ES2350851T3 - Gen humano de susceptibilidad al autismo que codifica una proteína transmembrana y sus usos. - Google Patents
Gen humano de susceptibilidad al autismo que codifica una proteína transmembrana y sus usos. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento in vitro para detectar la presencia o predisposición al autismo en un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra procedente del sujeto.
Description
Gen humano de susceptibilidad al autismo que
codifica una proteína transmembrana y sus usos.
La presente invención se refiere de manera
general a los campos de la genética y la medicina.
El autismo es un trastorno del desarrollo
neuropsiquiátrico caracterizado por desequilibrios en la interacción
social recíproca y en la comunicación verbal y no verbal, modelos
estereotipados y restringidos de intereses y actividades y la
presencia de anormalidades en el desarrollo sobre los 3 años de edad
(Bailey y col., 1996). En su estudio pionero de descripción del
autismo infantil, Kanner (1943) incluyó los siguientes síntomas:
afectación del lenguaje, falta de contacto visual, falta de
interacción social, comportamiento repetitivo, y una necesidad
insoslayable de rutina. Resaltó que, en la mayor parte de los casos,
el comportamiento del niño era anormal desde su temprana infancia.
Sobre esta base, sugirió la presencia de un defecto de nacimiento,
presumiblemente genético. Un año después, Hans Asperger en Alemania
describió pacientes similares y denominó la dolencia como
"psicopatía autística".
El autismo se define mediante criterios
comportamentales, sin embargo, no se conocen marcadores biológicos
específicos para diagnosticar la enfermedad. La imagen clínica del
autismo varía en gravedad, y está modificada por muchos factores,
entre los que se incluyen educación, capacidad y temperamento.
Además, la imagen clínica cambia durante el curso de la enfermedad
en el propio individuo. Además, el autismo está frecuentemente
asociado a otros trastornos, como el trastorno por déficit de
atención, coordinación motora y síntomas psiquiátricos como la
ansiedad y la depresión. Hay evidencias de que el autismo puede
también abarcar trastornos epilépticos, metabólicos e inmunológicos.
En línea con el reconocimiento clínico de la variabilidad, en la
actualidad hay acuerdo general de que existe un espectro de
trastornos autísticos, que incluyen individuos en todos los niveles
de inteligencia y capacidad lingüística extendiéndose a todos los
grados de gravedad.
Parte del espectro autista, pero considerado un
grupo especial, el síndrome de Asperger (SA). SA se distingue del
trastorno autístico por la falta de un retraso sínicamente
significativo en el desarrollo del lenguaje en presencia de
afectación de la interacción social y comportamientos restrictivos,
intereses y actividades repetitivos que caracterizan los trastornos
del espectro autistas (TEA).
Los TEA son tipos de trastornos generalizados
del desarrollo (TGD). El TGD "no especificado adicionalmente"
(TGD-NE) se usa para clasificar a los niños que no
cumplen los criterios estrictos del autismo pero están cerca, tanto
por manifestar síntomas típicos del autismo o por casi cumplir los
criterios diagnósticos en dos o tres áreas clave.
Para estandarizar el diagnóstico del autismo, la
Organización Mundial de la Salud (International Classification of
Diseases, 10ª Revisión (CIE-10), 1992) y la American
Psychiatric Association (Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders, 4ª edición (DSM-IV), 1994). han definido
los criterios diagnósticos. Se ha desarrollado una Entrevista
diagnóstica de autismo (Autism Diagnostic Interview, ADI) (Le
Couteur y col., 1989; Lord y col., 1994). La ADI es la única
herramienta diagnóstica disponible para diagnosticar el TEA que se
ha normalizado, probado rigurosamente y es universalmente
reconocida. La ADI es una entrevista semiestructurada con puntuación
de los padres basada en el listado de criterios
CIE-10 y DSM-IV para el diagnóstico
del autismo. Se centra en el comportamiento en tres áreas
principales: calidades de la interacción social recíproca;
comunicación y lenguajes; e intereses y comportamiento restrictivo y
repetitivo. Con estos criterios, el autismo ya no se considera un
trastorno raro. Se ha informado de tasas elevadas de
10-12 casos por 10.000 individuos en los estudios
más recientes (Gillberg y Wing, 1999) en comparación con la tasa de
prevalencia anteriormente informada de 4-5 pacientes
por 10.000 individuos según los criterios de Kanner (Folstein y
Rosen-Sheidley, 2001). Las estimaciones de la tasa
de prevalencia para el espectro completo de trastornos autistas son
de 1, a 2, veces mayores. Los informes de una tasa de aparición en
varones cuatro veces superior a la aparición en mujeres son
consistentes. El retraso mental está presente en entre el 25% y el
40% de los casos con (Baird y col. 2000; Chakrabarti y Fombonne,
2001). En cerca del 10% de la población se observan dolencias
médicas adicionales que implican el cerebro. (Gillberg y Coleman,
2000).
Los mecanismos subyacentes al aumento en los
casos informados de autismo son desconocidos. Se ha debatido
intensamente sobre si esta diferencia refleja un aumento en la
prevalencia del autismo, el cambio gradual en los criterios
diagnósticos, un reconocimiento de la mayor variabilidad de la
expresión de la dolencia, o un aumento en la conciencia del
trastorno. Además, existe una extendida percepción entre el público
de que el aumento aparente se debe principalmente a factores
ambientales (Nelson, 1991; Rodier y Hyman, 1998). Sin embargo,
parece que la mayor parte del aumento en la prevalencia se puede
explicar por una aplicación de los criterios diagnósticos, en
combinación con una explicación más amplia de dichos criterios.
Aunque existen tratamientos eficaces para
mejorar la dolencia, no existe cura, y los beneficios del
tratamiento tienden a ser modestos. Se han obtenido resultados
prometedores en algunos programas mediante diferentes estrategas del
comportamiento y el desarrollo. Entre las más prometedoras están los
programas basados en el análisis aplicado del comportamiento (ABA).
Parece que varias medicaciones mejoran algunos síntomas asociados al
autismo, incrementando de esta forma la capacidad del individuo para
beneficiarse de intervenciones sobre el comportamiento y el
desarrollo. Los agentes más extensamente estudiados son los
antagonistas de la dopamina. Varios estudios sugieren la utilidad de
varios inhibidores selectivos de la recepción de la serotonina.
Se ha publicado una revisión titulada "The
genetics of autism" por S.J Spence (Seminars in Pediatric
Neurology, vol. 11, nº 3, Septiembre de 2004
(2004-09), páginas 196-204).
Se han realizado tres estudios en gemelos para
estimar la posibilidad de heredar el autismo (Folstein y Rutter,
1977; Bailey y col., 1995; Steffenburg y col., 1989). Se estudiaron
todos los gemelos que vivían en una población geográficamente
definida. En el estudio combinaron, se estudiaron 36 gemelos
monocigóticos (MZ) y 30 dicigóticos (DZ). La tasa de posibilidad de
herencia dar concordancia MZ promedio es del 70% comparada con la
tasa en DZ del 0%. Se calculó una posibilidad de herencia superior
al 90% según la tasa de concordancia de MZ a DZ y el riesgo de
recurrencia entre hermanos se ha estimado en cerca del 2%-4% (Jorde
y col., 1991 Szatmari y col., 1998). Los estudios de familiares no
autistas mostraron claramente que las características de los TEA
aparecían más a menudo entre familiares de niños autistas que entre
los padres de los controles incluyendo reticencia social,
dificultades para la comunicación, preferencia por las rutinas y
dificultades con el cambio (Folstein y Rutter, 1977). El inicio
tardío del habla y las dificultades en la lectura son también más
frecuentes entre los miembros de las familias de los individuos con
autismo, así como depresión recurrente, trastornos de ansiedad,
serotonina elevada en plaquetas y aumento del perímetro craneal
(Folstein y Rosen-Sheidley, 2001).
La incidencia del autismo disminuye
significativamente al disminuir el grado de parentesco respecto del
individuo afectado, indicando que es improbable que un modelo de gen
único explique la mayor parte de los casos de autismo (Jorde y col.,
1990). Un análisis con segregación informado fue más consistente con
un modelo poligénico de la herencia (Jorde y col., 1991). El modelo
genético más parsimonioso es uno en el que varios genes interactúan
con otro para producir el fenotipo del autismo (Folstein y
Rosen-Sheidley, 2001).
Una considerable evidencia indirecta indica un
posible papel de la autoinmunidad en el autismo. Un estudio encontró
más miembros de la familia con enfermedades autoinmunes en familias
con un probando autista en comparación con probandos de control
(Comi y col., 1999). Unos pocos estudios informan que los haplotipos
del locus del Complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) presentes
en algunos niños con autismo, o en sus madres, podría predisponer a
sus hijos autistas a la autoinmunidad (Burger y Warren, 1998). En
dos estudios, se encontraron autoanticuerpos frente a algunos
tejidos y proteínas cerebrales, incluyendo la proteína básica
mielina, proteínas neurofilamentosas y epitelio vascular más a
menudo en niños con autismo en comparación con los controles (Singh
y col., 1993; Connolly y col., 1999; Weizman y col., 1982).
Aunque la mayor parte de los casos de autismo
son consistentes con el mecanismo de oligogenia y epistasis
propuesto, se han visto una minoría asociados con anormalidades
cromosómicas, y con trastornos con etiologías específicas. Smalley
(1997) declaró que aproximadamente de 15 a 37% de los casos de
autismo tienen una dolencia médica simultánea, incluyendo del 5 al
14% con un trastorno genético o anomalía cromosómica conocidas. Se
ha informado de anomalías cromosómicas que afectan a prácticamente
todos los cromosomas humanos. Entre estos se incluyen aneuploidías
autosómicas, anomalías de los cromosomas sexuales, delecciones,
duplicaciones, translocaciones, cromosomas en anillo, inversiones y
cromosomas marcadores (Gillberg, 1998). Son muy frecuentes
anormalidades en la región del cromosoma 15 relacionado con el
Síndrome de Prader Willi/Angelman. La asociación entre autismo un
una dolencia mendeliana o síndrome genético incluyó fenilcetonuria
no tratada, síndrome X frágil, esclerosis tuberosa y
neurofibromatosis. Recientemente, Carney y col. (2003) identificaron
mutaciones en el gen de MECP2 (proteína 2 de unión a metil CpG) en
dos mujeres con autismo que no mostraban manifestaciones del
síndrome de Rett causadas en el 80% de los casos por mutaciones en
el gen de MECP2.
Distintos grupos están realizando barridos
genómicos relacionados con el autismo o los fenotipos más amplios
del TEA. Este enfoque parece muy prometedor, puesto que es
sistemático y exento de modelos al mismo tiempo. Además, ya se ha
demostrado que funciona. De esta forma, se han obtenido resultados
positivos de relación incluso al analizar grupos de estudio
comparativamente pequeños. Más importante, algunos hallazgos ya han
sido replicados. El resultado más consistente se obtuvo para el
cromosoma 7q, pero también hay un considerable solapamiento en los
cromosomas 2q y 16p (Folstein y Rosen-Sheidley,
2001). También se ha realizado un considerable progreso en la
identificación de regiones cromosómicas en los cromosomas 15 y X. Se
han identificado mutaciones en dos genes relacionados con el X que
codifican las neuroliginas NLGN3 y NLGN4 en parientes con trastornos
del espectro autista (Jamain y col., 2003). Varias líneas de
evidencia respaldan el hecho de que mutaciones en las neuroliginas
están implicadas en el trastorno autista. En primer lugar, las
mutaciones informadas causan alteraciones graves en la estructura
predicha de la proteína. Segundo, se ha informado de delecciones en
el Xp22.3 que incluyen NLGN4 en varios niños autistas. Tercero, una
mutación de NLGN4 apareció de novo en la madre de un
individuo afectado.
La presente invención da a conocer ahora la
identificación de un gen humano de susceptibilidad al autismo, que
se puede usar para el diagnóstico del autismo, así como para el
cribado de fármacos terapéuticamente activos.
La presente invención da a conocer más
particularmente la identificación de un gen humano de
susceptibilidad al autismo, que se puede usar para el diagnóstico
del autismo, así como para el cribado de fármacos terapéuticamente
activos. La invención da a conocer más específicamente algunos
alelos del gen de la ATPasa2 de la membrana plasmática
transportadora de Ca++ (ATP2B2) relacionado con la susceptibilidad
al autismo y que representa una diana terapéutica novedosa para
intervención terapéutica. La presente invención se refiere a
mutaciones particulares en el gen ATP2B2 y en los productos de
expresión, así como herramientas diagnósticas y kits basados en
dichas
mutaciones.
mutaciones.
La invención se puede usar en el diagnóstico de
la predisposición, o para protegerse de, detección del autismo,
comprendiendo el procedimiento la detección en una muestra
procedente del sujeto de la presencia de una alteración en el gen
ATP2B2, siendo indicativa la presencia de dicho gen de la presencia
o predisposición al autismo. La presencia de dicha alteración puede
también ser indicativa de protección del autismo.
Un objeto particular de esta invención reside en
un procedimiento para detectar la presencia o predisposición al
autismo en un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar la
presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra
procedente del sujeto, siendo indicativa la presencia de dicha
alteración de la presencia o la predisposición al autismo.
Un objeto particular adicional al de esta
invención reside en un procedimiento para detectar la protección del
autismo en un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar la
presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra
procedente del sujeto, siendo indicativa la presencia de dicha
alteración de la protección del autismo.
Otro objeto particular descrito reside en un
procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un
tratamiento para el autismo, comprendiendo el procedimiento detectar
la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra
procedente del sujeto, siendo indicativa la presencia de dicha
alteración de una respuesta particular a dicho tratamiento.
Un objeto particular adicional descrito reside
en un procedimiento para evaluar el efecto adverso en un sujeto de
un tratamiento para el autismo, comprendiendo el procedimiento
detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una
muestra del sujeto, siendo indicativa la presencia de dicha
alteración de un efecto adverso de dicho tratamiento.
En una realización preferida, dicha alteración
es uno o varios SNP(s) o un haplotipo de SNP asociados con el
autismo. Más preferiblemente dicho haplotipo asociado con el autismo
comprende o está constituido por varios SNP seleccionados entre el
grupo constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61,
SNP73 y SNP74. Aún más preferiblemente, dicho haplotipo se
selecciona entre los haplotipos dados a conocer en la Tabla 4. Más
preferiblemente, dicho SNP asociado con el autismo puede ser
SNP22.
Preferiblemente, la alteración en el locus del
gen ATP2B2 de determina mediante la realización de un ensayo de
hibridación, un ensayo de secuenciación, un ensayo de
microsecuenciación, o un ensayo de amplificación específico del
alelo.
Un aspecto particular de esta divulgación reside
en composiciones de la materia que comprenden cebadores, sondas y/o
oligonucleótidos, que están específicamente diseñados para detectar
específicamente al menos un SNP o haplotipo asociados con el autismo
en la región genómica incluyendo el gen ATP2B2, o una combinación de
los anteriores. Más preferiblemente, dicho haplotipo asociado con el
autismo comprende o está constituido por varios SNP seleccionados
entre el grupo constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46,
SNP61, SNP73 y SNP74. Aún más preferible, dichos haplotipos están
seleccionados entre los haplotipos dados a conocer en la Tabla 4.
Más preferiblemente, dicho SNP asociado con el autismo puede ser
SNP.
Un aspecto adicional de esta invención reside en
el cribado de fármacos para terapia del autismo, basada en la
modulación o en la unión a un alelo del gen ATP2B2 asociado con el
autismo o producto génico del mismo.
Figura 1: Cartografía de alta densidad usando el
Perfil de identidad genómica híbrida (GenomeHIP).
La presente invención da a conocer la
identificación de ATP2B2 como un gen humano de susceptibilidad al
autismo. Varias muestras de ácido nucleico procedentes de 114
familias con autismo se sometieron a un procedimiento GenomeHIP
particular. Este procedimiento llevó a la identificación de
fragmentos particulares idénticos por descendencia en dichas
poblaciones que están alterados en sujetos autistas. Mediante
cribado de los fragmentos IBD, los inventores identificaron la
ATPasa2 de la membrana plasmática transportadora de Ca++ (ATP2B2) en
el cromosoma 3p25.3 como un candidato para el autismo y fenotipos
relacionados. Este gen está de hecho presente en el intervalo
crítico, y expresa un fenotipo funcional consistente con una
regulación genética del autismo. También se identificaron los SNP
del gen ATP2B2, puesto que estaban correlacionados con el autismo en
sujetos humanos. El SNP22 ubicado en el locus del gen ATP2B2, se
encontró asociado con el autismo. Los haplotipos dados a conocer en
la Tabla 4 que comprenden varios SNP seleccionados entre el grupo
constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y
SNP74 también fueron identificados como asociados con el
autismo.
La presente invención propone por tanto el uso
del gen ATP2B2 y los correspondientes productos de expresión para el
diagnóstico, prevención y tratamiento del autismo, así como para el
cribado de fármacos terapéuticos activos.
Autismo y trastornos del espectro autista (TEA):
el autismo se caracteriza típicamente como parte de un espectro de
trastornos (los TEA) entre los que se incluyen el síndrome de
Asperger (SA) y otros trastornos generalizados del desarrollo (TGD).
El autismo debe considerarse como cualquier estado de afectación de
la interacción y comunicación social con modelos repetitivos y
estereotipados restringidos del comportamiento, intereses y
actividades presente antes de los 3 años de edad, en la extensión en
que la salud puede quedar afectada. El SA se distingue del trastorno
autístico por la falta de un retraso clínicamente significativo en
el desarrollo del lenguaje en presencia de una afectación en la
interacción social y comportamientos, intereses y actividades
restringidas y repetitivas que caracterizan los trastornos del
espectro autista (los TEA). El TGD-NE (TGD, no
especificado adicionalmente) se usa para clasificar a los niños que
no cumplen los criterios estrictos del autismo pero están cerca,
bien por manifestar autismo atípico o por casi cumplir los criterios
diagnósticos en dos o tres de las áreas clave.
La invención se puede usar en varios sujetos,
particularmente seres humanos, incluyendo adultos, niños y en estado
prenatal.
En el contexto de esta invención, el locus del
gen ATP2B2 designa todas las secuencias o productos de ATP2B2 en una
célula u organismo, incluyendo las secuencias de codificación del
ATP2B2, secuencias no codificantes de ATP2B2 (por ejemplo,
intrones), secuencias reguladoras de ATP2B2 que controlan la
transcripción, la traducción (por ejemplo, un promotor, potenciador,
terminador, etc.), ARN y/o proteína de estabilidad, así como todos
los correspondientes productos de expresión tal como los ARN de
ATP2B2 (por ejemplo, ARN) y los polipéptidos de ATP2B2 (por ejemplo,
una preproteína y una proteína madura). El locus del gen ATP2B2
también comprenden las secuencias que rodean al ATP2B2 que incluyen
los SNP que están en desequilibrio de unión con los SNP ubicados en
el gen
ATP2B2.
ATP2B2.
Tal como se usa en la presente solicitud, el
término "gen ATP2B2" designa el gen de la ATPasa2 de la
membrana plasmática transportadora de Ca++ del cromosoma humano
3p25.3, así como sus variantes, análogos y fragmentos, incluyendo
alelos del mismo (por ejemplo, mutaciones en la línea germinal) que
están relacionados con la susceptibilidad al autismo. El gen ATP2B2
se puede denominar como PMCA2.
El término "gen" debe considerarse que
incluye cualquier tipo de ácido nucleico codificante, incluyendo ADN
genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc), ADN sintético o
semisintético, así como cualquier forma del correspondiente ARN. El
término gen incluye particularmente incluye particularmente ácidos
nucleicos recombinantes que codifican ATP2B2, es decir, cualquier
molécula de ácido nucleico de origen no natural creada
artificialmente, por ejemplo, mediante ensamblaje, cortado, ligado o
amplificación de secuencias. Un gen ATP2B2 normalmente es
bicatenario, aunque se pueden considerar otras formas, como la
monocatenaria. Los genes ATP2B2 se pueden obtener de varias fuentes
y de acuerdo con diferentes técnicas conocidas en la técnica, como
mediante el cribado de genotecas o mediante amplificación a partir
de varias fuentes naturales. Los ácidos nucleicos recombinantes se
pueden preparar mediante técnicas convencionales, entre las que se
incluyen la síntesis química, ingeniería genética, técnicas
enzimáticas, o una combinación de las mismas. Las secuencias
adecuadas del gen ATP2B2 se pueden concentrar en bancos génicos,
tales como Unigene Cluster para ATP2B2 (Hs. 268942) y Unigene
Representative Sequence NM_001001331. Un ejemplo particular de un
gen ATP2B2 comprende la SEC. DE ID. Nº: 1.
El término "gen ATP2B2" incluye cualquier
variante, fragmento o análogo de la SEC. DE ID. Nº 1 o de cualquier
secuencia codificante tal como se han identificado anteriormente,
por ejemplo, variantes de origen natural debidas a variaciones
alélicas entre individuos (por ejemplo, polimorfismos), alelos
mutados relacionados con el autismo, formas alternativas de corte y
empalme, etc. El término variante incluye también secuencias del gen
ATP2B2 procedentes de otras fuentes u organismos. Las variantes son
preferiblemente sustancialmente homólogas a la SEC. DE ID. Nº 1, es
decir, exhiben una identidad en la secuencia de nucleótidos de al
menos aproximadamente un 65%, típicamente de al menos
aproximadamente un 75%, preferiblemente de al menos aproximadamente
un 85%, más preferiblemente de al menos aproximadamente un 95% con
la SEC. DE ID. Nº 1. Las variantes y análogos del gen ATP2B2 también
incluyen secuencias de ácidos nucleico que se han hibridado con una
secuencia como la que se ha definido anteriormente (o una cadena
complementaria de la misma) en condiciones de hibridación
restrictivas.
Las condiciones de hibridación restrictivas
incluyen temperaturas superiores a 30º C, preferiblemente superiores
a 35ºC, más preferiblemente de más de 42ºC, y/o una salinidad
inferior a aproximadamente 500 mM, preferiblemente inferior a 200
mM. La persona experta en la técnica puede ajustar las condiciones
de hibridación por modificación de la temperatura, salinidad y/o
concentración del resto de reactivos tales como SDS, SSC, etc.
Un fragmento de un gen ATP2B2 designa cualquier
porción de al menos aproximadamente 8 nucleótidos consecutivos de
una secuencia como se ha dado a conocer más arriba, preferiblemente
de al menos aproximadamente 15, más preferiblemente de al menos
aproximadamente 20 nucleótidos, preferiblemente adicionalmente de al
menos 30 nucleótidos. Los fragmentos incluyen todas las longitudes
de nucleótidos posibles entre 8 y 100 nucleótidos, preferiblemente
entre 15 y 100, más preferiblemente entre 20 y 100.
Un polipéptido ATP2B2 designa cualquier proteína
o polipéptido codificado por un gen ATP2B2 como se ha dado a conocer
más arriba. El término "polipéptido" se refiere a cualquier
molécula que comprende una cadena de aminoácidos. Este término
incluye moléculas de varias longitudes, tales como péptidos y
proteínas. El polipéptido se puede modificar, como mediante
glicosilación y/o acetilaciones y/o reacción química o acoplamiento,
y pueden contener uno o varios aminoácidos no naturales o
sintéticos. Un ejemplo específico de un polipéptido ATP2B2 comprende
todo o parte de la SEC. DE ID. Nº: 2 (NP_001001331).
Las expresiones "respuesta a un
tratamiento" se refieren a la eficacia del tratamiento,
incluyendo pero sin limitarse a la capacidad de metabolizar un
compuesto terapéutico, respecto de la capacidad para convertir un
profármaco en un fármaco activo, y a la farmacocinética (absorción,
distribución, eliminación) y a la farmacodinámica (relacionada con
el receptor) de un fármaco en un individuo.
Las expresiones "respuesta adversa a un
tratamiento" se refieren a los efectos adversos de la terapia
resultante de las extensiones de la acción farmacológica principal
del fármaco o reacciones adversas idiosincráticas resultantes de una
interacción del fármaco con factores únicos del hospedador.
"Efectos secundarios de un tratamiento" incluyen, pero no se
limitan a, reacciones adversas como toxicidades dermatológicas,
hematológicas o hepatológicas, e incluye adicionalmente ulceración
gástrica e intestinal, perturbación en la función plaquetaria,
lesión renal, urticaria generalizada, broncoconstricción,
hipotensión y choque.
La invención proporciona ahora procedimientos
diagnósticos basados en el seguimiento del locus del gen ATP2B2 en
un sujeto. En el contexto de la presente invención, el término
"Diagnóstico" incluye la detección, seguimiento, dosificación,
comparación, etc., en varias etapas, incluyendo etapas tempranas
presintomáticas, y etapas tardías, en adultos, niños y previa al
nacimiento. El diagnóstico típicamente incluye el pronóstico, la
evaluación de una predisposición o riesgo de desarrollo, la
caracterización de un sujeto para definir el tratamiento más
apropiado (farmacogenética), etc. La presente invención proporciona
procedimientos diagnósticos para determinar si un individuo está en
riesgo de desarrollar autismo, o padece autismo, resultado de una
mutación o un polimorfismo en el gen ATP2B2. La presente invención
también proporciona procedimientos para determinar si es probable
que un individuo responda positivamente a un agente terapéutico o si
un individuo está en riesgo de desarrolla un efecto secundario
adverso a un agente terapéutico.
Un objeto particular de esta invención reside en
un procedimiento para detectar la presencia de una disposición al
autismo, comprendiendo el procedimiento detectar en una muestra
procedente del sujeto la presencia de una alteración en el gen
ATP2B2 en dicha muestra. La presencia de dicha alteración es
indicativa de la presencia o predisposición al autismo.
Opcionalmente, dicho procedimiento comprende una etapa previa de
proporcionar una muestra de u sujeto. Preferiblemente, la presencia
de una alteración en el gen ATP2B2 en dicha muestra se detecta
mediante el genotipado de la muestra.
Otro objeto particular de esta invención reside
en un procedimiento para detectar la protección frente al autismo en
un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de
una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra procedente del
sujeto, siendo indicativa la presencia de dicha alteración de la
protección frente al autismo.
En una realización preferida, dicha alteración
es uno o varios SNP(s) o un haplotipo de SNP asociado con el
autismo. Más preferiblemente, dicho haplotipo asociado con el
autismo comprende o está constituido por varios SNP seleccionados
entre el grupo constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46,
SNP61, SNP73 y SNP74. Aún más preferiblemente, dicho haplotipo se
seleccionan entre los haplotipos dados a conocer en la Tabla 4. Más
preferiblemente, dicho SNP asociado con el autismo es SNP22.
Otro objeto particular descrito reside en un
procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un
tratamiento del autismo, comprendiendo el procedimiento (i)
proporcionar una muestra procedente del sujeto y (ii) detectar la
presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en dicha muestra.
Otro objeto particular descrito reside en un
procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un
tratamiento del autismo, comprendiendo el procedimiento detectar en
una muestra procedente del sujeto la presencia de una alteración en
el gen ATP2B2 en dicha muestra. La presencia de dicha alteración es
indicativa de una respuesta particular a dicho tratamiento.
Preferiblemente, la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en
dicha muestra se detecta mediante el genotipado de la muestra.
Otro objeto particular descrito reside en un
procedimiento para evaluar los efectos adversos de un sujeto a un
tratamiento del autismo, comprendiendo el procedimiento detectar en
una muestra procedente del sujeto la presencia de una alteración en
el gen ATP2B2 en dicha muestra. La presencia de dicha alteración es
indicativa de efectos adversos a dicho tratamiento. Preferiblemente,
presencia de una alteración en el gen ATP2B2 de dicha muestra se
detecta mediante el genotipado de la muestra.
En una realización preferida, dicha alteración
en uno o varios SNP(s) o un haplotipo de SNP asociado con el
autismo. Más preferiblemente, dicho haplotipo asociado con el
autismo comprende o está constituido por varios SNP seleccionados
entre el grupo constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46,
SNP61, SNP73 y SNP74. Aún más preferiblemente, dicho haplotipo se
selecciona entre los haplotipos dados a conocer en la Tabla 4. Más
preferiblemente, dicho SNP asociado con el autismo es SNP22.
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El diagnóstico, que analiza y predice la
respuesta a un tratamiento o fármaco, o efectos secundarios para un
tratamiento o fármaco, se puede usar para determinar si un individuo
debería ser tratado con un fármaco de tratamiento particular. Por
ejemplo, si el diagnóstico indica una posibilidad de que un
individuo responda positivamente al tratamiento con un fármaco
particular, el fármaco se puede administrar al individuo. A la
inversa, si el diagnóstico indica que una posibilidad de que un
individuo responda negativamente al tratamiento con un fármaco
particular, se puede prescribir un curso de tratamiento alternativo.
Una respuesta negativa se puede definir tanto por la ausencia de una
respuesta eficaz como por la presencia de efectos secundarios
tóxicos.
Los ensayos clínicos de fármacos representan
otra aplicación de los SNP de ATP2B2. Uno o más SNP de ATP2B2
indicativos de respuesta a un fármaco o a efectos secundarios a un
fármaco se pueden identificar usando los procedimientos
anteriormente descritos. Posteriormente, los potenciales
participantes de un ensayo clínico de dicho agente se pueden cribar
para identificar aquellos individuos más propensos a responder
favorablemente al fármaco y excluir aquellos que posiblemente
experimenten efectos secundarios. De esta forma, se puede medir la
eficacia del tratamiento en individuos que respondan al fármaco, sin
disminuir la medición como resultado de la inclusión de individuos
que no es probable que respondan positivamente en el estudio y sin
corres el riesgo de problemas de seguridad no deseables.
La alteración se puede determinar respecto al
ADNg, ARN o polipéptido ATP2B2. Opcionalmente, la detección se lleva
a cabo por secuenciación de todo o parte del gen ATP2B2 o por
hibridación o amplificación selectiva de todo o parte del gen
ATP2B2. Más preferiblemente, se lleva a cabo una amplificación
específica del gen ATP2B2 antes de la etapa de identificación de la
alteración.
Una alteración en el locus del gen ATP2B2 puede
ser cualquier forma de mutación(es), delección(es),
reordenamiento(s) y/o inserciones en las regiones
codificantes y/o no codificantes del locus, solos en o en diferentes
combinación(es). Las mutaciones incluyen más específicamente
mutaciones puntuales. Las delecciones pueden abarcar cualquier
región o dos o más restos en una porción codificante o no
codificante del locus del gen, tal como desde dos restos al gen o
locus completo. Las delecciones típicas afectan las regiones más
pequeñas, como las regiones (intrones) o secuencias o fragmentos
repetidos de menos de aproximadamente 50 pares de bases
consecutivas, aunque también se pueden producir delecciones más
grandes. Las inserciones pueden abarcar la adición de uno o varios
restos en una porción codificante o no codificante del locus del
gen. Las inserciones típicamente comprenden la adición de entre 1 y
50 pares de bases en el locus del gen. Los reordenamientos incluyen
la inversión de secuencias. La alteración en el locus del gen ATP2B2
puede dar como resultado la creación de codones de detención,
mutaciones con desplazamiento de marco, sustituciones de
aminoácidos, corte y empalme o procesamiento de ARN particular,
inestabilidad del producto, producción de polipéptidos truncados,
etc. La alteración puede dar como resultado la producción del
polipéptido ATP2B2 con una función, estabilidad, direccionamiento o
estructura alterados. La alteración puede ser causa también de una
reducción en la expresión de la proteína o, alternativamente, un
aumento en dicha producción.
En una realización particular del procedimiento
de acuerdo con la presente invención, la alteración del locus del
gen ATP2B2 se selecciona entre una mutación puntual, una delección o
una inserción en el gen ATP2B2 o producto de expresión
correspondiente, más preferiblemente una mutación puntual y una
delección. La alteración puede determinar se en el ADNg, ARN o
polipéptido ATP2B2.
A este respecto, la presente invención da a
conocer ahora un SNP del gen ATP2B2 y algunos haplotipos, que
incluyen los SNP seleccionados entre el grupo constituido por SNP21,
SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y SNP74, que están asociado
con el autismo. Los SNP se recogen en la siguiente Tabla 1.
En cualquier procedimiento de acuerdo con la
presente invención, uno o varios SNP del gen ATP2B2 y algunos
haplotipos que comprenden SNP del gen ATP2B2 y las regiones
circundantes, más particularmente SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46,
SNP61, SNP73 y SNP74, se pueden usar en combinación otro SNP o
haplotipo asociado con el autismo y ubicado en otro gen o genes.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En otra variante, el procedimiento comprende
detectar la presencia de una alteración en la expresión del ARN de
ATP2B2. La alteración en la expresión del ARN incluye la presencia
de un procesamiento o corte y empalme alterados en el ARN, la
presencia de una alteración en la cantidad del ARN, etc. Estas se
pueden detectar mediante varias técnicas conocidas en la técnica,
incluyendo la secuenciación de todo o parte del ARN de ATP2B2 o
mediante hibridación selectiva o amplificación selectiva de todo o
parte de dicho ARN, por ejemplo.
En una variante adicional, el procedimiento
comprende detectar la presencia de una alteración en la expresión
del polipéptido ATP2B2. La alteración en la expresión del
polipéptido ATP2B2 incluye la presencia de una alteración en la
secuencia del polipéptido, la presencia de una alteración en la
cantidad del polipéptido ATP2B2, la presencia de una alteración en
la distribución tisular, etc. Estas se pueden detectar mediante
varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo la secuenciación
y/o unión a ligandos específicos (como los anticuerpos), por
ejemplo.
Como se ha indicado anteriormente, se pueden
usar varias técnicas conocidas en la técnica para detectar o
cuantificación una alteración del gen ATP2B2 o en la expresión del
ARN, incluyendo secuenciación, hibridación, amplificación y/o unión
a ligandos específicos (como los anticuerpos). Otros procedimiento
adecuados incluyen oligonucleótido específico de alelo (ASO),
amplificación específica de alelo, transferencia Southern (para
ADN), transferencia Northern para ARN, análisis de conformación
monocatenaria, (SSCA), PFGE, hibridación con fluorescencia in
situ (FISH), migración en gel, electroforesis en gel con
gradiente desnaturalizante, análisis de heteroduplex, protección con
RNasa, escisión por desemparejamiento químico, ELISA,
radioinmunoensayos (RIE) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA).
Algunos de estos enfoques (por ejemplo, SSCA y
CGGE) están basados en una variación en la movilidad electroforética
de los ácidos nucleicos, como resultado de la presencia de una
alteración en la secuencia. De acuerdo con estas técnicas, la
secuencia alterada se visualiza mediante un desplazamiento en la
movilidad de los geles. Los fragmentos se pueden secuenciar a
continuación para confirmar la alteración.
Otros están basados en la hibridación específica
entre los ácidos nucleicos procedentes del sujeto y una sonda
específica del gen ATP2B2 o ARN natural o alterado. La sonda puede
estar en suspensión o inmovilizada sobre un sustrato. La sonda está
típicamente marcada para facilitar la detección de híbridos.
Algunos de estos enfoque son particularmente
adecuados para evaluar una secuencia de o nivel de expresión de un
polipéptido, como la transferencia Northern, ELISA y RIA. Esto
último requiere el uso de un ligando específico del polipéptido, más
específicamente de un anticuerpo específico.
En una realización particular y preferida, el
procedimiento comprende detectar la presencia de una alteración en
el perfil de expresión del gen ATP2B2 en una muestra procedente del
sujeto. Como se ha indicado anteriormente, esto se puede llevar a
cabo más preferiblemente por secuenciación, hibridación selectiva
y/o amplificación selectiva de los ácidos nucleicos presentes en
dicha muestra.
La secuenciación se puede llevar a cabo mediante
técnicas bien conocidas en la técnica, mediante secuenciadores
automatizados. La secuenciación se puede llevar a cabo sobre el gen
ATP2B2 completo o, más preferiblemente, sobre regiones específicas
del mismo, típicamente las conocidas o sospechosas de transportar
mutaciones perjudiciales y otras alteraciones.
La amplificación está basada en la formación de
híbridos específicos entre secuencias de ácido nucleico
complementarias que sirven para iniciar la reproducción de los
ácidos nucleicos.
La amplificación se puede llevar a cabo de
acuerdo con varias técnicas conocidas en la técnica, como la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la
ligasa (LCR), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y
amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA).
Estas técnicas se pueden llevar a cabo con reactivos y protocolos
comerciales. Las técnicas preferidas usan PCR específica de alelo o
PCR-SSCP. La amplificación usualmente requiere el
uso de cebadores específicos de ácidos nucleicos para iniciar la
reacción.
Los cebadores de ácido nucleico útiles para
amplificar secuencias procedentes del gen o locus de ATP2B2 están
disponibles para hibridarse específicamente con una porción del
locus del gen ATP2B2 que flanquean una región diana de dicho locus,
estando alterada dicha región diana en algunos sujetos que padecen
autismo. En la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de dichas regiones
diana.
Los cebadores que se pueden usar para amplificar
una región diana de ATP2B2 que comprenden los SNP según
identificación en la Tabla 1 se pueden diseñar basándose en la
secuencia de la SEC. DE ID. Nº 1 o en la secuencia genómica de
ATP2B2. En una realización particular, los cebadores se pueden
diseñar basándose en la secuencia de la SEC. DE ID. N^{ros}
3-10.
Otro objeto particular de esta revelación reside
en un cebador de ácido nucleico útil para amplificar secuencias
procedentes del gen o locus de ATP2B2 incluyendo las regiones
circundantes. Dichos cebadores son preferiblemente complementarios,
y se hibridan específicamente a secuencias de ácido nucleico en el
locus del gen ATP2B2. Los cebadores particulares son capaces de
hibridarse específicamente con una porción del locus del gen ATP2B2
que flanquean una región diana de dicho locus, estando alterada
dicha región diana en algunos sujetos que padecen autismo.
La revelación también se refiere a un cebador de
ácido nucleico, siendo dicho cebador complementario de y se hibrida
específicamente con una porción de una secuencia codificante de
ATP2B2 (por ejemplo, gen o ARN) alterada en algunos sujetos que
padecen autismo. A este respecto, los cebadores particulares de esta
invención son específicos de las secuencias alteradas del gen o ARN
de ATP2B2. Mediante el uso de estos cebadores, la detección de un
producto de amplificación indica la presencia de una alteración en
el locus del gen ATP2B2. A diferencia de lo anterior, la ausencia de
producto de amplificación indica que la alteración específica no
está presente en la muestra.
Los cebadores típicos de esta revelación son
moléculas de ácido nucleico monocatenarias de aproximadamente 5 a 60
nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 8 a
aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. La secuencia se puede
derivar directamente de la secuencia del locus del gen ATP2B2. Se
prefiere una complementariedad perfecta para asegurar una elevada
especificidad. Sin embargo, se puede tolerar cierta falta de
emparejamiento.
La revelación también se refiere al uso de un
cebador de ácido nucleico o un par de cebadores de ácido nucleico
como se ha descrito anteriormente en un procedimiento para detectar
la presencia o la predisposición al autismo, en un sujeto, o a un
procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un
tratamiento del autismo.
Los procedimientos de detección de la
hibridación están basados en la formación de híbridos específicos
entre secuencias de ácido nucleico complementarias que sirven para
detectar la alteración o alteraciones en las secuencias de ácido
nucleico.
Una técnica de detección particular implica el
uso de una sonda de ácido nucleico específica de un gen o ARN de
ATP2B2 natural o alterado, seguido por la detección de la presencia
de un híbrido. La sonda puede estar en suspensión o inmovilizada
sobre un sustrato o soporte (como en una matriz de ácidos nucleicos
o tecnologías de chip). La sonda está típicamente marcada para
facilitar la detección de híbridos.
A este respecto, una realización particular de
esta invención comprende poner en contacto la muestra del sujeto con
una sonda de ácido nucleico específica de un locus del gen ATP2B2
alterado, y evaluar la formación de un híbrido. En una realización
particular y preferida, el procedimiento comprende poner en contacto
simultáneamente la muestra con un conjunto de sondas que son
específicas, respectivamente, de un locus del gen ATP2B2 de tipo
natural y de varias formas alteradas del mismo. En esta realización,
es posible detectar directamente la presencia de varias formas de
alteraciones en el locus del gen ATP2B2 de la muestra. Igualmente,
se pueden tratar en paralelo muestras procedentes de varios
sujetos.
En el contexto de esta revelación, una sonda
hace referencia a una secuencia de polinucleótidos que es
complementaria y capaz de una hibridación específica con
un(a) (porción diana de un) gen o ARN de ATP2B2, y que es
adecuada para detectar polimorfismos en el polinucleótido asociados
con los alelos de ATP2B2 que predisponen o están asociados con el
autismo. Las sondas preferiblemente complementarias del gen de
ATP2B2, ARN o porción diana de los anteriores. Las sondas
típicamente comprenden ácidos nucleicos monocatenarios de entre 8 y
1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo entre 10 y 800, más
preferiblemente de entre 15 y 700, típicamente de entre 20 y 500.
Deberá entenderse que se pueden usar igualmente sondas más largas.
Una sonda preferida de esta invención es una molécula de ácido
nucleico monocatenario de entre 8 y 500 nucleótidos de longitud, que
se puede hibridar específicamente con una región de un gen o ARN de
ATP2B2 que lleva una alteración.
Una realización específica de esta revelación es
una sonda de ácido nucleico específica de un gen o ARN alterado (por
ejemplo, mutado) de ATP2B2, es decir, una sonda de ácido nucleico
que específicamente se hibrida a dicho gen o ARN de ATP2B2 mutado y
esencialmente no se hibrida con un gen o ARN de ATP2B2 que carezca
de dicha alteración. Especificidad indica que la hibridación con la
secuencia diana genera una señal específica que se puede distinguir
de la señal generada mediante hibridación no específica. Se
prefieren secuencias perfectamente complementarias para diseñar
sondas de acuerdo con esta revelación. Deberá entenderse, sin
embargo, que se puede tolerar un cierto grado de no emparejamiento,
siempre que la señal específica se pueda distinguir de la
hibridación no específica.
Ejemplos particulares de dichas sondas son
secuencias de ácido nucleico complementarias de una porción diana de
la región genómica incluyendo el gen o ARN de ATP2B2 que contiene
una mutación puntual según la relación de la Tabla 1 anterior. Más
particularmente, las sondas pueden comprender una secuencia
seleccionada entre el grupo constituido por las SEC. DE ID.
N^{ros} 3-10 o un fragmento de la misma que
comprenden el SNP o una secuencia complementaria de la misma.
La secuencia de las sondas se puede derivar de
las secuencias del gen y ARN de ATP2B2 según se proporciona en la
presente solicitud. Las sustituciones de nucleótidos pueden
realizarse, así como las modificaciones químicas de la sonda. Dichas
modificaciones químicas se pueden llevar a cabo para incrementar la
estabilidad de los híbridos (por ejemplo, grupos intercalantes) o
para marcar la sonda. Ejemplos típicos de marcas incluyen, sin
limitación, radioactividad, fluorescencia, luminiscencia, marcado
enzimático, etc.
La revelación también concierne el uso de una
sonda de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente en un
procedimiento para detectar la presencia o predisposición al autismo
en un sujeto o en un procedimiento para evaluar la respuesta de un
sujeto a un tratamiento del autismo.
Como se ha indicado anteriormente, también se
puede detectar una alteración en el locus del gen ATP2B2 por cribado
de la alteración o alteraciones en los niveles de expresión de la
secuencia del polipéptido ATP2B2. A este respecto, una realización
específica de esta invención comprende poner en contacto la muestra
con un ligando específico de un polipéptido de ATP2B2 y determinar
la formación de un complejo.
Se pueden usar distintos tipos de ligandos, como
anticuerpos específicos. En una realización específica, la muestra
se pone en contacto con un anticuerpo específico de un polipéptido
de ATP2B2 y se determina la formación de un inmunocomplejo. Se
pueden utilizar varios procedimiento para detectar un
inmunocomplejo, tales como ELISA, radioinmunoensayos (RIE), y
ensayos inmunoenzimáticos (IEMA).
En el contexto de esta revelación, un anticuerpo
designa un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, así como
fragmentos o derivados de los mismos que tienen esencialmente la
misma especificidad por el antígeno. Los fragmentos incluyen Fab,
Fab'2, regiones CDR, etc. Los derivados incluyen anticuerpos
monocatenarios, anticuerpos humanizados, anticuerpos
polifuncionales, etc.
Un anticuerpo específico de un polipéptido
ATP2B2 designa un anticuerpo que se une selectivamente a un
polipéptido ATP2B2, concretamente, un anticuerpo generado contra un
polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo que contiene el epítopo.
Aunque se puede producir unión no específica a otros antígenos, la
unión al polipéptido ATP2B2 diana se produce con mayor afinidad y se
puede discriminar con fiabilidad de la unión no específica.
En una realización específica, el procedimiento
comprende poner en contacto una muestra procedente del sujeto con
(un soporte revestido con) un anticuerpo específico de una forma
alterada de un polipéptido ATP2B2, y determinar la presencia de un
inmunocomplejo. En una realización particular, la muestra se puede
poner en contacto simultáneamente, o en paralelo, o secuencialmente,
con varios (soportes revestidos con) anticuerpos específicos de
diferentes formas de un polipéptido ATP2B2, tal como un tipo natural
y varias formas alteradas del mismo.
La revelación también concierne al uso de un
ligando, preferiblemente un anticuerpo, un fragmento o un derivado
del mismo como se ha descrito anteriormente, en un procedimiento
para detectar la presencia o predisposición al autismo en un sujeto
o en un procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un
tratamiento del autismo, un trastorno del espectro autista, o un
trastorno asociado con el autismo.
Se describe también un kit diagnóstico que
comprende productos y reactivos para detectar en una muestra
procedente de un sujeto la presencia de una alteración en el gen o
polipéptido ATP2B2 o en la expresión del gen o polipéptido ATP2B2,
y/o en la actividad de ATP2B2. Dicho kit diagnóstico comprende
cualquier cebador, cualquier par de cebadores, cualquier sonda de
ácido nucleico y/o cualquier ligando, preferiblemente un anticuerpo,
descrito en la presente invención. Dicho kit diagnóstico kit de
acuerdo con la presente revelación puede comprender adicionalmente
reactivos y/o protocolos para realizar una reacción de hibridación,
amplificación o antígeno-anticuerpo.
Los procedimientos diagnósticos se pueden llevar
a cabo ex vivo o in vivo, preferiblemente in
vitro o ex vivo. Usan una muestra procedente del sujeto,
para evaluar el estado del locus del gen ATP2B2. La muestra puede
ser cualquier muestra biológica derivada de un sujeto que contenga
ácidos nucleicos o polipéptidos. Ejemplos de dichas muestras
incluyen fluidos, tejidos, muestras celulares, órganos, biopsias.
Las muestras más preferidas de sangre, plasma, saliva, orina, fluido
seminal, etc. El diagnóstico prenatal también se pueden llevar a
cabo ensayando células fetales o células placentales, por ejemplo.
La muestra se puede recoger de acuerdo con técnicas convencionales,
y usarse directamente para el diagnóstico o almacenarse. La muestra
se puede tratar antes de realizar el procedimiento, para conseguir o
mejorar la disponibilidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos
para el análisis. Los tratamientos incluyen, por ejemplo, lisis (por
ejemplo, mecánica, física, química, etc.), centrifugación, etc.
Igualmente, los ácidos nucleicos y/o polipéptidos se pueden
purificar previamente o enriquecerse mediante técnicas
convencionales, y/o reducirse en complejidad. Los ácidos nucleicos y
polipéptidos también se pueden tratar con enzimas o tratamientos
físicos para producir fragmentos de los mismos. Teniendo en cuanta
la elevada sensibilidad de los procedimientos reivindicados, es
suficiente una cantidad pequeña de muestra para llevar a cabo el
ensayo.
Como se ha indicado, la muestra se pone
preferiblemente en contacto con reactivos tales como sondas,
cebadores, o ligandos para evaluar la presencia de un locus alterado
en el gen ATP2B2. La puesta en contacto se puede llevar a cabo en un
dispositivo adecuado como una placa, tubo, pocillo, vidrio, etc. En
realizaciones específicas, la puesta en contacto se puede llevar a
cabo sobre un sustrato revestido con el reactivo, como una matriz de
ácido nucleico o una matriz de ligando específico. El sustrato puede
ser un sustrato sólido o semisólido como cualquier soporte que
comprenda vidrio, plástico, nylon, papel, metal, polímeros y
similares. El sustrato puede ser de varias formas y tamaños, como un
porta, una membrana, una perla, una columna, un gel, etc. La puesta
en contacto se puede realizar en cualquier condición adecuada para
que se forme un complejo entre el reactivo y los ácidos nucleicos o
polipéptidos de la muestra.
El hallazgo de un polipéptido, ARN, o ADN de
ATP2B2 alterado en la muestra es indicativo de la presencia de un
locus del gen ATP2B2 alterado en el sujeto, que se puede
correlacionar con la presencia, predisposición o estado de
progresión del autismo, un trastorno del espectro autista, o un
trastorno relacionado con el autismo. Por ejemplo, un individuo que
tenga una mutación en el ATP2B2 de su línea germinal tiene un
aumento en el riesgo de desarrollar autismo. La determinación de la
presencia de un locus del gen ATP2B2 alterado en un sujeto también
permite el diseño de una intervención terapéutica adecuada, que es
más eficaz y personalizado. Igualmente, esta determinación en un
nivel presintomático permite la aplicación de una pauta terapéutica
preventiva.
Una vez identificado un primer SNP en una región
genómica de interés, más particularmente en un locus del gen ATP2B2,
el médico normalmente experto en la técnica puede identificar
fácilmente SNP asociados en desequilibrio de unión con este primer
SNP. Así, cualquier SNP en desequilibrio de unión con un primer SNP
asociado con el autismo se asociará con este rasgo. Por tanto, una
vez se ha demostrado la asociación entre un SNP dado y el autismo,
el descubrimiento de SNP adicionales asociados con este rasgo puede
ser de gran interés para incrementar la densidad de los SNP de esta
región particular.
La identificación de SNP adicionales en
desequilibrio de unión con un SNP dado implica: (a) amplificar un
fragmento procedente de la región genómica que comprende o rodea un
primer SNP procedente de una pluralidad de individuos; (b)
identificar un segundo SNP en la región genómica que alberga o rodea
dicho primer SNP; (c) realizar un análisis del desequilibrio de
unión entre dicho primer SNP y los segundos SNP; y (d) seleccionar
dichos segundos SNP que están en desequilibrio de unión con dicho
primer marcador. También se contemplan subcombinaciones que
comprenden las etapas (b) y (c).
La persona experta en la técnica puede realizar
los procedimientos para identificar los SNP y para realizar el
análisis del desequilibrio de unión sin experimentación excesiva
usando procedimientos bien conocidos.
Estos SNP en desequilibrio de unión también se
pueden usar en los procedimientos de acuerdo con la presente
invención, y más particularmente en los procedimientos diagnósticos
de acuerdo con la presente invención.
Por ejemplo, un locus de unión de la enfermedad
de Crohn se ha cartografiado en una región grande que se expande
18cM en el cromosoma 5q31 (Rioux y col., 2000 y 2001). Usando mapas
de densidad de marcadores en microsatélites y SNP en la región
completa, se encontró fuerte evidencia de desequilibrio de unión
(LD). Habiendo encontrado evidencia de LD, los inventores
desarrollaron un mapa de SNP de densidad ultra alta y estudiaron una
colección más densa de marcadores seleccionados de dicho mapa. El
análisis multilocus definió un haplotipo de riesgo común
caracterizado por SNP múltiples cada uno independientemente asociado
mediante TDT. Estos SNP fueron únicos para el haplotipo del riesgo y
esencialmente idénticos en su contenido informativo en virtud de
estar en LD casi completa entre sí. Las propiedades equivalentes de
estos SNP hacen imposible identificar la mutación causal contenida
en esta región sobre la base solamente de la evidencia genética.
Las mutaciones del gen ATP2B2 responsables del
autismo se pueden identificar por comparación de las secuencias del
gen ATP2B2 procedentes de pacientes que presentaban autismo e
individuos de control. Basándose en la asociación identificada de
los SNP de ATP2B2 y el autismo, el locus identificado se pueden
barrer en busca de mutaciones. En una realización preferida, las
regiones funcionales tales como exones y sitios de corte y empalme,
promotores y otras regiones reguladoras del gen ATP2B2 se barren en
busca de mutaciones. Preferiblemente, los pacientes que presentan
autismo llevan la mutación mostrada como asociada mientras que los
individuos de control no llevan la mutación o alelo asociado con el
trastorno, Podría ser también posible que los pacientes que
presenten autismo lleven la mutación mostrada como asociada con el
autismo con una frecuencia mayor que la de los individuos de
control.
control.
El procedimiento usado para detectar dichas
mutaciones comprende por lo general las siguientes etapas:
amplificación de una región del gen ATP2B2 que comprende un SNP o un
grupo de SNPs asociados con el autismo procedente de muestras de ADB
del gen ATP2B2 procedentes de pacientes con autismo e individuos de
control; secuenciar la región amplificada; comparar las secuencias
de ADN del gen ATP2B2 procedentes de pacientes con autismo e
individuos de control, determinación de mutaciones específicas de
pacientes con autismo.
De este modo, la identificación de una mutación
causal del gen ATP2B2 se puede llevar a cabo por la persona experta
en la técnica sin excesiva experimentación utilizando procedimientos
bien conocidos.
Por ejemplo, se han identificado las siguientes
mutaciones causales en los siguientes ejemplos mediante
procedimientos rutinarios.
Hugot y col. (2001) aplicaron una estrategia de
clonación posicional para identificar variantes génicas con
susceptibilidad a la enfermedad de Crohn en una región del cromosoma
16 previamente encontrada como relacionada con la susceptibilidad a
la enfermedad de Crohn. Para refinar la ubicación de la
susceptibilidad potencial, se genotiparon 26 marcadores en el
microsatélite del locus y se ensayaron respecto de su asociación con
la enfermedad de Crohn usando el ensayo de transmisión en
desequilibrio. Se encontró una asociación fronteriza significativa
entre un alelo del marcador del microsatélite D16S136. Se
seleccionaron once SNP adicionales de las regiones circundantes, y
varios SNP mostraron una asociación significativa. El
SNP5-8 procedente de esta región se encontró
presente en un único exón del gen NOD2/CARD15 y mostró ser variantes
no sinónimas. Esto llevó a los inventores a secuenciar la secuencia
de codificación completa de este gen en 50 pacientes con EC. Se
encontraron adicionalmente dos mutaciones no sinónimas (SNP12 y
SNP13). SNP13 se asoció lo más significativamente
(p=6x10-6) mediante la prueba genealógica de
transmisión del desequilibrio. En otro estudio independiente, se
encontró también la misma variante por secuenciación de la región
codificante de este gen procedente de 12 individuos afectados en
comparación con 4 controles (Ogura y col., 2001). El alelo raro de
SNP13 correspondió a una inserción de 1 pb con predicción de truncar
la proteína NOD2/CARD15. Este alelo también estaba presente en
individuos sanos normales, aunque con una frecuencia
significativamente inferior en comparación con los controles.
De forma similar, Lesage y col. (2002)
realizaron un análisis mutacional de CARD 15 en 453 pacientes con
EC, incluyendo 166 esporádicos y 287 casos familiares, 159 pacientes
con colitis ulcerosa (CU), y 103 sujetos de control sanos por
secuenciación sistemática de la región codificante. De las 67
variaciones identificadas en la secuencia, 9 tuvieron una frecuencia
del alelo >5% en pacientes con EC. Seis de estos se consideraron
polimorfismos, y tres (SNP12-R702W,
SNP8-G908R, y SNP13-1007fs) se
confirmaron como asociados independientemente con la susceptibilidad
a la EC. También se consideraron mutaciones potenciales causantes de
enfermedad (DCM) 27 mutaciones raras adicionales. Las tres variantes
principales (R702W, G908R, y 1007fs) representaron 32%, 18%, y 31%,
respectivamente del total de mutaciones EC, mientras que el total de
27 mutaciones raras representó el 19% de las DCM. En su conjunto, el
93% de las mutaciones se localizaron en el tercio distal del gen. NO
se encontraron mutaciones asociadas con la CU. Por el contrario, el
50% de los pacientes con EC transportaron al menos una DCM,
incluyendo el 17% que tenían una mutación doble.
La presente invención proporciona también nuevas
dianas y procedimientos para cribar fármacos candidatos o cabeceras.
Los procedimientos incluyen ensayos de unión y/o ensayos
funcionales, y se pueden realizar in vitro, en sistemas
celulares, en animales, etc.
Un objeto particular de esta invención reside en
un procedimiento para seleccionar compuestos biológicamente activos,
comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto in vitro
un compuesto de ensayo con un gen o de polipéptido ATP2B2 de acuerdo
con la presente invención y determinar la capacidad de dicho
compuesto de ensayo para unirse a dicho gen o de polipéptido ATP2B2.
Al unirse a dicho gen o de polipéptido proporciona una indicación de
la capacidad del compuesto para modular la actividad de dicha diana,
y de esta forma afectar una ruta que conduce al autismo en un
sujeto. En una realización preferida, el procedimiento comprende
poner en contacto un compuesto de ensayo in vitro con un
polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo de acuerdo con la
presente invención y determinar la capacidad de dicho compuesto de
ensayo para unirse a dicho polipéptido ATP2B2 o fragmento. El
fragmento comprende preferiblemente un sitio de unión del
polipéptido ATP2B2. Preferiblemente, dicho gen o de polipéptido
ATP2B2 o fragmento del mismo es un gen o de polipéptido de ATP2B2
alterado o mutado o fragmento del mismo que comprende la alteración
o mutación.
Un objeto particular de esta invención reside en
un procedimiento para seleccionar compuestos activos para el
autismo, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto in
vitro un compuesto de ensayo con un polipéptido ATP2B2 de
acuerdo con la presente invención o un fragmento del mismo que
contiene el sitio de unión y determinar la capacidad de dicho
compuesto de ensayo para unirse a dicho polipéptido ATP2B2 o
fragmento del mismo. Preferiblemente, dicho polipéptido ATP2B2 o un
fragmento del mismo es un polipéptido ATP2B2 alterado o mutado o un
fragmento del mismo que comprende la alteración o mutación.
En una realización particular adicional, el
procedimiento comprende poner en contacto una célula hospedadora
recombinante que expresa un polipéptido ATP2B2 de acuerdo con la
presente invención con un compuesto de ensayo, y determinar la
capacidad de dicho compuesto de ensayo para unirse a dicho ATP2B2 y
para modular la actividad del polipéptido ATP2B2. Preferiblemente,
dicho polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo es un polipéptido
ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende la
alteración o mutación.
La determinación de la unión se puede llevar a
cabo por diferentes técnicas, tales como etiquetado del compuesto de
ensayo, por competición con un ligando de referencia marcado,
etc.
Un objeto adicional de esta invención reside en
un procedimiento para seleccionar compuestos biológicamente activos,
dicho procedimiento comprende poner en contacto in vitro un
compuesto de ensayo con un polipéptido ATP2B2 de acuerdo con la
presente invención y determinar la capacidad de dicho compuesto de
ensayo para modular la actividad de dicho polipéptido ATP2B2.
Preferiblemente, dicho polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo
es un polipéptido ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo
que comprende la alteración o
mutación.
mutación.
Un objeto adicional de esta invención reside en
un procedimiento para seleccionar compuestos biológicamente activos,
dicho procedimiento comprende poner en contacto in vitro un
compuesto de ensayo con un gen ATP2B2 de acuerdo con la presente
invención y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo
para modular la expresión de dicho gen ATP2B2. Preferiblemente,
dicho gen ATP2B2 o un fragmento del mismo es un gen alterado o
mutado ATP2B2 o un fragmento del mismo que comprende la alteración o
mutación.
En otra realización, esta invención se refiere a
un procedimiento para cribar, seleccionar o identificar compuestos
activos, particularmente compuestos activos para el autismo,
comprendiendo el procedimiento poner en contacto un compuesto de
ensayo con una célula hospedadora recombinante que comprende una
construcción indicadora, comprendiendo dicha construcción indicadora
un gen indicador bajo el control de un promotor del ATP2B2 y
seleccionar los compuestos de ensayo que modulan (por ejemplo,
estimulan o reducen) la expresión del gen informador.
Preferiblemente, dicho gen informador de ATP2B2 o un fragmento del
mismo es un gen promotor de ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento
del mismo que comprende la alteración o mutación.
En una realización particular de los
procedimientos de cribado, la modulación es una inhibición. En otra
realización particular de los procedimientos de cribado, la
modulación es una activación.
Los ensayos de cribado anteriores se pueden
llevar a cabo en cualquier dispositivo adecuado, como placas, tubos,
platos, frascos, etc. Típicamente, el ensayo se realiza en placas
multipocillo. Se pueden ensayar varios compuestos de ensayo en
paralelo. Adicionalmente, el compuesto de ensayo puede tener
orígenes, naturaleza y composición diferentes. Puede ser cualquier
sustancia orgánica o inorgánica, como un lípido, péptido,
polipéptido, ácido nucleico, molécula pequeña, etc., aislada o
mezclada con otras sustancias. Los compuestos pueden ser todo o
parte de una biblioteca combinatoria de productos, por ejemplo.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención se darán a conocer en la siguiente sección experimental,
que debe tomarse como ilustrativa y no limitante del alcance de la
presente solicitud.
Se describen aquí productos para uso en
diagnóstico, o cribado. Estos productos comprenden moléculas de
ácido nucleico que codifican un polipéptido ATP2B2 o un fragmento
del mismo, vectores que comprenden el mismo, células hospedadoras
recombinantes y polipéptidos expresados.
Más particularmente, se describen un gen ATP2B2
alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende dicha
alteración o mutación. Se dan a conocer adicionalmente moléculas de
ácido nucleico que codifican un polipéptido ATP2B2 alterado o mutado
o un fragmento del mismo que comprende dicha alteración o mutación.
Dicha alteración o mutación modifica la actividad de ATP2B2. La
actividad modificada puede estar aumentada o disminuida. Se describe
adicionalmente un vector que comprende un gen de ATP2B2 alterado o
mutado o un fragmento del mismo que comprende dicha alteración o
mutación de una molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que
comprende dicha alteración o mutación, células hospedadoras
recombinantes y polipéptidos expresados.
Se describe adicionalmente un vector que
comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido ATP2B2 tal
como se ha definido en el presente documento. El vector puede ser un
vector de clonación o, más preferiblemente, un vector de expresión,
es decir, un vector que comprende secuencias reguladoras que
originan la expresión de un polipéptido ATP2B2 a partir de dicho
vector en una célula hospedadora competente.
Estos vectores se pueden usar para expresar un
polipéptido ATP2B2 in vitro, ex vivo o in vivo,
para crear animales no humanos transgénicos o "con genes
desactivados" para amplificar los ácidos nucleicos, para expresar
ARN de sentido contrario, etc.
Los vectores descritos en el presente documento
típicamente comprenden una secuencia codificante de ATP2B2 de
acuerdo con la presente invención operativamente enlazada a
secuencias reguladoras, por ejemplo, un promotor, un poliA, etc. El
término "operativamente enlazada" indica que las secuencias
codificantes y regulatorias están funcionalmente asociadas de forma
que las secuencias reguladoras original la expresión (por ejemplo,
transcripción) de las secuencias codificantes. Los vectores pueden
comprender adicionalmente uno o varios orígenes de replicación y/o
marcadores seleccionables. La región del promotor puede ser homóloga
o heteróloga con respecto a la secuencia codificante, y puede
proporcionar una expresión específica ubicua, constitutiva, regulada
y/o específica del tejido, en cualquier célula hospedadora adecuada,
incluyendo el uso in vivo. Los ejemplos de promotores
incluyen promotores bacterianos (T7, pTAC, promotor Trp, etc.),
promotores víricos (LTR, TK, CMV-IE, etc.),
promotores de genes de mamífero (albúmina, PGK, etc), y
similares.
El vector puede ser un plásmido, un virus, un
cósmido, un fago, un BAC, un YAC, etc. Los vectores plásmidos se
pueden preparar a partir de vectores comerciales tales como
pBluescript, pUC, pBR, etc. Los vectores víricos se pueden producir
a partir de baculovirus, retrovirus, adenovirus, VAA, etc., de
acuerdo con las técnicas de ADN recombinante conocidas en la
técnica.
A este respecto, se describe un virus
recombinante que codifica un polipéptido ATP2B2 tal como se ha
definido anteriormente. El virus recombinante es preferiblemente
defectivo para la replicación, más preferiblemente seleccionado a
partir de adenovirus defectivos en E1- y/o E4-, Gag-, pol- y/o
retrovirus defectivos en env y VAA defectivos en Rep- y/o Cap-.
Dichos virus recombinantes se pueden producir por técnicas conocidas
en la técnica, tales como transfectar células de empaquetado o por
transfección transitoria con plásmidos o virus auxiliares Ejemplos
típicos de células de empaquetado de virus incluyen células PA317,
células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Los protocolos
detallados para producir estos virus recombinantes defectivos para
la replicación, por ejemplo, en los documentos WO95/14785,
WO96/22378, US5.882.877, US6.013.516, US4.861.719, US5.78.056 y
WO94/19478.
Otro objeto adicional de la presente revelación
reside en una célula hospedadora recombinante que comprende un gen o
un vector ATP2B2 recombinante tal como se ha definido anteriormente.
Las células hospedadoras adecuadas incluyen, sin limitación, células
procariotas (como bacterias) y células eucariotas (como células de
levadura, células de mamífero, células de insecto, células de
plantas, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E. coli, levaduras
Kluyveromyces o Saccharomyces, líneas de células de mamífero (por
ejemplo, células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.)
así como cultivos de células de mamífero primarios o establecidos
(por ejemplo, producidos a partir de fibroblastos, células
embriónicas, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos,
etc.).
Se describe adicionalmente un procedimiento para
producir una célula hospedadora recombinante que expresa un
polipéptido ATP2B2 como se ha definido en el presente documento,
comprendiendo dicho procedimiento (i) introducir in vitro o
ex vivo en una célula hospedadora competente un ácido
nucleico o vector recombinante como se ha descrito anteriormente,
(ii) cultivar in vitro o ex vivo las células
hospedadoras recombinantes obtenidas y (iii), opcionalmente,
seleccionar las células que expresan el polipéptido ATP2B2.
Dichas células hospedadoras recombinantes pueden
usarse para la producción de los polipéptido ATP2B2, así como para
el cribado de moléculas activas, como se describe más adelante.
Dichas células también se pueden usar como sistema modelo para
estudiar el autismo. Estas células se pueden mantener en medios de
cultivo adecuados, tales como DMEM, RPMI, HAM, etc., en cualquier
dispositivo de cultivo adecuado (placa, frasco, plato, tubo, bolsa,
etc.).
Se aplicó la plataforma GenomeHIP para permitir
la identificación rápida de un gen de susceptibilidad al
autismo.
Brevemente, la tecnología consiste en formar
pares a partir del ADN de individuos relacionados. Cada ADN se marca
con una etiqueta específica para permitir su identificación. A
continuación se forman híbridos entre ambos ADN. Seguidamente, se
aplica un procedimiento (documento WO00/53802) particular que
selecciona todos los fragmentos idénticos por descendencia (IBD, por
sus siglas en ingles) procedentes de ambos ADN en un procedimiento
multietapa. El ADN restante enriquecido por IBD se puntúa a
continuación frente a una matriz de ADN derivada de un clon BAC que
permite ubicar la fracción IBD en un cromosoma
La aplicación de este procedimiento a varias
familias diferentes da como resultado una matriz de fracciones IBD
para cada par procedente de cada familia. A continuación, el
análisis estadístico calcula las regiones mínimas IBD compartidas
entre todas las familias ensayadas. Se evidencian los resultados
significativos (valores p) para la unión entre la región positiva y
el rasgo de interés (aquí, el autismo). El intervalo relacionado
puede delimitarse mediante los dos clones más distantes que muestran
valores significativos.
En el presente estudio, 114 familias
estadounidenses (114 parejas de hermanos independientes)
concordantes para autismo estricto (según definición mediante
ADI-R) se sometieron al procedimiento GenomeHIP. Las
fracciones de ADN resultantes enriquecidas por IBD se marcaron a
continuación con colorantes fluorescentes de Cy5 y se hibridaron
contra una matriz de ADN constituida por 2263 clones BAC que cubrían
el genoma humano completo con una separación promedio de 1,2
megaparares de bases. Se usó ADN no seleccionado marcado con Cy3
para normalizar los valores de la señal y calcular las relaciones
para cada clon. A continuación, se agruparon los resultados de los
índices para determinar el estado IBD de cada clon y pareja.
Aplicando este procedimiento, se identificó un
clon BAC (FE0DBACAI7ZG05v) que mostró evidencias sugerentes de
relación con el autismo (p=6,4e-05). La región de
unión se expandía aproximadamente 2,18 megaparares de bases en la
región del cromosoma 3 (bases 9283670 a 11464577) tal como se
definió por los clones 3 proximal y distal del clon BAC que mostraba
evidencia sugerente de relación. Se usó el valor p de
7,4E-04 para evidencia sugerente de relación según
propuesta de Kruglyak y Lander (1995) para barridos de genoma
completo en rasgos
complejos.
complejos.
Tabla 2: Resultados de relación para el
cromosoma 3 del locus ATP2B2: se indica la región correspondiente al
clon BAC con evidencia de relación. Las posiciones de inicio y
parada de los clones correspondiente a sus ubicaciones genómicas
están basadas en el NCBI Build34 con respecto al inicio del
cromosoma (p-ter).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por cribado de las 2,18 megabases anteriormente
mencionadas en la región cromosómica relacionada, los inventores
identificaron la ATPasa2 de la membrana plasmática transportadora de
Ca++ (ATP2B2) como candidato para el autismo y fenotipos
relacionados. Este gen sin duda está presente en el intervalo
crítico, con evidencia de la relación delimitada por los clones
detallados anteriormente.
El gen ATP2B2 codifica un polipéptido de 1243
aminoácidos predicho para la isoforma NP_001001331, (ARNm
NM_001001331, 6821 pb) y se expande en 380 kb de secuencia genómica.
Se han identificado las variantes de transcripción mediante corte y
empalme alternativo codifican diferentes isoformas de este gen. La
proteína codificada por este gen pertenece a la familia de las
ATPasa transportadoras de cationes (Tipo P), subfamilia tipo IIB, y
se caracteriza por la formación de in intermedio de fosfato de
aspartilo durante el ciclo de reacción. Estas enzimas retiran los
iones de calcio divalente de las células eucariotas contra
gradientes de concentración muy grandes, y tienen un papel crítico
en la homeostasis del calcio intracelular.
Zaccharias y col (1997) emplearon la hibridación
in situ para determinar el modelo de expresión de cuatro
isoformas de la PMCA humana en el hipocampo humano. Los ARNm de
PMCA1 y 3 se expresaron débilmente durante la formación hipocámpica,
mientras que la expresión del ARNm de PMCA2 y 4 mostraron
diferencias regionales con niveles aumentados en CA2 y en la
circunvolución dentada.
Para analizar el papel fisiológico de PMCA2,
Kozel y col. (1998) produjeron ratones deficientes en PMCA2 mediante
direccionamiento genético. Los ratones homocigóticos con PMCA2
inactivado crecieron más lentamente que los heterocigóticos y los de
tipo natural, y mostraron un modo de andar no estacionario y
dificultades para mantener el equilibrio. El análisis histológico
del cerebelo y oído interno de los ratones mutantes y de tipo
natural mostró que los mutantes inactivados tenían un número
ligeramente aumentado de neuronas de Purkinje (en las que PMCA2 se
expresa fuertemente), una disminución en el espesor de la capa
molecular, una ausencia de otoconia en el sistema vestibular, y un
conjunto de anormalidades del órgano de Corti. El análisis de la
respuesta del tronco encefálico evocada por el oído demostró que los
mutantes homocigóticos eran sordos y que los ratones heterocigóticos
tenían una pérdida auditiva significativa. Estos datos demuestran
que PMCA2 es necesario tanto para el equilibrio como para el oído, y
sugieren que puede ser una fuente principal del calcio usado en la
formación y mantenimiento de la otoconia.
Street y col. (1998) informaron de que el gen
que codificaba una la ATPasa2 de la membrana plasmática bomba de
Ca2+ (ATP2B2, también conocida como PMCA2) estaba mutado en dfw. Una
transición de nucleótido A \rightarrow G en el ADN de dfw produce
la sustitución glicina-a-serina en
una posición de aminoácido muy conservada, mientras que en un
segundo alelo, dfw2J, una delección de 2 pares de bases origina un
desplazamiento de marco que predice una proteína truncada. En la
cóclea, la proteína ATP2B2 se ubica en los estereocilios y en la
pared basolateral de las células pilosas en los ratones de tipo
natural, pero no se detectó en los ratones dfw2J. Esto indica que la
mutación en ATP2B2 puede causar sordera y desequilibrio al afectar
la transducción sensorial en los estereocilios así como la
liberación de neurotransmisores desde la membrana basolateral.
Ueno y col. (2002) identificaron ratones con una
transición de nucleótido en el gen PCMA2 que produjo el cambio de
ácido glutámico a lisina. Los ratones mostraron defectos en el
comportamiento como temblor grave, movimiento del cuello arriba y
abajo y a derecha e izquierda sin coordinación. Puesto que PMCA2 se
expresa en el cerebelo y tiene un papel importante en el
mantenimiento de la homeostasis del Ca2+ intracelular como bomba de
Ca2+, el defecto en el comportamiento se puede adscribir al
desequilibrio en la regulación del Ca2+ en las neuronas del
cerebelo. Para confirmar el defecto en la homeostasis del Ca2+ en
los ratones mutantes, se midieron cambios importantes inducidos por
K+ en la concentración de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) en las
neuronas del cerebelo. La tasa de aumento en [Ca2+] i durante la
despolarización importante inducida por K+ se redujo
significativamente, y la tasa de extrusión del [Ca2+]i incrementada
también se redujo. Estos resultados sugieren que los canales del
Ca2+ controlados por voltaje estaban regulados en defecto en el
ratón mutante para regular la [Ca2+]i respecto de la homeostasis
normal. Los defectos en el comportamiento se pueden adscribir a la
homeostasis del Ca2+ regulada en defecto puesto que los cambios
dinámicos en la [Ca2+]i son importantes para varias funciones
neuronales 2.
Kozel y col. (2002) teorizaron que PMCA2 podría
ser el primer gen con una proteína mutada conocida producida que
confería susceptibilidad a la pérdida de audición debido al
ruido.
La pérdida auditiva bilateral o sordera de
pronunciada a profunda fue diagnosticada en casos de trastornos
autistas, representando una prevalencia considerable por encima de
la población en general y comparable a la prevalencia encontrada en
poblaciones con retraso mental (Rosenhall, y col. 1999). La pérdida
auditiva de suave a moderada se diagnosticó en el 7,9% y la pérdida
auditiva unilateral en el 1,6% de los que se ensayaron
adecuadamente. Los déficits auditivos en el autismo se produjeron en
tasas similares para todos los niveles de funcionamiento
intelectual, por lo que no parece que la covariación junto con
afectación intelectual per se pueden representar toda la varianza
del déficit auditivo en el autismo. La hiperacusia fue habitual,
afectando un 18,0% del grupo autista y un 0% en un grupo de
comparación no autista de edad similar. Además, la tasa de otitis
media serosa (23,5%) y pérdida auditiva relacionada con la conducta
(18,3%) parecieron aumentar en el trastorno autístico.
Hallazgos recientes en niños y adultos autistas
informados por Boddaert y col. (2003, 2004) sugieren que las
respuestas comportamentales inadecuadas a los sonidos y al lenguaje
típicamente vistas en el autismo podrían deberse al procesamiento
anormal de la corteza auditiva.
Los hallazgos de Kurnellas y col. (2005)
sugieren que una reducción en el nivel o la actividad de PMCA2 que
lleva a retraso en el aclaramiento del calcio puede causar daño
neuronal y pérdidas en la médula espinal.
Tomados en su conjunto, los resultados de
relación proporcionados en la presente solicitud, que relacionen el
gen ATP2B2 humano en el intervalo crítico de las alteraciones
genéticas con el autismo en el cromosoma 3, con implicación en la
función neuronal y pérdida auditiva, hacen concluir a los inventores
que las alteraciones (por ejemplo, mutaciones y/o polimorfismos) en
el gen ATP2B2 o en sus secuencias reguladoras puede contribuir al
desarrollo de autismo humano y representa una diana novedosa para el
diagnóstico o la intervención terapéutica.
Las mismas familias que habían participado en el
estudio de relación también se usaron para ensayar la asociación
entre un fenotipo específico (aquí, el autismo) en cuestión, y el
alelo marcador genético o haplotipos que contienen un alelo marcador
específico mediante el ensayo de transmisión del desequilibrio
(TDT). El TDT es una potente prueba de asociación puesto que es
insensible a los problemas de estratificación de la población en la
muestra ensayada. En breve, se ensaya la segregación de los alelos
procedentes de padres heterocigóticos en su progenie afectada. La
porción de alelos transmitidos a la progenie afectada en comparación
con los alelos no transmitidos se compara con la relación esperada
para una distribución aleatoria. Un exceso significativo de
transmisión del alelo sobre el valor esperado es una evidencia de la
asociación del alelo o haplotipo respectivo con el fenotipo autista
estudiado.
Los resultados de este análisis muestran que
algunos alelos del gen ATP2B2 están positivamente asociados con el
autismo y por tanto aumentan la susceptibilidad a la enfermedad. En
la población ensayada, el alelo 1 (A) de SNP22 está correlacionado
con el autismo según se determina mediante TDT (valor p = 0,0476). A
diferencia de lo anterior, el alelo 2 (G) de SNP22 está
significativamente menos transmitido a los individuos autistas lo
que demuestra que este alelo ayuda a protegerse de la
enfermedad.
En la Tabla 3 se proporcionan ejemplos de la
transmisión de alelos a los autistas.
Además, se construyeron haplotipos para SNP21,
SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y SNP74 para identificar la
fase de todos los SNP.
Los resultados de este análisis en la población
ensayada mostraron que algunos haplotipos, todos caracterizados por
la presencia del alelo 2 (T) en SNP21, del alelo 1 (A) en SNP22 o
del alelo 2 (T) en SNP28 estaban significativamente asociados con el
autismo, mientras que algunos haplotipos desprovistos de los alelos
2 (T), 1 (A) o 2 (T), respectivamente, preferentemente no se
transmiten a los autistas. Un ejemplo es el haplotipo
2-1 (T-C) de
SNP21-SNP46, p = 0,001644. Los haplotipos que llevan
el alelo 1 (C) en lugar del alelo 2 (T) en SNP21 o el alelo 1 (C) en
lugar del alelo 2 (T) en SNP 28 muestran evidencia significativa
estar menos representados en sujetos autistas. Un ejemplo es el
haplotipo 1-1 (C-A) de
SNP28-SNP61, p = 0,008087.
En la Tabla 4 se proporcionan ejemplos de
haplotipos con transmisión preferente y sin transmisión a los
autistas.
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<110> INTEGRAGEN
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<120> GEN HUMANO DE SUSCEPTIBILIDAD AL
AUTISMO QUE CODIFICA UNA PROTEÍNA TRANSMEMBRANA Y SUS USOS
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<130> B0359WO
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<160> 10
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 6821
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (320)..(4051)
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<223>
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 1243
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1001
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> SNP21
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (501)..(501)
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<223> C/T
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 537
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> SNP22
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (464)..(464)
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<223> C/T
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<400> 4
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<210> 5
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> SNP28
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<220>
<221 > misc_feature
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<222> (562)..(562)
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<223> C/T
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 401
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<223> SNP39
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (201)..(201)
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<223> C/T
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 1001
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> SNP46
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (501)..(501)
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<223> A/G
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 837
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> SNP61
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<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (337)..(337)
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<223> C/T
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 401
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> SNP73
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<222> (201)..(201)
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<223> C/T
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<400> 9
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<210> 10
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<223> SNP74
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<222> (201)..(201)
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<223> A/C
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<400> 10
Claims (13)
1. Un procedimiento in vitro para
detectar la presencia o predisposición al autismo en un sujeto,
comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de una
alteración en el gen ATP2B2 en una muestra procedente del
sujeto.
2. Un procedimiento in vitro para
detectar la protección del autismo en un sujeto, comprendiendo el
procedimiento detectar la presencia de una alteración en el gen
ATP2B2 en una muestra procedente del sujeto.
3. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, en el que la presencia de una
alteración en el gen ATP2B2 se detecta por secuenciación,
hibridación selectiva y/o amplificación selectiva.
4. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, en el que dicha alteración es
uno o varios SNP(s) o un haplotipo de SNP asociado con el
autismo.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que dicho haplotipo asociado con el autismo comprende varios SNP
seleccionados entre el grupo constituido por of SNP21 (SEC. DE ID.
Nº:3), SNP22 (SEC. DE ID. Nº:4), SNP28 (SEC. DE ID. Nº:5), SNP39
(SEC. DE ID. Nº: 6), SNP46 (SEC. DE ID. Nº:7), SNP61 (SEC. DE ID.
Nº:8), SNP73 (SEC. DE ID. Nº:9) y SNP74 (SEC. DE ID. Nº: 10).
6. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que dicho SNP asociado con el autismo es SNP22.
7. Un procedimiento para seleccionar compuestos
biológicamente activos sobre el autismo, dicho procedimiento
comprende poner en contacto a compuesto de ensayo con un polipéptido
o gen ATP2B2 o un fragmento del mismo y determinar la capacidad de
dicho compuesto de ensayo para unirse al polipéptido o gen ATP2B2 o
un fragmento del mismo.
8. Un procedimiento para seleccionar compuestos
biológicamente activos sobre el autismo, dicho procedimiento
comprende poner en contacto una célula hospedadora recombinante que
expresa un polipéptido ATP2B2 con un compuesto de ensayo, y
determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para unirse a
dicho polipéptido ATP2B2 y modular la actividad del polipéptido
ATP2B2.
9. Un procedimiento para seleccionar compuestos
biológicamente activos sobre el autismo, dicho procedimiento
comprende poner en contacto a compuesto de ensayo con un ATP2B2 gene
y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para modular
la expresión de dicho gen dicho ATP2B2.
10. Un procedimiento para seleccionar compuestos
biológicamente activos sobre el autismo, dicho procedimiento
comprende poner en contacto a compuesto de ensayo con una célula
hospedadora recombinante que comprende una construcción informadora,
comprendiendo dicha construcción informadora un gen informador bajo
el control de un promotor del gen ATP2B2, y seleccionar los
compuestos de ensayo que modulan (por ejemplo, estimulan o reducen)
la expresión del gen informador.
11. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que
dicho gen o polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo es un gen o
polipéptido ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que
comprende la alteración o mutación.
12. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en el que
dicha modulación es una activación.
13. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en el que
dicha modulación es una inhibición.
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