FR2734826A1 - Deltap62, ses variants, sequences nucleiques et leurs utilisations - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne un nouveau polypeptide désigné DELTAP62, ses variants, les séquences nucléiques correspondantes, et leurs utilisations, notamment en thérapie génique anti-cancéreuse.

Description

AP62. SES VARIANTS. SEQUENCES NUCLEIQUES ET LEURS
UTILISATIONS
La présente invention concerne un nouveau polypeptide désigné P62, ses variants, les séquences nucléiques correspondantes, et leurs utilisations thérapeutiques, notamment en thérapie génique anti-cancéreuse.
Différents gènes, appelés oncogènes et gènes suppresseurs, sont impliqués dans le contrôle de la division cellulaire. Parmi ceuxci, les gènes ras, et leurs produits généralement désignés protéines p21, jouent un rôle clé dans le contrôle de la prolifération cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés.
Notamment, il a été montré que certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogéniques. Ainsi, un grand nombre de tumeurs humaines a été associé à la présence de gènes ras modifiés. De même, une surexpression de ces protéines p21 peut conduire à un dérèglement de la prolifération cellulaire. La compréhension du rôle exact de ces protéines p21 dans les cellules, de leur mode de fonctionnement et de leurs caractéristiques constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension et l'approche thérapeutique de la cancérogénèse.
In vivo, on ne connait pas la nature précise des évènements responsables de la transduction du signal initié par les protéines p21.
Cependant, un nombre croissant de résultats souligne la multiplicité des effecteurs qui interagissent directement et préférentiellement avec la forme active (liée au GTP) des protéines ras. Parmi ces effecteurs, la protéine GAP a été la première dont l'implication dans la transduction du signal a été documentée. II s'agit d'une protéine cytosolique présente chez tous les organismes eucaryotes qui possède la faculté d'accélérer fortement l'hydrolyse du GTP, lié à la protéine normale. Elle possède deux domaines assurant des fonctions distinctes. Son extrémité carboxy-terminale porte l'activité catalytique qui interagit avec les protéines p21 et qui augmente leur activité GTPase.A son autre extrémité, en aval de la partie Nterminale, se trouve une juxtaposition de domaines SH2 et SH3 qui participent à la transduction du message et interagissent avec d'autres protéines. Parmi ces protéines se trouvent deux protéines, p62 et p190, respectivement de 62kDa et 190 kDa qui sont fortement phosphorylées en tyrosine. Ces deux protéines forment un complexe spécifique avec GAP et sont immunoprécipitées par des anticorps dirigés contre différents épitopes de GAP. On sait en particulier que c'est au niveau des domaines SH2 de GAP que se font les interactions de p62 avec GAP. Les acides aminés 271 à 443 de p62 contiennent des tyrosines phosphorylées et semblent impliqués dans ces interactions. Ces mêmes phosphorylations semblent par ailleurs participer à des interactions entre p62 et l'adaptateur GRB2.D'autre part, tout au long de la séquence de p62, sont répartis des sites consensus riches en prolines qui participent à la liaison aux domaines SH3 des tyrosines kinases de la famille src ainsi que de la phospholipase C.
La protéine p62 a été identifiée par Wong et al. (Cell 69 (1992) 551). Elle comporte 443 acides aminés, dont la séquence a été décrite dans la littérature (voir SEQ ID n" 1).
En plus des caractéristiques mentionnées ci-dessus, la protéine p62 présente plusieurs caractéristiques propres aux hnRNP ("heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein")
- elle est riche en glycines
- elle possède des régions riches en arginines
- de plus, ses acides aminés 145 à 247 définissent une région de forte homologie avec une hnRNP précédemment décrite, la
GRP33. Cette région contient un site consensus de liaison aux ARNs homologue à celui contenu dans la hnRNP K.Ce site consensus est désigné KH domaine (KH = hnRNPK Plomolog). Les résidus conservés sont essentiels à la liaison aux ARNs et l'impact de la non intégrité de ce domaine dans une pathologie a été montré pour FMR1 qui est le produit du gène associé au retard mental qui est observé dans le syndrome du X-fragile (Siomi et al., Cell 77 (1994) 33).
La présente invention réside notamment dans la démonstration de l'importance de la protéine p62 dans la prolifération et la mort cellulaires. Elle découle plus particulièrement de la mise en évidence que des dérivés de p62 sont capables d'interférer dans le processus de transformation cellulaire, et notamment d'inhiber les signaux transduits par les protéines ras. Elle découle en outre de la démonstration particulièrement surprenante que ces dérivés sont également doués de propriétés apoptotiques, et donc capables d'induire la mort cellulaire.
Un premier objet de l'invention concerne donc tout dérivé de p62 capable d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une protéine
GAP et p62. Préférentiellement, les dérivés selon l'invention sont capables d'inhiber au moins en partie le pouvoir oncogène des protéines ras.
Encore plus préférentiellement, les dérivés selon l'invention sont capables d'induire la mort cellulaire par apoptose. Les dérivés selon l'invention sont également caractérisés par la perte de la capacité à interagir avec l'ARN des62.
La présente invention décrit en particulier la mise en évidence, le clonage et la caractérisation d'une isoforme naturelle de la protéine p62. Cette isoforme, désignée p62, présente une délétion dans la zone d'homologie à la protéine GRP33, qui recouvre le domaine KH.
En raison de cette délétion, hop62 ne possède pas l'intégralité des propriétés de p62. Ainsi, ap62 possède un domaine d'interaction avec GAP et GRB2 intact ainsi que les différentes séquences riches en prolines partenaires de SH3 (Figure 1). Cependant, ap62 n'est plus capable d'interagir avec les acides nucléiques en raison de la délétion du domaine d'homologie à la protéine GRP33.La demanderesse a également montré que le transfert de I'ADNc de Ap62 dans différents modèles cellulaires normaux ou tumoraux s'oppose à la coopération entre p62 et Ras et inhibe les signaux transduits par les protéines Ras normales et oncogéniques
Surexprimée, la hop62 interfère donc avec les processus de prolifération et de différenciation et aboutit, dans les différents modèles cellulaires, à la mort cellulaire par apoptose.
Selon un mode préféré, l'invention concerne plus particulièrement tout dérivé de p62 portant au moins une délétion dans la zone d'homologie à la protéine GRP33. Plus particulièrement, les dérivés selon l'invention comportent au moins une délétion dans la région comprise entre les résidus 145 à 247 de la protéine p62 telle que représentée sur la séquence SEQ ID n" 1, et qui recouvre le domaine KH. La délétion porte avantageusement sur plus de 10 acides aminés et, plus préférentiellement, sur plus de 30 acides aminés. Elle peut concerner un ou plusieurs sites à l'intérieur de cette région, dès lors que le dérivé résultant présente les propriétés décrites ci-avant.
D'une manière particulièrement avantageuse, le dérivé selon l'invention est un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence
SEQ ID n" 2 ou d'un variant de celle-ci. Le terme variant au sens de l'invention désigné tout polypeptide dont la structure se distingue de la séquence SEQ ID n" 2 par une ou plusieurs modifications de nature génétique, biochimique et/ou chimique. II peut s'agir en particulier de toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus.De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son site d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases ou d'améliorer son passage à travers les membranes cellulaires, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Avantageusement, les variants comprennent des délétions ou des mutations portant sur des acides aminés dont la présence n'est pas déterminante à l'activité du dérivé. De tels acides aminés peuvent être identifiés par exemple par des tests d'activité cellulaire comme décrit dans les exemples.
D'une manière particulièrement préférée, les dérivés de l'invention retiennent au moins une partie de la protéine p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP. Cette partie de p62 est plus particulièrement constituée de tyrosines phosphorylées, localiées entre les résidus 200 à 450 de la protéine p62 (Cf SEQ ID n" 1). Un dérivé préféré selon l'invention comprend donc au moins (i) une délétion dans la région comprise entre les résidus 145 à 247 de p62 et (ii) une partie de p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP. Plus préférentiellement, la délétion porte sur les résidus 1 à 202.
A cet égard, la demanderesse a également montré que des dérivés selon l'invention présentant des propriétés particulièrement intéressantes peuvent être constitués de polypeptides comprenant essentiellement la région portant les tyrosines phosphorylées de p62.
Un exemple particulièrement préféré de polypeptide selon l'invention est représenté par le polypeptide top62 de séquence SEQ ID n"2, possédant une délétion des résidus 170-208 de la séquence de p62.
Un autre exemple est représenté par le polypeptide p62-C comprenant les résidus 203 à 443 de p62 (séquence SEQ ID n" 3).
Les résultats présentés dans la présente demande montrent notamment que Ap62 peut rentrer en compétition avec p62 vis à vis de GAP. GAP étant l'un des effecteurs des protéines Ras, ap62 bloque les voies mitogènes qui en dépendent. Surexprimée par transfert de gène (transfection, infection, microinjection, etc) ap62 induit la mort cellulaire par apoptose dans des cellules normales (fibroblastes NIH3T3 et Swiss 3T3) ou tumorales (H460;HCT116) .
Ce même effet est obtenu avec le dérivé p62-C (comprenant essentiellement la partie C-terminale de au62, qui recouvre la région comprise entre les acides aminés 203 et 443 et qui correspond au domaine d'interaction avec les domaines SH2 de GAP et de GRB2).
Cette partie C-terminale contient également trois des sites d'interaction avec les domaines SH3, ceux ayant le plus d'affinité pour Fyn. L'activité thérapeutique importante des dérivés selon l'invention est liée à leur propriétés multiples, et notamment leur pouvoir de titration des domaines SH3 des protéines de la famille src (exemple : fyn), leur capacité d'inhibition du recrutement de GRB2 en titrant son domaine SH2, et leur capacité d'inhibition de la fonction effectrice de la protéine GAP pour les voies de signalisation qui dépendent de Ras.
Un autre objet de la présente invention concerne tout acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini ci-avant.
L'acide nucléique selon l'invention peut être un acide ribonucléique (ARN) ou désoxyribonucléique (ADN). En outre, il peut s'agir d'un ADN génomique (ADNg) ou complémentaire (ADNc). II peut être d'origine humaine, animale, virale, synthétique ou semi-synthétique. II peut être obtenu de différentes manières et notamment par synthèse chimique en utilisant les séquences présentées dans la demande et par exemple un synthétiseur d'acides nucléiques. II peut également être obtenu par criblage de banques au moyen de sondes spécifiques, notamment telles que décrites dans la demande (voir séquences SEQ ID n" 6 et 7 par exemple). II peut encore être obtenu par des techniques mixtes incluant la modification chimique (élongation, délétion, substitution, etc) de séquences criblées à partir de banques. D'une manière générale, les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
Préférentiellement, I'acide nucléique selon l'invention est un ADNc ou un ARN.
L'acide nucléique selon l'invention est avantageusement choisi parmi:
(a) tout ou partie de la séquence SEQ ID n" 2 ou SEQ ID n" 3 ou de leur brin complémentaire,
(b) toute séquence hybridant avec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon l'invention,
(c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
Comme indiqué précédemment, la demanderesse a maintenant isolé et caractérisé de nouvelles séquences d'acide nucléique codant pour des polypeptides dérivés de p62, ayant des propriétés antiprolifératives et apoptotiques tout à fait remarquables. Ces acides nucléiques peuvent maintenant être utilisés comme agents thérapeutiques pour produire dans les cellules des dérivés selon l'invention capables de détruire ou de corriger des dysfonctionnements cellulaires. A cet effet, la présente invention concerne également toute cassette d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription. Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules mammifères, de préférence humaines. Plus préférentiellement, il s'agit d'un promoteur permettant l'expression d'un acide nucléoique dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés. II peut s'agir par exemple du propre promoteur du gène p62. II peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). II peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux.
Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAl, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, a-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinolque, etc).De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc.
En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissuspécifique ou majoritaire.
La présente invention fournit maintenant de nouveaux agents thérapeutiques permettant, par leurs propriétés antiprolifératives et/ou apoptotiques d'interférer avec de nombreux dysfonctionnements cellulaires. Dans ce but, les acides nucléiques ou cassettes selon l'invention peuvent être injectés tels quels au niveau du site à traiter, ou incubés directement avec les cellules à détruire ou traiter. II a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier. Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) l'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires.
Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré de la présente invention l'acide nucléique ou la cassette est incorporé dans un vecteur. Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique (liposome, nanoparticule, complexe peptidique, lipides ou polymères cationiques, etc) virale (rétrovirus, Adénovirus, virus de l'herpès, AAV, virus de la vaccine, etc) ou plasmidique.
L'utilisation de vecteurs viraux repose sur les propriétés naturelles de transfection des virus. II est ainsi possible d'utiliser par exemple les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus et les virus adéno associés.
Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection. A cet égard, un objet préféré selon l'invention réside dans un rétrovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant. Un autre objet particulier de l'invention réside dans un adénovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant.
Le vecteur selon l'invention peut également être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques, synthétiques ou naturels, représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques.
L'acide nucléique ou le vecteur utilisé dans la présente invention peut être formulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, I'acide nucléique ou le vecteur est utilisé sous une forme injectable. II peut donc être mélangé à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. II peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.Une injection directe de l'acide nucléique dans la tumeur du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique
Elle concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur tel que défini ci-avant.
Elle concerne aussi toute composition pharmaceutique comprenant au moins un dérivé de p62 tel que défini ci-avant.
En raison de leurs propriétés antiprolifératives, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le traitement des désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la resténose. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour la destruction de cellules, notamment de cellules hyperprolifératives. Elle peut être utilisée in vitro ou ex vivo. Ex vivo, elle consiste essentiellement à incuber les cellules en présence d'un ou plusieurs acides nucléiques (ou d'un vecteur, ou cassette ou directement du dérivé). In vivo, elle consiste à administrer à l'organisme une quantité active d'un vecteur (ou d'une cassette) selon l'invention, de préférence directement au niveau du site à traiter (tumeur notamment).A cet égard, I'invention a également pour objet une méthode de destruction de cellules hyperprolifératives comprenant la mise en contact desdites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec un acide nucléique tel que défini ci-avant.
La présente invention est avantageusement utilisée in vivo pour la destruction de cellules en hyperprolifération (i.e. en prolifération anormale). Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules de muscle lisse de la paroi vasculaire (resténose). Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers dans lesquels un oncogène activé est impliqué. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloides, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la peau, du pancréas ou encore les cancers du rein et de la prostate, etc.
Par ailleurs, I'invention concerne également les séquences antisens, dont l'expression dans une cellule cible permet de contrôler la transcription et/ou la traduction d'ARNm cellulaires codant pour p62 ou Au62. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires des ARNm cellulaires hop62 ou p62 et bloquer ainsi leur traduction en protéine selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléiques SEQ ID n" 1, 2 ou 3, transcrites dans l'orientation inverse.
La présente invention concerne également l'utilisation de tout composé capable d'induire l'expression ou la surexpression de Ap62 dans une cellule pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des désordres hyperprolifératifs.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légendes des figures Figure 1 : Représentation schématique des domaines structuraux de p62 et au62.
Figure 2: Effet de p62 et hop62 sur la transactivation par les protéines ras d'un RRE dérivé de l'enhancer du virus du polyôme.
Figure : Mise en évidence de la mort cellulaire induite par top62 dans les fibroblastes NIH3T3.
Figure : Mise en évidence de l'expression de Ap62 dans des fibroblastes embryonnaires traités par différents agents cytotoxiques et par déprivation de sérum.
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium,
I'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans
Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al.
(eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NewYork, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série
M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de I'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de
Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant.
La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par
Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Elolymérase-catalyzed Çhain Rection, Saiki R.K. et al., Science XQ (1985) 1350-1354; Mullis
K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycles" (Perkin Ex mer Cetus) selon les spécifications du fabricant.La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par
Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1: Isolement de l'ADN complémentaire de Au62.
L'ADN complémentaire de Ap62 a été isolé par PCR sur une population d'ADN complémentaire synthétisé à partir d' ARN poly A+ extraits de placenta humain. 1Cig d'ADN a été utilisé conjointement aux amorces dérivées de la séquence de p62 et qui recouvrent les acides aminés 123 à 131 d'une part (oligo 5') et 437 à 443 d'autre part (oligo 3').
Les séquences de ces amorces sont les suivantes:
oligo 5': CAGCTGCTGACGGCAGAAATTGAG (SEQ ID nO 4)
oligo 3': TTAATAACGTCCATATGGGTGCTC (SEQ ID n0 5)
Les réactions ont été menées à 550C et ont donné deux produits séparés par électrophorèse sur gel d'agarose:
- une bande de 98Î paires de bases, qui correspond au produit de PCR de p62
- une bande de 870 paires de bases, qui correspond au produit de PCR de ap62.
Cette dernière bande a été clonée et sa séquence correspond exactement à la séquence de p62, exception faite d'une délétion de 117 paires de bases dans le domaine d'homologie à la GRP33. La séquence complète de Ap62 est présentée SEQ ID n" 2 (voir aussi figure 1).
L' existence de cette isoforme de p62 a été confirmée par criblage d'une banque d'ADN complémentaire de placenta humain établie dans le vecteur Agt 11. L'oligonucléotide utilisé pour ce criblage est un 24-mer correspondant à la jonction spécifique de la délétion présente dans au62. La séquence de cet oligonucléotide est
CAGTATCCCAAGGAGGAAGAGCTG (SEQ ID n" 6)
Exemple 2 : Construction de vecteurs d'expression de Ap62 et p62-C.
Cet exemple décrit la construction de vecteurs utilisable pour le transfert des acides nucléiques de l'invention in vitro ou in vivo.
2.1. Vecteur plasmidique:
Pour la construction de vecteurs plasmidiques, 2 types de vecteurs ont été utilisés.
- Le vecteur SV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Ce vecteur est un vecteur d'expression eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les variants p62-C et Ap62 ont été insérés dans ce vecteur sous forme de fragments EcoRI. Ils sont ainsi placés sous le controle du promoteur de l'enhancer du virus SV40.
- Le vecteur pcDNA3 (Invitrogen). II s'agit également d'un vecteur d'expression eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les variants p62-C et hop62, été insérés dans ce vecteur sous forme de fragments EcoRI, sont ainsi placés sous le controle du promoteur précoce du CMV.
2.2. Vecteur Viral
Selon un mode particulier, l'invention réside dans la construction et l'utilisation de vecteurs viraux permettant le transfert et l'expression in vivo des acides nucléiques tels que définis ci-avant.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Maul, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et un acide nucléique selon l'invention. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle.
Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, I'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4.Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et l'acide nucléique de l'invention (Ct FR94 13355).
Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen.Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n" WO 94/26914 et W095/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à
ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. II comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus.Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment
WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528).
Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt.
Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant une séquence nucléique de l'invention d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Une lignée cellulaire utilisable est par exemple la lignée 293. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242,
EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick,
BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env).
Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné
MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention comportant un acide nucléique selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ledit acide nucléique est construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env.De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée
GP+envAm-12 (W089/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes dans les cellules tumorales.
2.3. Vecteur chimique
Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyéthylène immine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire.
Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA,
DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucléaire. En outre, le concept de la transfection ciblée a été développé, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser I'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit.La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants.
Exemple 3 : Inhibition de la transactivation de R.R.E(ras responsive elements) due aux formes oncogéniques de Ras (Figure 2)
Des fibroblastes NIH 3T3 ont été transfectés par un gène rapporteur, celui de la chloramphénicol acétyl transférase, placé sous le contrôle d'éléments de réponse à Ras dérivés de l'enhancer du virus du polyôme. Ces éléments sont stimulés de 15 à 20 fois lorsque les cellules sont cotransfectées par un vecteur d'expression portant
I'ADNc de 'oncogène Middle T(MT) de SV40. Cette stimulation n'est que peu affectée lorsqu'une cotransfection apporte les vecteurs d'expression de p62-C et de Ap62 (Cf exemple 2).Lorsque la cotransfection est réalisée, non plus avec MT mais avec la forme activée de I'oncogène Ha-ras (Val 12),1'activité CAT est stimulée de 30 à 40 fois au dessus du niveau de base. L'expression de la p62 affecte peu cette stimulation alors que p62-C et hp62 inhibent presque totalement toute activité due au Ras oncogénique.
Ces expériences ont été réalisées avec 0,59 de vecteur permettant l'expression de MT ou de Ras VAL12 et 4pg de vecteur d'expression portant l'ADNc de p62-C ou de hop62. Elles démontrent clairement le pouvoir des protéines de l'invention de s'opposer aux signaux ras oncogéniques.
Exemple 4. Mise en evidence de la mort cellulaire Induite par Ap62 dans les fibroblastes NIH3T3 (Figure 3).
Des fibroblastes NIH3T3 ont été transfectées avec une efficacité de 60% par 59 de vecteur d'expression de Ap62 (exemple 2).
24 heures après la transfection, les cellules présentent une altération importante de leur viabilité par rapport au témoin. L'analyse de leur ADN révèle après migration sur gel d'agarose des échelles de dégradation caractéristiques des phénomènes d'apoptose. Les mêmes phénomènes sont observés lorsque p62-C est transfectée dans les mêmes conditions que #p62.
Exemple 5 : Mise en évidence de l'expression de lad62 dans des fibroblastes embryonnaires traités par différents agents cytotoxiques et par déprivation de sérum (Figure 4).
Des fibroblastes embryonnaires de souris ont été mis en culture (1), traités par 0,Spg d'acide okadaique (2), traités par 1 OngimI de PMA et par 2pg de ionomycine (3), soumis à 1M de staurosporine (4) ou à 2pg/ml de camptotécine (5) et enfin déprivés en sérum.
L'expression des ARN messagers de p62 et de Ap62 dans ces fibroblastes et au cours de ces différents traitements a été analysée.
A chaque traitement, trois points ont été analysés. Ces points correspondent à trois temps de traitement: 6, 12 et 24 heures.
Sonde 5' spécifique de Ap62 (SEQ ID n 7): CTGTCAAGCAGTATCCCAAGGAGG
Sonde 5' spécifique de p62 (SEQ ID n 8): AAGGGCTCAATGAGAGACAAAGCC
Sonde 3'commun à p62 et à Ap62 (SEQ ID n 9):
GTATG TATCATCATATCCATATTC
Dans les fibroblastes mis en culture en présence de 10% de sérum de veau foetal (SVF), I'ARNm de p62 est mis en évidence alors que l'ARNm de Ap62 n'est pas détecté même après 24h de mise en culture. La situation est la même au cours du traitement par l'acide okadaique. En revanche, une forte induction de I'ARNm de Ap62 est observée après 6 à 12 heures de traitement par le PMA et la ionomycine.Cet ARNm est aussi détectable après addition de staurosporine et est très fortement induit après 12 heures de traitement à la camptotécine. Lorsque les fibroblastes embryonnaires sont déprivés en sérum, une forte induction de Ap62 est observée en même temps qu'une disparition du messager de p62.
Ces résultats démontrent donc que l'expression de l'ARNm de Ap62 est induite au cours de certaines situations apoptotiques dans les fibroblastes.
LISTE DE SEQUENCES SEQ ID n 1: Séquences nucléotidique et peptidique de p62 1/1 31/11
ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC GCG CGC ATG AGC CGC TCT TCG GGC CGT AGC GGC TCC
Met gln arg arg asp asp pro ala ala arg met ser arg ser ser gly arg ser gly ser 61/21 91/31
ATG GAC CCC TCC GGT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTC met asp pro ser gly ala his pro ser val arg gln thr pro ser arg gln pro pro leu 121/41 151/51
CCT CAC CGG TCC CGG GGA GCC GGA GGC GGA TCC CGC GGG GGC GCC CGC GCC TCG CCC GCC pro his arg ser arg gly gly gly gly gly ser arg gly gly ala arg ala ser pro ala 181/61 211/71
ACG CAG CCG CCA CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT CCC GAC GCG ACA GTG GCC GGG thr gln pro pro pro leu leu pro pro ser ala thr gly pro asp ala thr val gly gly 241/81 271/91
CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG GTC AAG ATG GAG CCA GAG pro ala pro thr pro leu leu pro pro ser ala thr ala ser val lys met glu pro glu 301/101 331/111
AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC TCG CTC GAC CCC TCC TTC ACT CAC asn lys tyr leu pro glu leu met ala glu lys asp ser leu asp pro ser phe thr his 361/121 391/131
GCC ATC CAG CTG CTC ACG GCA GAA ATT GAG AAG ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT ala met gln leu leu thr ala glu ile glu lys ile gln lys gly asp ser lys lys asp 421/141 451/151
GAT GAG GAG AAT TAC TTC GAT TTA TTT TCT CAT AAG AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG asp glu glu asn tyr leu asp leu phe ser his lys asn met lys leu lys glu arg val 481/161 511/171
CTG ATA CCT GTC AAG CAG TAT CCC AAG TTC AAT TTT GTG GGG AAG ATT CTT GGA CCA CAA leu ile pro val lys gln tyr pro lys phe asn phe val gly lys ile leu gly pro gln 541/181 571/191
GGG AAT ACA ATC AAA AGA CTC CAG GAA GAG ACT GGT GCA AAC ATC TCT GTA TTG GGA AAG gly asn thr ile lys arg leu gln glu glu thr gly ala lys ile ser val leu gly lys 601/201 631/211
GGC TCA ATC AGA GAC AAA GCC AAG GAG GAA GAG CTG CCC AAA GGT GGA GAC CCC AAA TAT gly ser met arg asp lys ala lys glu glu glu leu arg lys gly gly asp pro lys tyr 661/221 691/231
GCC CAC TTC AAT ATC GAT CTG CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT GGA CCC CCA TCT GAG GCT ala his leu asn met asp leu his val phe ile glu val phe gly pro pro cys glu ala 721/241 751/251
TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCC GAT ATC ATG tyr ala leu met ala his ala met glu glu val lys lys phe leu val pro asp met met 781/261 811/271
GAT GAT ATC TCT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTC AAT GGA GTA CCT GAA CCC asp asp ile cys gln glu gln phe leu glu leu ser tyr leu asn gly val pro glu pro 841/281 871/291
TCT CGT GGA CGT CCC GTG CCA GTC AGA GGC CGC GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA CCT GTT ser arg gly arg gly val pro val arg gly arg gly ala ala pro pro pro pro pro val 901/301 931/311
CCC ACC GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CGC CGC GCT TTC GTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG pro arg gly arg gly val gly pro pro arg gly ala leu val arg gly thr pro val arg 961/321 991/331
GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT CGA CCC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG AGG gly ala ile thr arg gly ala thr val thr arg gly val pro pro pro pro thr val arg 1021/341 1051/351
GGT GCT CCA GCA CCA AGA GCA CCC ACA CCC CCC ATC CAG AGG ATA CCT TTC CCT CCA CCT gly ala pro ala pro arg ala arg thr ala gly ile gln arg ile pro leu pro pro pro 1081/361 1111/371
CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA AGT TAC pro ala pro glu thr tyr glu glu tyr gly tyr asp asp thr tyr ala glu gln ser tyr 1141/381 1171/391
GAA GGC TAC GAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA CGC GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA glu gly tyr glu gly tyr tyr ser gln ser gln gly asp ser glu tyr tyr asp tyr gly 1201/401 1231/411
CAT CGC GAG GTT CAA GAT TCT TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT CCC ACC AGG his gly glu val gln asp ser tyr glu ala tyr gly gln asp asp trp asn gly thr arg 1261/421 1291/431
CCC TCC CTG AAC GCC CCT CCT GCT AGG CCA CTC AAC GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT pro ser leu lys ala pro pro ala arg pro val lys gly ala tyr arg glu his pro tyr 1321/441
GGA CGT TAT TAA gly arg tyr OCH SEQ ID n 2:: Séquences nucléotidique et peptidique de Ap62 1/1 31/11
ATG CAG CGC CGC GAC GAC CCC GCC GCG CGC ATG AGC CCC TCT TCG GGC CGT AGC CCC TCC
Met gln arg arg asp asp pro ala ala arg met ser arg ser ser gly arg ser gly ser 61/21 91/31
ATG GAC CCC TCC GGT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG ACC CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG met asp pro ser gly ala his pro ser val arg gln thr pro ser arg gln pro pro leu 121/41 151/51
CCT CAC CCC TCC CCG GGA CCC GGA GGG GGA TCC CCC CGC GGC GCC CCG GCC TCC CCC GCC pro his arg ser arg gly gly gly gly gly ser arg gly gly ala arg ala ser pro ala 181/61 211/71
ACC CAG CCC CCA CCC CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACC GGT CCC GAC CCC ACA GTC GGC CCC thr gln pro pro pro leu leu pro pro ser ala thr gly pro asp ala thr val gly gly 241/81 271/91
CCA CCC CCC ACC CCC CTC CTC CCC CCC TCC GCC ACA GCC TCC GTC AAC ATG GAG CCA GAG pro ala pro thr pro leu leu pro pro ser ala thr ala ser val lys met glu pro glu 301/101 331/111
AAC AAC TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC TCC CTC GAC CCC TCC TTC ACT CAC asn lys tyr leu pro glu leu met ala glu lys asp ser leu asp pro ser phe thr his 361/121 391/131
GCC ATC CAG CTG CTG ACC GCA GAA ATT GAG AAC ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT ala met gln leu leu thr ala glu ile glu lys ile gln lys gly asp ser lys lys asp 421/141 451/151
GAT GAG GAG AAT TAC TTC GAT TTA TTT TCT CAT AAC AAC ATC AAA CTC AAA GAG CGA CTC asp glu glu asn tyr leu asp leu phe ser his lys asn met lys leu lys glu arg val 481/161 511/171
CTC ATA CCT GTC AAC CAG TAT CCC AAC GAG GAA GAG CTG CCC AAA GGT GGA GAC CCC AAA leu ile pro val lys gln tyr pro lys glu glu glu leu arg lys gly gly asp pro lys 541/181 571/191
TAT GCC CAC TTC AAT ATG GAT CTC CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT GGA CCC CCA TCT GAG tyr ala his leu asn met asp leu his val phe ile glu val phe gly pro pro cys glu 601/201 631/211
GCT TAT GCT CTT ATC GCC CAT GCC ATC GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCC GAT ATC ala tyr ala leu met ala his ala met glu glu val lys lys phe leu val pro asp met 661/221 691/231
ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTC TCC TAC TTC AAT GGA GTA CCT GAA met asp asp ile cys gln glu gln phe leu glu leu ser tyr leu asn gly val pro glu 721/241 751/251
CCC TCT CGT GGA CGT CCC GTC CCA GTC AGA GGC CGC GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA CCT pro ser arg gly arg gly val pro val arg gly arg gly ala ala pro pro pro pro pro 781/261 811/271
GTT CCC AGG CCC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CCC CCC GCT TTC GTA CGT GGT ACA CCA GTA val pro arg gly arg gly val gly pro pro arg gly ala leu val arg gly thr pro val 841/281 871/291 ACC GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTC ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG arg gly ala ile thr arg gly ala thr val thr arg gly val pro pro pro pro thr val 901/301 931/311
AGG GGT GCT CCA GCA CCA AGA GCA CCG ACA CCC GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTC CCT CCA CCT arg gly ala pro ala pro arg ala arg thr ala gly ile gln arg ile pro leu pro pro pro 964/322
CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA AGT TAC pro ala pro glu thr tyr glu glu tyr gly tyr asp asp thr tyr ala glu gln ser tyr
1124/342
GAA GGC TAC CAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA GGG GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA glu gly tyr glu gly tyr tyr ser gln ser gln gly asp ser glu tyr tyr asp tyr gly
1184/362
CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGC ACC AGG his gly glu val gln asp ser tyr glu ala tyr gly gln asp asp trp asn gly thr arg
1244/382
CCG TCG CTG AAG GCC CCT CCT GCT AGG CCA GTG AAG GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT pro ser leu lys ala pro pro ala arg pro val lys gly ala tyr arg glu his pro tyr
1304/402
GGA CGT TAT TAA gly arg tyr OCH SEQ ID n" 3 : Séquences nucléotidique et peptidique de p62-C
ATG AGA GAC AAA GCC AAG GAG GAA GAG CTC CCC AAA GGT GGA GAC CCC AAA TAT
met arg asp lys ala lys glu glu glu leu arg lys gly gly asp pro lys tyr 661/221 691/231
GCC CAC TTC AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT GGA CCC CCA TGT GAG GCT ala his leu asn met asp leu his val phe ile glu Val phe gly pro pro cys glu ala 721/241 751/251
TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCC GAT ATC ATG tyr ala leu met ala his ala met glu glu val lys lys phe leu val pro asp met met 781/261 811/271
GAT GAT ATC TGT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC asp asp ile cys gln glu gln phe leu glu leu ser tyr leu asn gly val pro glu pro 841/281 871/291
TCT CGT GGA CGT GGG GTC CCA GTG AGA GGC CGC GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA CCT GTT ser arg gly arg gly val pro val arg gly arg gly ala ala pro pro pro pro pro val 901/301 931/311
CCC AGG GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG GCT TTC GTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG pro arg gly arg gly val gly pro pro arg gly ala leu val arg gly thr pro val arg 961/321 991/331
GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTC AGG gly ala ile thr arg gly ala thr val thr arg gly val pro pro pro pro thr val arg 1021/341 1051/351
GGT GCT CCA GCA CCA AGA GCA CGC ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTC CCT CCA CCT gly ala pro ala pro arg ala arg thr ala gly ile gln arg ile pro leu pro pro pro 1081/361 1111/371
CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA AGT TAC pro ala pro glu thr tyr glu glu tyr gly tyr asp asp thr tyr ala glu gln ser tyr 1141/381 1171/391
GAA GGC TAC GAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA CGC GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA glu gly tyr glu gly tyr tyr ser gln ser gln gly asp ser glu tyr tyr asp tyr gly 1201/401 1231/411
CAT CCC GAG GTT CAA GAT TCT TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT CCC ACC AGG his gly glu val gln asp ser tyr glu ala tyr gly gln asp asp trp asn gly thr arg 1261/421 1291/431
CCC TCG CTG AAG GCC CCT CCT GCT ACC CCA GTG AAG GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT pro ser leu lys ala pro pro ala arg pro val lys gly ala tyr arg glu his pro tyr 1321/441
GGA CGT TAT TAA gly arg tyr OCH SEQIDn 4.
CAGCTGCTGACGGCAGAAATTGAG
SEQIDn 5.
TTAATAACGTCCATATG G GTG CTC
SEQ ID n" 6.
CAGTATCCCAAGGAGGAAGAGCTG
SEQ ID n 7;
CTGTCAAGCAGTATCCCAAGGAGG
SEQ ID n 8:
AAGGGCTCAATGAGAGACAAAGCC
SEQ ID n 9:
GTATG TATCATCATATC CATATTC

Claims (27)

  1. REVENDICATIONS 1. Dérivé de p62 capable d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une protéine GAP et p62.
  2. 2. Dérivé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il inhibe au moins partiellement les signaux transduits par ras.
  3. 3. Dérivé de p62 caractérisé en ce qu'il a perdu la capacité de p62 d'interagir avec l'ARN.
  4. 4. Dérivé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comporte au moins une délétion dans la zone d'homologie à la protéine
    GRP33.
  5. 5. Dérivé selon la revendication 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comporte une partie de p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP.
  6. 6. Dérivé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n" 2 ou d'un variant de celle-ci.
  7. 7. Polypeptide hop62 de séquence SEQ ID n"2.
  8. 8. Dérivé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement la région portant les tyrosines phosphorylées de p62.
  9. 9. Dérivé selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n" 3.
  10. 10. Polypeptide p62-C de séquence SEQ ID n"3.
  11. 11. Acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'une des revendication 1 à 10.
  12. 12. Acide nucléique selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADNc ou d'un ARN.
  13. 13. Acide nucléique selon la revendication 11 ou 12 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi:
    (a) tout ou partie de la séquence SEQ ID n" 2 ou SEQ ID n" 3 ou de leur brin complémentaire,
    (b) toute séquence hybridant avec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon la revendication 1,
    (c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
  14. 14. Acide nucléique de séquence SEQ ID n" 2.
  15. 15. Acide nucléique de séquence SEQ ID n"3.
  16. 16. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 11 à 15, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription.
  17. 17. Vecteur comportant un acide nucléique selon l'une des revendications 11 à 15 ou une cassette selon la revendication 16.
  18. 18. Vecteur selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.
  19. 19. Vecteur selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
  20. 20. Vecteur selon la revendication 19 caractérisé en ce que le vecteur viral dérive d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus AAV ou d'un virus de l'herpès.
  21. 21. Rétrovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 11 à 15 ou une cassette selon la revendication 16.
  22. 22. Adénovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 11 à 15 ou une cassette selon la revendication 16.
  23. 23. Composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique selon la revendication 11.
  24. 24. Composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur selon la revendication 17.
  25. 25. Composition pharmaceutique comprenant au moins un dérivé selon la revendication 1.
  26. 26. Composition pharmaceutique selon les revendications 23 à 25 pour le traitement des cancers.
  27. 27. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 11 ou d'un vecteur selon la revendication 17 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des désordres hyperprolifératifs.
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