ES2350851T3 - Gen humano de susceptibilidad al autismo que codifica una proteína transmembrana y sus usos. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro para detectar la presencia o predisposición al autismo en un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra procedente del sujeto.

Description

Gen humano de susceptibilidad al autismo que codifica una proteína transmembrana y sus usos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a los campos de la genética y la medicina.

Antecedentes de la invención

El autismo es un trastorno del desarrollo neuropsiquiátrico caracterizado por desequilibrios en la interacción social recíproca y en la comunicación verbal y no verbal, modelos estereotipados y restringidos de intereses y actividades y la presencia de anormalidades en el desarrollo sobre los 3 años de edad (Bailey y col., 1996). En su estudio pionero de descripción del autismo infantil, Kanner (1943) incluyó los siguientes síntomas: afectación del lenguaje, falta de contacto visual, falta de interacción social, comportamiento repetitivo, y una necesidad insoslayable de rutina. Resaltó que, en la mayor parte de los casos, el comportamiento del niño era anormal desde su temprana infancia. Sobre esta base, sugirió la presencia de un defecto de nacimiento, presumiblemente genético. Un año después, Hans Asperger en Alemania describió pacientes similares y denominó la dolencia como "psicopatía autística".

El autismo se define mediante criterios comportamentales, sin embargo, no se conocen marcadores biológicos específicos para diagnosticar la enfermedad. La imagen clínica del autismo varía en gravedad, y está modificada por muchos factores, entre los que se incluyen educación, capacidad y temperamento. Además, la imagen clínica cambia durante el curso de la enfermedad en el propio individuo. Además, el autismo está frecuentemente asociado a otros trastornos, como el trastorno por déficit de atención, coordinación motora y síntomas psiquiátricos como la ansiedad y la depresión. Hay evidencias de que el autismo puede también abarcar trastornos epilépticos, metabólicos e inmunológicos. En línea con el reconocimiento clínico de la variabilidad, en la actualidad hay acuerdo general de que existe un espectro de trastornos autísticos, que incluyen individuos en todos los niveles de inteligencia y capacidad lingüística extendiéndose a todos los grados de gravedad.

Parte del espectro autista, pero considerado un grupo especial, el síndrome de Asperger (SA). SA se distingue del trastorno autístico por la falta de un retraso sínicamente significativo en el desarrollo del lenguaje en presencia de afectación de la interacción social y comportamientos restrictivos, intereses y actividades repetitivos que caracterizan los trastornos del espectro autistas (TEA).

Los TEA son tipos de trastornos generalizados del desarrollo (TGD). El TGD "no especificado adicionalmente" (TGD-NE) se usa para clasificar a los niños que no cumplen los criterios estrictos del autismo pero están cerca, tanto por manifestar síntomas típicos del autismo o por casi cumplir los criterios diagnósticos en dos o tres áreas clave.

Para estandarizar el diagnóstico del autismo, la Organización Mundial de la Salud (International Classification of Diseases, 10ª Revisión (CIE-10), 1992) y la American Psychiatric Association (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4ª edición (DSM-IV), 1994). han definido los criterios diagnósticos. Se ha desarrollado una Entrevista diagnóstica de autismo (Autism Diagnostic Interview, ADI) (Le Couteur y col., 1989; Lord y col., 1994). La ADI es la única herramienta diagnóstica disponible para diagnosticar el TEA que se ha normalizado, probado rigurosamente y es universalmente reconocida. La ADI es una entrevista semiestructurada con puntuación de los padres basada en el listado de criterios CIE-10 y DSM-IV para el diagnóstico del autismo. Se centra en el comportamiento en tres áreas principales: calidades de la interacción social recíproca; comunicación y lenguajes; e intereses y comportamiento restrictivo y repetitivo. Con estos criterios, el autismo ya no se considera un trastorno raro. Se ha informado de tasas elevadas de 10-12 casos por 10.000 individuos en los estudios más recientes (Gillberg y Wing, 1999) en comparación con la tasa de prevalencia anteriormente informada de 4-5 pacientes por 10.000 individuos según los criterios de Kanner (Folstein y Rosen-Sheidley, 2001). Las estimaciones de la tasa de prevalencia para el espectro completo de trastornos autistas son de 1, a 2, veces mayores. Los informes de una tasa de aparición en varones cuatro veces superior a la aparición en mujeres son consistentes. El retraso mental está presente en entre el 25% y el 40% de los casos con (Baird y col. 2000; Chakrabarti y Fombonne, 2001). En cerca del 10% de la población se observan dolencias médicas adicionales que implican el cerebro. (Gillberg y Coleman, 2000).

Los mecanismos subyacentes al aumento en los casos informados de autismo son desconocidos. Se ha debatido intensamente sobre si esta diferencia refleja un aumento en la prevalencia del autismo, el cambio gradual en los criterios diagnósticos, un reconocimiento de la mayor variabilidad de la expresión de la dolencia, o un aumento en la conciencia del trastorno. Además, existe una extendida percepción entre el público de que el aumento aparente se debe principalmente a factores ambientales (Nelson, 1991; Rodier y Hyman, 1998). Sin embargo, parece que la mayor parte del aumento en la prevalencia se puede explicar por una aplicación de los criterios diagnósticos, en combinación con una explicación más amplia de dichos criterios.

Aunque existen tratamientos eficaces para mejorar la dolencia, no existe cura, y los beneficios del tratamiento tienden a ser modestos. Se han obtenido resultados prometedores en algunos programas mediante diferentes estrategas del comportamiento y el desarrollo. Entre las más prometedoras están los programas basados en el análisis aplicado del comportamiento (ABA). Parece que varias medicaciones mejoran algunos síntomas asociados al autismo, incrementando de esta forma la capacidad del individuo para beneficiarse de intervenciones sobre el comportamiento y el desarrollo. Los agentes más extensamente estudiados son los antagonistas de la dopamina. Varios estudios sugieren la utilidad de varios inhibidores selectivos de la recepción de la serotonina.

Se ha publicado una revisión titulada "The genetics of autism" por S.J Spence (Seminars in Pediatric Neurology, vol. 11, nº 3, Septiembre de 2004 (2004-09), páginas 196-204).

Se han realizado tres estudios en gemelos para estimar la posibilidad de heredar el autismo (Folstein y Rutter, 1977; Bailey y col., 1995; Steffenburg y col., 1989). Se estudiaron todos los gemelos que vivían en una población geográficamente definida. En el estudio combinaron, se estudiaron 36 gemelos monocigóticos (MZ) y 30 dicigóticos (DZ). La tasa de posibilidad de herencia dar concordancia MZ promedio es del 70% comparada con la tasa en DZ del 0%. Se calculó una posibilidad de herencia superior al 90% según la tasa de concordancia de MZ a DZ y el riesgo de recurrencia entre hermanos se ha estimado en cerca del 2%-4% (Jorde y col., 1991 Szatmari y col., 1998). Los estudios de familiares no autistas mostraron claramente que las características de los TEA aparecían más a menudo entre familiares de niños autistas que entre los padres de los controles incluyendo reticencia social, dificultades para la comunicación, preferencia por las rutinas y dificultades con el cambio (Folstein y Rutter, 1977). El inicio tardío del habla y las dificultades en la lectura son también más frecuentes entre los miembros de las familias de los individuos con autismo, así como depresión recurrente, trastornos de ansiedad, serotonina elevada en plaquetas y aumento del perímetro craneal (Folstein y Rosen-Sheidley, 2001).

La incidencia del autismo disminuye significativamente al disminuir el grado de parentesco respecto del individuo afectado, indicando que es improbable que un modelo de gen único explique la mayor parte de los casos de autismo (Jorde y col., 1990). Un análisis con segregación informado fue más consistente con un modelo poligénico de la herencia (Jorde y col., 1991). El modelo genético más parsimonioso es uno en el que varios genes interactúan con otro para producir el fenotipo del autismo (Folstein y Rosen-Sheidley, 2001).

Una considerable evidencia indirecta indica un posible papel de la autoinmunidad en el autismo. Un estudio encontró más miembros de la familia con enfermedades autoinmunes en familias con un probando autista en comparación con probandos de control (Comi y col., 1999). Unos pocos estudios informan que los haplotipos del locus del Complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) presentes en algunos niños con autismo, o en sus madres, podría predisponer a sus hijos autistas a la autoinmunidad (Burger y Warren, 1998). En dos estudios, se encontraron autoanticuerpos frente a algunos tejidos y proteínas cerebrales, incluyendo la proteína básica mielina, proteínas neurofilamentosas y epitelio vascular más a menudo en niños con autismo en comparación con los controles (Singh y col., 1993; Connolly y col., 1999; Weizman y col., 1982).

Aunque la mayor parte de los casos de autismo son consistentes con el mecanismo de oligogenia y epistasis propuesto, se han visto una minoría asociados con anormalidades cromosómicas, y con trastornos con etiologías específicas. Smalley (1997) declaró que aproximadamente de 15 a 37% de los casos de autismo tienen una dolencia médica simultánea, incluyendo del 5 al 14% con un trastorno genético o anomalía cromosómica conocidas. Se ha informado de anomalías cromosómicas que afectan a prácticamente todos los cromosomas humanos. Entre estos se incluyen aneuploidías autosómicas, anomalías de los cromosomas sexuales, delecciones, duplicaciones, translocaciones, cromosomas en anillo, inversiones y cromosomas marcadores (Gillberg, 1998). Son muy frecuentes anormalidades en la región del cromosoma 15 relacionado con el Síndrome de Prader Willi/Angelman. La asociación entre autismo un una dolencia mendeliana o síndrome genético incluyó fenilcetonuria no tratada, síndrome X frágil, esclerosis tuberosa y neurofibromatosis. Recientemente, Carney y col. (2003) identificaron mutaciones en el gen de MECP2 (proteína 2 de unión a metil CpG) en dos mujeres con autismo que no mostraban manifestaciones del síndrome de Rett causadas en el 80% de los casos por mutaciones en el gen de MECP2.

Distintos grupos están realizando barridos genómicos relacionados con el autismo o los fenotipos más amplios del TEA. Este enfoque parece muy prometedor, puesto que es sistemático y exento de modelos al mismo tiempo. Además, ya se ha demostrado que funciona. De esta forma, se han obtenido resultados positivos de relación incluso al analizar grupos de estudio comparativamente pequeños. Más importante, algunos hallazgos ya han sido replicados. El resultado más consistente se obtuvo para el cromosoma 7q, pero también hay un considerable solapamiento en los cromosomas 2q y 16p (Folstein y Rosen-Sheidley, 2001). También se ha realizado un considerable progreso en la identificación de regiones cromosómicas en los cromosomas 15 y X. Se han identificado mutaciones en dos genes relacionados con el X que codifican las neuroliginas NLGN3 y NLGN4 en parientes con trastornos del espectro autista (Jamain y col., 2003). Varias líneas de evidencia respaldan el hecho de que mutaciones en las neuroliginas están implicadas en el trastorno autista. En primer lugar, las mutaciones informadas causan alteraciones graves en la estructura predicha de la proteína. Segundo, se ha informado de delecciones en el Xp22.3 que incluyen NLGN4 en varios niños autistas. Tercero, una mutación de NLGN4 apareció de novo en la madre de un individuo afectado.

Resumen de la invención

La presente invención da a conocer ahora la identificación de un gen humano de susceptibilidad al autismo, que se puede usar para el diagnóstico del autismo, así como para el cribado de fármacos terapéuticamente activos.

La presente invención da a conocer más particularmente la identificación de un gen humano de susceptibilidad al autismo, que se puede usar para el diagnóstico del autismo, así como para el cribado de fármacos terapéuticamente activos. La invención da a conocer más específicamente algunos alelos del gen de la ATPasa2 de la membrana plasmática transportadora de Ca++ (ATP2B2) relacionado con la susceptibilidad al autismo y que representa una diana terapéutica novedosa para intervención terapéutica. La presente invención se refiere a mutaciones particulares en el gen ATP2B2 y en los productos de expresión, así como herramientas diagnósticas y kits basados en dichas
mutaciones.

La invención se puede usar en el diagnóstico de la predisposición, o para protegerse de, detección del autismo, comprendiendo el procedimiento la detección en una muestra procedente del sujeto de la presencia de una alteración en el gen ATP2B2, siendo indicativa la presencia de dicho gen de la presencia o predisposición al autismo. La presencia de dicha alteración puede también ser indicativa de protección del autismo.

Un objeto particular de esta invención reside en un procedimiento para detectar la presencia o predisposición al autismo en un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra procedente del sujeto, siendo indicativa la presencia de dicha alteración de la presencia o la predisposición al autismo.

Un objeto particular adicional al de esta invención reside en un procedimiento para detectar la protección del autismo en un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra procedente del sujeto, siendo indicativa la presencia de dicha alteración de la protección del autismo.

Otro objeto particular descrito reside en un procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un tratamiento para el autismo, comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra procedente del sujeto, siendo indicativa la presencia de dicha alteración de una respuesta particular a dicho tratamiento.

Un objeto particular adicional descrito reside en un procedimiento para evaluar el efecto adverso en un sujeto de un tratamiento para el autismo, comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra del sujeto, siendo indicativa la presencia de dicha alteración de un efecto adverso de dicho tratamiento.

En una realización preferida, dicha alteración es uno o varios SNP(s) o un haplotipo de SNP asociados con el autismo. Más preferiblemente dicho haplotipo asociado con el autismo comprende o está constituido por varios SNP seleccionados entre el grupo constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y SNP74. Aún más preferiblemente, dicho haplotipo se selecciona entre los haplotipos dados a conocer en la Tabla 4. Más preferiblemente, dicho SNP asociado con el autismo puede ser SNP22.

Preferiblemente, la alteración en el locus del gen ATP2B2 de determina mediante la realización de un ensayo de hibridación, un ensayo de secuenciación, un ensayo de microsecuenciación, o un ensayo de amplificación específico del alelo.

Un aspecto particular de esta divulgación reside en composiciones de la materia que comprenden cebadores, sondas y/o oligonucleótidos, que están específicamente diseñados para detectar específicamente al menos un SNP o haplotipo asociados con el autismo en la región genómica incluyendo el gen ATP2B2, o una combinación de los anteriores. Más preferiblemente, dicho haplotipo asociado con el autismo comprende o está constituido por varios SNP seleccionados entre el grupo constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y SNP74. Aún más preferible, dichos haplotipos están seleccionados entre los haplotipos dados a conocer en la Tabla 4. Más preferiblemente, dicho SNP asociado con el autismo puede ser SNP.

Un aspecto adicional de esta invención reside en el cribado de fármacos para terapia del autismo, basada en la modulación o en la unión a un alelo del gen ATP2B2 asociado con el autismo o producto génico del mismo.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Cartografía de alta densidad usando el Perfil de identidad genómica híbrida (GenomeHIP).

Descripción detallada de la invención

La presente invención da a conocer la identificación de ATP2B2 como un gen humano de susceptibilidad al autismo. Varias muestras de ácido nucleico procedentes de 114 familias con autismo se sometieron a un procedimiento GenomeHIP particular. Este procedimiento llevó a la identificación de fragmentos particulares idénticos por descendencia en dichas poblaciones que están alterados en sujetos autistas. Mediante cribado de los fragmentos IBD, los inventores identificaron la ATPasa2 de la membrana plasmática transportadora de Ca++ (ATP2B2) en el cromosoma 3p25.3 como un candidato para el autismo y fenotipos relacionados. Este gen está de hecho presente en el intervalo crítico, y expresa un fenotipo funcional consistente con una regulación genética del autismo. También se identificaron los SNP del gen ATP2B2, puesto que estaban correlacionados con el autismo en sujetos humanos. El SNP22 ubicado en el locus del gen ATP2B2, se encontró asociado con el autismo. Los haplotipos dados a conocer en la Tabla 4 que comprenden varios SNP seleccionados entre el grupo constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y SNP74 también fueron identificados como asociados con el autismo.

La presente invención propone por tanto el uso del gen ATP2B2 y los correspondientes productos de expresión para el diagnóstico, prevención y tratamiento del autismo, así como para el cribado de fármacos terapéuticos activos.

Definiciones

Autismo y trastornos del espectro autista (TEA): el autismo se caracteriza típicamente como parte de un espectro de trastornos (los TEA) entre los que se incluyen el síndrome de Asperger (SA) y otros trastornos generalizados del desarrollo (TGD). El autismo debe considerarse como cualquier estado de afectación de la interacción y comunicación social con modelos repetitivos y estereotipados restringidos del comportamiento, intereses y actividades presente antes de los 3 años de edad, en la extensión en que la salud puede quedar afectada. El SA se distingue del trastorno autístico por la falta de un retraso clínicamente significativo en el desarrollo del lenguaje en presencia de una afectación en la interacción social y comportamientos, intereses y actividades restringidas y repetitivas que caracterizan los trastornos del espectro autista (los TEA). El TGD-NE (TGD, no especificado adicionalmente) se usa para clasificar a los niños que no cumplen los criterios estrictos del autismo pero están cerca, bien por manifestar autismo atípico o por casi cumplir los criterios diagnósticos en dos o tres de las áreas clave.

La invención se puede usar en varios sujetos, particularmente seres humanos, incluyendo adultos, niños y en estado prenatal.

En el contexto de esta invención, el locus del gen ATP2B2 designa todas las secuencias o productos de ATP2B2 en una célula u organismo, incluyendo las secuencias de codificación del ATP2B2, secuencias no codificantes de ATP2B2 (por ejemplo, intrones), secuencias reguladoras de ATP2B2 que controlan la transcripción, la traducción (por ejemplo, un promotor, potenciador, terminador, etc.), ARN y/o proteína de estabilidad, así como todos los correspondientes productos de expresión tal como los ARN de ATP2B2 (por ejemplo, ARN) y los polipéptidos de ATP2B2 (por ejemplo, una preproteína y una proteína madura). El locus del gen ATP2B2 también comprenden las secuencias que rodean al ATP2B2 que incluyen los SNP que están en desequilibrio de unión con los SNP ubicados en el gen
ATP2B2.

Tal como se usa en la presente solicitud, el término "gen ATP2B2" designa el gen de la ATPasa2 de la membrana plasmática transportadora de Ca++ del cromosoma humano 3p25.3, así como sus variantes, análogos y fragmentos, incluyendo alelos del mismo (por ejemplo, mutaciones en la línea germinal) que están relacionados con la susceptibilidad al autismo. El gen ATP2B2 se puede denominar como PMCA2.

El término "gen" debe considerarse que incluye cualquier tipo de ácido nucleico codificante, incluyendo ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc), ADN sintético o semisintético, así como cualquier forma del correspondiente ARN. El término gen incluye particularmente incluye particularmente ácidos nucleicos recombinantes que codifican ATP2B2, es decir, cualquier molécula de ácido nucleico de origen no natural creada artificialmente, por ejemplo, mediante ensamblaje, cortado, ligado o amplificación de secuencias. Un gen ATP2B2 normalmente es bicatenario, aunque se pueden considerar otras formas, como la monocatenaria. Los genes ATP2B2 se pueden obtener de varias fuentes y de acuerdo con diferentes técnicas conocidas en la técnica, como mediante el cribado de genotecas o mediante amplificación a partir de varias fuentes naturales. Los ácidos nucleicos recombinantes se pueden preparar mediante técnicas convencionales, entre las que se incluyen la síntesis química, ingeniería genética, técnicas enzimáticas, o una combinación de las mismas. Las secuencias adecuadas del gen ATP2B2 se pueden concentrar en bancos génicos, tales como Unigene Cluster para ATP2B2 (Hs. 268942) y Unigene Representative Sequence NM_001001331. Un ejemplo particular de un gen ATP2B2 comprende la SEC. DE ID. Nº: 1.

El término "gen ATP2B2" incluye cualquier variante, fragmento o análogo de la SEC. DE ID. Nº 1 o de cualquier secuencia codificante tal como se han identificado anteriormente, por ejemplo, variantes de origen natural debidas a variaciones alélicas entre individuos (por ejemplo, polimorfismos), alelos mutados relacionados con el autismo, formas alternativas de corte y empalme, etc. El término variante incluye también secuencias del gen ATP2B2 procedentes de otras fuentes u organismos. Las variantes son preferiblemente sustancialmente homólogas a la SEC. DE ID. Nº 1, es decir, exhiben una identidad en la secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente un 65%, típicamente de al menos aproximadamente un 75%, preferiblemente de al menos aproximadamente un 85%, más preferiblemente de al menos aproximadamente un 95% con la SEC. DE ID. Nº 1. Las variantes y análogos del gen ATP2B2 también incluyen secuencias de ácidos nucleico que se han hibridado con una secuencia como la que se ha definido anteriormente (o una cadena complementaria de la misma) en condiciones de hibridación restrictivas.

Las condiciones de hibridación restrictivas incluyen temperaturas superiores a 30º C, preferiblemente superiores a 35ºC, más preferiblemente de más de 42ºC, y/o una salinidad inferior a aproximadamente 500 mM, preferiblemente inferior a 200 mM. La persona experta en la técnica puede ajustar las condiciones de hibridación por modificación de la temperatura, salinidad y/o concentración del resto de reactivos tales como SDS, SSC, etc.

Un fragmento de un gen ATP2B2 designa cualquier porción de al menos aproximadamente 8 nucleótidos consecutivos de una secuencia como se ha dado a conocer más arriba, preferiblemente de al menos aproximadamente 15, más preferiblemente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, preferiblemente adicionalmente de al menos 30 nucleótidos. Los fragmentos incluyen todas las longitudes de nucleótidos posibles entre 8 y 100 nucleótidos, preferiblemente entre 15 y 100, más preferiblemente entre 20 y 100.

Un polipéptido ATP2B2 designa cualquier proteína o polipéptido codificado por un gen ATP2B2 como se ha dado a conocer más arriba. El término "polipéptido" se refiere a cualquier molécula que comprende una cadena de aminoácidos. Este término incluye moléculas de varias longitudes, tales como péptidos y proteínas. El polipéptido se puede modificar, como mediante glicosilación y/o acetilaciones y/o reacción química o acoplamiento, y pueden contener uno o varios aminoácidos no naturales o sintéticos. Un ejemplo específico de un polipéptido ATP2B2 comprende todo o parte de la SEC. DE ID. Nº: 2 (NP_001001331).

Las expresiones "respuesta a un tratamiento" se refieren a la eficacia del tratamiento, incluyendo pero sin limitarse a la capacidad de metabolizar un compuesto terapéutico, respecto de la capacidad para convertir un profármaco en un fármaco activo, y a la farmacocinética (absorción, distribución, eliminación) y a la farmacodinámica (relacionada con el receptor) de un fármaco en un individuo.

Las expresiones "respuesta adversa a un tratamiento" se refieren a los efectos adversos de la terapia resultante de las extensiones de la acción farmacológica principal del fármaco o reacciones adversas idiosincráticas resultantes de una interacción del fármaco con factores únicos del hospedador. "Efectos secundarios de un tratamiento" incluyen, pero no se limitan a, reacciones adversas como toxicidades dermatológicas, hematológicas o hepatológicas, e incluye adicionalmente ulceración gástrica e intestinal, perturbación en la función plaquetaria, lesión renal, urticaria generalizada, broncoconstricción, hipotensión y choque.

Diagnóstico

La invención proporciona ahora procedimientos diagnósticos basados en el seguimiento del locus del gen ATP2B2 en un sujeto. En el contexto de la presente invención, el término "Diagnóstico" incluye la detección, seguimiento, dosificación, comparación, etc., en varias etapas, incluyendo etapas tempranas presintomáticas, y etapas tardías, en adultos, niños y previa al nacimiento. El diagnóstico típicamente incluye el pronóstico, la evaluación de una predisposición o riesgo de desarrollo, la caracterización de un sujeto para definir el tratamiento más apropiado (farmacogenética), etc. La presente invención proporciona procedimientos diagnósticos para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar autismo, o padece autismo, resultado de una mutación o un polimorfismo en el gen ATP2B2. La presente invención también proporciona procedimientos para determinar si es probable que un individuo responda positivamente a un agente terapéutico o si un individuo está en riesgo de desarrolla un efecto secundario adverso a un agente terapéutico.

Un objeto particular de esta invención reside en un procedimiento para detectar la presencia de una disposición al autismo, comprendiendo el procedimiento detectar en una muestra procedente del sujeto la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en dicha muestra. La presencia de dicha alteración es indicativa de la presencia o predisposición al autismo. Opcionalmente, dicho procedimiento comprende una etapa previa de proporcionar una muestra de u sujeto. Preferiblemente, la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en dicha muestra se detecta mediante el genotipado de la muestra.

Otro objeto particular de esta invención reside en un procedimiento para detectar la protección frente al autismo en un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra procedente del sujeto, siendo indicativa la presencia de dicha alteración de la protección frente al autismo.

En una realización preferida, dicha alteración es uno o varios SNP(s) o un haplotipo de SNP asociado con el autismo. Más preferiblemente, dicho haplotipo asociado con el autismo comprende o está constituido por varios SNP seleccionados entre el grupo constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y SNP74. Aún más preferiblemente, dicho haplotipo se seleccionan entre los haplotipos dados a conocer en la Tabla 4. Más preferiblemente, dicho SNP asociado con el autismo es SNP22.

Otro objeto particular descrito reside en un procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un tratamiento del autismo, comprendiendo el procedimiento (i) proporcionar una muestra procedente del sujeto y (ii) detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en dicha muestra.

Otro objeto particular descrito reside en un procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un tratamiento del autismo, comprendiendo el procedimiento detectar en una muestra procedente del sujeto la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en dicha muestra. La presencia de dicha alteración es indicativa de una respuesta particular a dicho tratamiento. Preferiblemente, la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en dicha muestra se detecta mediante el genotipado de la muestra.

Otro objeto particular descrito reside en un procedimiento para evaluar los efectos adversos de un sujeto a un tratamiento del autismo, comprendiendo el procedimiento detectar en una muestra procedente del sujeto la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en dicha muestra. La presencia de dicha alteración es indicativa de efectos adversos a dicho tratamiento. Preferiblemente, presencia de una alteración en el gen ATP2B2 de dicha muestra se detecta mediante el genotipado de la muestra.

En una realización preferida, dicha alteración en uno o varios SNP(s) o un haplotipo de SNP asociado con el autismo. Más preferiblemente, dicho haplotipo asociado con el autismo comprende o está constituido por varios SNP seleccionados entre el grupo constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y SNP74. Aún más preferiblemente, dicho haplotipo se selecciona entre los haplotipos dados a conocer en la Tabla 4. Más preferiblemente, dicho SNP asociado con el autismo es SNP22.

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El diagnóstico, que analiza y predice la respuesta a un tratamiento o fármaco, o efectos secundarios para un tratamiento o fármaco, se puede usar para determinar si un individuo debería ser tratado con un fármaco de tratamiento particular. Por ejemplo, si el diagnóstico indica una posibilidad de que un individuo responda positivamente al tratamiento con un fármaco particular, el fármaco se puede administrar al individuo. A la inversa, si el diagnóstico indica que una posibilidad de que un individuo responda negativamente al tratamiento con un fármaco particular, se puede prescribir un curso de tratamiento alternativo. Una respuesta negativa se puede definir tanto por la ausencia de una respuesta eficaz como por la presencia de efectos secundarios tóxicos.

Los ensayos clínicos de fármacos representan otra aplicación de los SNP de ATP2B2. Uno o más SNP de ATP2B2 indicativos de respuesta a un fármaco o a efectos secundarios a un fármaco se pueden identificar usando los procedimientos anteriormente descritos. Posteriormente, los potenciales participantes de un ensayo clínico de dicho agente se pueden cribar para identificar aquellos individuos más propensos a responder favorablemente al fármaco y excluir aquellos que posiblemente experimenten efectos secundarios. De esta forma, se puede medir la eficacia del tratamiento en individuos que respondan al fármaco, sin disminuir la medición como resultado de la inclusión de individuos que no es probable que respondan positivamente en el estudio y sin corres el riesgo de problemas de seguridad no deseables.

La alteración se puede determinar respecto al ADNg, ARN o polipéptido ATP2B2. Opcionalmente, la detección se lleva a cabo por secuenciación de todo o parte del gen ATP2B2 o por hibridación o amplificación selectiva de todo o parte del gen ATP2B2. Más preferiblemente, se lleva a cabo una amplificación específica del gen ATP2B2 antes de la etapa de identificación de la alteración.

Una alteración en el locus del gen ATP2B2 puede ser cualquier forma de mutación(es), delección(es), reordenamiento(s) y/o inserciones en las regiones codificantes y/o no codificantes del locus, solos en o en diferentes combinación(es). Las mutaciones incluyen más específicamente mutaciones puntuales. Las delecciones pueden abarcar cualquier región o dos o más restos en una porción codificante o no codificante del locus del gen, tal como desde dos restos al gen o locus completo. Las delecciones típicas afectan las regiones más pequeñas, como las regiones (intrones) o secuencias o fragmentos repetidos de menos de aproximadamente 50 pares de bases consecutivas, aunque también se pueden producir delecciones más grandes. Las inserciones pueden abarcar la adición de uno o varios restos en una porción codificante o no codificante del locus del gen. Las inserciones típicamente comprenden la adición de entre 1 y 50 pares de bases en el locus del gen. Los reordenamientos incluyen la inversión de secuencias. La alteración en el locus del gen ATP2B2 puede dar como resultado la creación de codones de detención, mutaciones con desplazamiento de marco, sustituciones de aminoácidos, corte y empalme o procesamiento de ARN particular, inestabilidad del producto, producción de polipéptidos truncados, etc. La alteración puede dar como resultado la producción del polipéptido ATP2B2 con una función, estabilidad, direccionamiento o estructura alterados. La alteración puede ser causa también de una reducción en la expresión de la proteína o, alternativamente, un aumento en dicha producción.

En una realización particular del procedimiento de acuerdo con la presente invención, la alteración del locus del gen ATP2B2 se selecciona entre una mutación puntual, una delección o una inserción en el gen ATP2B2 o producto de expresión correspondiente, más preferiblemente una mutación puntual y una delección. La alteración puede determinar se en el ADNg, ARN o polipéptido ATP2B2.

A este respecto, la presente invención da a conocer ahora un SNP del gen ATP2B2 y algunos haplotipos, que incluyen los SNP seleccionados entre el grupo constituido por SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y SNP74, que están asociado con el autismo. Los SNP se recogen en la siguiente Tabla 1.

TABLA 1

1

TABLA 1 (continuación)

2

En cualquier procedimiento de acuerdo con la presente invención, uno o varios SNP del gen ATP2B2 y algunos haplotipos que comprenden SNP del gen ATP2B2 y las regiones circundantes, más particularmente SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y SNP74, se pueden usar en combinación otro SNP o haplotipo asociado con el autismo y ubicado en otro gen o genes.

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En otra variante, el procedimiento comprende detectar la presencia de una alteración en la expresión del ARN de ATP2B2. La alteración en la expresión del ARN incluye la presencia de un procesamiento o corte y empalme alterados en el ARN, la presencia de una alteración en la cantidad del ARN, etc. Estas se pueden detectar mediante varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo la secuenciación de todo o parte del ARN de ATP2B2 o mediante hibridación selectiva o amplificación selectiva de todo o parte de dicho ARN, por ejemplo.

En una variante adicional, el procedimiento comprende detectar la presencia de una alteración en la expresión del polipéptido ATP2B2. La alteración en la expresión del polipéptido ATP2B2 incluye la presencia de una alteración en la secuencia del polipéptido, la presencia de una alteración en la cantidad del polipéptido ATP2B2, la presencia de una alteración en la distribución tisular, etc. Estas se pueden detectar mediante varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo la secuenciación y/o unión a ligandos específicos (como los anticuerpos), por ejemplo.

Como se ha indicado anteriormente, se pueden usar varias técnicas conocidas en la técnica para detectar o cuantificación una alteración del gen ATP2B2 o en la expresión del ARN, incluyendo secuenciación, hibridación, amplificación y/o unión a ligandos específicos (como los anticuerpos). Otros procedimiento adecuados incluyen oligonucleótido específico de alelo (ASO), amplificación específica de alelo, transferencia Southern (para ADN), transferencia Northern para ARN, análisis de conformación monocatenaria, (SSCA), PFGE, hibridación con fluorescencia in situ (FISH), migración en gel, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante, análisis de heteroduplex, protección con RNasa, escisión por desemparejamiento químico, ELISA, radioinmunoensayos (RIE) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA).

Algunos de estos enfoques (por ejemplo, SSCA y CGGE) están basados en una variación en la movilidad electroforética de los ácidos nucleicos, como resultado de la presencia de una alteración en la secuencia. De acuerdo con estas técnicas, la secuencia alterada se visualiza mediante un desplazamiento en la movilidad de los geles. Los fragmentos se pueden secuenciar a continuación para confirmar la alteración.

Otros están basados en la hibridación específica entre los ácidos nucleicos procedentes del sujeto y una sonda específica del gen ATP2B2 o ARN natural o alterado. La sonda puede estar en suspensión o inmovilizada sobre un sustrato. La sonda está típicamente marcada para facilitar la detección de híbridos.

Algunos de estos enfoque son particularmente adecuados para evaluar una secuencia de o nivel de expresión de un polipéptido, como la transferencia Northern, ELISA y RIA. Esto último requiere el uso de un ligando específico del polipéptido, más específicamente de un anticuerpo específico.

En una realización particular y preferida, el procedimiento comprende detectar la presencia de una alteración en el perfil de expresión del gen ATP2B2 en una muestra procedente del sujeto. Como se ha indicado anteriormente, esto se puede llevar a cabo más preferiblemente por secuenciación, hibridación selectiva y/o amplificación selectiva de los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra.

Secuenciación

La secuenciación se puede llevar a cabo mediante técnicas bien conocidas en la técnica, mediante secuenciadores automatizados. La secuenciación se puede llevar a cabo sobre el gen ATP2B2 completo o, más preferiblemente, sobre regiones específicas del mismo, típicamente las conocidas o sospechosas de transportar mutaciones perjudiciales y otras alteraciones.

Amplificación

La amplificación está basada en la formación de híbridos específicos entre secuencias de ácido nucleico complementarias que sirven para iniciar la reproducción de los ácidos nucleicos.

La amplificación se puede llevar a cabo de acuerdo con varias técnicas conocidas en la técnica, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA). Estas técnicas se pueden llevar a cabo con reactivos y protocolos comerciales. Las técnicas preferidas usan PCR específica de alelo o PCR-SSCP. La amplificación usualmente requiere el uso de cebadores específicos de ácidos nucleicos para iniciar la reacción.

Los cebadores de ácido nucleico útiles para amplificar secuencias procedentes del gen o locus de ATP2B2 están disponibles para hibridarse específicamente con una porción del locus del gen ATP2B2 que flanquean una región diana de dicho locus, estando alterada dicha región diana en algunos sujetos que padecen autismo. En la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de dichas regiones diana.

Los cebadores que se pueden usar para amplificar una región diana de ATP2B2 que comprenden los SNP según identificación en la Tabla 1 se pueden diseñar basándose en la secuencia de la SEC. DE ID. Nº 1 o en la secuencia genómica de ATP2B2. En una realización particular, los cebadores se pueden diseñar basándose en la secuencia de la SEC. DE ID. N^{ros} 3-10.

Otro objeto particular de esta revelación reside en un cebador de ácido nucleico útil para amplificar secuencias procedentes del gen o locus de ATP2B2 incluyendo las regiones circundantes. Dichos cebadores son preferiblemente complementarios, y se hibridan específicamente a secuencias de ácido nucleico en el locus del gen ATP2B2. Los cebadores particulares son capaces de hibridarse específicamente con una porción del locus del gen ATP2B2 que flanquean una región diana de dicho locus, estando alterada dicha región diana en algunos sujetos que padecen autismo.

La revelación también se refiere a un cebador de ácido nucleico, siendo dicho cebador complementario de y se hibrida específicamente con una porción de una secuencia codificante de ATP2B2 (por ejemplo, gen o ARN) alterada en algunos sujetos que padecen autismo. A este respecto, los cebadores particulares de esta invención son específicos de las secuencias alteradas del gen o ARN de ATP2B2. Mediante el uso de estos cebadores, la detección de un producto de amplificación indica la presencia de una alteración en el locus del gen ATP2B2. A diferencia de lo anterior, la ausencia de producto de amplificación indica que la alteración específica no está presente en la muestra.

Los cebadores típicos de esta revelación son moléculas de ácido nucleico monocatenarias de aproximadamente 5 a 60 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. La secuencia se puede derivar directamente de la secuencia del locus del gen ATP2B2. Se prefiere una complementariedad perfecta para asegurar una elevada especificidad. Sin embargo, se puede tolerar cierta falta de emparejamiento.

La revelación también se refiere al uso de un cebador de ácido nucleico o un par de cebadores de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente en un procedimiento para detectar la presencia o la predisposición al autismo, en un sujeto, o a un procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un tratamiento del autismo.

Hibridación selectiva

Los procedimientos de detección de la hibridación están basados en la formación de híbridos específicos entre secuencias de ácido nucleico complementarias que sirven para detectar la alteración o alteraciones en las secuencias de ácido nucleico.

Una técnica de detección particular implica el uso de una sonda de ácido nucleico específica de un gen o ARN de ATP2B2 natural o alterado, seguido por la detección de la presencia de un híbrido. La sonda puede estar en suspensión o inmovilizada sobre un sustrato o soporte (como en una matriz de ácidos nucleicos o tecnologías de chip). La sonda está típicamente marcada para facilitar la detección de híbridos.

A este respecto, una realización particular de esta invención comprende poner en contacto la muestra del sujeto con una sonda de ácido nucleico específica de un locus del gen ATP2B2 alterado, y evaluar la formación de un híbrido. En una realización particular y preferida, el procedimiento comprende poner en contacto simultáneamente la muestra con un conjunto de sondas que son específicas, respectivamente, de un locus del gen ATP2B2 de tipo natural y de varias formas alteradas del mismo. En esta realización, es posible detectar directamente la presencia de varias formas de alteraciones en el locus del gen ATP2B2 de la muestra. Igualmente, se pueden tratar en paralelo muestras procedentes de varios sujetos.

En el contexto de esta revelación, una sonda hace referencia a una secuencia de polinucleótidos que es complementaria y capaz de una hibridación específica con un(a) (porción diana de un) gen o ARN de ATP2B2, y que es adecuada para detectar polimorfismos en el polinucleótido asociados con los alelos de ATP2B2 que predisponen o están asociados con el autismo. Las sondas preferiblemente complementarias del gen de ATP2B2, ARN o porción diana de los anteriores. Las sondas típicamente comprenden ácidos nucleicos monocatenarios de entre 8 y 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo entre 10 y 800, más preferiblemente de entre 15 y 700, típicamente de entre 20 y 500. Deberá entenderse que se pueden usar igualmente sondas más largas. Una sonda preferida de esta invención es una molécula de ácido nucleico monocatenario de entre 8 y 500 nucleótidos de longitud, que se puede hibridar específicamente con una región de un gen o ARN de ATP2B2 que lleva una alteración.

Una realización específica de esta revelación es una sonda de ácido nucleico específica de un gen o ARN alterado (por ejemplo, mutado) de ATP2B2, es decir, una sonda de ácido nucleico que específicamente se hibrida a dicho gen o ARN de ATP2B2 mutado y esencialmente no se hibrida con un gen o ARN de ATP2B2 que carezca de dicha alteración. Especificidad indica que la hibridación con la secuencia diana genera una señal específica que se puede distinguir de la señal generada mediante hibridación no específica. Se prefieren secuencias perfectamente complementarias para diseñar sondas de acuerdo con esta revelación. Deberá entenderse, sin embargo, que se puede tolerar un cierto grado de no emparejamiento, siempre que la señal específica se pueda distinguir de la hibridación no específica.

Ejemplos particulares de dichas sondas son secuencias de ácido nucleico complementarias de una porción diana de la región genómica incluyendo el gen o ARN de ATP2B2 que contiene una mutación puntual según la relación de la Tabla 1 anterior. Más particularmente, las sondas pueden comprender una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEC. DE ID. N^{ros} 3-10 o un fragmento de la misma que comprenden el SNP o una secuencia complementaria de la misma.

La secuencia de las sondas se puede derivar de las secuencias del gen y ARN de ATP2B2 según se proporciona en la presente solicitud. Las sustituciones de nucleótidos pueden realizarse, así como las modificaciones químicas de la sonda. Dichas modificaciones químicas se pueden llevar a cabo para incrementar la estabilidad de los híbridos (por ejemplo, grupos intercalantes) o para marcar la sonda. Ejemplos típicos de marcas incluyen, sin limitación, radioactividad, fluorescencia, luminiscencia, marcado enzimático, etc.

La revelación también concierne el uso de una sonda de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente en un procedimiento para detectar la presencia o predisposición al autismo en un sujeto o en un procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un tratamiento del autismo.

Unión de ligando específico

Como se ha indicado anteriormente, también se puede detectar una alteración en el locus del gen ATP2B2 por cribado de la alteración o alteraciones en los niveles de expresión de la secuencia del polipéptido ATP2B2. A este respecto, una realización específica de esta invención comprende poner en contacto la muestra con un ligando específico de un polipéptido de ATP2B2 y determinar la formación de un complejo.

Se pueden usar distintos tipos de ligandos, como anticuerpos específicos. En una realización específica, la muestra se pone en contacto con un anticuerpo específico de un polipéptido de ATP2B2 y se determina la formación de un inmunocomplejo. Se pueden utilizar varios procedimiento para detectar un inmunocomplejo, tales como ELISA, radioinmunoensayos (RIE), y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA).

En el contexto de esta revelación, un anticuerpo designa un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, así como fragmentos o derivados de los mismos que tienen esencialmente la misma especificidad por el antígeno. Los fragmentos incluyen Fab, Fab'2, regiones CDR, etc. Los derivados incluyen anticuerpos monocatenarios, anticuerpos humanizados, anticuerpos polifuncionales, etc.

Un anticuerpo específico de un polipéptido ATP2B2 designa un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido ATP2B2, concretamente, un anticuerpo generado contra un polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo que contiene el epítopo. Aunque se puede producir unión no específica a otros antígenos, la unión al polipéptido ATP2B2 diana se produce con mayor afinidad y se puede discriminar con fiabilidad de la unión no específica.

En una realización específica, el procedimiento comprende poner en contacto una muestra procedente del sujeto con (un soporte revestido con) un anticuerpo específico de una forma alterada de un polipéptido ATP2B2, y determinar la presencia de un inmunocomplejo. En una realización particular, la muestra se puede poner en contacto simultáneamente, o en paralelo, o secuencialmente, con varios (soportes revestidos con) anticuerpos específicos de diferentes formas de un polipéptido ATP2B2, tal como un tipo natural y varias formas alteradas del mismo.

La revelación también concierne al uso de un ligando, preferiblemente un anticuerpo, un fragmento o un derivado del mismo como se ha descrito anteriormente, en un procedimiento para detectar la presencia o predisposición al autismo en un sujeto o en un procedimiento para evaluar la respuesta de un sujeto a un tratamiento del autismo, un trastorno del espectro autista, o un trastorno asociado con el autismo.

Se describe también un kit diagnóstico que comprende productos y reactivos para detectar en una muestra procedente de un sujeto la presencia de una alteración en el gen o polipéptido ATP2B2 o en la expresión del gen o polipéptido ATP2B2, y/o en la actividad de ATP2B2. Dicho kit diagnóstico comprende cualquier cebador, cualquier par de cebadores, cualquier sonda de ácido nucleico y/o cualquier ligando, preferiblemente un anticuerpo, descrito en la presente invención. Dicho kit diagnóstico kit de acuerdo con la presente revelación puede comprender adicionalmente reactivos y/o protocolos para realizar una reacción de hibridación, amplificación o antígeno-anticuerpo.

Los procedimientos diagnósticos se pueden llevar a cabo ex vivo o in vivo, preferiblemente in vitro o ex vivo. Usan una muestra procedente del sujeto, para evaluar el estado del locus del gen ATP2B2. La muestra puede ser cualquier muestra biológica derivada de un sujeto que contenga ácidos nucleicos o polipéptidos. Ejemplos de dichas muestras incluyen fluidos, tejidos, muestras celulares, órganos, biopsias. Las muestras más preferidas de sangre, plasma, saliva, orina, fluido seminal, etc. El diagnóstico prenatal también se pueden llevar a cabo ensayando células fetales o células placentales, por ejemplo. La muestra se puede recoger de acuerdo con técnicas convencionales, y usarse directamente para el diagnóstico o almacenarse. La muestra se puede tratar antes de realizar el procedimiento, para conseguir o mejorar la disponibilidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos para el análisis. Los tratamientos incluyen, por ejemplo, lisis (por ejemplo, mecánica, física, química, etc.), centrifugación, etc. Igualmente, los ácidos nucleicos y/o polipéptidos se pueden purificar previamente o enriquecerse mediante técnicas convencionales, y/o reducirse en complejidad. Los ácidos nucleicos y polipéptidos también se pueden tratar con enzimas o tratamientos físicos para producir fragmentos de los mismos. Teniendo en cuanta la elevada sensibilidad de los procedimientos reivindicados, es suficiente una cantidad pequeña de muestra para llevar a cabo el ensayo.

Como se ha indicado, la muestra se pone preferiblemente en contacto con reactivos tales como sondas, cebadores, o ligandos para evaluar la presencia de un locus alterado en el gen ATP2B2. La puesta en contacto se puede llevar a cabo en un dispositivo adecuado como una placa, tubo, pocillo, vidrio, etc. En realizaciones específicas, la puesta en contacto se puede llevar a cabo sobre un sustrato revestido con el reactivo, como una matriz de ácido nucleico o una matriz de ligando específico. El sustrato puede ser un sustrato sólido o semisólido como cualquier soporte que comprenda vidrio, plástico, nylon, papel, metal, polímeros y similares. El sustrato puede ser de varias formas y tamaños, como un porta, una membrana, una perla, una columna, un gel, etc. La puesta en contacto se puede realizar en cualquier condición adecuada para que se forme un complejo entre el reactivo y los ácidos nucleicos o polipéptidos de la muestra.

El hallazgo de un polipéptido, ARN, o ADN de ATP2B2 alterado en la muestra es indicativo de la presencia de un locus del gen ATP2B2 alterado en el sujeto, que se puede correlacionar con la presencia, predisposición o estado de progresión del autismo, un trastorno del espectro autista, o un trastorno relacionado con el autismo. Por ejemplo, un individuo que tenga una mutación en el ATP2B2 de su línea germinal tiene un aumento en el riesgo de desarrollar autismo. La determinación de la presencia de un locus del gen ATP2B2 alterado en un sujeto también permite el diseño de una intervención terapéutica adecuada, que es más eficaz y personalizado. Igualmente, esta determinación en un nivel presintomático permite la aplicación de una pauta terapéutica preventiva.

Desequilibrio de unión

Una vez identificado un primer SNP en una región genómica de interés, más particularmente en un locus del gen ATP2B2, el médico normalmente experto en la técnica puede identificar fácilmente SNP asociados en desequilibrio de unión con este primer SNP. Así, cualquier SNP en desequilibrio de unión con un primer SNP asociado con el autismo se asociará con este rasgo. Por tanto, una vez se ha demostrado la asociación entre un SNP dado y el autismo, el descubrimiento de SNP adicionales asociados con este rasgo puede ser de gran interés para incrementar la densidad de los SNP de esta región particular.

La identificación de SNP adicionales en desequilibrio de unión con un SNP dado implica: (a) amplificar un fragmento procedente de la región genómica que comprende o rodea un primer SNP procedente de una pluralidad de individuos; (b) identificar un segundo SNP en la región genómica que alberga o rodea dicho primer SNP; (c) realizar un análisis del desequilibrio de unión entre dicho primer SNP y los segundos SNP; y (d) seleccionar dichos segundos SNP que están en desequilibrio de unión con dicho primer marcador. También se contemplan subcombinaciones que comprenden las etapas (b) y (c).

La persona experta en la técnica puede realizar los procedimientos para identificar los SNP y para realizar el análisis del desequilibrio de unión sin experimentación excesiva usando procedimientos bien conocidos.

Estos SNP en desequilibrio de unión también se pueden usar en los procedimientos de acuerdo con la presente invención, y más particularmente en los procedimientos diagnósticos de acuerdo con la presente invención.

Por ejemplo, un locus de unión de la enfermedad de Crohn se ha cartografiado en una región grande que se expande 18cM en el cromosoma 5q31 (Rioux y col., 2000 y 2001). Usando mapas de densidad de marcadores en microsatélites y SNP en la región completa, se encontró fuerte evidencia de desequilibrio de unión (LD). Habiendo encontrado evidencia de LD, los inventores desarrollaron un mapa de SNP de densidad ultra alta y estudiaron una colección más densa de marcadores seleccionados de dicho mapa. El análisis multilocus definió un haplotipo de riesgo común caracterizado por SNP múltiples cada uno independientemente asociado mediante TDT. Estos SNP fueron únicos para el haplotipo del riesgo y esencialmente idénticos en su contenido informativo en virtud de estar en LD casi completa entre sí. Las propiedades equivalentes de estos SNP hacen imposible identificar la mutación causal contenida en esta región sobre la base solamente de la evidencia genética.

Mutación causal

Las mutaciones del gen ATP2B2 responsables del autismo se pueden identificar por comparación de las secuencias del gen ATP2B2 procedentes de pacientes que presentaban autismo e individuos de control. Basándose en la asociación identificada de los SNP de ATP2B2 y el autismo, el locus identificado se pueden barrer en busca de mutaciones. En una realización preferida, las regiones funcionales tales como exones y sitios de corte y empalme, promotores y otras regiones reguladoras del gen ATP2B2 se barren en busca de mutaciones. Preferiblemente, los pacientes que presentan autismo llevan la mutación mostrada como asociada mientras que los individuos de control no llevan la mutación o alelo asociado con el trastorno, Podría ser también posible que los pacientes que presenten autismo lleven la mutación mostrada como asociada con el autismo con una frecuencia mayor que la de los individuos de
control.

El procedimiento usado para detectar dichas mutaciones comprende por lo general las siguientes etapas: amplificación de una región del gen ATP2B2 que comprende un SNP o un grupo de SNPs asociados con el autismo procedente de muestras de ADB del gen ATP2B2 procedentes de pacientes con autismo e individuos de control; secuenciar la región amplificada; comparar las secuencias de ADN del gen ATP2B2 procedentes de pacientes con autismo e individuos de control, determinación de mutaciones específicas de pacientes con autismo.

De este modo, la identificación de una mutación causal del gen ATP2B2 se puede llevar a cabo por la persona experta en la técnica sin excesiva experimentación utilizando procedimientos bien conocidos.

Por ejemplo, se han identificado las siguientes mutaciones causales en los siguientes ejemplos mediante procedimientos rutinarios.

Hugot y col. (2001) aplicaron una estrategia de clonación posicional para identificar variantes génicas con susceptibilidad a la enfermedad de Crohn en una región del cromosoma 16 previamente encontrada como relacionada con la susceptibilidad a la enfermedad de Crohn. Para refinar la ubicación de la susceptibilidad potencial, se genotiparon 26 marcadores en el microsatélite del locus y se ensayaron respecto de su asociación con la enfermedad de Crohn usando el ensayo de transmisión en desequilibrio. Se encontró una asociación fronteriza significativa entre un alelo del marcador del microsatélite D16S136. Se seleccionaron once SNP adicionales de las regiones circundantes, y varios SNP mostraron una asociación significativa. El SNP5-8 procedente de esta región se encontró presente en un único exón del gen NOD2/CARD15 y mostró ser variantes no sinónimas. Esto llevó a los inventores a secuenciar la secuencia de codificación completa de este gen en 50 pacientes con EC. Se encontraron adicionalmente dos mutaciones no sinónimas (SNP12 y SNP13). SNP13 se asoció lo más significativamente (p=6x10-6) mediante la prueba genealógica de transmisión del desequilibrio. En otro estudio independiente, se encontró también la misma variante por secuenciación de la región codificante de este gen procedente de 12 individuos afectados en comparación con 4 controles (Ogura y col., 2001). El alelo raro de SNP13 correspondió a una inserción de 1 pb con predicción de truncar la proteína NOD2/CARD15. Este alelo también estaba presente en individuos sanos normales, aunque con una frecuencia significativamente inferior en comparación con los controles.

De forma similar, Lesage y col. (2002) realizaron un análisis mutacional de CARD 15 en 453 pacientes con EC, incluyendo 166 esporádicos y 287 casos familiares, 159 pacientes con colitis ulcerosa (CU), y 103 sujetos de control sanos por secuenciación sistemática de la región codificante. De las 67 variaciones identificadas en la secuencia, 9 tuvieron una frecuencia del alelo >5% en pacientes con EC. Seis de estos se consideraron polimorfismos, y tres (SNP12-R702W, SNP8-G908R, y SNP13-1007fs) se confirmaron como asociados independientemente con la susceptibilidad a la EC. También se consideraron mutaciones potenciales causantes de enfermedad (DCM) 27 mutaciones raras adicionales. Las tres variantes principales (R702W, G908R, y 1007fs) representaron 32%, 18%, y 31%, respectivamente del total de mutaciones EC, mientras que el total de 27 mutaciones raras representó el 19% de las DCM. En su conjunto, el 93% de las mutaciones se localizaron en el tercio distal del gen. NO se encontraron mutaciones asociadas con la CU. Por el contrario, el 50% de los pacientes con EC transportaron al menos una DCM, incluyendo el 17% que tenían una mutación doble.

Cribado de fármacos

La presente invención proporciona también nuevas dianas y procedimientos para cribar fármacos candidatos o cabeceras. Los procedimientos incluyen ensayos de unión y/o ensayos funcionales, y se pueden realizar in vitro, en sistemas celulares, en animales, etc.

Un objeto particular de esta invención reside en un procedimiento para seleccionar compuestos biológicamente activos, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto in vitro un compuesto de ensayo con un gen o de polipéptido ATP2B2 de acuerdo con la presente invención y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para unirse a dicho gen o de polipéptido ATP2B2. Al unirse a dicho gen o de polipéptido proporciona una indicación de la capacidad del compuesto para modular la actividad de dicha diana, y de esta forma afectar una ruta que conduce al autismo en un sujeto. En una realización preferida, el procedimiento comprende poner en contacto un compuesto de ensayo in vitro con un polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo de acuerdo con la presente invención y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para unirse a dicho polipéptido ATP2B2 o fragmento. El fragmento comprende preferiblemente un sitio de unión del polipéptido ATP2B2. Preferiblemente, dicho gen o de polipéptido ATP2B2 o fragmento del mismo es un gen o de polipéptido de ATP2B2 alterado o mutado o fragmento del mismo que comprende la alteración o mutación.

Un objeto particular de esta invención reside en un procedimiento para seleccionar compuestos activos para el autismo, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto in vitro un compuesto de ensayo con un polipéptido ATP2B2 de acuerdo con la presente invención o un fragmento del mismo que contiene el sitio de unión y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para unirse a dicho polipéptido ATP2B2 o fragmento del mismo. Preferiblemente, dicho polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo es un polipéptido ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende la alteración o mutación.

En una realización particular adicional, el procedimiento comprende poner en contacto una célula hospedadora recombinante que expresa un polipéptido ATP2B2 de acuerdo con la presente invención con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para unirse a dicho ATP2B2 y para modular la actividad del polipéptido ATP2B2. Preferiblemente, dicho polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo es un polipéptido ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende la alteración o mutación.

La determinación de la unión se puede llevar a cabo por diferentes técnicas, tales como etiquetado del compuesto de ensayo, por competición con un ligando de referencia marcado, etc.

Un objeto adicional de esta invención reside en un procedimiento para seleccionar compuestos biológicamente activos, dicho procedimiento comprende poner en contacto in vitro un compuesto de ensayo con un polipéptido ATP2B2 de acuerdo con la presente invención y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para modular la actividad de dicho polipéptido ATP2B2. Preferiblemente, dicho polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo es un polipéptido ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende la alteración o
mutación.

Un objeto adicional de esta invención reside en un procedimiento para seleccionar compuestos biológicamente activos, dicho procedimiento comprende poner en contacto in vitro un compuesto de ensayo con un gen ATP2B2 de acuerdo con la presente invención y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para modular la expresión de dicho gen ATP2B2. Preferiblemente, dicho gen ATP2B2 o un fragmento del mismo es un gen alterado o mutado ATP2B2 o un fragmento del mismo que comprende la alteración o mutación.

En otra realización, esta invención se refiere a un procedimiento para cribar, seleccionar o identificar compuestos activos, particularmente compuestos activos para el autismo, comprendiendo el procedimiento poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula hospedadora recombinante que comprende una construcción indicadora, comprendiendo dicha construcción indicadora un gen indicador bajo el control de un promotor del ATP2B2 y seleccionar los compuestos de ensayo que modulan (por ejemplo, estimulan o reducen) la expresión del gen informador. Preferiblemente, dicho gen informador de ATP2B2 o un fragmento del mismo es un gen promotor de ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende la alteración o mutación.

En una realización particular de los procedimientos de cribado, la modulación es una inhibición. En otra realización particular de los procedimientos de cribado, la modulación es una activación.

Los ensayos de cribado anteriores se pueden llevar a cabo en cualquier dispositivo adecuado, como placas, tubos, platos, frascos, etc. Típicamente, el ensayo se realiza en placas multipocillo. Se pueden ensayar varios compuestos de ensayo en paralelo. Adicionalmente, el compuesto de ensayo puede tener orígenes, naturaleza y composición diferentes. Puede ser cualquier sustancia orgánica o inorgánica, como un lípido, péptido, polipéptido, ácido nucleico, molécula pequeña, etc., aislada o mezclada con otras sustancias. Los compuestos pueden ser todo o parte de una biblioteca combinatoria de productos, por ejemplo.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se darán a conocer en la siguiente sección experimental, que debe tomarse como ilustrativa y no limitante del alcance de la presente solicitud.

Genes, vectores, células recombinantes y polipéptidos

Se describen aquí productos para uso en diagnóstico, o cribado. Estos productos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo, vectores que comprenden el mismo, células hospedadoras recombinantes y polipéptidos expresados.

Más particularmente, se describen un gen ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende dicha alteración o mutación. Se dan a conocer adicionalmente moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende dicha alteración o mutación. Dicha alteración o mutación modifica la actividad de ATP2B2. La actividad modificada puede estar aumentada o disminuida. Se describe adicionalmente un vector que comprende un gen de ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende dicha alteración o mutación de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende dicha alteración o mutación, células hospedadoras recombinantes y polipéptidos expresados.

Se describe adicionalmente un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido ATP2B2 tal como se ha definido en el presente documento. El vector puede ser un vector de clonación o, más preferiblemente, un vector de expresión, es decir, un vector que comprende secuencias reguladoras que originan la expresión de un polipéptido ATP2B2 a partir de dicho vector en una célula hospedadora competente.

Estos vectores se pueden usar para expresar un polipéptido ATP2B2 in vitro, ex vivo o in vivo, para crear animales no humanos transgénicos o "con genes desactivados" para amplificar los ácidos nucleicos, para expresar ARN de sentido contrario, etc.

Los vectores descritos en el presente documento típicamente comprenden una secuencia codificante de ATP2B2 de acuerdo con la presente invención operativamente enlazada a secuencias reguladoras, por ejemplo, un promotor, un poliA, etc. El término "operativamente enlazada" indica que las secuencias codificantes y regulatorias están funcionalmente asociadas de forma que las secuencias reguladoras original la expresión (por ejemplo, transcripción) de las secuencias codificantes. Los vectores pueden comprender adicionalmente uno o varios orígenes de replicación y/o marcadores seleccionables. La región del promotor puede ser homóloga o heteróloga con respecto a la secuencia codificante, y puede proporcionar una expresión específica ubicua, constitutiva, regulada y/o específica del tejido, en cualquier célula hospedadora adecuada, incluyendo el uso in vivo. Los ejemplos de promotores incluyen promotores bacterianos (T7, pTAC, promotor Trp, etc.), promotores víricos (LTR, TK, CMV-IE, etc.), promotores de genes de mamífero (albúmina, PGK, etc), y similares.

El vector puede ser un plásmido, un virus, un cósmido, un fago, un BAC, un YAC, etc. Los vectores plásmidos se pueden preparar a partir de vectores comerciales tales como pBluescript, pUC, pBR, etc. Los vectores víricos se pueden producir a partir de baculovirus, retrovirus, adenovirus, VAA, etc., de acuerdo con las técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica.

A este respecto, se describe un virus recombinante que codifica un polipéptido ATP2B2 tal como se ha definido anteriormente. El virus recombinante es preferiblemente defectivo para la replicación, más preferiblemente seleccionado a partir de adenovirus defectivos en E1- y/o E4-, Gag-, pol- y/o retrovirus defectivos en env y VAA defectivos en Rep- y/o Cap-. Dichos virus recombinantes se pueden producir por técnicas conocidas en la técnica, tales como transfectar células de empaquetado o por transfección transitoria con plásmidos o virus auxiliares Ejemplos típicos de células de empaquetado de virus incluyen células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Los protocolos detallados para producir estos virus recombinantes defectivos para la replicación, por ejemplo, en los documentos WO95/14785, WO96/22378, US5.882.877, US6.013.516, US4.861.719, US5.78.056 y WO94/19478.

Otro objeto adicional de la presente revelación reside en una célula hospedadora recombinante que comprende un gen o un vector ATP2B2 recombinante tal como se ha definido anteriormente. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, sin limitación, células procariotas (como bacterias) y células eucariotas (como células de levadura, células de mamífero, células de insecto, células de plantas, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E. coli, levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces, líneas de células de mamífero (por ejemplo, células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.) así como cultivos de células de mamífero primarios o establecidos (por ejemplo, producidos a partir de fibroblastos, células embriónicas, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.).

Se describe adicionalmente un procedimiento para producir una célula hospedadora recombinante que expresa un polipéptido ATP2B2 como se ha definido en el presente documento, comprendiendo dicho procedimiento (i) introducir in vitro o ex vivo en una célula hospedadora competente un ácido nucleico o vector recombinante como se ha descrito anteriormente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo las células hospedadoras recombinantes obtenidas y (iii), opcionalmente, seleccionar las células que expresan el polipéptido ATP2B2.

Dichas células hospedadoras recombinantes pueden usarse para la producción de los polipéptido ATP2B2, así como para el cribado de moléculas activas, como se describe más adelante. Dichas células también se pueden usar como sistema modelo para estudiar el autismo. Estas células se pueden mantener en medios de cultivo adecuados, tales como DMEM, RPMI, HAM, etc., en cualquier dispositivo de cultivo adecuado (placa, frasco, plato, tubo, bolsa, etc.).

Ejemplos 1. Plataforma GenomeHIP para identificar el gen de la susceptibilidad en el cromosoma 3

Se aplicó la plataforma GenomeHIP para permitir la identificación rápida de un gen de susceptibilidad al autismo.

Brevemente, la tecnología consiste en formar pares a partir del ADN de individuos relacionados. Cada ADN se marca con una etiqueta específica para permitir su identificación. A continuación se forman híbridos entre ambos ADN. Seguidamente, se aplica un procedimiento (documento WO00/53802) particular que selecciona todos los fragmentos idénticos por descendencia (IBD, por sus siglas en ingles) procedentes de ambos ADN en un procedimiento multietapa. El ADN restante enriquecido por IBD se puntúa a continuación frente a una matriz de ADN derivada de un clon BAC que permite ubicar la fracción IBD en un cromosoma

La aplicación de este procedimiento a varias familias diferentes da como resultado una matriz de fracciones IBD para cada par procedente de cada familia. A continuación, el análisis estadístico calcula las regiones mínimas IBD compartidas entre todas las familias ensayadas. Se evidencian los resultados significativos (valores p) para la unión entre la región positiva y el rasgo de interés (aquí, el autismo). El intervalo relacionado puede delimitarse mediante los dos clones más distantes que muestran valores significativos.

En el presente estudio, 114 familias estadounidenses (114 parejas de hermanos independientes) concordantes para autismo estricto (según definición mediante ADI-R) se sometieron al procedimiento GenomeHIP. Las fracciones de ADN resultantes enriquecidas por IBD se marcaron a continuación con colorantes fluorescentes de Cy5 y se hibridaron contra una matriz de ADN constituida por 2263 clones BAC que cubrían el genoma humano completo con una separación promedio de 1,2 megaparares de bases. Se usó ADN no seleccionado marcado con Cy3 para normalizar los valores de la señal y calcular las relaciones para cada clon. A continuación, se agruparon los resultados de los índices para determinar el estado IBD de cada clon y pareja.

Aplicando este procedimiento, se identificó un clon BAC (FE0DBACAI7ZG05v) que mostró evidencias sugerentes de relación con el autismo (p=6,4e-05). La región de unión se expandía aproximadamente 2,18 megaparares de bases en la región del cromosoma 3 (bases 9283670 a 11464577) tal como se definió por los clones 3 proximal y distal del clon BAC que mostraba evidencia sugerente de relación. Se usó el valor p de 7,4E-04 para evidencia sugerente de relación según propuesta de Kruglyak y Lander (1995) para barridos de genoma completo en rasgos
complejos.

Tabla 2: Resultados de relación para el cromosoma 3 del locus ATP2B2: se indica la región correspondiente al clon BAC con evidencia de relación. Las posiciones de inicio y parada de los clones correspondiente a sus ubicaciones genómicas están basadas en el NCBI Build34 con respecto al inicio del cromosoma (p-ter).

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TABLA 2

3

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2. Identificación de un gen de susceptibilidad al autismo en el cromosoma 3

Por cribado de las 2,18 megabases anteriormente mencionadas en la región cromosómica relacionada, los inventores identificaron la ATPasa2 de la membrana plasmática transportadora de Ca++ (ATP2B2) como candidato para el autismo y fenotipos relacionados. Este gen sin duda está presente en el intervalo crítico, con evidencia de la relación delimitada por los clones detallados anteriormente.

El gen ATP2B2 codifica un polipéptido de 1243 aminoácidos predicho para la isoforma NP_001001331, (ARNm NM_001001331, 6821 pb) y se expande en 380 kb de secuencia genómica. Se han identificado las variantes de transcripción mediante corte y empalme alternativo codifican diferentes isoformas de este gen. La proteína codificada por este gen pertenece a la familia de las ATPasa transportadoras de cationes (Tipo P), subfamilia tipo IIB, y se caracteriza por la formación de in intermedio de fosfato de aspartilo durante el ciclo de reacción. Estas enzimas retiran los iones de calcio divalente de las células eucariotas contra gradientes de concentración muy grandes, y tienen un papel crítico en la homeostasis del calcio intracelular.

Zaccharias y col (1997) emplearon la hibridación in situ para determinar el modelo de expresión de cuatro isoformas de la PMCA humana en el hipocampo humano. Los ARNm de PMCA1 y 3 se expresaron débilmente durante la formación hipocámpica, mientras que la expresión del ARNm de PMCA2 y 4 mostraron diferencias regionales con niveles aumentados en CA2 y en la circunvolución dentada.

Para analizar el papel fisiológico de PMCA2, Kozel y col. (1998) produjeron ratones deficientes en PMCA2 mediante direccionamiento genético. Los ratones homocigóticos con PMCA2 inactivado crecieron más lentamente que los heterocigóticos y los de tipo natural, y mostraron un modo de andar no estacionario y dificultades para mantener el equilibrio. El análisis histológico del cerebelo y oído interno de los ratones mutantes y de tipo natural mostró que los mutantes inactivados tenían un número ligeramente aumentado de neuronas de Purkinje (en las que PMCA2 se expresa fuertemente), una disminución en el espesor de la capa molecular, una ausencia de otoconia en el sistema vestibular, y un conjunto de anormalidades del órgano de Corti. El análisis de la respuesta del tronco encefálico evocada por el oído demostró que los mutantes homocigóticos eran sordos y que los ratones heterocigóticos tenían una pérdida auditiva significativa. Estos datos demuestran que PMCA2 es necesario tanto para el equilibrio como para el oído, y sugieren que puede ser una fuente principal del calcio usado en la formación y mantenimiento de la otoconia.

Street y col. (1998) informaron de que el gen que codificaba una la ATPasa2 de la membrana plasmática bomba de Ca2+ (ATP2B2, también conocida como PMCA2) estaba mutado en dfw. Una transición de nucleótido A \rightarrow G en el ADN de dfw produce la sustitución glicina-a-serina en una posición de aminoácido muy conservada, mientras que en un segundo alelo, dfw2J, una delección de 2 pares de bases origina un desplazamiento de marco que predice una proteína truncada. En la cóclea, la proteína ATP2B2 se ubica en los estereocilios y en la pared basolateral de las células pilosas en los ratones de tipo natural, pero no se detectó en los ratones dfw2J. Esto indica que la mutación en ATP2B2 puede causar sordera y desequilibrio al afectar la transducción sensorial en los estereocilios así como la liberación de neurotransmisores desde la membrana basolateral.

Ueno y col. (2002) identificaron ratones con una transición de nucleótido en el gen PCMA2 que produjo el cambio de ácido glutámico a lisina. Los ratones mostraron defectos en el comportamiento como temblor grave, movimiento del cuello arriba y abajo y a derecha e izquierda sin coordinación. Puesto que PMCA2 se expresa en el cerebelo y tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis del Ca2+ intracelular como bomba de Ca2+, el defecto en el comportamiento se puede adscribir al desequilibrio en la regulación del Ca2+ en las neuronas del cerebelo. Para confirmar el defecto en la homeostasis del Ca2+ en los ratones mutantes, se midieron cambios importantes inducidos por K+ en la concentración de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) en las neuronas del cerebelo. La tasa de aumento en [Ca2+] i durante la despolarización importante inducida por K+ se redujo significativamente, y la tasa de extrusión del [Ca2+]i incrementada también se redujo. Estos resultados sugieren que los canales del Ca2+ controlados por voltaje estaban regulados en defecto en el ratón mutante para regular la [Ca2+]i respecto de la homeostasis normal. Los defectos en el comportamiento se pueden adscribir a la homeostasis del Ca2+ regulada en defecto puesto que los cambios dinámicos en la [Ca2+]i son importantes para varias funciones neuronales 2.

Kozel y col. (2002) teorizaron que PMCA2 podría ser el primer gen con una proteína mutada conocida producida que confería susceptibilidad a la pérdida de audición debido al ruido.

La pérdida auditiva bilateral o sordera de pronunciada a profunda fue diagnosticada en casos de trastornos autistas, representando una prevalencia considerable por encima de la población en general y comparable a la prevalencia encontrada en poblaciones con retraso mental (Rosenhall, y col. 1999). La pérdida auditiva de suave a moderada se diagnosticó en el 7,9% y la pérdida auditiva unilateral en el 1,6% de los que se ensayaron adecuadamente. Los déficits auditivos en el autismo se produjeron en tasas similares para todos los niveles de funcionamiento intelectual, por lo que no parece que la covariación junto con afectación intelectual per se pueden representar toda la varianza del déficit auditivo en el autismo. La hiperacusia fue habitual, afectando un 18,0% del grupo autista y un 0% en un grupo de comparación no autista de edad similar. Además, la tasa de otitis media serosa (23,5%) y pérdida auditiva relacionada con la conducta (18,3%) parecieron aumentar en el trastorno autístico.

Hallazgos recientes en niños y adultos autistas informados por Boddaert y col. (2003, 2004) sugieren que las respuestas comportamentales inadecuadas a los sonidos y al lenguaje típicamente vistas en el autismo podrían deberse al procesamiento anormal de la corteza auditiva.

Los hallazgos de Kurnellas y col. (2005) sugieren que una reducción en el nivel o la actividad de PMCA2 que lleva a retraso en el aclaramiento del calcio puede causar daño neuronal y pérdidas en la médula espinal.

Tomados en su conjunto, los resultados de relación proporcionados en la presente solicitud, que relacionen el gen ATP2B2 humano en el intervalo crítico de las alteraciones genéticas con el autismo en el cromosoma 3, con implicación en la función neuronal y pérdida auditiva, hacen concluir a los inventores que las alteraciones (por ejemplo, mutaciones y/o polimorfismos) en el gen ATP2B2 o en sus secuencias reguladoras puede contribuir al desarrollo de autismo humano y representa una diana novedosa para el diagnóstico o la intervención terapéutica.

3. Estudio de asociación

Las mismas familias que habían participado en el estudio de relación también se usaron para ensayar la asociación entre un fenotipo específico (aquí, el autismo) en cuestión, y el alelo marcador genético o haplotipos que contienen un alelo marcador específico mediante el ensayo de transmisión del desequilibrio (TDT). El TDT es una potente prueba de asociación puesto que es insensible a los problemas de estratificación de la población en la muestra ensayada. En breve, se ensaya la segregación de los alelos procedentes de padres heterocigóticos en su progenie afectada. La porción de alelos transmitidos a la progenie afectada en comparación con los alelos no transmitidos se compara con la relación esperada para una distribución aleatoria. Un exceso significativo de transmisión del alelo sobre el valor esperado es una evidencia de la asociación del alelo o haplotipo respectivo con el fenotipo autista estudiado.

Los resultados de este análisis muestran que algunos alelos del gen ATP2B2 están positivamente asociados con el autismo y por tanto aumentan la susceptibilidad a la enfermedad. En la población ensayada, el alelo 1 (A) de SNP22 está correlacionado con el autismo según se determina mediante TDT (valor p = 0,0476). A diferencia de lo anterior, el alelo 2 (G) de SNP22 está significativamente menos transmitido a los individuos autistas lo que demuestra que este alelo ayuda a protegerse de la enfermedad.

En la Tabla 3 se proporcionan ejemplos de la transmisión de alelos a los autistas.

TABLA 3

4

Además, se construyeron haplotipos para SNP21, SNP22, SNP28, SNP39, SNP46, SNP61, SNP73 y SNP74 para identificar la fase de todos los SNP.

Los resultados de este análisis en la población ensayada mostraron que algunos haplotipos, todos caracterizados por la presencia del alelo 2 (T) en SNP21, del alelo 1 (A) en SNP22 o del alelo 2 (T) en SNP28 estaban significativamente asociados con el autismo, mientras que algunos haplotipos desprovistos de los alelos 2 (T), 1 (A) o 2 (T), respectivamente, preferentemente no se transmiten a los autistas. Un ejemplo es el haplotipo 2-1 (T-C) de SNP21-SNP46, p = 0,001644. Los haplotipos que llevan el alelo 1 (C) en lugar del alelo 2 (T) en SNP21 o el alelo 1 (C) en lugar del alelo 2 (T) en SNP 28 muestran evidencia significativa estar menos representados en sujetos autistas. Un ejemplo es el haplotipo 1-1 (C-A) de SNP28-SNP61, p = 0,008087.

En la Tabla 4 se proporcionan ejemplos de haplotipos con transmisión preferente y sin transmisión a los autistas.

TABLA 4

5

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<110> INTEGRAGEN

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<120> GEN HUMANO DE SUSCEPTIBILIDAD AL AUTISMO QUE CODIFICA UNA PROTEÍNA TRANSMEMBRANA Y SUS USOS

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<130> B0359WO

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<160> 10

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 6821

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (320)..(4051)

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<223>

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<400> 1

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<210> 2

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<211> 1243

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 1001

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> SNP21

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<222> (501)..(501)

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<223> C/T

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<210> 4

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<211> 537

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> SNP22

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<221> misc_feature

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<222> (464)..(464)

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<223> C/T

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> SNP28

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<223> C/T

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<223> SNP39

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<222> (201)..(201)

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<223> C/T

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<213> secuencia artificial

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<223> SNP46

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<221> misc_feature

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<222> (501)..(501)

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<223> A/G

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<210> 8

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<211> 837

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SNP61

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (337)..(337)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> C/T

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

25

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 401

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SNP73

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (201)..(201)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> C/T

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

26

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<210> 10

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<211> 401

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SNP74

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (201)..(201)

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<223> A/C

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<400> 10

27

Claims (13)

1. Un procedimiento in vitro para detectar la presencia o predisposición al autismo en un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra procedente del sujeto.

2. Un procedimiento in vitro para detectar la protección del autismo en un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 en una muestra procedente del sujeto.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la presencia de una alteración en el gen ATP2B2 se detecta por secuenciación, hibridación selectiva y/o amplificación selectiva.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicha alteración es uno o varios SNP(s) o un haplotipo de SNP asociado con el autismo.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho haplotipo asociado con el autismo comprende varios SNP seleccionados entre el grupo constituido por of SNP21 (SEC. DE ID. Nº:3), SNP22 (SEC. DE ID. Nº:4), SNP28 (SEC. DE ID. Nº:5), SNP39 (SEC. DE ID. Nº: 6), SNP46 (SEC. DE ID. Nº:7), SNP61 (SEC. DE ID. Nº:8), SNP73 (SEC. DE ID. Nº:9) y SNP74 (SEC. DE ID. Nº: 10).

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho SNP asociado con el autismo es SNP22.

7. Un procedimiento para seleccionar compuestos biológicamente activos sobre el autismo, dicho procedimiento comprende poner en contacto a compuesto de ensayo con un polipéptido o gen ATP2B2 o un fragmento del mismo y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para unirse al polipéptido o gen ATP2B2 o un fragmento del mismo.

8. Un procedimiento para seleccionar compuestos biológicamente activos sobre el autismo, dicho procedimiento comprende poner en contacto una célula hospedadora recombinante que expresa un polipéptido ATP2B2 con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para unirse a dicho polipéptido ATP2B2 y modular la actividad del polipéptido ATP2B2.

9. Un procedimiento para seleccionar compuestos biológicamente activos sobre el autismo, dicho procedimiento comprende poner en contacto a compuesto de ensayo con un ATP2B2 gene y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para modular la expresión de dicho gen dicho ATP2B2.

10. Un procedimiento para seleccionar compuestos biológicamente activos sobre el autismo, dicho procedimiento comprende poner en contacto a compuesto de ensayo con una célula hospedadora recombinante que comprende una construcción informadora, comprendiendo dicha construcción informadora un gen informador bajo el control de un promotor del gen ATP2B2, y seleccionar los compuestos de ensayo que modulan (por ejemplo, estimulan o reducen) la expresión del gen informador.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que dicho gen o polipéptido ATP2B2 o un fragmento del mismo es un gen o polipéptido ATP2B2 alterado o mutado o un fragmento del mismo que comprende la alteración o mutación.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en el que dicha modulación es una activación.

13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en el que dicha modulación es una inhibición.