MXPA02010684A

MXPA02010684A - Secuencias de acido nucleico regulador del gen abc1.

Info

Publication number: MXPA02010684A
Application number: MXPA02010684A
Authority: MX
Inventors: Bryan Brewer
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2000-05-02
Filing date: 2001-05-02
Publication date: 2003-03-10
Also published as: JP2003531613A; NO20025265D0; FR2809414B1; WO2001083746A3; AU785155B2; US7378274B2; EP1280911A2; KR20020097242A; BR0110541A; AU6595601A; WO2001083746A2; ZA200208847B; IL152548A0; US20020146792A1; FR2809414A1; NZ522360A; CA2407737A1; NO20025265L

Abstract

La presente invencion se refiere a un acido nucleico que es capaz de regular la trascripcion del gen ABC1, que es un gen causal para las patologias enlazadas a una disfuncion del metabolismo de colesterol, que induce enfermedades tal como aterosclerosis. La invencion tambien se refiere a construcciones de nucleotidos que comprenden un polinucleotido que codifica para un polipeptido o un acido nucleico de interes, colocado bajo el control de un acido nucleico regulador para el gen ABC1. La invencion tambien se refiere a vectores recombinantes, celulas hospedadoras transformadas de mamiferos transgenicos no humanos que comprenden un acido nucleico que regula la trascripcion del gen ABC1 o una construccion de nucleotidos mencionada anteriormente, asi como a metodos para detectar moleculas o sustancias que son capaces de modificar la actividad del acido nucleico regulador para el gen ABC1.

Description

SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO REGULADOR DEL GEN ABCl Antecedentes La presente invención se refiere a un ácido nucleico que es capaz de regular la trascripción del gen ABCl que es un gen casual para patologías enlazadas a una disfunción del metabolismo del -colesterol, incluyendo enfermedades tal como aterosclerosis. La invención también se refiere a construcciones de nucleótidos que comprenden un polinucleótido que codifica para un polipéptido o un ácido nucleico de interés, colocado bajo el control de un ácido nucleico regulador para el gen ABCl. La invención también se refiere a vectores recombinantes, células hospedadoras transformadas y mamíferos transgénicos no humanos que comprenden un ácido nucleico que regula la trascripción del gen ABCl o una construcción de nucleótidos mencionada anteriormente, así como a métodos para detectar moléculas y sustancias que son capaces de modificar la actividad del ácido nucleico regulador para el gen ABCl . La invención también se refiere a métodos para detectar un daño en la trascripción del gen ABCl en un individuo en riesgo. Un objeto de la invención" también son las REF. : 142863 sustancias o moléculas que modifican la actividad del ácido nucleico que regula la trascripción del gen ABCl, así como composiciones farmacéuticas que contienen estas sustancias o estas moléculas. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) son una de las cuatro principales clases de lipoproteínas que circulan en el plasma sanguíneo. Estas lipoproteínas están comprendidas en varias rutas metabólicas, tal como el transporte de lípidos, formación de ácido biliar, esteroidogénesis o proliferación celular, y también interfieren con el sistema de proteinasa plasmática. Las HDL son aceptores de colesterol libre, perfectos, y en combinación con Jas proteínas de transferencia del éster de colesterol (CETP) , lipasa de lipoproteína (LPL) , lipasa hepática (HL) y lecitina-colesterol-aciltransferasa (LCAT) , juegan un papel importante en el transporte invertido de colesterol, es decir, el transporte de colesterol en exceso en las células periféricas al hígado, para su remoción del cuerpo en la forma de ácido biliar. Se ha demostrado que las HDL juegan en general un papel central en el transporte del colesterol desde los tejidos periféricos al hígado. Se han descrito varias enfermedades enlazadas a una deficiencia de HDL, incluyendo enfermedad de Tangier, deficiencia de HDL y deficiencia de LCAT. La deficiencia comprendida en la enfermedad de Tangier está enlazada a un defecto celular en la transcolocación de colesterol celular, que conduce a una degradación de las HDL. En la enfermedad de Tangier, este defecto celular conduce a una alteración del metabolismo de las lipoproteínas. Las partículas de HDL en la enfermedad de Tangier, que no incorporan colesterol desde las células periféricas, y que no son capaces para ser etabolízadas correctamente, se eliminan rápidamente del cuerpo. La concentración en plasma de las HDL en estos pacientes se reduce de esta manera de forma extrema, y las HDL no contribuyen por más tiempo al retorno del colesterol al hígado. Este colesterol se acumula en estas células periféricas y provoca las características de manifestaciones clínicas tal como formación de anginas de color naranja. Además, se observan en general otras alteraciones de las lipoproteínas tal como una producción en exceso de triglicéridos y una síntesis incrementada y catabolismo intracelular de los fosfolípidos. La enfermedad de Tangier, los síntomas de la cual se han descrito anteriormente, se clasifica entre las condiciones familiares enlazadas al metabolismo de las HDL que se detectan comúnmente en pacientes .afectados por enfermedades coronarias . Numerosos ^estudios han mostrado que un nivel reducido de colesterol de HDL es un factor de riesgo que se útil para detectar una condición coronaria. En este contexto, los síndromes enlazados a las deficiencias de HDL, han sido de interés creciente durante la década pasada, puesto que hace posible incrementar el entendimiento del papel de las HDL en la aterogénesis . Se han caracterizado varias mutaciones en el gen apo A-l. Estas mutaciones son raras y puede conducir a una ausencia de producción de apo A-l. La mutación en los genes que codifican para la lipasa de lipoproteína (LPL) o su activador apoC-II se asocian con hipertrigliceridemias severas y niveles sustancialmente reducidos de HDL-c. Las mutaciones en el gen que codifica para la enzima lecitina-colesterol-aciltransferasa (LCAT) también están asociadas con deficiencia severa de HDL. Además, las alteraciones en el transporte invertido de colesterol se pueden inducir por deficiencias fisiológicas que afectan al menos uno _ de los pasos para transportar el colesterol almacenado desde las vesículas intracelulares hacia la superficie de membrana, donde se acepta por las HDL.

Recientemente, se llevó a cabo un . estudio de la segregación de varias formas alélicas de los 343 marcadores microsatelitales distribuidos sobre el genoma completo y distante entre si por 10.3 cM en promedio. El estudio de enlaces se llevó a cabo en una familia que se ha caracterizado bien sobre once generaciones, en las cuales muchos miembros están afectados por la enfermedad de Tangier, la familia- que comprende cinco líneas consanguíneas. Este estudio hizo posible identificar una región localizada en el locus 9q31 del cromosoma 9 humano que esta estadísticamente enlazado a la condición (Rust S. et al., Nature Genetics Vol. 20, Septiembre de 1998, páginas 96-98). Sin embargo, el estudio de Rust et al. solo caracteriza una región amplia del genoma en la cual probablemente van a estar asociados los daños con la enfermedad de Tangier. El estudio señaló simplemente que la región 9q31-34 pertinente contiene EST, pero no el gen conocido- Se ha mostrado que una región que abarca 1 cM, situada en el locus 9q31 en los humanos, esta en generalmente asociada con las deficiencias familiares de HDL (Rust et al. , 1999) . Además, se ha mostrado que un gen que codifica para una proteína de la familia de los transportadores ABC, que se localiza precisamente en la región 1 cM del locus 9q31, esta comprendida en las patologías enlazadas a una deficiencia en el transporte invertido de colesterol . Por ejemplo, se ha mostrado que el gen que codifica para el transportador ABC-1 esta mutado en pacientes con transporte invertido, afectado, de colesterol, tal como en pacientes que sufren de la enfermedad de Tangier. Las proteínas del transportador ABC ("cartucho de unión a ATP") constituyen una familia de proteínas que están extremadamente conservadas en la evolución, de bacterias a humanos . Las proteínas del transportador ABC están comprendidas en el transporte por membrana de varios sustratos, por ejemplo iones, aminoácidos, péptidos, azucares, vitaminas u hormonas esteroides. La caracterización de la secuencia completa de aminoácidos de algunos transportadores ABC ha hecho posible determinar que estas proteínas tienen una estructura general común, por ejemplo, dos pliegues de unión a nucleótido (Pliegue de Unión a Nucleótido o NBF) con porciones del tipo Caminante A y Caminante B, así como dos dominios transmembrana, cada uno de los dominios transmembrana que consiste de seis hélices. La especificidad de los transportadores ABC para las varias moléculas transportadas parece estar determinada por la estructura de los dominios transmembrana, en tanto que la energía requerida para la actividad de transporte se proporciona al degradar ATP en el pliegue NBF. Varias de las proteínas del transportador ABC que se han identificado en humanos se han asociado con varias enfermedades . Por ejemplo, la fibrosis cística se provoca por mutaciones en el gen CFTLR (regulador de conductancia transmembrana de fibrosis cística) . Además, algunos de los fenotipos de resistencia a varios fármacos en célula de tumor se han asociado con mutaciones en el gen que codifica para la proteína MDR (resistencia a varios fármacos) que también tienen estructura de transportador ABC. Otros transportadores ABC se han asociado con condiciones neuronales y de tumor (patente de los Estados Unidos No. 5,858,719), o están potencialmente implicados en enfermedades provocadas por un daño de la homostasis de metales, por ejemplo, la proteína ABC-3. De manera similar, otro transportador ABC referido como PFIC2 , parece estar comprendido en una forma de colestasis intrahepática familiar, progresiva, esta proteína que es potencialmente responsable, en los humanos, de la exportación de sales biliares.

En 1994, se identificó un ADNc que codifica para un nuevo transportador ABC de ratón y se refirió como ABCl (Luciani et al., 1994). Esta proteína es característica de los transportadores ABC ya que tiene una estructura simétrica que comprende dos dominios transmembrana enlazados a un segmento altamente hidrófobo y a dos porciones NBF. En humanos, un ADNc parcial que comprende el cuadro de lectura abierto, completo del transportador ABCl humano se ha identificado (Langmann et al., 1999) . También se ha mostrado que el gen que modifica para la proteína ABCl humana se expresa en varios tej idos y de manera más particular a altos niveles en la placenta, el hígado, los pulmones, las glándulas suprarrenales y los tejidos fetales. Estos autores también han mostrado que la expresión del gen que codifica para la proteína ABCl humana se induce durante la diferenciación de los monocitos en los macrófagos in vitro. Además, la expresión del gen que codifica para la proteína ABCl se incrementa cuando los macrófagos humanos incuban en la presencia de lipoproteínas de baja densidad acetiladas (AcLDL) . El trabajo de Rust S. et al., 1999, Brooks- ilson A. et al., 1999, Bodzioch M. et al., 1999, Remaley A. et al., 1999 y de Marcil M. et al., 1999 ha mostrado que los pacientes que sufren de la enfermedad de Tangier y de deficiencias de HDL (FHD; deficiencia familiar de HDL) tienen un gen ABCl mutado. Varias mutaciones, están distribuidas en varias regiones del gen ABCl, se han identificado en el genoma de varios pacientes, por ejemplo, en pacientes con una forma severa de la enfermedad asociada con trastornos coronarios. Además, se han encontrado polimorfismos diversos, tanto en los exones como en los intrones del gen ABCl, en pacientes que sufren de formas moderadas de la enfermedad, indicando que estos pacientes tienen alelos específicos del gen, que son distintos del (los) alelo (s) "tipo silvestre". Aunque la expresión del gen ABC1 humano parece estar regulada de acuerdo al tipo de célula o la situación metabólica de un tipo dado de célula, la(s) secuencia (s) que hace (n) posible regular este gen no se conoce (n) . De esta manera, existe una necesidad en el estado de la técnica de identificar estas secuencias reguladoras, por las dos principales razones a continuación: a) Estas secuencias probablemente van a estar mutadas en pacientes que sufren de una patología enlazada a una deficiencia en el transporte de colesterol, por ejemplo, en pacientes que sufren de la enfermedad de Tangier, o probablemente desarrollen estas patologías. La caracterización de las secuencias reguladoras del gen ABCl humano hará posible, primeramente, detectar mutaciones en pacientes y por ejemplo, también diagnosticar los individuos quienes corresponden a grupos familiares en riesgo. Además, . ei aislamiento de estas secuencias reguladoras hará posible complementar la secuencia mutada con una secuencia funcional capaz de superar las alteraciones metabólicas inducidas por la(s) mutación (es) diagnosticada (s) a través de la construcción de medios terapéuticos buscados como objetivo, tal como medios propuestos para la terapia génica. b) La caracterización de las secuencias reguladoras del gen ABCl colocará a la disposición de personas expertas en la técnica un medio capaz de permitir la construcción, por ingeniería genética, y luego la expresión, de los genes dados en los tipos de células en los cuales se expresa en gen ABCl. c) Además, algunas porciones de las secuencias reguladoras del gen ABC1 pueden constituir secuencias promotoras constitutivas de alto nivel de expresión, que son confiables en permitir la construcción de nuevos medios para expresar secuencias dadas en las células, terminando un conjunto ya existente de medios. A la fecha, a pesar de los esfuerzos emprendidos, han permanecido totalmente desconocidas las secuencias reguladoras del gen ABCl. Los inventores han aislado de aquí en adelante y entonces secuenciado un ADN genómico que comprende los dos primeros exones del gen ABC1 (respectivamente, exón ÍA y exón IB) , así como una región no transcrita de aproximadamente 2.9 kb, que esta localizada en el lado 5' del exón ÍA, y que comprende señales de regulación para el gen ABCl .

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1 : ilustra una porción de la secuencia SEQ ID No. 3, que inicia con el nucleótido en la posición 1 de la secuencia SEQ ID No . 3. La posición de cada una de las porciones de unión características para los varios factores de trascripción se representa por cuadros, la designación del vector de trascripción específico para la secuencia correspondiente que se indica por arriba de la secuencia de nucleótidos . Figura 2A: es una ilustración esquemática que muestra la ubicación de las mutaciones de punto introducidas en la región promotora -200 pb del gen ABCl humano; Figura 2B: exhibe la actividad de luciferasa en células RAW después de la transfección con las construcciones mutante y tipo silvestre. Los datos mostrados representan la media de 3 estudios independientes de transfección. Los valores expresan con relación a la construcción tipo silvestre; Figura 3: se transfectaron células RAW 264.7 con la construcción tipo silvestre (p200-L) o la construcción LiXR mutante (p200-LXRm) junto con un plásmido de expresión de ß-galactosidasa. Tres horas después de la transfección, se volvieron alimentar las células con medio fresco que contiene FCS al 10 %. Dieciséis horas más tarde, las células se lavaron con PBS y se volvieron a colocar con medio DMEM que contiene BSA al 0.1 % y se adicionó 50 µg/ml de colesterol, 2 µg/ml de 22 (R) -HOch, 10 µM de 9CRA o, 2µg/ml de 22 (R) -HOch más lOµM de 9CRA durante 24 horas. Se analizaron los lisados celulares para la actividad de luciferasa y ß-galactosidasa. Los valores de luciferasa se normalizaron a ß-galactosidasa y se expresaron como media ± SEM. Figura 4: se transfectaron células RAW 264.7 con la const-rucción tipo silvestre (p200-L) , construcción E-box mutante (p200-EBm) o la construcción E-box suprimida (p200-EBd) junto con un plásmido de expresión de ß-galactosidasa. Se realizió la adición de 50 µg/ml de colesterol, 2 µg/ml de 22 (R) -HOch, 10 µM de 9CRA o, 2µg/ml de 22 (R) -HOch más lOµM de 9CRA. Se analizaron los lisados celulares para la actividad de luciferasa y ß-galactosidasa. Los valores de luciferasa se normalizaron a la actividad de ß-galactosidasa y se expresaron como media ± SEM. Figura 5 : Un fragmento radismarcado (-171 a -77 pb) del promotor gen ABCl se digirió con diferentes concentraciones de DNasel en la presencia (+) o ausencia (-) de extracto nuclear de células RAW (NE) . Las escaleras G y G+A de la secuencia de Maxam y Gilbert del fragmento radiomarcado se muestran. La posición de nucleótidos con relación al sitio de inicio de trascripción y la ubicación de las porciones Spl, API y EB en el promotor hABCl se indican a la derecha; Figura 6A: ilustra las ondas usadas para el análisis de desplazamiento en gel. El fragmento A (100 pb) incluye porciones de unión para Spl y API y el E-box. El fragmento EB (27 pb) contiene E-box y el fragmento EBm (no mostrado) contiene E-box mutado. En los paneles B y C, los fragmentos marcados (fragmentos A, EB o EBm) usados para el estudio de desplazamiento de gel se muestran en la parte superior de cada gel . La incubación de la sonda radiomarcada con el extracto nuclear (NE) de células RAW se indica (+) ; Figura 6B : muestra el análisis de desplazamiento en gel realizado al incubar los extractos nucleares de células RAW con el fragmento radiomarcado A (izquierda) , EB (parte media) o EBm (derecha) en la presencia o ausencia de competidores específicos (fragmento no marcado A, EB o EBm) ; Figura 6C: muestra análisis de superdesplazamiento en los Fragmentos A o EB con anticuerpos específicos a los extremos amino (N) o carboxilo (C) de USF1 y USF2. Las fechas indican la posición de la sonda hecha compleja con la proteína y las fechas con un asterisco indican la posición del complejo superdesplazado en el anticuerpo.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Generales Para el propósito de la presente invención, el término "aislado" se refiere a un material biológico (ácido nucleico o proteínas) que se ha extraído de su ambiente de origen (el ambiente del cual se localiza de forma natural) . Por ejemplo, un polinucleótido presente en el estado natural en una planta o un animal no esta aislado. El mismo polinucleótido separado de los ácidos nucleicos adyacentes entre los cuales esta insertado de forma natural en el genoma de la planta o el animal, se considera que esta "aislado". Este polinucleótido se puede incluir en un vector y/o este polinucleótido se puede incluir en una composición, y puede permanecer, sin embargo, en el estado aislado, debido a que el vector o la composición no constituyen su ambiente natural. El término "purificado" no requiere que el material se presente en una forma de pureza absoluta, excluyendo la presencia de otros compuestos. Más bien, es una definición relativa. Un polinucleótido está en el estado "purificado" después de la purificación del material de inicio, o después de la purificación del material natural, en donde las impurezas se presentan después de la purificación en una cantidad de al menos una orden de magnitud menor que la cantidad de impurezas antes de la purificación. En una modalidad, las impurezas se presentan después de la purificación en una cantidad de 2 ó 3 órdenes de magnitud menor que la cantidad de impurezas antes de la purificación. En otra modalidad, las impurezas se presentan después de la purificación en una cantidad de 4 ó 5 órdenes de magnitud menor que la cantidad de impurezas antes de la purificación. Para los propósitos de la presente descripción la expresión "secuencia de nucleótidos" se puede usar para referirse de manera indiscriminada a un polinucleótido o un ácido nucleico. La expresión "secuencia de nucleótido" abarca el material genético mismo, y de esta manera no se restringe a la información con relación a su secuencia. Los términos "ácido nucleico", "polinucleótidos", "oligonucleótidos" y "secuencia de nucleótidos" abarcan secuencias de ARN, ADN o ADNc, o secuencias híbridas de ADN/ARN de más de un nucleótido, indiscriminadamente en la forma de cadena individual o en la forma dúplex. El término "nucleótido" se refiere tanto a nucleótidos naturales (A, T, G, C) y nucleótidos modificados, que comprenden al menos una modificación tal como (1) un análogo de purina (2) un análogo de pirimidina o (3) una azúcar similar, ejemplos de estos nucleótidos modificados se describen por ejemplo en la solicitud de PCT No. WO 95/04 064. Para los propósitos de la presente invención, un primer polinucleótido se considera como que es "complementario" a un segundo polinucleótido cuando cada base del primer nucleótido esta apareada con la base complementaria del segundo polinucleótido, la orientación del cual esta invertida. Las bases complementarias son A y T (o A y U) , o C y G. "Variante" de un ácido nucleico de acuerdo con la invención se entenderá que significa un ácido nucleico que difiere por una o más bases con respecto al polinucleótido de referencia. Un ácido nucleico variante puede ser de origen natural, tal como una variante alélica encontrada de forma natural, o también puede ser una variante no natural obtenida, por ejemplo, por técnicas de mutagénesis. En general, las diferencias entre el ácido nucleico de referencia y el ácido nucleico variante son pequeñas, tal que las secuencias de nucleótidos del ácido nucleico de referencia y del ácido nucleico variante están muy cercanas y en muchas regiones, son idénticas. Las modificaciones de nucleótidos presentes en un ácido nucleico variante pueden ser imperceptibles, lo que significa que no alteran las secuencias de aminoácidos purificadas por el ácido nucleico variante. Sin embargo, los cambios de nucleótidos en un ácido nucleico variante pueden también dar por resultado sustituciones, adiciones o supresiones en el polipéptido codificado por el ácido nucleico variante, con respecto a los péptidos codificados por el ácido nucleico de referencia. Además, las modificaciones de nucleótidos en las regiones de modificación pueden producir sustituciones, que pueden ser conservadoras o no conservadoras en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, los ácidos nucleicos variantes de acuerdo con la invención codifican polipéptidos que conservan más o menos la misma función o actividad biológica como el polipéptido del ácido nucleico de referencia o la capacidad de ser reconocidos por anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos codificados por el ácido nucleico inicial . Algunos ácidos nucleicos variantes codificaran de esta manera para formas mutadas de los polipéptidos, el estudio sistemático de los cuales hará posible deducir las relaciones de estructura y actividad para las proteínas en cuestión. El conocimiento de estas variantes con respecto a la enfermedad estudiada es fundamental, puesto que hace posible entender la causa molecular de la patología. Un "fragmento" de un ácido nucleico de referencia de acuerdo con la invención, se propone que signifique una secuencia de nucleótidos que es más corta en longitud que la secuencia de nucleótJdos del ácido nucleico de referencia y que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica a una porción de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de referencia. Este "fragmento" es el nucleico de acuerdo con la invención se puede incluir, si se necesita, en la secuencia de nucleótidos de un segundo polinucleótido diferente del ácido nucleico de referencia. El nucleótido resultante que comprende el "fragmento" y el segundo polinucleótido pueden tener una secuencia de nucleótidos que es más larga que, de la misma longitud, o más corta que la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de referencia. Estos fragmentos comprenden, o consisten de forma alternativa de, oligonucleótidos de longitudes que varían de 20 a 25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 o 1500 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de acuerdo con la invención. El "fragmento biológicamente activo" de un ácido que regula la trascripción de acuerdo con la invención se propone que signifique un ácido nucleico que es capaz de modificar la trascripción de una secuencia de ADN colocada bajo su control. Este fragmento biológicamente activo comprende un promotor básico y/o un elemento regulador, como se define en la presente descripción.

El "ácido nucleico regulador" de -acuerdo con la invención se propone que signifique un ácido nucleico que activa y/o regula Ja expresión de una secuencia de ADN que se selecciona y coloca bajo su control. El "promotor" se propone que signifique una secuencia de ADN reconocida por las proteínas de la célula que están comprendidas en el inicio de la trascripción de un gen. EL promotor básico es el ácido nucleico regulador mínimo es capaz de iniciar la trascripción de una secuencia dada de ADN que se coloca bajo su control. En general, el promotor básico consiste de una región de ADN genómico en la dirección 5 ' del sitio de inicio de trascripción, donde una secuencia CAAT (a la cual se unen uno o más factores de trascripción de proteína) , así como, excepto en casos raros tal como en ciertos genes de mantenimiento, la secuencia TATA, o la "secuencia TATA", o una secuencia relacionada, se encuentran muy f ecuentemente. Una ARN. polimerasa, así como un o más factores de trascripción, tal como las proteínas de unión a la secuencia "TATA" (o TBP) , se une a esta secuencia. Una secuencia de nucleótidos se "coloca bajo el control" de un ácido nucleico regulador cuando este ácido nucleico regulador se localiza, con respecto a la secuencia de nucleótidos, de una manera tal para controlar el inicio de la trascripción de la secuencia de nucleótidos con una ARN-polimerasa. Para el propósito de la invención, "elemento regulador" y - "secuencia reguladora" se propone que signifiquen un ácido nucleico que comprende elementos capaces de modificar la trascripción iniciada por un promotor básico, tal como sitios de unión para diversos factores de trascripción, secuencias "intensificadora" para incrementar la trascripción o secuencias "lentificadoras" para inhibir la trascripción. La secuencia "intensificadora" se propone que signifique una secuencia de ADN incluida en un ácido nucleico regulador, que es capaz de incrementar o de estimular la trascripción iniciada por un promotor básico. La secuencia "lentificadora" se propone que signifique una secuencia de ADN incluida en un ácido regulador, que es capaz de disminuir o de inhibir la trascripción iniciada por un promotor básico. - Los elementos reguladores pueden estar presentes fuera de la secuencia que se localiza en el lado 5' del sitio de inicio de trascripción, por ejemplo, en los intrones y los exones, incluyendo en las secuencias de codificación. Los términos "promotor básico" y "elemento regulador" pueden ser "específicos para uno o más tejidos", si permiten la trascripción de una secuencia dada de ADN, colocada bajo su control, tal como en ciertas células (por ejemplo, las células específicas para un tejido), es decir, ya sea de forma- exclusiva a las células de ciertos tejidos, o a diferentes niveles de trascripción de acuerdo a los tejidos. El "factor de trascripción se propone que signifique proteínas que interactúan de manera preferencial con los elementos reguladores de un ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención, y que estimulen o por el contrario, supriman la trascripción. Algunos factores de trascripción están activos en la forma de monómeros, otros están activos en la forma de homo- o hetero-dímeros . El término "modificación" se refiere ya sea a una regulación positiva (incremento, estimulación) de la trascripción, o a una regulación negativa (disminución, inhibición, bloqueo) de la trascripción. Para el propósito de la presente invención, el "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se puede determinar al comparar dos secuencias óptimamente alineadas, a través de una ventana de comparación. La porción de la secuencia de nucleótidos o el polipéptido que esta en la ventana de comparación de esta manera puede comprender adiciones o supresiones (por ejemplo, "separaciones"), con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende estas adiciones o estas supresiones) , de una manera tal para mantener un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales se observa un residuo de aminoácido o ácido nucleico, idéntico para las dos secuencias (nucleico o péptido) comparadas, entonces al dividir el número de posiciones en las cuales hay identidad entre las dos bases o residuos de aminoácido por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y entonces al multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. La alineación óptima de secuencia para la comparación se puede llevar a cabo usando una computadora con la ayuda de algoritmos conocidos en el paquete de la compañía Wisconsin Genetics Software Package Genetics Computer Groups (GCG) , 575 Science Doctor, Madison, Wisconsin. A manera de ilustración, será posible producir el porcentaje de identidad de secuencia con la ayuda de programa de computo BLAST (Versiones BLAST 1.4.9 de Marzo de 1996, BLAST 2.0.4 de Febrero de 1998 y BLAST 2.0.6 de Septiembre de 1998) , usando exclusivamente los parámetros por omisión (S:F: Alstschul et al., J. Mol. Biol 1990 215: 403-410, S. F. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402) . Las búsquedas de Blast para secuencias que son similares/homologas a una secuencia de "pedido" de referencia, con la. ayuda del algoritmo de Altschul et al. La secuencia de pedido y las bases de datos usadas pueden ser del tipo nucleico o péptido, cualquier combinación que es posible. Para los propósitos de la presente invención, "condiciones de hibridación de alta severidad" se propone que signifique las siguientes condiciones: 1- Competición de membrana y Prehibridación: - Mezclado: 40 µl de ADN de esperma de salmón (10 mg/ml +40 µl de ADN de placenta humana (10 mg/ml) -Desnaturalizado durante 5 minutos a 96°C, luego sumergida la mezcla en hielo. -Removido el amortiguador 2X SSC y vertido 4 ml de mezcla de formamida en el tubo de hibridación que contiene las membranas . -Adicionada la mezcla de los dos ADN desnaturalizados. -Incubación a 42 °C durante 5 a 6 horas, con rotación. 2- Competición de sonda marcada: -Adicionados 10 a 50 µl de ADN de Cot I a la sonda marcada y purificada, de acuerdo a la cantidad de hibridación no específica.

-Desnaturalizado durante 7 a 10 minutos a 95 °C, -Incubado a 65 °C durante 2 a 5 horas. 3- Hibridación -Removida la mezcla de prehibridización. -Mezclado 40 µl de ADN de esperma de salmón + 40 µl de ADN de placenta humana; desnaturalizado 5 minutos a 96°C y luego sumergido en hielo. -adicionado 4 ml de mezcla de formamida, la mezcla de los dos ADN y la sonda marcada, desnaturalizada/ADN de Cot I al tubo de hibridación. -Encubado durante 15 a 20 horas a 42 °C, con rotación. 4- Lavados : -Un lavado a temperatura ambiente en 2X SSC, para enjuagar.

-Dos veces 5 minutos a temperatura ambiente, 2X SSC y SDS al 0.1 %, a 65°C. -Dos veces 15 minutos a 65°C, IX SSC y SDS al 0.1 %, a 65°C.

Enrolladas las membranas en Saranwrap y expuestas. Las condiciones de hibridación descritas anteriormente se adaptan a la hibridación, bajo condiciones de alta severidad, de una molécula de ácido nucleico de longitud variable, de 20 nucleótidos a varios cientos de nucleótidos . Las condiciones de hibridación descritas anteriormente se pueden adaptar como una función de la longitud del ácido nucleico cuya hibridación se desea, o del tipo de marcado elegido, de acuerdo a técnicas conocidas para las personas expertas en la técnica. Las condiciones adecuadas de hibridación se pueden adaptar, por ejemplo, de acuerdo a la enseñanza contenida en el trabajo de Hames and Higgins (1985) o en el trabajo de F.Ausebel et al. (1999). Para los propósitos de la presente invención, "transformación" se propone que signifique la introducción de un ácido nucleico (o de un vector recombinante) en una célula hospedadora. El término "transformación" también abarca una situación en la cual el genotipo de una célula se ha modificado por un ácido nucleico exógeno y en la cual esta célula transformada de esta manera expresa el ácido nucleico exógeno, por ejemplo, en la forma de un polipéptido recombinante o en la forma de un ácido nucleico homosentido o anti-sentido. Para los propósitos de la invención, un "animal transgénico" se propone que signifique un animal no humano, tal como un mamífero, el cual una o más moléculas contienen un ácido nucleico heterologo que se ha introducido a través de intervención humana, tal como por técnicas transgénesis bien conocidas por las personas expertas en la técnica. El ácido nucleico heterólogo se introduce directamente o de manera indirecta en la célula o el precursor de la célula, por manipulación genética tal como microinyección o infección con virus recombinante. El ácido nucleico heterólogo se puede integrar en el cromosoma, o puede estar en la forma de ADN que se replica de forma extracromosómica.

Acido Nucleico Regulador para el Gen ABCl Los inventores han tenido éxito en el aislamiento de un ácido nucleico regulador para el gen humano ABCl a partir de bibliotecas de vector del tipo BAC preparadas a partir de material genómico humano. De acuerdo al análisis de secuencias llevado a cabo, los inventores han determinado que el ácido nucleico que regula la trascripción del gen ABCl cuando se define de la manera más amplia, consiste de un polinucleótido que comprende, del extremo 5' al extremo 3': • una región no transcrita de aproximadamente 2.9 kb localizada en la dirección 51 del sitio de inicio de trascripción del gen ABCl; « la secuencia de nucleótidos del primer exón del gen ABCl, también referida como exón ÍA; • la secuencia parcial de nucleótidos del primer intrón del gen ABCl, también referida bajo el nombre intrón ÍA; y la secuencia de nucleótidss del segundo exón del gen humano ABCl también referido como exón IB. • la secuencia parcial de nucleótidos del segundo intrón del gen ABCl, también referida bajo el nombre intrón IB; Bajo una definición general, el ácido nucleico que regula la trascripción del gen ABCl comprende todas las regiones de nucleótidos como se define anteriormente, y se define como la secuencia SEQ ID No. 1 de acuerdo con la invención. De manera preferencial, el ácido nucleico que regula el factor de trascripción del gen ABCl comprende todas las regiones de nucleótidos que comprenden el nucleótido -2228 al nucleótido +108 con respecto al sitio de inicio de trascripción del gen ABCl, es decir, una región comprendida en los nucleótidos 654 a 3001 de la secuencia SEQ ID No : 1. De esta manera, un primer objeto de la invención consiste de un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1 o un ácido nucleico de la secuencia complementaria. La región de aproximadamente 2.9 kb, que se localiza en la dirección 5 ' (corriente arriba) del sitio de inicio de trascripción del gen ABCl, y que comprende el promotor básico y múltiples elementos reguladores para la trascripción, también se incluye en las secuencia identificada como .SEQ ID No. 3 de acuerdo con la invención. De manera más precisa, el nucleótido en la posición 1 de la secuencia SEQ ID No. 3 es el nucleótido en la posición -2893, con respecto al sitio de inicio de trascripción del gen ABCl . De acuerdo a un segundo aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene al menos 20 nucleótidos consecutivos del a secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 3 o un ácido nucleico de secuencia complementaria. Como se especifica ya de forma anterior, además de una región reguladora no transcripta de 5 ' , el ácido nucleico que regula la trascripción del gen ABCl, de la secuencia SEQ ID No. 1, también comprende el primer exón y la porción 5 ' del primer intrón del gen humano ABCl . El primer exón del gen ABCl también referido como el exón Al, se define como la secuencia SEQ ID No. 4. La secuencia del intrón la se ha caracterizado de forma parcial. El extremo 51 del intrón la se define como la secuencia de nucleótidos SEQ ID No . 6. El extremo 3' del intrón la se define como la secuencia SEQ ID No . 7. El segundo exón del gen humano ABCl, también referido como el exón IB, se define como las secuencias SEQ ID No. 5. De acuerdo a un tercer aspecto, la invención se refiere a un ácido*- nucleico que comprende un polinucleótido que tiene al menos 20 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos elegida de las secuencias SEQ ID No. 3 a 7, o a un ácido nucleico de secuencia complementaria . En algunas modalidades de la invención, un ácido nucleico de acuerdo a la invención estará en una forma aislada y/o purificada. Cualquier fragmento "biológicamente activo" de un ácido nucleico como se define anteriormente también forma parte de la invención. De acuerdo a otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que tiene al menos 80 % de la identidad de nucleótidos con un ácido nucleico como se define anteriormente . La invención también abarca a un ácido nucleico que hibridiza, bajo condiciones de alta severidad, con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. La invención también se refiere a un ácido nucleico que tiene al menos 80 %, por ejemplo, 90 %, 95 % o 98 %, de identidad de secuencia con un ácido nucleico que comprende al menos 20 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido elegido a partir de las - secuencias de nucleótidos SEQ ID No. 1, SEQ ID No . 2, SEQ ID No . 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No, 5, SEQ ID No . 6, SEQ ID No . 7, y SEQ ID No. 8.

Análisis Detallado de la SEQ ID No. 3 El ácido nucleico de las secuencias SEQ ID No. 3, incluido en el ácido nucleico regulador para el gen ABCl de la secuencia SEQ ID No. 1, comprende los elementos constituyentes de un promotor básico, respectivamente, una secuencia "TATA" y una homosecuencia, representada en la Figura 1. La secuencia reguladora SEQ ID No. 3, también comprende muchos sitios de unión para diversos factores de trascripción que son capaces de regular de forma positiva o negativa la actividad del promotor básico. De esta manera, las varias secuencias que son características de los sitios de unión para diversos factores de trascripción en las secuencias SEQ ID No. 3 se han identificado por los inventores, de la manera detallada a continuación. La secuencia SEQ ID No. 3 se usó como una secuencia de referencia y se procesó de acuerdo a los algoritmos del programa de computo BLAST 2, versión 2.10, y se comparó a los datos listados en las varias bases de datos, y la presencia, así como la ubicación, de los varios sitios características de las secuencias SEQ ID No. 3 y por ejemplo, los sitios de unión para los factores de trascripción, se determinaron de acuerdo a los métodos bien conocidos por las personas expertas en la técnica. Además, se llevó a cabo un análisis detallado en los 1.3 kb en la dirección 5' de sitio de inicio, en el cual un total de 1900 secuencias que corresponden a los sitios de unión para los factores de trascripción se identificaron durante el primer paso de la búsqueda. Después de la recopilación y filtrado como se describe anteriormente, solo se retuvieron 79 sitios de unión, específico para 27 diferentes factores de trascripción. Estos sitios se representan en la Tabla 1 posterior. La Tabla 1 representa los sitios de unión para los factores de trascripción identificados en el 1318 nt en la porción 3' de la secuencia SEQ ID No. 3 de acuerdo a la invención. Las posiciones de los nucleótidos de inicio y fin de cada uno de los sitios de unión para los factores de trascripción se refieren con referencia a la numeración de los nucleótidos de la secuencia SEQ ID No. 3, como se representa en la Figura 1 (+ hebra) o de los nucleótidos de la secuencia complementaria de las secuencias SEQ ID No. 3 (- hebra) .

TABLA 1 TABLA 1 (CONTINUACIÓN) TABLA 1 (CONTINUACIÓN) TABLA 1 (CONTINUACIÓN) TABLA 1 (CONTINUACIÓN) La Figura 1 representa una porción de la secuencia SEQ ID ?o. 3. El primer nucleótido en la posición 5' de la secuencia en la Figura 1 también es el primer nucleótido en la posición 5 ' de una de las secuencias de ácido nucleico SEQ ID ?o. 1 y SEQ ID ?o. 3. En la Figura, los sitios de unión para los factores de trascripción se ilustran con secuencias (cuadro) que delimitan sus respectivas posiciones de inicio y fin, y sus respectivas designaciones indican por arriba de cada una de las secuencias correspondientes. La numeración de los nucleótidos de la secuencia representada en la Figura 1 se llevó a cabo con respecto al sitio de inicio de trascripción, numerado "+1", el nucleótido 5' al nucleótido +1 que se autonumera "-1". La descripción de las características de los sitios de unión para cada uno de los factores de trascripción referidos en la Figura 1 y Tabla 1 se puede encontrar fácilmente por personas expertas en la técnica. A continuación se da una descripción breve de algunos de ellos .

Factor CAC: Las características de un sitio de unión para el factor CAC se pueden encontrar, por ejemplo, en el artículo -de. Schuele et al., (1988, Nature, Vol. 332: 87-90), entrada No. T00077 de la base de datos EMBL, del artículo de Mantovani et al., (1988), Nucleic Acids Research Vol. 16: 4299-4313), el artículo de Cátala et al., (1989, Nucleic Acid Research, Vol. 17: 3811-3827) y el artículo de Wang et al., (1993, Mol. Cell Biol., Vol. 13: 5691-5701). La unión de este factor se ha mostrado en las regiones reguladoras de varios genes, incluyendo el promotor para el gen de ß-globina y el gen de gamma-globina. Este factor parece actuar en cooperación con el receptor glucocorticoide .

Factor C/EBP: C/EBP-a Las características de un sitio de unión para el factor C/EPB-a se' pueden encontrar, por ejemplo, en los artículos que corresponden a las siguientes entradas en la base de datos Medline: 892020040, 94023981, 96194262, 96003748. Este factor inhibe la proliferación celular al incrementar el nivel de p21 (WAF-1) debido a una expresión incrementada del gen y a una estabilización pos-transduccional de p21.

C/EBP-ß Las características de unión para el factor C/EBP-ß, se pueden - encontrar, por ejemplo, en las siguientes entradas de la base de datos Medline: 93315489, 91248826, 94193722, 93211931, 92390404, 90258863, 94088523, 90269225 y 96133958. Es un activador de trascripción que esta comprendido a la regulación de los genes comprendidos en las respuestas inmunitaria e inflamatoria. Se une específicamente a un elemento de respuesta IL-1 en el gen de IL-6. Se cree que juega un papel en la regulación de la fase aguda de la inflamación y la hematopoyesis. El sitio de reconocimiento de consenso es como sigue: "T(T/G) NNGNAA(T/G) " .

Factor c-Myb: Las características de un sitio de unión para el factor c-Myb se puede encontrar en las siguientes entradas de la base de datos Medline: 91122626, 87092302, 93131991, 86261774, 92049347, 90044066, 90265605, 93101590, 94316485 y 90090611. Este factor reconoce de manera específica la secuencia "YAAC (G/T) G" . Juega un papel en el control de la proliferación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas .

Factor CP2 : Las características de los sitios de unión para el factor CP2 se _pueden encontrar, por ejemplo, en los artículos de Kím et al., (1990), Mol Cell Biol, Vol. 10: 5958-5966 y Lim et al., (1992), J. Biol. Chem. Vol. 268: 18008-18017.

Factor CTF: Las características de unión de factor CTF se pueden encontrar, por ejemplo, en las siguientes entradas en la base de datos Medline: 88319941, 91219459, 86140112, 87237877, 90174951, 89282387, 90151633, 892618136, 86274639, 87064414, 89263791. El factor CTF/NF-1 reconoce la siguiente secuencia palindrómica: "TGGCANNNTGCCA" , que esta presente en los promotores virales y celulares y en el origen de replicación de los adenovirus tipo 2. Estas proteínas son capaces de activar la trascripción y replicación. Se unen al ADN en la forma de un homodímero.

Factor E2A: Las características de un sitio de unión para el factor E2A se pueden encontrar, por ejemplo, en los artículos que corresponden a las siguientes entradas en la base de datos de Medline; 91160969, 91331308, 91115096, 91117219, 90346284, 89168418, 90150281. Este factor se une a un sitio KAPPA-E2 del elemento intensificador del gen de inmunoglobulina KAPPA. Forma un heterodímero con la proteína ASHl . Corresponde . a - la familia de factores de trascripción del tipo hélice-asa-hélice.

Factor GRa: Las características de un sitio de unión para el factor GRa se pueden encontrar, por ejemplo, en las siguientes entradas de la base de datos Medline: 88264449, 93024441, 89091080, 90319784, 92020837, 90381775, 86298392, 91131612, 86092211, 86092206. Es un receptor glucocorticoide que esta comprendido en la regulación de la expresión de genes eucarióticos y que afecta la proliferación y diferenciación de tejidos objetivo. Este factor se une a un sitio objetivo del tipo "GRE" . Esta compuesto de tres dominios y corresponde a la subfamilia NR3 de receptores nucleares de hormona.

Factor LXR: Las características de los sitios de unión para el factor LXR (Receptor X de Hígado) se han descrito por Apfel et al., (Molí. Cell. Biol., 1994) Song et al., (Proc. Nati.

Acad. Sci USA, 1994) y Willy et al., (Genes Dev., 1995).

Los oxyesteroles son el ligando fisiológico de los elementos LXR (Janowski et al., Proc. Nati. Acda. Sci USA, 1999).

Diferente de otros receptores, LXR heterodimeriza con RXR (Receptor X Retinoide) . Los presentes elementos de respuesta LXR se han identificado en las posiciones -1728/-1714 y -69/-5S (Figura 1) .

Factor NF-EIC: Las características de un sitio de unión para el factor NF-EIC se pueden encontrar, por ejemplo, en las siguientes entradas en la base de datos Medline: 91266910, 91216113, 91334450, 91203899, 91029498 y 910655813. Es un activador transcripcional que se une a un elemento intensificador de los genes a y 6 del receptor de células T. Se une a la siguiente secuencia de consenso. "AGATAG" . Corresponde a la familia de factores de trascripción del tipo GATA.

Factor NHF5 : Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia, por ejemplo, el artículo de Grange et al. (1991, Nucleic Acids Res. Vol. 19: 131-139) para este factor de trascripción.

Factor HNF3B: Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de forma ventajosa el artículo de Overdier et al., (1994, Mol. Cell Biol. Vol. 14:2755-2766).

Factor Nfkappa-B: Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de forma ventajosa a los artículos que corresponden a las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 95369245. 91204058, 94280766, 89345587, 93024383, 88248039, 94173892, 91088538, 91239561, 91218850, 92390404, 90156535, 93377072, 92097536, 93309429, 93267517, 92037544, 914266911, 91105848 y 95073993. El factor Nfkappa-B es un heterodímero que consiste de una primera subunidad de 50-kDa y una segunda subunidad de 65-kDa. Dos heterodimeros pueden formar un tetrámero lábil. Su unión a ADN depende de la presencia de zinc (Zn++) . Se puede inducir por muchos agentes, tal como TNF, PKA o PKC. En general, es un regulador de genes comprendidos en respuestas a infección, inflamación y tensión.

Factor NFY: El factor NFY se describe, por ejemplo, en la entrada No. P25.208 de la base de datos Swissprot. Es un reactor que reconoce una porción "CCAAT" de las secuencias promotoras tal como aquellas del gen que codifica para el colágeno tipo 1, de albúmina y de ß-actina. Es un estimulador de trascripción.

Factor PEA3 : Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de forma ventajosa a los artículos que corresponden a las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 90059931, 90309995, 90291989, 93181246 y 90384794. Este factor de trascripción se une a una porción de PEA3 "AGGAAG" , y puede jugar un papel regulador durante la embriogénesis.

Factor PEBP2 : Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de forma ventajosa a los artículos que corresponden a las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 95199266, 94217721, 97188387, 97325753 y 95347606. Este factor se une a un sitio "PYGTYGGT" en muchos elementos intensificadores y promotores.

Factor TFIID: Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de forma ventajosa a los siguientes artículos: Fikes et al., (1990, Nature, Vol. 346: 291-294), GILL et al., (1991, Cell, Vol. 65: 333-340), Hoffmann et al., (1990, Genes Dev. Vol. 4: 1141-1148). Este factor juega un papel principal en la activación de los genes eucarióticos que se transcriben por la ARN-polimerasa II. Este factor se une de manera específica al elemento promotor TATA localizado cerca del sitio de inicio de trascripción.

Factor T3R: Las personas expertas en la técnica pueden referirse de manera ventajosa a los artículos que corresponden a las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 92017776, 90242396, 870903752, 91212192. Este factor tiene una fuerte afinidad por triyodotiroina. Se compone de tres dominios y corresponde a la familia de receptores nucleares de hormona.

Factor SIF: Las personas expertas en la técnica pueden referirse de forma ventajosa al artículo de Wagner et al., (1990, EMBO J., Vol. 9: 4477-4784). Este factor activa la expresión del gen c-fos.

Factor RAR: Las personas expertas en la técnica pueden referirse a manera ventajosa a los artículos que corresponden a las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 91216109, 92017791, 92127595, 91219411, 92103690, 93321869, 91092269, 91029504, 90242395, 91029504. Este factor es un receptor de ácido retínico. Este factor controla las funciones celulares al regular- directamente la expresión génica. Corresponde a la familia de receptores nucleares de hormona.

Factor PU: Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de manera ventajosa a los artículos que corresponden a las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 92107189, 93165739, 95317607, 92318913, 92275360, 93028372, 93206099, 90199884, 87257848 y 93275657. Este factor se une a la secuencia PU, que es una secuencia de ADN con alto contenido de purina, tal como la secuencia "GAGGAA", que pueden actuar como un elemento intensificador específico de células linfoides. Es un factor de activación de trascripción que puede estar comprendido de manera específica en la activación o diferenciación de macrófagos o células B.

Sitio API: Las características de un sitio de unión para el factor de trascripción API se pueden encontrar en varios artículos que corresponden a las siguientes entradas en la base de datos de Medline: Números 89125693, 892552809, 90318391, 91175677, 911458338, 89313776, 88217909, 911662, 91121514, 89017284, 88070595, 90097934, 88189275, 87301729, 88151062, 90291989, 91330875, 89051877 y 91219459. Este factor se une a un elemento intensificador del tipo "TGA(C/G)TCA" . . - Factor AP2 : Las características de un sitio de unión para el factor de trascripción AP2 se pueden encontrar, por ejemplo en los artículos que corresponden a las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 90127451, 90174951 y 91009310. Este factor se une a los elementos tipo intensificador, a fin de estimular la trascripción de ciertos genes. Por ejemplo, el factor AP2 se une a la siguiente secuencia de consenso: "CCCCAGGC" .

Factor CCAAT: Una característica del sitio de unión del factor CCAAT se puede encontrar en el artículo de Lum et al . , (1990, Mol Cell Biol. Vol. 10:6709-6717) y en la entrada No. T 00086 de la base de datos EMBL. Este factor se ha mostrado, por ejemplo, que es un estimulador de la trascripción del promotor del gen humano hsp70. Factor GATA-1: Las características del sitio de unión para el factor GATA-1 se pueden encontrar, por ejemplo, en las siguientes entradas en. la base de datos de Medline: 91340773, 91093039, 91266910, 90114418, 89385992, 91268074, 89118131, 91224987, «9218991 y 91081330. Se conoce que es un factor de "intercalación" en el desarrollo eritroide. Se une al ADN en la siguiente secuencia de consenso: " (A/T) GATA(A/G) ", en regiones reguladoras de genes de globina y de otros genes expresados en células eritroides.

Factor MyoD-Mvf-3: Las características de un sitio de unión del factor MyoD-Myf-3 se pueden encontrar, por ejemplo, en el artículo de Rosenthal et al., (1990, Nucleic Acids Res., Vol. 18: 6239) . Este factor de trascripción induce la diferenciación de fibroblastos en mioblastos, activa promotores específicos del músculo e interactúa con, y se inhibe por la torsión de proteína.

Factor MYC/MAX: Las características de un sitio de unión para el factor Ncy/MAX se pueden encontrar, por ejemplo, en las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 94040733, 93101610, 92229468, 92112037, 93145325, 93026389, 93157390, 92366516, 93145324 y 91173288. Este factor de trascripción se une a AD ^ de forma no específica, pero también se une a ADN de forma específica, al reconocer la secuencia CAC[GA]TG. Este factor parece activar la trascripción de genes asociados con el crecimiento.

Factor HNF3 : Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de manera ventajosa a las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 91352065, 91032994, 92345837, 89160814, 91187609, 9160974, 91029477, 94301798 y 94218249. Este factor de trascripción actúa como un activador de muchos genes del hígado, tal como genes de AFT, albúmina y tirosina-aminotransferasa, e interactúa con regiones reguladoras que son cis-actuantes con respecto a estos genes .

Factor SRY: Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de manera ventajosa a los artículos que corresponden en las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 92132550, 95292338, 95112822, 93049201. Este factor es responsable, por ejemplo, de iniciar la determinación del sexo de los machos .

Factor Spl Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de manera ventajosa a los artículos que corresponden en las siguientes entradas en la base de datos de Medline: 852707437, 89091123, 89039842, 89384647, 85061571, 88111565-, 91224491, 91095025, 91357479, 91139695. Este factor activa la síntesis del ARN mensajero de genes que contienen sitios de reconocimiento funcional; pueden interactuar con porciones con alto contenido de base G/C del promotor del gen de receptor de serotonina.

Factor USF : USF corresponde a la familia de hélice-asa-hélice de factores de trascripción que se unen a la porción E-secuencia (CACGTG) e incluyen inter alia Myc, Madl, Max, MyoD (Littlewood et al., Oxford University Press, New york, Ipp. 1998) . Aunque tiene un papel bien establecido como un activador de trascripción (Ghosh et al., Oncogene, 1997, 14:589-594) . Es claro que en algunos contextos de promotor, el USF tiene la capacidad de actuar como un represor de trascripción. El USF1 no se ha mostrado que es importante para la represión de desarrollo del gen LpSl de Lytechinus pictus en todos los tipos celulares excepto células ectodermas aborales que no expresan USF (Seid et al., J. Mol Biol, 1996, 264:7-19). USF1 inhibe la activación del gen MyoD de Xenopus cuyo producto se une a E-secuencia (Lun et al., Cell Growth Differ., 1997, 8:275-282) y también reprime la trascripción del gen CYP1A1 al competir con el complejo estimulador AhR.Arnt para la unión al elemento sensible a xenobiótico (XRE) que contiene una porción tipo E secuencia (Takahashi et al.., iT. Biol Chem, 1997, 272: 30025-30031). Cárter et al . , demostró que la ausencia de un fuerte dominio de activación en USF1 conduce a la represión transcripcional del gen de cadena pesada e inmunoglobulina (IgH) (Cárter et al., Mol Cell Biol, 1997, 17:18-23). Las variantes truncadas y de empalme USF2 que abrogan la actividad de E-secuencia reprimen la expresión del complejo principal de histocompatibilidad clase I (Howcroft et al., Mol Cell Biol (1999) 19:4788-4797), ATPA (Breen Et al., J. Biol Chem, 1997, 272:10528-10542) y genes de prostaglandina G/H-sintasa-2. Harris et al (J Biol Chem, 2000, 275:28539-28548) ha proporcionado evidencia que la proximidad cercana entre los elementos AP-1 y E-secuencia en el promotor FGF-BP facilita la represión transcripcional vía interacciones entre USF1, USF2 y las proteínas de unión a AP-1. Además, la sobreexpresión de USF humano disminuye la trascripción dependiente de AP-1 en células F9 de teratocarcinoma murino (Pognonec et al., Oncogeno, 1997, 14_2091-2098) y USF que se une a un complejo que consiste de factores AP-1, Fra2 y CREB reprime el gen de alfaA-cristalina de pollo (Cvekl et al., 1994, Mol Cell Biol, 147363-7376) . Los homodímeros de USF1 y USF2 inhiben la trascripción del gen de ARN ribosómico (Sirito et al., Gen Expr, 1992, 2:231-240). Las porciones de unión a USF también se han mostrado que actúan como elementos reguladores negativos en los promotores de los genes de Proteasa Nexin-1 (Erno et al, Mol Cell Neurosci, 1996, 8:28-37) y HLA-B (Gobin et al., J Immunol , 1999, 163:1428-1434). De manera interesante, la apolipoproteína CIII, que igual que ABCl esta comprendida en el metabolismo de los lípidos, también se reprime por USF2 (Navantkasttusas et al., Mol Cell biol, 1994, 14: 7331-7339). Finalmente, USF puede regular tanto positiva como negativamente el gen MLC-2v y la trascripción del gen de ARN ribosómico. Varios estudios indican que USF también puede funcionar como una proteína constitutivamente unida que opera con factores básales tal como TAFI:[55 (Chiang et al., Science, 1995, 267:531-536) o factores inducibles tal como USA (Meisterernst et al., Cell, 1991, 66:981-993), PC5 (Halle et al, J Biol Chem, 1995, 270:21307-21311), c-Myc Max (Harris et al.), CREB y JunD (Cvekl et al.) para mediar la inducción o represión transcripcional. De esta manera, USF puede funciona ya sea para activar o reprimir la trascripción génica. Sin que se desee que se una por ninguna teoría, el solicitante piensa que USF puede inhibir, por ejemplo, la trascripción génica al competir por la unión a la E-secuencia con activadores transcripcionales (Lun et al.; Takahashi et al. citado anteriormente) . Sin embargo, el solicitante ha demostrado en el Ejemplo 5 que la transfección de las construcciones EBm (E-secuencia mutada) y EBdel (E-secuencra suprimida) en células RAW conduce a actividad incrementada en lugar de disminuida del promotor ABCl, consistente con la represión génica mediada por E-secuencia. Además, los ensayos de desplazamiento en gel usando anticuerpos específicos a diferentes activadores de unión a E-secuencia fallen al demostrar la unión a la porción E-secuencia. Los análisis de transferencia Western también se realizaron para determinar las variantes truncadas y de empalme de USF2 que carecen del dominio de transactivación (Liu et al., Sirito et al., et Howcroft et al.,) y conducen a la represión génica. Bajo estas condiciones, estas variantes de USF no se detectaron en los extractos nucleares de las células RAW o células 293. Debido a que USF también puede funcionar como un represor a través de la interacción específica de proteína a proteína con activadores transcripcionales que se unen a las porciones de ADN distintas de la E-secuencia (Harris et al., Pognonec et al., Cvekl et al., citado anteriormente) . Como se describe de forma previa, en el promotor humano ABCl, la porción E-secuencia esta flanqueada por dos sitios Spl y una porción API. Es bien conocido en la técnica que los factores de trascripción que se unen a SPI y API se han implicado en la regulación transcripcional de otros genes comprendidos en el metabolismo de los lípidos incluyendo apoA-II (Ribeiro et al., J Biol Chem, 265:1216-1225), apoC-III (Ogami et . ai, J.BiolChem, 1990, 265:9808-9815), Vitelogenina II de pollo (Seal et al., Mol Cell Biol, 1991, 11:2704-2717), ácido graso-sintasa (Casado et al., J Biol Chem, 1999, 274:2009-2013) y el receptor de LDL (Sánchez et al., J Biol Chem, 1995, 270:1161-1169) y la proteína relacionada al receptor LDL (LRP) (Gaeta et al., BBA, 1994, 1219:307-313) . Una característica preferida del ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención y las características de la secuencia localizada en la dirección 5' del sitio de inicio de trascripción, incluida tanto en las secuencias SEQ ID No. 1 como en las secuencias SEQ ID No. 3, es la presencia de ocho porciones que son características de un sitio de unión putativo para las proteínas PPAR. Las PPAR, también referidas como receptores activados por el proliferador de peroxisoma, que pueden ser del tipo a,d(ß) y ?, forman una subfamilia que corresponde a la familia de genes de receptores nucleares. Todas las PPAR se activan por ácidos grasos y derivados de los mismos. Por ejemplo, la PPAR del tipo a se une a fibratos hipolipidérmicos, en tanto que las glitazonas antidiabéticas son ligandos para la PPAR del tipo gamma. La activación de la PPAR tipo a induce efectos pleyotrópicos tal como la estimulación de oxidación de lípidos, el daño del metabolismo de las lipoproteínas y la inhibición de la inflamación vascular. Los activadores de PPARa incrementa Ja- absorción hepática y esterificación de ácidos grasos libres al estimular la expresión de la proteína de transporte de ácidos grasos y la acil -CoA-sintetasa. En el músculo esquelético y el corazón, la PPARa incrementa la absorción mitocondrial de ácidos grasos libres, y su oxidación, al estimular la carnitina-palmitoil-transferasa I específica del músculo. El efecto de los fibratos en el metabolismo de las lipoproteínas con alto contenido de triglicéridos es debido a la estimulación de la lipoproteína-lipasa, esta estimulación que es dependiente de PPARa, y a la inhibición de la apolipoproteína C-III, en tanto que el incremento en el colesterol plasmático, en la forma de HDL, depende de una expresión excesiva de la apolipoproteína A-I y apolipoproteína A-II. Las PPARa también se expresan en adhesiones ateroscleróticas. La PPARa inhibe la oxidonítrico-sintasa inducible en macrófagos e impide la cíclooxigenasa-2 inducida por IL-1 y la expresión de IL-6, así como la expresión de endotelina-1 inducida por trombina, que resulta de una regulación transcripcional negativa del factor nuclear de las rutas de señalización del factor nuclear NF-KAPPA B y de la proteína-1 de activación. La activación PPARa también induce apoptosis en macrófagos derivados de monocitos, probablemente al inhibir la actividad de NFKAPPA B. De esta manera, los efectos pleyotrópicos de los activadores de PPARa en el perfil de los lípidos plasmáticos, participa ciertamente en la inhibición del desarrollo de la aterosclerosis. Los activadores de PPARa tal como fibratos, inhibe el desarrollo de la aterosclerosis debido a sus actividades normolipidémicas . La presencia de ocho sitios potenciales de unión a PPAR (posiciones de los nucleótidos de inicio y fin, con respecto al sitio de inicio de trascripción, para cada uno de los sitios: -1280-1276/-1270-1267, -889-883/878-872, -584-578/575-569 y -366-360/358-352 [también ver Figura 1]) en un- ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención es compatible con la observación de acuerdo a la cual la expresión del gen que codifica para la proteína humana ABCl se induce durante la diferenciación de monocitos en macrófagos in vitro. También es compatible con la observación anterior de la regulación del gen ABCl por fibratos. También es compatible con los resultados experimentales que demuestran que la expresión del gen ABCl se incrementa cuando se incuban macrófagos humanos en la presencia de lipoproteínas de baja densidad, acetiladas (AcLDL) . Sin que se desee que se una por teoría, el solicitante piensa que los sitios de unión de PPAR identificados de acuerdo a la invención en el ácido nucleico regulador de la SEQ ?D No. 1 están altamente comprendidos en la regulación específica del tejido, y en la regulación específica de la situación metabólica celular, del gen ABCl, y que como resultado, una secuencia reguladora que comprende al menos 4, por ejemplo, al menos 5, 6, 7 o al menos 8 sitios de unión de PPAR (Figura 1) (de la secuencia SEQ ID No. 1, y que también comprende un elemento promotor básico, es útil como una secuencia reguladora para un polinucleótido cuya expresión se desee en el hígado, los pulmones, las glándulas suprarrenales, los monocitos/macrófagos, la placenta o los tejidos fetales, o para un polinucleótido cuya expresión se desee en respuesta a una estimulación específica de la célula, con relación al metabolismo del colesterol, tal como la presencia, en el ambiente celular, de lipoproteínas de baja densidad, acetiladas (Ac LDL) . Además, se ha mostrado de acuerdo con la invención que un ácido nucleico regulador para el gen humano ABCl, como se define anteriormente, que comprende todos los sitios PPAR mencionados con anterioridad, es capaz de regular la expresión de una secuencia de codificación colocada bajo su control, de una manera que es dependiente de la presencia de colesterol en el ambiente celular. Los resultados se presentan en el Ejemplo 4 posterior.

Como se menciona de forma previa, la invención se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene al menos 2D nucleótidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de nucleótidos SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2, así como un ácido nucleico de secuencia complementaria. Los ácidos nucleicos que comprenden uno o más fragmentos "biológicamente activos" de cualguiera de las secuencias SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2 se abarcan por la definición anterior. Las personas expertas en la técnica pueden obtener fácilmente fragmentos biológicamente activos de estas secuencias al hacer referencia, por ejemplo, a la Tabla 1 posterior y a la Figura 1, en las cuales se representan las varias porciones que son características de la secuencia reguladora para el gen ABCl. Las personas expertas en la técnica pueden obtener de esta manera fragmentos biológicamente activos al sintetizar de forma total o parcial químicamente los polinucleótidos correspondientes o al usar endonucleasas de restricción para obtener los fragmentos de ADN deseados, los sitios de restricción presentes en las secuencias SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 1 que son capaces de son encontrados fácilmente de la información de la secuencia, con la ayuda de un programa de computo actual de correlación de restricción tal como el mapa del módulo GCG versión 9.1. La producción de fragmentos de ácido nucleico determinados usando endonucleasas de restricción se describe, por ejemplo, en el trabajo de Sambrook et al. (1989) . La invención también se refiere de esta manera a un ácido nucleico como se define anteriormente, que es capaz de modular la trascripción de un polinucleótido colocado bajo su control. De acuerdo a una modalidad, un fragmento biológicamente activo de un ácido regulador de trascripción de acuerdo a la invención comprende el promotor básico (secuencia TATA y homo-secuencia) que varía desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición - 300, con respecto al sitio de inicio de trascripción, el primer nucleótido trascrito que es el nucleótido en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1. De acuerdo a una segunda modalidad, un fragmento biológicamente activo de un ácido nucleico de regulación de trascripción de acuerdo a la invención comprende tanto el promotor básico como los elementos reguladores próximos, que varían desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -600, con respecto al sitio de inicio de trascripción, el primer nucleótído trascrito que es el nucleótido en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No . 1. De acuerdo a una tercera modalidad, un fragmento biológicamente activo de un ácido nucleico de regulación de trascripción de acuerdo con la invención comprende además del promotor básico- (promotor de núcleo) y los próximos 200 pb del promotor del gen ABCl que es rico en sitios de unión para factores de trascripción, Spl, API, LXR, y E-secuencia, que probablemente estén comprendidos en la modulación de la expresión del gen humano ABCl . De acuerdo a una cuarta modalidad, este fragmento biológicamente activo del ácido de regulación de trascripción de acuerdo con la invención, también comprende, además del promotor básico (promotor de núcleo) y los elementos reguladores próximos, otros elementos reguladores tal como los varios sitios PPARa y tramos del nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -2894, con respecto al sitio de inicio de trascripción, el primer nucleótido trascrito que es un nucleótido en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1. De acuerdo a una quinta modalidad, este fragmento biológicamente activo de un ácido de regulación de trascripción de acuerdo con la invención, que también comprende, además del promotor básico (promotor de núcleo) y los elementos reguladores próximos, otros elementos reguladores tal como los varios sitios PPARa, tramos del nucleótido en la posición +120 al nucleótido en la posición -995, con respecto al sitio de inicio de trascripción, el primer nucleótido transcrito que es el nucleótido en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No . 1. De acuerdo a una sexta modalidad, un fragmento biológicamente activo de un ácido nucleico de regulación de trascripción de acuerdo con la invención comprende una región que varía desde el nucleótido en la posición +108 al nucleótido en la posición -2228, con respecto al sitio de inicio de trascripción como se expone en la secuencia SEQ ID No. 1.

Exones 1A y IB e Intrones ÍA y IB El solicitante también ha identificado las secuencias de nucleótidos localizadas en la dirección 3 ' del sitio de inicio de trascripción y que corresponden, respectivamente, desde el extremo 5' al extremo 3', al exón 1A, intrón ÍA, exón IB e intrón IB del gen humano que codifica para la proteína ABCl. De manera más precisa, el exón ÍA, que es de 221 nucleótidos de largo, inicia en el nucleótido en la posición 2894 de las secuencias SEQ ID No. 1 y termina en el nucleótido en la posición 3114 de la secuencia SEQ ID No. 1. Se identifica el exón ÍA como la secuencia SEQ ID No . 4. El exón IB, que es de 109 nucleótidos de largo, inicia en el nucleótido en la posición 100 y termina en el nucleótido en la posición 258 de la secuencia SEQ ID No. 2.

El exón IB se identifica como la secuencia SEQ ID No. 5. Se ha secuenciado parcialmente el intrón ÍA. El extremo 51 del intrón LA inicia en el nucleótido en la posición 3115 y finaliza en el nucleótido en la posición 3231 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1 y también se define como la secuencia SEQ ID No. 6. El extremo 3' del intrón 1A inicia en el nucleótido en la posición 1 y termina en el nucleótido y termina en el nucleótido en la posición 99 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 2 y también se identifica como la secuencia SEQ ID No. 7. Se ha secuenciado parcialmente el intrón IB. El extremo 5 ' del intrón IB inicia en el nucleótido en la posición 259 y termina en el nucleótido en la posición 357 de la secuencia SEQ ID No. 2. Esta secuencia también se identifica como la secuencia SEQ ID No. 8. El exón IB contiene el inicio del cuadro de lectura abierto del gen humano ABCl, el nucleótido A del codón ATG que se localiza en la posición de inicio en la posición 94 de la secuencia SEQ ID No. 5. El exón IB codifica para el polipéptido de la secuencia SEQ ID No. 9. Los exones ÍA y IB, así como los intrones ÍA y IB, pueden contener elementos para regular la expresión del gen ABCl, por ejemplo, elementos del tipo intensificador y/o elementos del tipo lentificador. En consecuencia, un ácido nucleico de regulación de trascripción de acuerdo a la invención también puede contener, además de los fragmentos biológicamente activos de la secuencia SEQ . ID- No. 1, fragmentos de nucleótidos o aun todos, de las secuencias SEQ ID No. 2 a SEQ ID'NO. 8. Las secuencias de nucleótidos SEQ ID No. l a SEQ ID No. 8, así como los fragmentos de las mismas, se pueden usar, por ejemplo, como sondas o cebadores de nucleótidos para detectar la presencia de al menos una copia del gen ABC1 en una muestra, o para amplificar una secuencia objetivo dada en la secuencia reguladora para el gen ABCl. Un individuo de la invención de esta manera es un ácido nucleico que tiene al menos 80 % de identidad de nucleótidos con un ácido nucleico como se define anteriormente, por ejemplo, que se origina de una de las secuencias a SEQ ID No. l a SEQ ID No. 8. La invención también se refiere a un ácido nucleico que hibridaza, bajo condiciones de alta severidad, con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo a la invención, por ejemplo, un ácido nucleico que se origina de una secuencia elegida de la secuencia SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 8. La invención también se refiere a un ácido nucleico como se define anteriormente y también se caracteriza adicionalmente en que es capaz de modificar la trascripción de un polinucleótido de interés colocado bajo su control . De acuerdo a un primer aspecto, este ácido nucleico es capaz de activar la trascripción del polinucleótido de interés colocado bajo su control. De acuerdo a un segundo aspecto, un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención se puede caracterizar en que es capaz de inhibir la trascripción del polinucleótido de interés colocada bajo su control. Por ejemplo, un ácido nucleico de regulación de trascripción de acuerdo con la invención, cuando se coloca de manera adecuada con respecto a un polinucleótido de interés cuya expresión se desea, permitirá la trascripción del polinucleótido de interés, ya sea de manera constitutiva o inducible. La naturaleza inducible de la trascripción iniciada por un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención se puede conferir por uno o más de los elementos reguladores que contiene, por ejemplo, la presencia de uno o más sitios PPARa, tal como al menos 4 sitios PPARa, o al menos 5, 6, 7 PPARa o los 8 sitios PPARa de la secuencia SEQ ID No . l o SEQ ID No . 3. Además, una expresión específica de tejido del polinucleótido de interés se puede buscar al colocar este polinucleótido de interés bajo el control de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención que es capaz, por ejemplo, de iniciar la trascripción de este polinucleótido de interés de manera específica en ciertas categorías de las. células, por ejemplo, células del hígado, células de placenta o macrófagos. En general, un ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención puede comprender uno o más elementos reguladores "discreto", tal como elementos intensificadores y lentificadores . Por ejemplo, este ácido nucleico regulador puede comprender uno o más sitios de unión al factor de trascripción potencial como se define en la Figura 1. Un ácido regulador de acuerdo con la invención también abarca una secuencia que no comprende el promotor básico, es decir, la secuencia que varía desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -300, con respecto al sitio de inicio de trascripción. Este ácido nucleico regulador entonces comprenderá en general un promotor básico llamado "heterólogo", es decir, un polinucleótido que comprende una secuencia "TATA" y una "homosecuencia" , que no se origina del ácido nucleico regulador para el gen ABCl. Un ácido nucleico de regulación de trascripción que comprende toda o parte de la secuencia SEQ ID No. 1 que se ha modificado, por ejemplo, por adición, supresión o sustitución de uno o más nucleótidos, también forma parte de la invención. Estas modificaciones pueden modificar la actividad trascripcional al provocar un incremento, o por el contrario, una disminución, en la actividad del promotor o del elemento regulador. Esta modificación también puede afectar la especificidad del tejido del promotor o del elemento regulador. De esta manera, por ejemplo, un ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención se puede modificar a fin de estimular la trascripción en solo uno de los tejidos en los cuales se expresa de forma natural . Un ácido de regulación de trascripción de acuerdo con la invención también se puede modificar y se puede hacer inducible por un compuesto específico, por ejemplo, al crear, en la secuencia un sitio que sea inducible por un compuesto terapéutico dado. Las modificaciones en una secuencia que comprende toda o parte de la secuencia SEQ ID No . 1 y que comprende el promotor o un elemento regulador se pueden llevar a cabo usando métodos que son bien conocidos por las personas expertas en la técnica, tal como mutagénesis. La actividad del elemento promotor regulador modificado entonces se puede probar, por ejemplo, al clonar el promotor modificado en la dirección 5 ' de un gen indicador, al transfectar la construcción de ADN resultante en una célula hospedadora y al medir el nivel de expresión del gen indicador en la célula hospedadora transfectada. La actividad del promotor modificado también se puede analizar in vivo en los animales transgénicos. También es posible construir bibliotecas de fragmentos modificados que se puedan detectar usando pruebas funcionales en las cuales, por ejemplo, solo se seleccionarán los promotores o los elementos reguladores que tengan actividad deseada. Estos ensayos se pueden basar, por ejemplo, en el uso de genes indicadores que confieran resistencia a compuestos dados, por ejemplo, a antibióticos. La selección de células que tienen una construcción de gen indicador/ácido nucleico regulador y que contengan un promotor o un elemento regulador con la modificación deseada, entonces se pueden aislar al cultivar las células hospedadoras transformadas que tienen esta construcción, en la presencia de un compuesto dado, por ejemplo, del antibiótico dado. El gen indicador también puede codificar para cualquier proteína fácilmente detectable, por ejemplo, una proteína ópticamente detectable tal como luciferaza. En consecuencia, un individuo de la invención es un ácido nucleico que comprende: a) un ácido nucleico de regulación de trascripción como se define anteriormente; y b) un polinucleótido de interés que codifica para un polipéptido o un ácido nucleico de interés.

De acuerdo a un primer aspecto, el polinucleótido de interés cuya trascripción se desea codifica para una proteína o un péptido. La proteína puede ser de cualquier naturaleza, por ejemplo, una proteína de interés terapéutico, incluyendo citocinas, proteínas estructurales, receptores o factores de trascripción. Por ejemplo, cuando se desea la trascripción de forma específica en ciertos tejidos, tal como por ejemplo en el hígado, macrófagos o células de placenta, el ácido nucleico de regulación de trascripción comprenderá de manera ventajosa un ácido nucleico que varía desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -1318, con respecto al sitio de inicio de trascripción de la secuencia SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 3. En este caso, el polinucleótido de interés codificará para un gen comprendido en el combate de la inflamación, tal como un receptor de citosina, o una superóxido-dismutasa. Si se desea un efecto antitumoral, entonces se buscará la estimulación y activación de linfocitos T citotóxicos específicos para un antígeno tumoral dado . De manera alternativa, el ácido nucleico regulador comprende de manera ventajosa un ácido nucleico que varía desde el nucleótido en la posición +108 al nucleótido en la posición -2228, con respecto al sitio de inicio de trascripción de la secuencia SEQ ID No. 1. En otra modalidad, un ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención se usará en combinación con un polinucleótido de interés que codifica para la proteína ABCl. Como se menciona ya, el polinucleótido de interés también puede codificar para un ácido nucleico, tal como un ácido nucleico antisentido específico para un gen, la inhibición de cuya traducción, se desea. De acuerdo a otro aspecto, el polinucleótido de interés, cuya trascripción se regula por el ácido nucleico regulador, es un gen indicador, tal como cualquier gen que codifica para un proteína detectable. Entre los genes indicadores de ejemplo, se puede hacer mención, por ejemplo, de luciferaza, la ß-galactosidasa (LacZ) o el gen de cloramfenicol-acetil-transferasa (CAT) o cualquier gen que codifica para una proteína que confiere resistencia a un compuesto específico, tal como un antibiótico.

Vectores Recombinantes Para los propósitos de la presente invención, "vector" se propondrá que signifique una molécula lineal o circular de ARN o ADN que esta de manera indistinta en la forma de hebra individual o de doble hebra.

De acuerdo a una primera modalidad, un vector recombinante de acuerdo con la invención se usa para amplificar el -ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención, que se inserta en el mismo después de la transformación o transfección de la célula hospedadora deseada. De acuerdo a una segunda modalidad, son vectores de expresión que comprenden además de un ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención, secuencias cuya expresión se busca en una célula hospedadora o en un organismo multicelular dado. De acuerdo a una modalidad ventajosa, un vector recombinante de acuerdo con la invención comprenderá, por ejemplo, los siguientes elementos: (1) un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención; (2) un polinucleótido de interés que comprende una secuencia de codificación incluida en el ácido nucleico que se va a insertar en este vector, la secuencia de codificación que se coloca en el cuadro con las señales reguladoras descritas en (1) ; y (3) secuencia de inicio y fin de trascripción, adecuadas . Además, los vectores recombinantes de acuerdo con la invención pueden incluir uno o más orígenes de replicación en las células hospedadoras en las cuales se desea su amplificación o su expresión, marcadores o marcadores de selección. A manera de ejemplo, los promotores bacterianos pueden ser los promotores Lacl o LacZ, los promotores de ANR-polimerasa de bacteriófago T3 o T7 o los promotores PR o PL de lambda-fago. Los promotores para células eucarióticas pueden comprender el promotor de timidina-cinasa del virus HSV o el promotor de metalotionina-L de ratón. En general, para la elección de un promotor adecuado, las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de manera ventajosa al trabajo mencionado con anterioridad de Sambrook et al. (1989) o a las técnicas descritas por Fuller et al. (1996) . Cuando la expresión de la secuencia genómica del gen ABCl se desea, los vectores que son capaces de incluir grandes secuencias de inserción se usarán, a manera de ejemplo. En esta modalidad específica, los vectores de bacteriófagos, tal como los vectores de bacteriófago Pl tal como el vector P158 o el vector P158/neo8 descritos por Sternberg (1992, 1994), se usarán a manera de ejemplo. Los vectores bacterianos de acuerdo con la invención pueden ser, por ejemplo, los vectores pBR322 (ATCC37017) o vectores tal como pAA2233 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y pGEMI (Promega Biotech, Madison, Wl , EUA) . También, se puede hacer mención de otros vectores comercializados, tal como los vectores pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) . También puede ser el vector recombinante PXP1 descrito por Nordeen SK et al (1988) . BioTechniques, 6: 454-457) . También pueden ser vectores del tipo de Baculovirus, tal como el vector pVL1392/1393 (Pharmingen) usado para transfectar células de la línea Sf9 (ATCC No. CRL 1711) derivada de Spodoptera frugiperda. También pueden ser vectores adenovirales, tal como el adenovirus humano tipo 2 o 5. Un vector recombinante de acuerdo con la invención también puede ser un vector retroviral o un vector adeno-asociado (AAV) . Estos vectores adeno-asociados se describen, por ejemplo, por Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989) o McLaughlin BA et al. (1996). Para permitir la expresión de un polinucleótido de interés bajo el control de una ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención, la construcción del polinucleótido que comprende la secuencia reguladora y la secuencia de codificación se puede introducir en una célula hospedadora.

La introducción de esta construcción de polinucleótido de acuerdo a la invención en una célula hospedadora se puede llevar a cabo in vitro, de acuerdo a técnicas bien conocidas para personas expertas en la técnica para transformar o transfectar células, ya sea en cultivo primario o en la forma de líneas celulares . La introducción de los polinucleótidos de acuerdo a la invención también se puede llevar a cabo in vivo o ex vivo, para prevenir o tratar enfermedades enlazadas a una deficiencia en el transporte invertido de colesterol. Para producir los polinucleótidos o los vectores en una célula hospedadora, las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia de manear ventajosa a varias técnicas, tal como la técnica de precipitación con fosfato de calcio (Graham et al., 1973, Chen et al., 1987), DEAE Dextran (Gopal, 1985) , electroporación (Tur-Kaspa, 1986; Póster et al., 1984) , microinyección directa (Harland et al., 1985) o liposomas cargados de ADN (Nicolau et al., 1982, Fraley et al., 1979) . Una vez que se ha introducido el polinucleótido en la célula hospedadora, se puede integrar de manera estable en el genoma de la célula. La integración se puede llevar a cabo en un lugar específico en el genoma, por recombinación homologa, o se puede integrar de manera aleatoria. En algunas modalidades, el polinucleótido se puede mantener de manera estable en la célula hospedadora en la forma de un fragmento de episoma, la episoma que comprende secuencias que permite a este último ser mantenido y replicado, ya sea de manera independiente o en sincronía con el ciclo celular. De acuerdo a una modalidad, un método para introducir un polinucleótido de acuerdo a la invención en una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora que se origina de un mamífero, in vivo, comprende una preparación que comprende un vector farmacéuticamente compatible y un polinucleótido "desnudo" de acuerdo a la invención, colocado bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas, se introducen por inyección local en el tejido elegido, por ejemplo, un tejido de músculo liso, el polinucleótido "desnudo" que se absorbe por las células de este tejido. Las composiciones para el uso in vitro e in vivo que comprenden polinucleótidos "desnudo" se describe, por ejemplo, en la solicitud de PCT No. WO 95/11307 (Pasteur Institute, Inserm, University of Ottawa) y en los artículos de Tacson et al. (1996) y por Huygen et al. (1996) . De acuerdo a una modalidad específica de la invención, se proporciona una composición para producir una proteína de interés in vivo. Esta composición comprende un polinucleótido que codifica para el polipéptido de interés, colocado bajo el control de una secuencia reguladora de acuerdo a la invención, en solución en un vector fisiológicamente aceptable. La cantidad del vector que se inyecta en el organismo hospedador elegido varía de acuerdo al sitio de inyección. A manera de indicación, se pueden inyectar entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 µg de la construcción de polinucleótido de secuencia reguladora/secuencia de codificación en el cuerpo de un animal . Cuando el ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención se localiza, en la construcción de polinucleótido (o vector) , para controlar la trascripción de una secuencia que comprende un cuadro de vector abierto que codifica para la proteína ABCl, el vector se puede inyectar en el cuerpo de un paciente probablemente para desarrollar una enfermedad enlazada a una deficiencia en el transporte invertido de colesterol, o quien haya desarrollado ya esta enfermedad, por ejemplo, un paciente con una predisposición para la enfermedad de Tangier, o quien haya desarrollado ya la enfermedad. En consecuencia, la invención también se refiere a una composición farmacéutica propuesta para prevenir, o para tratar individuos afectados por, una disfunción del transporte invertido del colesterol, que comprende un ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención y un polinucleótido de interés que codifica para la proteína ABCl, en combinación con uno o más excipientes fisiológicamente compatibles. De manera ventajosa, esta composición comprenderá el ácido nucleico regulador definido por cualguiera de las secuencias SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2, o un fragmento biológicamente activo de este ácido nucleico regulador. Un objeto de la invención también es una composición farmacéutica propuesta para prevenir, o para tratar individuos afectados por, una disfunción del transporte invertido de colesterol, que comprende un vector recombinante como se define anteriormente en asociación con uno o más excipientes fisiológicamente aceptables. La invención también se refiere al uso de una construcción de polinucleótido de acuerdo con la invención que comprende un ácido nucleico regulador para el gen ABCl, así como una secuencia que codifica para la proteína ABCl, para la elaboración de un producto medicinal propuesto para prevenir la aterosclerosis en varias formas o por ejemplo para tratar individuos afectados por una disfunción del transporte invertido de colesterol . La invención también se refiere al uso de un vector recombinante de acuerdo a la invención, que comprende, además de un ácido nucleico regulador de la invención, un ácido nucleico que codifica para la proteína ABCl, para elaborar un producto medicinal propuesto para prevenir la aterosclerosis en varias formas, o por ejemplo, para tratar individuos afectados para una disfunción del transporte invertido de colesterol .

Vectores que son útiles en métodos de terapia génica, somática y composiciones que contienen estos vectores La presente invención también se refiere a un nuevo planteamiento terapéutico para tratar patologías enlazadas al transporte de colesterol. Propone una solución ventajosa a las desventajas de la técnica anterior, al demostrar la posibilidad de tratar patologías, por ejemplo, patologías enlazadas al transporte de colesterol, por terapia génica, al transferir y expresar, in vivo, una construcción de polinucleótido que comprende, además de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención, una secuencia que codifica para una proteína ABCl comprendida en el transporte y metabolismo de colesterol. La invención también ofrece un medio simple que permite el tratamiento específico y efectivo de las patologías asociadas tal como por ejemplo aterosclerosis. La terapia génica consiste en la corrección de una deficiencia o una anormalidad (mutación, expresión anormal, etc.) o al efectuar la expresión de una proteína terapéutica de interés al introducir información genética en la célula u órgano afectado. Esta información genética se puede introducir ya sea ex vivo, en una célula extraída del órgano, la célula -modificada que se reintroduce en el cuerpo, o directamente in vivo en el tejido apropiado. En el segundo caso, existen varias técnicas, entre las cuales, diversas técnicas de transfección que comprenden complejos de ADN y de DEAE-dextrano (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), de ADN y de proteínas nucleares (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375, y de ADN y de lípidos (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), el uso de liposomas (Fraley et al., J. Biol, Chem 255 (1980) 10431), etc. De manera más reciente, el uso de virus como vectores para transferir genes ha aparecido como una alternativa promisoria a estas técnicas físicas de transfección. A este respecto, se han probado varios virus, para su capacidad para infectar ciertas poblaciones celulares. Por ejemplo, los retrovirus (RSV, HMS, MMS, etc.), el virus HSV, virus adeno-asociados y adenovirus . La presente invención se refiere de esta manera a un nuevo planteamiento terapéutico para tratar patologías enlazadas al transporte de colesterol, que consiste en la transferencia y en el expresión, in vivo, de genes que codifican para ABCl colocado bajo el control de un ácido regulador de acuerdo con la invención. El solicitante ahora ha mostrado de manera ventajosa que es posible construir virus recombinantes que contiene una secuencia de ADN que comprende un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención y una secuencia que codifica para una proteína ABCl comprendida en el metabolismo del colesterol y a administrar estos virus recombinantes in vivo, y que esta administración permite una expresión de una proteína ABCl biológicamente activa in vivo, que es estable y efectiva y que está sin efecto histopatológico. Los adenovirus constituyen vectores que son eficientes para la transferencia y expresión del gen ABCl. Por ejemplo, el uso de adenovirus recombinantes como vectores hace posible obtener niveles de expresión del gen de interés que son suficientemente altos para producir el efecto terapéutico deseado. Otros vectores virales, tal como retrovirus o virus adeno-asociados (AAV) , que permiten una expresión estable del gen, también se reivindican. La presente invención ofrece de esta manera un nuevo planteamiento para tratar y prevenir patologías cardiovasculares y neurológicas enlazadas a las anormalidades en el transporte de colesterol. Un objeto de la invención es de esta manera un virus recombinante defectuoso que comprende un ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína ABCl comprendida en el metabolismo del colesterol.

La invención también se refiere al uso de este virus recombinante defectuoso para preparar una composición farmacéutica propuesta para tratar y/o para prevenir enfermedades cardiovasculares. La presente invención también se refiere al uso de células que están genéticamente modificadas ex vivo con un virus como se escribe anteriormente o de células productoras para estos virus, que se implantan en el cuerpo, permitiendo una expresión prolongada y efectiva in vivo de una proteína ABCl biológicamente activa. La presente invención muestra que es posible incorporar una secuencia de ADN que codifica para ABCl, bajo el control de un ácido nucleico regulador como se define anteriormente, en un vector viral, y que estos vectores hacen posible expresar de manera efectiva una forma madura biológicamente activa. Por ejemplo, la invención muestra que la expresión in vivo de ABCl se puede obtener por administración directa de un adenovirus o por implantación de una célula productora o una célula que está genéticamente modificada con un adenovirus o con un retrovirus que incorpora este ADN. La presente invención también es ventajosa debido a que hace posible inducir una expresión de ABCl que se controla y sin efectos perjudiciales en órganos, la expresión de esta proteína que no está normalmente relacionada. Por ejemplo, se obtiene una liberación significativa de la proteína ABCl por implantación de células que producen vectores de la invención, o que son efectivos ex vivo con vectores de la invención. La actividad del transportador de colesterol producida en el contexto de la presente invención puede ser del tipo ABCl humano o animal . La secuencia de ácido nucleico usada en el contexto de la presente invención puede ser un ADNc, un ADN genómico (ADNg) , un ARN (en el caso de retrovirus) o una construcción híbrida que consiste, por ejemplo, de un ADNc en el cual se insertaran uno o más intrones. También pueden ser secuencias sintéticas o semi-sintéticas. Por ejemplo, se usa un ADNc o un ADNg. Por ejemplo, el uso de un ADNg permite mejor expresión en células humanas. Para permitir su incorporación en un vector viral de acuerdo con la invención, estas secuencias se modifican de manera ventajosa, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, para insertar sitios de restricción adecuados . Las secuencias descritas en la técnica anterior no se construyen en realidad para el uso de acuerdo con la invención y los ajustes anteriores pueden probar ser necesarios para obtener expresiones sustanciales. En el contexto de la presente invención, el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un proteína ABCl humana es un ejemplo. Además, también es posible usar una construcción que codifica para un derivado de estas proteínas ABCl . Un derivado de estas proteínas ABCl comprende, por - ejemplo, cualquier secuencia que este se obtenga por mutación, supresión y/o adición, con respecto a la secuencia nativa y que codifique para un producto que conserva la actividad de transportador de colesterol. Estas modificaciones se pueden llevar a cabo por las técnicas conocidas por las personas expertas en la técnica (ver,, las técnicas de biología molecular generales, posteriores) . La actividad biológica de los derivados obtenidos de esta manera entonces se puede determinar fácilmente, como se indica, por ejemplo, en los ejemplos que describen la medición de la afluencia de colesterol de las células. Para los propósitos de la invención, los derivados también se pueden obtener por hibridación usando bibliotecas de ácido nucleico, usando la secuencia nativa a un fragmento de esta secuencia como sonda. Estos derivados son, por ejemplo, moléculas con mayor afinidad para sus sitios de unión, o moléculas que tienen mayor resistencia a proteasa, o- moléculas con una mayor eficiencia terapéutica o menores efectos laterales u opcionalmente, nuevas propiedades biológicas. Los derivados también incluyen las secuencias modificadas de ADN que permiten la expresión mejorada in vivo. En una primera modalidad, la presente invención se refiere a un virus recombinante defectuoso que comprende un ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención y una secuencia de ADNc -que codifica para una proteína ABCl comprendida en el transporte y metabolismo de colesterol. En otra modalidad de la invención, la secuencia de ADN es una secuencia de ADNg. La secuencia de ADNc que codifica para la proteína ABC1, y que se puede usar en un vector de acuerdo con la invención, es de manera ventajosa la secuencia SEQ ID No. 10. Los vectores de la invención se pueden preparar a partir de varios tipos de virus. Por ejemplo, los vectores derivados de adenovirus, virus adeno-asociados (AAV) , herpesvirus (HSV) o retrovirus, se usan. También es ventajoso usar adenovirus para una administración directa o para la modificación ex vivo de células propuestas para el implante, o un retrovirus para implantar células productoras . Los virus de acuerdo con la invención son defectuosos, es decir, son incapaces de replicarse autónomamente en la célula objetivo. En general, el genoma de los virus defectuoso usados en el contexto de la presente invención de esta manera está carente de al menos la secuencias requeridas para la aplicación del virus en la célula infectada. Estas regiones se pueden ya sea remover (total o parcialmente) , poner no funcionales o sustituir con otras secuencias, y por ejemplo, con la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína ABC1. Por ejemplo, sin embargo, el virus defectuoso conserva las secuencias en su genoma que se requieren para la encapsidación de las partículas virales. Con respecto a los adenovirus, se han caracterizado varios serotipos, cuya estructura y propiedades varían algo. Por ejemplo, entre los serotipos en el contexto de la presente invención, se pueden usar los adenovirus humanos tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad5) o adenovirus de origen animal (ver solicitud WO 94/26914) . Entre los adenovirus de origen animal que se pueden usar en el contexto de la presente invención, se puede hacer mención de los adenovirus de origen canino, bovino, murino, (por ejemplo: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, avícola o simiesco (ejemplo: SAV) . Por ejemplo, el adenovirus de origen animal puede ser un adenovirus canino, tal como un adenovirus de CAV2 [por ejemplo, Manhattan o cepa A26/61 (ATCC VR-800) ] . Por ejemplo, en el contexto de la invención, se pueden usar adenovirus de origen humano o canino o mezclado. Además, el adenovirus defectuoso de la invención puede comprender también ITR, una secuencia que permite la encapsidación y la secuencia que codifica para la proteína ABC1 colocada bajo el control de un ácido nucleico de acuerdo con la invención. En una modalidad de la presente invención, en el genoma del adenovirus de la invención, la región El se vuelve al menos no funcional . En otra modalidad, en el genoma del adenovirus de la invención, en gen El y la menos uno de los genes E2, E4 y L1-L5 son no funcionales. El gen viral bajo consideración se pude volver no funcional por cualquier técnica conocida para las personas expertas en la técnica y por ejemplo, por eliminación total, substitución, supresión parcial o adición de una o más bases en el (los) gen(es) bajo consideración. Ciertas modificaciones se pueden obtener in vitro (en ADN aislados) o in situ, por ejemplo, por medio de las técnicas de ingeniería genética o por tratamiento con agentes mutagénicos. También se pueden modificar otras regiones y por ejemplo, la región E3 (WO 95/02697) , E2 (Wo94/28938) , E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) y L5 (WO 95/02697) . De acuerdo a una modalidad, el adenovirus de acuerdo con la invención comprende una supresión en las regiones El y E4, y la secuencia que codifica para ABCl se inserta en la región El inactivada. De acuerdo a otra modalidad, comprende usa supresión en la región El, en la cual se inserta un región E4 y la secuencia que codifica para ABCl (Solicitud de Patente Francesa FR 94 13355) . El adenovirus recombinante defectuoso de acuerdo con la invención se puede preparar por cualquier técnica conocida por las personas expertas en la técnica (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Por ejemplo, se pueden preparar por recombinación homologa entre un adenovirus y un plásmido que tiene, inter alia, la secuencia de ADN se codifica para la proteína ABCl. La recombinación homologa toma lugar, por ejemplo, después de la co-transfección del adenovirus y el plásmido en una línea celular adecuada. La línea celular usada deber ser, por ejemplo, (i) transformable por los elementos, (ii) tener las secuencias que son capaces de complementar la porción del genoma del adenovirus defectuoso, tal como en una forma integrada para evitar los riesgos de recombinación. A manera de ejemplo de una línea, se puede hacer mención de la línea de riñon embriónico humano 293 (Graham et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59) que comprende, por ejemplo, integrados a su genoma, la porción izquierdo del genoma de una adenovirus Ad5 (12 %) o líneas que son capaces de complementar las funciones El y E4, como se describe, por ejemplo, en las solicitudes No. WO 94/26914 y WO 95/02697. Luego, los adenovirus que se han multiplicado se pueden recuperar y modificar de acuerdo a las técnicas convencionales de biología molecular, como se ilustra en los ejemplos . En lo que respecta a los virus adeno-asociados (AAV) , son virus de ADN relativamente pequeños, que se integran en el genoma de la células que infectan, de una manera estable y especifica del sitio. Son capaces de infectar un amplio espectro de células, sin inducir efectos de crecimiento celular, morfología o diferenciación celular. Además, no parecen estar comprendidos en las patologías humanas. El genoma AAV se ha clonado, secuenciado y caracterizado. Comprende aproximadamente 4700 bases y contiene, en cada extremo, una región de repetición invertida (ITR) de 145 bases aproximadamente que sirven como un origen de replicación para el virus. El resto del genoma se divide en dos regiones esenciales que tienen las funciones de encapsidación: la porción izquierda del genoma, que contiene el gen rep que está comprendida en la replicación viral y en la expresión de genes virales; la porción derecha del genoma, que contiene el gen sea cap que codifica para las proteínas de cápsida del virus. El uso de los vectores derivados de AAV para transferir genes in vitro e in vivo se ha descrito en la literatura (ver, por ejemplo, WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528)". Estos documentos describen varias construcciones derivadas de AAV, en las cuales los genes rep y/o cap se suprimen y remplazan con un gen de interés, y su uso para transferir el gen- de interés in vitro (en células de cultivo) o in vivo (directamente en un organismo) . Sin embargo, ninguno de estos documentos describe o sugiere el uso de un AAV recombinante para transferir y espesar una proteína ABCl in vivo o ex vivo, con las ventajas- de esta transferencia. Los AAV recombinantes, defectuosos de acuerdo con la invención se pueden preparar al co-transfectar, en una línea celular que se ha infectado con un virus auxiliar humano (por ejemplo, un adenovirus) un plásmido que contiene la secuencia que codifica para la proteína ABCl, limitada por dos regiones de repetición invertidas (ITR) de AAV y un plásmido que tiene los genes de encapsidación de AAV (genes rep y cap) . Los AAV recombinantes producidos entonces se pueden purificar por técnicas convencionales. En lo que respecta a los virus de herpes o retrovirus, la construcción de vectores recombinantes se ha descrito ampliamente en la literatura: ver, por ejemplo, Brealfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. Por ejemplo, los retrovirus son virus de integración que infectan células en división. El genoma de retrovirus comprende dos LTR, una secuencia de encapsidación y tres regiones de codificación (gag, pol y env) . En los vectores recombinantes derivados de retrovirus, los genes gag, pol y env están en general suprimidos o reemplazados de manera total o parcial con una secuencia heteróloga de ácido nucleico de interés. Estos vectores se pueden preparar a partir de varios tipos de retrovirus, tal como por ejemplo MoMuLV ("virus - de -leucemia de Moloney murina"; también referida como MoMLV) , MSV ("virus de sarcoma de murino"), HaSV ("virus de sarcoma de Harvey") , SNV ("virus de necrosis de bazo") , RSV ("virus de sarcoma Rous") o el virus de Friend. Para construir el retrovirus recombinantes que comprende una secuencia que codifica para la proteína ABC1, colocada bajo el control de una ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención, un plásmido que comprende, por ejemplo, los LTR, la secuencia de encapsidación y la secuencia de codificación se construye en general, y entonces se usa para transfectar una llamada línea celular de encapsidación que es capaz de proporcionar, en transferencia, las funciones retrovirales deficientes en el plásmido. En general, las líneas de encapsidación son capaces de esta manera de expresar los genes gag, pol u env. Estas líneas de encapsidación se han descrito en la técnica anterior, por ejemplo, la línea PA317 (US 4,861,719); la línea PsiCRIP (WO 90/02806) y la línea GP+envAm-12 (WO 89/07150) . Los retrovirus recombinantes pueden comprender modificaciones en los LTR para eliminar la actividad transcripcional, así como la secuencia de encapsidación extendidas que comprende una porción del gen gag (Bender et al., J. Virol 61 (1987) 1639). Los retrovirus recombinantes producidos entonces se pueden purificar por técnicas convencionales. Para implementar la presente invención, es ventajoso usar un adenovirus recombinante defectuoso. Los resultados dados posteriormente demuestran en realidad las propiedades de los adenovirus que son ventajosas para expresar, in vivo, una proteína que tiene actividad de transporte de colesterol . Los vectores adenovirales de acuerdo a la invención son ventajosos para la administración directa in vivo de una sustancia purificada para transformar celular, por ejemplo, células antologas, ex vivo con vista a implantarlas. Además, los vectores adenovirales de acuerdo con la invención también tiene ventajas, tal como por ejemplo, su eficiencia muy alta de infección, que hace posible llevar a cabo infecciones usando pequeños volúmenes de suspensión viral . De acuerdo a otra modalidad de la invención, una línea productora para vectores retrovirales que contiene un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención y la secuencia que codifica para la proteína ABCl se usa para una implantación in vivo. Las líneas que se pueden usar para este fin son, por ejemplo, las células PA317 (US 4.861,719), PsiCrip (WO/90/02806) y GP+envAm-12 (US 5,278,056), que se modifican para permitir la producción de un retrovirus que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína ABCl de acuerdo a la invención. Por ejemplo, las células madre totipotenciales, que son precursores de las líneas de células sanguíneas, se pueden muestrear y aislar del individuo. Estas células, que se ponen en cultivo, entonces se pueden transfectar con el vector retroviral que contiene la secuencia que codifica para la proteína ABCl bajo el control de su propio promotor. Estas células entonces se reintroducen en el individuo. La diferenciación de estas células será el origen de las células sanguíneas que expresan la proteína ABC1, por ejemplo, el origen de monocitos que, cuando se transforma de macrófagos, participan en la remoción de colesterol de la pared arterial . Esto macrófagos que expresan la proteína ABCl tendrán una capacidad de incrementada de metabolizar el colesterol en exceso y la harán disponibles en la superficie celular para su remoción por los aceptores primarios del colesterol de membrana. En una modalidad de la presente invención, en los vectores de la invención, la secuencia que codifica para la proteína ABCl se coloca bajo el control de una ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención, que comprende los elementos reguladores que permiten su expresión de las células infectadas y por ejemplo, los elementos reguladores del tipo PPAR.

En otra modalidad, los vectores de la invención comprenden la secuencia que codifica para la proteína ABC1 que se coloca bajo el control de un ácido nucleico regulador que comprende una región que varía desde el nucleótido en la posición +108 al nucleótido en la posición -2228, con respecto al sitio de inicio de trascripción como se expone en la SEQ IN No. 1. Nuevamente, en otra modalidad, los vectores de la invención comprenden la secuencia que codifica para la proteína ABC1 que se coloca bajo el control de un ácido nucleico regulador que comprende la secuencia promotora de núcleo y los 200 bp próximos del promotor del gen ABCl. Como se indica anteriormente, la presente invención también se refiere a cualquier uso de un virus como se describe anteriormente para preparar una composición farmacéutica propuesta para tratar y/o para prevenir patologías enlazadas al transporte del colesterol . La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más virus recombinantes, defectuosos como se describe anteriormente. Estas composiciones farmacéuticas se pueden formular con una vista a la administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, transdérmica, etcétera. En una modalidad de la presente invención, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, por ejemplo, cada una inyección intravenosa, tal como por ejemplo, en- la vena por tal del paciente. Pueden ser, por ejemplo, soluciones estériles isotónicas o composiciones liofilizadas o composiciones secas, por ejemplo, liofilizadas, que dependiendo del caso, en la adición, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables. La inyección directa en la vena portal del paciente es ventajosa puesto que hace posible toma como objetivo la infección en el hígado, y de esta manera concentrar el efecto terapéutico en este órgano. Las dosis de virus recombinantes defectuosos usados para la inyección se pueden ajustar como una función de varios parámetros y por ejemplo, como una función del vector viral, el método de administraciones usados, la patología relacionada o la duración deseada del tratamiento. En general, los adenovirus recombinantes de acuerdo con la invención se formulan y administran en la forma de dosis entre 104 y 1014 pfu/ml, y por ejemplo, 106 a 1010 pfu/ml. El termino pfu ("unidad formadora de placas") corresponde a la potencia infecciosa de una solución viral, y se determina al intentar un cultivo celular adecuado y medir, en general después de 48 horas, un número de placas de células infectadas. Las técnicas para determinar el título de pfu en una solución viral están bien documentadas en -la literatura. Con respecto a los retrovirus, las composiciones de acuerdo con la invención pueden comprender directamente las células productoras, con una vista e implantarlas. A este respecto, otra modalidad de la invención se refiere a cualquier célula de mamífero infectada con uno o más virus recombinantes, defectuosos como se describe anteriormente. Por ejemplo, la invención se refiere a cualquier población de células humanas infectadas por estos virus. Pueden ser, por ejemplo, células de origen sanguíneo (células madre totipotenciales o precursores) , fibrolastos, mioblastos, hepatocitos, queratinocitos, célula del músculo liso, células endoteliales, células gliales, etcétera. Las células de acuerdo con la invención se pueden derivar de cultivos primarios. Estos cultivos primarios se pueden muestrear por cualquier técnica conocida para las personas expertas en la técnica, y se ponen en cultivo bajo condiciones que permitan su proliferación. Con respecto a los fibroblastos, se pueden obtener fácilmente de biopsias, por ejemplos, de acuerdo a la técnica descrita por Ham [Methods Cell. Biol.21a (1980 255]. Estas células se pueden usar directamente para la infección con los virus o almacenados, por ejemplo, por congelamiento, para establecer bancos antólogos, con una vista a uso posterior. Las células de acuerdo a la invención también pueden ser cultivos secundarios, obtenidos por ejemplo, a partir de bancos preestablecidos (ver, por ejemplo, EP 228458, EP 289034, EP 4.00047, EP 456640) .- Las células cultivadas entonces se infectan con los virus recombinantes, para conferirles la capacidad de deducir una proteína ABCl biológicamente activa. La infección se lleva a cabo in vitro de acuerdo a técnicas conocidas por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, de acuerdo al tipo de célula usada y el número de copia de virus deseado por célula, la persona experta en la técnica puede ajustar la multiplicidad e infección y opcionalmente, el número de ciclos de infección llevados a cabo. Se entiende claramente que el método se debe realizar bajo condiciones estériles adecuadas cuando las células se propongan para una administración in vivo. Las dosis de virus recombinantes usadas para la infección de las células se puede ajustar por las personas expertas en la técnica de acuerdo a la finalidad deseada. Las condiciones descritas anteriormente para la administración in vivo se podrán aplicar a la infección in vitro. Para la infección con retrovirus, también es posible co-cultivar las células cuya infección se desea con células productoras para retrovirus recombinantes de acuerdo a la invención. Esto hace posible distribuir purificando los retrovirus. Otro objeto de la invención se refiere a un implante que comprende células de mamífero infectadas con uno o más virus recombinantes defectuosos como se escribe anteriormente o células productoras de virus recombinantes, y una matriz extracelular. En una modalidad de la presente invención, los implante de acuerdo a la invención comprenden de 105 a 1010 células. Por ejemplo, pueden comprender 106 a 108 células. Además, los implantes de la invención, la matriz extracelular puede comprender un compuesto de gelación y opcionalmente un soporte para fijar las células. Se pueden usar varios tipos de agentes de gelación para preparar unos implantes de acuerdo a la invención. Los agentes de gelación se pueden usar para incrustar las células de una matriz que tiene la constitución de un gel, y para promover la fijación de las células en el soporte, cuando se necesita. De esta manera se pueden usar varios agentes de adhesión celular como agentes de gelación, tal como por ejemplo, colágeno, gelatina, glucosaminoglicanos, fibronectina, lectinas, etc. En una modalidad de la presente invención, se elige el colágeno como una gente de gelación. Puede ser colágeno de origen humano, bovino o murino. Por ejemplo, se usa colágeno tipo I. Como se indica anteriormente, las composiciones de acuerdo a la invención pueden comprender de manera ventajosa un soporte para fijar las células. El termino "fijación" se refiere a cualquier forma de interacción - biológica y/o química y/o física que conduce a la adhesión y/o unión de las células de -soporte. Además, las células pueden ya sea cubrir el soporte usado o penetrar dentro de ese soporte o ambas cosas. En el contexto de esta invención, un soporte sólido no toxico y/o suyo compatible se puede usar. Por ejemplo, se puede usar fibras de politetrafluoroetileno (PTFE) o un soporte de origen biológico. La presente invención ofrece de esta manera un medio efectivo para tratar o prevenir las patologías enlazadas al transporte de colesterol, tal como obesidad, hipertrigliceridemia o en el campo de trastornos cardiovasculares, infarto al miocardio, angina, muerte súbita, falla cardiaca y accidente cerebrovasculares. Además, este tratamiento puede relacionarse tanto a humanos como a cualquier animal tal como ovejas, ganado vacuno, animales domésticos (perros, gatos etc.), caballos, peces, etc.

Células Hospedadoras Recombinantes La invención también se refiere a una célula hospedadora recombinante que comprende al menos uno de los ácidos nucleicos de la invención elegidos de la secuencia SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No . 3, SEQ ID No . 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No . 6, SEQ ID No . 7, y SEQ ID No . 8, por ejemplo, un ácido nucleico de la secuencia elegida de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No . 4 y SEQ ID No. 5. - De acuerdo a otro aspecto, la invención también se refiere a una célula hospedadora recombinante que comprende un vector recombinante como se escribe anteriormente . Las células hospedadoras de acuerdo a la invención son, por ejemplo, como sigue: a) células hospedadoras procarióticas: cepas de Escherichia coli (cepa de DH5-a) , de Bacillus subtilis, de Salmonella typhimurium, o cepas de las especies tal como Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococus; b) células hospedadoras eucarióticas: células HeLa (ATCC No. CCL2), células Cv 1 (ATCC No. CCL70) , células COS (ATCC No. CRL 1650), células Sf-9 (ATCC No. CRL 1711), células CHO (ATCC No. CCL- 1) o células 3T3 (ATCC No. CRL-6361) , O células de la línea Hepal-6 referidas en American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, Estados Unidos de América) c) células en cultivo primario, que se originan debido en quien se desea la expresión de un ácido nucleico de interés, colocado bajo el control de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención. d) células que se multiplican de manera indefinida (líneas celulares) , obtenidas de células en cultivo primario en c) anterior, de acuerdo a las técnicas bien conocidas por personas expertas en la técnica.

Métodos de Detección Método de Detección in Vitro La invención proporciona un método para tratar un individuo afectado por una patología enlazada al nivel de expresión de la proteína ABCl. Por ejemplo, este método de tratamiento consiste de la administración al individuo de un compuesto que modifica la expresión del gen ABCl, y que se puede identificar de acuerdo a diversos métodos de detección in vitro como se define posteriormente. Un primer método consiste en la identificación de compuestos que modifican la expresión del gen ABCl. De acuerdo a este método, se incuban células que expresan el gen ABCl con usa sustancia de molécula candidata que se va a probar, y el nivel de expresión del ARN mensajero de ABCl o el nivel de producción de la proteína ABCl, entonces se determina . Los niveles del ARN mensajero de ABCl se pueden determinar con hibridación- en gel tipo Northern, que es bien conocido por las personas expertas en la técnica. Los niveles de ARN mensajero de ABCl también se pueden determinar por métodos usando PCR o la técnica descrita por WEBB y HURSKAINEN (1996, Journal of Biomolecular Screening, vol. 1:119) . Los niveles de producción de la proteína ABCl se pueden determinar por inmunoprecipitación o inmunoquímica, usando un anticuerpo que conoce específicamente la proteína ABCl. De acuerdo con el método . para detectar una molécula sustancia o candidata que modifica la actividad de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención, una construcción de nucleótido como se define anteriormente, que comprende un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención y un polinucleótido indicador colocado bajo el control de ácido nucleico regulador, se usa el ácido nucleico regulador que comprende al menos un promotor básico y la menos elemento regulador de una de las secuencias SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2, un ácido nucleico regulador que comprende una región que varia desde los nucleótidos -2228 a +108 de la secuencia SEQ ID No. 1, o un ácido nucleico regulador que comprende el promotor de núcleo y los 200 pb próximos en el promotor del gen ABCl. El polinucleótido indicador puede ser un gen que codifica para una proteína detectable, tal como un gen que codifica para una luciferasa . De acuerdo a este método de detección, las células se transfectan de manera estable o momentánea con la construcción de polinucleótido que contiene ácido nucleico regulador, de acuerdo a la invención y el polinucleótido indicador. Las células transformadas entonces se incuban en la presencia o ausencia de la molécula o sustancia candidata que se va a probar, durante un tiempo suficiente, y entonces se determina el nivel de expresión del gen indicador. Los compuestos que inducen un cambio estadísticamente significativo en la expresión del gen indicador (ya sea un incremento o por el contrario, una disminución en la expresión del gen indicador) entonces se identifica y cuando es apropiado, se selecciona. De esta manera, un objeto de la invención también es un método para detectar, in vitro, una molécula o una sustancia que modifica la actividad de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención, por ejemplo, que modifica la trascripción del polinucleótido indicador que es un constituyente de una construcción de polinucleótido de acuerdo a la invención, caracterizada en que comprende: a) cultivar una célula hospedadora al recombinante que comprende un polinucleótido de interés colocado bajo el control de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención; b) incubar la célula hospedadora recombinante con la sustancia molecular que se va a probar; c) detectar la expresión del polinucleótido de interés; d) comparar los resultados obtenidos en c) con los resultados obtenidos cuando la célula hospedadora recombinante se cultiva en la ausencia de la molécula o sustancia candidata que se va a probar. La invención también se refiere a un equipo o paquete para detectar, in vitro, una molécula o sustancia candidata que es capaz de modificar la actividad de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención, que comprende: a) una célula hospedadora transformada con una construcción de polinucleótido como se define anteriormente, que comprende un polinucleótido e indicador de interés colocado bajo control de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención; y b) opcionalmente, un medio para detectar la expresión del polinucleótido indicador de interés. En una modalidad de la presente invención, el polinucleótido indicador de interés es la secuencia que codifica para un luciferasa. En esta modalidad, el ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención se inserta en un vector, en la dirección cinco con apostrofo en la secuencia que codifica para la luciferasa. Puede ser, por ejemplo, el vector pGL3 -básico (pGL3-b) vendido por la compañía PROMEGA (Madison, Wisconsin, USA) . En esta modalidad, el vector recombinante que comprende la secuencia que codifica -para la luciferasa, colocado bajo control de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la - invención, se transfecta en células de carcinoma hepatocelular, tal como las células de la línea HepG2 , cuya actividad en luciferasa entonces se determina después del cultivo en la presencia o ausencia de la sustancia molécula candidata que se va a probar. En esta modalidad, los vectores pGL3-b que contienen ya sea el promotor de citomegalovirus (CMV) , el promotor ApoAl o ningún promotor, se pueden usar como controles. Para el ensayo de actividad de luciferasa, las células transfectadas se lavaron con un amortiguador de PBS y se usaron con 500 µl de amortiguador de lisis (tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0.02 % de azida sódica, 1 % de NP-40, 100 µg/ml de AEBSF y 5 µg/ml de leupeptina) . 50 µl de lisado celular obtenido entonces se adicionan a 100 µl del sustrato de luciferasa (Promega) y las mediciones de actividad se llevan a cabo en un lector de espectrofotométrico de microplacas, 5 minutos después de la adición del lisado celular. Los datos se expresan en unidades relativas de actividad de luciferasa. Las construcciones de polinucleótido que producen altos niveles de actividad de luciferasa en las células transfectadas son aquellas que contienen un ácido nucleico regulador de acuerdo con la invención, incluido en la secuencia SEQ ID No. 1 que es capaz de estimular la trascripción. Para l s -mediciones de los niveles de expresión del ARN mensajero en un método de detección de acuerdo a la invención, se preparan primero sondas específicas para el ARN mensajero del polinucleótido indicador de interés, por ejemplo, usando el equipo de multimarcado Kit Multiprime (vendido por la compañía Amersham Life Sciences, Cleveland, Ohio, EUSA) .

Método de Detección In Vivo De acuerdo a otro aspecto de la invención, las composiciones que modifican la actividad de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención se puede identificar in vivo en animales transgénicos no humanos. De acuerdo a este método, un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón, se trata con una molécula o sustancia candidata que se va a probar, por ejemplo, una sustancia o molécula candidata que se ha seleccionado de antemano por un método de detección in vitro como se define anteriormente. Después de una duración dada, el nivel de actividad del ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención se determina y compara a la actividad de un animal transgénico no humano idéntico, por ejemplo, un ratón transgénico idéntico, que no ha recibido la molécula o sustancia candidata. La actividad del ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención, que es funcional en el animal transgénico, se puede determinar por métodos diversos, por ejemplo, midiendo los niveles de la ARN mensajero que corresponden a los polinucleótidos indicadores de interés colocados bajo el control del ácido nucleico regulador, por hibridación tipo Northern o por hibridación in situ. De acuerdo a una alternativa, la actividad del ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención se puede determinar al medir los niveles de expresión de proteína codificada por los polinucleótidos indicadores de interés, por ejemplo, por inmunohistoquímica, cuando el indicador de polinucleótido de interés comprenda un cuadro de lectura abierto de acuerdo a una proteína que es detectable por esta técnica. Para implementar un método para detectar, in vivo, una sustancia o molécula candidata que modifica la actividad de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención, se pueden usar mamíferos no humanos, tal como ratones, ratas o cobayos o conejos, cuyo genoma se modifica al insertar una construcción de polinucleótido que comprende un polinucleótido de interés colocado bajo el control de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención.

Los animales transgénicos de acuerdo a la invención comprenden el transgen, es decir, la construcción de polinucleótido - mencionado anteriormente, en una pluralidad de sus células somáticas y/o germen. La construcción de animales transgénicos de acuerdo a la invención se puede llevar a cabo de acuerdo a técnicas convencionales bien conocidas por las personas expertas en la técnica. Las personas expertas en la técnica pueden hacer referencia, por ejemplo, a la producción de animales transgénicos, tal como a la producción de ratones transgénicos, como se describe en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,873,191 (otorgada el 10 de Octubre de 1989), No. 5,464,764 (otorgada el 7 de Noviembre de 1995) y No. 5,789,215 (otorgada el 4 de Agosto de 1998), los contenidos de estos documentos que se incorporan en la presente a manera de referencia. De manera breve, una construcción de polinucleótido que comprende un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención y un polinucleótido indicador de interés, colocado bajo el control de este último, se inserta una línea de células madre del tipo ES. La inserción en la construcción de polinucleótido se lleva a cabo, por ejemplo, por electroporación, como se describe por Thomas et al. (1987, Cell, Vol. 51:503-512). Las células que se han sometido a la electroporación entonces se detectan para la presencia de la construcción de polinucleótido (por ejemplo, por selección con la ayuda de marcadores, o por PCR, o por análisis tipo Southern de ADN en geles de electroforesis) , a fin de seleccionar las células positivas que tienen integrado la construcción de polinucleótido exógeno en su genoma, cuando es apropiado, después de un evento de recombinación homólogo. Esta técnica se describe, por ejemplo, por Mansour et al. (1988, Nature, Vol. 336:348-352). Luego, las células positivamente seleccionadas se aislan, se clonan y se inyectan en blastocitos de ratón de 3.5 días de edad, como se describe por Bradley (1987, Production and Analysis of Chimaeric mice. In: E.J. Robertson (Ed. , Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practil approach. IRL Press, Oxford, pag. 113) . Entonces se introducen blastocitos en un animal hospedador hembra, y se monitorea hasta término completo el desarrollo de los embriones . De acuerdo a una alternativa, células positivamente seleccionadas del tipo ES se ponen en contacto con embriones de 2.5 días de edad en una etapa de 8 a 16 células (morulae) , como se describe por Wood et al. (1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. Vol. 90:4582-4585) o Nagy et al. (1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 90:8424-8428), las células ES que se internalizan para colonizar extensivamente el blastocito, incluyendo las células que dan la línea germen. Lo descandientes entonces se prueban para determinar aquellos que tienen integrado la construcción de polinucleótido (el transgen) . Un objeto de la invención de esta manera es un animal transgénico no humano cuyas células somáticas y/o germen se han transformado con un ácido nucleico o una construcción de polinucleótido de acuerdo a la invención. La invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes obtenidas a partir de un animal transgénico como se define anteriormente. Las líneas de células recombinantes que se originan de un animal transgénico de acuerdo a la invención se pueden establecer en cultivo a largo plazo iniciado de cualguier tejido de este animal transgénico, por ejemplo, al transfectar cultivos de células primarias con vectores que expresan los oncogenes tal como el antígeno T de SV40, como se describe, por ejemplo, por Chou (1989, Mol. Endocrinol. Vol. 3:1511-1514) y Schay ett al. (1991, Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1072 : 1-1) . La invención también se refiere a un método para detectar, in vivo, una molécula sustancia candidata que modifica la actividad de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención, que comprende: a) administrar la sustancia o molécula candidata a un animal transgénico como se describe anteriormente; b) detectar el nivel de expresión de un polinucleótido indicador de interés colocado bajo control de un ácido nucleico regulador; c) comparar los resultados obtenidos en b) con los resultados obtenidos en un animal transgénico que no ha recibido la molécula o sustancia candidata. La invención también se refiere a un equipo o paquete para detectar, in vivo, una molécula o sustancia candidata que modifica la actividad de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención, que comprende: a) un animal transgénico como se define anteriormente; b) opcionalmente, el medio para detectar el nivel de expresión del polinucleótido indicador de interés.

Composiciones y Compuestos Farmacéuticos La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas propuestas para prevenir o para tratar una deficiencia en el metabolismo del colesterol, tal como aterosclerosis, a manera de ejemplo, en el transporte de colesterol y en el transporte invertido de colesterol . Primeramente, un objeto de la invención también es una sustancia molécula candidata que modifica la actividad de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención. La invención también se refiere a una sustancia o molécula candidata - caracterizada en que incrementa la actividad de un ácido nucleico regulador, de acuerdo a la invención, y por ejemplo, de un ácido nucleico regulador que comprende las secuencias SEQ ID No . 1 y SEQ ID No . 3, una región que comprende la secuencia que varía de los nucleótidos -2228 a +108 de las secuencias SEQ ID No. 1, o una región que comprende el promotor o núcleo de los 200 pb próximos del promotor del gen ABC1) . Por ejemplo, esta sustancia o molécula que es capaz de modificar la actividad de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención se ha seleccionado de acuerdo a uno de los métodos de detección in vitro o in vivo definidos anteriormente. De esta manera, un individuo cuyo metabolismo de colesterol este afectado, por ejemplo, un individuo afectado por la enfermedad de Tangier, se trata al administrar a ese individuo una cantidad efectiva de un compuesto que modifica la actividad de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención. De esta manera, un paciente con una actividad débil del promotor ABC1 se puede tratar con una molécula o sustancia mencionada anteriormente para incrementar la actividad del promotor ABCl.

De manera alternativa, un paciente con una actividad anormalmente alta del promotor ABC1 se puede tratar con un compuesto que se capaz de disminuir o bloquear la actividad del promotor ABCl . Este compuesto puede ser un compuesto que modifica la interacción de al menos un factor de transición con el promotor ABCl o un elemento regulador de un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención. Por ejemplo, eí compuesto puede inhibir la interacción de uno de los factores de trascripción listados en la Tabla 1 con un ácido nucleico regulador de acuerdo a la invención. El compuesto también puede ser un compuesto que modifique la actividad de un factor en transición que se une al promotor ABC1, o de un elemento regulador presente en este último. Un compuesto de interés terapéutico de acuerdo a la invención también puede ser un compuesto que modifique la interacción de una primera factor de trascripción con un segundo factor de trascripción. Como se detalla en el análisis de los varios factores de trascripción que son capaces de la unión a la secuencia SEQ ID No. 3, algunos factores de trascripción son activos solos y se están asociados con otros factores de trascripción.

Un compuesto de interés terapéutico de acuerdo a la invención es por ejemplo elegido, de ácido nucleicos, péptidos y moléculas pequeñas. Por ejemplo, este compuesto puede ser un ácido nucleico antisentido que se una de manera específica a una región del promotor ABCl o a un elemento regulador de un ácido nucleico regulador de ABCl, que inhiba o disminuya la actividad del promotor. Este compuesto de interés terapéutico también puede ser un ácido nucleico antisentido que interactúa específicamente con un gen que codifica para un factor de trascripción que modifique la actividad del promotor ABCl, tal que la interacción del ácido nucleico antisentido con el gen que codifica para el factor de transición que se une al promotor ABC1 disminuye la producción de este factor de transición, da por resultado un incremento o una disminución en la actividad del promotor ABCl, de acuerdo a si el factor de transición se incrementa, o por el contrario, reduce la actividad del promotor ABCl. La toxicidad y la eficiencia terapéutica de los compuestos terapéuticos de acuerdo con la invención se puede determinar de acuerdo a protocolos farmacéuticos normales, en células en cultivo o en animales experimentales, por ejemplo, para determinar la dosis letal LD50 (es decir, la dosis que es letal para 50 % de la población probada) y la dosis efectiva ED50 (es decir, la dosis que es terapéuticamente efectiva en 50 % de la población probada) . Para todos los compuestos de interés terapéutico de acuerdo a la invención, la dosis terapéutica efectiva se puede estimar de manera inicial de las pruebas llevadas a cabo en cultivos celulares in vitro. Un objeto de la invención también son composiciones f rmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de una sustancia o molécula de interés terapéutico de acuerdo a la invención. Estas composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional, usando uno o más vectores fisiológicamente aceptables o excipientes. De esta manera, los compuestos de interés terapéuticos de acuerdo a la invención, así como sales y solvatos fisiológicamente aceptable de los mismos, se pueden formular para la administración por inyección o inhalación, o por administración oral, bucal, parenteral o rectal. Las técnicas para preparar composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención se pueden encontrar fácilmente por personas expertas en la técnica, por ejemplo, en el trabajo Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mead Publishing Co., Easton, PA EUA. Para una administración sistémica, se puede usar una inyección, incluyendo inyecciones intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. En este caso, las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención se pueden formular en la forma de soluciones líquidas, por ejemplo, en soluciones amortiguadores fisiológicamente compatibles.

Método para Detectar un Daño de la Trascripción del Gen ABCl Humano Un objeto de la invención también son métodos para determinar si un individuo presenta un riesgo de desarrollar una patología enlazada a una deficiencia en el metabolismo del colesterol, tal como aterosclerosis, por ejemplo, en el transporte de colesterol, y en el transporte invertido de colesterol, tal como un riesgo de desarrollar la enfermedad de Tangier. Estos métodos comprenden detectar, en las células que una muestra biológica, que se origina de un individuo que se va a probar, la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por un daño de la expresión en gen cuya expresión se regula para el promotor ABCl. A manera de ilustración, se pueden detectar estas alteraciones genéticas, a fin de determinar la existencia de una supresión de uno o más nucleótidos en la secuencia de un ácido nucleico regulador para ABC1 de las secuencias SEQ ID No. 1 y SEQ ID No . 2, de la adición de uno o más nucleótidos o de la sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencias SEQ ID No . l o SEQ ID No. 2. De acuerdo a una modalidad de un método para detectar un daño de la alteración del gen ABCl en un individuo, la alteración genética se identifica de acuerdo a un método que comprende secuenciar toda o parte de la secuencia SEQ ID No. 1 o alternativamente toda o parte de al menos la secuencia SEQ ID No. 2. Los cebadores de secuenciación se pueden construir a fin de hibridizar con una región dada de la secuencia SEQ ID No. 1. Estos cebadores de secuenciación se construyen, por ejemplo, para amplificar los fragmentos de aproximadamente 250 a aproximadamente 300 nucleótidos de la secuencia SEQ ID No. 1 o de una secuencia complementaria. Los fragmentos identificados, por ejemplo, por el método de PCR, entonces se secuencian, y la secuencia obtenida se compara con la secuencia de referencia SEQ ID No. 1 a fin de determinar si se encuentran una o más supresiones, adiciones o sustituciones de nucleótidos en la secuencia amplificada del ADN contenido en la muestra biológica que se origina del individuo probado. La invención de esta manera también se refiere a un método para detectar un daño de la trascripción del gen ABCl en un individuo, que comprende: a) secuenciar un fragmento de ácido nucleico que se puede amplificar con la ayuda de al menos un cebador de nucleótido que hibridiza con la secuencia SEQ ID No. l o SEQ ID No. 2 de acuerdo con la invención: b) alinear la secuencia obtenida en a) con la SEQ ID No. 1 o la SEQ ID No . 2. c) determinar la presencia de uno o más supresiones, adiciones o sustituciones de al menos un nucleótido en la secuencia del fragmento de ácido nucleico, con respecto a la secuencia de referencia SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2. Las sondas de oligonucleótidos que hibridizan con una región de la SEQ ID No . 1 a la SEQ ID No . 2 en la cual se ha determinado una alteración de la secuencia durante la implementación del método de detección descrito anteriormente también forman parte de la invención. De manera alternativa, las sondas de oligonucleótidos que hibridizan específicamente con una región que corresponde a la SEQ ID No. 1 o de la SEQ ID No. 2, para las cuales se han determinado una o más supresiones, adiciones o sustituciones de al menos un nucleótido, en un individuo, también forma parte de la invención. Estas sondas de oligonucleótidos constituyen un medio para detectar alteraciones en la secuencia reguladora para el gen ABCl y de esta manera también un medio para detectar una predisposición al desarrollar una patología desarrollada a una deficiencia del metabolismo del colesterol, tal como aterosclerosis o enfermedad de Tangier. Un objeto "de la invención de esta manera también se un equipo o paquete para detectar un daño de la trascripción del gen ABCl en un individuo, que comprende: a) uno o más cebadores que hibridizan con una región de las secuencia SEQ ID No. 1 o de la SEQ ID No. 2. b) opcionalmente, el medio requerido para llevar a cabo una reacción de amplificación. Un objeto de la invención también es un equipo o paquete para detectar un daño de la trascripción del gen ABCl en un individuo, que comprende: a) una o más sondas de oligonucleótidos como se define anteriormente; b) opcionalmente, los reactivos requeridos para llevar a cabo una reacción de hibridación. Los fragmentos de ácido nucleico derivados de cualquiera de las secuencias de nucleótidos SEQ ID No. 1 a 8 de esta manera son útiles para detectar la presencia de al menos una copia de una secuencia reguladora de nucleótidos para el gen ABCl o de un fragmento o de una variante (que contiene una mutación o un polimorfismo) de este último, en una muestra. Las sondas o cebadores de nucleótidos de acuerdo con la invención comprenden al menos 8 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico elegido del grupo qu consiste de las secuencias SEQ ID No. 1 a 8, o de un ácid nucleico de- secuencia complementaria. Por ejemplo, las sondas o cebadores de nucleótido de acuerdo con la invención, tendrán una longitud elegid entre 10, 12, 15, 18, 20 a 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200 500, 1000 o 1500 nucleótidos consecutivos de un ácid nucleico de acuerdo con la invención, tal como un ácid nucleico de la secuencia de nucleótidos elegida de la secuencias SEQ ID No . 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ I No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, y SEQ I No. 8. De manera alternativa, una sonda o cebador d nucleótidos de acuerdo a la invención consistirá y/ comprenderá los fragmentos de una longitud elegida de 12 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 y 150 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de acuerdo la invención, o un ácido nucleico elegido de las secuencia SEQ ID No. 1, SEQ ID No . 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No . 4, SE ID No. 5, SEQ ID No . 6, SEQ ID No . 7, y SEQ ID No . 8, o d un ácido nucleico de secuencia complementaria. La definición de una sonda y cebador de nucleótid -de acuerdo a la invención abarca de esta maner oligonucleótidos que hibridizan, bajo las condiciones d hibridación de alta severidad definidas anteriormente, co un ácido nucleico elegido de las secuencias SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No . 3, SEQ ID No . 4, SEQ ID No . 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No*. 7, y SEQ ID No . 8 o con una secuencia complementaria de estas secuencias. Los ejemplos de cebadores y pares de cebadores para amplificar varias regiones del gen ABC1 se representan posteriormente . Por ejemplo, el par de cebadores representado por el cebador de las SEQ ID No. 12: 5 ' -TTG CCG TCG ACT GTT TTG GGT AGT TT-3' y el cebador de la secuencia SEQ ID No. 13:5'-GCC CTG TCG ACC GGC TCT GTT GGT G-3 ' . Un cebador o sonda de nucleótido de acuerdo a la invención se puede preparar por cualquier método adecuado bien conocido por las personas expertas en la técnica, incluyendo por clonación y acción con enzimas de restricción, o por síntesis química directa de acuerdo a las técnicas tal como el método de fosfodiéster de Narang et al. (1979) o Brown et al. (1979), el método de dietílfosforamidita de Beaucage et al. (1980) o la técnica en un soporte sólido descrita en la patente de la Unión Europea No. EP 0 707 592. Cada uno de los ácidos nucleicos de acuerdo a la invención, incluyendo las sondas y cebadores de oligonucleótidos descritos anteriormente, se pueden marcar, si se desea, al incorporar una marca detectable, por medio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, inmunoquímico o químico. Por ejemplo, estas marcas pueden comprender isótopos radioactivos (32P, 33P, 3H, 35S) , moléculas fluorescentes (5-bromodesoxiuridina, fluoresceína, acetil-aminofluoreno, digoxigenina) o ligandos tal como biotina. El marcado de las sondas se lleva a cabo, por ejemplo, por incorporación de moléculas marcadas en los polinucleótidos por extensión con cebador, o por adición en los extremos 5 ' o 3 ' . Los ejemplos del marcado no radioactivo de fragmentos de ácido nucleico se describen, por ejemplo, en la Patente Francesa No. FR 78 109 75 o en los artículos de Urdea et al (1988) o Sánchez-pescador et al. (1988). De manera ventajosa, las sondas de acuerdo con la invención pueden tener propiedades estructurales de un tipo que permite una amplificación de la señal, tal como las sondas descritas por Urdea et al. (199), o en la patente Europea No. EP-0 225 807 (Chiron) . Las sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la invención se pueden usar, por ejemplo, en hibridaciones tipo Southern al ADN genómico. Las sondas de acuerdo con la invención también se pueden usar para detectar productos de amplificación por PCR o para detectar malapareamientos.

Las sondas o cebadores de nucleótidos de acuerdo con la invención se pueden inmovilizar en un soporte sólido. Estos soportes sólidos son bien conocidos por las personas expertas en la técnica, y comprenden superficies de las cavidades de placas de microtitulación, cuentas de poliestireno, cuentas magnéticas, bandas de microcelulosa o micropartículas tal como partículas de látex. En consecuencia, la presente invención también se refiere a un método para detectar la presencia de un ácido nucleico como se describe anteriormente en una muestra, el método que comprende : 1) poner en contacto una o más sondas de nucleótidos de acuerdo con la invención con la muestra que se va a probar; 2) detectar el complejo posiblemente formado entre la(s) sonda (s) y el ácido nucleico presente en la muestra. De acuerdo a una modalidad del método de detección de acuerdo a la invención, la(s) sonda (s) de oligonucleótido se inmoviliza (s) en un soporte. De acuerdo a otro aspecto, las sondas de oligonucleótidos comprenden una marca detectable. La invención también se refiere a un paquete o tipo para detectar la presencia de un ácido nucleico de acuerdo a la invención en una muestra, el paquete que comprende : a) una o más sondas de nucleótidos como se describe anteriormente; b) opcionalmente, los reactivos requeridos para la reacción de hibridación. De acuerdo a un primer aspecto, el paquete o equipo de detección se caracteriza en que la(s) sonda (s) se inmoviliza (n) en un soporte. De acuerdo a un segundo aspecto, el paquete de tipo de detección se caracteriza en que las sondas de oligonucleótidos comprenden una marca detectable. De acuerdo a una modalidad del equipo de detección descrito anteriormente, este equiipo comprenderá una pluralidad de sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la invención, que se pueden usar para detectar secuencias u objetivos de interés, o de manera alternativa para detectar mutaciones en las regiones de codificación o en las regiones de no codificación de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo, de los ácidos nucleicos de secuencias elegidas de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No . 5 o los ácidos nucleicos de secuencia complementaria. De esta manera, las sondas de acuerdo con la invención que se inmovilizan en el soporte y se pueden ordenar en matrices tal como "circuitos de ADN" . Estas matrices ordenadas se han descrito, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,143,854 y en las Solicitudes de PCT No. WO 90/15070 y 92/10092. Las matrices de soporte en las cuales se han inmovilizado las sondas de oligonucleótidos a una alta densidad se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,414,087 y en la Solicitud PCT No. WO 95/11995. Los cebadores de nucleótido de acuerdo con la invención, se pueden usar para amplificar cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, y por ejemplo, todo o partes de un ácido nucleico de las secuencias elegidas de SEQ ID No . 1, SEQ ID No . 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 5, o una variante de este ácido nucleico. Otro objeto de la invención se refiere a un método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo a la invención, y por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico elegida de SEQ ID No. 1, SEQ ID No . 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No . 4, y SEQ ID No. 5, o un fragmento o una variante de este ácido nucleico, contenida en una muestra, el método que comprende: a) poner en contacto la muestra, en la cual se sospecha la presencia del ácido nucleico objetivo, con un par de cebadores de nucleótidos, de los cuales la posición de hibridación se localiza respectivamente en el lado 5' y en el lado 3' de la región del ácido nucleico objetivo cuya amplificación se busca, en la presencia de reactivos requeridos para la reacción de amplificación; y b) detectar los ácidos nucleicos amplificados. Para implementar el método de amplificación como se describe anteriormente,_ se usará de manera ventajosa cualquiera de los cebadores nucleótidos descritos anteriormente . Un objeto de la invención también es un paquete de equipo para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con la invención, y por ejemplo, toda o parte de una secuencia de ácido nucleico elegida de SEQ ID No . 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No . 3 , SEQ ID No . 4 y SEQ ID No . 5 , un paquete o equipo que comprende : a) un par de cebadores de nucleótidos de acuerdo con la invención, la posición de hibridación de la cual se localiza respectivamente del lado 5 ' y en el lado 3 ' del ácido nucleico objetivo cuya amplificación se busca; b) opcionalmente, los reactivos requeridos para la reacción de amplificación. Este paquete o equipo de amplificación comprenderá de manera ventajosa al menos un par de cebadores de nucleótidos como se describe anteriormente. Los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.

Ejemplos Eiemplo 1: Distribución en tejido de transcriptos de gen ABCl de acuerdo a la invención El perfil de expresión de los polinucleótidos de acuerdo a la presente invención se determinó de acuerdo a los protocolos del análisis por transferencia Northern y de PCR acoplada a trascripción invertida, descritos por ejemplo en Sambrook et al (ref. CSH Sambrook, J. , Fritsch, E.F., y Maniatis, T- (1989) . "Molecular Cloting: A Laboratory Manual" 2n Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Prees, Cold Spring Harbor, NY.) . Por ejemplo, en el caso de un análisis por trascripción invertida, un par de cebadores que se han sintetizado a partir del ADNc de longitud completa del gen ABCl humano de la secuencia SEQ ID No. 10 se usó para detectar el ADNc correspondiente. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo en matrices de ADNc que corresponden al ARNm poliA" transcrito de manera invertida (Clontech) . La trascripción invertida en ADNc se llevó a cabo con la enzima Superscript II (GibcoBRL, Life Technologies) , de acuerdo a las condiciones descritas por el fabricante. La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo de acuerdo a las condiciones normales, en 20 µl de mezcla de reacción, con 25 ng de de la preparación de ADNc. La mezcla de reacción estaba compuesta de 400 µM de cada uno del los dNTP, de 2 unidades de ADN-polimerasa (Taq) Thermus aquaticus (Ampli Taq Gold; Perkin Elmer), de 0.5 µM de cada cebador, de MgCl2 2.5 mM y de amortiguador de PCR. 34 ciclos de PCR (desnaturalización durante 30 segundos a 94°C, hibridación de 30 segundos, rompimiento como sigue durante 34 ciclos: 64°C 2 ciclos, 61°C 2 ciclos, 58°C 2 ciclos y 55 °C 28 ciclos, y un alargamiento de un minuto por kilobase a 72 °C) se llevó a cabo después de una primera desnaturalización a 94 °C durante 10 minutos en una máquina de termociclador Perkin Elmer 9700. Las reacciones de PCR se visualizaron en geles de agarosa por electroforesis. Los fragmentos de ADNc obtenidos se pueden usar como sondas para un análisis de transferencia Northern y se pueden usar también para determinar exactamente la secuencia de polinucleótidos . En el caso de un análisis por transferencia de Northern, una sonda de ADNc producida como se describe anteriormente se marcó con 32P, usando el sistema de marcado de ADN de Alta Cebadura (Boehringer) , de acuerdo a las instrucciones indicadas por el fabricante. Después del marcado, la sonda se purificó en una microcolumna Sephadex G50 (Pharmacia) , de acuerdo a las instrucciones indicadas pro el fabricante. La sonda marcada y purificada entonces se usó para detectar la expresión de los ARNm en varios tejidos . La transferencia Northern que contuvo muestras de ARN de varios tejidos humanos (Múltiple Tissue Northern, MTN, Clontech) Transferencia 2, referencia 77759-1) se hibridizó con la sonda marcada. El protocolo que se siguió para las hibridaciones y lavados fue ya sea directamente aquel descrito por el fabricante (Manual de instrucciones PT1200-1) , o una adaptación de este protocolo usando los métodos que se conocen por las personas expertas en la técnica y que se describen, por ejemplo, en F. Ausubel et al. (1999). Por ejemplo, se pueden variar de esta manera las temperaturas de prehibridación y de hibridación en la presencia de formamida . Por ejemplo, se usó el siguiente protocolo: 1 - Competición en membrana y Prehibridación: Mezclar: 40 µl de ADN de esperma de salmón (10 mg/ml) + 40 µl de ADN de placenta de humano (10 mg/ml) Desnaturalizar durante 5 minutos a 96°C, luego sumergir la mezcla en hielo. - Remover el amortiguador 2X SSC y vertir 4 ml de mezcla de formamida en el tubo de hibridación que contiene ías membranas. Adicionar la mezcla de los dos AND desnaturalizados . - Incubación a 42 °C durante 5 a 6 horas, con rotación. 2 - Competición de sonda marcada: Adicionar 10 a 50 µl de ADN de Cot I a la sonda marcada y purificada, de acuerdo a la cantidad de las secuencias repetidas . Desnaturalizado de 7 a 10 minutos a 95°C Incubar a 65 °C durante 2 a 5 horas. 3 - Hibridación: Remover la mezcla de pre-hibridación. Mezclar 40 µl de ADN de esperma de salmón + 40 µl de ADN de placenta humana, desnaturalizar 5 minutos a 96°C, luego sumergir en hielo. Adicionar 4 ml de mezcla de formamida, la mezcla de los dos ADN y la sonda marcada desnaturalizada/ADN de Cot I al tubo de hibridación. Incubar durante 15 a 20 horas a 42°C, con rotación. 4 - Lavados : Un lavado a temperatura ambiente en 2X SSC para enjuagar. Dos veces 5 minutos a temperatura ambiente, 2X SSC y SDS al 0.1 %, a 65°C. Dos veces 15 minutos a 65 °C, IX SSC y SDS al 0.1 %, a 65°C. Después de la hibridación y lavado, se realizó la transferencia después de la exposición durante la noche en contacto con un detector de fósforo, que se reveló con ayuda de Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) .

Eiemplo 2: Análisis del perfil de la expresión génica para la enfermedad de Tangier La verificación del daño en el nivel de expresión del gen ABCl, que conduce al fenotipo celular de Tangier determinado por hibridación de estas secuencias con sondas que corresponden a los ARNm que se originan de los fibroblastos de individuos posiblemente que sufren de la enfermedad, de acuerdo a los métodos descritos a continuación: 1. Preparación de los ARN totales, .ARNm de poli (A) * y las sondas de ADNc Los ARN totales se obtuvieron de los cultivos celulares de los fibroblastos de individuos quienes estaban normales o que sufren de la enfermedad de Tangier, por el método de isotiocianato de guanidina (Chomczynki & Sacci, 1987). Los ARN m de poli (A) + se obtuvieron por cromatografía de afinidad en columnas de celulosa-oligo (dT) (Sambrook et al., 1989), y los ADNc usados como sondas se obtuvieron por RT-PCR (DeRisi et al., 1997) con oligonucleótidos que se marcaron con un producto fluorescente (Amersham Pharmacia Biotech; CyDye™) . 2. Hibridación y detección de niveles de expresión Las membranas de fibra de vidrio que contienen las secuencias de acuerdo a la presente invención que corresponden al gen de Tangier se hibridizaron con la sondas de ADNc, que se obtuvieron a partir de los fibroblastos (Lyer et al., 1999) . Usando el sistema de Amersham/Molecular Dynamics (Avalanche Microscanner*) permitió la cuantificación de las expresiones de los productos de la secuencia en el tipo celular saludable o afectado.

Eiemplo 3: Uso de macrófagos de THP-1 que expresan IL-lbeta para detectar moléculas que activan o inhiben la expresión del gen ABC-1 El principio de este ensayo es que cualquier sustancia que modifica la actividad de síntesis de la proteína ABCl tiene repercusiones en la síntesis IL-lbeta. a) Las células de macrófagos de las líneas THP-1, que son células - de leucemia monocítica humana, son un modelo de macrófagos diferenciados. Estas células se cultivaron en un medio RPMI 1640 complementado con 10 % de suero de becerro fetal, en placas de varias cavidades, a una densidad de 2105 células por cavidades. b) Para el ensayo per se, las células entonces se lavaron y colocaron en un medio RPMI 1640 que contiene 1 mg/ml de la fracción IV de albúmina humana purificada. c) Los productos se adicionaron en el medio extracelular. De manera simultánea, las células entonces se activaron por la adición de lipopolisacáridos (LPS) durante 3 horas, a 1 µg/mol seguido por una incubación de 30 minutos en la presencia de ATP a 5 mmol/L. d) Las concentraciones de IL-lbeta y de IL-lalfa de control, el factor alfa de necrosis de tumor (TNF-alfa) y de IL-6 se determinaron con los equipos de ELISA, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (R&D System; human IL-lbeta Chemiluminescent ELISA referencia QLB00) . Las variaciones en el ARN de IL-lbeta, que no se suponía que estuvieran afectadas, se evaluaron por la técnica de transferencia Northern, usando la sonda correspondiente. Eiemplo 4: Expresión de un gen de interés bajo el control "del ácido nucleico regulador para el gen ABCl humano de acuerdo a la invención 4.1 Materiales y Métodos 4.1.1 Construcción ríe plásmido de expresión que contiene un ácido nucleico regulador para el gen ABCl humano La región del ácido regulador para el gen ABCl humano que varía desde el nucleótido en la posición -995 hasta el nucleótido en la posición +120, con respecto al sitio de inicio de trascripción, se amplificó por la técnica de PCR, con la ayuda de los siguientes pares de cebadores: cebador directo S995 (SEQ ID No. 12), de secuencia 5' -TTG CCG TCG ACT GTT TTG GGT AGT TT-3 ' ; y cebador invertido +220R (SEQ ID No. 13), de secuencia 5 ' -GCC CTG TCG ACC GGC TCT GTT GGT-3; Del ADN genómico, humano presente en un vector BAC de una colección de vectores BAC humanos . El fragmento de ADN amplificado se digirió con la endonucleasa de restricción Sal 1, y luego se insertó en el vector PXP1 descrito por Nordeen et al. (1988, BioTechniques, 6: 454-457), en el sitio de restricción Sal 1 de este vector. El inserto entonces se secuenció. 4.1.2. Cultivo y transfección celular Se cultivaron células de la línea Hepa-1-6 (ATCC, Rockville, MD, EUA) en el medio y E-MEM (Medio Esencial Mínimo con Sales de Earle) , al cual se adicionó 10 % (v/v) de suero de becerro fetal (Biowhittaker, Walkersville, MD) . Se distribuyeron aproximadamente 1.5 x 105 células en cada una de las cavidades de una placa de cultivo de 12 cavidades (2.5 cm) y se cultivaron hasta aproximadamente 50 a 70 % de confluencia, y luego se co-trasformaron con 1 µg del plásmido Sal-Lucif y 0.5 µg del vector de control pBetagel (Clone Tech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, EUA) usando el paquete Superfectin Reagent Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) . Dos horas después de la adición del ADN, el medio de cultivo se removió y se remplazó con el medio AMEM completo (Modificación Alfa de Eagle del Medio Esencial Mínimo) . Después de una duración de veinte horas, las células se colocaron en medio fresco tal como DMEM (Medio Esencial Mínimo de Dulbecco) , al cual se adicionaron 2 µg/Ml de glutamina, 100 unidades/ml de estreptomicina y 0.1 % de albúmina de suero bovino (BSA, Fracción V) , en la presencia o ausencia de 50 µg/ml de colesterol (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, MO, EUA) . Las células se recuperaron 16 horas después del cambio final del medio usando una solución de lisis del paquete Tropix Luciferase Assay Kit (Tropix Inc. , Bedford, MA, EUA) . El lisado celular se dividió en fracciones de alícuota que se almacenaron a -70°C.

Se usaron fracciones de alícuota descongeladas recientemente para cuantificar las proteínas, usando el paquete MicroBCA Kit (Pierce, Rockford, IL, EUA) , así como para cuantificar la producción de luciferasa y beta-galactosidasa, usando, respectivamente, los paquetes Tropix Luciferasa Assay Kit y Galacto-Light Plus Kit. Los ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante . 4.2 Resultados Los resultados se representan en la Tabla 2 a continuación: Tabla 2 : Producción de luciferasa por las células transfectadas con un vector que contiene el gen de luciferasa colocado bajo el control de un ácido nucleico regulador para el gen ABCl humano de acuerdo a la invención, en la presencia o ausencia de colesterol .

Los resultados anteriores muestran la capacidad de un ácido regulador para el gen ABCl humano de acuerdo a la invención para dirigir la expresión de una secuencia de codificación colocada bajo su control. Además, el ácido nucleico regulador usado, que abarca desde el nucleótido en la posición -995 al nucleótido en la posición +120, con respecto al sitio de inicio de trascripción, y que contiene todos los sitios PPAR identificados, se reguló por colesterol.

Eiemplo 5: Caracterización de las porciones de unión al factor de trascripción en el promotor del gen ABCl humano próximo . 5.1 Materiales y Métodos 5.1.1 Construcción de plásmidos indicadores para el ensayo de Luciferasa Se construyeron plásmidos que contienen los fragmentos SPI, API, E-secuencia, LXR y E-secuencia suprimido por mutagénesis dirigida al sitio usando el método de PCR de traslape y la construcción (Previato et al., JBC, 1991, 266:18958-63) como plantilla. Los cebadores listados posteriormente se usaron para amplificar -200 a +44 pb del promotor ABCl humano. Las letras mayúsculas representan la secuencia tipo silvestre en tanto que las letras minúsculas representan la secuencia mutante.

MDistante SPIF (SEQ ID No: 14) 5 ' TCGCCmTT--mgGcttgGGcgCC^^ MDistante SP1R 5 ' GAGCCCGGGc-gCCcagCcT-AAAsGGGG3A3 ' MPrcocimo SPIF: (SEQ ID No: 15) 5 • CAGA-3GCCGGGA-gGcttgGGcgGGAGGGA3 ' MPr?ximo SP1R: 5 ' TCCCTCCcgCCcaagCcTCCa--K-XX_TCIO3 ' MAP1F: (SEQ ID No: 16) 5 ' -m-rriTC- GCTC?G^ ' MAP1R: 5 'GTAGTICgcatcC-TC-AGCAFAAAGCACG3 ' DEsecuenciaF: (SEQ ID No: 18) 5 'GCCTCC rTCTGCTGAGTGACTGM DEsecuenciaR: 5 'GA?AGGAGCa3GGGCCOGCCCCA3 ' MLXRF: (SEQ ID No: 19) 5 ' C -TCGtgtGATAGTAAAActaCT-GCGC-^^ ML RR 5 ' TGCACCGAGa -AGtagTTACTATCacaCAAAG S224-HindIII: (SEQ ID No: 20) 5 '-ACTCCC--AAGC pGTCGTGG3 ' 44-HindIII: 5 < GM? QCr?P3G£K333( JIG3 < S224-HindIII y 44-HindIII fueron los cebadores en la dirección 5' y en la dirección 3' usados para la PCR de translape. Los sitios HindIII están subrayados. Los fragmentos resultantes que abarcan -200 -a +44 del gen ABCl humano se ligaron en el sitio HindIII, del plásmido indicador de PXPl-lucif erasa (Nordeen et al., Biotechniques, 1988, 6:454-457) . Todas las construcciones se confirmaron por secuenciacion. .1.2. Cultivo y transfección celular Células RAW 264.7, de macrófagos murinos y células 293 de riñon embriónico humano (American Type Culture Collection, Rockville, MD) se cultivaron en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero de becerro fetal al 10 % (FCS) . Se colocaron en placa aproximadamente 1.5 x 10s células en placas de 12 cavidades (Costar, Corning, NY) , se cultivó a 50-70 % de confluencia y se cotransfectaron con 1.5 µg del plásmido de promotor ABC1-luciferasa y 0.5 µg del vector de ß-galactosidasa (pCMVß : Clontech, Palo Alto, CA) al usar el Equipo de Reactivo de Superpectina (Qiagen, Valencia, CA) . Tres horas después de la adición del ADN, las células se volvieron alimentar con medio fresco que contiene FCS al 10 %. Dieciséis horas más tarde, las células se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y se volvieron alimentar con DMEM que contiene albúmina de suero bovino al 0.1 % (BSA) y ya sea 50 µg/ml de colesterol, 2 µg/ml de 22- (R) -hidroxicolesterol (22 (R) -Hch) , ácido 9-cis-retinoico lOµM (9CRA) , estradiol 10-100 nM (Sigma, St . Louis, Mo) , Insulina regular 10-100 nM (Sigma) o etanol al 0.1 % durante 24 horas. Después de la recolección, se usaron 10 µl de extracto celular para los ensayos de luciferasa y ß- galactosidasa al usar el sistema de ensayo de luciferasa dual de Promega (Promega, Madison, Wl) o los equipos Tropix Galacto-Líght Plus "Kits, respectivamente (Tropix, Bedford MA) . La relación de la actividad de luciferasa en unidades de luz relativa se dividió por la actividad de ß-galactosidasa para dar un valor de luciferasa normalizado. .1.3 Ensayo de Desplazamiento de Movilidad en Gel Tres fragmentos del promotor ABCl humano de doble hebra (Fragmento A que abarca -171 a -71 pb; Fragmento EB que abarca -156 a -130 pb y Fragmento EB que abarca a -156 a 130pb) se marcaron en extremo con a32P-ATP usando T4-polinucleótido-cinasa (Lofstrand, Gaithersburg MD) . Los extractos nucleares se aislaron de las células RAW 264.7 no estimulada y la célula HepG2 así como de las células RAW 264.7 después de la estimulación con las mismas concentraciones de colesterol y 22 (R) -Hch mostrado anteriormente (Paragon Bioservices Inc. Baltimore, MD) . Un ng (10,000 cpm) de sonda radiomarcada se adicionó a 2.5 µg de extracto nuclear en 20 µl de amortiguador de desplazamiento en gel TRIS 20 mM (pH 7.9) que contiene KCl 60mM, EDTA, 0.2mM, DTT 0.5mM, PMS 0.25mM, MgCl 1.3mM, glicerol al 10 %, Ficoll al 3 % y 3 µg de poli (dldC) de doble hebra como se describe (Previato et al . , J Biol Chem, 1991, 266:18958-18963) y se incubó durante 10 minutos en hielo seguido por 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla incubada se cargó en un gel de poliacrilamida al 6 % en amortiguador TBE- 0.25 x y se sometió a electroforesis a 100 V durante 90 minutos seguido por autoradiografía. Para los ensayos de competición, se preincubaron extractos nucleares durante 10 minutos en hielo en una mezcla de reacción de 20 µl en la presencia o ausencia de un exceso de 100-200 veces de los competidores de ADN de doble hebra para Spl (-173 a -155 pb) , API (-135 a -155- pb) , LXR (-54 a -69 pb) y E-secuencia) -158 a -136 bp) para los ensayos de superdesplazamiento, los extractos nucleares se preincubaron con anticuerpos contra diferentes proteínas de unión de E-secuencia incluyendo Madl, Mad2 , Mad3 , Max, c-Myc, MyoD, USFl y USF2 así como Spl, c-Fos, c-Jun, JunB y JunD (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) en hielo durante 30 minutos antes de la adición de la sonda. .1.4. Ensayo de protección de ADNsa I o DNasa I Se digirió el fragmento A marcado en el extremo con AspHI . El fragmento de 94pb se purificó en gel de un gel de TBE de acrilamida al 10 % (Novex) y se adicionó a 14 µl de extracto nuclear de células RAW (5.2 µg/µl de proteína) en amortiguador de desplazamiento de gel (Ejemplo 5.1.3) y se incubó en hielo durante 10 minutos. Un µl de sonda (10,000 emp) se adicionó en la mezcla, se incubó en hielo durante otros 10 minutos. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se adicionaron 20 µl del amortiguador de digestión DNasa ? (Tris-HCl 10 M pH 8.0 , CaCl2 5 mM, MgCl2 5. OmM) , entonces 15 segundos más tarde se adicionó DNasa I y se incubó durante 1 minuto, 45 segundos. El amortiguador de detención de DNasa I (Tris-HCl -10 mM, pH 8.0, acetato de sodio 0.6 M pH 7.0, SDS al 0.5 %, EDTA 100 mM) entonces se adicionó. Se adicionaron 2.0 µl de proteasa K a 20 mg/ml y las muestras se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Se adicionaron 10 µl de NaOAc 3M y 4.0 µl de ARNt (10 mg/ml) . Las muestras se extrajeron con fenol/cloroformo y la fase acuosa se precipitó en 2.5 volúmenes de etanol al 100 %. Después de un lavado con etanol al 70 %, los sedimentos se disolvieron en amortiguador de carga de gel de secuenciación, se calentaron y corrieron en un gel de secuenciación al 8 %. Se adicionó el ADN desnudo con DNasa I como se describe anteriormente, excepto que la adición del extracto nuclear y el tratamiento con Proteasa K se omitieron. Se realizó la secuenciación de Maxam-Gilbert como se describe en Current Protocols in Molecular Biology /Aubusel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, 1994, 2: 12.1-12.11) . .1.5 Análisis Western Extractos nucleares de células RAW (35 µg de proteína por senda) de células estimuladas con colesterol o 22-R-hidroxicolesterol se cargaron en geles de gradiente 4-12 % de NuPage Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se corrieron de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon-P PVDF (Millipore Corp, Bedford, MA) . Los anticuerpos (concentrado 2 mg/ml) fueron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) y se usaron de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Se usó el anticuerpo C20X Anti-USFl (Número de catálogo sc-229X) a una dilución de 1/600 y se usaron los anticuerpos C20X (número de catálogo sc862X) y N18X (número de catalogo sc861X) anti-USF a una dilución de 1/100. .2.1 Análisis de porciones de unión en el promotor del gen ABCl humano , próximo Para investigar el papel de algunas de las porciones de unión del factor de trascripción, descritas anteriormente, en esta región del promotor del gen ABCl humano, es decir, Spl (-100 y -166 bp) , API (-131 bp) , LXR (-69bp) y E-secuencia (-147bp), se han generado de acuerdo al ejemplo 5.1.1 construcciones de indicador de luciferasa bajo el control del promotor ABC de -200 pb, ya sea tipo silvestre (p200-L) o mutado. La Figura 2A muestra las ubicaciones de las mutaciones puntuales introducidas en la región promotora de -200 pb del gen ABCl humano.

El efecto de estas mutaciones puntuales en la actividad transcripcional del gen ABCl humano en células RAW no estimuladas se ilustra en la Figura 2B. La mutación del sitio Spl distante, el sitio API y los sitios Spl próximos tuvieron sólo un efecto menor en la actividad del promotor. En contraste, la mutación de E-secuencia provocó un incremento fuerte y significativo en la actividad del promotor y la mutación del elemento LXR provocó una fuerte y significativa disminución en la actividad del promotor. Estos resultados son consistentes con la unión de un represor transcripcional a la E-secuencia ABCl humana y la unión de un activador transcripcional al elemento LXR. .2.2 Mutación del elemento LXR reduce trascripción del gen a hABCl La Figura 3 muestra que el elemento LXR está implicado como la porción del promotor ABCl humano sensible a oxiesteroles . La mutación del elemento LXR en - 69 pb provocó una significativa disminución en la trascripción para células no estimuladas así como para las células estimuladas por ácido cis-retinoico (CRA) y 22 (R) -hidroxicolesterol (220H) . La mutación del elemento LXR también provocó una disminución significativa en la trascripción para células estimuladas por colesterol, presumiblemente debido a la conversión intracelular de colesterol a oxiesteroles. De esta manera, el elemento LXR media la respuesta a colesterol así como a ácido cis-retinoico y a hidroxiesteroles . -2.3 Mutación de la E-secuencia incrementa la trascripción del gen ABCl humano La Figura 4 demuestra que la mutación o supresión de la porción de E-secuencia incrementa la trascripción del gen ABCl humano en células RAW no estimuladas por aproximadamente 3 veces y también en células RAW estimuladas con colesterol (c) , ácido cis-retinoico (CRA) y oxiesterol (22OH) por hasta 40 veces. Además, la mutación o supresión de la E-secuencia en el promotor ABCl humano, próximo no tiene efecto en el efecto estimulador de ya sea CRA u oxiesteroles. Hallazgos similares se demostraron para células 293 de riñon, embrionales, humanas, estimuladas y no estimuladas. Estos resultados indican que la activación mediada por LXR de la trascripción del gen ABCl por CRA y oxiesteroles no requiere una porción intacta de E-secuencia y es consistente con la unión de un represor transcripcional a la E-secuencia en el gen ABCl humano. .2.4 Factores de trascripción nucleares unen la E-secuencia en el promotor del gen ABCl humano El análisis de impronta de DNasa I del promotor próximo ABCl reveló protección de la E-secuencia en la presencia de extractos nucleares de la RAW (Figura 5) indicativo de -una- unión de proteína a esta región. Consistente con la carencia de efectos trascripcionales observados al mutar independientemente las porciones API y Spl (Figura 2B) , no fue evidente por el análisis de impronta la protección de estos sitios potenciales de unión en el promotor ABCl humano (Figura 5) . Para demostrar adicionalmente la unión de los factores de trascripción nucleares a la porción de E-secuencia se realizó el análisis de desplazamiento en gel del promotor ABCl humano (Figura 6) . La sonda utilizada en la Figura 6B (izquierda) fue un fragmento de doble hebra de 100 pb que abarca -171 hasta -71 del promotor ABCl (designado Fragmento A) . La incubación de la sonda radiomarcada con extracto nuclear aislado de células RAW no estimuladas dio por resultado un desplazamiento en gel (Figura 6B) . El desplazamiento se abolió cuando se usaron como competidores ya sea el fragmento A no marcado (A) o un oligonucleótido de doble hebra que abarca la E-secuencia (EB) . La competición con el fragmento de 27 pb que codifica para la E-secuencia mezclada (EBM) no abolió la banda de desplazamiento en gel . La competición por los fragmentos de ADN de doble hebra que abarcan cualquiera de las porciones Spl próxima o distante o los sitios de unión API no abolió la banda de desplazamiento en gel. Se observaron resultados similares cuando se utilizaron extractos nucleares de células 293 no estimuladas. También se realizó el análisis de desplazamiento en gel del promotor ABC1 humano usando ya sea una sonda de doble hebra de 27 pb que abarca la E-secuencia (Figura 6A; Fragmento EB; panel derecho) o una sonda alternativa que contiene una secuencia de E-secuencia mutante, mezclada como se describe anteriormente (Fragmento EBm) . La incubación de la sonda de E-secuencia tipo silvestre con extracto nuclear de células RAW no estimuladas dio por resultado un desplazamiento en gel, indicando la unión de una proteína a esta sonda (Figura 6B; panel intermedio) . La adición del competidor tipo silvestre no marcado (EB) eliminó la unión. En contraste, la competición con el fragmento de E-secuencia mutante (EBm) no afectó de manera significativa la unión a la E-secuencia tipo silvestre. Además, usando el mutante E-secuencia como una sonda objetivo para la unión de extractos nucleares celulares no dio por resultado la formación de una banda de desplazamiento en gel (Figura 6B; panel derecho) . Esto demuestra claramente la unión específica de una proteína a la porción de E-secuencia tipo silvestre del gen ABCl humano . .2.5 USF se une a la E-secuencia en el promotor de gen hABCl En el promotor ABCl humano, la E-secuencia se flanquea por dos C, que conduce a una secuencia de CCACGTGC. Este es un apareamiento perfecto a la porción de consenso para el factor de trascripción USF. Para establecer que USF es en realidad del factor de trascripción que se une a la E-secuencia en el promotor del gen hABCl, se realizó un análisis de desplazamiento en gel utilizando anticuerpos específicos a USF (Figura 6C) . Usando el fragmento de 100 pb como una sonda (Figura 6C, panel izquierdo) , demostró que la E-secuencia desplazó en gel algo de proteína en el extracto nuclear de células RAW. La adición de anticuerpos anti-USF contra ya sea el término amino (N) o carboxi (C) de USFl o USF2 provocó un superdesplazamiento de la sonda desplazada en gel, confirmando la identidad de las proteínas de unión a E-secuencia como USFl y USF2. Los anticuerpos contra otras proteínas de unión a E-secuencia incluyendo Madl, Mad2 , Max, c-Myc, y MyoD así como Spl, c-Jun, JunB y JunD no compiten o superdesplazan la banda de desplazamiento en gel de la proteína de ADN. Se obtuvieron resultados similares al pre-incubar el fragmento de doble hebra de 27 pb que abarca la E-secuencia (EB) con anticuerpos anti-USF (Figura 6C; panel derecho) . Como con el fragmento de desplazamiento en gel de 100 pb, los anticuerpos específicos a otros miembros de la familia de hélice-asa-hélice de factores de trascripción conocidos que se unen a la porción de E-secuencia no alteran la banda de desplazamiento en gel obtenida con la sonda de EB de 27 pb. No se han mostrado diferencias en los patrones de la banda de transferencia en gel obtenidos cuando extractos nucleares aislados de las células RAW no estimuladas y RAW estimuladas con colesterol u oxiesteroles se incubaron con la sonda de EB. Estos datos combinados identifican USFl u USF2 como los factores de trascripción que se unen a la E-secuencia en el promotor ABC1 próximo e indica que su unión no se modula por activadores conocidos de la expresión del gen ABC1. .2.6 USF y USF2 se expresan en células RAW La presencia de USF en extractos nucleares de células RAW se estableció al realizar análisis de hibridación por transferencia Western utilizando anticuerpos específicos para USFl (N- y C- términos) y USF2 (N- y C-términos) . Dos bandas inmunorreactivas principales de aproximadamente 43 y 44 KDa de tamaño se identificaron cuya expresión en las células RAW no se alteró por la estimulación con colesterol u oxiesteroles. De manera importante, la expresión de la isoforma mini-USF de 18 kDa que carece del dominio de activación transcripcional del término carboxi (Liu et al., 22:427-433) no se detectó en ya sea las células RAW- no estimuladas o células RAW incubadas durante 24 horas con colesterol u oxiesteroles. Todos los artículos, patentes y solicitudes de patente mencionadas en este especificación se incorporan en la presente como referencia.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende un polinucleótido que tiene al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1", o un ácido nucleico aislado de secuencia complementaria.
2. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un polinucleótido que tiene al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 2, o un ácido nucleico aislado de secuencia complementaria.
3. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un polinucleótido que tiene al menos 20 nucleótidos consecutivos dé la secuencia SEQ ID No. 3, o un ácido nucleico aislado de secuencia complementaria.
4. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un polinucleótido que tiene- al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEQ ID No. 4, o un ácido nucleico aislado de secuencia complementaria.
5. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un polinucleótido que tiene al menos 20 nucleótidos consecutivos de la - secuencia SEQ ID No . 5, o un ácido nucleico aislado de secuencia complementaria.
6. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico modifica la trascripción de un polinucleótido colocado bajo su control .
7. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido nucleico aislado es un polinucleótido que comprende una secuencia que varía del nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -200, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No . 1.
8. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido nucleico aislado es un polinucleótido que comprende una secuencia que varía del nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -300, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
9. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía del nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -600, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia- de -nucleótidos SEQ ID No. 1.
10. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -2894, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No . 1.
11. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición +120 al nucleótido en la posición -995, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
12. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición +108 al nucleótido en la posición -2228, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No . 1.
13. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido nucleico aislado activa la trascripción de un polinucleótido de interés colocado bajo su control.
14. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido nucleico aislado inhibe - la -trascripción de un polinucleótido de interés colocado bajo su control.
15. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene al menos 80 % de identidad de nucleótidos con un ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 1.
16. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el ácido nucleico aislado modifica la trascripción de un polinucleótido colocado bajo su control.
17. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el ácido nucleico aislado es un polinucleótido que comprende una secuencia que varía desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -300, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
18. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -600, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
19. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en- la posición -200, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
20. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -2894, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No . 1.
21. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición +120 al nucleótido en la posición -995, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
22. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición +108 al nucleótido en la posición -2228, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
23. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque hibridiza bajo condiciones de hibridación de alta severidad, con un ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 1.
24. Un ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el ácido nucleico aislado modifica la trascripción de un polinucleótido colocado bajo su control.
25. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico aislado es un polinucleótido que comprende la secuencia que varía del nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -300, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
26. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico aislado es un polinucleótido que comprende una secuencia que varía desde nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -200, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No . 1.
27. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindica?ión 24, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -600, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
28. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación -24, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición -1 al nucleótido en la posición -2894, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
29. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición +120 al nucleótido en la posición -995, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
30. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende un polinucleótido que varía desde el nucleótido en la posición +108 al nucleótido en la posición -2228, con respecto al primer nucleótido transcrito, que se localiza en la posición 2894 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1.
31. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico aislado activa la trascripción de un polinucleótido de interés colocado bajo su control.
32. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico aislado inhibe la trascripción de un polinucleótido de interés colocado bajo su control.
33. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende el ácido nucleico aislado de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 32, que comprende además un polinucleótido que codifica por al menos un compuesto elegido del polipéptido de interés y ácidos nucleicos de interés .
34. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para al menos un compuesto para al menos un ácido nucleico de interés elegido de oligonucleótidos homosentido y oligonucleótidos antisentido.
35. Un vector recombinante, caracterizado porque comprende un al menos un ácido nucleico aislado de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 34.
36. Un vector recombinante de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el vector se elige de un vector de clonación recombinante y un vector de expresión recombinante.
37. Una célula hospedadora, caracterizada porque está transformada con al menos un ácido nucleico aislado de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 34. -
38. Una célula hospedadora, caracterizada porque está transformada con un vector recombinante de acuerdo a la reivindicación 35.
39. Un mamífero transgénico no humano, caracterizado porque- al menos una de las células de mamífero elegida de las células somáticas y sus células germen se ha transformado con al menos un ácido nucleico aislado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 34.
40. Un mamífero transgénico no humano, caracterizado porgue al menos una de las células de mamífero elegidas de células somáticas y células germen se ha transformado con un vector recombinante de acuerdo a la reivindicación 35.
41. Un método para detectar una sustancia o una molécula que modifica la trascripción del polinucleótido que es un constituyente del ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque comprende: a) cultivar una célula huésped transformada de acuerdo a una de las reivindicaciones 37 y 38; b) incubar las células huésped transformada en la presencia de la sustancia o molécula candidata; c) detectar la expresión de un polinucleótido de interés; d) comparar los resultados de detección obtenidos en c) con los resultados de detección obtenidos al cultivar la células hospedadora transformada en ausencia de la molécula o sustancia candidata.
42. Un equipo para detectar, in vitro, una molécula o sustancia candidata que modifica la expresión del polipéptido de interés que es un constituyente del ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque comprende: a) una célula hospedadora transformada de acuerdo a una de las reivindicaciones 37 y 38; b) opcionalmente el medio requerido para detectar la detección del polinucleótido de interés es un constituyente del ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 30.
43. Un método para detectar, in vivo, una sustancia o molécula que modifica la trascripción de un polinucleótido de interés que es un constituyente del ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque comprende: a) administrar la sustancia o molécula a un mamífero transgénico no humano de acuerdo a una de las reivindicaciones 39 a 40; b) detectar la expresión del polinucleótido de interés en el mamífero transgénico como se trata en a) : c) comparar los resultados de detección en b) con los resultados observados en un mamífero transgénico no humano de acuerdo a una de las reivindicaciones 39 y 40 que no ha recibido la administración de la sustancia o molécula o candidata.
44. Un equipo o paquete para detectar, in vivo, al menos una molécula o sustancia candidata que modifica la trascripción del polinucleótido de interés que es un constituyente del ácido nucleico aislado de acuerdo a una de las reivindicaciones 1, 15 y 23, caracterizado porque comprende : a) un mamífero transgénico no humano de acuerdo a una de las reivindicaciones 39 y 40; b) opcionalmente, el medio requerido para detectar la trascripción del polinucleótido de interés.
45. Una sustancia, caracterizada porque modifica la trascripción de un polinucleótido de interés que es un constituyente del ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 33.
46. La sustancia de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la sustancia comprende al menos una molécula que modifica la trascripción de un polinucleótido de interés que es un constituyente del ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 33.
47. La sustancia de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la sustancia se selecciona de acuerdo al método de la reivindicación 41, o el método de la reivindicación 43.
48. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende, como principio activo, al menos una sustancia de una- molécula de acuerdo a una de las reivindicaciones 45 a 47.
49. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 48, caracterizada porque la composición se usa para tratar un trastorno elegido de hipercolesterolemia y aterosclerosis.
50. Una sustancia de conformidad con una de las reivindicaciones 45 a 47, caracterizada porque es un principio activo de un producto medicinal .
51. Un método para detectar un daño de la trascripción del gen ABCl en un individuo, caracterizado porque comprende : a) extraer el ARN mensajero total de un material biológico que se origina del individuo que se va a probar. b) cuantificar el ARN mensajero de ABCl presente en el material biológico; c) comparar la cantidad del ARN mensajero de ABCl obtenido en b) con la cantidad del ARN mensajero de ABCl hospedado en un individuo normal .
52. Un método para detectar un daño de la trascripción del gen ABCl en un individuo, caracterizado porgue comprende : a) secuenciar, iniciando con un material biológico que se origina del individuo, un polinucleótido localizado en la dirección 5 ' del sitio de inicio de trascripción del gen-ABCl; b) alinear la secuencia de nucleótidos obtenida en a) con la secuencia SEQ ID No. 1; c) determinar las diferencias de nucleótidos entre el polinucleótido secuenciado que se origina del material biológico del individuo que se va probar en la secuencia de referencia SEQ ID No. 1.
53. Un equipo para detectar un daño de la trascripción del gen ABC1 en un individuo, caracterizado porque comprende el medio requerido para cuantificar el ARN mensajero de ABCl en un material biológico que se origina del individuo .
54. Un equipo para detectar un daño de la trascripción del gen ABCl en un individuo, caracterizado porque comprende el medio requerido para secuenciar un polinucleótido localizado en la dirección 5 ' del sitio de inicio de trascripción del gen ABCl en el individuo.
55. Un método para detectar una molécula o sustancia que modifica la trascripción del polinucleótido de interés que es un constituyente de un ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque comprende : a) incubar al menos un ácido nucleico aislado de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 34, o un vector recombinante de acuerdo a la reivindicación 35, con una molécula o sustancia- candidata que se va a probar; b) detectar el complejo formado entre la molécula o sustancia candidata y la molécula o sustancia candidata.
56. Un equipo o paquete para detectar una molécula o sustancia candidata que modifica la trascripción del polinucleótido de interés que es un constituyente del ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque comprende: a) al menos un ácido nucleico aislado de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 34 o un vector recombinante de acuerdo a la reivindicación 35; b) opcionalmente, el medio requerido para detectar el complejo formado entre la molécula o sustancia candidata y el ácido nucleico aislado.