CN117867097A - 检测THRβ基因突变情况的引物及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了对THRβ基因突变进行检测的引物及其试剂盒，所述的检测THRβ基因突变的引物包括c.1144+19G>A突变检测引物对，和/或c.*108G>C突变检测引物对。结合PCR技术以及Sanger测序，本发明可用于快速检测THRβ基因c.1144+19G>A、c.*108G>C位点的突变情况，检测结果准确可靠，为临床甲状腺激素抵抗综合症的鉴别诊断提供了更为全面的参考信息，从而减少临床误诊和漏诊的现象发生。

Description

检测THRβ基因突变情况的引物及其试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及检测THRβ基因突变情况的引物及其试剂盒。

背景技术

甲状腺激素抵抗综合症(thyroid hormone resistance syndrome，THRS)是临床上罕见的一类常染色体显性或隐性遗传性疾病，有家族性发病倾向，也有散发病例，其发病率约为1:40000；临床基本特征为甲状腺激素的靶腺组织，如垂体及其周围组织，对甲状腺激素的反应性降低，导致血清游离甲状腺素(FT4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)水平升高，以及促甲状腺激素(TSH)正常或升高，临床表现为甲状腺功能亢进或甲状腺功能减退症状。自1967年由Refetoff等首次发现此病以来，国外至今报道有300多个家系，1000多例的文献报道，国内近年报道数十例，包括家系以及散发患者，但大多为全身性激素抵抗患者，垂体激素抵抗的报道有限。由于甲状腺激素抵抗综合症的临床表现复杂多变，可以表现为甲亢、甲减，或无任何临床表现，部分患者甚至可能同时出现甲亢或甲减的症状或体征；因此，临床上极易出现漏诊和误诊的现象，影响到患者的治疗。

1988年Usala等通过限制性片段长度多态性分析证实该病与甲状腺激素受体β(THRβ)基因突变有关。THRβ基因具有11个外显子，共编码461个氨基酸，目前已鉴定出该基因170多个变异位点，主要集中于由178～461号氨基酸构成的TRD羧基末端的配体结合域(E区)和部分铰链区(D区)。目前报道最多的5个突变位点分别是：R338w、A317T、R438H、R243Q和P453T，报道的突变位点有P453A、F245F、H435L、V458AH以及1276L、R429Q等；而尚无1～6号外显子及内含子突变的相关报道。因此，对THRβ基因全外显子进行深入探索，并针对其变异位点建立有效的检测方法，对于临床甲状腺激素抵抗综合症的认知具有重要意义。

发明内容

为了进一步深入了解甲状腺激素抵抗综合症，对其临床鉴别诊断提供更全面的信息，本发明在国内外关于该疾病研究的基础上，对THRβ基因全外显子进行了一系列的探索与验证，提供了一种THRβ基因突变检测引物以及包括该检测引物的试剂盒，结合PCR技术以及Sanger测序，实现了对THRβ基因c.1144+19G>A、c.*108G>C位点的突变情况的快速检测，检测结果准确可靠，为临床甲状腺激素抵抗综合症的鉴别诊断提供了更为全面的参考信息，从而减少临床误诊和漏诊的现象发生。

本发明提供了检测THRβ基因突变的引物，包括：

c.1144+19G>A突变检测引物对，所述c.1144+19G>A突变检测引物对包括碱基序列如SEQ ID NO 1所示的THRβ10-F、碱基序列如SEQ ID NO 2所示的THRβ10-R；

和/或c.*108G>C突变检测引物对，所述c.*108G>C突变检测引物对包括碱基序列如SEQ ID NO 3所示的THRβ11-F、碱基序列如SEQ ID NO 4所示的THRβ11-R。

发明人团队在对甲状腺激素抵抗综合症患者志愿者样本进行扩增、测序过程中，首次发现了两个新的THRβ基因突变：c.1144+19G>A以及c.*108G>C，且这两个突变并未在正常样本中发现。与野生型TRHβ(NG_009159.1)参考序列进行比对后，提示THRβ基因c.1144+19G>A、c.*108G>C突变可能是遗传性血管炎病人的特异性突变，虽然这两个突变并有引起编码氨基酸的改变，但在调节蛋白表达上发挥了重要作用。进一步地，对这两个突变位点的碱基及氨基酸分别进行了保守性分析，发现所述的两个位点在不同物种间均存在高度保守性。并且，应用SIFT，polyphen2和Mutation Taster等软件对上述两个突变进行了致病性预测分析，结果均提示THRβ基因c.1144+19G>A以及c.*108G>C突变均具有致病相关性。结合上述信息，发明人团队认为对上述两个突变进行基因检测可以为临床甲状腺激素抵抗综合症的鉴别诊断提供更全面的信息，因此分别针对所述的两个突变设计了检测引物，即所述的c.1144+19G>A突变检测引物对以及c.*108G>C突变检测引物对(表1)，利用PCR技术以及Sanger测序，实现了对相应位点的有效、准确且快速稳定的检测，为临床甲状腺激素抵抗综合症的鉴别诊断提供了帮助，从而减少临床误诊和漏诊的现象发生。在PCR过程中，本发明通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，使得扩增效率达到最佳，构建了稳定的扩增体系。

作为优选，还包括测序引物对，所述测序引物对包括碱基序列如SEQ ID NO 5所示的M13-F、碱基序列如SEQ ID NO 6所示的M13-R。

表1.引物

本发明还提供了上述检测THRβ基因突变的引物在制备检测THRβ基因突变的试剂盒中的应用。将所述的c.1144+19G>A突变检测引物对，和/或c.*108G>C突变检测引物对应用于检测THRβ基因突变的试剂盒，拓展了检测THRβ基因突变的试剂盒的检测位点，快速准确鉴定THRβ基因的突变情况，为确定遗传性甲状腺激素抵抗综合症提供可靠依据。此外，所述的c.1144+19G>A突变检测引物对也可单独应用于制备检测THRβ基因c.1144+19G>A突变的试剂盒；同理，所述的c.*108G>C突变检测引物对也可单独应用于制备检测THRβ基因c.*108G>C突变的试剂盒。

本发明还提供了用于检测THRβ基因突变的试剂盒，所述用于检测THRβ基因突变的试剂盒包括上述检测THRβ基因突变的引物。在这里，所述的用于检测THRβ基因突变的试剂盒可以包括所述的c.1144+19G>A位点突变检测引物对，或c.*108G>C位点突变检测引物对，或同时包括c.1144+19G>A位点突变检测引物对以及c.*108G>C位点突变检测引物对，以实现对c.1144+19G>A突变，和/或c.*108G>C突变的检测。作为优选，所述的用于检测THRβ基因突变的试剂盒包括血液DNA抽提试剂、检测体系PCR扩增反应液、测序体系试剂、阳性对照品和阴性对照品；所述的检测体系PCR扩增反应液包括上述的检测THRβ基因突变的引物THRβ10-F/THRβ10-R，和/或THRβ11-F/THRβ11-R；所述的测序体系试剂包括上述的测序引物对M13-F、M13-R。

本发明还提供了上述检测THRβ基因突变的引物在制备检测THRβ基因多态性的试剂盒中的应用。相应地，本发明还提供了用于检测THRβ基因多态性的试剂盒，所述用于检测THRβ基因多态性的试剂盒包括上述检测THRβ基因突变的引物。采用上述检测THRβ基因突变的引物，结合其余根据THRβ各等位基因设计的特异性引物，通过PCR特异性扩增该基因片段，对THRβ基因进行分型从而达到分析THRβ基因多态性的目的。

本发明还提供了体外非诊断目的的检测THRβ基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)抽提样本中的基因组DNA；

(2)利用检测THRβ基因突变的引物对步骤(1)获得的基因组DNA进行扩增；

(3)利用测序引物对对步骤(2)获得的扩增产物进行测序；

(4)将步骤(3)中的测序结果与野生型TRHβ(NG_009159.1)参考序列进行比对，确定THRβ基因突变；

其中，步骤(2)中所述检测THRβ基因突变的引物包括：

c.1144+19G>A突变检测引物对，所述c.1144+19G>A突变检测引物对包括碱基序列如SEQ ID NO 1所示的THRβ10-F、碱基序列如SEQ ID NO 2所示的THRβ10-R；

和/或c.*108G>C突变检测引物对，所述c.*108G>C突变检测引物对包括碱基序列如SEQ ID NO 3所示的THRβ11-F、碱基序列如SEQ ID NO 4所示的THRβ11-R；

步骤(3)中所述测序引物对包括碱基序列如SEQ ID NO 5所示的M13-F、碱基序列如SEQ ID NO 6所示的M13-R。作为优选，步骤(1)中样本为外周血。

本发明的有益效果：本发明提供了对THRβ基因突变进行检测的引物及其试剂盒，为甲状腺激素抵抗综合症的临床鉴别诊断提供了更为全面以及准确的参考信息。发明人团队在对甲状腺激素抵抗综合症患者样本进行基因扩增和测序过程中首次发现了两个新的THRβ基因突变：c.1144+19G>A和c.*108G>C。基于此，本发明针对这两个突变分别设计了检测引物，即c.1144+19G>A突变检测引物对和c.*108G>C突变检测引物对，并通过调整引物浓度、退火温度等反应条件构建了稳定的扩增体系，结合PCR技术以及Sanger测序，实现了对样本DNA中THRβ基因c.1144+19G>A和c.*108G>C突变的快速稳定检测，且检测结果准确可靠，为临床甲状腺激素抵抗综合症的鉴别诊断提供了帮助，从而减少临床误诊和漏诊的现象发生。

附图说明

图1为样本20、样本118、样本121、样本123检测THRβ基因c.1144+19G位点的测序结果。

图2为样本20、样本118、样本121、样本123检测THRβ基因c.*108G位点的测序结果。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1：

本实施例提供了一种用于检测THRβ基因突变的试剂盒，所述用于检测THRβ基因突变的试剂盒包括血液DNA抽提试剂、检测体系PCR扩增反应液、测序体系试剂、阳性对照品和阴性对照品。其中，血液DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂,；检测体系PCR扩增反应液包括c.1144+19G>A突变检测引物对THRβ10-F/THRβ10-R或c.*108G>C突变检测引物对THRβ11-F/THRβ11-R，检测体系PCR扩增反应液具体配置见表2；测序体系试剂包括测序引物对M13-F、M13-R。

基于上述的试剂盒，本实施例还提供了一种体外非诊断目的的检测样本中THRβ基因突变的方法，具体包括以下步骤：

(1)抽提样本中的基因组DNA：采用血液基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)，具体操作步骤如下1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次；12000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)利用检测THRβ基因突变的引物对步骤(1)获得的基因组DNA进行扩增：1)按检测样本份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每份18μl分装，配置明细如下：

X＝18μl反应液×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；

n为检测样本数。

2)向检测体系PCR扩增反应液(表2)中加入2μl步骤(1)抽提得到的样本基因组DNA；阳性对照组和阴性对照组中分别加入2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照组中加入2μl生理盐水或不加任何物质。表2中，F为碱基序列如SEQ ID NO 1所示的THRβ10-F，或碱基序列如SEQ ID NO 3所示的THRβ11-F，R为碱基序列如SEQ ID NO 2所示的THRβ10-R，或碱基序列如SEQ ID NO 4所示的THRβ11-R；碱基序列具体参考表1。

表2.检测体系PCR扩增反应液

3)对样本、阳性对照组、阴性对照组以及空白对照组分别进行检测，检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如表2。对扩增后的产物进行电泳验证(1.5％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，凝胶成像系统观察)，电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。

表3.扩增条件

(3)利用测序引物对对步骤(2)获得的扩增产物进行Sanger测序：1)分别取步骤(2)获得的9μl PCR产物，与2μl纯化体系混合，按照表4程序进行纯化。

表4.纯化条件

2).分别将1μl纯化产物与测序引物(碱基序列如SEQ ID NO 5所示的M13-F、碱基序列如SEQ ID NO 6所示的M13-R，表1)按照表5体系进行混合后按表6程序进行测序反应。

表5.测序反应液

表6.测序反应程序

3).向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。

(4)将步骤(3)中的测序结果与野生型TRHβ(NG_009159.1)参考序列进行比对，确定THRβ基因突变结果，对结果进行报告。

实施例2

取2例临床证实是甲状腺激素抵抗综合征的EDTA抗凝全血样本118、样本121，另取2例正常对照样本20、样本123，按实施例1所述方法提取基因组、配制试剂并检测。检测结果见表7，测序如图1和图2所示。

表7.检测结果

结合图1和表7可知，患病样本118、样本121其TRHβ基因c.1144+19G位点均发生了杂合突变，即c.1144+19G>GA；而正常样本20、样本123没有发生突变。结合图2和表7可知，患病样本118、样本121其TRHβ基因c.*108G位点均发生杂合突变，即c.*108G>GC；而正常样本20、样本123没有发生突变。综上，本发明提供的检测THRβ基因突变的引物及方法可快速准确地对THRβ基因c.1144+19G>A和c.*108G>C突变进行快速稳定的检测，且检测结果准确可靠。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.检测THRβ基因突变的引物，其特征在于，包括：

c.1144+19G>A突变检测引物对，所述c.1144+19G>A突变检测引物对包括碱基序列如SEQ ID NO 1所示的THRβ10-F、碱基序列如SEQ ID NO 2所示的THRβ10-R；

和/或c.*108G>C突变检测引物对，所述c.*108G>C突变检测引物对包括碱基序列如SEQID NO 3所示的THRβ11-F、碱基序列如SEQ ID NO 4所示的THRβ11-R。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物对，所述测序引物对包括碱基序列如SEQ ID NO 5所示的M13-F、碱基序列如SEQ ID NO 6所示的M13-R。

3.如权利要求1或2所述的引物在制备检测THRβ基因突变的试剂盒中的应用。

4.包括权利要求1或2所述引物的用于检测THRβ基因突变的试剂盒。

5.如权利要求1所述的引物在制备检测THRβ基因多态性的试剂盒中的应用。

6.包括权利要求1所述引物的用于检测THRβ基因多态性的试剂盒。

7.体外非诊断目的的检测THRβ基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)抽提样本中的基因组DNA；

(2)利用检测THRβ基因突变的引物对步骤(1)获得的基因组DNA进行扩增；

(3)利用测序引物对对步骤(2)获得的扩增产物进行测序；

(4)将步骤(3)中的测序结果与野生型TRHβ(NG_009159.1)参考序列进行比对，

确定THRβ基因突变；

其中，

步骤(2)中所述检测THRβ基因突变的引物包括：

c.1144+19G>A突变检测引物对，所述c.1144+19G>A突变检测引物对包括碱基序列如SEQ ID NO 1所示的THRβ10-F、碱基序列如SEQ ID NO 2所示的THRβ10-R；

和/或c.*108G>C突变检测引物对，所述c.*108G>C突变检测引物对包括碱基序列如SEQID NO 3所示的THRβ11-F、碱基序列如SEQ ID NO 4所示的THRβ11-R；

步骤(3)中所述测序引物对包括碱基序列如SEQ ID NO 5所示的M13-F、碱基序列如SEQID NO 6所示的M13-R。