SK283071B6 - Proteín Deltap62, jeho varianty, nukleotidové sekvencie a ich využitie - Google Patents

Abstract

Je opísaný nový derivát polypeptidu p62 označený ako Deltap62, jeho varianty, príslušné nukleotidové sekvencie a ich využitie, najmä v protirakovinovej génovej terapii. Derivát proteínu p62 je schopný inhibovať signály medzi proteínom GAP a p62 prenášané prostredníctvom ras.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka nového polypeptidu označeného Δρ62, jeho variantov, zodpovedajúcich nukleotidových sekvencií a ich terapeutického využívania, najmä v protirakovinovej génovej terapii.

Doterajší stav techniky

Rôzne gény, nazývané onkogény a gény supresory, sa podieľajú na kontrole bunkového delenia. Z nich gény ras a ich produkty označované všeobecne ako proteiny p21, hrajú kľúčovú úlohu v procese kontroly bunkového delenia pri všetkých eukaryotických organizmoch, pri ktorých boli sledované. Dokázalo sa, že niektoré špecifické modifikácie týchto proteínov u nich zapríčiňujú stratu ich normálnej kontroly a podieľajú sa tak na tom, že sa menia na onkogénne. Veľký počet tumorov zistených u ľudí sa dával do súvislosti s prítomnosťou týchto modifikovaných génov ras. Rovnako tiež určitá superexpresia týchto proteínov p21 môže viesť k narušeniu bunkového delenia. Pochopenie presnej úlohy týchto proteínov p21 v bunkách, ich funkcie a ich charakteristiky je základným problémom pochopenia a terapeutiky karcinogenézy.

V prípade in vivo nepoznáme presnú povahu týchto procesov zodpovedných za prenos signálu iniciovaného proteínmi p21. Predsa však stále väčší počet výsledkov zdôrazňuje množstvo efektorov, ktoré sú v priamej a preferenčnej interakcii s aktívnou formou (viazanou na GTP) proteínov ras. Z týchto efektorov bol proteín GAP prvý, ktorého implikácia do procesu prenosu signálu bola podrobne zdokumentovaná. Ide o cytozolický proteín prítomný vo všetkých eukaryotických organizmoch, ktorý má schopnosť výrazne urýchľovať hydrolýzu GTP viazaného na normálny proteín. Má dve oblasti, ktoré zabezpečujú rozdielne funkcie. Jeho karboxyterminálny koniec zahŕňa katalytickú aktivitu, ktorá je v interakcii s proteínmi p21 a ktorá zvyšuje ich GTP-ázovú aktivitu GTP-ázy. Na jeho druhom, N-terminálnom konci zaznamenávame juxtapozíciu oblastí SH2 a SH3, ktoré sa zúčastňujú na prenose signálu a sú v interakcii s ďalšími proteínmi. Medzi týmito proteínmi sú dva proteiny, p62 a p 190, respektíve 62 kDa a 190 kDa, ktoré sú výrazne fosforylované na tyrozíne. Tieto dva proteíny tvoria špecifický komplex s GAP a sú imunoprecipitované protilátkami zameranými proti rôznym epitopom GAP. Je známe, že práve na úrovni oblasti SH2 GAP prebiehajú interakcie proteínov p62 s GAP. Aminokyseliny 271 až 433 proteínu p62 obsahujú fosforylované tyrozíny a zúčastňujú sa pravdepodobne na týchto interakciách. Rovnaké fosforylácie sa pravdepodobne podieľajú na interakciách medzi proteínom p62 a adaptorom GRB2. Na druhej strane, v celom rozsahu sekvencie proteínu p62, sú rozložené miesta obohatené prolínmi, ktoré sa zúčastňujú na väzbe s oblasťami SH3 tyrozínkináz rodiny src ako aj fosfolipázy C.

Proteín p62 (alebo Sam68) bol identifikovaný Wongom (Celí 69 (1992) 551). Obsahuje 433 aminokyselín, ktorých sekvencie boli opísané v odbornej literatúre (pozri SEQ ID č. 1). Okrem uvedenej charakteristiky má proteín p62 niektoré znaky charakteristické pre hnRNP („heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein“):

- je bohatý na glyciny,

- obsahuje oblasti bohaté na arginíny,

- okrem toho ešte aminokyseliny 145 až 247 definujú oblasť výrazne homologickú s opísaným hnRNP, totiž GRP33.

Táto oblasť zahŕňa miesto väzby na sRNA homologickú s miestom prítomným v hnRNP K. Toto miesto je označené ako KH oblasť (KH = hnRNPK Homolog). Zachované rezíduá sú dôležité na väzbu na sRNA a vplyv nulovej integrity tejto oblasti v patológii bol dokázaný pre FMR1, čo je produkt génu dávaného do súvislosti s mentálnou retardáciou, ktorý je pozorovaný pri syndróme X-fragilného chromozómu (Siomi, Celí 17 (1994) 33).

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález spočíva predovšetkým v dokázaní významu proteínu p62 (Sam68) na delenie a ničenie buniek. Vychádza hlavne z dokázanej skutočnosti, že deriváty proteínu p62 sú schopné zasahovať do procesu bunkovej transformácie a zvlášť potom inhibovať signály prenášané proteínmi ras a src. Ďalej potom vychádzajú z prekvapivého dôkazu skutočnosti, že tieto deriváty majú rovnako apoptické vlastnosti a že sú teda schopné indukovať smrť buniek.

Prvý predmet predkladaného vynálezu sa týka derivátu proteínu p62, ktorý je schopný inhibovať aspoň čiastočne interakciu medzi proteínom GAP a p62. Deriváty podľa predkladaného vynálezu sú schopné prednostne inhibovať aspoň do istej miery onkogénnu schopnosť proteínov ras a/alebo src. Ešte výraznejšie preferenčne sú deriváty podľa vynálezu schopné indukovať smrť buniek apoptózou. Deriváty podľa vynálezu sú charakterizované stratou schopnosti spolupôsobiť s RNA p62.

Predkladaný vynález opisuje zvlášť dôkaz, klonovanie a charakteristiku prirodzenej izoformy proteínu p62. Táto izoforma označená ako Δρ62 (alebo ASam68) má deléciu v oblasti homológie s proteínom GRP33, ktorý pokrýva oblasť KH. Na základe tejto delécie polypeptidu Δρ62 chýba integrita vlastností proteínu p62. Takže polypeptid Δρ62 má intaktnú oblasť interakcie s GAP a GRB2, ako aj jednotlivé sekvencie bohaté na partnerské prolíny SH3 (obr. 1). Predsa však polypeptid Δρ62 nie je schopný vstúpiť do interakcie s nukleovými kyselinami v dôsledku delécie oblasti homológie s proteínom GRP33. Prihlasovateľ rovnako dokázal, že transfer cDNA polypeptidu Δρ62 do rôznych normálnych alebo nádorových bunkových modelov pôsobí proti súčinnosti medzi p62 a Ras a inhibuje signály prenášané normálnymi a onkogénnymi proteínmi Ras. Superexprimovaný Δρ62 interferuje s proliferačnými a diferenciačnými procesmi a vyúsťuje pri jednotlivých bunkových modeloch v smrť bunky v dôsledku apoptózy.

Predkladaný vynález sa týka najmä akéhokoľvek derivátu p62 prinášajúceho prinajmenšom deléciu do oblasti homológie s proteínom GRP33. Hlavne však deriváty podľa predkladaného pripúšťajúce deléciu v oblasti medzi rezíduami 145 až 247 proteínu p62, ako je zobrazená na sekvencii SEQ ID č. 1 a ktorá pokrýva oblasť KH. Delécia sa týka viac ako 10 aminokyselín a hlavne viac ako 30 aminokyselín. Môže sa týkať jedného alebo viac miest vnútri tejto oblasti, hneď ako vznikajúce deriváty vykážu opísané vlastnosti.

Výhodná je skutočnosť, že derivát podľa predkladaného vynálezu je polypeptid obsahujúci celok alebo časť sekvencie SEQ ID č. 2 alebo jej variant. Termín variant v zmysle predkladaného vynálezu označuje akýkoľvek polypeptid, ktorého štruktúra sa odlišuje od sekvencie SEQ ID č. 2 jednou alebo viacerými modifikáciami genetickej, biochemickej a/alebo chemickej povahy. Môže ísť zvlášť o mutáciu, substitúciu, deléciu, adíciu a/alebo modifikáciu jedného alebo niekoľkých rezíduí. Takéto deriváty môžu byť generované s rôznym cieľom, najmä však s cieľom zvýšiť afinitu peptidu k jeho interakčnému miestu, zlepšiť jeho úroveň produkcie, zvýšiť jeho odolnosť proti proteázam alebo zlepšiť jeho prechod bunkovými membránami, zvýšiť jeho terapeutickú účinnosť či znížiť jeho vedľajšie účinky, alebo mu prideliť nové farmakokinetické a/alebo biologické vlastnosti. Jednotlivé varianty zahrnujú delécie alebo mutácie vzťahujúce sa na aminokyseliny, ktorých prítomnosť nie je rozhodujúca pokiaľ ide o aktivitu derivátu. Takéto aminokyseliny môžu byť identifikované napríklad pomocou testov bunkovej aktivity, ako je opísané v uvedených príkladoch.

Deriváty podľa predkladaného vynálezu obsahujú aspoň časť proteínov p62 umožňujúcu interakciu s oblasťou SH2 GAP. Táto časť proteínu p62 je tvorená predovšetkým fosforylovanými tyrozínmi lokalizovanými medzi rezíduami 200 až 450 proteínu p62 (Cf SEQ ID č. 1). Derivát preferovaný podľa predkladaného vynálezu zahŕňa teda aspoň (I) deléciu v oblasti medzi rezíduami 145 až 247 p62 a (ii) časť p62 umožňujúcu interakciu s oblasťou SH2 GAP. Delécia sa predovšetkým týka rezíduí 1 až 202.

V tomto ohľade prihlasovateľ rovnako dokázal, že deriváty podľa predkladaného vynálezu majúce obzvlášť zaujímavé vlastnosti môžu byť tvorené polypeptidmi zahŕňajúcimi zvlášť oblasť fosforylovaných tyrozínov p62.

Obzvlášť preferovaný príklad polypeptidov podľa predkladaného vynálezu predstavuje polypeptid Δρ62 so sekvenciou SEQ ID č. 2 zahrnujúcou deléciu rezíduí 170 až 208 sekvencie p62. Iným príkladom je polypeptid p62-C zahrnujúci rezíduá 203 až 443 p62 (so sekvenciou SEQ ID č. 3).

Výsledky uvedené v predkladanom vynáleze dokazujú najmä, že polypeptid Δρ62 môže konkurovať s proteínom p62 proti GAP, keď GAP je jedným z efektorov proteínov Ras, polypeptid Δρ62 blokuje od taho závisiace mitogénne cesty. Polypeptid Δρ62 superexprimovaný genotransferom (transfekcia, infekcia, mikroinjekcia atď.) indukuje bunkovú smrť apoptózou v normálnych bunkách (fibroblasty NIH 3T3 a Swiss 3T3) alebo v bunkách tumorových (H460, HCT 116) a je schopný inhibovať utváranie ložísk indukovaných génmi ras. Rovnaký účinok dosiahneme s derivátom p62-C (zahrnujúcim hlavne C-terminálnu časť polypeptidu, ktorá pokrýva oblasť medzi aminokyselinami 203 a 443 a zodpovedá oblasti interakcie s oblasťami SH2 GAP a GRB2. Táto C-terminálna časť zahŕňa tiež tri miesta interakcie s oblasťami SH3, ktoré majú najvyššiu afinitu pre Fyn. Významná terapeutická aktivita derivátov podľa predkladaného vynálezu sa viaže na ich početné vlastnosti a najmä ich schopnosť titrovať oblasti SH3 proteínov rodiny src (príklad: fyn), ich kapacitu inhibovať regrutovanie GRB2 titráciou jeho oblasti SH2 a ich schopnosť inhibovať účinnú funkciu proteínu GAP v signalizačných cestách závisiacich od Ras.

Ďalší predmet predkladaného vynálezu sa týka akejkoľvek nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid ako je definovaný.

Kyselina nukleová podľa predkladaného návrhu môže byť kyselina ribonukleová (RNA) alebo deoxyribonukleová (DNA). Okrem toho môže ísť o genómovú DNA (gDNA) alebo komplementárnu (cDNA). Môže byť ľudského, zvieracieho, vírusového, syntetického alebo polysyntetického pôvodu. Môže byť získaná rôznym spôsobom, najmä však chemickou syntézou s využitím sekvencií prezentovaných v prihláške vynálezu alebo syntetizátora nukleových kyselín. Rovnako tiež môže byť získaná triedením bánk pomocou špecifických sond, ako sú opísané v žiadosti (pozri sekvencie SEQ ID č. 6 a 7). Ďalej môže byť získaná kombinova nými technikami, zahrnujúcimi chemickú modifikáciu (elongáciu, deléciu, substitúciu atď.) sekvencií triedených v bankách. Všeobecne povedané, nukleové kyseliny uvedené vo vynáleze môžu byť pripravené akoukoľvek odborníkom známou technikou.

Nukleová kyselina podľa vynálezu je väčšinou cDNA alebo RNA.

Nukleová kyselina podľa vynálezu môže byť vyberaná predovšetkým z množiny zahrnujúcej:

(a) celok alebo časť sekvencie SEQ ID č. 2 alebo SEQ ID č. 3, alebo ich komplementárne časti, (b) akékoľvek sekvencie hybridizujúce so sekvenciami (a) a kódujúce derivát podľa predkladaného vynálezu, (c) varianty (a) a (b) vyplývajúce z degenerácie genetického kódu.

Ako je uvedené, prihlasovateľ izoloval a charakterizoval nové sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptidy derivované z p62, vyznačujúce sa pozoruhodnými antiproliferatívnymi a apoptotickými vlastnosťami. Tieto nukleové kyseliny môžu byť teraz použité ako terapeutické činidlá a produkovať v bunkách deriváty podľa vynálezu schopné zničiť alebo korigovať bunkové dysfunkcie. Preto sa predkladaný vynález týka rovnako každej expresnej kazety obsahujúcej nukleovú kyselinu ako je definované, promótor umožňujúci jej expresiu a signál ukončenia transkripcie. Promótor sa vyberá z funkčných promótorov v samčích bunkách, najlepšie ľudského pôvodu. Ide o promótor umožňujúci expresiu kyseliny nukleovej v hyperproliferatívnej bunke (nádorovej, restenóznej atď.). Z tohto hľadiska je možné použiť niekoľko promótorov. Môže napríklad ísť o vlastný promótor génu p62. Tiež však môže ísť o oblasti rôzneho pôvodu (zodpovedné sa expresiu ďalších proteínov, dokonca syntetických). Môže teda ísť o akýkoľvek promótor alebo derivovanú sekvenciu stimulujúcu alebo naopak potláčajúcu transkripciu génu špecifickým či nešpecifickým spôsobom, induktívnu alebo nie, výraznú alebo naopak slabú.

Hlavne je možno uviesť aktivačné sekvencie eukaryotických alebo vírusových génov. Napríklad môže ísť o aktivačné sekvencie pochádzajúce z genómu cieľovej bunky. Z eukaryotických promótorov je možné použiť hlavne promótory ubikvitáme (promótory génov HPRT, PGK, a-aktin, tubulín atď.), promótory intermediálnych vláken (promótory génov GFAP, dezmín, vimentín, neurovlákna, keratínu atď.), promótory terapeutických génov (promótory génov MDR, CFTR, faktor Vín, ApoAI atď.), špecifické tkanivové promótory (promótory génov pyruvát-kinázy, vilín, črevný proteín väzby mastných kyselín, a-aktín hladkého svalu atď.) alebo tiež promótory reagujúce na určitý podnet (receptory steroidných hormónov, kyseliny retionovej atď.). Ďalej môže ísť o aktivačné sekvencie pochádzajúce z genómu určitého vírusu, ako napríklad promótory génov E1A a MLP adenovírusu, skorý promótor génu CMV alebo tiež promótor génu LTR, génu RSV atď. Tieto aktivačné oblasti môžu byť modifikované pridaním aktivačných či regulačných sekvencií, či sekvencií umožňujúcich tkanivovo-špecifickú alebo majoritnú expresiu.

Predkladaný vynález uvádza teraz nové terapeutické činidlá umožňujúce svojimi antiproliferatívnymi alebo apoptickými vlastnosťami interferovať s mnohými bunkovými dysfunkciami. Na tento účel môžu byť nukleové kyseliny alebo kazety podľa vynálezu injikované samy osebe na úrovni miesta, ktoré je určené na ošetrenie alebo inkubované priamo s bunkami, ktoré je treba zničiť alebo ošetriť. Opísalo sa, že jednoduché nukleové kyseliny sú schopné prenikať do buniek bez zvláštneho vektora. Akokoľvek, v rámci predkladaného vynálezu sa uprednostňuje tzv. aplikované ho vektora umožňujúceho zvýšenie (i) účinnosti prieniku do bunky, (ii) zacielenie a zvýšenie (iii) extra- a intrabunkovej stability.

Pri obzvlášť preferovanom spôsobe aplikácie podľa predkladaného vynálezu je kyselina nukleová alebo kazeta inkorporovaná do vektora. Použitý vektor môže byť chemického (lipozóm, nanopartikula, peptidický komplex, lipidy alebo katiónové polyméry atď.) alebo vírusového pôvodu (retrovírus, adenovírus, vírus herpesu, AAV, vakcínia vírus atď.) či pôvodu plazmidového.

Použitie vírusových vektorov je dané prirodzenými schopnosťami transfekcie vírusov. Tak je možné použiť napríklad adenovírusy, vírusy herpesu, retrovírusy a asociované adenovírusy. Tieto vektory sú mimoriadne účinné na úseku transfekcie. V tomto ohľade predkladaný vynález uprednostňuje defektný rekombinantný retrovírus, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu podľa uvedenej definície.

V druhom prípade vynález využíva defektný rekombinantný adenovírus, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu podľa uvedenej definície.

Vektorom podľa predkladaného vynálezu môže byť rovnako nevírusový agens, schopný aktivovať transfer a expresiu nukleových kyselín do eukaryotických buniek. Chemické alebo biochemické, syntetické alebo prírodné vektory predstavujú zaujímavú alternatívu prírodných vírusov, najmä teda kvôli jednoduchosti a bezpečnosti aplikácie a rovnako v dôsledku toho, že nie je daná teoretická medzná hodnota množstva DNA určenej na prenos. Tieto syntetické vektory majú dve hlavné funkcie - zhutniť nukleovú kyselinu určenú na transfekciu a aktivovať jej bunkovú fixáciu ako aj jej prechod plazmatickou membránou a prípadne oboma jadrovými membránami. Aby mohli čeliť polyaniónovej povahe nukleových kyselín, sú nevírusové vektory vybavené polykatiónovými funkciami. Nukleová kyselina alebo vektor s nábojom použitý v predkladanom vynáleze môže byť podávaný topicky, orálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, intraokulárne, transdermálne atď. Najčastejšie sa kyselina nukleová alebo vektor aplikujú injekčnou formou. Môžu teda byť zmiešané s akýmkoľvek farmaceutickým vehikulom prijateľným pre injikovateľnú formu, hlavne na priame injikovanie na úrovni miesta určeného na ošetrenie. Môže ísť najmä o sterilné alebo izotonické roztoky, alebo o suché, najmä lyofilizované zlúčeniny, ktoré pridaním buď sterilizovanej vody, alebo fyziologického séra, umožňujú vytvorenie injikovateľných tekutín. Priame injikovanie kyseliny nukleovej do tumoru pacienta je veľmi zaujímavým riešením, pretože umožňuje sústrediť terapeutický účinok na úroveň postihnutých tkanív. Aplikované dávky kyseliny nukleovej môžu byť upravené v závislosti od rôznych parametrov a predovšetkým potom v závislosti od génu, od vektora, od daného spôsobu aplikácie, od danej patológie alebo od dĺžky trvania sledovaného ošetrovania.

Predkladaný vynález sa rovnako týka akejkoľvek farmaceutickej kompozície obsahujúcej aspoň kyselinu nukleovú.

Rovnako sa týka akejkoľvek farmaceutickej kompozície obsahujúcej aspoň vektor podľa uvedenej definície.

Rovnako sa týka akejkoľvek farmaceutickej kompozície obsahujúcej aspoň derivát p62 podľa uvedenej definície.

Vzhľadom na svoje antiproliferatívne vlastnosti sú farmaceutické kompozície podľa vynálezu obzvlášť prispôsobené na ošetrovanie hyperproliferatívnych porúch, najmä rakoviny a restenózy. Predkladaný vynález ponúka mimoriadne účinnú metódu ničenia buniek, predovšetkým potom buniek hyperproliferatívnych. Tá môže byť použitá tak in vitro, ako aj ex vivo. Pri použití ex vivo spočíva v inkubácii buniek za prítomnosti jednej alebo viaceíých nukleových kyselín (alebo vektora, kazety alebo priamo derivátu). Pri použití in vivo potom spočíva v podávaní určitého aktívneho množstva vektora (alebo kazety) organizmu, najlepšie priamo na úrovni miesta určeného na ošetrenie (najmä tumoru). Z tohto hľadiska je predmetom vynálezu metóda ničenia hyperproliferatívnych buniek založená na kontakte spomínaných buniek alebo ich časti s kyselinou nukleovou podľa uvedenej definície.

Predkladaný vynález sa výhodne využíva in vivo na ničenie hyperproliferujúcich buniek, (t. j. anormálnej proliferácii). Dá sa teda využiť na ničenie tumorálnych buniek alebo buniek hladkého svalu vaskulámej steny (restenóza). Najmä je vhodný na ošetrenie prípadov rakoviny, kde je implikovaný aktivovaný onkogén. Napríklad je možno uviesť adenokarcinómy hrubého čreva, rakovinu štítnej žľazy, karcinómy pľúc, myeloidnú leukémiu, kolorektálnu rakovinu, rakovinu prsníka, pľúc, žalúdka, hltana, Blymfocytov, vaječníkov, močového mechúra, glioblastómov, karcinómy pečene, rakovinu kostí, kože, pankreasu alebo obličiek, či prostaty atď.

Produkty vynálezu sú vhodné tiež na identifikáciu ďalších partnerov ciest signalizácie onkogénov vyhľadávaním inhibítorov, agonizujúcich činidiel, kompetítorov alebo molekúl reagujúcich in vivo práve s týmito produktmi.

Napokon, vynález sa týka tiež antimediátorových sekvencií, ktorých expresia v cieľovej bunke umožňuje riadiť transkripciu a/alebo transdukciu bunkových mRNA kódujúcich protein p62 alebo polypeptid Δρ62. Takéto sekvencie môžu byť napríklad premenené v cieľovej bunke na RNA doplňujúce bunkové mRNA polypeptidu Δρ62 alebo proteínu p62 a blokovať ich premenu na protein podľa techniky opísanej v patente EP 140 308. Tieto sekvencie môžu byť tvorené čiastočne alebo úplne nukleotidovými sekvenciami SEQ ID č. 1,2 alebo 3, transkribovanými v opačnej orientácii.

Predkladaný vynález sa rovnako týka použitia akejkoľvek zlúčeniny schopnej indukovať expresiu či superexpresiu polypeptidu Δρ62 v bunke na účely prípravy farmaceutickej kompozície určenej na ošetrenie hyperproliferatívnych porúch.

Predkladaný vynález bude opísaný podrobnejšie pomocou následne uvedených príkladov, ktoré je treba považovať za ilustratívne a vôbec nie limitatívne.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: Schematické zobrazenie štrukturálnych oblastí proteínov p62 a polypeptidov Δρ62.

Obr. 2: Účinky proteínu p62 a polypeptidu Δρ62 na transaktiváciu RRE-dcrivátov zosilňovača transkripcie vírusu polyómu proteínmi ras.

Obr. 3: Dokázanie zničenia buniek indukované prostredníctvom polypeptidu Δρ62 vo fibroblastoch NIH3T3.

Obr. 4: Dokázanie expresie polypeptidu Δρ62 v embryonálnych fibroblastoch ošetrených rôznymi cytotoxickými činidlami a sérovou depriváciou.

Obr. 5: Inhibícia tvorby ložísk indukovanej onkogénmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Biomolekuláma technika

Metódy klasicky používané v molekulárnej biológii, ako napríklad preparatívna extrakcia plazmidovej DNA, centrifugácia plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza na agarovom alebo polyakrylamidovom géli, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteínov fenolom alebo fenolchloroformom, precipitácia DNA v soľnom prostredí etanolom alebo izopropanolom, transformácia v Escherichia coli atď... sú metódy, ktoré odborník dobre pozná a ktoré sú dostatočne opísané v odbornej literatúre (Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 199, 82, Ausubel F.M. et al. (eds), „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley and Sons, New York, 1987).

Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série M13 majú obchodný pôvod (Bethesda Research Laboratories). Na účely ligácie môžu byť fragmenty DNA oddelené podľa svojej veľkosti elektroforézou na agarovom alebo polyakrylamidovom géli, extrahované fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, precipitované etanolom a inkubované za prítomnosti DNA ligázy fága T4 (Biolabs) podľa odporúčania dodávateľa.

Proeminentné konce 5' môžu byť doplnené Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I odvodené z E. coli (Biolabs) podľa špecifikácie dodávateľa. Zničenie proeminentných koncov 3' sa uskutoční za prítomnosti DNA polymerázy fága T4 (Biolabs) podľa odporúčania výrobcu. Zničenie proeminentných koncov 5' sa uskutoční ošetrením nukleázou SI.

Mutagenéza riadená in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidmi môže byť uskutočnená podľa metódy vyvinutej Zaylorom at al. (Nucleic Acid Res., 13 (1985) 8749 -

- 8764) s použitím súpravy distribuovanej Amershamom. Enzýmová amplifikácia fragmentov DNA technikou nazvanou PCR (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350 - 1354, Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzým. 155 (1987) 335 - 350) môže byť uskutočnená s použitím tzv. „DNA thermal cycler“ (Perín Elmer Cetus) podľa špecifikácie výrobcu. Overenie nukleotidových sekvencií môže byť uskutočnené metódou vyvinutou Sangerom et. Al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463 - 5467) s použitím súpravy distribuovanej Amershamom.

Izolovanie komplementárnej DNA poiypeptidu Ap62. Komplementárna DNA poiypeptidu Ap62 bola izolovaná pomocou PCR na populácii syntetizovanej komplementárnej DNA z RNA poly A+ extrahovanej z ľudskej placenty. 1 pg DNA bol použitý spoločne s primermi derivovanými so sekvencie p62, ktoré pokrývajú aminokyseliny 123 až 131 na jednej strane (oligo 5'0 a 437 až 443 na strane druhej (oligo 3').

Sekvencie týchto štartérov sú nasledovné: oligo 5': CAGCTGCTGACGGCAGAAATTGAG (SEQ ID č. 4), oligo 3': TTAATAACGTCCATATGGGTGCTC (SEQ ID č. 5).

Reakcie prebiehali pri 55 C a výsledkom boli dva produkty oddelené elektroforézou na agarovom géli:

- pás 987 párov báz zodpovedajúci produktu PCR p62,

- pás 870 párov báz zodpovedajúci produktu PCR Δρ62.

Tento druhý pás bol klonovaný a jeho frekvencia zodpovedá presne frekvencii p62 s výnimkou delécie 117 párov báz v oblasti homológie s GRP33. Kompletná sekvencia Ap62 je prezentovaná ako SEQ ID č. 2 (pozri obr. 1).

Existencia tejto izoformy proteínu p62 bola potvrdená skríningom banky komplementárnej DNA ľudskej placenty vo vektore gt 11. Oligonukleotid použitý na tento skríning je 24-mér zodpovedajúci špecifickému spojeniu delécie prítomnej v polypeptide Ap62. Sekvencia tohto oligonukleotidu je:

CAGTATCCCAAGGAGGAAGAGCTG (SEQ ID č. 6).

Príklad 2

Konštrukcia vektorov expresie poiypeptidu Δρ62 a proteínu p62-C.

Tento príklad opisuje konštrukcie vektorov použiteľných na transfer nukleových kyselín podľa vynálezu in vitro alebo in vivo.

2.1 Plazmidový vektor

Na konštrukciu plazmidových vektorov boli použité 2 typy vektorov:

- Vektor SV2, opísaný v DNA Cloning, A practical approach Vol. 2, D. M. Glover (ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Tento vektor je vektorom eukaryotickej expresie. Nukleové kyseliny kódujúce varianty proteínu p62-C a poiypeptidu Δρ62 boli vložené do tohto vektora vo forme fragmentov EcoRI. Sú tak pod kontrolou promótora zosilňovača transkripcie vírusu SV40.

- Vektor pcDNA3 (Invitrogen). Ide rovnako o vektor eukaryotickej expresie. Nukleové kyseliny kódujúce varianty proteínu p62-C a poiypeptidu Δρ62 boli vložené do tohto vektora vo forme fragmentov EcoRI a sú tak pod kontrolou skorého promótora CMV.

2.2 Vírusový vektor

Vynález spočíva v konštrukcii a použití vírusových vektorov umožňujúcich transfer a expresiu nukleových kyselín in vivo podľa uvedenej definície.

Pretože ide najmä o adenovírusy, boli charakterizované rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa mierne líšia.

Z nich sa prednostne využívajú v rámci predkladaného vynálezu ľudské adenovírusy typu 2 a 5 (Ad 2 alebo Ad 5) alebo adenovírusy živočíšneho pôvodu (pozri patentová prihláška WO 94/26914). Z adenovírusov živočíšneho pôvodu využiteľných v rámci predkladaného vynálezu je možno uviesť adenovírusy psieho, bovínneho, myšacieho (príklad: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasačieho, vtáčieho alebo opičieho pôvodu (príklad: SAV). Adenovírusom živočíšneho pôvodu je adenovírus psí, najmä teda adenovírus CAV2 (napríklad kmeň manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800). V rámci predkladaného vynálezu sa používa predovšetkým adenovírus ľudského či psieho pôvodu alebo adenovírusov kombinovaných.

Defektné adenovírusy podľa vynálezu obsahujú ITR, sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu a nukleovú kyselinu podľa vynálezu. Ešte častejšie je potom v genóme adenovírusov podľa vynálezu oblasť El nefunkčná. Sledovaný vírusový gén môže byť znefunkčnený akoukoľvek technikou známou odborníkom, najmä celkovou supresiou, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo pridaním jednej či viac báz do sledovaného génu (či sledovaných génov). Takéto modifikácie môžu byť dosiahnuté in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ pomocou metód génového inžinierstva alebo ošetrením mutagénnymi činidlami. I ďalšie oblasti môžu byť rovnako modifikované a hlavne potom oblasť E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Podľa preferovaného spôsobu využitia obsahuje adenovírus podľa vynálezu v oblastiach El a E4. Podľa iného preferovaného realizačného postupu zahrnuje deléciu v oblasti El, na úrovni ktorej je vložená oblasť E4 a kyselina nukleová podľa vynálezu (porovnaj FR94 13355). Vo vírusoch podľa vynálezu zasahuje delécia v oblasti El do nukleotidov 455 až 3329 na sekvencií adenovírusu Ad5.

Defektné rekombinantné adenovírusy podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené akoukoľvek odborníkom známou technikou (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graha, EMBO J. 3 (1984) 2917). Najmä však môžu byť pripravené homologickou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom so sekvenciou DNA. Homologická rekombinácia vzniká po kotransfekcii spomínaných adenovírusov a plazmidu do vhodnej bunkovej línie. Použitá bunková línia musí byť transformovateľná spomínanými prvkami, musí zahrnovať sekvencie schopné doplniť časť genómu defektného adenovírusu, najlepšie integrovanou formou, aby sa zabránilo nebezpečiu rekombinácie. Ako príklad môžeme uviesť ľudskú embryonálnu líniu obličiek 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje ľavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12 %) integrovanú do svojho genómu, alebo línie schopné doplniť funkcie El a E4, ako sú opísané v patentových prihláškach č. WO 94/26914 a WO 95/02697. Rozmnožené adenovírusy sú zachytené a purifikované klasickými metódami molekulárnej biológie ako je ilustrované v uvedených príkladoch.

Pokiaľ ide o tzv. adeno-asociované vírusy (AAV), ide o vírusy na báze DNA relatívne redukovanej veľkosti, ktoré sa integrujú do genómu buniek, ktoré infikujú a to stabilne a špecificky pre dané miesto. Sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez toho, aby indukovali akýkoľvek vplyv na rast, morfológiu alebo diferenciáciu buniek. Ako sa zdá, nepodieľajú sa však na patológii u človeka. Genóm vírusu AAV bol klonovaný, rozložený do sekvencií a charakterizovaný. Zahrnuje približne 4700 báz a obsahuje na každom konci oblasť obrátenej repetície (ITR) 145 báz. Zvyšok genómu je rozdelený do dvoch podstatných oblastí s enkapsidačnými funkciami: do ľavej časti genómu obsahujúcej gén rep podieľajúci sa na vírusovej replikácii a expresii vírusových génov a do pravej časti genómu obsahujúcej gén cap kódujúci kapsidové proteíny vírusu.

Použitie vektorov derivovaných z AAV na transfer génov in vitro a in vivo bolo opísané v odbornej literatúre (najmä WO 91/18088, WO 93/09239, US 4, 797, 368, US 5, 139, 941, EP 488 528). Sú tu opísané rôzne konštrukcie derivované z AAV, v ktorých gény rep a/alebo cap sú eliminované deléciou a nahradené významným génom a ďalej je tu opísané ich použitie na transfer tohto významného génu in vitro (na bunkách v kultúre) alebo in vivo (priamo do organizmu). Rekombinantné defektné AAV podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené kotransfekciou plazmidu obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu ohraničenej dvoma oblasťami ITR AAV a plazmidu s enkapsidačnými génmi (gény rep a cap) AAV do bunkovej línie infikovanej pomocným ľudským vírusom (napríklad adenovírusom). Použiteľná bunková línia je napríklad línia 293. Produkované rekombinantné AAV sú následne purifikované klasickými technikami.

Pokiaľ ide o vírusy herpesu a retrovírusy, bola konštrukcia rekombinantných vektorov už skôr podrobne opísaná v odbornej literatúre: pozri hlavne Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP 17 8220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235, Mc Cormick, Biotechnology 3 (1985) 689, atď. Retrovírusy sú integratívne vírusy infikujúce selektívne bunky v procese delenia. Predstavujú teda významné vektory vhodné na aplikáciu v prípade rakoviny. Genóm retrovírusov zahŕňa najmä dve LTR, enkapsidačné sekvencie a tri kódujúce oblasti (gag, pol a env). V rekombinantných vektoroch derivovaných z retrovírusov potom gény gag, pol a env sú väčšinou eliminované deléciou a to celkovo alebo čiastočne a sú nahradené sekvenciou zainteresovanej heterológnej nukleovej kyseliny. Tieto vektory môžu byť realizované z rôznych typov retrovírusov, ako MoMuLV („Murine Moloney Leukémia Virus“ označovaný tiež MoMLV), MSV („Murine Moloney Sarcoma Virus“), HaSV („Harvey Sarcoma Virus“), SNV („spleen nacrosis virus“), RSV („Rous Sarcoma Virus“) či tiež Friendov vírus.

Na konštrukciu rekombinantných vírusov podľa vynálezu obsahujúcich nukleovú kyselinu rovnako podľa vynálezu sa vytvorí plazmid obsahujúci najmä LTR, enkapsidačnú sekvenciu a spomínanú nukleovú kyselinu a potom sa použije na prenos bunkovej línie, zvanej enkapsidačná, schopnej vložiť do polohy trans retrovírusové funkcie, ktoré sú v plazmide deficientné. Všeobecne povedané sú enkapsidačné línie schopné exprimovať gény gag, pol a env. Takéto enkapsidačné línie boli opísané v skorších prácach, najmä potom línie PA317 (US 4, 861, 719), línie PsiCRIP (WO 90/02806) a línie GP + envAm-12 (WO 89/07150). Rekombinantné vírusy môžu zahŕňať modifikácie na úrovni LTR na potlačenie transkripčnej aktivity, ako i enkapsidačné sekvencie zahŕňajúce časť génu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Produkované rekombinantné retrovírusy sú potom purifikované klasickými technikami.

Na využitie predkladaného vynálezu je vhodné použiť adenovírus alebo defektný rekombinantný retrovírus. Tieto vektory majú skutočne mimoriadne zaujímavé vlastnosti na prenos génov do tumorálnych buniek.

2.3 Chemický vektor

Z vyvinutých syntetických vektorov sa prednostne v rámci predkladaného vynálezu využívajú katiónové polyméry typu polylyzínu, (LKLK)n, (LKKL)n, polyetylénimínu a DEAE dextrán alebo katiónových, alebo lipofektantných lipidov. Majú tú vlastnosť, že kondenzujú DNA a podporujú jej spojenie s bunkovou membránou. Z nich môžeme uviesť lipopolyamíny (lipofektamín, transfektam atď.), rôzne katiónové alebo neutrálne lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE atď.) ako aj peptidy nukleárneho pôvodu. Okrem toho bol vyvinutý koncept cieľovej transfekcie sprostredkovanej receptorom, ktorý využíva princíp kondenzácie DNA vďaka katiónovému polyméru pri orientácii fixácie komplexu na membránu vďaka chemickej väzbe medzi katiónovým polymérom a väzivom membránového receptora prítomného na povrchu bunkového typu, ktorý’ chceme transplantovať. Zacielenie receptora na transferín, inzulín alebo receptor asialoglykoproteinov bolo už skôr podrobne opísané. Príprava zlúčeniny s použitím chemického vektora je realizovaná bežnou, odborníkom známou technikou, predovšetkým potom jednoduchým uvedením jednotlivých zložiek do vzájomného kontaktu.

Príklad 3

Inhibícia transaktivácic R.R.E. (ras responsive elements) podmienená onkogenetickými formami Ras (obr. 2).

Fibroblasty NIH 3T3 boli transfekované nosným génom, génom chloramfenikol acetyltransferázy, riadeným prvkami reagujúcimi na Ras derivovanými zo zosilňovača transkripcie vírusu polyómu. Tieto prvky sú stimulované 15 - 20-krát ak sú bunky kotransfekované expresným vektorom nesúcim cDNA onkogénu Middle T (MT) SV40. Táto stimulácia je len nepatrne ovplyvnená, ak kotransfekcia

SK 283071 Β6 prináša expresné vektory proteínu p62-C a polypeptidu Δρ62 (porovnaj príklad 2). Ak je kotransfekcia realizovaná nielen s MT, ale aj s aktivovanou formou onkogénu Ha-ras (Val 12), aktivita CAT je stimulovaná 30 - 40-krát nad základnú úroveň. Expresia polypeptidu p62 ovplyvňuje túto stimuláciu len nepatrne, zatiaľ čo proteín p62-C a polypeptid Ap62 inhibuje takmer bezo zvyšku celkovú aktivitu podmienenú onkogénnym Ras. Rovnakým spôsobom je potom stimulácia dosiahnutá kotransfekciou s onkogénom v-src výrazne inhibovaná proteínmi p62-C a polypeptidom Ap62, nie však proteínom p 62.

Tieto pokusy boli uskutočnené s 0,5 pg vektora umožňujúceho expresiu MT alebo Ras VAL 12 alebo v-src et s 4 pg expresného vektora nesúceho cDNA proteínu p62-C alebo polypeptidu Ap62. Jasne dokazujú schopnosť proteínov podľa predkladaného vynálezu pôsobiť proti onkogénnym signálom ras.

Príklad 4

Dôkaz smrti bunky indukovanej polypeptidom Ap62 vo fibroblastoch NIH3T3 (obr. 3).

Fibroblasty NIH3T3 boli transfekované s účinnosťou 60 % množstvom 5 pg expresného vektora polypeptidu Δρ62 (príklad 2).

hodín po transfekcii majú bunky výrazné zhoršenie ich životaschopnosti vzhľadom na kontrolné subjekty. Analýza ich DNA ukazuje po migrácii na agarózovom géli charakteristické degradačné štádia apoptóznych javov. Rovnaké javy možno pozorovať v prípade, kedy je p62-C transfekovaný za rovnakých podmienok ako je Δρ62.

Príklad 5

Dôkaz expresie polypeptidu Δρ62 v embryonálnych fibroblastoch ovplyvnených rôznymi cytotoxickými činidlami a sérovou depriváciou (obr. 4).

Myšie embryonálne fibroblasty boli vnesené do kultúry (1), ovplyvnené 0,5 pg kyseliny okadovej (2), ovplyvnené 10 ng/ml PMA a 2 pg ionomycínu (3), 1 pM staurosporínu (4) alebo 2 pg/ml kamtotecínu (5) a potom zbavené séra.

Expresia mediátorových RNA proteínu p62 a polypeptidu Δρ62 v týchto fibroblastoch a počas rôznych ovplyvnení bola podrobená dôkladnej analýze. Pri každom ovplyvnení boli analyzované tri body. Tie zodpovedajú trom časovým intervalom ovplyvnenia: 6, 12 a 24 hodín.

Sonda 5' špecifická pre polypeptid Δρ62 (SEQID č. 7): CTGTCAAGCAGTATCCCAAGGAGG

Sonda 5' špecifická pre proteín p62 (SEQ ID č. 8): AAGGGCTCAATGAGAGACAAAGCC

Sonda 3 spoločná pre p62 a Δρ62 (SEQ ID č. 9): GTATGTATCATCATATCCTATTTC

Vo fibroblastoch vnesených do kultúry za prítomnosti 10 % fetálneho teľacieho séra (SVF) bola mRNA proteínu p62 potvrdená, zatiaľ čo mRNA polypeptidu Δρ62 nebola detekovaná ani po 24 hodinách po vnesení do kultúry. Rovnaká situácia je pri ošetrení kyselinou okadovou. Na rozdiel od toho, je možno porovnať výraznú indukciu polypeptidu Δρ62 po 6 až 12 hodinách ovplyvňovania pomocou PMA a ionomycínom. mRNA sa dá rovnako dokázať pridaním staurosporínu a je výrazne indukovaná po 12 hodinách ovplyvňovania kaptotecínom. Hneď ako sú embryonálne fibroblasty odobraté zo séra, je možné pozorovať vý raznú indukciu polypeptidu Δρ62 súčasne so zmiznutím informácie pre proteín p62.

Tieto výsledky dokazujú, že expresia mRNA polypeptidu Δρ62 je indukovaná počas niektorých apoptických situácií vo fibroblastoch.

Príklad 6

Inhibícia tvorby ložísk indukovaných ras polypeptidom Δρ62

Tento príklad opisuje inú štúdiu, dokazujúcu, že polypeptid Δρ62 interferuje s transformačným procesom, indukovaným onkogénmi. Najmä tento príklad dokresľuje, že polypeptid Δρ62 dokáže inhibovať tvorbu ložísk indukovanú rôznymi onkogénmi (ras onkogénny, v-src) v bunkách NIH3T3, zatiaľ čo proteín p62 na tento fenomén vôbec nepôsobí.

Fibroblasty NIH3T3 boli kotransfekované pomocou 0,1 pg vektora expresie v-Src alebo Ha-Ras Vall2 a 4 mg vektora expresie proteínu p62, polypeptidu Δρ62 alebo prázdneho vektora (príklad 2). Bunky boli udržované v prostredí obsahujúcom 10 % fetálne teľacie sérum a počet ložísk bol určený po fixácii a zafarbení buniek za prítomnosti fenolfuksínu. Pokusy boli uskutočnené v troch opakovaniach.

Dosiahnuté výsledky sú uvedené na obr. 5. Potvrdzujú, že polypeptid Δρ62 znižuje počet ložísk indukovaných prostredníctvom v-src a Ha-Ras Val 12 asi o 50 %. Tento účinok potvrdzuje špecifickú antagonistickú schopnosť transformácie prostredníctvom v-src a Ha-Ras onkogénneho, pretože polypeptid Δρ62 nepôsobí na tvorbu ložísk indukovaných prostredníctvom v-Raf. Okrem toho, sledovaný účinok nie je viazaný na toxicitu produktu, pretože počet kolónií rezistentných proti neomycínu po transfekcii prostredníctvom proteínu p62, polypeptidu Δρ62 alebo prázdneho vektora je porovnateľný. Tieto výsledky teda potvrdzujú inhibičnú úlohu molekúl podľa vynálezu v procese transformácie indukovanom onkogénmi. Rovnako potvrdzujú vhodnosť týchto produktov na korekciu procesov bunkovej proliferácie indukovaných onkogénmi, ako aj nástroje na identifikáciu ďalších molekúl buď aktívnych, a/alebo podieľajúcich sa na signalizácii týchto onkogénov.

Príklad 7

Dôkaz interakcie s src in vivo

Tento príklad názorne opisuje štúdiu interakcie polypeptidu Δρ62 s ďalšími molekulami. Dokazuje celkom jasne, že proteín p62 a polypeptid Δρ62 dokážu vstúpiť do interakcie in vivo so src.

Fibroblasty NIH3T3 boli transfekované vektorom expresie proteínu p62 alebo polypeptidu Δρ62 obsahujúcom marker myc („myc teg“) (príklad 2). Transfekované bunky boli udržiavané v asynchrónnom raste alebo blokované v mitotickej fáze nocodazolom. Bunky boli potom kotransfekované expresným vektorom v-Src alebo prázdnym. Po 48 hodinách boli bunky lyzované a utvorené komplexy boli imunodetekované pomocou protilátok anti-myc (protilátka 9E10) a anti-Src (protilátka N16).

Dosiahnuté výsledky dokazujú, že proteín p62 a polypeptid Δρ62 dokážu vstúpiť do interakcie in vivo so src. Okrem toho, zatiaľ čo interakcie medzi p62 a src prebiehajú, ako sa zdá, výlučne v mitotických bunkách, polypeptid Δρ62 viaže src dokázateľne dokonca i v bunkách asynchrónnych. Táto interakcia je zintenzívnená v bunkách mitotických.

ZOZNAM SEKVENCIÍ

GGT GTT 960

GGA

CCA

CCT

CGG

GGG

CCT

TTG

CTA

CGT

GGT

ACA

CCA

GTA

AGG

Gly val

Gly

Pro

Pro

Arg

Gly

Ala

Leu

val

Arg

Gly

Thr

Pro

Val

Arg

INFORMÁCIE 0 SEQ ID č. 1

305

310

315

320

Charakteristika sekvencie:

GGA GCC 1008

ATC

ACC

AGA

GGT

GCC

ACT

GTG

ACT

CGA

GGC

GTG

CCA

CCC

CCA

(A) DÍžka : 1332 párov báz

Gly Ala

íle

Thr

Arg 325

Gly

Ala

Thr

Val

Thr 330

Arg

Gly

Val

Pro

Pro 335

Pro

(B) Typ : nukleotid

CCT ACT

GTG

AGG

CCA

GCA

CCA

GCA

CGG

ACA

GCG

GGC

ATC

(C) Počet vlákien : jedno

1056

AGA

(D) Konfigurácia : lineárna

Pro Thr

Val

Arg 340

Gly

Ala

Pro

Ala

Pro 345

Arg

Ala

Arg

Thr

Ala 35C

Gly

íle

Typ molekuly: cDNA

CAG AGG

ATA

CCT

TTG

CCT

CCA

CCT

CCT

GCA

CCA

GAA

ACA

TAT

GAA

GAA

Hypotetická : nie

1104 Gin Arg

íle

Pro

Leu

Pro

Pro

Pro

Pre

Ala

Pro

Glu

Thr

Tyr

Glu

Glu

Antimediátorová: nie

355

360

365

Popis sekvencie : SEQ ID č. 1

TAT GGA 1152

TAT

GAT

GAT

ACA

TAC

GCA

GAA

CAA

AGT

TAC

GAA

GGC

TAC

GAA

ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC GCG

CGC

ATG

AGC

CGG

TCT

TCG

GGC

Tyr Gly

Tyr

Asp

Asp

Thr

Tyr

Ala

Glu

Gin

Ser

Tvr

Glu

Gly

Tyr

Glu

48 Met Gin Arg Arq Asp Asp Pro Ala Ala

Arg

Met

Ser

Arg

Ser

Ser

Gly

370

375

380

1 5

10

15

GGC TAT 1200

TAC

AGC

CAG

AGT

CAA

GGG

GAC

TCA

GAA

TAT

TAT

GAC

TAT

GGA

CGT AGC GGC TCC ATG GAC CCC TCC GGT

GCC

CAC

CCC

TCG

GTG

CGT

CAG

Gly Tyr

Tyr

Ser

Gin

Ser

Gin

Gly

Asp

Ser

Glu

Tyr

Tyr

Asp

Tyr

Gly

96 Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Sex Gly

Ala

H1S

Pro

Ser

val

Arg

Gin

385

390

395

400

20 25

30

CAT GGG

GAG

GTT

CAA

GAT

rcr

TAT

GAA

GCT

TAT

GGC

CAG

GAC

GAC

TGG

ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG CCT 144

CAC

CGG

TCC

CGG

GGA

GGC

GGA

1248 His Gly

Glu

Val

Gin

Asp

Ser

Tyr

Glu

Ala

Tyr

Gly

Gin

Asp

Asp

Trp

405

410

415

Thr pro ser Arg Gin Pro Pro Leu Pro 3S 40

Hla

Arg

Ser

Arg 45

Gly

Gly

Gly

AAT GGG 1296

ACC

AGG

CCG

TCG

CTG

AAG

GCC

CCT

CCT

GCT

AGG

CCA

GTG

AAG

GGC GGA TCC CGC GGG GGC GCC CGG GCC 192

TCG

CCC

GCC

ACG

CAG

CCG

CCA

Aan Gly

Thr

Arg

Pro

Ser

Leu

Lys

Ala

Pro

Pro

Ala

Arg

Pro

Val

Lys

Gly Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala

Ser

Pro

Ala

Thr

Gin

Pro

Pro

420

425

430

50 55

60

GGA GCA

TAC

AGA

GAG

CAC

CCA

TAT

GGA

CGT

TAT

TAA

CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT

CCC

GAC

GCG

ACA

GTG

GGC

GGG

1332

240

Gly Ala

Tyr

Arg

G1U

HiS

Pro

Tyr

Gly Arg Tyr

*

Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly 65 70

Pro

ASp 7S

Ala

Thr

Val

Gly

Gly 80

435

440

CCA

GCG

CCG

ACC

CCG

CTG

CTG

CCC

CCC

TCG

GCC

ACA

GCC

TCG

GTC

AAG

288 Pro

Ala

Pro

Thr

Pro

Leu

Leu

Pro

Pro

Ser

Ala

Thr

Ala

Ser

Val

Lys

INF

ORMACIE O

SE

QI

Dč

í. 2

85

90

95

Charak

téri

stik

a se

:kvi

sne:

ie:

ATG

GAG

CCA

GAG

AAC

AAG

TAC

CTG

CCC

GAA

CTC

ATG

GCC

GAG

AAG

GAC

(A)

Dlž

ka:

12

15 párov báz

Met

Glu

Pro

Glu

Asn

Lys

Tyr

Leu

Pro

Glu

Leu

Het

Ala

Glu

Lys

Asp

(B)

Typ

>: n

ukl·

eoti

d

ioo

105

110

(C)

Poč

etv

lák

ien

:je.

dno

TCG 384

CTC

GAC

CCG

TCC

TTC

ACT

CAC

GCC

ATG

CAG

CTG

CTG

ACG

GCA

GAA

(D)

Konfig

urá

cia

: lineárna

Ser

Leu

Asp 115

Pro

Ser

Phe

Thr

H13 120

Ala

Met

Gin

Leu

Leu 125

Thr

Ala

Glu

Typ

mo

dcki

uly

: cDNA

ATT

GAG

AAG

ATT

CAG

AAA

GGA

GAC

TCA

AAA

AAG

GAT

GAT

GAG

CAG

AAT

Hyp

Otei

tick

á: nie

432 íle

Glu

Lys

íle

Gin

Lys

Gly

Asp

Ser

Lys

Lys

Asp

Asp

Glu

Glu

Asn

Anti

ime

diát

oro

vá:

: nie

130

135

1 40

Pop

ÍS S(

:kvi

^nci

ie :

SEQ ID č.

2:

TAC

TTG

GAT

TTA

TTT

TCT

CAT

AAC

AAC

ATG

AAA

CTG

AAA

GAG

CGA

GTG

ATG

CAG

CGC

CGG

GAC

GAC

CCC

GCC

GCG

CGC

ATG

AGC

CGG

TCT

TCG

GGC

480

48

Tyr

Leu

Asp

Leu

Phe

Ser

KiS

Lys

Asn

Met

Lys

Leu

Lys

Glu

Arg

Val

Met

Gin

Arg

Arg

ASO

Asp

pro

Ala

Ala

Arg

Met

Ser

Arg

Ser

Sex

Gly

145

150

155

160

1

5

1 0

15

CTG

ATA

CCT

GTC

AAG

CAG

TAT

CCC

AAG

TTC

AAT

TTT

GTG

GGG

AAG

ATT

CGT

AGC

GGC

TCC

ATG

GAC

CCC

TCC

GGT

GCC

CAC

CCC

TCG

GTG

CGT

CAG

528

96

Leu

íle

Pro

Val

Lys

Gin

Tyr

Pro

Lys

Phe

Asn

Phe

val

Gly

Lys

íle

Arg

Ser

Gly

Ser

Met

Asp

Pro

Ser

Gly

Ala

His

Pro

Ser

Val

Arg

Gin

165

170

175

20

25

30

CTT 576

GGA

CCA

CAA

GGG

AAT

ACA

ATC

AAA

AGA

CTG

CAG

GAA

GAG

ACT

GGT

ACG

CCG

TCT

CGG

CAG

CCG

CCG

CTG

CCT

CAC

CGG

TCC

CGG

GGA

GGC

GGA

Leu

Gly

Pro

Gin 180

Gly

Asn

Thr

íle

Lys 185

Arg

Leu

Gin

Glu

Glu 190

Thr

Gly

144 Thr

Pro

Sar 35

Arg

Gin

Pro

Pro

Leu 40

Pro

His

Arg

Ser

Arg 45

Gly

Gly

Gly

GCA 624

AAG

ATC

TCT

GTA

TTG

GGA

AAG

GGC

TCA

ATG

AGA

GAC

AAA

GCC

AAG

GGG

GGA

TCC

CGC

GGG

GGC

GCC

CGG

GCC

TCG

CCC

GCC

ACG

CAG

CCG

CCA

Ala

Lys

íle 195

Ser

Val

Leu

Gly

Lys 200

Gly

Ser

Met

Arg

Asp 205

Lys

Ala

Lys

192 Gly

Gly

ser

Arg

Gly

Gly

Ala

Arg

Ala

ser

Pro

Ala

Thr

Gin

Pro

Pro

50

55

60

GAG

GAA

GAG

CTG

CGC

AAA

GGT

GGA

GAC

CCC

AAA

TAT

GCC

CAC

TTG

AAT

GCG

ACA

GTG

GGC

GGG

672

CCG

CTG

CTG

CCG

CCC

TCG

GCC

ACG

GGT

CCC

GAC

Glu

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

Gly

Gly

Asp

Pro

Lys

Tyr

Ala

His

Leu

Asn

240

Gly

Ala

Thr

Val

Gly

Gly

210

215

220

Pro

Leu

Leu

Pro

Pro

Ser

Ala

Thr

Pro

Asp

65

70

75

60

ATG

GAT

CTG

CAT

CTC

TTC

ATT

GAA

GTC

TTT

GGA

CCC

CCA

TGT

GAG

GCT

GTC

AAG

720

CCA

GCG

CCG

ACC

CCG

CTG

CTG

CCC

CCC

TCG

GCC

ACA

GCC

TCG

288

Met

Asp

Leu

His

Val

Phe

íle

Glu

Val

Phe

Gly

Pro

Pro

Cys

Glu

Ala

Pro

Ala

Pro

Thr

Pro

Leu

Leu

Pro

Pro

Ser

Ala

Thr

Ala

Ser

Val

Lys

225

230

235

240

85

90

95

TAT

GCT

CTT

ATG

GCC

CAT

CCC

ATC

CAG

CAA

GTC

AAG

AAA

TTT

CTA

GTA

ATG

GAG

CCA

GAG

AAC

AAG

TAC

CTG

CCC

GAA

CTC

ATG

GCC

GAG

AAG

GAC

768

336

Glu

Asp

Tyr

Ala

Leu

Met

Ala

His

Ala

Met

Glu

Glu

Val

Lys

Lys

Phe

Leu

val

Met

Glu

Pro

Glu

Asn

Lys

Tyr

Leu

Pro

Glu

Leu

Met

Ala

Lys

245

250

255

100

105

110

CCG

GAT

ATG

ATG

GAT

GAT

ATC

TGT

CAG

GAG

CAA

TTT

CTA

GAG

CTG

TCC

TCG

CTC

GAC

CCG

TCC

TTC

ACT

CAC

GCC

ATG

CAG

CTG

CTG

ACG

GCA

CAA

816

384

Ala

Glu

Pro

Asp

Met

Met

Asp

Asp

íle

Cys

Gin

Glu

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Asp

Pro

Ser

Phe

Thr

His

Ala

Met

Gin

Leu

Leu

Thr

260

265

270

115

120

125

TAC

TTG

AAT

GGA

GTA

CCT

GAA

CCC

TCT

CGT

GGA

CGT

GGG

GTG

CCA

GTG

ATT

GAG

AAG

ATT

CAG

AAA

GGA

GAC

TCA

AAA

AAG

GAT

GAT

GAG

GAG

AAT

864

432

Tyr

Leu

Asn

Gly

Val

Pro

G1U

Pro

Ser

Arg

Gly

Arg

Gly

val

Pro

Val

íle

Glu

Lys

íle

Gin

Lys

Gly

Asp

Ser

Lys

Lys

Asp

Asp

Glu

Glu

Asn

275

280

285

1 30

135

140

AGA

GGC

CGG

GGA

GCT

GCA

CCT

CCT

CCA

CCA

CCT

GTT

CCC

AGG

GGC

CGT

TAC

TTG

GAT

TTA

TTT

TCT

CAT

AAG

AAC

ATG

AAA

CTG

AAA

GAG

CGA

GTG

912

480

Arg

Gly

Arg

Gly

Ala

Ala

Pro

Pro

Pro

Pro

Pro

Val

Pro

Arg

Gly

Arg

Tyr

Leu

Asp

Leu

Phe

Ser

His

Lys

Asn

Met

Lys

Leu

Lys

Glu

Arg

Val

290

295

300

145

150

155

160

CTG ΑΓΑ CCT GTC AA3 CAC TAT CCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT 520

Leu íle Pro Val Lys Gin Tyr Pro Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly

165 170 175

SK 283071 Β6

GGA GAC 576

ccc Pro

AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT

Gly

Asp

Lys Tyr Ala His Leu Asn Met Asp Leu His Val Phe

íle

180

185

190

GAA 624

GTC

TTT

GGA

CCC

CCA

TGT

GAG

GCT

TAT

GCT

CTT

ATG

GCC

CAT

GCC

Glu

Val

Phe 195

Gly

Pro

Pro

Cys

Glu 200

Ala

Tyr

Ala

Leu

Met 205

Ala

His

Ala

ATG 672

GAG

GAA

GTC

AAG

AAA

TTT

CTA

GTA

CCG

GAT

ATG

ATG

GAT

GAT

ATC

Met

Glu 210

Glu

Val

Lys

Lys

Phe 215

Leu

Val

Pro

Asp

Met 220

Met

Asp

Asp

íle

TGT 720

CAG

GAG

CAA

TTT

CTA

GAG

CTG

TCC

TAC

TTG

AAT

GGA

GTA

CCT

GAA

Cys 22S

Gin

Glu

Gin

Phe

Leu 230

G1U

Leu

Ser

Tyr

Leu 235

Asn

Gly

Val

Pro

Glu 240

ccc 768

TCT

CCT

GGA

CGT

GGG

GTG

CCA

GTG

AGA

GGC

CGG

GGA

GCT

GCA

CCT

Pro

Ser

Arg

Gly

Arg 245

Gly

Val

Pro

val

Arg 250

Gly

Arg

Gly

Ala

Ala 255

Pro

cer 816

CCA

CCA

CCT

GTT

CCC

AGG

GGC

CGT

GGT

GTT

GGA

CCA

CCT

CGG

GGG

Pro

Pro

Pro

Pro 260

Val

Pro

Arg

Gly

Arg 265

Gly

Val

Gly

Pro

Pro 270

Arg

Gly

GCT 864

TTG

GTA

CGT

GGT

ACA

CCA

GTA

AGG

GGA

GCC

ATC

ACC

AGA

GGT

GCC

Ala

Leu

Val 275

Arg

Gly

Thr

Pro

Val 280

Arg

Gly

Ala

íle

Thr 285

Arg

Gly

Ala

ACT 912

GTG

ACT

CGA

GGC

GTG

CCA

CCC

CCA

CCT

ACT

GTG

AGG

GGT

GCT

CCA

Thr

Val 290

Thr

Arg

Gly

val

Pro 295

Pro

Pro

Pro

Thr

Val 300

Arg

Gly

Ala

Pro

GCA 960

CCA

AGA

GCA

CGG

ACA

GCG

GGC

ATC

CAG

AGG

ATA

CCT

TTG

CCT

CCA

Ala 305

Pro

Arg

Ala

Arg

Thr 310

Ala

Gly

íle

Gin

Arg 315

íle

Pro

Leu

Pro

Pro 320

CCT

CCT

GCA

CCA

GAA

ACA

TAT

GAA

GAA

TAT

GGA

TAT

GAT

GAT

ACA

TAC

1008

Pro Pro

Ala

Pro

G1U

Thr

Tyr

Glu

Glu

Tyr

Gly

Tyr

Asp

Asp

Thr

Tyr

325

330

335

GCA GAA

CAA

AGT

TAC

GAA

GGC

TAC

GAA

GGC

TAT

TAC

AGC

CAG

AGT

CAA

1056

Ala Glu

Gin

Ser

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Tyr

Ser

Gin

Ser

Gin

340

345

350

GGG GAC

TCA

GAA

TAT

TAT

GAC

TAT

GGA

CAT

GGG

GAG

GTT

CAA

GAT

TCT

1104

Gly Asp

ser

Glu

ryr

Tyr

Asp

Tyr

Gly

His

Gly

Glu

val

Gin

Asp

Ser

355

360

365

TAT GAA

GCT

TAT

GGC

CAG

GAC

GAC

TGG

AAT

GGG

ACC

AGG

CCG

TCG

CTG

1152

Tyr Glu

Ala

Tyr

Gly

Gin

Asp

Asp

Trp

Asn

Gly

Thr

Arg

Pro

Ser

Leu

370

375

380

AAG GCC

CCT

CCT

' GCT

AGG

CCA

GTG

AAG

GGA

GCA

TAC

AGA

GAG

; CAC CCA

1200

Lys Ala

Pro

Pro

Ala

Arg

Pro

Val

Lys

Gly

Ala

Tyr

Arg

Glu

. His Pro

385

390

395

400

ATG AGA 48

GAC Asp

AAA GCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT GGA GAC CCC

Lys Ala Lys 5

Glu

Glu

Glu

Leu 10

Arg

Lys

Gly Cly

Asp 15

Pro

Met 1

Arg

AAA

TAT

GCC

CAC

TTG

AAT

ATG

GAT

CTG

CAT

GTC

TTC

ATT

GAA

GTC

TTT

96

Lys

Tyr

Ala

His

Leu

Asn

Met

Asp

Leu

KiS

Val

Phe

íle

Glu

Val

Phe

20

25

30

GGA

CCC

CCA

TGT

GAG

GCT

TAT

GCT

CTT

ATG

GCC

CAT

GCC

ATG

GAG

GAA

144

Gly

Pro

Pro

Cys

Glu

Ala

Tyr

Ala

Leu

Met

Ala

His

Ala

Met

Glu

Glu

35

40

45

GTC

AAG

AAA

TTT

CTA

GTA

CCG

GAT

ATG

ATG

GAT

GAT

ATC

TGT

CAG

GAG

192

Val

Lys

Lys

Phe

Leu

Val

Pro

Asp

Met

Met

Asp

Asp

íle

Cys

Gin

Glu

50

55

60

CAA

TTT

CTA

GAG

CTG

TCC

TAC

TTG

AAT

GGA

GTA

CCT

GAA

ccc

TCT

CGT

240

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Ser

Tyr

Leu

Asn

Gly

Val

Pro

Glu

Pro

Ser

Arg

65

70

75

80

GGA

CGT

GGG

GTG

CCA

GTG

AGA

GGC

CGG

GGA

GCT

GCA

CCT

CCT

CCA

CCA

288

Gly

Arg

Gly

val

Pro

val

Arg

Gly

Arg

Gly

Ala

Ala

Pro

Pro

Pro

Pro

B5

90

95

CCT

GTT

CCC

AGG

GGC

CGT

GGT

GTT

GGA

CCA

CCT

CCG

GGG

GCT

TTG

GTA

336

Pro

Val

Pro

Arg

Gly

Arg

Gly

Val

Gly

Pro

Pro

Arg

Gly

Ala

Leu

Val

100

105

110

CGT

GGT

ACA

CCA

GTA

AGG

GGA

GCC

ATC

ACC

AGA

GGT

GCC

ACT

GTG

ACT

384

Arg

Gly

Thr

Pro

Val

Arg

Gly

Ala

íle

Thr

Arg

Gly

Ala

Thr

val

Thr

115

120

125

CGA

GGC

GTG

CCA

CCC

CCA

CCT

ACT

GTG

AGG

GGT

GCT

CCA

GCA

CCA

AGA

432

Arg

Gly

val

Pro

Pro

Pro

Pro

Thr

Val

Arg

Gly

Ala

Pro

Ala

Pro

Arg

130

135

140

GCA

CGG

ACA

GCG

GGC

ATC

CAG

AGG

ATA

CCT

TTG

CCT

CCA

CCT

CCT

GCA

480

Ala

Arg

Thr

Ala

Gly

íle

Gin

Arg

íle

Pro

Leu

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala

145

150

155

160

CCA

GAA

ACA

TAT

GAA

GAA

TAT

GGA

TAT

GAT

GAT

ACA

TAC

GCA

GAA

CAA

528

Pro

Glu

Thr

Tyr

Glu

Glu

Tyr

Gly

Tyr

Asp

Asp

Thr

Tyr

Ala

Glu

Gin.

165

170

175

AGT

TAC

GAA

GGC

TAC

GAA

GGC

TAT

TAC

AGC

CAG

AGT

CAA

GGG

GAC

TCA

576

Ser

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Tyr

Ser

Gin

Ser

Gin

Gly

Asp

Ser

180

185

190

GAA

TAT

TAT

GAC

TAT

GGA

CAT

GGG

GAG

GTT

CAA

GAT

TCT

TAT

GAA

GCT

624 Glu

Tyr

Tyr

Asp

Tyr

Gly

His

Gly

Glu

Val

Gin

Asp

Ser

Tyr

G1U

Ala

195

200

205

TAT

GGC

CAG

GAC

GAC

TGG

AAT

GGG

ACC

AGG

CCG

TCG

CTG

AAG

GCC

CCT

672

Tyr

Cly

Gin

Asp

Asp

Trp

Asn

Gly

Thr

Arg

Pro

Ser

Leu

Lys

Ala

Pro

210

215

220

CCT

GCT

AGG

CCA

GTG

AAG

GGA

GCA

TAC

AGA

GAG

CAC

CCA

TAT

GGA

CGT

720

Pro

Ala

Arg

Pro

Val

Lys

Gly

Ala

Tyr

Arg

Glu

His

Pro

Tyr

Gly

Arg

225

230

235

240

TAT TAA

726

Tyr *

TAT GGA GGT TAT TAA 1215

Tyr Gly Arg Tyr ·

405

INFORMÁCIE O SEQ ID č. 3 :

Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 726 párov báz (B) Typ: nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: cDNA Hypotetická : nie Antimediátorová: nie

Popis sekvencie : SEQ ID č. 3 :

INFORMÁCIE O SEQ ID č. 4 : Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka ; 24 párov báz (B) Typ: nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: cDNA

Hypotetická: nie

Antimediátorová: nie

Popis sekvencie: SEQ ID č. 4 : CAGCTGCTGA CGGCAGAAAT TGAG

INFORMÁCIE O SEQ ID č. 5 : Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 24 párov báz (B) Typ : nukleotid (C) Počet vlákien . jedno (D) Konfigurácia: lineárna Typ molekuly: cDNA Hypotetická: nie Antimediátorová: nie

Popis sekvencie : SEQ ID č. 5 : TTAATAACGT CCATATGGGT GCTC

INFORMÁCIE O SEQ ID č. 6 :

Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka : 24 párov báz (B) Typ : nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia: lineárna Typ molekuly : cDNA Hypotetická: nie Antimediátorová: nie

Popis sekvencie : SEQ ID č. 6 : CAGTATCCCA AGGAAGGAAGA GCTC

INFORMÁCIE O SEQ ID č. 71 :

Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka : 24 párov báz (B) Typ : nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: cDNA

Hypotetická : nie Antimediátorová: nie

Popis sekvencie : SEQ ID č. 7 : CTGTCAAGCA GTATCCCAAG GAGG

INFORMÁCIE O SEQ ID č. 8 :

Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka : 24 párov báz (B) Typ: nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia: lineárna Typ molekuly: cDNA

Hypotetická: nie Antimediátorová: nie

Popis sekvencie : SEQ ID č. 8 : AAGGGCTCAA TGAGAGACAA AGCC

INFORMÁCIE O SEQ ID č. 9 :

Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka : 24 párov báz (B) Typ: nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia : lineárna Typ molekuly : cDNA Hypotetická: nie Antimediátorová: nie

Popis sekvencie : SEQ ID č. 9 : GTATGTATCA TCATATCCAT ATTC

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Derivát proteínu p62 schopný čiastočne inhibovať interakciu medzi proteínom GAP a p62, vyznačujúci sa tým, že obsahuje deléciu aspoň 10 aminokyselín v oblasti medzi aminokyselinovými zvyškami 145-247, čím stráca schopnosť proteínu p62 vstúpiť do interakcie s RNA a že obsahuje väčšinu z oblasti aminokyselín medzi 200 až 450 proteínu p62, ktorá má fosforylované tyrozíny lokalizované medzi zvyškami 200 a 450, umožňujúcu interakciu s oblasťou SH2 proteínu GAP.
2. 2. Derivát podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že inhibuje signály prenášané prostredníctvom ras.
3. 3. Derivát podľa nárokov la 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje deléciu aspoň 10 aminokyselín medzi aminokyselinovými zvyškami 145 až 247 v oblasti homológie s proteínom GRP33.
4. 4. Derivát podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ide o polypeptid obsahujúci celú sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo jej časť, alebo jej variant, ktorý kóduje polypeptid zachovávajúci si uvedené vlastnosti.
5. 5. Polypeptid Δρ62 so sekvenciou SEQ ID NO: 2.
6. 6. Derivát podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vo väčšine oblasť nesúcu fosforylované tyrozíny proteínu p62.
7. 7. Derivát podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že ide o polypeptid obsahujúci celú sekvenciu SEQ ID NO: 3 alebo jej časť, ktorá kóduje polypeptid zachovávajúci si uvedené vlastnosti.
8. 8. Polypeptid p62-C so sekvenciou SEQ ID NO: 3.
9. 9. Nukleová kyselina kódujúca polypeptid podľa nárokov 1 až 8.
10. 10. Nukleová kyselina podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že ide o cDNA alebo RNA.
11. 11. Nukleová kyselina podľa nárokov 9 alebo 10, vyznačujúca sa tým, že je zvolená z množiny zahrnujúcej:

    (a) celok alebo časť sekvencie SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 3, alebo jej komplementárneho vlákna, (b) sekvenciu hybridizujúcu so sekvcnciami (a) a kódujúcu derivát podľa nároku 1 a (c) varianty (a) a (b) vyplývajúce z degenerácie genetického kódu.
12. 12. Nukleová kyselina so sekvenciou SEQ ID NO: 2.
13. 13. Nukleová kyselina so sekvenciou SEQ IDNO: 3.
14. 14. Expresná kazeta obsahujúca nukleovú kyselinu podľa nárokov 9 až 13, ďalej promótor umožňujúci jej expresiu a signál ukončenia transkripcie.
15. 15. Vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa nároku 9 až 13 alebo kazetu podľa nároku 14.
16. 16. Vektor podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že ide o vektor plazmidový.
17. 17. Vektor podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že ide o vektor vírusový.
18. 18. Vektor podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že vírusový vektor je odvodený z adeno vírusu, retrovírusu, vírusu AAV alebo herpetického vírusu.
19. 19. Defektný rekombinantný retrovirus, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 9 až 13 alebo kazetu podľa nároku 14.
20. 20. Defektný rekombinantný adenovírus, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 9 až 13 alebo kazetu podľa nároku 14.
21. 21. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň nukleovú kyselinu podľa nároku 9.
22. 22. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň jeden vektor podľa nároku 15.
23. 23. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň jeden derivát podľa nároku 1.
24. 24. Farmaceutická kompozícia podľa nárokov 21 až 23 na použitie na liečenie rakoviny.
25. 25. Použitie nukleovej kyseliny podľa nároku 9 alebo vektora podľa nároku 15 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na ošetrenie hyperproliferatívnych porúch.