne Thermal Cycler® (30 or 40 amplification cycles respectively). Each cycle consists of:
  • the sense primers used are the following: oligonucleotides 1 or 2 for the cDNAs and the oligonucleotide A5'1 (complementary to part of A5 * NV) for the cDNAs ligated at 3 '.
  • An antisense and common primer L is used.
  • the amplification products are separated on a 2% agarose gel and analyzed by the Southern blotting technique using the oligonucleotide H as probe.
  • the parts of the gel containing the bands observed are isolated and the DNA which they contain is purified, under clone in the plasmid pUC19 (Appligen) and sequenced on the two strands by means of the Sequenase® kit (USB, Amersham).
  • the sequences and positions (cf. FIG. 1) of the oligonucleotides used are:
  • RNAs or poly (A) + RNAs are prepared from rat tissues as described above, fractionated on agarose gel (1%) / formaldehyde and transferred to nylon membranes (Hybond N + , Amersham) as described in the literature (Faucon Biguet et al., EMBO J., 5 287-291 1986).
  • the filters are hybridized at 42 ° C., in a buffer containing 50% (vol / vol) of formamide, to a DNA fragment Smal-EcoRI (position 31-1724), labeled by random priming (19) with ( ⁇ - 32p) dCTP (3000 Ci / mmol; Amersham) and having a specific activity of 1.2 x 10 ⁇ cpm / ⁇ g.
  • the last washings of the filters are carried out at 65 ° C in the 0.1 x SSC / 0.1% SDS solution.
  • CHAT choline acetyltransferase
  • ACh acetylcholine
  • VMAT vesicular transporter of monoamines
  • TM transmembrane domain
  • rVAT vesicular transporter of rat acetylcholine
  • CTCCTCTCAG TCCTCATACC CTCATAGTTC AGAATTAGCT GCCAAGACTT TCTGCCTAAG 360
  • CTCCGTGCCC GCTGTGCGCC GAAGTCCAGG CTGAGGAGGA GGTCTAGAGC CCCCGGCTCT 600 CCCGTCTCCC ACCAGGCTGC GGGGAACTGG CTGCCGCACC CCTCCTCCAA GTGGGGGTAG 660
  • GGCTTCCATC CTGGGCGCAT CTCAGAAGCG GACCCCTGCC CGGACGCGCC CCGCCCCCGG 840 CCCCCGCCCC GACGACGTCC TATTAGCATG AGCGACGCCA GTGGCCGGGG CACCACTCGG 900
  • CTCTGGGCAC CACGCGTCCA GTCTCCCGCC TCAGCCCCTC GGCTTGCCGG CCTTTGCGGT 1140 TGCGCTCGAA ACATCGTCCA CTGGTCCCCG AAGCATCTAA GAGCAGCGGC GCCGCGCGGG 1200
  • CCACCGCGCC AACCGGTCAG GCCCGGGCGG CGGCCACCAA ACTGTCGGAA GCGGTGGGAG 1440 CCGCGCTACA AGAGCCCCAG AGGCAGCGGC GCCTGGTGCT GGTCATCGTG TGCGTTGCAC 1500
  • TAGCTGACAT CTCCTATTCT GTGGCCTACG CGCTCGGGCC CATAGTGGCA GGCCACATCG 2700
  • CCATTTAGGT CAAGATGGTC ATTCTGCAAG AGCACTGTCC AACTTTGGCT TGGGGCCCAC 3060 CTCCTCTAAT GAATACCCTA GCCCCTCGCC CGTCCTGAAT TCCTTTGCTG GAATCCCTTC 3120
  • CTCTACGCAC CAGTCCTTCT TCTTTTGCGC AATGTAGGCC TCCTTACACG CTCGCGTTCG 1440 GAGCGCGATG TGTTGCTTGA TGAACCGCCG CAGGGTCTGT ACGACGCGGT GCGCCTGCGT 1500

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Abstract

La présente invention se rapporte à une séquence nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transport vésiculaire de l'acétylcholine, à la protéine correspondante et aux séquences promotrices impliquées dans l'expression de ladite protéine. Elle vise également des vecteurs d'expression intégrant ladite séquence et l'utilisation de cette séquence ou desdits vecteurs à des fins thérapeutiques.

Description

NOUVEAU TRANSPORTEUR VESICULAIRE DR L'ACETYLCHOLINE
La présente invention se rapporte à une séquence nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transport vésiculaire de l'acétylcholine et à la protéine correspondante. Elle vise également des vecteurs d'expression intégrant ladite séquence et l'utilisation de cette séquence ou desdits vecteurs à des fins thérapeutiques.
L'acétylcholine, ACh, est un neurotransmetteur synthétisé par l'enzyme choline acétyltransférase, ChAT. Au niveau des extrémités des neurones cholinergiques, la majorité dç 'ACh produite, est transportée du cytoplasme à l'intérieur des vésicules synaptiques. L'accumulation de l'ACh, au niveau de ces vésicules, passe par l'activité d'une ATPase qui pompe des ions H+ ce qui génère un gradient électrochimique (Anderson D.C.et al., (1982) Biochemistry 21, 3037-3043). Ce gradient est utilisé par un transporteur pour la capture de l'ACh via un échange de protons (Parsons S. M. et al., (1993), Int. Rev. neurobiol. 35, 279-390). Ce type de mécanisme est comparable à celui impliqué dans le transport des aminés biogènes au sein des vésicules synaptiques. La compréhension des différents mécanismes de régulation, intervenant au niveau de l'expression de l'ACh, serait particulièrement précieuse sur un plan thérapeutique.
Récemment, ont été clones et séquences des ADNc codant pour des transporteurs vésiculaires de l'ACh chez Caetiohabditis elegans et Torpédo (Alfonso A et al., (1993) Science 261, 617-619; Varoqui H et al., FEBS Letters 342, 97-102). L'étude des séquences des protéines correspondantes a révélé l'existence de similitudes structurales entre ces deux protéines de même que vis-à-vis de deux transporteurs vésiculaires d'aminés biogènes de mammifères, les VMAT1 et VMAT2 (Liu et al., (1992) Cell 70, 539-551). Ces caractéristiques structurales communes sont notamment (i) 12 domaines transmembranaires (TM), (ii) la présence, dans ces domaines transmembranaires, de résidus d'acides aminés chargés qui interviennent vraisemblablement dans le transport de substrat, (iii) une boucle glycosylée localisée entre TM1 et TM2, et (iv) des extrémités C et N terminales cytoplasmiques qui présentent moins de similitudes que le reste de la protéine.
La présente invention a plus particulièrement pour objet l'isolement, le séquençage et la caractérisation d'une région du gène codant pour la ChAT, capable d'exprimer un transporteur vésiculaire d'ACh ainsi que l'identification de séquences promotrices impliquées dans l'expression de ce transporteur. Elle décrit aussi des cassettes d'expression de ce gène, des vecteurs le contenant et leur utilisation pour diriger l'expression de ce transporteur.
Plus précisément, la présente invention se rapporte à une séquence nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transport vésiculaire de l'ACh caractérisée en ce qu'elle est localisée au sein du premier intron du gène codant pour la ChAT, dans la même orientation transcriptionnelle.
A partir de la région 5' du gène codant pour la ChAT de rat et plus précisément d'une carte de restriction de cette région, les inventeurs ont isolé un fragment HindlII- BamHI portant le premier intron de ce gène et en partie les séquences des deux premiers exons R et N correspondants respectivement aux extrémités 5' et 3' de ce fragment. De manière inattendue, le clonage et le séquencage de ce fragment ont révélé la présence d'une phase ouverte de lecture de 1590 pb, codant pour une protéine de l'ordre de 530 acides aminés soit d'une masse de l'ordre de 56,5kDa et présentant des similitudes, au niveau de sa séquence avec des protéines du type transporteur. Cette protéine a été identifiée comme un transporteur vésiculaire d'ACh de rat et est désignée ci-après par rVAT.
Cette séquence d'ADN est plus précisément localisée au sein du premier intron du gène codant pour la ChAT, en aval du promoteur de type R du gène de la ChAT et dans la même orientation transcriptionnelle que le gène ChAT. Elle n'est interrompue par aucun intron.
Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une séquence nucléique codant pour un transporteur vésiculaire d'ACh caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la SEQ ID N°l ou l'un de ses dérivés.
Préférentiellement, il s'agit de tout ou partie de la séquence SEQ ID N°2 ou l'un de ses dérivés.
Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et dont le produit possède l'activité indiquée. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du polypeptide correspondant pour son(ses) ligand(s), celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les séquences nucléiques chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrémité. Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions de stringence conventionnelles (Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire), ou, de préférence, dans des conditions de stringence élevées.
La présente invention entend également couvrir les séquences antisens correspondantes dont l'expression permet de contrôler la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie de la séquence nucléique considérée, transcrite dans l'orientation inverse.
Plus préférentiellement, il s'agit de la séquence nucléique codant pour le transporteur vésiculaire d'ACh de rat, la rVAT.
Compte-tenu de la localisation du gène selon l'invention à savoir dans le premier intron du gène codant pour la ChAT, en aval du promoteur ChAT de type R et dans la même orientation transcriptionnelle, les inventeurs ont cherché à savoir si les ARNms ChAT et VAT pouvaient être exprimés à partir du même promoteur.
Cette hypothèse a été vérifiée expérimentalement. Deux formes d'ARNm codant pour le transporteur VAT ont été identifiées. Elles contiennent tout ou partie de la séquence de l'exon R de type RI ou R2 (de l'ARNm ChAT) (Kengaku et al. Mol. brain Res.18: 71-76 (1993)) (figure 1) immédiatement suivie de la séquence d'un second exon débutant à 308pb en amont du codon d'initiation de la traduction (de VAT). Outre ces deux ARNm, il existe trois autres formes d'ARNm VAT, apparemment plus abondantes que les deux formes précitées, codant pour le polypeptide objet de l'invention. Une forme d'ARNm VAT contient tout ou partie de l'exon R cité ci-dessus. Les extrémités 5' des deux autres formes sont localisées en aval de l'exon R. La forme que nous désignons VI, de 2.6 kb environ, a deux extrémités 5' situées à 426 pb et 402 pb en amont du codon d'initiation de la traduction de VAT (positions 949 et 972 respectivement, sur la SEQ ID n°l). La forme d'ARNm VAT que nous désignons V2, de 3 kb environ, a plusieurs extrémitées 5' situées entre 863 pb et 888 pb en amont du codon d'initiation de la traductionde VAT (positions 486 à 51 1 de la SEQ ID n°l). La présente invention a également pour objet des régions promotrices impliquées dans l'expression de VAT et localisées dans le gène codant pour la ChAT. Il s'agit plus particulièrement de la région promotrice comprenant tout ou partie de la SEQ ID n°3 ou un de ses dérivés et de régions promotrices annexes localisées dans la SEQ ID n°l . Au sens de la présente invention, région promotrice, désigne le ou les séquences responsables de l'expression de VAT. Il s'agit en particulier de séquences promotrices, d'activation, de régulation, et/ou de séquences permettant une expression tissu-spécifique.
La SEQ ID N°3, est déjà connue pour contrôler l'expression du gène ChAT (Bejanin et al. J. Neurochem.58 : 1580-1583 (1992)). De manière inattendue, cette région s'est révélée être également responsable de l'expression du gène codant pour le VAT et plus précisément d'au moins deux types d'ARNm VAT. Il a ainsi été mis en évidence que des ARNm VAT et ChAT peuvent être produits à partir du même promoteur ChAT de type R. De plus, deux régions promotrices responsables de la production des ARNm VAT de type VI et V2 ont été identifiées en aval de l'exon R dans le premier intron du gène de la ChAT. L'ARNm VAT de type VI est produit à partir d'un promoteur situé entre les positions 584 et 1027 de la SEQ ID n°l, alors que l'ARNm de type V2 est produit à partir d'un promoteur compris entre les positions 2 et 583 de la séquence SEQ ID n°l . La présente invention a également pour objet l'utilisation de ces régions promotrices pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes. Ces régions promotrices sont également avantageuses pour cibler l'expression d'une protéine dans les neurones cholinergiques. Bien entendu, ces régions promotrices sont particulièrement utiles pour diriger l'expression d'une protéine de transport vésiculaire de l'acétylcholine, expression couplée le cas échéant avec celle d'un autre gène. L'invention concerne en outre un polypeptide impliqué dans le transport vésiculaire de l'ACh susceptible d'être exprimé par une séquence nucléique telle que décrite précédemment.
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessus, par synthèse chimique, sur la base de la séquence SEQ ID n° 2 en utilisant les techniques connues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques.
La comparaison de cette protéine avec des protéines déjà connues à titre de transporteur d'ACh, comme celles de Torpédo ou Caenorhabditis elegans a permis de mettre en évidence certaines similitudes. C'est ainsi que la protéine selon l'invention possède environ 77% d'homologie avec la protéine Torpédo et 56% d'homologie avec la protéine Caenorhabditis elegans, sur 352 acides aminés.
Dans le cas des homologies significatives précitées, on note en particulier que les 12 domaines transmembranaires, (TM), représentatifs des transporteurs déjà connus, existent dans la protéine selon l'invention. En particulier, sont présents les résidus d'acide aspartique des domaines transmembranaires 1, 6, 10 et 1 1 et le résidu lysine du domaine transmembranaire 2, qui, vraisemblablement, interviennent dans la liaison avec le substrat. La divergence importante, entre la protéine selon l'invention et les autres transporteurs connus, existe au niveau de la boucle hautement hydrophile, située entre les deux premiers domaines transmembranaires et les extrémités N- et C- terminales. Dans le cas de la présente invention, la boucle intègre deux sites potentiels de N-glycosylation.
L'ensemble de ces observations démontre l'appartenance de la protéine revendiquée à la famille des transporteurs vésiculaires de neurotransmetteurs à 12 domaines transmembranaires.
Plus précisément, il s'agit d'une protéine qui comprend tout ou partie de la SEQ ID N°l, N°2 ou l'un de leurs dérivés. Pour la définition du terme dérivé on se référera à la définition soumise précédemment.
Plus préférentiellement, il s'agit du transporteur vésiculaire de l'ACh de rat, désigné ci-après par rVAT.
Préférentiellement, les séquences nucléiques selon l'invention font partie d'un vecteur. L'emploi d'un tel vecteur permet en effet d'améliorer l'administration de l'acide nucléique dans les cellules à traiter, et également d'augmenter sa stabilité dans lesdites cellules, ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable.
Le vecteur utilisé peut être d'origines diverses, dès lors qu'il est capable de transformer les cellules animales, de préférence les cellules nerveuses humaines. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut être choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus, les virus adéno-associés (AAV), le virus de l'herpès, le cytomégalovirus (CMV), le virus de la vaccine, etc. Des vecteurs dérivés des adénovirus, des rétrovirus, ou des AAV incorporant des séquences d'acides nucléiques hétérologues ont été décrits dans la littérature [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224 ; Stratford-Perricaudet et al., Human Gène Therapy 1 (1990) 241 ; EP 185 573, Levrero et al., Gène 101 (1991) 195 ; Le Gai la Salle et al., Science 259 (1993) 988 ; Roemer et Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211 ; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353 ; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739 ; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238 ; WO91/18088].
La présente invention concerne donc également tout virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, une séquence nucléique telle que définie avant.
Avantageusement, le virus recombinant selon l'invention est un virus défectif. Le terme "virus défectif désigne un virus incapable de se répliquer dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par l'acide nucléique de l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
Il est particulièrement avantageux d'utiliser les séquences nucléiques de l'invention sous forme incorporée à un adénovirus, un AAV ou un rétrovirus recombinant défectif.
Concernant les adénovirus, il en existe différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui ne sont pas pathogènes pour l'homme, et notamment les sujets non immuno-déprimés. Par ailleurs, ces virus ne s'intègrent pas dans le génome des cellules qu'ils infectent, et peuvent incorporer des fragments importants d'ADN exogène. Parmi les différents sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). Dans le cas des adénovirus Ad 5, les séquences nécessaires à la réplication sont les régions E1A et E1B.
Les virus recombinants défectifs de l'invention peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un virus défectif et un plasmide portant entre autre la séquence nucléotidique telle que définie ci-avant (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits virus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome du virus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation d'adénovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation de rétrovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460).
Ensuite, les virus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une séquence nucléotidique, un vecteur ou un polypeptide selon l'invention.
Elle se rapporte également à toute utilisation d'une séquence ou d'un vecteur tels que revendiqués pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies affectant le système nerveux.
La séquence nucléique codant pour un transporteur de l'acétylcholine, telle que revendiquée, est en outre tout particulièrement utile pour cribler de nouveaux produits biologiquement actifs et en particulier impliqués au niveau de l'expression et/ou de la régulation en acétylcholine.
La présente invention a également pour objet des animaux transgéniques dans le génome desquels est insérée au moins une séquence nucléique codant pour un transporteur de l'acétylcholine telle que revendiquée . Les exemples et figures présentés ci-après à titre illustratif et non limitatif mettent en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
Figure. 1 • Réprésentation schématique de la région 5' du gène ChAT de rat et des différents ARNm ChAT
Les boites blanches et noires indiquent respectivement, les exons codants et non codants R, N et M sont les 3 exons ChAT non codants. La phase ouverte de lecture de 1590pb, identifiée à partir du séquençage d'un fragment de gène HindIII(H)- BamHI(B) de 3940 pb, est également représentée Le codon d'initiation potentiel de la traduction, ATG (position + 1) est bordé par une cytosine (position -1) et deux résidus de guanosine (positions -3 et +4) qui concordent avec la séquence consensus de Kozak (Kozak M J , Cell Biol 1 15, 887-903 1991) Il est précédé d'un codon stop en phase situé 726pb en amont La phase ouverte de lecture, est suivie par des séquences consensus de polyadenylation La plus probable, désignée par PA (AATAAA) (SEQ ID N°4), est située 389pb en aval du codon de terminaison.
Figure. 2 Analyse par la technique de Northern de la distribution des ARNm-rVAT dans différents tissus de rat avec une sonde spécifique de la phase ouverte de lecture (position 31-1724 telle que définie en Fig 1 )
Ligne 1 ARN poly (A)+ de moelle épinière (1 μg) ; Lignes 2-1 1 10 μg de
2,3 ARN de moelle épinière (2 préparations différentes) , 4 ARN de tronc cérébral , 5 ARN poly (A)+de glande surrénale ;
6 ARN du bulbe olfactif ,
7 ARN de cervelet ,
8 ARN de foie ,
9 ARN de moelle épinière , 10 ARN poly(A)+ de la région septale ,
1 1 ARN poly(A)+ de striatum Les blots d'ARN sont préparés en présence de marqueurs de poids moléculaires d'ARN (Gibco BRL). Les lignes 1 à 8 et 9 à 11 représentent les résultats des deux expériences indépendantes Les autoradiographies sont exposées pendant 3 jours à une température de -70°C avec un écran intensifiant Figure. 3 : Diversité des ARNm-rVAT dans la moelle épinière de rat Y sont représentés les résultats d'analyse par Southern blot des produits d'amplification d'ADNc (lignes 1,2) et des produits SLIC (lignes 3,4). Les boîtes blanches et noires indiquent respectivement les exons non codants et codants. Les oligonucléotides utilisés pour la synthèse de l'ADNc (P), pour l'amplification (deux amorces sens 1,2 en amont et une amorce antisens commune L) et pour l'hybridation des Southern (H), sont schématisés par des flèches. L'ARN poly(A)+ est soumis à une synthèse de premier brin d'ADNc avec/ou comme contrôle sans transcriptase réverse. Les amplifications de l'ADNc (+) ou des contrôles (-) avec la paire d'oligonucléotides L et 1 ou 2 sont représentées respectivement, en lignes 1 et 2. Les amplifications avec des oligonucléotides L et A5'l de l'ADNc (+) ou des contrôles (-), ligaturés ou non, sont présentées respectivement en lignes 3 et 4. Les barres verticales dans les exons R et rVAT représentent les sites d'épissage déduits des séquences des deux fragments d'ADN obtenus en ligne 1. Le site d'épissage en 5' dans l'exon R correspond à celui représenté en figure 1. La séquence consensus du site d'épissage en 3' est soulignée. La position du nucléotide situé le plus en 5' pour les produits SLIC séquences est indiquée par un astérisque.
EXEMPLE 1
Synthèse du premier brin d'ADNc (extension d'amorce) et ligation d'un oligonucléotide à l'ADNc simple brin (SLIC).
L'ARN est extrait de moelle épinière de rat en utilisant la méthode RNAzol (System Bioprobe). L'ARN poly(A)+ est purifié à l'aide du kit Dynabeads® (Dynal).
Le premier brin d'ADNc est synthétisé à partir de 1 μg d'ARN poly(A)+ dans un tampon de transcription réverse en présence de 100 μg/ml BSA, 15 unités de RNasin
(Promega), 14 mM de β-mercaptoéthanol, ImM de dNTPs, 4 mM de pyrophosphate,
7,5 pM d'oligonucléotide amorce P (Fig. 3) et 40 unités de transcriptase réverse (RTase, Promega). Le mélange réactionnel est incubé 45 minutes à 42° C. Un contrôle est effectué en l'absence de RTAse. ADNc et contrôles sont chauffés 5 minutes à 95°C afin de dénaturer les hétéroduplex ADN-ARN, puis purifiés avec le Kit Prep-A-Gène®
(Biorad). Dans les expériences de SLIC, un oligonucléotide 50 mer (A5'NV) est ligaturé à l'extrémité 3' du premier brin d'ADNc purifié en utilisant TARN ligase de T4 (Boehringer) comme décrit dans la littérature (Dumas et al., Nucleic Acids Res. 19 5227-5232, 1991). Un contrôle est effectué en absence de l'enzyme. Les produits de ligation et les contrôles sont ensuite purifiés en utilisant le Kit Prep-A-Gène.®
EXEMPLE 2. Expériences d'amplification
Les ADNc et les produits de SLIC sont amplifiés dans un Techne Thermal Cycler® (30 ou 40 cycles d'amplification respectivement). Chaque cycle consiste en :
45s à 94°C, 45s à 65°C et 50s à 72°C. Les amorces sens utilisées sont les suivantes : oligonucléotides 1 ou 2 pour les ADNc et l'oligonucléotide A5'l (complémentaire d'une partie de A5*NV) pour les ADNc ligaturés en 3'. Une amorce antisens et commune L, est utilisée. Les produits d'amplification sont séparés sur gel d'agarose à 2% et analysés par la technique de Southern blotting en utilisant l'oligonucléotide H comme sonde. Les parties du gel contenant les bandes observées sont isolées et l'ADN qu'elles contiennent est purifié, sous clone dans le plasmide pUC19 (Appligène) et séquence sur les deux brins au moyen du kit Sequenase® (USB, Amersham). Les séquences et les positions (cf. figure 1) des oligonucléotides utilisés sont :
1 (-1486, 5'-CTGTCGCTGCAAGCCAGGACTCT-3') ( SEQ ID N°5)
2 (-410, 5'-TGGAGGAAGAGGCAAGAGCGGA-3') ( SEQ ID N°6) H (+24, 5'-ACCGGTTGGCGCGGTGGGTTCCAT-3') ( SEQ ID N°7) L (+62, 5'-CACCGCTT CCGACAGTTTGGTG-3') ( SEQ ID N°8) P (+187, 5'-TGGGCGATATAGTCGG GAACAATG-3') ( SEQ ID N°9)
A5'NV (5'-CTGCATCTATCTAATGCTCCTCTCGCTACCTGCTCACTCTGCGTGA
CATC-3') ( SEQ ID N°10) A5'l (5 -GATGTCACGCAGAGTGAGCAGGTAG-3') ( SEQ ID N°l 1)
EXEMPLE 3
Analyse de l'ARN
Les ARN ou ARN poly(A)+ sont préparés à partir des tissus de rat comme décrit ci- dessus, fractionnés sur gel d'agarose (1 %)/formaldéhyde et transférés sur des membranes de nylon (Hybond N+, Amersham) comme décrit dans la littérature (Faucon Biguet et al., EMBO J., 5 287-291 1986). Les filtres sont hybrides à 42°C, dans un tampon contenant 50 % (vol/vol) de formamide, à un fragment d'ADN Smal- EcoRI (position 31-1724), marqué par amorçage aléatoire (19) avec (α-32p) dCTP (3000 Ci/mmol ; Amersham) et ayant une activité spécifique de 1.2 x 10^ cpm/μg. Les derniers lavages des filtres sont effectués à 65°C dans la solution 0.1 x SSC/0.1 % SDS.
Abréviations utilisées :
ChAT : choline acétyltransférase
ACh : acétylcholine
VMAT : transporteur vésiculaire des monoamines
TM : domaine transmembranaire rVAT : transporteur vésiculaire de l'acétylcholine de rat
SLIC : ligation du cDNA simple brin
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSAN :
(A) NOM: RHONE POULENC RORER
(B) RUE: 20 AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY CEDX (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: 40.91.69.22 (H) TELECOPIE: 40.91.72.91 (ii) TITRE DE L'INVENTION: NOUVEAU TRANSPORTEUR DE L'ACEYLCHOLINE VESICULAfRE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 11 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D1 EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 3925 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 :
AAGCTTCCAA GCCACTTGTG AGCCCACTCA GGGTTTGGAG GCGGACGGGG TGGGGGTGGG 60
GTGGGGAAAT GCAGAAAAGT GGGCGGAGGC TCTCAAGAGC CTAGGGAGGA TAAGGTCTGG 120 AAAGAAGAGG ACCTGGGAGG AGTTAGATTG AGGAGTGGGA GAGTAGAAGG GGAGGGAAAT 180
AGGCGGGGCT GGAGGCCGGG GAGACCCGCG CACCGAAAAG CCCAAAGGGA GAGTCCAGGC 240
AGGGGGAGGT CAAAAAGGGT TAGCGTTGAC ATCCAGGACC CTGGGTGCAG AGAAAGACTC 300
CTCCTCTCAG TCCTCATACC CTCATAGTTC AGAATTAGCT GCCAAGACTT TCTGCCTAAG 360
GGCGGTGGGT CGGAACCAGA GCCTGAAGGC TCTGTACCTC CCCCCTCCCT TCCCGGAGGA 420 GGGGATGGGA CGGGCTGGGG GCGGGATTGA GGAAGGGGGT TGCGTGCGCT GTGCCTCTGG 480
GTCCGGGCTG CGCGTTCCAG CTGCGAGAAC AGATGGAGGC AGCGCGGCTC ACCTCGGGGG 540
CTCCGTGCCC GCTGTGCGCC GAAGTCCAGG CTGAGGAGGA GGTCTAGAGC CCCCGGCTCT 600 CCCGTCTCCC ACCAGGCTGC GGGGAACTGG CTGCCGCACC CCTCCTCCAA GTGGGGGTAG 660
AACGGAGTCT CACCCCCATA GGTCCCAGAA CTAAGGGGAA CATAGGGCCG GTTCCTCCCA 720
CTGCTCAGCC ATCCCCAGGG GCTTGTCTAG GACTATAGCT CTCCAAATCC CCCTTCCCCT 780
GGCTTCCATC CTGGGCGCAT CTCAGAAGCG GACCCCTGCC CGGACGCGCC CCGCCCCCGG 840 CCCCCGCCCC GACGACGTCC TATTAGCATG AGCGACGCCA GTGGCCGGGG CACCACTCGG 900
GGGCCGAGAC TCACCGCGTC ATAGCCCCAA GTGGAGGGAG AAAGAAAAAA AAAGAGGCGG 960
CGGTGGAGGA AGAGGCAAGA GCGGACGGGC GGGGAGGGCT GGAGAGACGG CGGGCGGCGG 1020
CAGCATGC€C CTGGGCGGGT GCACACGGCC TCTCTGCACC GCAGGGGCTG CTTCTGCTCT 1080
CTCTGGGCAC CACGCGTCCA GTCTCCCGCC TCAGCCCCTC GGCTTGCCGG CCTTTGCGGT 1140 TGCGCTCGAA ACATCGTCCA CTGGTCCCCG AAGCATCTAA GAGCAGCGGC GCCGCGCGGG 1200
ACAATCCTTG CTTTTTTCTG AGCTCGGGGA TATGAGCCCC ACAGCCACCT GAAGCGCAGG 1260
GGGCGCTACG GCTAGGACCG CGCCCCCGAA GTACCTTATC CTAGCCTCTG CACTGCGGGA 1320
CGCCGACACC CGACTCCGGT GGAGGCATCT TAGGGAAAGC AGCCGGTAGG GGCATGGAAC 1380
CCACCGCGCC AACCGGTCAG GCCCGGGCGG CGGCCACCAA ACTGTCGGAA GCGGTGGGAG 1440 CCGCGCTACA AGAGCCCCAG AGGCAGCGGC GCCTGGTGCT GGTCATCGTG TGCGTTGCAC 1500
TGTTACTGGA CAACATGTTG TACATGGTCA TCGTGCCCAT TGTTCCCGAC TATATCGCCC 1560
ACATGCGCGG GGGCAGCGAG GGCCCGACCC TGGTCTCTGΛ GGTGTGGGAA CCCACTCTGC 1620
CGCCGCCCAC TCTGGCTAAT GCCAGTGCCT ACTTGGCCAA CACGTCGGCG TCCCCGACGG 1680
CTGCCGGGTC GGCTCGGTCA ATCCTGCGAC CTCGCTACCC CACAGAAAGC GAAGATGTGA 1740 AGATAGGTGT GCTGTTTGCC TCCAAGGCTA TCCTGCAGCT TCTGGTGAAC CCCTTAAGCG 1800
GGCCTTTCAT TGATCGCATG AGCTACGACG TGCCGCTGCT TATAGGCCTG GGCGTCATGT 1860
TCGCCTCCAC AGTCATGTTT GCCTTTGCAG AAGACTATGC CACGCTCTTC GCTGCGCGCA 1920
GTCTACAAGG CCTGGGCTCG GCCTTCGCGG ACACGTCTGG CATTGCCATG ATCGCCGACA 1980
AGTATCCCGA GGAGCCTGAG CGCAGTCGTG CCCTGGGCGT GGCGCTAGCC TTTATTAGCT 2040 TTGGAAGCCT AGTGGCGCCA CCGTTTGGGG GCATCCTCTA CGAGTTCGCG GGCAAGCGTG 2100
TACCCTTTCT AGTGCTCGCC GCTGTGTCCC TTTTCGACGC GCTCCTGCTC CTGGCGGTGG 2160
CTAAGCCCTT CTCGGCTGCG GCTCGGGCGC GAGCCAACCT GCCGGTGGGC ACACCTATCC 2220
ATCGCCTCAT GCTAGACCCT TACATCGCTG TGGTAGCCGG CGCGCTCACC ACTTGTAACA 2280
TTCCCCTTGC GTTCCTCGAG CCCACCATAG CCACGTGGAT GAAGCACACA ATGGCCGCAT 2340 CCGAGTGGGA GATGGGCATG GTTTGGCTGC CGGCTTTCGT GCCACACGTG TTAGGCGTCT 2400
ACCTCACCGT GCGCCTGGCG GCGCGTTATC CACACCTGCA GTGGCTGTAC GGCGCTCTCG 2460
GGCTAGCGGT AATTGGAGTG AGCTCTTGCG TCGTACCTGC CTGTCGCTCA TTCGCGCCGT 2520
TAGTGGTCTC GCTCTGCGGA CTCTGCTTCG GCATCGCGTT AGTGGACACA GCGCTCCTAC 2580
CCACGCTCGC CTTTCTGGTG GACGTGCGCC ACGTATCCGT CTATGGCAGT GTCTATGCCA 2640
TAGCTGACAT CTCCTATTCT GTGGCCTACG CGCTCGGGCC CATAGTGGCA GGCCACATCG 2700
TTCACTCTCT TGGCTTTGAG CAGCTCAGCC TGGGCATGGG CCTGGCCAAC CTGCTCTACG 2760 CACCAGTCCT TCTTCTTTTG CGCAATGTAG GCCTCCTTAC ACGCTCGCGT TCGGAGCGCG 2820 t
ATGTGTTGCT TGATGAACCG CCGCAGGGTC TGTACGACGC GGTGCGCCTG CGTGAGGTGC 2880
AGGGCAAGGA TGGCGGCGAA CCTTGTAGCC CACCTGGCCC TTTTGACGGG TGCGAGGACG 2940
ACTACAACTA TTACTCCCGC AGCTAGCAGA CCCGCTTCTC CTCCAGGCCA CCTACCCGCC 3000
CCATTTAGGT CAAGATGGTC ATTCTGCAAG AGCACTGTCC AACTTTGGCT TGGGGCCCAC 3060 CTCCTCTAAT GAATACCCTA GCCCCTCGCC CGTCCTGAAT TCCTTTGCTG GAATCCCTTC 3120
TCCATGACCC CTCCCAGTCT AGGCCCCTCC CAAACACACT CGTATTCATT GGGGAAATGG 3180
AGCAGGGAGG CAGAAGAAGC TGTTGGGCTC TTGGCAGAGG TGAAGAGGTG TGCGGGTGAT 3240
CGCCAATCAC CTACTGAGAG CCCCCAAATA GAGTCATGCA TCTGTTTGTC CTTCCTGCGG 3300
ATCTTTCCAG TGCCAAACTT GGTCTCTGCA CTCCGGTGCC TCCGGCCTGA ATTAATAAAC 3360 CATATCTATC TGAGGAGGCC GAGTCTCTTT ACTGATGAGG GGTGGGTGGT GTGACACAAG 3420
ACCTAAGCAC AGAGAAGGCT GCCTGGGTTT CACAGGTTCA GTCCAGACCT GAGGAGGAGG 3480
GGAAGCCTGA AGCGTCTTTG CTGCCTGGTA AAAGAACCCA AAGGAGGGCT CTCCCCCATG 3540
GATATTCAGA ACACACACAC ACACACACAC ACTCACACAC ACACACACAC ACACACACAC 3600
ACACACGAAC GATAGACAGA CAGACAGACA GACAGACAGA CAGACAGTCT CTCCCTTCCA 3660 AGTCCAGTGT AGCACCTGGA GGTTCCACCC GAGGGAGCCT GAGGATCTGC CTGGCCTTGG 3720
AGGATAGCTG GCACCAGGAA TTTTGGGTGC CAGGACTGGG CTTTCCTACA CAGTGGGAAC 3780
TCGCTTCATG TTGTCAAGAA AGGGAGCTGT TTTCTGCAGA GAAGAGGAGG TAGTCCCGTC 3840
TTTTAGGGTC CTGGCCTGGG GACAGTGTTC ATTAAGGATT CAGGCTCTTT CTGTGAAGAC 3900
TGAGAGGACA CTTACCTGTG GATCC 3925 (3) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1593 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATGGAACCÇA CCGCGCCAAC CGGTCAGGCC CGGGCGGCGG CCACCAAACT GTCGGAAGCG 60
GTGGGAGCCG CGCTACAAGA GCCCCAGAGG CAGCGGCGCC TGGTGCTGGT CATCGTGTGC 120 GTTGCACTGT TACTGGACAA CATGTTGTAC ATGGTCATCG TGCCCATTGT TCCCGACTAT 180
ATCGCCCACA TGCGCGGGGG CAGCGAGGGC CCGACCCTGG TCTCTGAGGT GTGGGAACCC 240
ACTCTGCCGC CGCCCACTCT GGCTAATGCC AGTGCCTACT TGGCCAACAC GTCGGCGTCC 300
CCGACGGCTG CCGGGTCGGC TCGGTCAATC CTGCGACCTC GCTACCCCAC AGAAAGCGAA 360
GATGTGAAGA TAGGTGTGCT GTTTGCCTCC AAGGCTATCC TGCAGCTTCT GGTGAACCCC 420 TTAAGCGGGC CTTTCATTGA TCGCATGAGC TACGACGTGC CGCTGCTTAT AGGCCTGGGC 480
GTCATGTTCG CCTCCACAGT CATGTTTGCC TTTGCAGAAG ACTATGCCAC GCTCTTCGCT 540
GCGCGCAGTC TACAAGGCCT GGGCTCGGCC TTCGCGGACA CGTCTGGCAT TGCCATGATC 600
GCCGACAAGT ATCCCGAGGA GCCTGAGCGC AGTCGTGCCC TGGGCGTGGC GCTAGCCTTT 660
ATTAGCTTTG GAAGCCTAGT GGCGCCACCG TTTGGGGGCA TCCTCTACGA GTTCGCGGGC 720 AAGCGTGTAC CCTTTCTAGT GCTCGCCGCT GTGTCCCTTT TCGACGCGCT CCTGCTCCTG 780
GCGGTGGCTA AGCCCTTCTC GGCTGCGGCT CGGGCGCGAG CCAACCTGCC GGTGGGCACA 840
CCTATCCATC GCCTCATGCT AGACCCTTAC ATCGCTGTGG TAGCCGGCGC GCTCACCACT 900
TGTAACATTC CCCTTGCGTT CCTCGAGCCC ACCATAGCCA CGTGGATGAA GCACACAATG 960
GCCGCATCCG AGTGGGAGAT GGGCATGGTT TGGCTGCCGG CTTTCGTGCC ACACGTGTTA 1020 GGCGTCTACC TCACCGTGCG CCTGGCGGCG CGTTATCCAC ACCTGCAGTG GCTGTACGGC 1080
GCTCTCGGGC TAGCGGTAAT TGGAGTGAGC TCTTGCGTCG TACCTGCCTG TCGCTCATTC 1140
GCGCCGTTAG TGGTCTCGCT CTGCGGACTC TGCTTCGGCA TCGCGTTAGT GGACACAGCG 1200
CTCCTACCCA CGCTCGCCTT TCTGGTGGAC GTGCGCCACG TATCCGTCTA TGGCAGTGTC 1260
TATGCCATAG CTGACATCTC CTATTCTGTG GCCTACGCGC TCGGGCCCAT AGTGGCAGGC 1320 CACATCGTTC ACTCTCTTGG CTTTGAGCAG CTCAGCCTGG GCATGGGCCT GGCCAACCTG 1380
CTCTACGCAC CAGTCCTTCT TCTTTTGCGC AATGTAGGCC TCCTTACACG CTCGCGTTCG 1440 GAGCGCGATG TGTTGCTTGA TGAACCGCCG CAGGGTCTGT ACGACGCGGT GCGCCTGCGT 1500
GAGGTGCAGG GCAAGGATGG CGGCGAACCT TGTAGCCCAC CTGGCCCTTT TGACGGGTGC 1560
GAGGACGACT ACAACTATTA CTCCCGCAGC TAG 1593
(4) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: e
(i) "CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1902 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AAGCTTTTTG CTGAAGGCGA TCCTTCCCTG ACTGTGGCCC CATATCCTTC CGATGTAAAG 60
TCTCTGCCTT CTTATTTGGA AGCTAAAGAA TGTCATTTAG GGACCTGGAA GGAGCCAAAC 120
CCATGCCTCC CTCACTCCGA TTTTATTTGC CTAGGTGTGT GTGCCACACT GCACATGGAG 180 TGACACAGGC GTAATGAAAC ACAAGGGAAA GGGAGGTGGC ACGAAGACCT CAAAGCAGGT 240
CCCAACAGCC TGGAAACTCA ACAAGTGACC ATCTCCCTTC TCCATGCCTA GTTTCCTATG 300
GGGGTGTGTG ATGGGGGTGG GGTGGATAGC ATCTACATTG TACCAAGATT GAGGAAGGAC 360
GGAGTGAGCT CACCCATGGC CCTGGCACGA AACCAGTGGG TCTGCACCTT ATCAGAGAGG 420
AACGGAGGAG CAGAGAGTTG GGTGCGAGTC CCAGAATGAA TTGGCTTCAT TCTCAGGAAG 480 CCATGGATTA TTATGTGGGC TGGAGGGCTG AGAGACAAGG TCTGCCTCTT GCTAGCACTG 540
GGAAGTTTCT TTCCTGAAAG ATTCTACTGT CCACTAACCA CCAGAAAGAA AACTGCTGCC 600
TGCGGTGTTG TCCTGCACCC TGATTTTATT CAGTCAGAGC GGCAATATAT GAATAAGTAA 660
TCACGACCAT GTAGGGCAGG AAATACCTCT TTAAAAACCA CCAGTGGGAT TTTCATAGAA 720
AAGTCAGAGG AACCCAGAGC GTTCTTAAAC TCCAGTGTCT GGAGAGCCAA GCAGGTGACA 780 GACAGAGTTC ATGAAGCAAG CTGAGGGAAA ACCCCATCGC TGGAGTGTGT GCTATGAACA 840
AAGGCACCAG GATAATATTT AAAGTTGTTT CACCGCACTT TCTGCAAGGT GGATCTTGGT 900
AATCTCTTGA TGAACAGAGG CCAAGTGGGC CAGGGTTAGT GGGGAATGTG GCTTGCCCAA 960 TGCTTTCCAT AGCCATGGCT GTCCCCATAG TTAGGCTTCC TCCCTCATTT TGAGGGCAGC 1020
TGGGCCACTG CAGGGTATGT GATGGGCAGC TCTCTACTCA GATGAGTCTG TTCCTTTCAG 1080
GAGTACCTGT GTACAGGTTG GGAGGTTGGG CACTAGACCA CTTGATTGCT GCCTCTCTCC 1140
CTGACTCTGT TCTCCATCAC CTCCTCTTGC AACTGGCTTA AGAACAGAAG CCAGCCAATT 1200 TTCCAGCTCC TTCTGTATCT TCCACCATCC CAGACAGAGT CCAGGCTCAC AATGCCTACC 1260
CAACTGAGGA AGAAATCAGA GAGTCAGGAT GCTCCCGGTG TCTGACTGCC CTTCACAAGA 1320
CCCTCATGAA CACAAGGCAG CAAGCACATG CTATAACAAC AACGGCAAAT GCTAATGATT 1380
CACACCACÇC GTGTGCCACA CCCTAGTTGT ACGTACTCCT ATTCCATTTT ACAGATAAAT 1440
AAAGGGGCGG TGGGGGCAGA GGGAGGAAAC AACGGCTCCC TTGGCACTGT TATCTAGTAA 1500 GTGGCAGCAC TGGGAGCCAT CCTATCTGTC TGCATCTGGA GCTCAAATCG TGATGCCTCC 1560
TTCGGTGGAG GAAGGCTAGC TTGGGATATG GAGGCTACTG TGACTCCGGA AGACAGAGAA 1620
AAGTCCAATC TCAACAACGT CACCACTATC CCCAATCTCA GCTGACTGGC ATCCTCTCTC 1680
CTGCCAGTCT GTGGACGGGA ACGCGGGCCT CACGTGCCAT CTAGGGTCAA AACTCGTCTG 1740
AGGACACACA CTGGGCCCAA CGCAGAGGCT GATCTGTTCA GCCTGTCGGC TGCAAGCCAG 1800 GACTCTCAGC TTGTGCAGCA CCCCCGGAAG GAAGGTGAGC CTTCCTAAGC CTCTACTGAC 1860
AGCAAAGCTG CAGAGGCCCT GCCGCGTGAG ACCCAGAAGC TT 1 02
(5) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR:6 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4
AATAAA (6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:23 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CTGTCGCTGC AAGCCAGGAC TCT 23
(7) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:22 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(i ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
TGGAGGAAGA GGCAAGAGCG GA 22
(8) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: ACCGGTTGGC GCGGTGGGTT CCAT 24
(9) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CACCGCTTCC GACAGTTT GGTG 24
(10) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
TGGGCGATAT AGTCGGGAAC AATG 24
(11) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR:50 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
CTGCATCTAT CTAATGCTCC TCTCGCTACC TGCTCACTCT GCGTGACATC 50
(12) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple '» (D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m) HYPOTHETIQUE: NON (ni) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11
GATGTCACGC AGAGTGAGCA GGTAG 25

Claims

REVENDICATIONS
1. Vecteur comprenant une séquence nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transport vésiculaire de l'acétylcholine.
2.Vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite séquence est représentée en tout ou partie par la séquence SEQ ID n°l.
3. Vecteur selon la revendication 1 caractérisée en ce que ladite séquence est représentée en tout ou partie par la séquence SEQ ID n°2.
4. Vecteur selon la revendication 1 caractérisée en ce que ladite séquence est représentée par la séquence codant pour la protéine rVAT.
5. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
6. Vecteur selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur dérivé des adénovirus, des rétrovirus, des AAV, du virus HSV, CMV ou du virus de la vaccine.
7. Vecteur selon les revendications 5 ou 6 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus défectif pour la réplication.
8. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs vecteurs selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Composition pharmaceutique comprenant une ou plusieurs séquences nucléiques telles que définies dans les revendications 1 à 4, ou un polypeptide correspondant
10. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 4 ou d'une séquence telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de pathologies affectant le système nerveux.
11. Régions promotrices susceptible d'exprimer une séquence codante selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce qu'il s'agit de la région comprise entre les positions 584 et 1027 de la séquence SEQ ID n°l et/ou de la région compriseentre les positions 2 et 583 de la séquence SEQ ID n°l.
12. UTilisation d'une région selon la revendication 11 pour cibler l'expression d'une protéine dans les neurones cholinergiques;
13. Utilisation d'une région promotrice selon la revendication 11 ou de la région promotrice représentée par la SEQ ID n°3 pour le contrôle de l'expression d'une protéine de transport vésiculaire de l'acétylcholine.
l'4. Animal transgénique caractérisé en ce qu'il comprend dans son génome au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine impliquée dans le transport vésiculaire de l'acétylcholine (ACh) telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4.
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