CZ9902003A3 - Polypeptidy kódované lidským genem podobným lipáze, kompozice a způsoby - Google Patents

Description

Polypeptidy kódované lidským genem podobným lipáze, kompozice a způsoby

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká polypeptidů rodiny triacylglycerol-lipasy, nukleových kyselin kódujících uvedené polypeptidy, protismyslných sekvencí odvozených od uvedených nukleových kyselin a protilátek proti uvedeným polypeptidům. Předkládaný vynález se také týká přípravy uvedených polypeptidů za použití rekombinantní technologie a použití uvedených polypeptidů pro vyhledávání agonistú a antagonistú uvedených polypeptidů. Předkládaný vynález se také týká způsobů pro terapeutické použití takových polypeptidů a nukleových kyselin kódujících tyto polypeptidy ve farmaceutických prostředcích, včetně prostředků pro genovou terapii, pro léčbu onemocnění lipidového a lipoproteinového metabolismu.

Dosavadní stav techniky

A) Lipidy

Lipidy jsou ve vodě nerozpustné organické biomolekuly, které jsou základními složkami různých biologických funkcí, včetně skladování, transportu a metabolismu energie a membránové struktury a kapalnosti. Lipidy jsou lidí a jiných živočichů získávány ze dvou zdrojů: některé lipidy jsou přijímány potravou jako potravinové tuky a oleje a jiné lipidy jsou biosyntetizovány člověkem nebo živočichem. U savců tvoří lipidy alespoň 10% tělesné hmotnosti, z nichž většina je ve formě triacylglycerolů.

Triacylglyceroly, též známé jako triglyceridy a triacylglyceridy, jsou tvořeny třemi mastnými kyselinami

esterifikovanými na glycerol. Potravinové triacylglyceroly jsou skladovány v tukové tkáni jako zdroj energie, nebo jsou hydrolyzovány v trávícím traktu triacylglycerol-lipasami, z nichž nejvýznamnější je pankreatická lipasa. Triacylglyceroly jsou transportovány mezi tkáněmi ve formě lipoproteinů.

Lipoproteiny jsou micelovitá seskupení, která se nacházejí v plasmě a obsahují různé poměry různých typů lipidů a proteinů (nazývaných apoproteiny). Existuje pět hlavních tříd plasmatických lipoproteinů, jejichž hlavní funkcí je transport lipidů. Tyto třídy jsou, podle zvyšující se hustoty, chylomikrony, lipoproteiny s velmi nízkou hustotou (VLDL), lipoproteiny se střední hustotou (IDL), lipoproteiny s nízkou hustotou (LDL) a lipoproteiny s vysokou hustotou (HDL). Ačkoliv se společně s každou třídou lipoproteinů vyskytují různé typy lipidů, transportuje každá třída především jeden typ lipidů; triacylglyceroly popsané výše jsou transportovány v chylomikronech, VLDL a IDL, zatímco fosfolipidy a estery cholesterolu jsou transporotvány v HDL a LDL, v příslušném pořadí.

Fosfolipidy jsou diestery mastných kyselin s glycerofosfatem, které také obsahuj í polární skupinu navázanou na fosfát. Fosfolipidy jsou významnou strukturální složkou buněčných membrán. Fosfolipidy jsou hydrolyzovány enzymy zvanými fosfolipasy. Fosfatidylcholin, příklad fosfolipidu, je hlavní složkou membrán většiny eukaryotických buněk.

Cholesterol je metabolickým prekursorem steroidních hormonů a žlučových kyselin, stejně jako je základní složkou buněčných membrán. U lidí a u jiných živočichů je cholesterol přijímán potravou a též je syntetizován v játrech a v jiných tkáních. Cholesterol je transportován mezi tkáněmi ve formě

I • · · · cholesteryl-esterů v LDL a jiných lipoproteinech.

Membrány obklopují každou živou buňku a slouží jako bariera mezi intracelulárním a extracelulárním kompartměntem. Membrány také obklopují jádro eukaryotických buněk, tvoří endoplasmatické retikulum a slouží ve specializovaných funkcích jako jsou například myelinové pochvy obklopující axony. Typická membrána obsahuje přibližně 40% lipidů a 60% proteinů, ale v tomto poměru existují významné odchylky. Hlavními lipidovými složkami jsou fosfolipidy, zejména fosfatidylcholin a fosfatidylethanolamin, a cholesterol. Fyzikálně-chemické vlastnosti membrán, jako kapalnost, mohou být změněny modifikaci profilu fosfolipidů mastných kyselin nebo obsahu cholesterolu. Modulování složení a organizace membránových lipidů také ovlivňuje buněčné funkce závislé na membráně, jako je aktivita receptorů, endocytosa a tok cholesterolu.

B) Enzymy

Triacylglycerol-lipasy jsou rodinou enzymů, která má mnoho zásadních funkcí v metabolismu lipidů v těle. Byly popsány tři členy lidské rodiny triacylglycerol-lipas: pankreatická lipasa, lipoproteinová lipasa a jaterní lipasa (Goldberg, I.J., Le, N.A., Ginsberg, H.N., Krauss, R.M., a Lindgren, F.T. (1988) J. Clin. Invest. 81: 561 - 568; Goldberg, X.J., Le, N., Paterniti, J.R., Ginsberg, H.N., Lindgren, F.T. a Brown, W.V. (1982) J. Clin. Invest. 70: 1184 - 1192; Hide, W.A., Chán, L., a Li, W.-H., (1992) J. Lipid Res. 33: 167 - 178). Pankreatická lipasa je primárně odpovědná za hydrolýzu potravinových lipidů. Byly popsány varianty pankreatické lipasy, ale jejich fyziologická funkce nebyla určena (Giler, T., Buchwald, P., Blum-Kaelin, D. a Hunziker, W., (1992) J. Biol. Chem. 267: 16509 - 16516). Lipoproteinová lipasa je hlavním enzymem odpovědným za distribuci

a využití triacylglyceridů v těle. Lipoproteinová lipasa hydrolyzuje triglyceridy jak v chylomikronech, tak ve VLDL. Jaterní lipasa též působí jako fosfolipasa a hydrolyzuje fosfolipidy v HDL.

Fosfolipasy mají významnou úlohu v katabolismu a remodelování fosfolipidovych složek lipoproteinů a fosfolipidů v membránách. Fosfolipasy mají také funkci v uvolňování kyseliny arachidonové a v následné tvorbě prostaglandinů, leukotrienů a jiných lipidů, které se účastní různých zánětlivých procesů.

Lipasové polypeptidy kódované těmito lipasovými geny mají délku přibližně 450 aminokyselin s vedoucími signálními peptidy pro usnadění sekrece. Lipasové proteiny se skládají ze dvou hlavních domén (Winkler, K., D'Arcy, A., a Hunziker, W., (1990),

Nátuře 343: 771 - 774). Amino-koncová doména obsahuje katalytické místo, zatímco o karboxy-koncové doméně se předpokládá, že je odpovědná za vazbu substrátu, asociaci s kofaktorem a za interakce s buněčnými receptory (Wong, H,, Davis, R.C., Nikazy, J., Seebart, K.E. a Schotz, M.C. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 88: 11290 - 11294; van Tilbeurgh, H. Roussel, A., Lalouel, J.M., a Cambillau, C., (1994) J. Biol. Chem. 269: 4626 - 4633; Wong, H., Davis, R.C., Thuren, T., Goers, J.W., Nikazy, J.,

Waite, Μ., a Schotz, M.C. (1994) J. Biol. Chem. 269: 10319 10323; Chappel, D.A., Inoue, I., Fry, G.L., Pladet, M.W., Bowen, S.L., Iverius, P.-H., Lalouel, J.M., a Strickland, D.K. (1994) J. Biol. chem. 269: 18001 - 18006). Celková úroveň aminokyselinové homologie mezi členy rodiny je 22 - 65%, s lokálními regiony vysoké homologie odpovídajícím strukturálním homologiím, které jsou spojeny s enzymatickou funkcí.

Přirozený protein lipoproteinové lipasy je glykosylovaný a glykosylace je nutná pro enzymatickou aktivitu LPL (Semenkovich, • « · · · · ·· ·· ·· ·· ·· · · · · ·

C.F., Luo, C.-C., Nakanishi, M.K., Chen, S.-H., Smith, L.C. a Chán, L. (1990) J. Biol. Chem. 265: 5429 - 5433). Existují tři místa pro N-vázanou glykosylaci na jaterní a lipoproteinové lipase a jedno místo na pankreatické lipase. Dále, čtyři sady cysteinů tvoří disulfidové můstky, které jsou nutné pro zachování strukturální integrity nutné pro enzymatickou aktivitu (Lo,

J.-Y., Smith, L.C. a Chán, L. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 206: 266 - 271; Brady, L., Brzozowski, A.M., Dereweda, Z.S., Dodson, E., Dodson, G., Tolley, S., Turkenburg, J.P., Christiansen, L., Huge-Jensen, B., Norskov, L., Thim, L., a Menge, U., (1990) Nátuře 343: 767 - 770).

Členové rodiny triacylglycerol-lipas mají společné mnohé strukturální charakteristiky. Jedni rysem je GXSXG motiv, ve kterém je centrální serinový zbytek jedním ze tří zbytků obsahujících katalytickou trias (Winkler, K., D'Arcy, A., a Hunziker, W., (1990), Nátuře 343: 771 - 774; Faustinella, F.,

Smith, L.C. a Chán, L., (1992) Biochemistry 31: 7219 - 7223).

Konzervované asparagové a histidinové zbytky vytvářejí rovnováhu katalytické trias. Krátký úsek o 19 - 23 aminokyselinách (víčkový region) tvoří amfipatickou šroubovici a pokrývá katalytickou kapsu enzymu (Winkler, K., D'Arcy, A., a Hunziker, W., (1990), Nátuře 343: 771 - 774). Tento region odlišuje členy rodiny a nedáno bylo zjištěno, že určuje substrátovou specificitu enzymu (Dugi, K.A., Dichek, H.L., a Santamarina-Fojo, S., (1995)

J. Biol. Chem. 270: 25396 - 25401). Srovnání mezi jaterní a lipoproteinovou lipasou prokázalo, že rozdíly v triacylglycerol lipasové a fosfolipasové aktivitě enzymů jsou částečně způsobeny tímto víčkovým regionem (Dugi, K.A., Dichek, H.L. a Santamarina Fojo, S., (1995) J. Biol. Chem. 270: 25396 - 25401).

Triacylglycerolové-lipasy mají různý stupeň vazebné aktivity pro heparin. Lipoproteinová lipasa má nejvyšší afinitu pro

heparin a tato vazebná aktivita byla lokalizována na řetězce pozitivně nabitých zbytků v amino-koncové doméně (Ma, Y., Henderson, H.E., Liu, M.S., Zhyng, H., Forsyte, I.J.,

Clarke-Lewis, I., Hayden, M.R., a Brunzell, J.D., J. Lipid Res., 35: 2049 - 2059). Lokalizace lipoproteinové lipasy na povrch endotelu (Cheng, C.F., Oosta, G.M., Bensadoun, A., a Rosenberg, R.D. (1981) J. Biol. Chem. 256: 12893 - 12896) je primárně zprostředkována vazbou na povrchové proteoglykany (Shimada, K., Gill, P.J., Silbert, J.E., Douglas, W.H.J., a Fanburg, B.L., (1981) J. Clin. Invest. 68: 995 - 1002; Saxena, U., Klein, M.G., a Goldberg, I.J., (1991) J. Biol. Chem. 266: 17516 - 17521;

Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T. a Vlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest. 90: 2013 - 2021). Tato vazebná aktivita umožňuje enzymu akcelerovat vychytávání LDL tím, že působí jako můstek mezi LDL a povrchem buněk (Mulder, M., Lombardi, P., Jansen, H., vanBerkel, T.J., Frants, R.R. a Havekes, L.M. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 185: 582 - 587; Rutledge, J.C. a Goldberg, I.J. (1994) J. Lipid Res. 35: 1152 - 1160; Tsuchia, S., Yamabe, M., Yamaguchi, T., Kobayashi, Y, Konno, T., a Tada, K. (1980)

Int. J. Cancer 26: 171 - 176) .

lipoproteinové lipase a jaterní lipase je obou známo, že působí spolu s ko-aktivačními proteiny: apolipoproteinem Cil pro lipoproteinovou lipasu a ko-lipasou pro pankreatickou lipasu.

Genové sekvence kódující lidskou pankreatickou lipasu, jaterní lipasu a lipoproteinovou lipasu byly popsány (Genbank přírůstkové Č. M93285, J03540 a M15856, v příslušném pořadí). Mediátorová RNA lidské jaterní lipasy a pankreatické lipasy mají délky přibližně

1,7 a 1,8 kilobází, v příslušném pořadí. Dva mRNA transkripty o 3,6 a 3,2 kB jsou produkovány z lidského genu pro lipoproteinovou lipasu. Tyto dva transkripty využívají alternativní polyadenylační signály a liší se ve své transkrípční účinnosti • 4 4 4 4 4 4 4 ·»*(·· 4 4 4 4 ♦ (Ranganathan, G., Ong, J.M., Yukht, A., Saghizadeh, M., Simsolo, R.B., Pauer, A., a Kern, P.A. (1995) J. Biol. Chem. 270: 7149 7155).

C. Fyziologické procesy

Metabolismus lipidů zahrnuje interakce lipidů, apoproteinů, lipoproteinů a enzymů.

Jaterní lipasa a lipoproteinová lipasa jsou multifunkční proteiny, které zprostředkují vazbu, vychytávání, katabolismus a remodelování lipoproteinů a fosfolipidů. Lipoproteinová lipasa a jaterní lipasa jsou funkční při navázání na luminální povrch endotelových buněk v periferní tkáni a v játrech, v příslušném pořadí. Oba enzymy se účastní v reverzním transportu cholesterolu, což je přesun cholesterolu z periferních tkání do jater, bud' z důvodů exkrece z těla nebo recyklace. Genetické defekty v jaterní lipase a lipoproteinové lipase jsou známé a jsou příčinou dědičných onemocnění lipoproteinového metabolismu. Defekty v metabolismu lipoproteinů vedou k závažným metabolickým onemocněním, včetně hypercholesterolemie, hyperlipidemie a atherosklerosy.

Atherosklerosa je komplexní, polygenní onemocnění, které je histologicky definováno depozity (lipidovými nebo fibrolipidovými plaky) lipidů a jiných krevních derivátů ve stěně cév, zejména velkých arterií (aortě, koronárních arteriích, karotidách).

Tyto plaky, které jsou více či méně kalcifikovány, podle stupně progrese atherosklerotického procesu, mohou být spojeny s lšzemi a jsou asociovány s akumulací tukových depozit v cévách, kde se tato depozita skládají hlavně z esterů cholesterolu. Tyto plaky jsou doprovázeny ztluštěním stěny cév, hypertrofií hladkého svalu, výskytem pěnitých buněk (buňky obsahující lipidy vzniklé

z makrofágú nekontrolovatelně vychytávajících cholesterol) a akumulací vazivové tkáně. Atheromový plak přesahuje stěnu, vytváří stenosu, která je odpovědná za oklusy cévy atheromem, trombem nebo embolem, k čemuž dochází u nejvíce postižených pacientů. Takové léze mohou vést ke vzniku závažných kardiovaskulárních patologických stavů, jako je infarkt, náhlá smrt, srdeční insuficience a mrtvice.

Funkce triacylglycerol-lipas u vaskulárních patologických stavů jako je atherosklerosa byla intenzivně zkoumána (přehled je uveden v Olivecrona, G. a Olivecrona, T. (1995) Curr. Opin. Lipid. 6: 291 - 305). Obecně se soudí, že účinek triacylglycerol-lipas je antiatherogenní, protože tyto enzymy snižují hladiny sérových triacylglycerolů a podporují tvorbu HDL. Transgenní zvířata exprivující lidskou lipoproteinovou lipasu a jaterní lipasu mají snížené koncentrace plasmatických triglyceridů a zvýšené hladiny lipoproteinů s vysokou hustotou (HDL) (Shimada, M., Shimano, H., Gotoda, T., Yamamoto, K., Kawamura, M., Inaba, T., Yazaki, T. a Yamada, N. (1993) J. Biol. chem. 268: 17924 - 17929; Liu, M.-S., Jirik, F.R., LeBoeuf, R.C., Henderson, H., Castellani, L.W., Lusis, A.J., Ma, Y., Forsythe,

I. J., Zhang, H., Kirk, E., Brunzell, J.D. a Hayden, M.R. (1994)

J. Biol. Chem. 269: 11417 - 11424). Bylo zjištěno, že lidé s genetickými defekty vedoucími k snížené aktivitě lipoproteinové lipasy mají hypertriglyceridemii, ale nemají vyšší riziko koronárních onemocnění. Je popsáno, že tato skutečnost je způsobena tím, že chybí produkce středně velikých, atherogenních lipoproteinů, které se mohou akumulovat v subendotelovém prostoru (Zilversmit, D.B. (1973) Circ. Res. 33: 633 - 638).

V lokalizované oblasti atherosklerotické léze se nicméně předpokládá, že zvýšená lipasová aktivita akceleruje atherogenní proces (Zilversmit, D.B. (1995) Clin. Chem. 41: 153 - 158;

Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C., Moojani, S., Lupien, P.J., Hayden, M.R. a Brunzell, J.D. (1993) Lancet 341: 1119 - 1121). Toto může být způsobeno vyšší vazbou a vychytáváním lipoproteinů cévní tkání, které je způsobeno lipasami (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T. a Vlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest. 90: 2013 - 2021; Tabas, I., Li, I., Brocia, R.W., Xu,

S.W., Swenson, T.L., Williams, K.J. (1993) J. Biol. Chem. 268: 20419 - 20432; Nordestgaard, B.G. a Nielsen, A.G. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5: 252 - 257; Williams, K.J. a Tabas, I. (1995) Art. Thromb. and Vasc. Biol. 15: 551 - 561). Dále, vysoká lokální hladina lipasové aktivity může vést k cytotoxickým koncentracím mastných kyselin a lysofosfatidylcholinu v prekursorových atherosklerotických lézích.

Přes znalosti funkce lipasové aktivity v homeostase lipidů nebyly v oboru identifikovány další geny kódující proteiny, které regulují metabolismus lipidů.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká objevu lipase-podobného genu (LLP), jeho exprivovaného polypeptidového produktu a prostředků a způsobů pro jeho použití. LLP polypeptid se váže na heparin, má homologii s lidskou lipoproteinovou lipasou a jaterní lipasou a obsahuje 39 kD katalytickou doménu náležící do rodiny triacylglycerol-lipas. V dalším provedení má polypeptid aktivitu fosfolipasy A.

Předkládaný vynález obsahuje izolovaný polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 10.

Předkládaný vynález dále obsahuje izolovaný polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 8, který má molekulovou hmotnost • 1 ··· · přibližně 55 kD nebo 68 kD na 10% SDS-PAGE gelu.

Předkládaný vynález také obsahuje izolovaný polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 6, který má molekulovou hmotnost přibližně 40 na 10% SDS-PAGE gelu.

Vynález dále obsahuje antigenní fragment LLG polypeptidů.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je nukleová kyselina kódující polypeptid mající výše uvedené sekvence.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je vektor obsahující výše uvedenou nukleovou kyselinu kódující uvedený polypeptid, která je operativně navázaná na regulační region, jako je promotor.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je rekombinantní buňka obsahující výše uvedený vektor.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je způsob přípravy polypeptidů, který obsahuje kultivaci rekombinantních buněk obsahujících uvedenou nukleovou kyselinu kódující polypeptid za podmínek umožňujících expresi uvedeného polypeptidů.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je protilátka, která je schopná specifické vazby na polypeptid a/nebo neutralizace biologické aktivity polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Dále, další charakteristikou polypeptidů podle předkládaného vynálezu je to, že se specificky váže na protilátku podle předkládaného vynálezu, t.j. na protilátku specifickou pro LLG polypeptid.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je prostředek obsahující

polypeptid, nukleovou kyselinu, vektor, protismyslnou nukleovou kyselinu nebo protilátku podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je způsob pro vyhledávání agonistů a antagonistů enzymatické aktivity vykazované polypeptidy podle předkládaného vynálezu, který obsahuje kontaktování potenciálního agonisty nebo antagonisty s uvedenými polypeptidy a jejich substráty a měření schopnosti potenciálních agonistů nebo antagonistů potencovat nebo inhibovat aktivitu.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je způsob pro enzymatickou hydrolýzu fosfatidylcholinesteru, který obsahuje kontaktování uvedeného fosfatidylcholinesteru s polypeptidem podle předkládaného vynálezu.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je způsob léčby vedoucí ke zlepšení profilu sérových lipidů u lidí a jiných živočichů, kteří mají nežádoucí profil lipidů, při kterém je uvedeným živočichům podáno účinné množství prostředku podle předkládaného vynálezu.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je způsob léčby nebo prevence atherosklerosy u lidí a jiných živočichů, při kterém je uvedeným živočichům podáno účinné množství prostředku podle předkládaného vynálezu.

Jiné aspekty a výhody předkládaného vynálezu jsou popsány dále v obrázcích a v následujícím podrobném popisu výhodných provedení předkládaného vynálezu.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje sekvence (SEQ ID NO: 17 - 31) primerů použitých v příkladných PCR amplifikacích.

Obr. 2 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO: 1) a odvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 2) RT-PCR produktu diferenciálního zobrazení obsahujícího cDNA lipase-podobného genu. Sekvence odpovídající dvěma primerům použitým v amplifikaci jsou podtrženy. Terminační kodon a polyadenylační signál jsou orámečkovány. GAATTC motivy a sousedící sekvence jsou z pCRII vektoru, do kterého byl produkt klonován.

Obr. 3 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO: 3) a odvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 4) 5'-RACE extenze LLG cDNA. Sekvence odpovídající dvěma primerům použitým v amplifikaci jsou podtrženy. GAATTC motivy a sousedící sekvence jsou z pCRII vektoru, do kterého byl produkt klonován.

Obr. 4 ukazuje sekvenci (SEQ ID NO: 7) cDNA obsahující kompletní otevřený čtecí rámec lipase-podobného genu, LLGXL.

Start kodon (ATG) a terminační kodon (TGA) jsou orámečkovány.

Dral místo (TTTAAA) a Srfl místo (GCCCGGGC) použité při konstrukci expresních vektorů jsou podtrženy.

Obr. 5 ukazuje odvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 8) LLGXL proteinu. Předpokládaná signální sekvence je podtržena.

Obr. 6 ukazuje přiřazení proteinové sekvence členů triacylglycerol-lipasové genové rodiny (SEQ ID NO: 13 - 15). Zbytky v rámečku jsou identické s LLGXL proteinem (SEQ ID NO: 8). Mezery byly vloženy do sekvencí pro maximalizaci přiřazení za « 4 4 4 44 4

4 4 · • · · · • 4 4 · 4

44« 444 44 4

44

4 4 4 • 4 4 · • *4 ·

4 4 4

44 použití CLUSTAL programu.

Obr. 7 ukazuje Northern analýzu LLG mRNA v THP-1 buňkách.

Buňky byly stimulovány buď PMA nebo PMA a oxidovaným LDL (PMA + oxLDL). Čísla vlevo ukazují pozice RNA standardů (v kilobazích).

Obr. 8 ukazuje northern analýzu mRNA z více lidských tkání, která byla sondována cDNA pro LLG, lipoproteinovou lipasu (LPL) a lidský beta-aktin. Pozice 4,4 kB RNA standardu je uvedena vlevo na LLG a LPL panelech.

Obr. 9 ukazuje Northern analýzu LLG a LPL exprese v kultivovaných lidských endotelových buňkách a v THP-1 buňkách. Buňky byly buď nestimulované (nevystavené PMA), nebo stimulované PMA.

Obr. 10 ukazuje sekvenci imunizujícího peptidu (SEQ ID NO: 16) a její vztah k sekvenci LLGXL proteinu. Peptid je uveden v rámečku. Terminální cystein byl vložen pro usnadnění vazby peptidu na proteinový nosič.

Obr. 11 ukazuje Western analýzu heparinem-Sepharosou koncentrovaných proteinů z kondicionovaného media kultivovaných endotelových buněk. Skvrna byla sondována anti-LLG antisérem. Čísla nalevo ukazují pozici proteinových standardů v kilodaltonech.

Obr. 12 ukazuje Western analýzu proteinů navázaných na heparin-Sepharosu v kondicionovaném mediu COS-7 buněk dočasně transfektovaných expresním vektorem obsahujícím cDNA ro LLGN nebo LLGXL nebo neobsahujícím DNA (falešným vektorem). Proteiny z endotelových buněk stimulovaných PMA (HCAEC + PMA) byly použity pro kontrolu velikosti. Čísla nalevo uvádějí zřetelné molekulové

• • ·	« • Φ	«·		9 · •	•	*	« * • *
•	<	•	•		•	•	• *
*
♦	•	•	•	•	•	•	• ·
··»	• » ·	• ft			t «

hmotnosti hlavních imunoreaktivních proteinů, jak byly určeny srovnáním s proteinovými standarty.

Obr. 13 ukazuje sekvenci králičího LLG PCR produktu (RELLG.SEQ, SEQ ID NO: 12) a přiřazení sekvence mezí králičím LLG PCR produktem a odpovídající sekvencí v lidské cDNA (LLG7742A). Identické nukleotidy jsou v rámečku.

Obr. 14 ukazuje aktivitu fosfolipasy A u lidského LPL, LLGN a LLGXL, za použití fosfatidylcholinového substrátu.

Obr. 15.ukazuje aktivitu triacylglycerid-lipasy u lidského LPL, LLGN a LLGXL, za použití trioleinového substrátu.

Obr. 16 ukazuje hybridizaci LLG a LPL sond na genomové DNA z různých druhů.

Předkládaný vynález se týká objevu lipase-podobného genu (LLP) a jeho exprivovaného polypeptidového produktu. Polypeptidový produkt, člen triacylglycerol-lipasové rodiny, obsahuje 39 kD katalytickou doménu náležící do rodiny triacylglycerol-lipas, která má například sekvenci SEQ ID NO: 10. Jedním provedením předkládaného vynálezu je LLGN polypeptid, který obsahuje 354 aminokyselin. Druhým provedením předkládaného vynálezu je LLGXL polypeptid, který obsahuje 500 aminokyselin a vykazuje 43% podobnost s lidskou lipoproteinovou lipasou a 37% podobnost S lidskou jaterní lipasou. LLGXL polypeptid má aktivitu fosfolipasy A.

Vynálezci izolovali částečnou cDNA z mRNA THP-1 buněk, které byly vystaveny forbolesteru a oxidovaným LDL. Po 5¹-RACE extenzi této částečné cDNA byla izolována menší alternativně sestřižená cDNA. Druhá, větší cDNA byla izolována z lidské placentární cDNA knihovny.

Norther analýzy prokázaly, že LLG gen je exprivován v endotelových buňkách. Antisérum proti peptidu předpokládané odvozenému z otevřeného čtecího rámce cDNA detekovalo proteiny předpokládané velikosti pro LLGN a LLGXL v kondicionovaném mediu z kultivovaných endotelových buněk. Zpracování endotelových buněk forbolesterem vedlo ke zvýšené produkci LLG jak na úrovni mRNA, tak na úrovni proteinů. Jedná se prvního člena triacylglycerollipasové rodiny, jehož exprese byla zjištěna v endotelových buňkách.

A) Definice

Následující definované termíny jsou použity v předkládané přihlášce a měly by napomoci pochopení a provádění předkládaného vynálezu.

Polypeptid je polymerická sloučenina skládající se z kovalentně vázaných aminokyselinových zbytků. Aminokyseliny mají následující obecnou strukturu:

H

I

R-C-COOH

I nh₂

Aminokyseliny jsou klasifikovány do sedmi skupin podle vedlejšího řetězce R: (1) s alifatickým vedlejším řetezcem, (2) s vedlejším řetezcem obsahujícím hydroxylovou (OH) skupinu, (3) s vedlejším řetezcem obsahujícím atomy síry, (4) s vedlejším řetezcem obsahujícím kyselou nebo amidovou skupinu, (5) s vedlejším řetezcem obsahujícím bazickou skupinu, (6) s vedlejším řetezcem obsahujícím aromatický kruh, a (7) prolin, iminokyselinu, ve které je vedlejší.řetězec fúzován na aminoskupinu .

Protein je polypeptid, který má strukturální nebo funkční úlohu v živých buňkách.

Polypeptidy a proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být glykosylované nebo neglykosylované.

Homologie znamená podobnost sekvence, která je důsledkem společného evolučního původu. 0 polypeptidech a proteinech se uvádí že mají homologii, nebo podobnost, pokud je významná část jejich aminokyselin buď (1) identická, nebo (2) mají chemicky podobný vedlejší řetězec R. 0 nukleových kyselinách se říká, že mají homologii, pokud je významné množství jejich nukleotidů identické.

Izolovaný polypeptid nebo izolovaný protein je polypeptid nebo protein, který v podstatě neobsahuje ty sloučeniny, které obvykle obsahuje v přirozeném stavu (například jiné proteiny nebo polypeptidy, nukleové kyseliny, uhlovodany, lipidy). Termín izolovaný nevylučuje arteficiální nebo syntetizované směsi s jinými sloučeninami, nebo nevylučuje přítomnost nečistot, které neovlivňují biologickou aktivitu a které mohou být přítomny, například, v důsledku neúplného přečištění, přidání stabilizačních činidel, nebo zpracování do formy farmaceuticky přijatelného prostředku.

Molekula je antigenní, pokud je schopna specifické interakce s molekulou rozpoznávající antigen v imunitním systému, jako je ·· ···· imunoglobulin (protilátka) nebo antigení receptor T buněk. Antigenní polypeptid obsahuje nejméně 5, lépe alespoň 10, aminokyselin. Antigenní část molekuly může být ta část, která je imunodominantní pro rozpoznání protilátkou nebo receptorem T buněk, nebo to může být část použitá pro vytvoření protilátky k molekule pomocí konjugace antigenní části na molekulu nosiče pro imunizaci. Molekula, která je antigenní, nemusí být sama o sobě imunogenní, t.j. schopná vyvolání imunitní odpovědi bez nosiče.

LLGN polypeptid a LLGN protein je polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 6, kde uvedený polypeptid může být glykosylovaný nebo neglykosylovaný.

LLGXL polypeptid a LLGXL protein je polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 8, kde uvedený polypeptid může být glykosylovaný nebo neglykosylovaný.

LLG polypeptid obecně označuje LLGN polypeptid a LLGXL polypeptid.

LLG polypeptid nebo protein podle předkládaného vynálezu zahrnuje jakýkoliv analog, fragment, derivát nebo mutant odvozený od LLG polypeptidů, který si uchovává alespoň jednu biologickou vlastnost LLG polypeptidů. V přírodě existují různé varianty LLG polypeptidů. lyto varianty mohou být alelické varianty charakterizované rozdíly v nukleotidových sekvencích strukturálního genu kódujícího protein, nebo mohou obsahovat odlišný sestřih nebo postranslační modifikace. Odborníci v oboru mohou vyrobit varianty mající jednu nebo více aminokyselinových substitucí, deleci, adicí nebo přesunů. Tyto varianty mohou zahrnovat, mimo jiné: (a) varianty, ve kterých je jeden nebo více aminokyselinových zbytků substituován konzervativní nebo nekonzervativní aminokyselinou, (b) varianty, ve kterých je jedna ·· ···· • · ··

44 · · · ·

4 9 4 4

4 · 9 4

4 4 4

44 nebo více aminokyselin přidána k LLG polypeptidů, (c) varianty, ve kterých jedna nebo více aminokyselin obsahuje substituent, a (d) varianty, ve kterých je LLG polypeptid fúzován s jiným polypeptidem, jako je sérový albumin. Jiné LLG polypeptidy podle předkládaného vynálezu zahrnují varianty, ve kterých jsou aminokyselinové zbytky od jednoho druhu substituovány za odpovídající zbytky v jiném druhu, buď v konzervované nebo v nekonzervované pozici. V jiném provedení jsou aminokyselinové zbytky v nekonzervovaných pozicích substituovány konzervativními nebo nekonzervativními zbytky. Techniky pro získání těchto variant, včetně genetických (suprese, delece, mutace atd.), chemických a enzymatických technik, jsou odborníkům v oboru známé.

Pokud takové varianty, analogy, fragmenty, deriváty, mutanty a modifikace, včetně forem vzniklých alternativním sestřihem mRNA a forem vzniklých alternativním post-translačním zpracováním, vedou ke vzniku derivátů LLG polypeptidů, který si zachovává biologické vlastnosti LLG polypeptidů, pak spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Nukleová kyselina je polymerická sloučenina složená z kovalentně navázaných podjednotek, které se nazývají nukleotidy. Nukleové kyseliny zahrnují pólyribonukleovou kyselinu (RNA) a polydeoxyribonukleovou kyselinu (DNA), které mohou být obě jednořetězcové nebo dvouřetězcové. DNA zahrnuje cDNA, genomovou DNA, syntetickou DNA a semi-syntetickou DNA. Sekvence nukleotidů, která kóduje protein, se nazývá kódující sekvence.

Protismyslná nukleová kyselina je sekvence nukleotidů, která je komplementární ke kódující sekvenci. Protismyslné nukleové kyseliny mohou být použity pro snížení nebo blokádu exprese polypeptidů kódovaného kódujícím řetězcem.

9999

99

ΛΛ ·» · · · ···· •J J · 9 · · · · · ) J .···· · J · J J • 9 ··· * * * ··> 999 9* 9 9 9 ® *

Izolovaná nukleová kyselina je nukleová kyselina, která v podstatě neobsahuje ty sloučeniny, které obvykle obsahuje v přirozeném stavu. Termín izolovaná nevylučuje arteficiální nebo syntetizované směsi s jinými sloučeninami, nebo nevylučuje přítomnost nečistot, které neovlivňují biologickou aktivitu a které mohou být přítomny, například, v důsledku neúplného přečištění, přidání stabilizačních činidel, nebo zpracování do formy farmaceuticky přijatelného prostředku.

Termín nukleová kyselina, která hybridizuje při vysoké přísnosti znamená, že hybridizované nukleové kyseliny odolávají promývání při podmínkách vysoké přísnosti. Příkladem vysoce přísných promývacích podmínek pro DNA-DNA hybridy je 0,1 X SSC, 0,5% SDS při 68 °C. Jiné vysoce přísné promývací podmínky jsou odborníkům v oboru známé.

Regulační region označuje sekvenci nukleové kyseliny, která reguluje expresi nukleové kyseliny. Regulační region může obsahovat sekvence, které jsou přirozeně odpovědné za expresi určité nukleové kyseliny (homologní region) nebo může obsahovat sekvence jiného původu (odpovědné za expresi jiných proteinů nebo i syntetických proteinů). Konkrétně mohou být těmito sekvencemi sekvence eukaryotických nebo virových genů nebo odvozené sekvence, které stimulují nebo potlačují transkripci genu specifickým nebo nespecifickým způsobem a indukovatelným nebo neindukovatelným způsobem. Regulační regiony zahrnují elementy rozpoznávající počátek replikace, místa pro sestřih RNA, zesilovače transkripce, transkripční terminační sekvence, signální sekvence, které směrují polypeptid do sekreční dráhy cílové buňky a promotory.

Regulační region z heterologního zdroje je regulační region, který není přirozeně asociován s exprivovanou nukleovou

20* • φ c · • * • · · • · • ·» «Φ ··9 · ·« φφ • · · · • * · * t « · · · • · · <

«· »* kyselinou. Mezi tyto heterologní regulační regiony patří regulační regiony z jiných druhů, regulační regiony z jiných genů, hybridní regulační sekvence a regulační sekvence, které se přirozeně nevyskytují, ale které jsou navrženy odborníky.

Vektor je jakýkoliv prostředek pro přenos nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu do hostitelské buňky. Termín vektor zahrnuje jak virové, tak nevirové prostředky pro vložení nukleové kyseliny do prokaryotických nebo eukaryotických buněk in vivo, ex vivo nebo in vitro. Nevirové vektory zahrnují plasmidy, liposomy, elektricky nabité lipidy (cytofektiny), komplexy DNA-protein a biopolymery. Virové vektory zahrnují retrovirus, adeno-asociovaný virus, pox-virus, bakulovirus, virus vakcinie, herpes simplex virus, virus Epstein-Barrové a adenovirus. Kromě nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může vektor také obsahovat jeden nebo více regulačních regionů a /nebo selektovatelných markérů použitelných při selekci, měření a monitorování výsledků přenosu nukleové kyseliny (přenosu do určitých tkání, trvání exprese a podobně).

Rekombinantní buňka je buňka, která obsahuje nukleovou kyselinu, která se přirozeně nevyskytuje v buňce. Rekombinantní buňka může být vyšší eukaryotická buňka jako je savčí buňka, nižší eukaryotická buňka jako je kvasinka, prokaryotická buňka a archaebakteriální buňka.

Termín farmaceuticky přijatelný nosič označuje ředidla a plnidla, která jsou farmaceuticky přijatelná pro způsob podání, která jsou sterilní a kterými mohou být vodné nebo olejové suspenze vyrobené za použití vhodných dispergačních nebo smáčivých činidel a suspendačnich činidel. Konkrétní farmaceuticky přijatelný nosič a poměr aktivní sloučeniny k nosiči jsou určeny rozpustností a chemickými vlastnostmi • ·

• · · · · · · • · · · · · ·

00 * · · · ·

0 0 · · · · • 0 · · · · · prostředku, určitým způsobem podání a standardní farmaceutickou praxí.

Lipasa je protein, který enzymaticky štěpí lipidový substrát.

Fosfolipasa je protein, který enzymaticky štěpí fosfolipidový substrát.

Triacylglycerol-lipasa je protein, který enzymaticky štěpí triacylglycidový substrát.

Fosfatidylcholin je glycerolový fosfolipid mající následující strukturu:

O

II

R-— c— O-CH₂

R'—C-O-CH _n

II I ii + o H₂c—O—p—o—CH~CH₂—N(CH₃)₃

0' kde R a R' jsou uhlovodíkové vedlejší řetězce mastných kyselin. Fosfatidylcholin je také známý jako lecitin.

Termín lipidový profil označuje sadu koncentrací cholesterolu, triglyceridů, lipoproteinového cholesterolu a jiných lipidů v lidském těle nebo v těle jiného živočicha.

Nežádoucí lipidový profil je stav, při kterém jsou koncentrace cholesterolu, triglyceridů nebo lipoproteinového cholesterolu mimo referenční meze pro věk a pohlaví. Obecně jsou koncentrace celkového cholesterolu > 200 mg/dl, plasmatických triacylglyceridů > 200 mg/dl, LDL cholesterolu > 130 mg/dl, HDL cholesterolu < 39 mg/ml nebo poměr celkového cholesterolu k HDL cholesterolu > 4,0 považovány za nežádoucí lípidový profil. Nežádoucí lípidový profil je asociován s mnoha patologickými stavy, včetně hyperlipidemie, diabetické hypercholesterolemie, atherosklerosy a jiných forem onemocněni koronárních arterií.

B) Polypeptidy

Předkládaný vynález obsahuje polypeptidy, které patří do triacylglycerol-lipasové rodiny a které obsahují 39 kD katalytickou doménu triacylglycerol-lipasové rodiny, například tu, která má sekvenci SEQ ID NO: 10. Jedním provedením předkládaného vynálezu je izolovaný LLG polypeptid obsahující SEQ ID NO: 6a mající zřetelnou molekulovou hmotnost přibližně 40 kDa na 10% SDS-PAGE gelu. Jiným provedením předkládaného vynálezu je izolovaný LLG polypeptid obsahující SEQ ID NO: 8a mající zřetelnou molekulovou hmotnost přibližně 55 kDa nebo 68 kDa na 10% SDS-PAGE gelu.

Polypeptidy a proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být rekombinantni polypeptidy, přirozené polypeptidy nebo syntetické polypeptidy a jejich zdrojem mohou být lidé, králíci nebo jiní živočichové. Polypeptidy jsou charakterizovány reprodukovatelnou jednou molekulovou hmotností a/nebo sadou více molekulových hmotností, chromatografickou odpovědí a elučními profily, aminokyselinovým složením a sekvencí a biologickou aktivitou.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány z přirozených zdrojů, jako jsou extrakty z placenty, lidské plasmy nebo z kondicionovaného media kultivovaných buněk, jako jsou makrofágy nebo endotelové buňky, za použití technik přečištění, které jsou v oboru známé.

Alternativně mohou být polypeptidy podle předkládaného vynálezu připraveny pomocí rekombinantní DNA technologie, která obsahuje vložení nukleové kyseliny kódující polypeptid do vhodného vektoru, inserci výsledného vektoru do vhodné hostitelské buňky, získání polypeptidu produkovaného výslednou hostitelskou buňkou a přečištění získaného polypeptidu.

C) Nukleové kyseliny

Předkládaný vynález obsahuje izolované nukleové kyseliny, které kódují LLG polypeptid.

Předkládaný vynález také obsahuje protismyslné nukleové kyseliny, které mohou být použity pro snížení nebo blokádu exprese LLG polypeptidů in vitro, in vivo nebo ex vivo.

Techniky rekombinantní DNA technologie j sou v oboru známé. Obecné metody pro klonování a expresi rekombinantnich molekul jsou popsány v Maniatis (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982) a v Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1987), které jsou zde uvedeny jako odkaz.

Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být navázány na jeden nebo více regulačníích regionů. Výběr vhodného regulačního regionu nebo regionů je pro odborníky v oboru snadný. Regulační regiony zahrnují promotory a mohou zahrnovat zesilovače transkripce, supresory a podobně.

Mezi promotory, které mohou být použity v předkládaném vynálezu patří jak konstitutivní promotory, tak regulovatelné (indukovatelné) promotory. Promotory mohou být eukaryotické nebo prokaryotické, podle hostitele. Mezi prokaryotické (včetně • · · ·· 9 ·«· • · · · 9 9 9 bakteriofágových) promotory použitelné v předkládaném vynálezu patří láci, lacZ, T3, T7, lambda Ρ*., Ρ_χ, a trp promotor. Mezi eukaryotické (včetně virových) promotory použitelné v předkládaném vynálezu patří ubikvitní promotory (například pro HPRT, vimentin, aktin, tubulin), intermediální vláknité promotory (například pro desmin, neurofilamenta, keratin, GFAP), terapeutické genové promotory (například pro MDR typ, CFTR, faktor VIII), tkáňově-specifické promotory (například aktinový promotor v buňkách hladkého svalu, nebo Fit a Flk promotory aktivní v endotelových buňkách), promotory, které jsou přednostně aktivovány v dělících se buňkách, promotory, které reagují na stimuly (například pro receptor steroidních hormonů, pro receptor pro kyselinu retinovou), tetracyklinem regulované transkripční modulátory, cytomegalovirový bezprostřední časný promotor, retrovirový LTR promotor, SV-40 promotor, Ela promotor a MPL promotor. Tetracyklinem regulované transkripční modulátory a CMV promotory jsou popsány v WO 96/01313, US 5168062 a 5385839, jejich obsah je zde uveden jako odkaz.

Výhodně jsou virové vektory použité v genové terapii replikace-deficientní, to znamená, že nejsou schopné autonomní replikace v cílových buňkách. Obecně, v genomech replikace-deficientních virových vektorů, které jsou použité ve způsobech podle předkládaného vynálezu, chybí alespoň jeden region, který je nutný pro replikaci viru v infikovaných buňkách. Tyto regiony mohou být buď eliminovány (zcela nebo částečně), nebo mohou být inaktivovány technikami, které jsou v oboru známé. Tyto techniky zahrnují úplné odstranění, substituci (jinou sekvencí, konkrétně insertovanou nukleovou kyselinou), částečnou delecí nebo adicí jedné nebo několika baží k esenciálnímu (pro replikaci) regionu. Takové techniky mohou být provedeny in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu, za použití technik genetické manipulace nebo zpracováním mutageními činidly.

• Β · »· · · · · ·

Výhodně jsou v replikace-deficientním viru zachovány genomové sekvence, které jsou nezbytné pro enkapsidaci virových částic.

Retroviry jsou integrující viry, které infikují dělící se buňky. Genom retroviru obsahuje dva LTR, sekvenci pro enkapsidaci a tři kódující regiony (gag, pol a env). Konstrukce rekombinantních retrovirových vektorů byla popsána, viz například EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atd. V rekombinantních virových vektorech jsou gag, pol a env geny obvykle deletovány, zcela nebo částečně, a jsou nahrazeny požadovanou heterologní sekvencí nukleové kyseliny. Tyto vektory mohou být vyrobeny z různých typů retrovirů, například z MoMuL ( Moloneyův virus myší leukemie), MSV ( Moloneyův virus myšího sarkomu), HaSV (virus Harveyho sarkomu), SNV (virus nekrosy sleziny), RSV ( virus Rousova sarkomu) a Friend viru.

Obecně je pro konstrukci rekombinantních retrovirů obsahujících sekvenci kódující LLG podle předkládaného vynálezu konstruován plasmid, který obsahuje LTR, enkapsidační sekvenci a kódující sekvenci. Tento konstrukt je použit pro transfekci nosičské buněčné linie, která je schopná nahradit funkce retroviru, které jsou deficitní v plasmidu. Obecně budou nosičské buněčné linie schopné exprivovat gag, pol a env geny. Takové nosičské buněčné linie byly popsány již dříve, například buněčná linie PA317 (US 4861719); PsiCRIP buněčná linie (WO 90/02806) a GP+envAm-12 buněčná linie (WO 89/07150). Kromě toho mohou rekombinantní buněčné linie obsahovat modifikace v LTR pro potlačení transkripční aktivity, stejně jako rozsáhlé enkapsidační sekvence, které mohou obsahovat část gag genu (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Rekombinantní retrovirové vektory jsou přečištěny standardními technikami známými v oboru.

	• • · •	• •	·♦	• · · · • · • ·	• · • •	• •	··
• •	• • •
	•	•		• ·		•	•	•
• ·	···		··	•	• ·			• ·

Adeno-asociované viry (AAV) jsou DNA viry relativně malé velikosti, které mohou integrovat, stabilním a místně specifickým způsobem, do genomu buněk, které infikují. Jsou schopny infikovat široké spektrum buněk bez indukce jakýchkoliv efektů na buněčný růst, morfologii nebo diferenciaci, a proto se nezdá, že by vyvolávaly u lidí patologické stavy. Genom AAV byl klonován, sekvencován a charakterizován. Obsahuje přibližně 4700 bází a obsahuje invertovaný terminální repetitiviní (ITR) region o přibližně 145 bazích na každém konci, který slouží jako sekvence rozpoznávajíce počátek replikace pro virus. Zbytek genomu je rozdělen do dvou základních regionů, které mají enkapsidační funkci: levou část genomu, která obsahuje rep gen, který se účastní virové replikace a exprese virových genů; a pravou část genomu, která obsahuje cap gen kódující kapsidové proteiny viru.

Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno (viz WO 91/18088; US 4797368; US 5139941; EP 488528) . Tyto publikace popisují různé konstrukty odvozené od AAV, ve kterých jsou rep a/nebo cap geny deletovány a jsou nahrazeny požadovaným genem, a dále popisují použití těchto konstruktů pro přenos požadovaného genu in vitro (do kultivovaných buněk) nebo in vivo (přímo do organismu).

Replikace-deficientní rekombinantní AAV podle předkládaného vynálezu může být připraven současnou transfekci plasmidu obsahujícího požadovanou sekvenci nukleové kyseliny obklopenou dvěma invertovanými terminálními repetitiviními (ITR) regiony, a plasmidem obsahujícím enkapsidační geny AAV (rep a cap geny), do buněčné linie, která je infikována lidským pomocným virem (například adenovirem). AAV rekombinanty, které jsou produkovány, jsou potom přečištěny standardními technikami. Vynález se také proto týká rekombinantního viru odvozeného od AAV, jehož genom obsahuje sekvenci kódující LLG polypeptid obklopenou ITR AAV. Vynález také obsahuje plasmid obsahující sekvenci kódující LLG • · ·» ···· ·· ·· • · ·· ·· · ···· • 9 · · · · · · · • · · · · · ·>·· · • · · · · ···· ··· ·· · 99 9 9 9 9 9 polypeptid. obklopenou ITR z AAV. Takový plasmid může být použit pro přenos LLG sekvence, kdy plasmid je - pokud je to vhodné inkorporován do liposomálního vektoru (pseudo-virus).

Ve výhodném provedení je vektorem adenovirový vektor.

Adenoviry jsou eukaryotické viry, které mohou být upraveny pro účinný přenos nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu do různých typů buněk.

Existují různé serotypy adenovirů. Z těchto serotypů jsou v předkládaném vynálezu přednostně použity typ 2 nebo typ 5 adenovirů (Ad 2 nebo Ad 5), nebo adenovirus zvířecího původu (viz WO 94/26914). Adenoviry zvířecího původu, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, zahrnují psí, hovězí, myší (například Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčí, prasečí, ptačí a opičí (například SAV) adenoviry. Výhodně je zvířecím adenovirem psí adenovirus, nejlépe CAV2 adenovirus (například Manhattan nebo kmen A26/61 (ATCC VR-800).

Výhodně obsahují replikace-deficientní adenovirové vektory podle předkládaného vynálezu ITR, enkapsidační sekvenci a požadovanou nukleovou kyselinu. Ještě lépe je alespoň jeden El region adenovirového vektoru nefunkční. Delece v El regionu je výhodně v rozsahu od nukleotidu 455 do nukleotidu 3329 v sekvenci adenovirů Ad5. Další regiony mohou být také modifikovány, konkrétně E3 region (WO 95/02697), E2 region (WO 94/28938), E4 region (WO 94/28152 a WO 94/12649) nebo jakýkoliv z pozdních genů L1-L5. Defektní retrovirové vektory jsou popsány v WO 95/02697.

Ve výhodném provedení má adenovirový vektor delece v El a E4 regionech. V jiném výhodném provedení má adenovirový vektor deleci v El regionu, do kterého je insertován E4 region a

•	•		•4 4444	44			4 4
• ·	• ·	•	4 4	4	4	4		•
4	4	4	4 4	4	4	4		4
								4
•	•	•	4 4	4	4	4		4
44 ·	• 44		44 4	44			44

sekvence kódující LLG (viz PR94 13355).

Replikace-deficientní rekombinantni adenoviry podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakoukoliv technikou známou v oboru (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; EP 185573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Konkrétně mohou být připraveny homologní rekombinaci mezí adenovirem a plasmidem, který obsahuje - mimo jiné - požadovanou DNA sekvenci. Homologní rekombinace je provedena po současné transfekci uvedeného adenovirů a plasmidu do vhodné buněčné linie. Použitá buněčná linie by měla být (i) transformovatelná uvedenými elementy, a (ii) měla by obsahovat sekvence, které jsou schopné doplnit část genomu replikacedef icientního adenovirů, výhodně v integrované formě, aby se předešlo riziku rekombinace. Příklady buněčných linií, které mohou být použity, jsou buněčná linie lidských embryonálních ledvin 293 (Graham et al., J. Genet. Virol. 36 (1977) 59)), která obsahuje levostrannou část genomu Ad5 adenovirů (12%) integrovanou do svého genomu, a buněčné linie, které jsou schopné doplnit funkce El a E4, jak jsou popsány v přihláškách WO 94/26914 a WO 95/02679. Rekombinantni adenoviry jsou získány a přečištěny za použití standardních technik molekulární biologie, které jsou v oboru dobře známé.

Snížení genové exprese za použití protismyslných nukleových kyselin může být provedeno na translační nebo na transkripční úrovni. Protismyslné nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou výhodně fragmenty nukleové kyseliny, které jsou schopné specifické hybridizace s celou nebo s částí nukleové kyseliny kódující LLG nebo s odpovídající mediátorovou RNA. Tyto protismyslné nukleové kyseliny mohou být syntetické oligonukleotidy, volitelně modifikované tak, že je zvýšena jejich stabilita a selektivita. Mohou jimy být také DNA sekvence, jejichž exprese v buňkách vede k produkci RNA, která je

4 44 «44« 44 44 · 4 44 4 4 4 4 4

4 44 « 444 4

44444 44 44 4

4 444 4444

444 444 44 · 44 4« komplementární k celé nebo k části mRNA pro LLG. Protismyslné nukleové kyseliny mohou být připraveny expresí celé nebo části sekvence vybrané ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 nebo SEQ ID NO: 11, v opačné orientaci, jak je to popsáno v EP 140308. Jakákoliv délka protismyslné sekvence je vhodná pro použití v předkládaném vynálezu, pokud je schopná snížení nebo blokování exprese LLG. Výhodně má protismyslná sekvence délku alespoň 20 nukleotidů. Příprava a použití protismyslných nukleových kyselin, DNA kódující protismyslnou RNA a použití oligo a genetických protismyslných sekvencí je popsána ve WO 92/15680, jejíž obsah je zde uveden jako odkaz.

D) Protilátky

Předkládaný vynález obsahuje protilátky proti LLG polypeptidu. Tyto protilátky mohou být monoklonální protilátky nebo polyklonální protilátky. Předkládaný vynález obsahuje chimérické, jednořetězcové a humanizované protilátky, stejně jako Fab fragmenty a produkty Fab expresní knihovny.

Polyklonální protilátky mohou být připarveny proti antigennímu fragmentu LLG polypeptidu, jak je popsáno v příkladu 4A. Protilátky mohou být také vyrobeny proti intaktnímu LLG proteinu nebo polypeptidu, nebo proti fragmentu, derivátu nebo epitopu proteinu nebo polypeptidu. Protilátky mohou být získány po podání proteinu, polypeptidu, fragmentu, derivátu nebo epitopu zvířeti, za použití technik a postupů v oboru známých.

Monoklonální protilátky mohou být připraveny podle techniky, kterou popsal Mishell, B.B. et al., Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman, ed.), San Francisco (1980). Stručně, polypeptid podle předkládaného vynálezu se použije pro imunizaci buněk sleziny Balb/c myší. Imunizované buňky seleziny se fúzují s • · myelomovými buňkami. Fúzované buňky obsahující charakteristiky slezinných a myelomových buněk se izolují růstem na HAT mediu, což je medium, které usmrcuje oba původní typy buněk, ale umožňuje přežití a růst fúzovaných buněk.

Monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být humanizované, aby se zabránilo vyvolání imunitní odpovědi hostitele vůči protilátkám. Humanizovaná protilátka je taková protilátka, ve které jsou komplementaritu určující regiony (CDR) a/nebo jiné části pracovního rámce variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce odvozeny od jiného než lidského imunoglobulinu, ale zbývající části molekuly jsou odvozeny od jednoho nebo více lidských imunoglobulinů. Humanizované protilátky také zahrnují protilátky charakterizované humanizovaným těžkým řetězcem spojeným s donorovým nebo akceptorovým nemodifikovaným lehkým řetězcem nebo chimérickým lehkým řetězcem, nebo naopak. Humanizace protilátek může být provedena technikami známými v oboru (viz například G.E. Mark and E.A. Padlan, Chapter 4, Humanization of Monoclonal Antibodies, The Handbook of Experimental Pharmacology, svazek 113, Springer-Verlag, New York, 1994). Pro expresi humanizovaných protilátek mohou být použita transgenní zvířata.

Techniky známé v oboru pro produkci jednořetězcových protilátek mohou být upraveny pro produkci jednořetězcových protilátek k imunogenním polypeptidům a proteinům podle předkládaného vynálezu.

Anti-LLG protilátky jsou užitečné v testech pro detekci nebo kvantifikaci hladin LLG. V jednom provedení tyto testy umožňují klinickou diagnostiku a hodnocení LLG u různých patologických stavů a umožňují testování účinnosti léčby.

• · · · • · 4 4 • · 4 · · · • 4 4 · · »

4 4 4 · 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

E) Způsoby pro vyhledávání agonistů a antagonistů

Předkládaný vynález obsahuje způsoby pro vyšetřování knihoven malých molekul nebo přirozených sloučenin na agonistickou aktivitu (zesilovací nebo ko-aktivační aktivitu včetně proteinových ko-aktivátorů) nebo antagonistickou aktivitu (inhibiční) vzhledem k LLGXL. Potenciální agonista nebo antagonista je kontaktován s LLGXL proteinem a substrátem LLGXL a měří se schopnost potenciálního agonisty nebo antagonisty zesilovat nebo inhibovat aktivitu LLGXL.

LLGXL protein použitý v této technice může být produkován rekombinantně v různých hostitelských buňkách, včetně savčích buněk (jak jsou uvedeny v příkladu 7), bakulovirem infikovaných hmyzích buněk, kvasinek a bakterií. LLG exprese ve stabilně transfektovaných CHO buňkách může být optimalizována methotrexatovou amplifikací buněk. LLGXL protein může být také přečištěn z přirozených zdrojů, jako je lidská plasma, extrakty z placenty, nebo z kondicionovaného media kultivovaných endotelových buněk, ΊΉΡ-1 buněk nebo makrofágů.

Optimalizace parametrů testu, včetně pH, koncentrací iontů, teploty, koncentrací substrátu a emulsifikačních podmínek, je určena empiricky odborníkem.

Substituenty mastných kyselin substrátů se mohou lišit v délce řetězce, stejně jako v množství a pozici nenasycených vazeb. Substráty mohou být radioaktivně značené v několika pozicích. Fosfolipidové substráty, jako je například fosfatidylcholin, mohou být radioaktivně značené, například v pozici Sn-1 nebo Sn-2 mastné kyseliny, nebo na glycerolu, fosfátu nebo polární hlavní skupiné (cholinu v případě fosfatidylcholinu).

• 4 444444 44 44

44 44 4 4 · · 4

4 444 4444

444 44 44 44 4

4 444 4444

444 444 44 4 44 44

Jako alternativa k radioaktivním značícím substrátům mohou být ve vyšetřovacích metodách použity také jiné třídy značkovacích substrátů, jako jsou fluorescentní substráty nebo substráty obsahující thio-skupinu.

Fluorescentní substráty jsou zejména užitečné pro vyšetřovací testy, protože enzymatická katalýza může být měřena kontinuálně měřením intenzity fluorescence, bez fyzikální separace (extrakce) produktů od substrátu. Příkladem fluorescentního fosfatidylcholinového substrátu je C_sNBD-BC{l-acyl-2-[6-(nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino] kaproylfosfatidylcholin.

Substráty obsahující thio-skupinu zahrnují 1,2-bis(hexanoylthio) -1,2-dideoxy-sn-glycero-3-fosforylcholin (L.J. Reynolds, W.N. Washburn, R.A. Deems, a E.A. Dennis, 1991, Methods in Enzymology 197: 3 - 23; L. Yu a E.A. Dennis, 1991, Methods in Enzymology 197: 65 - 75; L.A. Wittenauer, K. Shirai, R.L. Jackson, a J.D. Johnson, 1984, Biochem. Biophys. Res. Commun. 118: 894 - 901).

F) Hydrolýza fosfatidylcholinových esterů

Předkládaný vynález obsahuje způsob pro hydrolýzu fosfatidylcholinových esterů, například pro průmyslové použití nebo pro potravinářské zpracování, nebo pro použití v pracích prostředcích. Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro hydrolýzu fosfatidylcholinových esterů v roztoku, nebo mohou být enzymy navázány na pevný nosič, který je potom uveden do kontaktu se substrátem. Tento způsob může být použit pro výrobu lysofosfolipidů a volných mastných kyselin.

G) Prostředky

Předkládaný vynález obsahuje prostředky v biologicky ··· • · kompatibilním (biokompatibilním) roztoku, které obsahují polypeptidy, nukleové kyseliny, vektory a protilátky podle předkládaného vynálezu. Biologicky kompatibilní roztok je roztok, ve kterém je polypeptid, nukleová kyselina, vektor nebo protilátka podle předkládaného vynálezu udržován v aktivní formě, například ve formě zachovávající biologickou aktivitu. Například, polypeptid podle předkládaného vynálezu bude mít fosfolipasovou aktivitu; nukleová kyselina bude schopná replikace, translace informace, nebo bude schopná hybridizace na komplementární nukleovou kyselinu; vektor bude schopen transfekce cílových buněk; protilátka se bude vázat na polypeptid podle předkládaného vynálezu. Obecně bude takový biologicky kompatibilní roztok vodný roztok pufru, například Tris, fosfátového nebo HEPES pufru, obsahující ionty solí. Obvykle bude koncentrace iontů solí podobná fyziologickým koncentracím. V určitém provedení je biokompatibilní roztok farmaceuticky přijatelný přípravek. Biologicky kompatibilní roztoky mohou obsahovat stabilizační a konzervační činidla.

Takové prostředky mohou být připraveny pro lokální, orální, parenterální, intranasální, podkožní a intraokulární způsob podání. Parenterální podání zahrnuje intravenosní injekci, intramuskulární injekci, intraarteriální injekci nebo infusi. Prostředek může být podán parenterálně v jednotkové dávce obsahující standardní, dobře známé netoxické fyziologicky přijatelné nosiče, adjuvans a vehikula.

Výhodným sterilním prostředkem pro injekční podání může být roztok nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném rozpouštědle nebo ředidle. Příklady farmaceuticky přijatelných nosičů jsou fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, izotonický fyziologický roztok (například dihydrogen- nebo hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo • ·

hořečnatý, nebo směsi takových solí), Ringerův roztok, dextrosa, voda, sterilní voda, glycerol, ethanol, a jejich kombinace. 1, 3-butandiol a sterilní netěkavé oleje jsou výhodně použity jako rozpouštědla nebo suspendační činidla. Může být použit jakýkoliv nedráždivý netěkavý olej, včetně syntetických mono- nebo di-glyceridů. Mastné kyseliny jako je kyselina olejová se mohou také použít při přípravě injekčních roztoků.

Mediem prostředku může být také hydrogel, který je připraven z jakéhokoliv biokompatibilního nebo netoxického (homo- nebo hetero-) polymeru, jako je hydrofilní polymer polyakrylové kyseliny, který může sloužit jako houbovitá substance absorbující léčivo. Takové polymery byly popsány, například, v přihlášce WO 93/08845, jejíž celý obsah je zde uveden jako odkaz. Některé z těchto hydrogelů, zejména ty, které jsou získány z ethylenoxidu a/nebo propylenoxidu, jsou komerčně dostupné. Hydrogel může být umístěn přímo na povrchu léčené tkáně, například v průběhu chirurgického zákroku.

Jiným výhodným provedením předkládaného vynálezu je farmaceutický prostředek obsahující replikace-deficientní rekombinantní virus a poloxamer. Přesněji se vynález týká prostředku obsahujícího replikace-deficientní rekombinantní virus obsahující nukleovou kyselinu kódující LLG polypeptid a poloxamer. Výhodným poloxamerem je Poloxamer 407, který je komerčně dostupný (BASF, Parsippany, NJ) a který je netoxický, biokompatibilní polyol. Poloxamer impregnovaný rekombinantními viry může být umístěn přímo na povrchu léčené tkáně, například v průběhu chirurgického zákroku. Poloxamery mají v podstatě stejné výhody jako hydrogely a mají menší viskozitu.

H) Způsoby léčby ·· φφφφ • · φ φφφ

Předkládaný vynález obsahuje způsoby léčby, které obsahují podání účinného množství prostředku podle předkládaného vynálezu lidem nebo jiným živočichům.

φφφ Φ· φ φφ φφ • · φ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ • Φ φφ

Účinné množství se může lišit, podle věku, typu a závažnosti léčeného stavu, tělesné hmotnosti, požadovaného trvání léčby, způsobu podání a jiných parametrů. Účinné množství je určeno lékařem nebo jiným kvalifikovaným zdravotníkem.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou obecně podány v dávce od přibližně 0,01 mg/kg do přibližně 100 mg/kg, lépe od přibližně 0,1 mg/kg do přibližně 50 mg/kg a nejlépe od přibližně l mg/kg do přibližně 10 mg/kg tělesné hmotnosti a den.

Rekombinantní viry podle předkládaného vynálezu jsou obvykle připraveny a podány ve formě dávek mezi přibližně 10⁴ pfu a přibližně 10³·⁴ pfu. V případě AAV a adenovirů jsou výhodně použity dávky od přibližně 10^s pfu a přibližně 10¹¹ pfu. Termín pfu (plaky tvořící jednotky) odpovídá infekčnímu potenciálu suspenze virionů a je určen infikováním vhodné buněčné kultury a měřením počtu vytvořených plaků. Techniky pro určení pfu titru virového roztoku jsou v oboru dobře známé.

Předkládaný vynález obsahuje způsob pro léčbu atherosklerosy, kde uvedená atherosklerosa vzniká v důsledku nadměrné, abnormální nebo neadekvátní exprese aktivity LLG polypeptidu.

Předkládaný vynález dále obsahuje způsob pro léčbu lidí nebo zvířat majících nežádoucí lipidový profil, kde uvedený nežádoucí lipidový profil vzniká v důsledku abnormálně vysoké nebo neadekvátní exprese aktivity LLG polypeptidu.

Předkládaný vynález dále obsahuje způsob pro léčbu diabetes ·· · ·· · ··· mellitus, hyperlipidemie, intrahepatální cholestasy nebo jiných metabolických onemocnění, kde uvedený diabetes mellitus, hyperlipidemie, intrahepatální cholestasa nebo jiná metabolická onemocnění vznikají v důsledku abnormálně vysoké nebo neadekvátní exprese aktivity LLG polypeptidů.

1) Léčba nežádoucích lipidových profilů spojených se zvýšenou expresí LLG polypeptidů

Způsoby pro snížení exprese LLG polypeptidů pro léčbu těch stavů, při kterých aktivita LLG polypeptidů způsobuje onemocnění nebo poruchu spojenou s nežádoucím lipidovým profilem zahrnují, ale nejsou omezeny na, podání prostředku obsahujícího protismyslnou nukleovou kyselinu, podání prostředku obsahujícího intracelulární vazebný protein jako je protilátka, podání prostředku obsahujícího LLGN polypeptid nebo jiný fragment LLG a podání prostředku obsahujícího nukleovou kyselinu, která kóduje LLGN polypeptid nebo jiný fragment LLG.

V jednom provedení je prostředek obsahující protismyslnou nukleovou kyselinu použit pro snížení nebo blokování exprese LLG. V jednom výhodném provedení kóduje nukleová kyselina molekuly protismyslné RNA. V tomto provedení je nukleová kyselina operativně navázaná na signální sekvence umožňující expresi sekvence nukleové kyseliny a je vložena do buněk, výhodně za použití rekombinantních vektorů, které exprivují protismyslnou nukleovou kyselinu po vložení vektoru do buňky. Příklady vhodných vektorů zahrnují plasmidy, adenoviry, adeno-asociované viry, retroviry a herpes viry. Výhodně je vektorem adenovirus. Nejvýhodněji je vektorem replikace-deficientní adenovirus obsahující deleci v El a/nebo E3 regionech viru.

V jiném provedení je exprese LLG snížena nebo blokována • 9 ·· ···· ·1 ·· • · ·· · · · ···· • · · · · · · · · • ····· · · · · · • · ··· ···· ······ ·· · ·* ·· expresí sekvence nukleové kyseliny kódující intracelulární vazebný protein, který je schopný selektivní interakce s LLG. WO 94/29446 a WO 94/02610, jejichž obsahy jsou zde uvedeny jako odkazy, popisují transfekci buněk geny, které kódují intracelulární vazebné proteiny. Mezi intracelulární vazebné proteiny patří jakýkoliv protein schopný selektivní interakce, nebo vazby, s LLG v buňkách, ve kterých je exprivován a který je schopen neutralizovat funkci navázaného LLG. Výhodně je intracelulárním vazebným proteinem protilátka nebo fragment protilátky. Nejvýhodněji je intracelulárním vazebným proteinem jednořetězcová protilátka.

WO 94/02610 popisuje přípravu protilátek a identifikaci nukleové kyseliny kódující určitou protilátku. Za použití LLG nebo jeho fragmentu je specifická monoklonální protilátka připravena technikami, které jsou v oboru známé. Potom je pro použití ve způsobu podle předkládaného vynálezu připraven vektor obsahující nukleovou kyselinu kódující intracelulární vazebný protein, nebo jeho část, který je schopen exprese v hostitelské buňce.

Alternativně může být aktivita LLG blokována podáním neutralizační protilátky do oběhu. Taková neutralizační protilátka může být podána přímo jako protein, nebo může být exprivována z vektoru (se sekrečním signálem).

V jiném provedení je aktivita LLGXL inhibována podáním prostředku obsahujícího LLGN polypeptid nebo jiný fragment LLG. Takový prostředek může být podán vhodným způsobem, jako je orální, lokální, intravenosní, intraperitoneální, intramuskulární, subkutánni, intranasální nebo intradermální způsob podání. Prostředek může být podán přímo, nebo může být enkapsulován (například v lipidovém systému, aminokyselinových * » 000000 00 «0 0 0 0 0 0 0 · 0 0 0 0 • 0 0 0 0 ·««· • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 • · 0 0 0 »000

000 000 ·· 0 00 00 mikrosférách, nebo v globulárních dendrimerech). Polypeptid může být, v některých případech, navázán na jiný polymer, jako je sérový albumin nebo polyvinylpyrrolidon.

V jiném provedení je aktivita LLGXL inhibována pomocí sloučenin o malé molekulové hmotnosti, které interferují s jeho enzymatickými vlastnostmi nebo které brání jeho rozpoznání vhodnými buněčnými vazebnými místy.

V jiném provedení je aktivita LLGXL inhibována pomocí genové terapie, to znamená pomocí podání prostředku obsahujícího nukleovou kyselinu, která kóduje a řídí expresi LLGN polypeptidu, nebo jiného fragmentu LLG.

Ve specifickém provedení má LLG gen podle předkládaného vynálezu také afinitu pro heparin. Vazba LLG polypeptidu na extracelulární heparin v lumen cév umožňuje vazbu LLG na LDL a akceleraci vychytávání LDL tím, že působí jako můstek mezi LDL a extracelulárním heparinem. Předpokládá se, že v lokalizované oblasti atherosklerotické léze akceleruje zvýšená lipasová aktivita atherogenní proces (Zilversmit, D.B. (1995) Clin. Chem. 41: 153 - 158; Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C., Moojani, S., Lupien, P.J., Hayden, M.R. a Brunzell, J.D. (1993) Lancet 341: 1119 - 1121). Toto může být způsobeno vyšší vazbou a vychytáváním lipoproteinů cévní tkání, které je způsobeno lipasami (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T. a Vlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest. 90: 2013 - 2021; Tabas, I., Li, I., Brocia, R.W., Xu, S.W., Swenson, T.L., Williams, K.J. (1993) J. Biol. Chem. 268: 20419 - 20432; Nordestgaard, B.G. a Nielsen,

A.G. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5: 252 - 257; Williams, K.J. a Tabas, I. (1995) Art. Thromb. and Vasc. Biol. 15: 551 - 561). Dále, vysoká lokální hladina lipasové aktivity může vést k cytotoxickým koncentracím mastných kyselin a lysofosfatidylcholinu v prekursořových atherosklerotických lézích. Tato jednotlivá aktivita LLG může způsobovat vývoj nebo progresi atherosklerosy, zejména v souvislosti s vysokými hladinami lipidů u subjektu, které jsou způsobeny dietními nebo genetickými faktory. Tak předkládaný vynález umožňuje inhibici akumulace lipoproteinu tím, že inhibuje expresi LLG polypeptidů nebo jeho vazbu na lipoprotein (například na LDL).

2) Léčba nežádoucích lipidových profilů spojených s nedostatečnou aktivitou LLG polypeptidů

Způsoby pro zvýšení exprese LLG pro léčbu těch stavů, při kterých aktivita LLG polypeptidů způsobuje onemocnění nebo poruchu spojenou s nežádoucím lipidovým profilem zahrnují, ale nejsou omezeny na, podání prostředku obsahujícího LLGXL polypeptid a podání prostředku obsahujícího nukleovou kyselinu, která kóduje LLGXL polypeptid.

V jednom provedení je aktivita LLGXL zvýšena podáním prostředku obsahujícího LLGXL polypeptid. Takový prostředek může být podán vhodným způsobem, jako je orální, lokální, intravenosní, intraperitoneální, intramuskulární, subkutánní, intranasální nebo intradermální způsob podání. Prostředek může být podán přímo, nebo může být enkapsulován (například v lipidovém systému, aminokyselinových mikrosférách, nebo v globulárních dendrimerech). Polypeptd může být, v některých případech, navázán na jiný polymer, jako je sérový albumin nebo polyvinylpyrrolidon.

V jiném provedení je aktivita LLGXL zvýšena pomocí sloučenin o malé molekulové hmotnosti, které zvyšují expresi LLGXL expresi na úrovni transkripce, translace nebo na post-translační úrovni.

• · • · * · · · • · · * * 9 9 9 9 9 * * · · · ··· 999 9· ř

V jiném provedení je aktivita LLGXL zvýšena pomocí genové terapie, to znamená pomocí podání prostředku obsahujícího nukleovou kyselinu, která kóduje a řídí expresi LLGXL polypeptidu.

Intrahepatální cholestasa může být charakterizována zvýšenou hladinou sérového cholesterolu a fosfolipidů. Nově popsaný krysí model intrahepatální cholestasy indukované faloidinem demonstruje signifikantní zvýšení sérových hladin cholesterolu a fosfolipidů (Ishizaki, K., Kinbara, S., Miyazawa, N., Takeuchi, Y., Hirabayashi, N., Kasai, H. a Araki, T. (1997) Toxicol. Letters 90: 29 - 34). Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro léčbu intrahepatální cholestasy u pacientů, kteří mají zvýšený sérový cholesterol a/nebo fosfolipidy. Kromě toho, tento model také vykazuje závažné snížení exkreční rychlosti cholesterolu žlučí. LLG polypeptidy a nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro léčbu pacientů s poruchou biliárního vylučovacího systému.

Intrahepatální cholestasa je také charakterizována jako porušený odtok žluči z jater. Nově byly lokusy pro progresivní familiární intrahepatální cholestasu (PFIC nebo Bylerovu nemoc) a benigní recidivující intrahepatální cholestasu (BRIG) mapovány na 18q21-q22 (Carlton, V.E.H., Knisely, A.S., a Freimer, N.B. (1995) Hum. Mol. Genet. 4: 1049 - 1053 a Houwen, R.H., Baharloo, S., Blankenship, K., Raeymaekers, P., Juyn, J., Sandkuijl, L.A. a Freimer, N.B., (1994) Nátuře Genet. 8: 380 - 386, v příslušném pořadí). Protože je LLG gen lokalizován v tomto chromosomálním regionu v 18q21, může být LLG gen nebo prostředek podle předkládaného vynálezu použit pro léčbu pacientů s intrahepaální cholestasou, která je způsobena mutací nebo defektní expresí PFIC/BRIC genu.

* · · · * t ··· ··· ··* ·« K

V jiném provedení může být LLG gen nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu použit pro léčbu pacientů s intrahepatální cholestasou, která není způsobena defektem v PFIC/BRIC genech v 18g21-q22. Nedávné studie naznačily, že jiný lokus, lokalizovaný mimo 18q21-q22 region, může také vyvolávat PFIC fenotyp (Strautnieks, S.S., Kagalwalla, A.F., Tanner, M.S., Gardiner,

R.M. a Thompson, R.J. (1996) J. Med. Genet. 33: 833 - 836). Nicméně, podání LLG polypeptidu, buď přímé nebo v genové terapii, může zmírnit tuto formu onemocnění.

V genové terapii je jedna nebo více nukleových kyselin kódujících polypeptid, stejně jako regulačních regionů kontrolujících jejich expresi, přenesena do cílových buněk člověka nebo zvířete. Tento přenos je proveden buď ex vivo postupem, při kterém jsou nukleové kyseliny přeneseny do buněk v laboratoři a modifikované buňky jsou potom podány lidem nebo jiným živočichům, nebo in vivo postupem, při kterém jsou nukleové kyseliny přeneseny přímo do buněk člověka nebo jiného živočicha. Přenos nukleových kyselin může být proveden za použití virových nebo nevirových vektorů popsaných výše.

Nevirové vektory mohou být přeneseny do buněk za použití jakékoliv techniky známé v oboru, včetně koprecipitaqce fosforečnanem vápenatým, lipofekce (syntetických aniontových nebo kationtových liposomů), receptory zprostředkovaného genového přenosu, injekce holé DNA, elektroporace a biobalistiky nebo urychlených částic.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady ilustrují vynález. Tyto příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

• 0 0* 0000 *0 « · <· 0 ·« * 0 · 0 0

0 000 000» • ·00 00 00 00 0 • · 000 0000

0 0 0 0 0 «0 W 0 0 0 ·

Příklad 1: Identifikace diferenciálně exprivované cDNA

A) Příprava RNA

Lidské monocyty THP-1 (Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., a Klenk, D.C. (1985) Anal. Biochem., 150: 76 - 85) se kultivují v RPMI-1640 mediu (GIBCO) s 25 mM HEPES, 10% fetálním hovězím sérem, 100 jednotkami/ml penicilinu G, sodné soli a 100 jednotkami/ml streptomycinsulfatu. Buňky se umístí na 15 cm tkáňové kultivační disky v koncentraci 1,0 x 10 ⁷ buněk/disk a zpracují se 40 ng/ml forbol-12-myristat-13-acetatem (Sigma) po dobu 48 hodin pro indukci diferenciace buněk. Lidské lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) se zakoupí od Calbiochem a dialyzují se do vyčerpání proti PBS při 4 °C. LDL se potom ředí na 500 /ig/ml a dialyzuje se proti 5 μΜ CuSO₄ v PBS při 37 °C po dobu 16 hodin. Pro ukončení oxidace se LDL důkladně dialyzuje proti 150 mM NaCl, 0,3 mM EDTA a potom se sterilizuje filtrací. Koncentrace proteinu se určí BCA metodou (Schuhm J., Fairclough, G.F., a Haschemeyer, R.H. (1978) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3173 - 3177) (Pierce). Stupeň oxidace se určí TBARS metodou (Chomczynski, P. (1993) Biotechniques 15: 532 - 537) a je mezi 25 - 30 nmol MDA ekvivalentů/mg proteinu. Diferencované THP-1 buňky se vystaví na 24 hodin buď 50 ^g/ml oxidovaného LDL, nebo NaCl-EDTA pufru v RPMI mediu s 10% lipoprotein-deficientním fetálním hovězím sérem (Sigma). Pro získání RNA se plotny promyjí 10 ml PBS a potom se do každé plotny přidá 14 ml TRIZOL (Liang,

P. a Pardee, A.B. (1992)) Science 257: 967 - 971). Roztok se několikrát pipetuje pro smísení, potom se stejné vzorky shromáždí do centrifugačních zkumavek a přidají se 3 ml chloroformu na plotnu a provede se míšení. Zkumavky se centrifugují při 12000 x g po dobu 15 minut. Po centrifugaci se horní vrstva přenese do nové zkumavky a přidá se 7,5 ml isopropanolu na plotnu a provede

se míšení. Zkumavky se centrifugují při 12000 x g po dobu 20 minut. Peleta se promyje ledově chladným 70% ethanolem a suší se při pokojové teplotě. Pelety se resuspendují v 500 μΐ TE (Tris-EDTA) a zpracují se 200 jednotkami DNAsy I prosté RNAsy a 200 jednotkami RNasinového placentárního inhibitoru RNAsy (Promega) po dobu 30 minut při 37 °C. RNA se přečistí postupnými extrakcemi fenolem, fenol/chloroform/isoamylalkoholem (25:24:1) a chloroform/isoamylalkoholem (24:1) a potom se provede srážení ethanolem.

B) Syntéza DNA

Syntéza cDNA a PCR amplifikace se provede podle protokolu uvedeném v Differential Display Kitu, verzi 1.0 (Display System Biotechnology, Inc.). Tento systém je založen na technice, kterou původně popsali Liang a Pardee (Mead, D.A., Pey, N.K.,

Herrnstadt, C., Marcil, R.A., a Smith, L.M. (1991) Bio/Technology 9: 657 - 663) . Páry primerů, které vedly k zisku fragmentu cDNA obsahujícímu první informaci o lipase podobnému genu byly downstream primer 7 a upstream primer 15. cDNA pro amplifikaci byla syntetizována následujícím způsobem, za použití RNA získané z THP-1 buněk ošetřených PMA vystavených bud' pufru, nebo oxidovanému LDL: 3 μΐ 25 μΜ downstream primeru 7 a 7,5 μΐ vody zpracované diethylpyrouhličitanem (DEPC) se přidá k 300 ng (3,0 μΐ) THP z každého vzorku THP-1 RNA. Tato směs se zahřeje na 70 °C na dobu 10 minut a potom se ochladí na ledu. Do této zkumavky se přidají 3 μΐ 5x PCR pufru (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KC1) (GIBCO), 3 pil 25 mM MgCl₂, 3 μΐ 0,1 M DTT, 1,2 μί 500 μΜ dNTP, 0,7 μί RNasinu a 5,6 μί vody zpracované DEPC. Zkumavky se inkubují po dobu 2 minut při pokojové teplotě a potom se přidá

1,5 μί (300 jednotek) Superscript II RNAsa H - reversní transkríptasy (GIBCO). Zkumavky se inkubují postupně při pokojové teplotě po dobu 2 minut, při 37 °C po dobu 60 minut a při 95 °C • « · · po dobu 5 minut a potom se ochladí na ledu. PCR amplifikace se provede za použití master směsi obsahující 117 μΐ lOx PCR pufru (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl₂ a 0,01% (hmot./obj.) želatiny), 70,2 μΐ 25 mM MgCl₂, 5,9 μΐ α-³³Ρ dATP (10 mCi/ml, DuPont NEN), 4,7 μΐ 500 μΜ směsi dNTP, 11 μΐ Ampli-Taq DNA polymerasy (5 jednotek/μΐ, Perkin-Elmer) a493,3 μΐ vody zpracované DEPC. DO každé reakční směsi se přidá 12 μΐ master směsi do 2 μΐ downstream primerů 7, 1 μΐ cDNA a 5 μΐ upstream primerů 15. Reakční směsi se zahřejí na 94 °C na dobu 1 minuty, potom se provede 40 teplotních cyklů s denaturačním krokem 94 °C po dobu 15 sekund, krokem tepelného zpracování při 40 °C po dobu 1 minuty a krokem extenze při 72 °C po dobu 30 sekund. Po 40 cyklech se reakční směsi inkubují při 72 °C po dobu 5 minut a uskladní se při 10 °C. PCR reakce se provedou na Perkin-Elmer GeneAmp System 960 přístroji pro teplotní cykly.

μΐ amplifikační reakční směsi se smísí se stejným objemem zaváděcího pufru (0,2% bromfenolová modř, 0,2% Xylen cyanol, 10 mM EDTA, pH 8,0 a 20 glycerol). 4 μΐ této směsi se nechají projít 6% nedenaturačním sekvenačním gelem během 3 hodin při 1200 V (konstantní napětí). Gel se suší při 80 °C po dobu 1,5 hodiny a exponuje se na Kodak XAR filmu. Produkt amplifikace nalezený pouze v reakční směsi obsahující cDNA z THP-1 buněk vystavených oxidovanému LDL se identifikuje a exciduje se z gelu. 100 μΐ vody zpracované DEPC se přidá do mikrocentrifugové zkumavky obsahující excidovaný gelový fragment a inkubuje se po dobu 30 minut při pokojové teplotě a potom při 95 °C při teplotě 15 °C.

Pro reamplifikaci PCR produktu se 26,5 μΐ eluované DNA použije v amplifikační reakční směsi, která také obsahuje 5 μΐ lOx PCR pufru, 3 μΐ 25 mM MgCL₂, 5 μΐ 500 μΜ dNTP, 5 μΐ 2 μΜ downstream primerů 7, 7,5 μΐ upstream primerů 15 a 0,5 μΐ Amplitaq polymerasy. Parametry cyklů pro PCR a přístroje jsou stejné, jak

bylo popsáno výše. Po amplifikaci se 20 μΐ reamplifikovaného produktu analyzuje na agarosovém gelu a 4 μΐ se použijí pro subklonování PCR produktů do vektoru pCRII za použití TA klonovacího systému (Frohman, M.A. , Dush, M.K. a Martin, G.R. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 8998 - 9002) (Invitrogen). Po ligaci přes noc při 14 °C se produkty ligace použijí pro transformaci E. coli. Vzniklé transformanty se odeberou a 3 ml kultur kultivovaných přes noc se použijí v plasmidových minipřípravcích. Velikosti insertů se určí pomocí trávení plasmidů EcoRI a klony obsahující inserty přibližné velikosti původního PCR produktu se sekvencují za použití fluorescenčních barviv-terminačních činidel (Prism, Applied Biosystems) a Applied Biosystems 373 DNA sekvenačního přístroje. Sekvence produktu PCR je uvedena na obr. 2. Sekvence amplifikačních primerů jsou podtrženy.

C) 5'RACE reakce

Extenze cDNA identifikované pomocí RT-PCR se provede pomocí 5'RACE systému (Loh, E.Y., Eliot, J.F., Cwirla, S., Lanier, L.L., a Davis, M.M. (1989) Science 243: 217 - 219; Simms, D., Guan, N., a Sitaraman, K., (1991) Focus 13: 99) (GIBCO). 1 ptg THP-1 RNA (ošetřené oxidovaným LDL) se použitá nejprve v diferenciálních zobrazovacích reakcích se použije v 5'RACE postupu:

μΐ (1 /xg) RNA se smísí s 3 μΐ (3 pmol) primeru 2a a 11 μΐ vody zpracované DEPC a zahřeje se na 70 °C na dobu 10 minut, a potom se chladí po dobu 1 minuty na ledu. Přidá se 2,5 μΐ lOx reakčního pufru (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KC1), 3 μΐ 25 mM MgCL₂, 5 μΐ 500 μΜ směsi dNTP, a 2,5 μΐ 0,1 M DTT. Směs se inkubuje při 42 °C po dobu 2 minut a potom se přidá 1 μΐ Superscript II reversní transkriptasy. Reakční směs se inkubuje do dobu dalších 30 minut při 42 °C, 15 minut při 70 °C a na ledu po dobu l minuty. Přidá se 1 μΐ RNAsy H (2 jednotky) a směs se inkubuje při 55 °C po dobu 10 minut. cDNA se přečistí za použití

GlassMax kolon (Sambrook, J., Fritsch, E.F., a Maniatis, T.

(1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) obsažených v kitu. cDNA se eluuje z kolony v 50 μΐ dH₂O, lyofilizuje se a resuspenduje se ve 21 μΐ dH^O. Připojení koncového úseku cDNA se provede následující reakcí: 7,5 μΐ dH₂O, 2,5 μΐ reakčního pufru (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KC1), 1,5 μΐ 25 mM MgCL₂,

2,5 μΐ 2 mM dCTP a 10 μΐ cDNA se inkubuje při 94 °C po dobu 3 minut, potom 1 minutu na ledu. Přidá se 1 μΐ (10 jednotek) terminální deoxynukleotidyltransferasy a směs se inkubuje po dobu 10 minut při 37 °C. Enzym se tepelně inaktivuje inkubací při 70 °C po dobu 10 minut a směs se umístí na led. PCR amplifikace cDNA se provede v následujících krocích: 5 μΐ cDNA s koncovým úsekem se přidá do reakční směsi, která také obsahuje 5 μΐ lOx PCR pufru (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl₂ a 0,01% (hmot./obj.) želatiny), 1 μΐ 10 mM směsi dNTP, 2 μΐ (10 pmol) kotvícího primeru a 35 μΐ dH₂O. Tato reakční směs se zahřeje na 95 °C na dobu 1 minuty a potom se přidá 0,9 μΐ (4,5 jednotek) Amplitaq polymerasy. Provede se 40 reakčních cyklů za následujících podmínek: 94 °C po dobu 5 sekund, 50 °C po dobu 20 sekund, a 72 °C po dobu 30 sekund. 1 μΐ této reakční směsi se použije v skupinové reamplifikaci pro zvýšení hladin specifických produktů pro následnou izolaci. Reamplifikace obsahuje: 1 μΐ produktu primární amplifikace, 5 μΐ lOx PCR pufru, 1 μΐ 10 mM směsi dNTP, 2 μΐ (20 pmol) universálního amplifikačního primeru, μΐ (20 pmol) primeru 4a a 38 μΐ dH₂O. Reakční směs se zahřeje na 95 °C na dobu 1 minuty a potom se přidá 0,7 μΐ (3,5 jednotek) Amplitaq polymerasy. Provede se 40 reakčních cyklů za následujících podmínek: 94 °C po dobu 5 sekund, 50 °C po dobu 20 sekund, a 72 °C po dobu 30 sekund. Produkty amplifikace se analyzují pomocí elektroforesy na 0,8% agarosovém gelu. Detekuje

se převládající produkt velikosti přibližně 1,2 kB. 2 μΐ reakčního produktu se klonují do pCRII vektoru z TA klonovacího kitu (Invitrogen) a provede se inkubace při 14 °C přes noc. Produkty ligace se použijí pro transformaci E. coli. Velikosti insertů výsledných transformantů se určí pomocí trávení plasmidů EcoRI. Klony obsahující inserty přibližné velikosti původního PCR produktu se sekvencují za použití fluorescenčních barviv-terminačních činidel (Přisni, Applied Biosystems) a Applied Biosystems 373 DNA sekvenačního přístroje. Sekvence RACE produktu včetně EcoRI míst z TA vektoru jsou uvedeny na obr. 3. Sekvence amplímerů (universální amplifikační primer a komplement k 5'RACE primeru 4a) jsou podtrženy.

Příklad 2: Klonování a chromosomální lokalizace LLGXL genu

A) Vyšetřování cDNA knihovny

Lidská placentární cDNA knihovna (Oligo dT a náhodně primed, katalogové č. 5014b, Lot č. 52033) se získá od Clontech (Palo Alto, CA). Radioaktivně značená sonda se vytvoří excisí insertu plasmidu obsahujícího reakční produkt 5'RACE PCR popsaný výše. Sonda se radioaktivně značí pomocí techniky náhodné vazby: DNA fragment (50 - 100 ng) se inkubuje s 1 ^g náhodných hexamerů (Gibco) při 95 °C po dobu 10 minut a potom na ledu po dobu 1 minuty. Při pokojové teplotě se přidá: 3 μΐ lOx Klenow pufru (100 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM MgCl₂, 57 mM dithiotreitolu; New England Biolabs), 3 μΐ 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP), 100 μΰΐ O!-^3:2PdCTP (3000 Ci/mmol, New England Nuclear) a 1 μΐ Klenow fragmentu DNA polymerasy I (5 jednotek, Gibco). Reakční směs se inkubuje po dobu 2-3 hodin při pokojové teplotě a reakce se potom ukončí zvýšením objemu na 100 μΐ pomocí TE, pH 8,0 a přidáním EDTA do konečné koncentrace 1 mM. Neinkorporované nukleotidy se odstraní zvýšením reakčního objemu na 100 μΐ a

zpracováním na G-50 odstředivé koloně (Boehringer Mannheim). Výsledné sondy mají specifickou aktivitu vyšší než 5 x 10® cpm/pig DNA.

Knihovna se sonduje pomocí běžných technik (Walter, P., Gilmore, R. a Blobel, G. (1984) Cell 38: 5-8). Stručně, filtry se hybridizují po dobu 24 hodin při 65 °C v 4,8x SSPE (20X SSPE =

3,6 M NaCl, 0,2 M NaH^PO^, 0,02 M EDTA, pH 7,7), 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, IX Denhartově roztoku (100X = 2% Ficoll 400, 2% polyvinylpyrrolidon, 2% BSA), 10% dextransíranu, 0,1% SDS, 10 /xg/ml lososí spermat i cké DNA a 1 x 10^s cpm/ml radioaktivně značené sodný. Filtry se potom promyjí 3x po dobu 15 minut při pokojové teplotě v 2X SSC (IX SSC = 150 mM NaCl, 15 mM citrát sodný, pH 7,0), 0,1% dodecylsíranu sodném (SDS) a potom následují tři promytí pokaždé po dobu 15 minut při 65 °C v 0,5X SSC, 0,1% SDS. Fág, který hybridizuje na sondu, se izoluje a amplifikuje. DNA se přečistí z amplifikovaného fágu za použití LambdaSorb činidla (Promega) podle návodu výrobce. Inserty se excidují z fágové DNA trávením EcoRI. Inserty se subklonují do EcoRI místa plasmidového vektoru (Bluescript II SK, Stratagene). Sekvence otevřeného čtecího rámce v 2,6 kB EcoRI fragmentu cDNA se určí automatizovaným sekvencováním, jak je popsáno výše. Sekvence je uvedena na obr. 4. Aminokyselinová sekvence předpokládaného proteinu kódovaného otevřeným čtecím rámcem je uvedena na obr. 5 a byla určena LLGXL. Předpokládá se, že první methionin je kodován páry nukleotidů 252 - 254. Předpokládaný protein má délku 500 aminokyselin. Prvních 18 aminokyselin tvoří sekvenci pro sekreční signální peptid (Higgins, D.G. a Sharp, P.M. (1988) Gene 73: 237 - 244). Předpokládá se, že propeptid má molekulovou hmotnost 56800 Daltonů. Za předpokladu štěpení signálního peptidu v pozici 18 má nemodifikovaný zralý protein molekulovou hmotnost 54724 Daltonů.

Celková podobnost mezi tímto proteinem a dalšími známými členy triacylglycerol-lipasové rodiny je uvedena na obr. 6 a v tabulce 1. V uspořádání uvedeném na obr. 6 je LLG polypeptid (SEQ ID NO: 6) kódovaný cDNA (SEQ ID NO: 5) popsanou v příkladu 1 a je zde označen jako LLGN. Tento protein je identický s LLGXL proteinem v amino-terminálních 345 zbytcích. 9 jedinečných zbytků je následováno terminačním kodonem, za vzniku propolypeptidu o 39,3 kD a zralého proteinu o 37,3 kD. Sekvence, které jsou společné LLGN a LLGXL jsou sekvence nukleové kyseliny SEQ ID NO: 9a aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 10.

Zajímavé je, že pozice, ve které se LLGN a LLGXL proteiny liší, je v regionu, o kterém je známo ze struktury jiných lipas, že je mezi amino- a karboxy-koncovými doménami proteinů. Proto se zdá, že LLGN protein obsahuje pouze jednu ze dvou domén triacylglycerol-lipas. Tato sekvence obsahuje charakteristický GXSXG Upasový motiv v pozici 167 - 171, stejně jako konzervaci zbytků katalytické triady v Ser 169, Asp 193 a His 274.

Konzervace cysteinových zbytků (pozice 64, 77, 252, 272, 297,

308, 311, 316, 463 a 483), které se účastní na disulfidových vazbách v jiných lipasách naznačuje, že LLGXL protein má strukturální podobnosti s jinými enzymy. Existuje zde pět předpokládaných míst pro N-glykosylaci: v aminokyselinových pozicích 80, 136, 393, 469 a 491. Proteinové sekvence použité pro srovnání jsou lidská lipoproteinová lipasa (LPL; Genbank přírůstkové č. M15856, SEQ ID NO: 13), lidská jaterní lipasa (HL; Genbank přírůstkové č. J03540, SEQ ID NO: 14), lidská pankreatická lipasa (PL; Genbank přírůstkové č. M93285, SEQ ID NO: 15), lidský protein 1 příbuzný s pankreatickou lipasou (PLRP-1; Genbank přírůstkové č. M93283) a lidský protein 2 příbuzný s pankreatickou lipasou (PLRP-2; Genbank přírůstkové č. M93284).

• 4

9· ·· · · 4 4 4 4 4

4 444 4444

4 444 4444

44444 «4 4 44 « «

Tabulka 1: Podobnost genů rodiny triacylglycerol-lipas

	LLGXL	LPL	HL	PL	PLRP-1	PLRP-2
LLGXL	-	42,7	36,5	24,5	22,5	22,6
LPL	42,7	-	40,0	22,8	22,7	20,9
HL	36,5	40,0	-	22,8	24,0	22,0
PL	24,5	22,8	22,8	-	65,2	62,2
PLRP-1	22,5	22,7	24, 0	65,2	-	61,7
PLRP-2	22,6	20,9	22,0	62,2	61,7	-

Procentuální podobnost se určí na základě párového přiřazení za použití Clustal algoritmu (Camps, L., Reina, M., Llobera, M., Vilaro, S., a Olivercrona, T., (1990) Am. J. Physiol. 258: C673

- C681) v Megalign programu Lasergene Biocomputing Software Suitě (Dnastar).

B) Chromosomální lokalizace

DNA z Pl klonu (Sternberg, N., Ruether, J. a De Riel, K. New Biologist 2: 151 - 62, 1990) obsahující genomovou LLG DNA se značí digoxigenin-UTP pomocí značkovací translace. Značená sonda se smísí s nastříhanou lidskou DNA a hybridizuje na PHA stimulované lymfocyty periferní krve od mužského dárce v roztoku obsahujícím 50% formamid, 10% dextransíran a 2X SSC. Specifické hybridizační signály se detekují pomocí inkubace hybridizováných buněk s fluoresceinovanými protilátkami proti digoxigeninu, po které následuje kontrastní barvení DAPI. Tento první pokus vede ke specifickému označení chromosomu skupiny E, o kterém se soudí podle barvení DAPI, že jde o chromosom 18.

Provede se druhý pokus, ve kterém biotinem značená sonda specifická pro centromeru chromosomu 18 hybridizuje současně s

LLG sondou. Tento pokus vede ke specifickému červenému značení centromery chromosomu 18 a zelenému značení dlouhého raménka chromosomu 18. Měření 11 specificky značených hybridizovaných chromosomů 18 ukázalo, že LLG má Flter 0,67 (Frankovo měření 0,38), což odpovídá proužku 18q21. Předpokládá se, že několik genetických onemocnění, včetně intrahepatální cholestasy, dystrofie tyčinek sítnice a familiární expansivní osteolýzy, obsahuje defekty v tomto chromosomálním regionu.

Příklad 3: Analýza LLG RNA

A) Exprese LLG RNA v THP-1 buňkách

Analýza mRNA, ze které byla odvozena cDNA, byla provedena pomocí Northern analýzy THP-1 RNA. RNA z těchto buněk byla připravena způsobem popsaným výše. mRNA byla přečištěna z celkové RNA za použití systému poly-dT-magnetických korálků (Polyattract systém, Promega). 3 /xg mRNA obsahující póly(A) se podrobí elektroforese na 1% agarosovém-formaldehydovém gelu. Gel se promývá po dobu 30 minut v dH^O. RNA se ve vakuu přenese na nylonové membrány za použití alkalického přenosového pufru (3M NaCl, 8 mM NaOH, 2 mM sarkosyl). Po přenosu se skvrny neutralizují inkubací po dobu 5 minut v 200 mM fosfátovém pufru, pH 6,8. RNA se naváže na membrány za použití přístroje pro navázání využívajícího ultrafialové záření (Stratagene).

Sonda se vyrobí excisí insertu plasmidu obsahujícího reakční produkt 5'RACE PCR, jak je uvedeno výše. Sonda se radioaktivně značí za použití techniky náhodného značení jak je uvedena v příkladu 2.

Filtry se prehybridizuji v QuickHyb roztoku pro rychlou hybridizaci (Stratagene) po dobu 30 minut při 65 °C. Radioaktivně

značená sonda (1-2 x 10⁶ cpm/ml) a sonikovaná lososí spermatická DNA (konečná koncentrace 100 ^g/ml) se denaturují zahřátím na 95 °C na dobu 10 minut a rychle se ochladí na ledu před přidáním k filtru v QuickHyb. Hybridizace se provede při 65 ^QC po dobu 3 hodin. Nehybridizovaná sonda se odstraní promytím filtru dvakrát po dobu 15 minut v 2X SSC, 0,1% dodecylsíranem sodným při pokojové teplotě a potom dvakrát po dobu 15 minut v O,1X SSC,

0,1% SDS při 62 °C. Po promytí se filtry krátce suší a potom se exponují na Kodak XAR-2 filmu s intenzifikovaným snímáním při -80 °C. Výsledky jsou uvedeny na obr. 7, který ukazuje hlavní typ mRNA o přibližně 4,5 kB. Minoritní typy o 4,3 kB a 1,6 kB jsou také přítomné. Očekávaná velikost LLGN cDNA je 1,6 kB. LLGXL sekvence je pravděpodobně kódována hlavním detekovaným typem mRNA.

B) Exprese LLG RNA v různých lidských tkáních

Komerčně připravený filtr obsahující 3 μg každé mRNA z lidských tkání (srdce, mozku, placenty, plic, jater, kosterního svalu, ledvin a slinivky břišní) se získají od Clontech (katalogové č. 7760-1). Tento filtr se sonduje a zpracuje způsobem popsaným výše. Po sondování radioaktivně značeným LLG fragmentem a autoradiografii se sonda odstraní promytím v horkém 0,lX SSC, 0,1% SDS po dobu 2 x 15 minut v inkubátoru při 65 °C. Membrány se potom sondují 1,4 kB DNA fragmentem kódujícím lidskou lipoproteinovou lipasu. Tento fragment se získá RT-PCR RNA z THP-1 (ošetřených PMA a oxLDL) za použití 5'LPL a 3'LPL primerů uvedených na obr. 1 a RT-PCR podmínek popsaných výše. Po autoradiografii se membrány znovu očistí a sondují se znovu radioaktivně značeným fragmentem cDNA lidského β-aktinu pro normalizaci obsahu RNA. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny na obr. 8. Nejvyšší hladiny informace pro LLG se detekují v placentární RNA a nejnižší hladiny se detekují v RNA z plic, •

φ φ • φ φ

• •φ jater a ledvin. V souladu s dříve uvedenými studiemi (Verhoeven, A.J.M., Jansen, Η., (1994) Biochem. Biophys. Acta 1211: 121 124) se informace pro lipoproteinovou lipasu nachází v mnoha tkáních, s nejvyššími koncentracemi v srdeční tkáni a kosterním svalu. Výsledky této analýzy naznačují, že tkáňová distribuce exprese LLG je velmi odlišná od distribuce LPL. Charakter exprese LLG je také odlišný od charakteru exprese jak jaterní lipasy, tak pankreatické lipasy, jak je popsán v jiných studiích (Wang,

C.-S., a Harstuck, J.A. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1166: 1 19; Semenkovich, C.F., Chen, S.-W., Wims, M., Luo, C.-C., Li, W.-H., a Chán, L., (1989) J. Lipid. Res. 30: 423 - 431; Adams,

M.D., Kerlavage, A.R., Fields, C., a Venter, C. (1993) Nátuře Genet. 4: 256 - 265).

Pro určení charakteru exprese v dalších lidských tkáních se jiná komerčně dostupná membrána sonduje LLGXL cDNA. Tento dot blot (Human RNA Master Blot, Clontech katalogové č. 7770-1) obsahuje 100 - 500 ng mRNA z 50 různých tkání a je normalizován pro ekvivalentní přirozenou genovou expresi (Chen, L., a Morin,

R. (1971) Biochim. Biophys. Acta 231: 194 - 197). 1,6 kB Dral-Srfl fragment LLGXL cDNA se značí ³²PdCTP za použití systému náhodných oligonukleotidů (Prime It II, Stratagene) podle návodu výrobce. Po 30 minutách prehybridizace při 65 °C se sonda přidá do QuickHyb hybridizačního roztoku při 1,3 χ 10⁶ cpm/ml. Hybridizace se provede při 65 °C po dobu 2 hodin. Nehybridizovaná sonda se odstraní promytím filtrů dvakrát po dobu 15 minut v 2X SSC, 0,1% dodecylsíranem sodným při pokojové teplotě a potom dvakrát po dobu 15 minut v 0,lX SSC, 0,1% SDS při 62 °C. Po promytí se filtry krátce suší a potom se exponují na Kodak XAR-2 filmu s intensifikovaným snímáním při -80 °C, po různou dobu. Vzniklý záznam se kvantifikuje densitometrií. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2. Relativní hladiny exprese ve tkáních zjištěné v northern analýze více tkání a dot blot analýze více ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · · tkání jsou podobné, s nejvyššími hladinami v placentě a nejnižšími hladinami v plících, játrech a ledvinách. Ve fetálních játrech, ledvinách a plících je exprese zhruba stejná jako ve tkáních od dospělých jedinců. Překvapivě byly hladiny exprese ve tkáních štítné žlázy nejvyšší ze všech testovaných tkání, s expresí rovnou 122% exprese ve placentám! tkáni. Zatímco se předpokládala exprese lipasy v placentě (Rothwell, J.E., Elphick, M.C. (1982) J. Dev. Physiol. 4: 153 - 159; Verhoeven, A.J.M., Carling, D., a Jansen, H. (1994) J. Lipid Res. 35: 966 - 975; Burton, B.K., Mueller, H.W. (1980) Biochim. Biophys. Acta 618:

449 - 460), nebylo doposud známo, že by byla ve štítné žláze exprivována jakákoliv lipasa. Tyto výsledky naznačují, že LLG exprese se může účastnit funkce placenty, kde může LLG sloužit k uvolnění volných mastných kyselin ze substrátů jako jsou fosfolipidy, které jsou potom zdrojem energie. LLG exprivovaný ve štítné žláze může vytvářet prekursory pro syntézu bioaktivních molekul štítnou žlázou.

Tabulka 2: Exprese LLG mRNA v různých lidských tkáních

Celý mozek	N.D.	Substantia nigra	N.D.
Amygdala	N.D.	Temporální lalok	N.D.
Nucleus caudatus	N.D.	Thalamus	N.D.
Cerebellum	4	Subtalamické jádro	N.D.
Mozková kůra	N.D.	Mícha	N.D.
Frontální lalok	N.D.	Srdce	N.D.
Hippocampus	N.D.	Aorta	N.D.
Medulla oblongata	N.D.	Kosterní sval	N.D.
Okcipitální lalok	N.D.	Tlusté střevo	8
Putamen	N.D.	Močový měchýř	N.D.
Děloha	N.D.	Varlata	9
Prostata	5	Vaj ečníky	N.D.

φ ·· ···· ·« • · · φ φ ·

Tabulka 2 - pokračování

Žaludek	N.D.	Slinivka břišní	N.D.
Hypofýza	N.D.	Kostní dřeň	N.D.
Nadledviny	N.D.	Apendix	7
Štítná žláza	122	Plíce	29
Slinné žlázy	N.D.	Průdušnice	12
Mléčná žláza	N.D.	Placenta	100
Ledviny	44	Fetální mozek	5
Játra	61	Fetální srdce	N.D.
Tenké střevo	6	Fetální ledvina	56
Slezina	N.D.	Fetální játra	14
Thymus	N.D.	Fetální slezina	N.D.
Periferní leukocyt	N.D.	Fetální thymus	N.D.
Lymfatická uzlina	N.D.	Fetální plíce	8

Uvedené hodnoty jsou procenta exprese vůči expresi v placentě, která byla stanovena na 100%. Hodnoty jsou průměry densitometrických měření ze dvou autoradiografických měření.

N.D. = nedetekovatelná hladina.

C) Exprese LLG RNA v kultivovaných endotelových buňkách

Lidské endotelové buňky pupečníkové žíly (HUVEC) a lidské endotelové buňky koronární arterie (HCAEC) se získají od Clonetics. HUVEC se propagují v komerčně získaném kultivačním mediu pro endotelové buňky (EGM, Clonetics) doplněném 3 mg/ml extraktu z hovězího mozku (Maciag, T., Cerunolo, J., Ilsley, S., Kelley, P.R. a Forand, R., (1979) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:

5674 - 5678), Clonetics), zatímco HCAEC se propagují v EGM doplněném 3 mg/ml extraktu z hovězího mozku a 3% fetálním hovězím šerem (5% konečná koncentrace). Buňky se kultivují do konfluence a potom se mediu zamění za EGM bez extraktu z hovězího mozku.

99 • 9 9 9

4 4 4 • 9 • • 9 9 ·· 4444

9 4

9

4 4 9

94

Kultury se stimulují přidáním 100 ng/ml forbolmyristatu (Sigma). Po 24 hodinové inkubaci se RNA extrahuje z buněk za použití Trizolové metody popsané výše. 20 μ$ celkové RNA se podrobí elektroforese a přenese se na membrány pro analýzu. Membrány se sondují LLG a LPL sondami, jak je popsáno výše. Výsledky jsou uvedeny na obr. 9. Na 20 ^g celkové RNA z THP-1 buněk stimulovaných PMA se provede analýza na skvrně pro srovnání. RNA hybridizující na LLG sondu se detekuje v nestimulováných a PMA stimulovaných HUVEC buňkách. Naopak, detekovatelné hladiny LLG mRNA byly v kulturách HCAEC buněk zjištěny pouze po stimulaci PMA. V souladu s předchozími studiemi nebyla v jakýchkoliv RNA endotělových buněk detekována mRNA pro lipoproteinovou lipasu (Verhoeven, A.J.M., Jansen, H., (1994) Biochem. Biophys. Acta

1211: 121 - 124).

Příklad 4: Analýzy LLG proteinu

A) Příprava protilátky

Připraví se antisérum k peptidům se sekvencí odpovídající regionu předpokládaného proteinu kódovaného LLG cDNA otevřeným čtecím rámcem. Tento peptid se vybere vzhledem k jeho předpokládanému vysokému indexu antigenicity (Jameson, B.A., a Wolf, H. (1988) Comput. Applic. in the Biosciences 4: 181 - 186) Sekvence imunizačního peptidu nebyla nalezena v žádném proteinu nebo translatované DNA sekvenci v Genbank databázy. Jeho odpovídající pozice v LLG proteinu je uvedena na obr. 10. Karboxy-koncový cystein peptidu neodpovídá zbytku v domnělém LLG proteinu, ale je vložen pro usnadnění navázání na proteinový nosič. Peptid se syntetizuje na Applied Biosystems Model 433A peptidovému syntezátoru. 2 mg peptidu se naváží na 2 mg přílipkového hemokyaninu aktivovaného meleimimidem podle postupu posaného v Imject Activated Immunogen Conjugation Kitu (Pierce

*		•Λ 9		99		99
9	9 9	9	• ·	9 9	9	9
9		•
β	9	•	« »	9 9	9	•
• ·	9 99	99	•	99		··

Chemical). Po odsolení se jedna polovina konjugatu emulsifikuje se stejným objemem Freundova kompletního adjuvans (Pierce). Tato emulse se podá injekčně králíkům druhu New Zaeland White. 4 týdny po první imunizaci se podá dosycovací dávka emulze vyrobené stejným způsobem s tou výjimkou, že se použije Freundovo nekompletní adjuvans (Pierce). Dva týdny po dosycovací dávce se odebere krev a titry specifických protilátek se určí ELISA za použití imobilizovaného peptidu. Další dosycovací dávka se provede 1 měsíc po první dosycovací dávce.

B) Western analýza media z kultur endotelových buněk

HUVEC a HCAEC buňky se kultivují a stimulují PMA stejným způsobem, jak je popsán v příkladu 3C s tou výjimkou, že buňky se stimulují PMA po dobu 48 hodin. Vzorky kondicionovaného media (9 ml) se inkubuji s 500 μΐ 50% kaše heparin-Sepharosa CL- B ve fosfátem pufrovaném saliňičkém roztoku (PBS, 150 mM chlorid sodný, 100 mM fosforečnan sodný, pH 7,2). Heparin-Sepharosa se vybere pro částečné přečištění a koncentrování LLG proteinů vzhledem ke konzervaci zbytků v LLGXL sekvenci, které byly identifikovány jako zásadní pro vazebnou aktivitu LPL pro heparin (Ma, Y., Henderson, H.E., Liu, M.S., Zhyng, H., Forsyte, I.J., Clarke-Lewis, I., Hayden, M.R., a Brunzell, J.D., J. Lipid Res., 35: 2049 - 2059; a obr. 6). Po rotaci při 4 °C po dobu 1 hodiny se vzorky centrifugují po dobu 5 minut při 150 x g. Medium se aspiruje a Sepharosa se promyje 14 ml PBS. Po centrifugaci a aspiraci se peleta hepari-Sepharosy suspenduje v 200 μΐ 2x SDS zaváděcího pufru (4% SDS, 20% glycerol, 2% β-merkaptoethanol, 0,002% bromfenolová modř a 120 mM Tris, pH 6,8). Vzorky se zahřívají při 95 °C po dobu 5 minut a 40 μΐ se zavede do 10% Tris-Glycin SDS gelu. Po elektroforese při 140 V po dobu přibližně 90 minut se proteiny přenesou na nitrocelulosové membrány za použití Novex elektroblotovacího přístroje (210 V, 1 «

tí • fcfcfc fc

Λ • < · fc • fcfc *

O · · · « fc fcfc · fcfc « fc hodina). Membrány se blokují po dobu 30 minut v blokovacím pufru (5% odtučněné sušené mléko, 0,1% Tween 20, 150 mM chlorid sodný, 25 mM Tris pH 7,2) . Antisérum proti peptidu a normální králičí sérum se ředí 1:5000 v blokovacím pufru a inkubují se s membránami přes noc při 4 °C s jemným míšením, membrány se potom promyjí 4 x 15 minut TBTS (0,1% Tween 20, 150 mM chlorid sodný, mM Tris pH 7,2). Kozí antisérum proti králičím protilátkám konjugované s peroxidasou (Boehringer Mannheim) se ředí 1:5000 v blokovacím pufru a inkubuje se s membránami po dobu 1 hodiny za jemného třepání. Membrány se promyjí způsobem uvedeným výše, reagují s Renaissance chemiluminiscenčním činidlem (DuPont NEN) a exponují se na Kodak XAR-2 filmu. Výsledky jsou uvedeny na obr.

11. Ve vzrocích z nestimulováných HUVEC a HCAEC buněk jsou přítomny dva druhy imunoreaktivních proteinů. Koncentrace imunoreaktivních proteinů v nestimulováných HCAEC vzorků jsou o mnoho nižší, než koncentrace v odpovídajících HUVEC vzorcích. Při stimulaci PMA jsou kulturami endotelových buněk secernovány tři imunoreaktivní proteiny. Expozice PMA značně zvyšuje hladiny LLG proteinů produkovaných HCAEC kulturami. Indukce LLG proteinů PMA v HUVEC kulturách není tak výrazná.

Příklad 5: Rekombinantní produkce LLG proteinu

A) LLG expresní konstrukty cDNA kódující LLGN a LLGXL proteiny se klonují do savčího expresního vektoru pCDNA3 (Invitrogen). Tento vektor umožňuje expresi cizorodých genů v mnoha savčích buňkách za použití cytomegalovirového hlavního pozdního promotoru. LLGN 5' RACE produkt se klonuje do EcoRI místa pCDNA3. LLGXL cDNA se tráví Dral a Srfl za zisku 1,55 kB cDNA (viz obr. 4). Vektor se tráví restrikčním enzymem EcoRV a vektor a insert se ligují za použití T4 DNA ligasy a činidel z Rapid Ligation Kitu (Boehringer

9 9 • · 9

Mannheim) podle návodu výrobce. Produkty ligace se použijí pro transformaci kompetentních E. coli. Výsledné kolonie se vyšetřují restrikční analýzou a sekvencováním na přítomnost a orientaci insertu v expresním vektoru.

• 9 · • · ·

9 9 * ·

B) Přechodná transfekce LLG v COS-7 buňkách

LLG expresní vektory se vloží do COS-7 buněk za použití Lipofectaminového kationtového lipidového činidla (GIBCO). 24 hodin před transfekcí se COS-7 buňky umístí na 60 mm tkáňové kultivační disky v hustotě 2 χ 10⁵ buněk/disk. Buňky se propagují v Dulbeccově modifikovaném Eaglově mediu (DMEM, GIBCO) doplněném 10% fetálním telím sérem, 100 U/ml penicilinu, 100 pig/ml streptomycinu. 1 μ$ plasmidové DNA se přidá do 300 μΐ Optimem I bezsérového media (GIBCO). 10 μΐ Lipofectaminového činidla se ředí 300 μΐ Optimem I media a tato směs se přidá k roztoku DNA a provede se reakce při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Medium se odstraní z ploten a buňky se propláchnou 2 ml Optimem media. Roztok DNA-Lipofectamin se přidá k plotnám spolu s 2,7 ml Optimem media a plotny se inkubují po dobu 5 hodin při 37 °C. Po inkubaci se bezsérové medium odstraní a nahradí se DMEM doplněným 2% FBS a antibiotiky. 12 hodin po transfekcí se některé kultury ošetří buď 0,25 mM Pefabloc SC (Boehringer Mannheim), inhibitorem proteas, nebo 10 U/ml heparinu. 30 minut před odběrem se vzorky ošetřené heparinem ošetřří dalšími 40 U/ml heparinu. Medium se odstraní z buněk 60 hodin po transfekcí. Heparin-Sepharosa CL-4B (200 μΐ 50% kaše v PBS, pH 7,2) se přidá k 1 ml media a mísí se při 4 °C po dobu 1 hodiny. Sepharosa se peletuje centrifugací při nízké rychlosti a promyje se třikrát 1 ml chladného PBS. Sepharosa se peletuje a suspenduje ve 100 μΐ 2x zaváděcího pufru. Vzorky se zahřejí na 95 °C na dobu 5 minut. 40 μΐ každého vzorku se zavede na 10% SDS-PAGE gel. Elektroforesa a western analýza se provedou za použití anti-LLG antiséra způsobem popsaným výše. Výsledky • · «· ♦ · · · * · · • · · · · »··« e é · · 4 * · * ⁹ · · • « ··· · · · ♦ ···«·· ·» · ·· ·· jsou uvedeny na obr. 12. Proteiny z HCAEC kondicionovaného media byly použity pro kontrolu velikosti. LLGN migruje při přibližně 40 kD, což odpovídá nejmenšímu proužku v HCAEC. Medium z COS-7 buněk transfektovaných LLGXL cDNA obsahuje proužky jak 68 kD, tak 40 kD. Když byly tyto buňky ošetřeny heparinem, tak se výrazně zvýšilo množství jak 68 kD, tak 40 kD proteinů získaných z media, což ukazuje buď na uvolnění proteinu navázaného na proteoglykany z povrchu buněk, nebo na stabilizaci proteinů heparinem. Když byly buňky ošetřeny inhibitorem proteas Pefabloc, tak se množství 68 kD proteinu zvýšilo vůči 40 kD proteinu. Toto naznačuje, že protein s nižší molekulovou hmotností produkovaný těmito buňkami je produkt proteolýzy větší 68 kD formy. Úloha mRNA identifikované v diferenciálním zobrazení, která kóduje kratší, kD protein, není známá. Existují nicméně práce popisující alternativně sestřiženou formu jaterní lipasy, která je exprivována tkáňově specifickým způsobem a může tvořit zkrácený protein.

Příklad 6: LLG ve zvířecích druzích

A) Klonování králičího homologu LLG

Komerčně dostupná lambda cDNA knihovna odvozená z králičí plicní tkáně (Clontech, katalogové č. TLIOlOb) se použije k izolaci fragmentu králičího homologu LLG genu. 5 μΐ zásobního roztoku knihovny se přidá k 45 μΐ vody a směs se zahřeje na 95 °C na dobu 10 minut. Potom se přidá v konečném objemu 100 μΐ: 200 μΜ dNTP, 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl_a, 100 μΜ každého primeru DLIP774 a LLGgen2a a 2,5 U Taq polymerasy (GIBCO). Provede se 35 teplotních cyklů s parametry: 15 sekund při 94 °C, 20 sekund při 50 °C a 30 sekund při 72 °C. 10 μΐ reakční směsi se analyzuje za použití elektroforesy na agarosovém gelu. Detekuje se produkt o přibližně 300 párech baží. Část (4 • <

• ·· · ·» μΐ) reakční směsi se použije pro klonování produktu za použití TA klonovacího systému. Insert výsledného klonu se sekvencuje (SEQ ID NO: 11). Seřazení odvozené králičí aminokyselinové sekvence (SEQ ID NO: 12) a odpovídající sekvence lidské cDNA je také uvedeno na obr. 14. V nukleotidech, které nepatří do amplifikačních primerů, je 85,8% identita mezi sekvecí králičího a lidského LLG. Předpokládaný protein kódovaný touto králičí cDNA má 94,6% identitu s lidským proteinem, s tím, že většina nukleotidových substitucí je v třetí nebo vratké pozici kodonů. Významné je, že tento region zahrnuje víčkovou sekvenci předpokládaných LLG proteinů a je variabilní doménou v rodině Upasového genu. Toto je důkaz vysokého stupně konzervace tohoto genu mezi druhy.

B) LLG v jiných druzích

Pro důkaz přítomnosti LLG genu v jiných druzích je genomová DNA z různých druhů restrikčně trávena EcoRI, separována elektroforesou na agarosových gelech a blotována na nitrocelulosové membrány.

Membrány se hybridizují přes noc při 65 °C s 2,5 x 10® cpm/ml náhodných ³²P-LLG nebo ³²P-LPL (lipoproteinová lipasa) sond v hybridizačním roztoku obsahujícím 6X SSC, 10% dextransíran, 5X Denhartův roztok, 1% SDS a 5 /xg/ml lososí spermatické DNA. Membrány se promyjí O,1X SSC, 0,5% SDS po dobu 10 minut při pokojové teplotě a potom postupně po dobu 10 minut při 40 °C, 50 °C a 55 °C. Autoradiogramy blotů jsou uvedeny na obr. 16.

Obr. 16 ukazuje přítomnost LLG a LPL genů u všech vyšetřovaných druhů s tou výjimkou, že žádná hybridizace nebyla pozorována pro LLG sondu proti krysí DNA. Data pro krysí DNA mohou být artefaktem způsobeným tvorbou abnormálně velikých • · ♦ < · · • · · « • * · 4 • · · · • » <* * restrikčních fragmentů obsahujících LLG sekvence. Takové fragmenty mohou být mimo frakcionační rozsah agarosového gelu nebo mohou být neúčině blotovány. Různé proužky detekované dvěma sondami naznačují, že LPL a LLG jsou separované, evolučně konzervované geny.

Příklad 7: Enzymatická aktivita LLGXL

A) Fosfolipasová aktivita

Kondicionovaná media z COS-7 buněk přechodně exprivujících lidskou lipoproteinovou lipasu (LPL), LLGN, nebo LLGXL se testují na fosfolipasovou aktivitu. MEM obsahující 10% FBS (MEM) se použije jako prázdný vzorek a kondicionované medium z COS-7 buněk transfektovaných protismyslným LLGXL plasmidem (AS) se použije jako negativní kontrola.

Fosfatidylcholinová (PC) emulse se vyrobí za použití 10 μΐ fosfatidylcholinu (10 mM), 40 μΐ ^x<C-fosfatidylcholin, dipalmitoylu (2 /xCi) , značeného v sn 1 a sn 2 pozici a 100 μΐ Tris-TCNB (100 mM Tris, 1% Triton, 5 mM CaCl₂, 200 mM NaCl, 0,1% BSA). Emulse se odpaří během 10 minut, potom se upraví na konečný objem 1 ml přidáním Tris-TCNB.

Reakce se provede dvojmo a obsahuje 20 μΐ PC emulse a 950 μΐ media. Vzorky se inkubují v třepací vodní lázni po dobu 2-4 hodin při 37 °C. Reakce se ukončí přidáním 1 ml IN HC1, potom se provede extrakce 4 ml 2-propanol:hexanu (1:1). Vrchní 1,8 ml hexanová vrstva se zavede do silikagelové kolony a uvolněný ¹⁴C-bez mastných kyselin obsažený v protékající frakci se kvantifikuje v scintilačním přístroji. Výsledky testu jsou uvedeny na obr. 14.

B) Triacylglycerol-Upasová aktivita

Kondicionovaná media z COS-7 buněk přechodně exprivujících lidskou lipoproteinovou lipasu (LPL), LLGN, nebo LLGXL se testují na triacylglycerol-Upasovou aktivitu. MEM obsahující 10% FBS (MEM) se použije jako prázdný vzorek a kondicionované medium z COS-7 buněk transfektovaných protismyslným LLGXL plasmidem (AS) se použije jako negativní kontrola.

Koncentrovaný substrát se připraví jako bezvodá emulse značeného trioleinu (9,10-³H(N)) a neznačeného trioleinu (konečné množství celkového trioleinu = 150 mg s 6,25 x 10® cpm), která se stabilizuje přidáním 9 mg lecitinu v 100% glycerolu. 0,56 ³H-trioleinu (0,28 mCi) se smísí s 0,17 ml neznačeného trioleinu a 90 μΐ lecitinu (9 mg). Směs se odpaří proudem dusíku. Sušená lipidová směs se emulsifikuje v 2,5 ml 100% glycerolu sonikací (30 sekundové pulsy, intenzita 2, 2 sekundové cykly, 5 minut).

Substrát pro test se připraví ředěním 1 objemu koncentrovaného susbtrátu 4 objemy 0,2 M Tris-HCl pufru (pH 8,0) obsahujícími 3% hmot./obj. hovězího sérového albuminu bez mastných kyselin.

Ředěný substrát se důkladně míchá po dobu 5 sekund.

Reakce se provedou dvojmo v celkovém objemu 0,2 ml obsahujícím 0,1 ml substrátu pro test a 0,1 ml uvedeného kondicionovaného media. Reakční směsi se inkubují po dobu 90 minut při 37 °C. Reakce se ukončí přidáním 3,25 ml methanol-chloroform-heptanu 1,41:1,25:1 (obj./obj./obj.) a potom 1,05 ml 0,lM uhličitan vápenatý-boritanového pufru (pH 10,5). Po důkladném míšení po dobu 15 sekund se vzorky centrifugují po dobu 5 minut při 1000 rpm. 1,0 alikvota vrchní vodné fáze se odečítá v scintilačním přístroji. Výsledky testu jsou uvedeny na obr. 15.

• · · φ· ···· ·· · · • · · · ♦ · · • 9 · · · · ·

Příklad 8: Použití LLG polypeptidu pro vyšetřování agonistú a antagonistú

Rekombinantní LLG se produkuje v bakulovirem infikovaných hmyzích buňkách. Rekombinantní LLG se přečistí z kondicionovaného media obsahujícího nebo neobsahujícího sérum chromatografii na heparin-Sepharose a potom chromatografii na kationtové iontoměničové pryskyřici. Pokud je to nutné, použije se k přečištění LLG třetí chromatografický krok, jako je zpracování na molekulovém sítu. Během přečištění se protilátky proti peptidu použijí pro monitorování LLG proteinu a fosfolipasový test se použije pro určení aktivity LLG.

Ve fluorescenčním testu jsou konečné podmínky přibližně 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM KC1, 2 mM CaCl₂, 5 μΜ C_eNBD-PC{l-acyl-2-[6-(nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-kaproylfosfatidylcholin a LLG protein (přibližně 1 - 100 ng). Reakční směs se podrobí fluorescenční excitaci při 470 nm a průběžně se sleduje aktivita enzymu, jak je měřena emisí fluorescence při 540 nm. Sloučeniny a/nebo substance, které jsou testovány na stimulační a/nebo inhibiční aktivitu pro LLG, se přidají jako 10 - 200 mM roztoky v dimethylsulfoxidu. Sloučeniny, které stimulují nebo inhibují aktivitu LLG se identifikují podle toho, zda způsobují zvýšení nebo snížení emise fluorescence při 540 nm.

Ve thio-testu jsou konečné podmínky přibližně 25 mM Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM KC1, 10 mM CaCl₂, 4,24 mM Triton X-100, 0,5 mM 1,2-bis(hexanoylthio)-1,2-dideoxy-sn-glycero-3-fosforylcholinu, mM 4,4'-dithiobispyridinu (z 50 mM zásobního roztoku v ethanolu) a 1 - 100 ng rekombinantního LLG. Fosfolipasová aktivita se měří zvýšením absorpce při 342 nm. Sloučeniny a/nebo substance, které jsou testovány na stimulační a/nebo inhibiční aktivitu pro LLG, se přidají jako 10 - 200 mM roztoky • 4 · · · 4 · 4 ·· ·«

4 · · · · · ···· • 4 4 4 4 4 · 4 ·

4*4 4· * 4 4 4 4

4 444 4444

444444 44 · 4 · 44 v dimethylsulfoxidu. Sloučeniny, které stimulují nebo inhibují aktivitu LLG se identifikují podle toho, zda způsobují zvýšení nebo snížení absorpce při 342 nm.

Příklad 9: Transgenní myši exprivující lidský LLG

Pro další výzkum fyziologické úlohy LLG byly vytvořeny transgenní myši exprivující lidský LLG.

1,53 kb Dral/Srfl restrikční fragment kódující LLGXL (viz obr. 4) se klonuje do plasmidového vektoru (pHMG) downstream od promotoru pro ubikvitně exprivovaný gen pro 3-hydroxy-3methylglutaryl koenzym A (HMG CoA) reduktasu. TRansgenní myši exprivující různé hladiny lidského LLGXL se generují za použití běžných technik (viz například G.L. Tromp et al., Gene 1565: 199 - 205, 1995) . Transgenní myši se použijí pro určení vlivu nadměrné exprese LLGXL na lipidový profil, vaskulární patologické stavy, rychlost vývoje a závažnost atherosklerosy a jiné fyziologické parametry.

Příklad 10: Exprese LLG v atherosklerotické tkáni

Exprese LLGXL v atherosklerotické tkáni se vyšetřuje pomocí reversní transkriptasové - polymerasové řetězové reakce (RT-PCR) za použití mRNA izolované z vaskulárních biopsií od čtyř pacientů s atherosklerosou. Vzorky tkáně jsou ze stěny aorty (jeden vzorek), arteria iliaca (dva vzorky) a karotidy (jeden vzorek).

Biopsie z atherosklerotické tkáně se získají od Gloucestershire Royal Hospital, England, a polyA+ mRNA se připraví a resuspenduje se ve vodě zpracované diethylpyrouhličitaném (DEPC) v koncentraci 0,5 pig/μΐ mRNA.

Reakce s reversní transkriptasou se provedou podle GibcoBRL * · ···· · · protokolu pro Superscript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis. Stručně, cDNA se syntetizuje následujícím způsobem: 2 μΐ každé mRNA se přidají k 1 μΐ oligo(dT)₁₂__xe primeru a 9 μΐ DEC vody. Zkumavky se inkubují při 70 °C po dobu 10 minut a potom se umístí na led na dobu 1 minuty. Do každé zkumyvky se přidají následující složky: 2 μΐ 10X PCR pufru, 2 μΐ 25 mM MgCl₂, 1 μΐ 10 mM směsi dNTP a 2 μΐ 0,1 M DTT. Po 5 minutách při 42 °C se přidá 1 μΐ (200 jednotek) Superscript II reversní transkriptasy. Reakční směs se jemně mísí a potom se inkubuje při 42 °C po dobu 50 minut. Reakce se ukončí inkubací při 70 °C po dobu 15 minut a potom umístěním na led. Zbývající mRNA se zničí přidáním 1 μΐ RNAsy H do každé zkumavky a inkubací po dobu 20 minut při 37 °C.

PCR amplifikace se provedou za použití 2 μΐ cDNA reakčních směsí. Do každé zkumavky se přidá: 5 μΐ 10X PCR pufru, 5 μΐ 2 mM dNTP, 1 μΐ hllg-gspl primeru (20 pmol/ml, viz obr. 1), 1 μΐ hllg-gsp2a primeru (20 pmol/ml, viz obr. 1), 1,5 μΐ 50 mM MgCl₂, 0,5 μΐ Taq polymerasy (5 U/ml) a 34 μΐ vody. Po 2 hodinách při 95 °C se provede následujících 30 cyklů PCR reakce: 15 sekund při 94 °C, 20 sekund při 52 °C a 30 sekund při 72 °C. Výsledná reakční směs se nechá po dobu 10 minut při 72 °C před elektroforetickou analýzou na agarosovém gelu. hllg-gsp primery jsou specifické pro LLG a vedou k zisku očekávaného produktu o 300 bp. V paralelní PCR pro průkaz toho, že reakce syntézy cDNA byly úspěšné, se použijí primery specifické pro provozní gen, G3PDH (lidská glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa) (1 μΐ v koncentraci 20 pmol/ml) .

G3PDH primery (viz obr. 1) vedou k zisku očekávaného produktu o 983 bp ve všech bioptických vzorcích z cév. LLG se detekuje ve třech ze čtyřech vzorků, kdy žádná exprese není detekována ve vzorku z arteria carotis.

Všechny uvedené citace jsou zde obsaženy jako odkaz.

Odborníků v oboru bude jasné, že předkládaný vynález je vhodný pro provádění předmětů vynálezu a získání uvedených výsledků a výhod, stejně jako těch, které jsou od nich odvozené. Peptidy, polynukleotidy, způsoby, postupy a techniky, které jsou zde uvedené, jsou příklady výhodných provedení a neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Do rozsahu předkládaného vynálezu a připojených patentových nároků spadají jejich varianty a jiná použití, která budou odborníkům v oboru zřejmá.

• · ······ ·· Α» • A A A « · A AAAA • · AAA · A · t • AAAA· A · A A · • · · · · · A A · ······ ·· A ·· ··

Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel: Jaye, Michael C.

Doan, Kim-Anh T.

Krawiec, John A.

Lynch, Kevin J.

Amin, Dilip V.

South, Victoria J.

(ii) Název vynálezu: LLG polypeptidy triacylglycerol-lipasové rodiny a prostředky a způsoby pro jejich použití v enzymatické hydrolýze a proteinové a genové terapii (iii) Počet sekvencí: 31 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A)	Adresa: Rhone-Poulenc	Rorer lne.
(B)	Ulice: 500 Arcola Rd.	3C43
(C)	Město: Collegeville
(D)	Země: PA
(E)	Stát: USA
(F)	ZIP: 19426

(v) Počítačová čtecí forma:

(A) Medium: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1.0, verze # 1.30 (vi) Data současné přihlášky:

(A) Číslo přihlášky: US (B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(viii) Zástupce/agent - informace:

(A) Jméno: Fehlner Ph.D., Paul F.

(B) Registrační číslo: 35135 (C) Reference/číslo rejstříku: A2582-WO (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: (610)454-3839 (B) Telefax: (610)454-3808 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

·· ···· ·· ·» • · · · * · • * · · · · (A) Délka: 367 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 22...180 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

GAATTCGGCT TGATCAATCG C TTC Phe	AAA AAG	GGG ATC TGT CTG AGC TGC CGC	51
Lys	Lys	Gly	Ile 5	Cys	Leu	Ser	Cys Arg 10
	.1
AAG	AAC CGT TGT AAT AGC ATT	GGC	TAC	AAT	GCC	AAG	AAA	ATG	AGG AAC	99
tys	Asn Arg Cys Asn Ser Ile	Gly	Tyr	Asn	Ala	Lys	Lys	Met	Arg Asn
	15			20					25
AAG	AGG AAC AGC AAA ATG TAC	CTA	AAA	ACC	CGG	GCA	GGC	ATG	CCT TTC	147
Lys	Arg Asn Ser Lys Met Tyr	Leu	Lys	Thr	Arg	Ala	Gly	Met	Pro Phe
	30		35					40
AGA	GGT AAC CTT CAG TCC CTG	GAG	TGT	CCC	TGA	GGAAGGCCCT TAATACCTCC	200
Arg	Gly Asn Leu Gin Ser Leu	Glu	Cys	Pro	*
	45	50

TTCTTAATAC	CATGCTGCAG	AGCAGGGCAC	ATCCTAGCCC	AGGAGAAGTG	GCCAGCACAA	260
TCCAATCAAA	TCGTTGCAAA	TCAGATTACA	CTGTGCATGT	CCTAGGAAAG	GGAATCTTTA	320
CAAAATAAAC	AGTGTGGACC	CCTCAAAAAA	AAAAAAAAGC	CGAATTC		367

(2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 53 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Phe 1

Lys

Lys

Gly

Xle 5

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg 10

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn 15

Ser

Ile

Gly

Tyr

Asn 20

Ala

Lys

Lys

Met

Arg 25

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser 30

Lys

Met

Tyr

Leu

Lys 35

Thr

Arg

Ala

Gly

Met 40

Pro

Phe

Arg

Gly

Asn 45

Leu

Gin

Ser

Leu

Glu

Cys

Pro

*

(2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1328 párů baží (B) iyp: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 312...1370 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

GAATTCGGCT TCTACTACTA CTAGGCCACG CGTCGCCTAG TACGGGGGGG GGGGGGGGGG 60

TCAGCGAGTC CTTGCCTCCC GGCGGCTCAG GACGAGGGCA GATCTCGTTC TGGGGCAAGC 120

CGTTGACACT CGCTCCCTGC CACCGCCCGG GCTCCGTGCC GCCAAGTTTT CATTTTCCAC 180

CTTCTCTGCC TCCAGTCCCC CAGCCCCTGG CCGAGAGAAG GGTCTTACCG GCCGGGATTG 240

CTGGAAACAC CAAGAGGTGG TTTTTGTTTT TTAAAACTTC TGTTTCTTGG GAGGGGGTGT 300

GGCGGGGCAG G ATG AGC AAC TCC GTT CCT CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC 350

Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu

60 65

TGC TAT

TGC Cys

TTT Phe 70

GCT GCG GGG AGC CCC GTA CCT TTT GGT

CCA GAG Pro Glu 80

GGA Gly

398

Cys

Tyr

Ala

Ala Gly

Ser Pro 75

Val

Pro

Phe Gly

CGG

CTG

GAA

GAT

AAG

CTC

CAC

AAA

CCC

AAA

GCT

ACA

CAG

ACT

GAG

GTC

446

Arg

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val

85

90

95

AAA

CCA

TCT

GTG

AGG

TTT

AAC

CTC

CGC

ACC

TCC

AAG

GAC

CCA

GAG

CAT

494

Lys

Pro

Ser

Val

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

His

100

105

110

GAA

GGA

TGC

TAC

CTC

TCC

GTC

GGC

CAC

AGC

CAG

CCC

TTA

GAA

GAC

TGC

542

• · · ···· · · · · • · ·· · ···· • · · * · · · ·

« • ·· ·

• • · ·

• · • ·

9 9

• · · · 99 99

Glu 115

Gly

Cys

Tyr

Leu

Ser 120

Val

Gly

His

Ser

Gin 125

Pro

Leu

Glu

Asp

Cys 130

AGT

TTC

AAC

ATG

ACA

GCT

AAA

ACC

TTT

TTC

ATC

ATT

CAC

GGA

TGG

ACG

590

Ser

Phe

Asn

Met

Thr 135

Ala

Lys

Thr

Phe

Phe 140

Ile

Ile

His

Gly

Trp 145

Thr

ATG

AGC

GGT

ATC

TTT

GAA

AAC

TGG

CTG

CAC

AAA

CTC

GTG

TCA

GCC

CTG

638

Met

Ser

Gly

Ile 150

Phe

Glu

Asn

Trp

Leu 155

His

Lys

Leu

Val

Ser 160

Ala

Leu

CAC

ACA

AGA

GAG

AAA

GAC

GCC

AAT

GTA

GTT

GTG

GTT

GAC

TGG

CTC

CCC

686

His

Thr

Arg 165

Glu

Lys

Asp

Ala

Asn 170

Val

Val

Val

Val

Asp 175

Trp

Leu

Pro

CTG

GCC

CAC

CAG

CTT

TAC

ACG

GAT

GCG

GTC

AAT

AAT

ACC

AGG

GTG

GTG

734

Leu

Ala 180

His

Gin

Leu

Tyr

Thr 185

Asp

Ala

Val

Asn

Asn 190

Thr

Arg

Val

Val

GGA

CAC

AGC

ATT

GCC

AGG

ATG

CTC

GAC

TGG

CTG

CAG

GAG

AAG

GAC

GAT

782

Gly 195

His

Ser

Ile

Ala

Arg 200

Met

Leu

Asp

Trp

Leu 205

Gin

Glu

Lys

Asp

Asp 210

TTT

TCT

CTC

GGG

AAT

GTC

CAC

TTG

ATC

GGC

TAC

AGC

CTC

GGA

GCG

CAC

830

Phe

Ser

Leu

Gly

Asn 215

Val

His

Leu

Ile

Gly 220

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala 225

His

GTG

GCC

GGG

TAT

GCA

GGC

AAC

TTC

GTG

AAA

GGA

ACG

GTG

GGC

CGA

ATC

878

Val

Ala

Gly

Tyr 230

Ala

Gly

Asn

Phe

Val. 235

Lys

Gly

Thr

Val

Gly 240

Arg

Ile

ACA

GGT

TTG

GAT

CCT

GCC

GGG

CCC

ATG

TTT

GAA

GGG

GCC

GAC

ATC

CAC

926

Thr

Gly

Leu 245

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro 250'

Met

Phe

Glu

Gly

Ala 255

Asp

Ile

His

AAG

AGG

CTC

TCT

CCG

GAC

GAT

GCA

GAT

TTT

GTG

GAT

GTC

CTC

CAC

ACC

974

Lys

Arg 260

Leu

Ser

Pro

Asp

Asp 265

Ala

Asp

Phe

Val

Asp 270

Val

Leu

His

Thr

TAC

ACG

CGT

TCC

TTC

GGC

TTG

AGC

ATT

GGT

ATT

CAG

ATG

CCT

GTG

GGC

1022

Tyr 275

Thr

Arg

Ser

Phe

Gly 280

Leu

Ser

Ile

Gly

Ile 285

Gin

Met

Pro

Val

Gly 290

CAC

ATT

GAC

ATC

TAC

CCC

AAT

GGG

GGT

GAC

TTC

CAG

CCA

GGC

TGT

GGA

1070

His

Ile

Asp

Ile

Tyr 295

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp 300

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys 305

Giy

CTC

AAC

GAT

GTC

TTG

GGA

TCA

ATT

GCA

TAT

GGA

ACA

ATC

ACA

GAG

GTG

1118

Leu

Asn

Asp

Val 310

Leu

Gly

Ser

Ile

Ala 315

Tyr

Gly

Thr

Ile

Thr 320

Glu

Val

GTA

AAA

TGT

GAG

CAT

GAG

CGA

GCC

GTC

CAC

CTC

TTT

GTT

GAC

TCT

CTG

1166

• · ······ ·· ·· • · · · · · · ···· • · · · · · 9 9 · • · · · · · 9 · · · · • · · · · 9 9 9 9

999 999 99 9 99 99

Val Lys Cys

Glu His

Glu Arg

Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu

325

330

335

GTG

AAT

CAG

GAC

AAG

CCG

AGT

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACT

GAC

TCC

AAT

1214

Val

Asn

Gin

Asp

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

340

345

350

CGC

TTC

AAA

AAG

GGG

ATC

TGT

CTG

AGC

TGC

CGC

AAG

AAC

CGT

TGT

AAT

1262

Arg

Phe

Lys

Lys

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

355

360

365

370

AGC

ATT

GGC

TAC

AAT

GCC

AAG

AAA

ATG

AGG

AAC

AAG

AGG

AAC

AGC

AAA

1310

Ser

Ile

Gly

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

375

380

385

ATG

TAC

CTA

AAA

ACC

CGG

GCA

GGC

ATG

CCT

TTC

AGA

GGT

AAC

CTT

CAG

1358

Met

Tyr

Leu

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Gly

Asn

Leu

Gin

390

395

400

TCC

CTG

GAG

TGT

CAAGCCGAAT TC

1382

Ser

Leu

Glu

Cys

405,

(2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 353 aminokyselin (B) iyp: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

73

• 9 99

• 9 9 9 9 9 99«

99 9999

99 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9

9 9 9 • 9

► i «

Met

Ser

Asn

Ser

Val

Pro

Leu

Leu

Cys

Phe

Trp

Ser

Leu

Cys

Tyr

Cys

1

5

10

15

Phe

Ala

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Pro

Phe

Gly

Pro

Glu

Gly

Arg

Leu

Glu

20

25

30

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val

Lys

Pro

Ser

35

40

45

1

Val

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

His

Glu

Gly

Cys

50

55

60

*

Tyr

Leu

Ser

Val

Gly

His

Ser

Gin

Pro

Leu

Glu

Asp

Cys

Ser

Phe

Asn

65

70

75

80

Met

Thr

Ala

Lys

Thr

Phe

Phe

Ile

Ile

His

Gly

Trp

Thr

Met

Ser

Gly

85

90

95

Ile

Phe

Glu

Asn

Trp

Leu

His

Lys

Leu

Val

Ser

Ala

Leu

His

Thr

Arg

-

100

105

110

Glu

Lys

Asp

Ala

Asn

Val

Val

Val

Val

Asp

Trp

Leu

Pro

Leu

Ala

His

-

115

120

125

Gin

Leu

Tyr

Thr

Asp

Ala

Val

Asn

Asn

Thr

Arg

Val

Val

Gly

His

Ser

130

135

140

Ile

Ala

Arg

Met

Leu

Asp

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys

Asp

Asp

Phe

Ser

Leu

145

150

155

160

Gly

Asn

Val

His

Leu

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala

His

Val

Ala

Gly

165

170

175

Tyr

Ala

Gly

Asn

Phe

Val

Lys

Gly

Thr

Val

Gly

Arg

Ile

Thr

Gly

Leu

180

185

190

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro

Met

Phe

Glu

Gly

Ala

Asp

Ile

His

Lys

Arg

Leu

195

200

205

Ser

Pro

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe

Val

Asp

Val

Leu

His

Thr

Tyr

Thr

Arg

210

215

220

-

Ser

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile

Gly

Ile

Gin

Met

Pro

Val

Gly

His

Ile

Asp

225

230

235

240

Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gin Pro Gly Cys Gly Leu Asn Asp 245 250 255

4 * · 4*4 4 *» 44 • 4 4 4 44 4 444« • 4 β 4 4 4444

444 44 4 4 4 4 «

4 444 4444

444 444 44 4 44 44

Val

Leu

Gly

Ser 260

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr 265

Ile

Thr

Glu

Val

Val 270

Lys

Cys

Glu

His

Glu 275

Arg

Ala

Val

His

Leu 280

•Phe

Val

Asp

Ser

Leu 285

Val

Asn

Gin

Asp

Lys 290

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe 295

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser 300

Asn

Arg

Phe

Lys

Lys 305

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser 310

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg 315

Cys

Asn

Ser

Ile

Gly 320

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys 325

Met

Arg

Asn

Lys

Arg 330

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr 335

Leu

Lys

Thr

Arg

Ala 340

Gly

Met

Pro

Phe

Arg 345

Gly

Asn

Leu

Gin

Ser 350

Leu

Glu

Cys (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1065 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jraéno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...1065 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

ATG AGC AAC TCC

GTT CCT CTG CTC TGT TTC

TGG Trp

AGC CTC TGC

TAT TGC Tyr Cys

Met

Ser Asn 355

Ser

Val

Pro Leu 360

Leu

Cys

Phe

Ser 365

Leu

Cys

TTT

GCT

GCG

GGG

AGC

CCC

GTA

CCT

TTT

GGT

CCA

GAG

GGA

CGG

CTG

GAA

Phe

Ala

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Pro

Phe

Gly

Pro

Glu

Gly

Arg

Leu

Glu

370

375

380

385

GAT

AAG

CTC

CAC

AAA

CCC

AAA

GCT

ACA

CAG

ACT

GAG

GTC

AAA

CCA

TCT

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val

Lys

Pro

Ser

390

395

400

144 • ···· · · ·· * · · ♦ · · • · · · · · * • · · · · · · · • · · · · · · • · * · · φ ·

GTG AGG TTT AAC CTC CGC ACC TCC AAG GAC CCA GAG CAT GAA GGA TGC 192

Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His Glu Gly Cys

405 410 415

TAC CTC TCC GTC GGC CAC AGC CAG CCC TTA GAA GAC TGC AGT TTC AAC 240

Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gin Pro Leu Glu Asp Cys Ser Phe Asn

420 425 430

ATG ACA GCT AAA ACC TTT TTC ATC ATT CAC GGA TGG ACG ATG AGC GGT 288

Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr Met Ser Gly

435 440 445

ATC TTT GAA AAC TGG CTG CAC AAA CTC GTG TCA GCC CTG CAC ACA AGA 336

Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu His Thr Arg

450 455 460 465

GAG AAA GAC GCC AAT GTA GTT GTG GTT GAC TGG CTC CCC CTG GCC CAC 384

Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro Leu Ala His

470 475 480

CAG CTT TAC ACG GAT GCG GTC AAT AAT ACC AGG GTG GTG GGA CAC AGC 432 j

Gin Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val Gly His Ser f

495

485

ATT	GCC	AGG	ATG	CTC	GAC
Ile	Ala	Arg 500	Met	Leu	Asp
GGG	AAT	GTC	CAC	TTG	ATC
Gly	Asn 515	Val	His	Leu	Ile
TAT	GCA	GGC	AAC	TTC	GTG
Tyr 530	Ala	Gly	Asn	Phe	Val 535
GAT	CCT.	GCC	GGG	CCC	ATG
Asp	Pro	Ala	Gly	Pro 550	Met
TCT	CCG	GAC	GAT	GCA	GAT
Ser	Pro	Asp	Asp 565	Ala	Asp
TCC	TTC	GGC	TTG	AGC	ATT
Ser	Phe	Gly 580	Leu	Ser	Ile
ATC	TAC	CCC	AAT	GGG	GGT
Ile	Tyr 595	Pro	Asn	Gly	Gly
GTC	TTG	GGA	TCA	ATT	GCA
Val 610	Leu	Gly	Ser	Ile	Ala 615

490

TGG	CTG	CAG	GAG	AAG	GAC
Trp	Leu 505	Gin	Glu	Lys	Asp
GGC	TAC	AGC	CTC	GGA	GCG
Gly 520	Tyr	Ser	Leu	Gly	Ala 525
AAA	GGA	ACG	GTG	GGC	CGA
Lys	Gly	Thr	Val	Gly 540	Arg
TTT	GAA	GGG	GCC	GAC	ATC
Phe	Glu	Gly	Ala 555	Asp	Ile
TTT	GTG	GAT	GTC	CTC	CAC
Phe	Val	Asp 570	Val	Leu	His
GGT	att'	CAG	ATG	CCT	GTG
Gly	Ile 585	Gin	Met	Pro	Val
GAC	TTC	CAG	CCA	GGC	TGT
Asp 600	Phe	Gin	Pro	Gly	Cys 605
TAT	GGA	ACA	ATC	ACA	GAG
Tyr	Gly	Thr	Ile	Thr 620	Glu

GAT TTT TCT CTC 480

Asp Phe Ser Leu

510

CAC GTG GCC GGG 528

His Val Ala Gly

ATC ACA GGT TTG 576

Ile Thr Gly Leu

545

CAC AAG AGG CTC 624

His Lys Arg Leu

560

ACC TAC ACG CGT 672

Thr Tyr Thr Arg

575

GGC CAC ATT GAC 720

Gly His Ile Asp

590

GGA CTC AAC GAT 768

Gly Leu Asn Asp

GTG GTA AAA TGT 816

Val Val Lys Cys

625

Ίζ>

• · ······ · · - fcfc • ο · · · · · ·«·· * · ·· « · « · · • · * · * · · · · · · • · · · · · · · · fc·*··· ·· · ·· ··

GAG Glu

CAT GAG CGA GCC GTC

CAC CTC

TTT GTT GAC TCT CTG GTG AAT CAG

864

His

Glu

Arg

Ala 630

Val

His

Leu

Phe

Val 635

Asp

Ser

Leu

Val Asn Gin 640

GAC

AAG

CCG

AGT

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACT

GAC

TCC

AAT

CGC

TTC

AAA

912

Asp

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

Lys

645

650

655

AAG

GGG

ATC

TGT

CTG

AGC

TGC

CGC

AAG

AAC

CGT

TGT

AAT

AGC

ATT

GGC

960

Lys

Gly

Ile

cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Ser

Ile

Gly

660

665

670

TAC

AAT

GCC

AAG

AAA

ATG

AGG

AAC

AAG

AGG

AAC

AGC

AAA

ATG

TAC

CTA

1008

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr

Leu

675

680

685

AAA

ACC

CGG

GCA

GGC

ATG

CCT

TTC

AGA

GGT

AAC

CTT

CAG

TCC

CTG

GAG

1056

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Gly

Asn

Leu

Gin

Ser

Leu

Glu

690

695

700

705

TGT CCC TGA Cys Pro * (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 355 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Xet ser Asn Ser Val Pro Leu. Leu Cys Phe Trp Ser Leu Cys Tyr Cys i 5 10 ¹⁵

Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu ^{25 30}

Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala 35 40

Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser 50 55

Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gin 65 70

Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe lle 85 lle Phe Glu Asn Trp Leu His Lys 100

Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val 115 120

Gin Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn 130 135 lle Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu 145 150

Gly Asn Val His Leu lle Gly Tyr 165

Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly

180

Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu 195 200

Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val 210 215

Ser Phe Gly Leu Ser lle Gly lle 225 230 lle Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe 245

Val Leu Gly Ser lle Ala Tyr Gly 260

Glu His Glu Arg Ala Val His Leu 275 280

	•	• ·	•	• · · · · · « ·	• · • ·	• · • ·
77	•	• · ·	• • A	• • · »· ·	•	• · • * • ·	• · • · • «
Thr	Gin	Thr	Glu	Val 45	Lys	Pro	1 | Ser
Lys	Asp	Pro	Glu 60	His	Glu	Gly	Cys
Pro	Leu	Glu 75	Asp	Cys	Ser	Phe	Asn 80
lle	His 90	Gly	Trp	Thr	Met	Ser 95	Gly
Leu 105	Val	Ser	Ala	Leu	His 110	'Thr	Arg
Val	Asp	Trp	Leu	Pro 125	Leu	Ala	His
Asn	Thr	Arg	Val 140	Val	Gly	His	Ser
Gin	Glu	Lys 155	Asp	Asp	Phe	Ser	Leu 160
Ser	Leu 170	Gly	Ala	His	Val	Ala 175	Gly
Thr 185	Val	Gly	Arg	lle	Thr 190	Gly	Leu:
Gly	Ala	Asp	lle	His 205	Lys	Arg	Leu
Asp	Val	Leu	His 220	Thr	Tyr	Thr	Arg
Gin	Met	Pro 235	Val	Gly	His	lle	Asp 240
Gin	Pro 250	Gly	Cys	Gly	Leu	Asn 255	Asp
Thr 265	lle	Thr	Glu	Val	Val 270	Lys	Cys
Phe	Val	Asp	Ser	Leu	Val	Asn	Gin

285

Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gin Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys 290 295 300

9 9 9 • · · · 9 9 9 » 9 9 9 • · 999 9999

999999 99 9 9 9 99

Lys 305

Gly

lle

Cys

Leu

Ser 310

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg 315

Cys

Asn

Ser

Ile

Gly 320

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys 325

Met

Arg

Asn

Lys

Arg 330

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr 335

Leu

Lys

Thr

Arg

Ala 340

Gly

Met

Pro

Phe

Arg 345

Gly

Asn

Leu

Gin

Ser 350

Leu

Glu

Cys Pro * 355 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 2565 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jměno/klíč: CDS (B) Umístění: 252...1754 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7

GATCTCGTTC	TGGGGCAAGC	60
GCCAAGTTTT	CATTTTCCAC	120
GGTCTTACCG	GCCGGGATTG	180
TGTTTCTTGG	GAGGGGGTGT	240
: TGT TTC TGG AGC CTC	290

Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu 360 365

TGC TAT TGC

TTT GCT GCG GGG AGC CCC GTA CCT

TTT GGT CCA GAG GGA

338

Cys

Tyr 370

Cys

Phe Ala Ala Gly 375

Ser Pro Val

Pro

Phe 380

Gly

Pro

Glu

Gly

CGG

CTG

GAA

GAT

AAG

CTC

CAC

AAA

CCC

AAA

GCT

ACA

CAG

ACT

GAG

GTC

386

Arg

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val

385

390

395

400

AAA

CCA

TCT

GTG

AGG

TTT

AAC

CTC

CGC

ACC

TCC

AAG

GAC

CCA

GAG

CAT

434

Lys

Pro

Ser

Val

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

His

405 410 415

GAA	GGA	TGC	TAC	CTC	TCC
Glu	Gly	Cys	Tyr 420	Leu	Ser
AGT	TTC	AAC	ATG	ACA	GCT
Ser	Phe	Asn 435	Met	Thr	Ala
ATG	AGC	GGT	ATC	TTT	GAA
Met	Ser 450	Gly	Ile	Phe	Glu
CAC	ACA	AGA	GAG	AAA	GAC
His 465	Thr	Arg	Glu	Lys	Asp 470
CTG	GCC	CAC	CAG	CTT	TAC
Leu	Ala	His	Gin	Leu 485	Tyr
GGA	CAC	AGC	ATT	GCC	AGG
Gly	His	Ser	Ile 500	Ala	Arg
TTT	TCT	CTC	GGG	AAT	GTC
Phe	Ser	Leu 515	Gly	Asn	Val
GTG	GCC	GGG	TAT	GCA	GGC
Val	Ala 530	Gly	Tyr	Ala	Gly
ACA	GGT	TTG	GAT	CCT	GCC
Thr 545	Gly	Leu	Asp	Pro	Ala 550
AAG	AGG	CTC	TCT	CCG	GAC
Lys	Arg	Leu	Ser	Pro 565	Asp
TAC	ACG	CGT	TCC	TTC	GGC
Tyr	Thr	Arg	Ser 580	Phe	Gly
CAC	ATT	GAC	ATC	TAC	CCC
His	Ile	Asp 595	Ile	Tyr	Pro
CTC	AAC	GAT	GTC	TTG	GGA
Leu	Asn 610	Asp	Val	Leu	Gly
GTA	AAA	TGT	GAG	CAT	GAG
Val 625	Lys	Cys	Glu	His	Glu 630
GTG	AAT	CAG	GAC	AAG	CCG
Val	Asn	Gin	Asp	Lys 645	Pro

• ·« ···« · · ·· • · · · · 0 · 0 «

00 0 000« *0 00 00 00 0

000 0000

1000 00 0 00 00

TTA GAA GAC TGC 482

Leu Glu Asp Cys 430

CAC GGA TGG ACG 530

His Gly Trp Thr

445

GTG TCA GCC CTG 578

Val Ser Ala Leu

GAC TGG ČTC CCC 626

Asp Txp Leu Pro

480 ,

ACC AGG GTG GTG 674

Thr Arg Val Val 495

GAG AAG GAC GAT 722

Glu Lys Asp Asp 510

CTC GGA GCG CAC 770

Leu Gly Ala His

525

GTG GGC CGA ATC 818

Val Gly Arg Ile

GCC GAC ATC CAC 866

Ala Asp Ile His 560

GTC CTC CAC ACC 914

Val Leu His Thr 575

ATG CCT GTG GGC 962

Met Pro Val Gly 590

CCA GGC TGT GGA 1010

Pro Gly Cys Gly

605

ATC ACA GAG GTG 1058

Ile Thr Glu Val

GTT GAC TCT CTG 1106

Val Asp Ser Leu 640

ACT GAC TCC AAT 1154

Thr Asp Ser Asn

655

GTC	GGC	CAC	AGC	CAG	CCC
Val	Gly	His 425	Ser	Gin	Pro
AAA	ACC	TTT	TTC	ATC	ATT
Lys	Thr 440	Phe	Phe	Ile	Ile
AAC	TGG	CTG.	CAC	AAA	CTC
Asn 455	Trp	Leu	His	Lys	Leu 460
GCC	AAT	GTA	GTT	GTG	GTT
Ala	Asn	Val	Val	Val 475	Val
ACG	GAT	GCG	GTC	AAT	AAT
Thr	Asp	Ala	Val· 490	Asn	Asn
ATG	CTC	GAC	TGG	CTG	CAG
Met	Leu	Asp 505	Trp	Leu	Gin
CAC	TTG	ATC	GGC	TAC	AGC
His	Leu 520	Ile	Gly	Tyr	Ser
AAC	TTC	GTG	AAA	GGA	ACG
Asn 535	Phe	Val	Lys	Gly	Thr 540
GGG	CCC	ATG	TTT	GAA	GGG
Gly	Pro	Met	Phe	Glu 555	Gly
GAT	GCA	GAT	TTT	GTG	GAT
Asp	Ala	Asp	Phe 570	Val	Asp
TTG	AGC	ATT	GGT	ATT	CAG
Leu	Ser	Ile 585	Gly	Ile	Gin
AAT	GGG	GGT	GAC	TTC	CAG
Asn	Gly 600	Gly	Asp	Phe	Gin
TCA	ATT	GCA	TAT	GGA	ACA
Ser 615	Ile	Ala	Tyr	Gly	Thr 620
CGA	GCC	GTC	CAC	CTC	TTT
Arg	Ala	Val	His	Leu 635	Phe
AGT	TTT	GCC	TTC	CAG	TGC
Ser	Phe	Ala	Phe	Gin	Cys

650

CGC TTC AAA	AAG GGG	ATC TGT CTG AGC. TGC CGC AAG AAC CGT TGT AAT	1202
Arg Phe	Lys	Lys 660	Gly	Ile Cys	Leu	Ser 665	Cys Arg	Lys Asn Arg 670	Cys Asn
AGC ATT	GGC	TAC	AAT	GCC AAG	AAA	ATG	AGG AAC	AAG AGG AAC	AGC AAA	1250
Ser Ile	Gly 675	Tyr	Asn	Ala Lys	Lys 680	Met	Arg Asn	Lys Arg Asn 685	Ser Lys
ATG TAC	CTA	AAA	ACC	CGG GCA	GGC	ATG	CCT TTC	AGA GTT TAC	CAT TAT	1298
Met Tyr 690	Leu	Lys	Thr	Arg Ala 695	Gly	Met	Pro.Phe	Arg Val Tyr 700	His Tyr
CAG ATG	AAA	ATC	CAT	GTC TTC	AGT	TAC	AAG AAC	ATG GGA GAA	ATT GAG	1346
Gin Met 705	Lys	Ile	His	Val Phe 710	Ser	Tyr	Lys Asn 715	Met Gly Glu	Ile Glu 720
CCC ACC	TTT	TAC	GTC	ACC CTT	TAT	GGC	ACT AAT	GCA GAT TCC	CAG ACT	1394
Pro Thr	Phe	Tyr	Val 725	Thr Leu	Tyr	Gly	Thr Asn 730	Ala Asp Ser	Gin Thr 735
CTG CCA	CTG	GAA	ATA	GTG GAG	CGG	ATC	GAG CAG	AAT GCC ACC	AAC ACC	1442
Leu Pro	Leu	Glu 740	Ile	Val Glu	Arg	Ile 745	Glu Gin	Asn Ala Thr 750	Asn Thr
TTC CTG	GTC	TAC	ACC	GAG GAG	GAC	TTG	GGA GAC	CTC TTG AAG	ATC CAG	1490
Phe Leu	Val 755	Tyr	Thr	Glu Glu	Asp 760	Leu	Gly Asp	Leu Leu Lys 765	Ile Gin
CTC ACC	TGG	GAG	GGG	GCC TCT	CAG	TCT	TGG TAC	AAC CTG TGG	AAG GAG	1538
Leu Thr 770	Trp	Glu	Gly	Ala Ser 775	Gin	Ser	Trp Tyr	Asn Leu Trp 780	Lys Glu
TTT CGC	AGC	TAC	CTG	TCT CAA	CCC	CGC	AAC CCC	GGA CGG GAG	CTG AAT	1586
Phe Arg 785	Ser	Tyr	Leu	Ser Gin 790	Pro	Arg	Asn Pro 795	Gly Arg Glu	Leu Asn 800
ATC AGG	CGC	ATC	CGG	GTG AAG	TCT	GGG	GAA ACC	CAG CGG AAA	CTG ACA	1634
Ile Arg	Arg	Ile	Arg 805	Val Lys	Ser	Gly	Glu Thr 810	Gin Arg Lys	Leu Thr 815
TTT TGT	ACA	GAA	GAC	CCT GAG	AAC	ACC	AGC ATA	TCC CCA GGC	CGG GAG	1682
Phe Cys	Thr	Glu 820	Asp	Pro Glu	Asn	Thr 825	Ser Ile	Ser Pro Gly 830	Arg Glu
CTC TGG	TTT	CGC	AAG	TGT CGG	GAT	GGC	TGG AGG	ATG AAA AAC	GAA ACC	1730
Leu Trp	Phe 835	Arg	Lys	Cys Arg	Asp 840	Gly	Trp Arg	Met Lys Asn 845	Glu Thr
AGT CCC Ser Pro	ACT Thr	GTG Val	GAG Glu	CTT CCC Leu Pro	TGA ★	GGGTGCCCGG GCAAGTCTTG CCAGCAAGGC	1784

850 855 • · ·*···· «· ·* • 4 44 · 4 « ···« • 4 444 4444 • 444 44 44 44 4 > · 444 444 «

44444« 4· 4 *4 44

AGCAAGACTT	CCTGCTATCC	AAGCCCATGG	AGGAAAGTTA	CTGCTGAGGA	CCCACCCAAT	1844
GGAAGGATTC	TTCTCAGCCT	TGACCCTGGA	GCACTGGGAA	CAACTGGTCT	CCTGTGATGG	1904
CTGGGACTCC	TCGCGGGAGG	GGACTGCGCT	GCTATAGCTC	TTGCTGCCTC	TCTTGAATAG	1964
CTCTAACTCC	AAACCTCTGT	CCACACCTCC	AGAGCACCAA	GTCCAGATTT	GTGTGTAAGC	2024
AGCTGGGTGC	CTGGGGCCTC	TCGTGCACAC	TGGATTGGTT	TCTCAGTTGC	TGGGCGAGCC	2084
TGTACTCTGC	CTGACGAGGA	ACGCTGGCTC	CGAAGAGGCC	CTGTGTAGAA	GGCTGTCAGC	2144
TGCTCAGCCT	GCTTTGAGCC	TCAGTGAGAA	GTCCTTCCGA	CAGGAGCTGA	CTCATGTCAG	2204
GATGGCAGGC	CTGGTATCTT	GCTCGGGCCC	TGGCTGTTGG	GGTTCTCATG	ggttgcactg	2264
ACCATACTGC	TTACGTCTTA	GCCATTCCGT	CCTGCTCCCC	AGCTCACTCT	CTGAAGCACA	2324
CATCATTGGC	TTTCCTATTT	TTCTGTTCAT	TTTTTAATTG	AGCAAATGTC	TATTGAACAC	2384
.TTAAAATTAA	TTAGAATGTG	GTAATGGACA	TATTACTGAG	CCTCTCCATT	TGGAACCCAG	2444
TGGAGTTGGG	ATTTCTAGAC	CCTCTTTCTG	TTTGGATGGT	GTATGTGTAT	ATGCATGGGG	2504
AAAGGCACCT	GGGGCCTGGG	GGAGGCTATA	GGATATAAGC	AGTCGACGCG	GCCGCGAATT	2564
C						2565

(2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 501 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

(xij	i Popis	sekvence:	SEQ ID NO:	8:
Met 1	Ser Asn	Ser Val Pro 5	Leu Leu Cys	Phe Trp Ser Leu Cys Tyr Cys 10 15
Phe	Ala Ala	Gly Ser Pro 20	Val Pro Phe 25	Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu 30
Asp	Lys Leu 35	His Lys Pro	Lys Ala Thr 40	Gin Thr Glu Val Lys Pro Ser 45

0 0 0 0 0 0 0 0 0 • 0 0 0 · 0 ·

0 · 0 0 0 0

0

0 0

0 0

0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0

0 0

Val

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

His

Glu

Gly

Cys

50

55

60

Tyr

Leu

Ser

Val

Gly

His

Ser

Gin

Pro

Leu

Glu

Asp

Cys

Ser,

Phe

Asn

65

70

75

80

Met

Thr

Ala

Lys

Thr

Phe

Phe

Ile

Ile

His

Gly

Trp

Thr

Met

Ser

Gly

85

90

95

Ile

Phe

Glu

Asn

Trp

Leu

His

Lys

Leu

Val

Ser

Ala

Leu

His

Thr

Arg

100

105

110

Glu

Lys

Asp

Ala

Asn

Val

Val

Val

Val

Asp

Trp

Leu

Pro

Leu

Ala

His

115

120

125

Gin

Leu

Tyr

Thr

Asp

Ala

Val

Asn

Asn

Thr

Arg

Val

Val

Gly

His

Ser

130

135

140

Ile

Ala

Arg

Met

Leu

Asp

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys

Asp

Asp

Phe

Ser

Leu

145

150

155

160

Gly

Asn

Val

His

Leu

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala

His

Val

Ala

Gly

165

170

175

Tyr

Ala

Gly

Asn

Phe

Val

Lys

Gly

Thr

Val

Gly

Arg

Ile

Thr

Gly

Leu

180

185

190

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro

Met

Phe

Glu

Gly

Ala

Asp

Ile

His

Lys

Arg

Leu

195

200

205

Ser

Pro

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe

Val

Asp

Val

Leu

His

Thr

Tyr

Thr

Arg

210

215

220

Ser

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile

Gly

Ile

Gin

Met

Pro

Val

Gly

His

Ile

Asp

225

230

235

240

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys

Gly

Leu

Asn

Asp

245

250

255

Val

Leu

Gly

Ser

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Val

Val

Lys

Cys

260

265

270

Glu

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

Val

Asn

Gin

275

280

285

Asp

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

Lys

290

295

300

Lys

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Ser

Ile

Gly

305

310

315

320

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr

Leu

325

330

335

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Val

Tyr

His

Tyr

Gin

Met

Lys

340

345

350

• · ·♦ ···· · ·

83

• · ··· ···

• · • ·

• •

• · · ·

• ·

• ·

Ile

His

Val

Phe

Ser

Tyr

Lys

Asn

Met

Gly

Glu

Ile

Glu

Pro

Thr

Phe

355

360

365

Tyr

Val

Thr

Leu

Tyr

Gly

Thr

Asn

Ala

Asp

Ser

Gin

Thr

Leu

Pro

Leu

370

375

380

Glu

Ile

Val

Glu

Arg

Ile

Glu

Gin

Asn

Ala

Thr

Asn

Thr

Phe

Leu

Val

385

390

•395

400

Tyr

Thr

Glu

Glu

Asp

Leu

Gly

Asp

Leu

Leu

Lys

Ile

Gin

Leu

Thr

Trp

405

410

415

*

Glu

Gly

Ala

Ser

Gin

Ser

Trp

Tyr

Asn

Leu

Trp

Lys

Glu

Phe

Arg

Ser

420

425

430

Tyr

Leu

Ser

Gin

Pro

Arg

Asn

Pro

Gly

Arg

Glu

Leu

Asn

Ile

Arg

Arg

435

440

445

Ile

Arg

Val

Lys

Ser

Gly

Glu

Thr

Gin

Arg

Lys

Leu

Thr

Phe

Cys

Thr

450

455

460

Glu

Asp

Pro

Glu

Asn

Thr

Ser

Ile

Ser

Pro

Gly

Arg

Glu

Leu

Trp

Phe

465

470

475

480

Arg

Lys

Cys

Arg

Asp

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Asn

Glu

Thr

Ser

Pro

Thr

485

490

495

Val

Glu

Leu

Pro

*

500 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1035 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...1035 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

ATG AGC AAC

TCC Ser 505

GTT CCT

CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC

TGC TAT TGC

48

Met

Ser

Asn

Val

Pro

Leu Leu

Cys Phe 510-

Trp Ser

Leu

Cys Tyr 515

Cys

TTT

GCT

GCG

GGG

AGC

CCC

GTA

CCT

TTT

GGT

CCA

GAG

GGA

CGG

CTG

GAA

96

Phe

Ala

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Pro

Phe

Gly

Pro

Glu

Gly

Arg

Leu

Glu

520

525

530

GAT

AAG

CTC

CAC

AAA

CCC

AAA

GCT

ACA

CAG

ACT

GAG

GTC

AAA

CCA

TCT'

144

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val

Lys

Pro

Ser

535 540 545

GTG

AGG

TTT

AAC

CTC

CGC

ACC

TCC

AAG

GAC

CCA

GAG

CAT

GAA

GGA

TGC

192

Val

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

His

Glu

Gly

Cys

550

555

560

565

TAC

CTC

TCC

GTC

GGC

CAC

AGC

CAG

CCC

TTA

GAA

GAC

TGC

AGT

TTC

AAC

240

Tyr

Leu

Ser

Val

Gly

His

Ser

Gin

Pro

Leu

Glu

Asp

Cys

Ser

Phe

Asn

570

575

580

ATG

ACA

GCT

AAA

ACC

TTT

TTC

ATC

ATT

CAC

GGA

TGG

ACG

ATG

AGC

GGT

288

Met

Thr

Ala

Lys

Thr

Phe

Phe

Ile

Ile

His

Gly

Trp

Thr

Met

Ser

Gly

585

590

595

ATC

TTT

GAA

AAC

TGG

CTG

CAC

AAA

CTC

GTG

TCA

GCC

CTG

CAC

ACA

AGA

336

Ile

Phe

Glu

Asn

Trp

Leu

His

Lys

Leu

Val

Ser

Ala

Leu

His

Thr

Arg

600

605

610

GAG

AAA

GAC

GCC

AAT

GTA

GTT

GTG

GTT

GAC

TGG

CTC

CCC

CTG

GCC

CAC

384

Glu

Lys

Asp

Ala

Asn

Val

Val

Val

Val

Asp

Trp

Leu

Pro

Leu

Ala

His

615

620

625

CAG

CTT

TAC

ACG

GAT

GCG

GTC

AAT

AAT

ACC

AGG

GTG

GTG

GGA

CAC

AGC

432

Gin

Leu

Tyr

Thr

Asp

Ala

Val

Asn

Asn

Thr

Arg

Val

Val

Gly

His

Ser

630

635

640

645

ATT

GCC

AGG

ATG

CTC

GAC

TGG

CTG

CAG

GAG

AAG

GAC

GAT

TTT

TCT

CTC

480

Ile

Ala

Arg

Met

Leu

Asp

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys

Asp

Asp

Phe

Ser

Leu

650

655

660

GGG

AAT

GTC

CAC

TTG

ATC

GGC

TAC

AGC

CTC

GGA

GCG

CAC

GTG

GCC

GGG

528

Gly

Asn

Val

His

Leu

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala

His

Val

Ala

Gly

665

670

675

TAT

GCA

GGC

AAC

TTC

GTG

AAA

GGA

ACG

GTG

GGC

CGA

ATC

ACA

GGT

TTG

576

Tyr

Ala

Gly

Asn

Phe

Val

Lys

Gly

Thr

Val

Gly

Arg

Ile

Thr

Gly

Leu

680

685

690

GAT

CCT

GCC

GGG

CCC

ATG

TTT

GAA

GGG

GCC

GAC

ATC

CAC

AAG

AGG

CTC

624

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro

Met

Phe

Glu

Gly

Ala

Asp

Ile

His

Lys

Arg

Leu

695

700

705

TCT

CCG

GAC

GAT

GCA

GAT

TTT

GTG

GAT

GTC

CTC

CAC

ACC

TAC

ACG

CGT

672

Ser

Pro

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe

Val

Asp

Val

Leu

His

Thr

Tyr

Thr

Arg

710

715

720

725

TCC

TTC

GGC

TTG

AGC

ATT

GGT

ATT

CAG

ATG

CCT

GTG

GGC

CAC

ATT

GAC

720

Ser

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile

Gly

Ile

Gin

Met

Pro

Val

Gly

His

Ile

Asp

730

735

740

ATC

TAC

CCC

AAT

GGG

GGT

GAC

TTC

CAG

CCA

GGC

TGT

GGA

CTC

AAC

GAT

768

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys

Gly

Leu

Asn

Asp

745

750

755 *4 4··· 44 44 • · 4 4 4 4

85

4 4 4 4 44 4

4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4

• · 4 4 • 4 4 · 4 4 4 4 44 44

GTC

TTG

GGA

TCA

ATT

GCA

TAT

GGA

ACA

ATC

ACA

GAG

GTG

GTA

AAA

TGT

816

Val

Leu

Gly

Ser

lle

Ala

Tyr

Gly

Thr

lle

Thr

Glu

Val

Val

Lys

Cys

760

765

770

GAG

CAT

GAG

CGA

GČC

GTC

CAC

CTC

TTT

GTT

GAC

TCT

CTG

GTG

AAT

CAG

864

Glu

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

Val

Asn

Gin

775

780

785

GAC

AAG

CCG

AGT

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACT

GAC

TCC

AAT

CGC

TTC

AAA

912

Asp

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

Lys

*

790

795

800

805

•

AAG

GGG

ATC

TGT

CTG

AGC

TGC

CGC

AAG

AAC

CGT

TGT

AAT

AGC

ATT

GGC

960

Lys

Gly

lle

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Ser

lle

Gly

810

815

820

TAC

AAT

GCC

AAG

AAA

ATG

AGG

AAC

AAG

AGG

AAC

AGC

AAA

ATG

TAC

CTA

1008

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr

Leu

825

830

835

AAA

ACC

CGG

GCA

GGC

ATG

CCT

TTC

AGA

1035

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

*

840

845

(2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 345 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Met 1

Ser

Asn

Ser

Val 5

Pro

Leu

Leu

Cys

Phe 10

Trp

Ser

Leu

Cys

Tyr 15

Cys

Phe

Ala

Ala

Gly 20

Ser

Pro

Val

Pro

Phe 25

Gly

Pro

Glu

Gly

Arg 30

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu 35

His

Lys

Pro

Lys

Ala 40

Thr

Gin

Thr

Glu

Val 45

Lys

Pro

Ser

Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His Glu Gly Cys

55 60 • ·· · ·· · ·· ·· ·· ····· • ··· · · · · ·· • » · · · ···· ······ ·· · *· ·«

Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gin Pro Leu Glu Asp Cys Ser Phe Asn 65 70 75 80

Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr Met Ser Gly 85 90 95

Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu His Thr Arg 100 105 110

Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro Leu Ala His 115 120 125

Gin Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val Gly His Ser

130 135 140

Ile Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu Gin Glu Lys Asp Asp Phe Ser Leu

145 150 155 160

Gly Asn Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Val Ala Gly

165 170 175

Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly Thr Val Gly Arg Ile Thr Gly Leu 180 185 190

Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu Gly Ala Asp Ile His Lys Arg Leu 195 200 205

Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr Tyr Thr Arg 210 . 215 220

Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile Gin Met Pro Val Gly His Ile Asp

225 230 235 240

Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gin Pro Gly Cys Gly Leu ASn Asp

245 250 255

Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val Val Lys Cys 260 265 270

Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gin 275 280 285

Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gin Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys 290 295 300

Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser Ile Gly

305 310 315 320

Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn Lys Arg Asn Ser Lys Met Tyr Leu

325 330 335

Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe Arg 340 345 • * tt 999» tt tt

9 · · · · · ···« • * · · · 9 9 9 « • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 999 9999

999 999 99 9 «9 99 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 225 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...225 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

CTG Leu

GGA TCC ATC

GCC TAT GGC ACG ATC GCG GAG GTG GTG AAG TGC GAG

48

Gly Ser

Ile

Ala 350

Tyr Gly

Thr Ile

Ala Glu 355

Val Val

Lys

Cys 360

Glu

CAT

GAG

CGG

GCC

GTG

CAT

CTC

TTT

GTG

GAC

TCC

CTG

GTG

AAC

CAG

GAC

96

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

Val

Asn

Gin

Asp

365

370

375

AAG

CCG

AGC

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACA

GAC

TCC

AAC

CGC

TTC

AAA

AAA

144

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

Lys

Lys

380

385

390

GGG

ATC

TGT

CTC

AGC

TGC

CGG

AAG

AAC

CGC

TGT

AAC

GGC

ATC

GGC

TAC

192

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Gly

Ile

Gly

Tyr

395

400

405

AAT

GCT

AAG

AAG

ACG

AGG

AAT

AAG

AGG

AAC

ACC

225

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

410 415 420 (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 75 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

t· ft ··· ·* «44· • · 4 • ftft • · · ·· ft • ft *4 • · a · • · · · • ft· · • ftft · ·· ··

Leu 1

Gly

Ser

Ile

Ala 5

Tyr

Gly

Thr

Ile

Ala 10

Glu

Val

Val

Lys

Cys 15

Glu

His

Glu

Arg

Ala 20

Val

His

Leu

Phe

Val 25

Asp'

Ser

Leu

Val

Asn 30

Gin

Asp

Lys

Pro

Ser 35

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys 40

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg 45

Phe

Lys

Lys

Gly

Ile 50

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg 55

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn 60

Gly

Ile

Gly

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

65

70

75

(2) Informace pro SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 472 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

Met 1

Glu

Ser

Lys

Ala 5 ·

Leu

Leu

Val

Leu

Thr 10

Leu

Ala

Val

Trp

Leu 15

Gin

Ser

Leu

Thr

Ala 20

Ser

Arg

Gly

Gly

Val 25

Ala

Ala

Ala

Asp

Gin 30

Arg

Arg

Asp

Phe

Ile 35

Asp

Ile

Glu

Ser

Lys 40

Phe

Ala

Leu

Arg

Thr 45

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala 50

Glu

Asp

Thr

Cys

His 55

Leu

Ile

Pro

Gly

Val 60

Ala

Glu

Ser

Val

Ala 65

Thr

Cys

His

Phe

Asn 70

His

Ser

Ser

Lys

Thr 75

Phe

Met

Val

Ile

His 80

Gly

Trp

Thr

Val

Thr 85

Gly

Met

Tyr

Glu

Ser 90

Trp

Val

Pro

Lys

Leu 95

Val

Ala

Ala

Leu

Tyr 100

Lys

Arg

Glu

Pro

Asp 105

Ser

Asn

Val

Ile

Val 110

Val

Asp

Trp

Leu

Ser

Arg

Ala

Gin

Glu

His

Tyr

Pro

Val

Ser

Ala

Gly

Tyr

Thr

115 120 125

Lys Val Gly Gin Asp Val Ala Arg Phe Ile Asn Trp Met Glu Glu Glu

130 135 140 « »

89

•

Β B Β B

B Β B

B * • B

• « Β B

•

• B B

B

Β B

β

• · B ·

Β · Β B

Phe

Asn

Tyr

Pro

Leu

Asp

Asn

Val

His

Leu

Leu

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly

145

150

155

160

Ala

His

Ala

Ala

Gly

lle

Ala

Gly

Ser

Leu

Thr

Asn

Lys

Lys

Val

Asn

165

170

175

Arg

lle

Thr

Gly

Leu

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro

Asn

Phe

Glu

Tyr

Ala

Glu

180 185 190

Ala

Pro Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His

195

200

205

Thr

Phe

Thr

Arg

Gly

Ser

Pro

Gly

Arg

Ser

lle

Gly

lle

Gin

Lys

Pro

*

210

215

220

Val

Gly

His

Val

Asp

lle

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Thr

Phe

Gin

Pro

Gly

225

230

235

240

Cys

Asn

lle

Gly

Glu

Ala

lle

Arg

Val

lle

Ala

Glu

Arg

Gly

Leu

Gly

*

245

250

255

Asp

Val

Asp

Gin

Leu

Lys

Cys

Ser

His

Glu

Arg

Ser

lle

His

Leu

Phe

260

265

270

lle

Asp

Ser

Leu

Leu

Asn

Glu

Glu

Asn

Pro

Ser

Lys

Ala

Tyr

Arg

Cys

275

280

285

Ser

Ser

Lys

Glu

Ala

Phe

Glu

Lys

Gly

Leu

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

290

295

300

Asn

Arg

Cys

Asn

Asn

Leu

Gly

Tyr

Glu

Xle

Asn

Lys

Val

Arg

Ala

Lys

305

310

315

320

Arg

Ser

Ser

Lys

Met

Tyr

Leu

Lys

Thr

Arg

Ser

Gin

Met

Pro

Tyr

Lys

325

330

335

Val

Phe

His

Tyr

Gin

Val

Lys

lle

His

Phe

Ser

Gly

Thr

Glu

Ser

Glu

340

345

350

Thr

His

Thr

Asn

Gin

Ala

Phe

Glu

lle

Ser

Leu

Tyr

Gly

Thr

Val

Ala

355

360

365

Glu

Ser

Glu

Asn

lle

Pro

Phe

Thr

Leu

Pro

Glu

Val

Ser

Thr

Asn

Lys

370

375

380

Thr

Tyr

Ser

Phe

Leu

lle

Tyr

Thr

Glu

Val

Asp

lle

Gly

Glu

Leu

Leu

385

390

395

400

Met Leu Lys Leu Lys Trp Lys Ser Asp Ser Tyr Phe Ser Trp Ser Asp 405 410 415

90

• · • 4 444 444

4 4 4 4 4 ·

4 4

• 4 4 ·

• 4 4 4 • 4

« 4 4

Trp

Trp

Ser

Ser 420

Pro

Gly

Phe

Ala

Ile 425

Gin

Lys

Ile

Arg

Val 430

Lys

Ala

Gly

Glu

Thr 435

Gin

Lys

Lys

Val

Ile 440

Phe

Cys

Ser

Arg

Glu 445

Lys

Val

Ser

His

Leu 450

Gin

Lys

Gly

Lys

Ala 455

Pro

Ala

Val

Phe

Val 460

Lys

Cys

His

Asp

Lys Ser Leu Asn Lys Lys Ser Gly 465 47Q (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 499 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Met 1

Asp

Thr

Ser

Pro 5

Leu

Cys

Phe

Ser

Ile 10

Leu

Leu

Val

Leu

Cys 15

Ile

Phe

Ile

Gin

Ser 20

Ser

Ala

Leu

Gly

Gin 25

Ser

Leu

Lys

Pro

Glu 30

Pro

Phe

Gly

Arg

Arg 35

Ala

Gin

Ala

Val

Glu 40

Thr

Asn

Lys

Thr

Leu 45

His

Glu

Met

Lys

Thr 50

Arg

Phe

Leu

Leu

Phe 55

Gly

Glu

Thr

Asn

Gin 60

Gly

Cys

Gin

Ile

Arg 65

Ile

Asn

His

Pro

Asp 70

Thr

Leu

Gin

Glu

Cys 75

Gly

Phe

Asn

Ser*

Ser 80

Leu

Pro

Leu

Val

Met 85

Ile

Ile

His

cly

Trp 90

Ser

Val

Asp

Gly

Val 95

Leu

Glu

Asn

Trp

Ile 100

Trp

Gin

Met

Val

Ala 105

Ala

Leu

Lys

Ser

Gin 110

Pro

Ala

Gin Pro Val Asn Val Gly Leu Val Asp Trp Ile Thr Leu Ala His Asp

115 120 125

91 •

• · ·

•

• · » · • ·

• • •

• · · · • · · ·

« ·

Λ 9

His

Tyr

Thr

lle

Ala

Val

Arg

Asn

Thr

Arg

Leu

Val

Gly

Lys

Glu

Val

130

135

140

Ala

Ala

Leu

Leu

Arg

Trp

Leu

Glu

Glu

Ser

Val

Gin

Leu

Ser

Arg

Ser

145

150

155

160

His

Val

His

Leu

lle

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala

His

Val

Ser

Gly

Phe

165

170

175

Ala

Gly

Ser

Ser

lle

Gly

Gly

Thr

His

Lys

lle

Gly

Arg

lle

Thr

Gly

180

185

190

Leu

Asp

Ala

Ala

Gly

Pro

Leu

Phe

Glu

Gly

Ser

Ala

Pro

Ser

Asn

Arg

195

200

205

Leu

Ser

Pro

Asp

Asp

Ala

Asn

Phe

Val

Asp

Ala

lle

His

Thr

Phe

Thr

210

215

220

Arg

Glu

His

Met

Gly

Leu

Ser

Val

Gly

lle

Lys

Gin

Pro

lle

Gly

His

225

230

235

240

Tyr

Asp

Phe

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Ser

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys

His

Phe

245

250

255

Leu

Glu

Leu

Tyr

Arg

His

lle

Ala

Gin

His

Gly

Phe

Asn

Ala

lle

Thr

260

265

270

Gin

Thr

lle

Lys

Cys

Ser

His

Glu

Arg

Ser

Val

His

Leu

Phe

lle

Asp

275

280

285

Ser

Leu

Leu

His

Ala

Gly

Thr

Gin

Ser

Met

Ala

Tyr

Pro

Cys

Gly

Asp

290

295

300

Met

Asn

Ser

Phe

Ser

Gin

Gly

Leu

Cys

Leu

Ser

Cys

Lys

Lys

Gly

Arg

305

310

315

320

Cys

Asn

Thr

Leu

Gly

Tyr

His

Val

Arg

Gin

Glu

Pro

Arg

Ser

Lys

Ser

325

330

335

Lys

Arg

Leu

Phe

Leu

Val

Thr

Arg

Ala

Gin

Ser

Pro

Phe

Lys

Val

Tyr

340

345

350

His

Tyr

Gin

Leu

Lys

lle

Gin

Phe

lle

Asn

Gin

Thr

Glu

Thr

Pro

lle

355

360·

365

Gin

Thr

Thr

Phe

Thr

Met

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Lys

Glu

Lys

Met

Gin

370 375 380

Lys lle Pro lle Thr Leu Gly Lys Gly lle Ala Ser Asn Lys Thr Tyr 385 390 395 400

• • ·

• • ·

• •

• 999 9 9 9 9

• · • 9

• · •

92 :

9

•

9

► 9

• ·

• •

•

9

•

9 9

•

• ·

•

• ·

9 99 9

•

9 9

• »

99

Ser

Phe

Leu

Ile

Thr

Leu

Λ Asp

Val

Asp

Ile

Gly

Glu

Leu

Ile

Met

Ile

405

410

415

Lys

Phe

Lys

Trp

Glu

Asn

Ser

Ala

Val

Trp

Ala

Asn

Val

Trp

Asp

Thr

420

425

430

Val

Gin

Thr

Ile

Ile

Pro

Trp

Ser

Thr

Gly

Pro

Arg

His

Ser

Gly

Leu

435

440

445

Val

Leu

Lys

Thr

Ile

Arg

Val

Lys

Ala

Gly

Glu

Thr

Gin

Gin

Arg

Met

450

455

460

Thr

Phe

Cys

Ser

Glu

Asn

Thr

Asp

Asp

Leu

Leu

Leu

Arg

Pro

Thr

Gin

465

470

475

480

Glu

Lys

Ile

Phe

Val

Lys

Cys

Glu

Ile

Lys

Ser

Lys

Thr

Ser

Lys

Arg

485

490

495

Lys Ile Arg (2) Informace pro SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 465 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

Met 1

Leu

Pro

Leu

Trp 5

Thr

Leu

Ser

Leu

Leu 10

Leu

Gly

Ala

Val

Ala 15

Gly

Lys

Glu

Val

Cys 20

Tyr

Glu

Arg

Leu

Gly 25

Cys

Phe

Ser

Asp

Asp 30

Ser

Pro

Trp

Ser

Gly 35

Ile

Thr

Glu

Arg

Pro 40

Leu

His

Ile

Leu

Pro 45

Trp

Ser

Pro

Lys

Asp 50

Val

Asn

Thr

Arg

Phe 55

Leu

Leu

Tyr

Thr

Asn 60

Glu

Asn

Pro

Asn

Asn 65

Phe

Gin

Glu

Val

Ala 70

Ala

Asp

Ser

Ser

Ser 75

Ile

Ser

Gly

Ser

Asn 80

Phe

Lys

Thr

Asn

Arg 85

Lys

Thr

Arg

Phe

Ile 90

Ile

His

Gly

Phe

Ile 95

Asp

Lys

Gly

Glu

Glu 100

Asn

Trp

Leu

Ala

Asn 105

Val

Cys

Lys

Asn

Leu 110

Phe

Lys

Val

Glu

Ser

Val

Asn

Cys

Ile

Cys

Val

Asp

Trp

Lys

Gly

Gly

Ser

Arg

115 120 125

Thr Gly Tyr Thr Gin Ala Ser Gin Asn Ile Arg Ile Val Gly Ala Glu

130 135 140 ·· *· * · · · • · · · • · · 4 • 4 4 4

Val Ala Tyr Phe Val Glu Phe Leu Gin Ser Ala Phe Gly Tyr Ser Pro

145

150

155

160

Ser

Asn

Val

His

Val

Ile

Gly

His

Ser

Leu

Gly

Ala

His

Ala

Ala

Gly

165

170

175

Glu

Ala

Gly

Arg

Arg

Thr

Asn

Gly

Thr

Ile

Gly

Arg

Ile

Thr

Gly

Leu

180

185

190

Asp

Pro

Ala

Glu

Pro

Cys

Phe

Gin

Gly

Thr

Pro

Glu

Leu

Val

Arg

Leu

195

200

205

Asp

Pro

Ser

Asp

Ala

Lys

Phe

Val

Asp

Val

Ile

His

Thr

Asp

Gly

Ala

210

215

220

Pro

Ile

Val

Pro

Asn

Leu

Gly

Phe

Gly

Met

Ser

Gin

Val

Val

Gly

His

225

230

235

240

Leu

Asp

Phe

Phe

Pro

Asn

Gly

Gly

Val

Glu

Met

Pro

Gly

Cys

Lys

Lys

245

250

255

Asn

Ile

Leu

Ser

Gin

Ile

Val

Asp

Ile

Asp

Gly

Ile

Trp

Glu

Gly

Thr

260

265

270

Arg

Asp

Phe

Ala

Ala

Cys

Asn

His

Leu

Arg

Ser

Tyr

Lys

Tyr

Tyr

Thr

275

280

285

Asp

Ser

Ile

Val

Asn

Pro

Asp

Gly

Phe

Ala

Gly

Phe

Pro

Cys

Ala

Ser

290

295

300

Tyr

Asn

Val

Phe

Thr

Ala

Asn

Lys

Cys

Phe

Pro

Cys

Pro

Ser

Gly

Gly

305

310

315

320

Cys

Pro

Gin

Met

Gly

His

Tyr

Ala'

Asp

Arg

Tyr

Pro

Gly

Lys

Thr

Asn

325

330

335

Asp

Val

Gly

Gin

Lys

Phe

Tyr

Leu

Asp

Thr

Gly

Asp

Ala

Ser

Asn

Phe

340

345

350

Ala

Arg

Trp

Arg

Tyr

Lys

Val

Ser

Val

Thr

Leu

Ser

Gly

Lys

Lys

Val

355

360

365

Thr

Gly

His

Ile

Leu

Val

Ser

Leu

Phe' Gly

Asn

Lys

Gly

Asn

Ser

Lys

370

375

380

Gin

Tyr

Glu

Ile

Phe

Lys

Gly

Thr

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Thr

His

Ser

385

390

395

400

Asn

Glu

Phe

Asp

Ser

Asp

Val

Asp

Val

Gly

Asp

Leu

Gin

Met

Val

Lys

405

410

415

Phe Ile Trp Tyr Asn Asn Val Ile Asn Pro Thr Leu Pro Arg Val Gly

• 9

• ·

•

•

• ·

• 9

9

•

•

•

• 9

9

9 9

9

94.Í.

• • · 9

• • ·

9 9 9

•

9 9 9 9 9 9 9

420

425

430

Ala

Ser

Lys 435

Ile

Ile

Val

Glu

Thr 440

Asn Val

Gly

Lys

Gin •445

Phe

Asn

Phe

Cys

Ser 450

Pro

Glu

Thr

Val

Arg 455

Glu

Glu Val

Leu

Leu 460

Thr

Leu

Thr

Pro

cys

465 (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr 1.5 io ₁₅

Cys (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 13 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) PÓ^ís: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

TTTTTTTTTT TGA • φ φφφφφφ φφ φφ ·· ·· φφ φ φφφφ • · φφφ φφφφ • ΦΦΦΦΦ ΦΦΦΦΦ • φ φφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φ φφ Φ· (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 10 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

GATCAATCGC 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 23 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

TAGGACATGC ACAGTGTAAT CTG (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

GATTGTGCTG GCCACTTCTC ·· ···« (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 19 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

GACACTCCAG GGACTGAAG (2) Informace pro SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 48 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná baze (B) Umístění: 36 (D) Jiné informace /mod_baze = i (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná baze (B) Umístění: 37 (D) Jiné informace /mod_baze = i (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná baze (B) Umístění: 41 (D) Jiné informace /mod_baze = i (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná baze (B) Umístění: 42 (D) Jiné informace /mod_baze = i (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná baze (B) Umístění: 46 (D) Jiné informace /mod_baze = i

49 ► · 4 « » 9 4 a (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná baze (B) Umístění: 47 (D) Jiné informace /mod_baze = i (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGNNGGG NNGGGNNG 48 (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 28 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

CACACACAGG CCACGCGTCG ACTAGTAC 28 (2) Informace pro SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

ACCACCATGG AGAGCAAAGC CCTG 24 (2) Informace pro SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ** ·««· • · · · • · · • · · fc • · · ··· ·· ·· ·· • fcfcfcfc fc · · · · • fcfc fcfc · • · « · · • fcfc ·· (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

CCAGTTTCAG .CCTGACTTCT TATTC (2) Informace pro SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

GGCTGTGGAC TCAACGATGT C (2) Informace pro SEQ ID NO: 27:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 22 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27: CCGGGTGGGT AGGTACATTT TG (2) Informace pro SEQ ID NO: 28:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:

GGGGGTGACT TCCAGCCAGG CTGTG

• ··· ···· • · · · · · «· ·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 29:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

AACTCTGAAA GGCATGCCTG CCCGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 30:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 26 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:

TGAAGGTCGG AGTCAACGGA TTTGGT (2) Informace pro SEQ ID NO: 31:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = Oligonukleotid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:

CATGTGGGCC ATGAGGTCCA CCAC

Claims (5)

faterxto-vě rx cá. xr o (ki y

1. Izolovaný polypeptid kódovaný genem podobným genu pro lipasu, kde uvedený polypeptid:

(a) se váže na heparin, (b) má homologii s lidskou lipoproteinovou lipasou a jaterní lipasou, a (c) obsahuje 39 kD katalytickou doménu triacylglycerol-lipasové rodiny.

2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde 39 kD katalytická doména triacylglycerol-lipasové rodiny má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10.

3. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8a molekulovou hmotnost přibližně 55 kD na 10% SDS-PAGE gelu.

4 4 ·4 ··«· ·· ·· • 4 · 4 ·· · 4444 • 4 444 4 · « · • 444 44 44 *4 · • * 4 4 · 4444 ··« 4·4 44 · ·· ·· downstream primer 7 pro diferenciální zobrazení:(SEQ ID N0:17)

A.

5 ’TTTTTTTTTTTGA3 ’ _β upstream primer 15 pro diferenciální zobrazení:(SEQ ID NO:18) 5'GATCAATCGC3’

C. 5’RACE Primer 2a: (SEQ ID NO: 19)

5’TAGGACATGCACAGTGTAATCTG3’

D. 5’RACE Primer 3a: (SEQ ID NO: 20)

5’GATTGTGCTGGCCACTTCTC3’

E. 5’RACE Primer 4a: (SEQ ID NO: 21)

5OACACTCCAGGGACTGAAG3’

p. 5'RACE kotvící primer (SEQ ID NO: 22)

5’CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG3’

G. 5'RACE universální amplifikační primer (SEQ ID NO: 23) 5’CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC3’

H. 5’LPL Primer: (SEQ ID NO: 24)

5’ ACCACCATGGAGAGCAAAGCCCTG3’

-start kodon lidské kódující sekvence pro LPL je podtržen

I. 3’LPL Primer: (SEQ ID NO: 25)

5’ CCAGTTTCAGCCTGACTTCTTATTC3’

-komplement k terminačnímu kodonu kódující sekvence pro LPL je podtrže

J. Primer DLIP774: (SEQ ID NO: 26)

5’GGCTGTGGACTCAACGÁTGTC3’

K. Primer LLGgen2a: (SEQ ID NO: 27)

4. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8a molekulovou hmotnost přibližně 68 kD na 10% SDS-PAGE gelu.

5. Izolovaný polypeptid podle nároků 1-4, kde polypeptid má aktivitu fosfolipasy A.

6. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6a molekulovou hmotnost přibližně 40 kD na 10% SDS-PAGE gelu.

7. Izolovaný polypeptid podle nároků 1-6, kde polypeptid je lidského původu.

8. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje

101 polypeptid podle nároků 1-7 a biologicky kompatibilní roztok.

9. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároků 1-7 a farmaceuticky přijatelný nosič.

10. Antigenní fragment izolovaného polypeptidu podle nároků 1-7.

11. Izolovaná nukleová kyselina kódující polypeptid podle nároků 1-7.

12. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 11, která je cDNA.

13. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 12, jejíž nukleotidová sekvence je vybrána ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 5, 7 a 9.

14. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 13 obsahující nukleotidy 252 - 1754 SEQ ID NO: 7.

15. Izolovaná nukleová kyselina, která hybridizuje za podmínek vysoké přísnosti na nukleovou kyselinu mající sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 3, 5 a 7.

16. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 15, která obsahuje 20 nukleotidů.

17. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 15, která je protismyslná nukleová kyselina.

18. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 17, kde je protismyslná nukleová kyselina operativně navázána na regulační region pro genovou expresi.

• · ···· · · ·« • · · · · · · • · · · · · ·

102

19. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 15, která hybridizuje za podmínek vysoké přísnosti na cílovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z nukleotidů 44-79 SEQ ID NO: 3 a nukleotidů 1036-1065 SEQ ID NO: 5.

20. Prostředek vyznačuj ící se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 17 a biologicky kompatibilní roztok.

21. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároků 17 a farmaceuticky přijatelný nosič.

22. Vektor obsahující izolovanou nukleovou kyselinu podle nároků 11-14 operativně navázanou na regulační region.

23. Vektor podle nároku 22, kde regulační region je z heterologního zdroje.

24. Vektor podle nároku 22 nebo 23, kterým je virový vektor.

25. Vektor podle nároku 24, kterým je adenovirový vektor.

26. Rekombinantní buňka obsahující vektor podle nároků 22-25.

27. Rekombinantní buňka podle nároku 26, kde buňka je eukaryotická buňka.

28. Rekombinantní buňka podle nároku 27, kde buňka je COS-7 buňka.

29. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároků 22-25 a biologicky kompatibilní roztok.

103

30. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, še obsahuje vektor podle nároků 22-25 a farmaceuticky přijatelný nosič.

31. Způsob výroby polypeptidu vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci rekombinantních buněk podle nároku 26-28 za podmínek umožňujících expresi polypeptidu.

32. Polypeptid připravený způsobem podle nároku 31.

33. Protilátka schopná specifické vazby na polypeptid podle nároků 1-7 nebo 3 2.

34. Protilátka schopná specifické vazby na polypeptid podle nároku 5 a neutralizující fosfolipasovou aktivitu polypeptidu.

35. Protilátka podle nároků 33 nebo 34, která je monoklonální protilátka.

36. Protilátka podle nároků 33 nebo 34, která je polyklonální protilátka.

37. Hýbridomní buňka, která produkuje protilátku podle nároku 35.

38. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároků 33-36 a biologicky kompatibilní roztok.

39. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároků 33-36 a farmaceuticky přijatelný nosič.

40. Způsob pro vyšetřování agonistů a antagonistů aktivity LLG vyznačující se tím, že obsahuje:

104 (a) kontaktování potenciálních agonistů a antagonistů s LLG a substrátem LLG, a (b) měření schopnosti potenciálních agonistů a antagonistů potencovat nebo inhibovat aktivitu LLG, kde LLG je polypeptid podle nároku 1.

41. Způsob pro enzymatickou hydrolýzu fosfatidylcholinesteru vyznačující se tím, že obsahuje kontaktování uvedeného fsfatidylcholinesteru s polypeptidem podle nároků 1-5.

42. Způsob pro zlepšení sérového lipidové profilu u lidí a jiných živočichů majících nežádoucí lipidový profil vyznačuj ící se t i m, že obsahuje podání účinného množství farmaceutického prostředku podle nároků 9 nebo 21.

43. Způsob pro zlepšení sérového lipidové profilu u lidí a jiných živočichů majících nežádoucí lipidový profil vyznačuj ící se t i m, že obsahuje podání účinného množství farmaceutického prostředku podle nároku 39.

44. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid je králičího původu.

45. Izolovaný polypeptid podle nároku 45, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12.

46. Izolovaná nukleová kyselina kódující polypeptid podle nároku 45.

47. Nukleová kyselina podle nároku 47 mající nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 11.

49. Transgenní myš exprivující polypeptid podle nároků 1-5.

Obr. 1

5’CCGGGTGGGTAGGTACATTTTG3’

L. Hllg-gspl primer: 5’ GGG GGT GAC TTC CAG CCA GGC TGT G 3’ (nukleotidy 772-796 na obr. 4, SEQ ID NO: 28)

Hllg-gsp2a primer: 5’ AAC TCT GAA AGG CAT GCC TGC CCG G 3’ (reversní komplement k nukleotidům 1053-1077 na obr.4,SEQ ID NO:29)

G3PDH 5’ primer: 5’ TGA AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG GT 3’ (SEQ ID NO: 30)

G3PDH 3’ primer: 5’ CAT GTG GGC CÁT GAG GTC CAC CAC 3’ (SEQ ID NO: 31)