FR2782167A1 - Procede de classification de patients atteints de schizophrenie et identification d'une cible therapeutique potentielle pour cette maladie - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de classification de patients atteints de schizophrénie comprenant : - l'analyse un extrait protéique préparé à partir d'au rnoins une lignée de cellules lymphoblastoïdes desdits patients, par western blot avec un anticorps monoclonal, et - la sélection desdits patients pour lesquels l'analyse a révélé l'existence d'une protéine acide de 52 à 57 kDa qui présente une expression de polyglutamines.

Description

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L'invention a pour objet un procédé de classification de patients atteints de schizophrénie et l'identification d'une cible thérapeutique potentielle pour cette maladie.

La schizophrénie est une pathologie multifactorielle d'origine complexe probablement à la fois environnementale et polygénique. Jusqu'à présent, la mise en évidence de cette pathologie chez un patient n'est possible qu'à l'issue d'un examen clinique de ce dernier, c'est-àdire au moyen des symptômes qu'il présente. Cependant, le diagnostic de la schizophrénie est délicat et comprend toujours une part d'incertitude, il peut en effet n'être confirmé que des années plus tard.

Les inventeurs se sont donc attachés à mettre en évidence l'un des maillons impliqués dans les bases moléculaires de cette maladie.

L'expansion de polyglutamines dans les protéines (EPG ou PGE en anglais pour Polyglutamine expansion) codée par une expansion de triplets répétés CAG est à la base de huit maladies neurodégénératives héréditaires parmi lesquelles l'atrophie musculaire spino-bulbaire, l'ataxie spino-cérébelleuse 1 (ASC 1), l'ASC 2, l'ASC 3, l'ASC 6, l'ASC 7, l'atrophie dentorubrique-pallidoluysienne, et la chorée de Huntington (CH ou Hd en anglais pour Huntington's disease) (1,2). Des expansions CAG ont également été décrites dans le cas de la schizophrénie (3-5), ce qui laisse supposer que l'EPG joue un rôle. La mise en évidence d'expansion CAG en schizophrénie est difficile à répliquer (6), ce qui suggère que le locus et l'hétérogénéité allélique en schizophrénie peuvent entraîner une hérédité complexe pour laquelle les associations génétiques sont difficiles à détecter (7). A cet égard, l'utilisation de familles nucléaires comprenant un patient atteint par une forme précoce et/ou grave de schizophrénie est considérée comme une méthode de plus en

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plus séduisante pour l'identification de gènes de susceptibilité (7). Les inventeurs ont recherché une EPG dans la schizophrénie apparue dans l'enfance (SAE ou COS en anglais pour Childhood Onsct Schizophrcnia), forme rare et grave de la maladie (8-11). La SAE peut être décelée à l'aide des critères DSM-llIR non modifiés (8-9) (3ème édition révisée du manuel diagnostique et statistique des maladies mentales édité par l'American Psychiatrie Association) et présente les caractéristiques principales suivantes : (i) maladie plus grave que la schizophrénie apparue à l'âge adulte (SAA ou AOS en anglais pour Adult Onset Schizophrenia), (ii) perturbation de multiples domaines du développement avant l'apparition de symptômes psychotiques et, occasionnellement, la progression d'anomalies cérébrales après l'apparition de la psychose (9-11), et (iii) continuité clinique (9) et neurobiologique (Il) avec la SAA. L'étude de la SAE peut donc apporter de nouveaux éclairages sur la susceptibilité génétique à la schizophrénie en générale.

Des lignées de cellules lymphoblastoidcs (LCL) de 32 patients sans lien de parenté atteints de SAE recrutés sur l'ensemble des EtatsUnis (étude NIMH en cours, voir réf. 8) ont été testées par analyse western blot avec l'anticorps monoclonal 1C2 initialement généré contre la TATA-binding protein . L'anticorps 1C2 reconnaît de manière spécifique les polyglutamines longues (polyglutamines) (12). Au-dessus du seuil de détection (33 à 35 glutamines), l'intensité du signal augmente en fonction du nombre de glutamines (12). On observe des signaux EPG à soixante kDa environ chez huit des onze patients noirs américains sans lien de parenté atteints de SAE (Tableau). L'intensité de la bande à 60 kDa est forte chez deux patients (patients 14 et 18) des huit patients positifs atteints de SAE, et atteste d'une forte EPG. Dans les familles nucléaires (FNI et FNII ou NFI et NFII en anglais) des patients 14 et 18, on détecte une faible bande à 60 kDa (attestant d'une faible EPG) chez

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certains parents et frères et soeurs non atteints, ce qui laisse supposer que la bande plus faible à 60 kDa n'est pas associée à SAE (Figures la et 1b). En utilisant des gels SDS-PAGE (10 %) longs à haute résolution, la bande faible migre clairement à une position légèrement supérieure à celle de la bande forte dans FNl (Figure la, planche du bas), ce qui indique que le signal faible ne correspond pas à la même protéine avec un domaine polyglutaminique plus court, et que les signaux EPG faibles et fort sont le fait de deux protéines différentes. Les profils de détection sont reproduits pour FNI et FNII en utilisant trois lots différents d'extraits de LCL.

Les segments polyglutaminiques longs dans les protéines humaines induisent un déplacement de migration vers des poids moléculaires élevés (12). Par exemple, la TBP est une protéine de 37,2 k qui migre à 50 kDa environ. Ceci laisse supposer que le signal EPG fort à 60 kDa correspond à une protéine d'une masse réelle de 47 kDa environ. Lorsqu'elle est sondée avec l'anticorps monoclonal IC2, il a précédemment été rapporté que la protéine HD normale est à peine décelable après une surexposition brute si la polyglutamine contient plus de 27 unités (12). En utilisant des gels SDS-PAGE (7 %, 10 %) avec une migration prolongée et une longue exposition, la protéine de 60 kDa qui réagit à l'anticorps monoclonal 1C2 chez le patient 14 atteint de SAE n'est pas décelée sous forme de doublet (données non présentées), ce qui laisse supposer que la forme allélique normale de la protéine en question contient moins de 28 glutamines (12). Dans des expériences de contrôle, aucune bande à 60 kDa n'est observée chez trois familles blanches en bonne santé (généalogies Utah CEPH 1334,1344 et 1420 ; 53 individus au total ; données non présentées) pour lesquelles une expansion de CAG avait précédemment été rapportée (13). 38 témoins noirs américains sans antécédents de maladies psychiatriques ont également été testés (voir
METHODES, ci-après). A l'exception de onze d'entre eux (présentant

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une faible bande à 60 kDa), ces individus sont négatifs aux signaux EPG à 60 kDa, comme l'illustre la Figure 1c.

Afin de caractériser davantage la protéine qui porte le signal EPG fort, une électrophorèse sur gel bidimensionnel (2D) (gradient pl 10 à 3) a été effectuée. En utilisant deux lots différents d'extrait de LCL du patient 14 atteint de SAE, la comparaison de l'IEF/SDS-PAGE coloré au nitrate d'argent (Figure 2a) avec des immunotransferts 1C2 (Figure 2b) laisse supposer que l'EPG est portée par une protéine acide (point d'isoélectrofocalisation [pI] de 4 environ). Les expériences d'électrophorèse sur gel en deux dimensions entraînent également une estimation plus précise (52 à 57 kDa) de la masse relative (Mr) de cette protéine. Aucun signal EPG n'est détecté chez le patient 10 atteint de SAE et négatif par l'EPG (données non présentées). On ne détecte pas non plus de signal EPG chez le patient 16 atteint de SAE, ce qui laisse supposer que la bande faible de 60 kDa correspond à une protéine (pi en dehors de la plage testée) différente de la protéine acide détectées chez les patients 14 et 18 atteints de SAE (données non présentées). Cette observation corrobore les observations précédemment effectuées dans la FNI par électrophorèse sur gel ID à grande résolution (voir le paragraphe précédent).

Afin d'identifier le gène de la polyglutamine étendue chez les patients 14 et 18 atteints de SAE, 27 protéines portant 8-34 glutamines consécutives ont été choisies par ciblage informatique, et une protéine acide, DAN26 (14) (52,5 kDa, pI 4,8) a été retenue pour un test PCR dans la famille SAE FNI(voir METHODES). Vingt-sept triplets répétés CAG trouvés dans des ADN complémentaires (15-17) et des triplets répétés CAG/CTG isolés à partir d'ADN génomique (18) constitués de plus de 10 à 15 unités consécutives ont également été testés pour expansion dans la FNI (voir METHODES). Tous les candidats testés présentent des allèles (répétition CAG) non étendus et on n'observe

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aucune différence de taille de ces allèles entre le patient 14 et ses parents ou frères et saurs (données non présentées). En conséquence, tous les candidats testés ont été exclus. Ceci laisse supposer que la protéine cible détectée chez les patients 14 et 18 n'est pas représentée dans les séquences d'ADN de Gcnbank qui contiennent de longues répétitions de CAG (> 10 à 15 unités). L'essai d'autres candidats choisis selon des critères moins rigoureux et/ou l'analyse aminoacide détaillée de la protéine cible pourrait permettre le clonage de ce gène.

La détection d'expansions CAG (3-5) et l'identification de loci de susceptibilité (19) laissent supposer que la schizophrénie a une base génétique. Ce qui pourrait être hérité, dans la schizophrénie, est une prédisposition à développer la maladie (7-19), et l'on considère que l'utilisation de familles nucléaires comprenant un patient atteint d'une forme précoce et/ou grave de la maladie constitue une variante intéressante à l'approche des gènes candidats pour définir la susceptibilité génétique (7). Une apparition plus précoce et/ou une plus grande gravité de la maladie peuvent en effet refléter une plus grande transmission héréditaire, et les membres non atteints de familles nucléaires fournissent des témoins bien appariés. En utilisant l'électrophorèse sur gel 1D et 2D et des expériences d'immunotranfert pour révélation à l'aide de l'anticorps monoclonal 1C2, un signal EPG fort a été détecté correspondant à une protéine acide vraisemblablement nouvelle de 52 à 57 kDa, et a été observé de manière spécifique chez les patients nord américains 14 et 18 atteints de SAE. Etant donné que l'intensité du signal EPG chez les patients 14 et 18 atteints de SAE est nettement plus forte que celle observée pour la bande de la TBP et pour la bande faible à 60kDa, et étant donné l'absence de bruits de fond, il est peu probable que le signal EPG fort résulte de réactions croisées de l'anticorps monoclonal 1C2 avec des polyglutamines contenant moins de
33 à 35 glutamines. La faible bande à 60 kDa observée chez certains

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membres non atteints des familles des patients 14 et 18 et chez les autres témoins testés correspond vraisemblablement à une protéine différente, comme l'indiquent les expériences d'électrophorèse sur gel ID et 2D à grande résolution. Etant donné qu'aucun signal EPG tort n'a été détecté chez les témoins appariés suivant l'âge sans antécédents de troubles psychiatriques (en particulier une des s#urs du patient 14 ; voir Figure 1, piste 4), il est peu probable qu'il y ait des différences dues à l'âge dans l'expression de la protéine acide de 52 à 57 kDa observée avec un pic pendant la puberté. Ainsi, ces données indiquent que la protéine acide de 52 à 57 kDa est un candidat potentiellement intéressant pour la SAE et nécessitent trois lignes de recherches supplémentaires afin de déterminer si cette protéine peut oui ou non être impliquée dans la schizophrénie. Premièrement, le nombre de LCL actuellement disponibles pour des patients atteints de SAE est limité, et les études de réplication chez d'autres patients atteints de SAE sont justifiées (8). En second lieu, la notion de continuité clinique de la SAE à la SAA (9-10) exige de rechercher l'EPG détectée dans cette étude dans la schizophrénie en général. L'EPG ne semble pas se produire chez les patients schizophrènes présentant des expansions CAG/CTG de cinquante unités ou plus (20). Récemment, il a été rapporté que les allèles les plus longs (> 19 à 20 unités) de répétition de CAG (codant un domaine de polyglutamine polymorphe constitué de 12 à 28 unités) dans le gène hSKCa3 (canal potassique) sont sur-représentés chez des patients schizophrènes (21), ce qui laisse supposer que les polyglutamines modérément agrandies jouent un rôle dans la schizophrénie. Finalement, il est intéressant de noter qu'en utilisant l'anticorps monoclonal 1C2, on observe des signaux EPG dans la plage comprise entre 50 et 60 kDa chez deux patients blancs sans lien de parenté atteints de SAA (données non montrées), ce qui suggère en outre que les protéines portant des polyglutamines polymorphes pourraient être des candidats à la

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schizophrénie en général. Tandis que l'utilisation de la technique de détection d'expansion CAG (13) (DER, RED en anglais) a permis la détection de plus grandes répétitions de CAG/CTG chez les patients schizophrènes (3-5), des répétitions de CAG/CTG longues et instables ont également été identifiées chez des individus normaux, notamment la répétition intronique CTG18.1dans le gène SEF2-1 et la répétition transcrite ERDAl/Dir I (22). Il s'est avéré que de la majorité des expansions de CAG détectées par DER dans SAE (22) est due aux expansions CAG au niveau de ces deux loci. En particulier, le patient 14 atteint de SAE a un score DER de 90 unités et une taille Dir I de 95 unités, et le patient 18 atteint de SAE a un score DER de 60 unités et une taille Dir I de 57, la répétition CTG18. étant normale (< 37 unités) chez ces deux patients (données non montrées). L'intensité du signal EPG fort à 60 kDa est similaire chez ces deux patients, et les autres patients atteints de SAE pour lesquels des scores DER élevés correspondent à des tailles Dir I ne présentent pas de signal EPG fort de 60 kDa, ce qui laisse supposer que le tractus polyglutaminique détecté dans la protéine acide candidate ne correspond pas à Dir 1 ou à d'autres expansions CAG détectées par DER en SAE. En conclusion, le faible nombre de patients atteints de SAE qui s'avèrent positifs au signal EPG fort dans notre étude peut refléter le fait que tout gène candidat peut apporter une faible part de sensibilité à une maladie complexe telle que la schizophréenie. A cet égard, on peut s'attendre à ce que les études supplémentaires mentionnées ci-dessus, sur des effectifs plus importants et/ou plus diversifiés, apportent un éclairage plus approfondi sur le rôle éventuel de la protéine détectée dans cette étude dans la schizophrénie.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé de classification de patients atteints de schizophrénie comprenant :

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l'analyse d'un extrait protéique préparé à partir d'au moins une lignée de cellules lymphoblastoïdcs desdits patients, par western blot avec un anticorps monoclonal, et - la sélection desdits patients pour lesquels l'analyse a révélé l'existence d'une protéine acide de 52 à 57 kDa présentant une expansion de polyglutamines.

Cette expansion de polyglutamines. est à associer à un signal fort correspondant à la reconnaissance des polyglutamines par un anticorps monoclonal spécifique, comme indiqué précédemment.

Ce procédé peut notamment être mis en #uvre au moyen d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe comprenant : 1C2 (12) commercialisé par Eurogentec, France ; 1 F8 (24) qui est un anticorps monoclonal généré contre TBP et présentant des propriétés similaires à celles de l'anticorps monoclonal 1C2, ou tout autre anticorps de préférence monoclonal spécifique des expansions de polyglutamines.

En effet, tous ces anticorps monoclonaux présentent la particularité commune d'être spécifiques des EPG.

Plus particulièrement, le procédé de classification conforme à l'invention peut comprendre une étape supplémentaire consistant à déterminer le profil clinique de chaque patient sélectionné (c'est-à-dire pour lequel l'analyse au moyen de l'anticorps a révélé l'existence d'une protéine acide de 52 à 57 kDa présentant une expansion de polyglutamines).

En effet, le but de cette étape supplémentaire est d'essayer d'établir une corrélation entre la mise en évidence chez certains patients de l'existence de protéines présentant une expansion de polyglutamines et leur profil clinique. Il s'agit là d'essayer d'une part de mieux comprendre, au moins en partie, les causes et/ou le développement de la schizophrénie et d'autre part d'envisager avec le plus de précision possible un traitement efficace.

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Le profil clinique d'un patient peut notamment être déterminé au moyen de critères choisis dans le groupe comprenant : l'âge d'apparition de la pathologie, la sévérité de la pathologie. la réponse du patient à certains médicaments...

Quoiqu'il en soit, l'association expansion des

polyglutamines/schizophrénie a été établie dans le cadre de la présente invention et de ce fait, les protéines présentant lesdites expansions constituent une cible thérapeutique, même partielle, dans le cadre d'un traitement de la schizophrénie. En fait, cette notion de cible s'étend également à toutes les voies biochimiques impliquées dans la synthèse, la fonction et la dégradation de ces protéines. Ainsi, que l'on cherche à réprimer l'expression de gènes codants pour les protéines présentant une expansion de polyglutamines ou que l'on cherche au contraire à surexprimer ce gène, l'homme du métier est à même de mettre en oeuvre les différents techniques permettant d'obtenir l'un ou l'autre de ces résultats en agissant directement ou indirectement sur les protéines en question y compris au niveau des séquences nucléotidiques (ADN ou ARN) correspondant auxdites protéines.

La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'un composé ou d'une molécule (choisi(e) en fonction de la technique utilisée et du but à atteindre) pour la préparation d'un médicament ayant pour cible les protéines contenant des expansions de polyglutamines et/ou les voies biochimiques impliquées dans la synthèse, la fonction et la dégradation de ces protéines, ledit médicament étant destiné au traitement de la schizophrénie.

Figure 1. Détection de l'EPG dans les cas de la SAE. On effectue une électrophorèse sur 50 g (gels de polyacrylamide avec gradients de 4 à 20 %) ou 60 g (gels de polyacrylamide longs à 10 %) de protéine provenant d'extraits de LCL (voir le Tableau).

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(a) Un signal EPG fort à 60 kDa environ est détecté par l'anticorps monoclonal 1C2 chez les patients (atteints de SAE, noirs américains) 14 (famille nucléaire NFI, planche en haut à gauche) et 18 (famille nucléaire NF11, planche en haut à droite , on ne dispose pas de LCL du père du patient 18, celui-ci étant décédé). Les parents ou les frères et s#urs de ces deux patients SAE (aucun antécédent de maladies psychiatriques excepté le père du patient 14, atteint de SAA) sont négatifs pour la bande à environ 60 kDa (NFI, bande 2) ou présentent un signal EPG faible à environ 60 kDa (NFI, bandes 1 à 4 à 6). L'analyse sur gel SDS-PAGE (10 %) haute résolution (NFI, planche du bas, vue agrandie du gel) indique que la bande faible à 60 kDa réagissant avec l'anticorps monoclonal 1C2 (bandes 1 et 4 à 6) migre à une position plus élevée que la bande forte à 60 kDa (bande 3). Les frères et s#urs du patient 14 sont âgés de 13,9 (bande 4), 23,3 (bande 5) et 23,9 ans (bande 6) au moment du prélèvement sanguin. Les patients NF1, SCA2 (bande 7) et SCA3 (bande 8) sont montrés comme étant des témoins EPG positifs, le nombre de répétitions de Gln des allèles de la TBP dans le NFI a été déterminé par analyse PCR ainsi que décrit précédemment (15) et il est compris entre 33 et 37 unités. Les bandes NFII 1 et 2 montrent respectivement le patient SAE 14 (pour comparaison avec le signal EPG fort à 60 kDa) et sa mère (négative pour la bande à 60 kDa).

(b) Aucun signal EPG à 60 kDa (pateints 10 et 32) ou un signal
EPG faible à 60 kDa (pateints 16, 5, 30,29 et 13) est détecté par l'anticorps monoclonal 1C2 chez les 30 autres patients SAE testés (voir le Tableau). Dernière bande à gauche : patient SAE 14 (pour comparaison avec le signal EPG fort à 60 kDa).

(c) Aucun signal EPG à 60 kDa (bandes 2,3, 4,5 et 7) ou un signal EPG faible à 60 kDa (bandese 6 et 8) est détecté par l'anticorps monoclonal 1C2 chez des sujets noirs américains sains. Bande 1 : 14 SAE (pour comparaison avec le signal EPG fort à 60 kDa).

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Figure 2. Caractérisation de la protéine portant l'EPG chez le patient 14 SAE.

(u) lEF/SDS:PAGE coloré à l'argent (moitié droite du gel représentée) de protéines provenant d'extrait de LCL (500 g de protéine) de patient SAE. La TBP n'est pas détectée car cette protéine a un pl théorique supérieur ou égal à 10.

(b) Immunoblot correspondant au gel 2D et révélation avec l'anticorps monoclonal 1C2. Flèche noire (planches 1 et B) = protéine immunoréactive vis-à-vis de l'anticorps monoclonal 1C2 (Mr 52-57 kDa, PI = 4 environ)

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TABLEAU EPG chez des patients américains atteints de SAE

<tb>
<tb> AGE <SEP> AGE <SEP> AUQUEL <SEP> LE <SEP> SLONAI.
<tb>

PATIENT <SEP> SEXE' <SEP> APPARTENANCE <SEP> D'APPARITION <SEP> PRELEVEMENT <SEP> EPO <SEP> A
<tb> ETHNIQUE <SEP> DE <SEP> LA <SEP> SANGUIN <SEP> A <SEP> ETE <SEP> 60 <SEP> KDA#
<tb> MALADIE <SEP> EFFECTUE
<tb> 1 <SEP> F <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 9 <SEP> 14 <SEP> -
<tb> 2 <SEP> F <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 11 <SEP> 15 <SEP> -
<tb> 3 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> -
<tb> 4 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 8 <SEP> 13 <SEP> -
<tb> 5 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 10 <SEP> 14 <SEP> +
<tb> 6 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 10 <SEP> 14 <SEP> -
<tb> 7 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 7 <SEP> 12-
<tb> 8 <SEP> M <SEP> Iranien <SEP> blanc <SEP> 11 <SEP> 13 <SEP> -
<tb> 9 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 11 <SEP> 17 <SEP> -
<tb> 10 <SEP> F <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 10 <SEP> 16 <SEP> -
<tb> 11 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 11 <SEP> 14 <SEP> -
<tb> 12 <SEP> F <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 9 <SEP> 10-
<tb> 13 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 11 <SEP> 16 <SEP> +
<tb> 14 <SEP> F <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 12 <SEP> 14 <SEP> ++
<tb> 15 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 11 <SEP> 15
<tb> 16 <SEP> F <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 12 <SEP> 16 <SEP> +
<tb> 17 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 11 <SEP> 16
<tb> 18 <SEP> F <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 11 <SEP> 13 <SEP> ++
<tb> 19 <SEP> F <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 12 <SEP> 17
<tb> 20 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 7 <SEP> 14
<tb> 21 <SEP> F <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 5 <SEP> 9 <SEP> +
<tb> 22 <SEP> M. <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 6 <SEP> 21 <SEP> -
<tb> 23 <SEP> F <SEP> Philippin <SEP> 11 <SEP> 12-
<tb> 24 <SEP> F <SEP> Hispanique <SEP> blanc <SEP> 11 <SEP> 16-
<tb> 25 <SEP> F <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> -
<tb> 26 <SEP> F <SEP> Hispanique <SEP> blanc <SEP> 12 <SEP> 14-
<tb> 27 <SEP> F <SEP> Hispanique <SEP> blanc <SEP> 9 <SEP> 17-
<tb> 28 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> blanc <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> -
<tb> 29 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 12 <SEP> 19 <SEP> +
<tb> 30 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 12 <SEP> 16 <SEP> +
<tb> 31 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> indien <SEP> 12 <SEP> 15
<tb> 32 <SEP> M <SEP> Américain <SEP> noir <SEP> 12 <SEP> 15
<tb>

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Légende du tableau
Trente-deux patients atteints de SAE ont été testés par analyse western blot avec l'anticorps monoclonal 1C2 pour rechercher une EPG (voir la figure 1). Huit des 11 patients noirs américains atteints de SAE se sont révélés positifs pour l'EPG.

* F = sexe féminin, M = sexe masculin # Mr ou masse relative approximative, - = négatif, + = faible intensité non associée à la maladie (également observé chez des sujets noirs américains non atteints par la
SAE), ++ = forte intensité (observée uniquement chez les patients atteints de SAE).

METHODES Origines et préparation des extraits de LCL
Nous avons analysé les échantillons suivants : (1) LCL provenant de 32 patients atteints de SAE sans lien de parenté (recrutés dans tous les Etats-Unis) pour lesquels une description clinique détaillée a précédemment été publiée (8-10-11) ; (2) LCL provenant de 38 témoins noirs américains sans lien de parenté, parmi lesquels 10 individus en bonne santé, (NIMH ; entre 9 et 50 ans ; pas d'antécédents de maladies psychiatriques) provenant de la région de Washington et 28 individus non atteints (NIGMS Cell Repository, Coriell Institute for Medical Research, NY, USA : entre 2 et 58 ans ; origine régionale aux Etats-Unis non identifiée) présentant des mutations pathologiques pour des maladies autres que des maladies psychiatriques, notamment l'ataxie télangiectase, la fibrose kystique, l'arriération mentale des sites fragiles, la cryptophtalmie, des mutations des loci d'hémoglobine, et des troubles du

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métabolisme des nucléotides et des acides nucléiques et des hydrates de carbone, et (3) LCL provenant de trois familles d'américains blancs en bonne santé (généalogies CEPHUtah 1334, 1344 et 1420 ; 53 individus au total). On prépare des extraits cellulaires totaux sans détergent à partir de cellules en phase de division. On obtient des extraits cellulaires comme indiqué précédemment (12) par homogénéisation dans du TrisHCI 50 mM pH 8,0 du glycérol à 10 % (v/v), de l'EDTA I mM, du KCI 5 mM, du PMSF 1 mM, 2 g/ml de peptine-Leu et 4 g/ml de protinine A. On détermine la concentration en protéine des extraits de LCL en utilisant le réactif à l'acide bicinchoninique (BCA) (Pierce) conformément aux recommandations du fabricant. On stocke les aliquotes à - 80 C jusqu'à l'utilisation.

Electrophorèse sur gel 1 D et 2D et électroblottine
On effectue l'électrophorèse sur gel ID comme suit. On analyse des extraits cellulaires totaux de LCL (50 g de protéine par ligne) par SDS-PAGE en utilisant des gels à gradient d'acrylamide/bisacrylamide à 4-20 % (39/1) (Biorad). Pour l'électrophorèse sur gel ID à grande résolution, on analyse des extraits cellulaires totaux de LCL (60 g de protéine/ligne) par SDS-PAGE en utilisant des gels longs à 7 ou 10 % d'acrylamide/bisacrylamide (39/1) (CBS Scientific Co. ). On effectue l'électrophorèse sur gel 2D comme suit : on analyse des échantillons de protéine de LCL (500 g) par électrophorèse sur gels de dodécylsulfate de sodium et polyacrylamide par SDS-d'isoélectrofocalisation (IEF) en utilisant des gels de polyacrylamide à 12 % de 20 x 20 cm (PharmaciaBiotech) conformément aux recommandations du fabricant. On établit la masse relative (Mr) des protéines en utilisant des étalons de masse moléculaire fournis par Sigma. On colore à l'argent les gels SDS-PAGE comme indiqué précédemment (23). On effectue un électroblotting des

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membranes Hybond N+ conformément aux procédures standards sur un système Biorad (électrophorèse sur gel ID) et sur les systèmes Multiphor Il et Novablot de Pharmacia-Biotcch (électrophorèse sur gel 2D) conformément aux recommandations des fabricants.

Immunodétcction de PEPG
On remet en suspension de l'anticorps monoclonal 1C2 lyophilisé provenant de fluide ascite de souris dans de l'eau distillée stérile, on prépare des aliquotes que l'on stocke à - 20 C jusqu'à l'utilisation. On effectue l'immunosondage et la détection comme indiqué précédemment (12) avec de légères modifications. On bloque les membranes avec du lait en poudre écrémé à 5 % et du Tween 0,02 % jusqu'au lendemain à 4 C, on laisse incuber dans du lait en poudre écrémé à 0,5 % avec l'anticorps monoclonal IC2 (1/2000) pendant deux heures à la température ambiante et on traite avec du sérum anti-souris conjugué à de la peroxydase de raifort (Amcrsham), à 1/4000 dans 0,5 % de lait sans matières grasses pendant une heure à température ambiante.

Après avoir été lavées, les membranes sont traitées en ayant recours à la détection ECL+TM conformément aux recommandations du fabricant (Amersham). On expose les blots à des hyperfilms MP (Amersham) pendant 30 s à 1 h afin d'examiner les signaux de fond dus à la présence de protéines normales contenant des segments de polyglutamine. On interprète les profils de détection par analyse comparative d'intensités de bande pour les protéines réagissant de manière spécifique, la protéine liant la séquence TATA (TBP) pour laquelle le principal allèle correspond à 38 glutamines, et les protéines ASC2 (22/43 glutamines) et
ASC3 (23/72 glutamines) provenant de patients hétérozygotes au niveau de ces loci. On répète ces expériences au moins trois fois.

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Critères de sélection et test de gènes candidats contenant des

trinlcts i-éi)étés CAG
On recherche dans la base de données Gcnbank (version n 103) la présence de séquences codantes entières connues ou supposées coder pour des protéines avec polyglutamines. On utilise le logiciel BLASTP avec une séquence de requête (Gln)25 comme indiqué précédemment (15). On choisit toutes les séquences sélectionnées pour s'assurer que toutes les polyglutamines ayant au moins 8 à 10 unités consécutives sont extraites puis on trie les séquences humaines et uniques. Ceci ce traduit par la sélection de 27 candidats portant 8 à 28 glutamines consécutives (à l'exception de la TBP qui présente 34 glutamines consécutives) : huit protéines de maladies neurodégénératives à EPG, 15protéines normales

(qui incluent des facteurs de transcription tels que AIB 1/Rac2, ASH ATBF1-A, hSNF2a, N-Oct-3, SATB1, TBP, et l'homologue polyhoméolytique humain 1 HPH1, la protéine homéobox humaine HLX1, la polymérase gamma polyglutamine et la protéine du méningiome MN1), et quatre nouvelles protéines (DAN26, DAN 15, AADIO et AAD14) préalablement identifiées par immunocriblage avec l'anticorps monoclonal 1C2 d'une bibliothèque d'ADN complémentaire construite à partir d'une LCL de patient SCA7 (14). On détermine la masse moléculaire théorique et le point d'isoélectrofocalisation (pI) de chacune des protéines sélectionnées en utilisant un programme

disponible à l'adresse URL suivante : http:/hwv-biol.univ-mrs.fr. En particulier, une des protéines, DAN26, présente une masse théorique dans la plage de 50 à 60 kDa (52,5 kDa) et un pI) théorique dans la plage comprise entre 4 et 6 (pI 4,8) et a été retenue pour un test PCR dans la famille FNI de SAE. On teste également des répétitions CAG polymorphes et/ou longues (n=20) constituées de plus de dix unités consécutives et précédemment trouvées dans des bibliothèques d'ADN complémentaire humain (15-17), notamment 2. 116, 2.119, i.181,i.182

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(15), 1250lr, b01500t, et g02502r (16), et CTGla, CTG3a, CTG4a, CTG7a, CTG20a, CAGF9, F28, H1, H16, H26, 1132, H38, H39, 1144, 1145, L69, L85, L114, L234 et L237, dont certains sont supposés coder pour un segment polyglutarniniduc (17). Finalement, on teste également

sept répétitions de CAG/CTG (GC'I' l C9, GC'I'4I3 l0, GG't'S1-:1 l, GCT16E06, GC'f 1 OD04, GCTIOCIO et GCTlOH06) isolées à partir d'ADN génomique et constituées de plus de 15 unités consécutives (18).

La sélection et l'utilisation d'amorces adaptées à la détection d'expansion de CAG dans l'ADN de la famille FNI de SAE sont réalisées comme indiqué précédemment (15).

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REFERENCES

1. Koshy 13.1'. and Zoghbi Fui Y. Te CAG/polyglutaminc tract discasc : genc products and molccular pathogcncsis. ///// /'//;/. 1997 ; 7 : 927-942.

2. David G., Abbas N., Stevanin G., Durr A., Yvcrt G., Weber C., Imbert G., Saudou F., Antoniou E., Drabkin H., Gemmill R., Giunti P., Benomar A., Wood N., Ruberg M , Agid Y., Mandel J.L., and Brice A. Cloning of the SCA7 gène reveals a higly unstable CAG repeat expansion. Nature Genet. 1997 ; 17 : 65-70.

3. O'Donovan M.C., Guy C., Craddock N., Murphy K.C., Cardno A.G., Jones L.A., Owen M. J., and McGuffin P. Expanded CAG repeats in schizophrenia and bipolar disorders. Nature Genet. 1995 ; 10 : 380- 381.

4. Morris A.G., Gaitond E., McKenna P.J., Mollon J. D., and Hunt D.M. CAG repeat expansions ans schizophrenia : association with discasc in fcmalcs and with early age-at-onset. Hum. Mol. Genet 1995 ; 4 : 1957-1961.

5. O'Donovan M. C., Guy C., Craddock N., Bowcn T., McKeon P., Macedo A., Maier W., Wildenauer D., Aschauer H.N., Sorbi S., Feldman E., Mynett-Johnson L. Claffey E., Nacmias B., Valente J., Dourado A., Grassi E., Lenzinger E., Heiden A.M., Moorhead S., Harrison D., Williams J., McGuffin P., and Owen M. J. Confirmation of association between expanded CAG/CTG repeats and both schizophrenia and bipolar disorder. Psychol. Med. 1996 ; 26 : 1145-1153.

6. Petronis A., Basset A.S., Honer W. G., Vincent J.B., Tatuch Y.,
Sasaki T., Ying D.J., Klempan T.A., and Kennedy J.L. Search for unstable DNA in schizophrenia families with evidence for genetic anticipation. Am J. Hum. Genet. 1996 ; 59 : 905-911.

<Desc/Clms Page number 19>

7. Craddock N. an Owcn M. Modem molccular gcnctic approaches to psychiatrie discasc. British Médical Bulletin 1996 ; 52 : 434-452.

8. Gordon C.T., Frazicr J.A., McKcnna K., Gicdd J., Zamcthkin A.,

Zahn T., llommer D., 1 long W., Kayscn D., AlbllS K.E., and Rapoport J.L. Childhood onsct schir.opiu'cnia : a NIMH study in progress.

Schizophr. Bull 1994 ; 20 : 697-712.

9. Asarnow R.F., Caplan R., and Asarnow J.R. Neurobehavioural studies of schizophrénie children : a developmental perspective on schizophrénie disorders. In : Hafner H. and Gattaz W.F. (eds) Searchfor

the causes of schizophrenia. Springer-Verlag : Berlin Heidelberg, Vol. 3, 1995, pp 87-113.

10. Rapoport J.L., Giedd J., Jacobsen L.K., Kumra S., Smith A., Lee P., Nelson J., and Hamburger S. Childhood onset schizophrenia : progressive ventricular enlargment during adolescence on MRI brain rescan. Arch Gen Psychiatry 1997 ; 54 : 897-903.

11. Jacobsen L. K. and Rapoport J.L. Childhood onset schizophrenia :

implications of clinical and ncurobiological research../. (liild 1'.ycliol.

Psychiatry 1997, in press.

12. Trottier Y., Lutz Y., Stevanin G., Imbert G., Devys D., Cancel G,, Saudou F., Weber C., David G., Tora L., Agid Y., Brice A., and Mandel J.L. Polyglutamine expansion as a pathological epitope in Huntington's disease and four dominant cerebellar ataxia. Nature 1995 ; 378 : 403-406.

13. Schalling M., Hudson T.J., Buetow K. H., and Housman D.E., Direct detection of novel expanded trinucleotide repeats in the human genome. Nature Genet. 1993 ; 4 : 135-139.

14. Imbert G., Saudou F., Yvert G., Devys D., Trottier Y., Garnier J.M., Weber C., Mandel J.L. and Cancel G., Abbas N., Dürr A.,
Didierjean O., Stevanin G., Agid Y., Brice A. Cloning of the gene for spinocerebellar ataxia 2 reveals a locus with high sensitivity to expanded
CAG/glutamine repeats. Nature Genet. 1996 ;14 : 285-291.

<Desc/Clms Page number 20>

15. Néri C., Albanèsc V., Lcbrc A. S., Holbcrt S., Saada C., Bouguelcrct L., Mcicr-Ewcrt S., Lc Gall I., Millasscau P., Bui H., Guidicclli C., Massart C., Guillou S., Gcrvy P., Poullicr E, Rigault P.,

Weissenbach J., Lennon G., Chumakov I., Daussct J., L,cIlrVCl1 1 L, Cohen D., and Cann Il. Survcy of CAG/CTG repeats in human cDNAs representing new gènes : candidates for inherited neurological diseases.

Hum Mol. Genet. 1996 ; 5 : 1001-1009.

16. Bulle F., Chiannilkulchai N., Pawlak A , Weissenbach J., Gyapay G., and Guellaen G. Identification and chromosomal localization of human genes containing CAG/CTG repeats expressed in testis and brain.

Génome lies. 1997 ; 7 :705-715.

17. Margolis R.L. Abraham M.R., Gatchell S B., Li S.H., Kidway A S., Breshel T.S., Stine O.C., Callahn C., Mclnnis M.G., and Ross C.A. cDNAs with long CAG trinucleotide repeats from human brain. Hum.

Genet. 1997 ; 100 : 114-122.

18. Gastier J.M., Brody T., Pulido J.C., Businga T., Sunden S., Hu X., Maitra S., Buetow K. H., Murray J.C., Sheffield V.C., Boguski M , Duyk G.M., and Hudson T.J. Dcvelopmcnt of a scrccning set for new (CAG/CTG),, dynamic mutations Genomics 1996 ; 32 :75-85.

19. Moises H. W., Yang L., Kristbjarnarson H., Wiese C., Byerley W., Macciardi F., Arolt V., Blackwood D., Liu X., Sjogren B., Ashauer H.N., Hwu H.G., Jang K., Livesley W.J., Kennedy J.L., Zega T., Ivarsson O., Bui M.T., Yu M.H., Havsteen B., Commenges D., Weissenbach J., Schwinger E., Gottesman II, Pakstis A.J., Wetterberg L., Kidd K.K., and Helgason T. An international two-stage genome wide search for schizophrenia susceptibility gènes. Nature Genet. 1995 ; 11 : 321-324.

20. Jones A.L., Middle F., Guy C. Spurlock G., Cairns N.J.,
McGuffin P., Craddock N., Owen M., and O'Donovan M. C. No évidence for expanded polyglutamine séquences in bipolar disorder and schizophrenia. Molecular Psychiatry 1997 ; 478-482.

<Desc/Clms Page number 21>

21. Chandly K.D., Fantino E., Wittckindt O., Kalman K., Tong L.L., Gutman G.A., Crocq M.A., Ganguli R., Nimgaonkar V., Morris- Roscndahl D.J., and Gargus J.J. Isolation of a novcl potassium channel gen hSKCa3 containing a polymorphic CAG rcpcat : a condidatc l'or

schizophrcnia ? Molecular P.\yclliatlY 1998 ; 3 : 32-37.

22. Sidransky E., Burgess C., Ikeuchi T., Lindbald K., Long R. T., Philibert R.A., Rapoport J., Schalling M., Tsuji S., and Ginns E. I. A triplet repeat on 17q accounts for most expansions detected by the repeat

expansion detection technique. Am. J. Hum. Genêt. 1998 ; 62: 1548- 1551, 23. Gallat A. and Rioux V. Convergence of amino acid composition of certain groups of proteins aids in their identification on two-

dimentiosnal electrophoresis gels, Electrophoresis 1997 ; 18 : 443-451, 24. White J.K., Auerbach W., Duyao M.P., Vonsattel J.P., Gusella J. F., Joyner A. L. & MacDonald M.E. hutingtin is required for neurogenesis and is not impaired by the Huntington's disease CAG expansion. Nature Genetics Vol. 17 december 1997.

Claims (5)

1. REVENDICATIONS 1. Procédé de classification de patients atteints de schizophrénie comprenant : l'analyse d'un extrait protéique préparé à partir d'au moins une lignée de cellules lymphoblastoïdes desdits patients, par western blot avec un anticorps monoclonal, et la sélection desdits patients pour lesquels l'analyse a révélé l'existence d'une protéine présentant une expansion de polyglutamines.
2. 2. Procédé de classification selon la revendication 1, dans lequel l'anticorps monoclonal est choisi dans le groupe comprenant .

   1C2, 1F8 ou tout autre anticorps spécifique des expansions de polyglutamines.
3. 3. Procédé de classification selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la protéine révélée est une protéine acide de 52 à 57 kDa.
4. 4. Procédé de classification selon l'une des revendications 1 à 3 comprenant après l'étape de sélection, une étape de détermination du profil clinique de chaque patient sélectionné.
5. 5. Procédé de classification selon la revendication 4, dans lequel le profil clinique est déterminé au moyen de critères choisis dans le groupe comprenant : l'âge d'apparition de la pathologie, la sévérité de la pathologie et la réponse du patient à certains médicaments.