SK283071B6 - Proteín Deltap62, jeho varianty, nukleotidové sekvencie a ich využitie - Google Patents

Proteín Deltap62, jeho varianty, nukleotidové sekvencie a ich využitie Download PDF

Info

Publication number
SK283071B6
SK283071B6 SK1613-97A SK161397A SK283071B6 SK 283071 B6 SK283071 B6 SK 283071B6 SK 161397 A SK161397 A SK 161397A SK 283071 B6 SK283071 B6 SK 283071B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
nucleic acid
vector
polypeptide
seq
protein
Prior art date
Application number
SK1613-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK161397A3 (en
Inventor
Fabien Schweighoffer
Bruno Tocque
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of SK161397A3 publication Critical patent/SK161397A3/sk
Publication of SK283071B6 publication Critical patent/SK283071B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Je opísaný nový derivát polypeptidu p62 označený ako Deltap62, jeho varianty, príslušné nukleotidové sekvencie a ich využitie, najmä v protirakovinovej génovej terapii. Derivát proteínu p62 je schopný inhibovať signály medzi proteínom GAP a p62 prenášané prostredníctvom ras.ŕ

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka nového polypeptidu označeného Δρ62, jeho variantov, zodpovedajúcich nukleotidových sekvencií a ich terapeutického využívania, najmä v protirakovinovej génovej terapii.
Doterajší stav techniky
Rôzne gény, nazývané onkogény a gény supresory, sa podieľajú na kontrole bunkového delenia. Z nich gény ras a ich produkty označované všeobecne ako proteiny p21, hrajú kľúčovú úlohu v procese kontroly bunkového delenia pri všetkých eukaryotických organizmoch, pri ktorých boli sledované. Dokázalo sa, že niektoré špecifické modifikácie týchto proteínov u nich zapríčiňujú stratu ich normálnej kontroly a podieľajú sa tak na tom, že sa menia na onkogénne. Veľký počet tumorov zistených u ľudí sa dával do súvislosti s prítomnosťou týchto modifikovaných génov ras. Rovnako tiež určitá superexpresia týchto proteínov p21 môže viesť k narušeniu bunkového delenia. Pochopenie presnej úlohy týchto proteínov p21 v bunkách, ich funkcie a ich charakteristiky je základným problémom pochopenia a terapeutiky karcinogenézy.
V prípade in vivo nepoznáme presnú povahu týchto procesov zodpovedných za prenos signálu iniciovaného proteínmi p21. Predsa však stále väčší počet výsledkov zdôrazňuje množstvo efektorov, ktoré sú v priamej a preferenčnej interakcii s aktívnou formou (viazanou na GTP) proteínov ras. Z týchto efektorov bol proteín GAP prvý, ktorého implikácia do procesu prenosu signálu bola podrobne zdokumentovaná. Ide o cytozolický proteín prítomný vo všetkých eukaryotických organizmoch, ktorý má schopnosť výrazne urýchľovať hydrolýzu GTP viazaného na normálny proteín. Má dve oblasti, ktoré zabezpečujú rozdielne funkcie. Jeho karboxyterminálny koniec zahŕňa katalytickú aktivitu, ktorá je v interakcii s proteínmi p21 a ktorá zvyšuje ich GTP-ázovú aktivitu GTP-ázy. Na jeho druhom, N-terminálnom konci zaznamenávame juxtapozíciu oblastí SH2 a SH3, ktoré sa zúčastňujú na prenose signálu a sú v interakcii s ďalšími proteínmi. Medzi týmito proteínmi sú dva proteiny, p62 a p 190, respektíve 62 kDa a 190 kDa, ktoré sú výrazne fosforylované na tyrozíne. Tieto dva proteíny tvoria špecifický komplex s GAP a sú imunoprecipitované protilátkami zameranými proti rôznym epitopom GAP. Je známe, že práve na úrovni oblasti SH2 GAP prebiehajú interakcie proteínov p62 s GAP. Aminokyseliny 271 až 433 proteínu p62 obsahujú fosforylované tyrozíny a zúčastňujú sa pravdepodobne na týchto interakciách. Rovnaké fosforylácie sa pravdepodobne podieľajú na interakciách medzi proteínom p62 a adaptorom GRB2. Na druhej strane, v celom rozsahu sekvencie proteínu p62, sú rozložené miesta obohatené prolínmi, ktoré sa zúčastňujú na väzbe s oblasťami SH3 tyrozínkináz rodiny src ako aj fosfolipázy C.
Proteín p62 (alebo Sam68) bol identifikovaný Wongom (Celí 69 (1992) 551). Obsahuje 433 aminokyselín, ktorých sekvencie boli opísané v odbornej literatúre (pozri SEQ ID č. 1). Okrem uvedenej charakteristiky má proteín p62 niektoré znaky charakteristické pre hnRNP („heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein“):
- je bohatý na glyciny,
- obsahuje oblasti bohaté na arginíny,
- okrem toho ešte aminokyseliny 145 až 247 definujú oblasť výrazne homologickú s opísaným hnRNP, totiž GRP33.
Táto oblasť zahŕňa miesto väzby na sRNA homologickú s miestom prítomným v hnRNP K. Toto miesto je označené ako KH oblasť (KH = hnRNPK Homolog). Zachované rezíduá sú dôležité na väzbu na sRNA a vplyv nulovej integrity tejto oblasti v patológii bol dokázaný pre FMR1, čo je produkt génu dávaného do súvislosti s mentálnou retardáciou, ktorý je pozorovaný pri syndróme X-fragilného chromozómu (Siomi, Celí 17 (1994) 33).
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález spočíva predovšetkým v dokázaní významu proteínu p62 (Sam68) na delenie a ničenie buniek. Vychádza hlavne z dokázanej skutočnosti, že deriváty proteínu p62 sú schopné zasahovať do procesu bunkovej transformácie a zvlášť potom inhibovať signály prenášané proteínmi ras a src. Ďalej potom vychádzajú z prekvapivého dôkazu skutočnosti, že tieto deriváty majú rovnako apoptické vlastnosti a že sú teda schopné indukovať smrť buniek.
Prvý predmet predkladaného vynálezu sa týka derivátu proteínu p62, ktorý je schopný inhibovať aspoň čiastočne interakciu medzi proteínom GAP a p62. Deriváty podľa predkladaného vynálezu sú schopné prednostne inhibovať aspoň do istej miery onkogénnu schopnosť proteínov ras a/alebo src. Ešte výraznejšie preferenčne sú deriváty podľa vynálezu schopné indukovať smrť buniek apoptózou. Deriváty podľa vynálezu sú charakterizované stratou schopnosti spolupôsobiť s RNA p62.
Predkladaný vynález opisuje zvlášť dôkaz, klonovanie a charakteristiku prirodzenej izoformy proteínu p62. Táto izoforma označená ako Δρ62 (alebo ASam68) má deléciu v oblasti homológie s proteínom GRP33, ktorý pokrýva oblasť KH. Na základe tejto delécie polypeptidu Δρ62 chýba integrita vlastností proteínu p62. Takže polypeptid Δρ62 má intaktnú oblasť interakcie s GAP a GRB2, ako aj jednotlivé sekvencie bohaté na partnerské prolíny SH3 (obr. 1). Predsa však polypeptid Δρ62 nie je schopný vstúpiť do interakcie s nukleovými kyselinami v dôsledku delécie oblasti homológie s proteínom GRP33. Prihlasovateľ rovnako dokázal, že transfer cDNA polypeptidu Δρ62 do rôznych normálnych alebo nádorových bunkových modelov pôsobí proti súčinnosti medzi p62 a Ras a inhibuje signály prenášané normálnymi a onkogénnymi proteínmi Ras. Superexprimovaný Δρ62 interferuje s proliferačnými a diferenciačnými procesmi a vyúsťuje pri jednotlivých bunkových modeloch v smrť bunky v dôsledku apoptózy.
Predkladaný vynález sa týka najmä akéhokoľvek derivátu p62 prinášajúceho prinajmenšom deléciu do oblasti homológie s proteínom GRP33. Hlavne však deriváty podľa predkladaného pripúšťajúce deléciu v oblasti medzi rezíduami 145 až 247 proteínu p62, ako je zobrazená na sekvencii SEQ ID č. 1 a ktorá pokrýva oblasť KH. Delécia sa týka viac ako 10 aminokyselín a hlavne viac ako 30 aminokyselín. Môže sa týkať jedného alebo viac miest vnútri tejto oblasti, hneď ako vznikajúce deriváty vykážu opísané vlastnosti.
Výhodná je skutočnosť, že derivát podľa predkladaného vynálezu je polypeptid obsahujúci celok alebo časť sekvencie SEQ ID č. 2 alebo jej variant. Termín variant v zmysle predkladaného vynálezu označuje akýkoľvek polypeptid, ktorého štruktúra sa odlišuje od sekvencie SEQ ID č. 2 jednou alebo viacerými modifikáciami genetickej, biochemickej a/alebo chemickej povahy. Môže ísť zvlášť o mutáciu, substitúciu, deléciu, adíciu a/alebo modifikáciu jedného alebo niekoľkých rezíduí. Takéto deriváty môžu byť generované s rôznym cieľom, najmä však s cieľom zvýšiť afinitu peptidu k jeho interakčnému miestu, zlepšiť jeho úroveň produkcie, zvýšiť jeho odolnosť proti proteázam alebo zlepšiť jeho prechod bunkovými membránami, zvýšiť jeho terapeutickú účinnosť či znížiť jeho vedľajšie účinky, alebo mu prideliť nové farmakokinetické a/alebo biologické vlastnosti. Jednotlivé varianty zahrnujú delécie alebo mutácie vzťahujúce sa na aminokyseliny, ktorých prítomnosť nie je rozhodujúca pokiaľ ide o aktivitu derivátu. Takéto aminokyseliny môžu byť identifikované napríklad pomocou testov bunkovej aktivity, ako je opísané v uvedených príkladoch.
Deriváty podľa predkladaného vynálezu obsahujú aspoň časť proteínov p62 umožňujúcu interakciu s oblasťou SH2 GAP. Táto časť proteínu p62 je tvorená predovšetkým fosforylovanými tyrozínmi lokalizovanými medzi rezíduami 200 až 450 proteínu p62 (Cf SEQ ID č. 1). Derivát preferovaný podľa predkladaného vynálezu zahŕňa teda aspoň (I) deléciu v oblasti medzi rezíduami 145 až 247 p62 a (ii) časť p62 umožňujúcu interakciu s oblasťou SH2 GAP. Delécia sa predovšetkým týka rezíduí 1 až 202.
V tomto ohľade prihlasovateľ rovnako dokázal, že deriváty podľa predkladaného vynálezu majúce obzvlášť zaujímavé vlastnosti môžu byť tvorené polypeptidmi zahŕňajúcimi zvlášť oblasť fosforylovaných tyrozínov p62.
Obzvlášť preferovaný príklad polypeptidov podľa predkladaného vynálezu predstavuje polypeptid Δρ62 so sekvenciou SEQ ID č. 2 zahrnujúcou deléciu rezíduí 170 až 208 sekvencie p62. Iným príkladom je polypeptid p62-C zahrnujúci rezíduá 203 až 443 p62 (so sekvenciou SEQ ID č. 3).
Výsledky uvedené v predkladanom vynáleze dokazujú najmä, že polypeptid Δρ62 môže konkurovať s proteínom p62 proti GAP, keď GAP je jedným z efektorov proteínov Ras, polypeptid Δρ62 blokuje od taho závisiace mitogénne cesty. Polypeptid Δρ62 superexprimovaný genotransferom (transfekcia, infekcia, mikroinjekcia atď.) indukuje bunkovú smrť apoptózou v normálnych bunkách (fibroblasty NIH 3T3 a Swiss 3T3) alebo v bunkách tumorových (H460, HCT 116) a je schopný inhibovať utváranie ložísk indukovaných génmi ras. Rovnaký účinok dosiahneme s derivátom p62-C (zahrnujúcim hlavne C-terminálnu časť polypeptidu, ktorá pokrýva oblasť medzi aminokyselinami 203 a 443 a zodpovedá oblasti interakcie s oblasťami SH2 GAP a GRB2. Táto C-terminálna časť zahŕňa tiež tri miesta interakcie s oblasťami SH3, ktoré majú najvyššiu afinitu pre Fyn. Významná terapeutická aktivita derivátov podľa predkladaného vynálezu sa viaže na ich početné vlastnosti a najmä ich schopnosť titrovať oblasti SH3 proteínov rodiny src (príklad: fyn), ich kapacitu inhibovať regrutovanie GRB2 titráciou jeho oblasti SH2 a ich schopnosť inhibovať účinnú funkciu proteínu GAP v signalizačných cestách závisiacich od Ras.
Ďalší predmet predkladaného vynálezu sa týka akejkoľvek nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid ako je definovaný.
Kyselina nukleová podľa predkladaného návrhu môže byť kyselina ribonukleová (RNA) alebo deoxyribonukleová (DNA). Okrem toho môže ísť o genómovú DNA (gDNA) alebo komplementárnu (cDNA). Môže byť ľudského, zvieracieho, vírusového, syntetického alebo polysyntetického pôvodu. Môže byť získaná rôznym spôsobom, najmä však chemickou syntézou s využitím sekvencií prezentovaných v prihláške vynálezu alebo syntetizátora nukleových kyselín. Rovnako tiež môže byť získaná triedením bánk pomocou špecifických sond, ako sú opísané v žiadosti (pozri sekvencie SEQ ID č. 6 a 7). Ďalej môže byť získaná kombinova nými technikami, zahrnujúcimi chemickú modifikáciu (elongáciu, deléciu, substitúciu atď.) sekvencií triedených v bankách. Všeobecne povedané, nukleové kyseliny uvedené vo vynáleze môžu byť pripravené akoukoľvek odborníkom známou technikou.
Nukleová kyselina podľa vynálezu je väčšinou cDNA alebo RNA.
Nukleová kyselina podľa vynálezu môže byť vyberaná predovšetkým z množiny zahrnujúcej:
(a) celok alebo časť sekvencie SEQ ID č. 2 alebo SEQ ID č. 3, alebo ich komplementárne časti, (b) akékoľvek sekvencie hybridizujúce so sekvenciami (a) a kódujúce derivát podľa predkladaného vynálezu, (c) varianty (a) a (b) vyplývajúce z degenerácie genetického kódu.
Ako je uvedené, prihlasovateľ izoloval a charakterizoval nové sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptidy derivované z p62, vyznačujúce sa pozoruhodnými antiproliferatívnymi a apoptotickými vlastnosťami. Tieto nukleové kyseliny môžu byť teraz použité ako terapeutické činidlá a produkovať v bunkách deriváty podľa vynálezu schopné zničiť alebo korigovať bunkové dysfunkcie. Preto sa predkladaný vynález týka rovnako každej expresnej kazety obsahujúcej nukleovú kyselinu ako je definované, promótor umožňujúci jej expresiu a signál ukončenia transkripcie. Promótor sa vyberá z funkčných promótorov v samčích bunkách, najlepšie ľudského pôvodu. Ide o promótor umožňujúci expresiu kyseliny nukleovej v hyperproliferatívnej bunke (nádorovej, restenóznej atď.). Z tohto hľadiska je možné použiť niekoľko promótorov. Môže napríklad ísť o vlastný promótor génu p62. Tiež však môže ísť o oblasti rôzneho pôvodu (zodpovedné sa expresiu ďalších proteínov, dokonca syntetických). Môže teda ísť o akýkoľvek promótor alebo derivovanú sekvenciu stimulujúcu alebo naopak potláčajúcu transkripciu génu špecifickým či nešpecifickým spôsobom, induktívnu alebo nie, výraznú alebo naopak slabú.
Hlavne je možno uviesť aktivačné sekvencie eukaryotických alebo vírusových génov. Napríklad môže ísť o aktivačné sekvencie pochádzajúce z genómu cieľovej bunky. Z eukaryotických promótorov je možné použiť hlavne promótory ubikvitáme (promótory génov HPRT, PGK, a-aktin, tubulín atď.), promótory intermediálnych vláken (promótory génov GFAP, dezmín, vimentín, neurovlákna, keratínu atď.), promótory terapeutických génov (promótory génov MDR, CFTR, faktor Vín, ApoAI atď.), špecifické tkanivové promótory (promótory génov pyruvát-kinázy, vilín, črevný proteín väzby mastných kyselín, a-aktín hladkého svalu atď.) alebo tiež promótory reagujúce na určitý podnet (receptory steroidných hormónov, kyseliny retionovej atď.). Ďalej môže ísť o aktivačné sekvencie pochádzajúce z genómu určitého vírusu, ako napríklad promótory génov E1A a MLP adenovírusu, skorý promótor génu CMV alebo tiež promótor génu LTR, génu RSV atď. Tieto aktivačné oblasti môžu byť modifikované pridaním aktivačných či regulačných sekvencií, či sekvencií umožňujúcich tkanivovo-špecifickú alebo majoritnú expresiu.
Predkladaný vynález uvádza teraz nové terapeutické činidlá umožňujúce svojimi antiproliferatívnymi alebo apoptickými vlastnosťami interferovať s mnohými bunkovými dysfunkciami. Na tento účel môžu byť nukleové kyseliny alebo kazety podľa vynálezu injikované samy osebe na úrovni miesta, ktoré je určené na ošetrenie alebo inkubované priamo s bunkami, ktoré je treba zničiť alebo ošetriť. Opísalo sa, že jednoduché nukleové kyseliny sú schopné prenikať do buniek bez zvláštneho vektora. Akokoľvek, v rámci predkladaného vynálezu sa uprednostňuje tzv. aplikované ho vektora umožňujúceho zvýšenie (i) účinnosti prieniku do bunky, (ii) zacielenie a zvýšenie (iii) extra- a intrabunkovej stability.
Pri obzvlášť preferovanom spôsobe aplikácie podľa predkladaného vynálezu je kyselina nukleová alebo kazeta inkorporovaná do vektora. Použitý vektor môže byť chemického (lipozóm, nanopartikula, peptidický komplex, lipidy alebo katiónové polyméry atď.) alebo vírusového pôvodu (retrovírus, adenovírus, vírus herpesu, AAV, vakcínia vírus atď.) či pôvodu plazmidového.
Použitie vírusových vektorov je dané prirodzenými schopnosťami transfekcie vírusov. Tak je možné použiť napríklad adenovírusy, vírusy herpesu, retrovírusy a asociované adenovírusy. Tieto vektory sú mimoriadne účinné na úseku transfekcie. V tomto ohľade predkladaný vynález uprednostňuje defektný rekombinantný retrovírus, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu podľa uvedenej definície.
V druhom prípade vynález využíva defektný rekombinantný adenovírus, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu podľa uvedenej definície.
Vektorom podľa predkladaného vynálezu môže byť rovnako nevírusový agens, schopný aktivovať transfer a expresiu nukleových kyselín do eukaryotických buniek. Chemické alebo biochemické, syntetické alebo prírodné vektory predstavujú zaujímavú alternatívu prírodných vírusov, najmä teda kvôli jednoduchosti a bezpečnosti aplikácie a rovnako v dôsledku toho, že nie je daná teoretická medzná hodnota množstva DNA určenej na prenos. Tieto syntetické vektory majú dve hlavné funkcie - zhutniť nukleovú kyselinu určenú na transfekciu a aktivovať jej bunkovú fixáciu ako aj jej prechod plazmatickou membránou a prípadne oboma jadrovými membránami. Aby mohli čeliť polyaniónovej povahe nukleových kyselín, sú nevírusové vektory vybavené polykatiónovými funkciami. Nukleová kyselina alebo vektor s nábojom použitý v predkladanom vynáleze môže byť podávaný topicky, orálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, intraokulárne, transdermálne atď. Najčastejšie sa kyselina nukleová alebo vektor aplikujú injekčnou formou. Môžu teda byť zmiešané s akýmkoľvek farmaceutickým vehikulom prijateľným pre injikovateľnú formu, hlavne na priame injikovanie na úrovni miesta určeného na ošetrenie. Môže ísť najmä o sterilné alebo izotonické roztoky, alebo o suché, najmä lyofilizované zlúčeniny, ktoré pridaním buď sterilizovanej vody, alebo fyziologického séra, umožňujú vytvorenie injikovateľných tekutín. Priame injikovanie kyseliny nukleovej do tumoru pacienta je veľmi zaujímavým riešením, pretože umožňuje sústrediť terapeutický účinok na úroveň postihnutých tkanív. Aplikované dávky kyseliny nukleovej môžu byť upravené v závislosti od rôznych parametrov a predovšetkým potom v závislosti od génu, od vektora, od daného spôsobu aplikácie, od danej patológie alebo od dĺžky trvania sledovaného ošetrovania.
Predkladaný vynález sa rovnako týka akejkoľvek farmaceutickej kompozície obsahujúcej aspoň kyselinu nukleovú.
Rovnako sa týka akejkoľvek farmaceutickej kompozície obsahujúcej aspoň vektor podľa uvedenej definície.
Rovnako sa týka akejkoľvek farmaceutickej kompozície obsahujúcej aspoň derivát p62 podľa uvedenej definície.
Vzhľadom na svoje antiproliferatívne vlastnosti sú farmaceutické kompozície podľa vynálezu obzvlášť prispôsobené na ošetrovanie hyperproliferatívnych porúch, najmä rakoviny a restenózy. Predkladaný vynález ponúka mimoriadne účinnú metódu ničenia buniek, predovšetkým potom buniek hyperproliferatívnych. Tá môže byť použitá tak in vitro, ako aj ex vivo. Pri použití ex vivo spočíva v inkubácii buniek za prítomnosti jednej alebo viaceíých nukleových kyselín (alebo vektora, kazety alebo priamo derivátu). Pri použití in vivo potom spočíva v podávaní určitého aktívneho množstva vektora (alebo kazety) organizmu, najlepšie priamo na úrovni miesta určeného na ošetrenie (najmä tumoru). Z tohto hľadiska je predmetom vynálezu metóda ničenia hyperproliferatívnych buniek založená na kontakte spomínaných buniek alebo ich časti s kyselinou nukleovou podľa uvedenej definície.
Predkladaný vynález sa výhodne využíva in vivo na ničenie hyperproliferujúcich buniek, (t. j. anormálnej proliferácii). Dá sa teda využiť na ničenie tumorálnych buniek alebo buniek hladkého svalu vaskulámej steny (restenóza). Najmä je vhodný na ošetrenie prípadov rakoviny, kde je implikovaný aktivovaný onkogén. Napríklad je možno uviesť adenokarcinómy hrubého čreva, rakovinu štítnej žľazy, karcinómy pľúc, myeloidnú leukémiu, kolorektálnu rakovinu, rakovinu prsníka, pľúc, žalúdka, hltana, Blymfocytov, vaječníkov, močového mechúra, glioblastómov, karcinómy pečene, rakovinu kostí, kože, pankreasu alebo obličiek, či prostaty atď.
Produkty vynálezu sú vhodné tiež na identifikáciu ďalších partnerov ciest signalizácie onkogénov vyhľadávaním inhibítorov, agonizujúcich činidiel, kompetítorov alebo molekúl reagujúcich in vivo práve s týmito produktmi.
Napokon, vynález sa týka tiež antimediátorových sekvencií, ktorých expresia v cieľovej bunke umožňuje riadiť transkripciu a/alebo transdukciu bunkových mRNA kódujúcich protein p62 alebo polypeptid Δρ62. Takéto sekvencie môžu byť napríklad premenené v cieľovej bunke na RNA doplňujúce bunkové mRNA polypeptidu Δρ62 alebo proteínu p62 a blokovať ich premenu na protein podľa techniky opísanej v patente EP 140 308. Tieto sekvencie môžu byť tvorené čiastočne alebo úplne nukleotidovými sekvenciami SEQ ID č. 1,2 alebo 3, transkribovanými v opačnej orientácii.
Predkladaný vynález sa rovnako týka použitia akejkoľvek zlúčeniny schopnej indukovať expresiu či superexpresiu polypeptidu Δρ62 v bunke na účely prípravy farmaceutickej kompozície určenej na ošetrenie hyperproliferatívnych porúch.
Predkladaný vynález bude opísaný podrobnejšie pomocou následne uvedených príkladov, ktoré je treba považovať za ilustratívne a vôbec nie limitatívne.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: Schematické zobrazenie štrukturálnych oblastí proteínov p62 a polypeptidov Δρ62.
Obr. 2: Účinky proteínu p62 a polypeptidu Δρ62 na transaktiváciu RRE-dcrivátov zosilňovača transkripcie vírusu polyómu proteínmi ras.
Obr. 3: Dokázanie zničenia buniek indukované prostredníctvom polypeptidu Δρ62 vo fibroblastoch NIH3T3.
Obr. 4: Dokázanie expresie polypeptidu Δρ62 v embryonálnych fibroblastoch ošetrených rôznymi cytotoxickými činidlami a sérovou depriváciou.
Obr. 5: Inhibícia tvorby ložísk indukovanej onkogénmi.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Biomolekuláma technika
Metódy klasicky používané v molekulárnej biológii, ako napríklad preparatívna extrakcia plazmidovej DNA, centrifugácia plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza na agarovom alebo polyakrylamidovom géli, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteínov fenolom alebo fenolchloroformom, precipitácia DNA v soľnom prostredí etanolom alebo izopropanolom, transformácia v Escherichia coli atď... sú metódy, ktoré odborník dobre pozná a ktoré sú dostatočne opísané v odbornej literatúre (Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 199, 82, Ausubel F.M. et al. (eds), „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley and Sons, New York, 1987).
Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série M13 majú obchodný pôvod (Bethesda Research Laboratories). Na účely ligácie môžu byť fragmenty DNA oddelené podľa svojej veľkosti elektroforézou na agarovom alebo polyakrylamidovom géli, extrahované fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, precipitované etanolom a inkubované za prítomnosti DNA ligázy fága T4 (Biolabs) podľa odporúčania dodávateľa.
Proeminentné konce 5' môžu byť doplnené Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I odvodené z E. coli (Biolabs) podľa špecifikácie dodávateľa. Zničenie proeminentných koncov 3' sa uskutoční za prítomnosti DNA polymerázy fága T4 (Biolabs) podľa odporúčania výrobcu. Zničenie proeminentných koncov 5' sa uskutoční ošetrením nukleázou SI.
Mutagenéza riadená in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidmi môže byť uskutočnená podľa metódy vyvinutej Zaylorom at al. (Nucleic Acid Res., 13 (1985) 8749 -
- 8764) s použitím súpravy distribuovanej Amershamom. Enzýmová amplifikácia fragmentov DNA technikou nazvanou PCR (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350 - 1354, Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzým. 155 (1987) 335 - 350) môže byť uskutočnená s použitím tzv. „DNA thermal cycler“ (Perín Elmer Cetus) podľa špecifikácie výrobcu. Overenie nukleotidových sekvencií môže byť uskutočnené metódou vyvinutou Sangerom et. Al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463 - 5467) s použitím súpravy distribuovanej Amershamom.
Izolovanie komplementárnej DNA poiypeptidu Ap62. Komplementárna DNA poiypeptidu Ap62 bola izolovaná pomocou PCR na populácii syntetizovanej komplementárnej DNA z RNA poly A+ extrahovanej z ľudskej placenty. 1 pg DNA bol použitý spoločne s primermi derivovanými so sekvencie p62, ktoré pokrývajú aminokyseliny 123 až 131 na jednej strane (oligo 5'0 a 437 až 443 na strane druhej (oligo 3').
Sekvencie týchto štartérov sú nasledovné: oligo 5': CAGCTGCTGACGGCAGAAATTGAG (SEQ ID č. 4), oligo 3': TTAATAACGTCCATATGGGTGCTC (SEQ ID č. 5).
Reakcie prebiehali pri 55 C a výsledkom boli dva produkty oddelené elektroforézou na agarovom géli:
- pás 987 párov báz zodpovedajúci produktu PCR p62,
- pás 870 párov báz zodpovedajúci produktu PCR Δρ62.
Tento druhý pás bol klonovaný a jeho frekvencia zodpovedá presne frekvencii p62 s výnimkou delécie 117 párov báz v oblasti homológie s GRP33. Kompletná sekvencia Ap62 je prezentovaná ako SEQ ID č. 2 (pozri obr. 1).
Existencia tejto izoformy proteínu p62 bola potvrdená skríningom banky komplementárnej DNA ľudskej placenty vo vektore gt 11. Oligonukleotid použitý na tento skríning je 24-mér zodpovedajúci špecifickému spojeniu delécie prítomnej v polypeptide Ap62. Sekvencia tohto oligonukleotidu je:
CAGTATCCCAAGGAGGAAGAGCTG (SEQ ID č. 6).
Príklad 2
Konštrukcia vektorov expresie poiypeptidu Δρ62 a proteínu p62-C.
Tento príklad opisuje konštrukcie vektorov použiteľných na transfer nukleových kyselín podľa vynálezu in vitro alebo in vivo.
2.1 Plazmidový vektor
Na konštrukciu plazmidových vektorov boli použité 2 typy vektorov:
- Vektor SV2, opísaný v DNA Cloning, A practical approach Vol. 2, D. M. Glover (ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Tento vektor je vektorom eukaryotickej expresie. Nukleové kyseliny kódujúce varianty proteínu p62-C a poiypeptidu Δρ62 boli vložené do tohto vektora vo forme fragmentov EcoRI. Sú tak pod kontrolou promótora zosilňovača transkripcie vírusu SV40.
- Vektor pcDNA3 (Invitrogen). Ide rovnako o vektor eukaryotickej expresie. Nukleové kyseliny kódujúce varianty proteínu p62-C a poiypeptidu Δρ62 boli vložené do tohto vektora vo forme fragmentov EcoRI a sú tak pod kontrolou skorého promótora CMV.
2.2 Vírusový vektor
Vynález spočíva v konštrukcii a použití vírusových vektorov umožňujúcich transfer a expresiu nukleových kyselín in vivo podľa uvedenej definície.
Pretože ide najmä o adenovírusy, boli charakterizované rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa mierne líšia.
Z nich sa prednostne využívajú v rámci predkladaného vynálezu ľudské adenovírusy typu 2 a 5 (Ad 2 alebo Ad 5) alebo adenovírusy živočíšneho pôvodu (pozri patentová prihláška WO 94/26914). Z adenovírusov živočíšneho pôvodu využiteľných v rámci predkladaného vynálezu je možno uviesť adenovírusy psieho, bovínneho, myšacieho (príklad: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasačieho, vtáčieho alebo opičieho pôvodu (príklad: SAV). Adenovírusom živočíšneho pôvodu je adenovírus psí, najmä teda adenovírus CAV2 (napríklad kmeň manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800). V rámci predkladaného vynálezu sa používa predovšetkým adenovírus ľudského či psieho pôvodu alebo adenovírusov kombinovaných.
Defektné adenovírusy podľa vynálezu obsahujú ITR, sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu a nukleovú kyselinu podľa vynálezu. Ešte častejšie je potom v genóme adenovírusov podľa vynálezu oblasť El nefunkčná. Sledovaný vírusový gén môže byť znefunkčnený akoukoľvek technikou známou odborníkom, najmä celkovou supresiou, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo pridaním jednej či viac báz do sledovaného génu (či sledovaných génov). Takéto modifikácie môžu byť dosiahnuté in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ pomocou metód génového inžinierstva alebo ošetrením mutagénnymi činidlami. I ďalšie oblasti môžu byť rovnako modifikované a hlavne potom oblasť E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Podľa preferovaného spôsobu využitia obsahuje adenovírus podľa vynálezu v oblastiach El a E4. Podľa iného preferovaného realizačného postupu zahrnuje deléciu v oblasti El, na úrovni ktorej je vložená oblasť E4 a kyselina nukleová podľa vynálezu (porovnaj FR94 13355). Vo vírusoch podľa vynálezu zasahuje delécia v oblasti El do nukleotidov 455 až 3329 na sekvencií adenovírusu Ad5.
Defektné rekombinantné adenovírusy podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené akoukoľvek odborníkom známou technikou (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graha, EMBO J. 3 (1984) 2917). Najmä však môžu byť pripravené homologickou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom so sekvenciou DNA. Homologická rekombinácia vzniká po kotransfekcii spomínaných adenovírusov a plazmidu do vhodnej bunkovej línie. Použitá bunková línia musí byť transformovateľná spomínanými prvkami, musí zahrnovať sekvencie schopné doplniť časť genómu defektného adenovírusu, najlepšie integrovanou formou, aby sa zabránilo nebezpečiu rekombinácie. Ako príklad môžeme uviesť ľudskú embryonálnu líniu obličiek 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje ľavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12 %) integrovanú do svojho genómu, alebo línie schopné doplniť funkcie El a E4, ako sú opísané v patentových prihláškach č. WO 94/26914 a WO 95/02697. Rozmnožené adenovírusy sú zachytené a purifikované klasickými metódami molekulárnej biológie ako je ilustrované v uvedených príkladoch.
Pokiaľ ide o tzv. adeno-asociované vírusy (AAV), ide o vírusy na báze DNA relatívne redukovanej veľkosti, ktoré sa integrujú do genómu buniek, ktoré infikujú a to stabilne a špecificky pre dané miesto. Sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez toho, aby indukovali akýkoľvek vplyv na rast, morfológiu alebo diferenciáciu buniek. Ako sa zdá, nepodieľajú sa však na patológii u človeka. Genóm vírusu AAV bol klonovaný, rozložený do sekvencií a charakterizovaný. Zahrnuje približne 4700 báz a obsahuje na každom konci oblasť obrátenej repetície (ITR) 145 báz. Zvyšok genómu je rozdelený do dvoch podstatných oblastí s enkapsidačnými funkciami: do ľavej časti genómu obsahujúcej gén rep podieľajúci sa na vírusovej replikácii a expresii vírusových génov a do pravej časti genómu obsahujúcej gén cap kódujúci kapsidové proteíny vírusu.
Použitie vektorov derivovaných z AAV na transfer génov in vitro a in vivo bolo opísané v odbornej literatúre (najmä WO 91/18088, WO 93/09239, US 4, 797, 368, US 5, 139, 941, EP 488 528). Sú tu opísané rôzne konštrukcie derivované z AAV, v ktorých gény rep a/alebo cap sú eliminované deléciou a nahradené významným génom a ďalej je tu opísané ich použitie na transfer tohto významného génu in vitro (na bunkách v kultúre) alebo in vivo (priamo do organizmu). Rekombinantné defektné AAV podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené kotransfekciou plazmidu obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu ohraničenej dvoma oblasťami ITR AAV a plazmidu s enkapsidačnými génmi (gény rep a cap) AAV do bunkovej línie infikovanej pomocným ľudským vírusom (napríklad adenovírusom). Použiteľná bunková línia je napríklad línia 293. Produkované rekombinantné AAV sú následne purifikované klasickými technikami.
Pokiaľ ide o vírusy herpesu a retrovírusy, bola konštrukcia rekombinantných vektorov už skôr podrobne opísaná v odbornej literatúre: pozri hlavne Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP 17 8220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235, Mc Cormick, Biotechnology 3 (1985) 689, atď. Retrovírusy sú integratívne vírusy infikujúce selektívne bunky v procese delenia. Predstavujú teda významné vektory vhodné na aplikáciu v prípade rakoviny. Genóm retrovírusov zahŕňa najmä dve LTR, enkapsidačné sekvencie a tri kódujúce oblasti (gag, pol a env). V rekombinantných vektoroch derivovaných z retrovírusov potom gény gag, pol a env sú väčšinou eliminované deléciou a to celkovo alebo čiastočne a sú nahradené sekvenciou zainteresovanej heterológnej nukleovej kyseliny. Tieto vektory môžu byť realizované z rôznych typov retrovírusov, ako MoMuLV („Murine Moloney Leukémia Virus“ označovaný tiež MoMLV), MSV („Murine Moloney Sarcoma Virus“), HaSV („Harvey Sarcoma Virus“), SNV („spleen nacrosis virus“), RSV („Rous Sarcoma Virus“) či tiež Friendov vírus.
Na konštrukciu rekombinantných vírusov podľa vynálezu obsahujúcich nukleovú kyselinu rovnako podľa vynálezu sa vytvorí plazmid obsahujúci najmä LTR, enkapsidačnú sekvenciu a spomínanú nukleovú kyselinu a potom sa použije na prenos bunkovej línie, zvanej enkapsidačná, schopnej vložiť do polohy trans retrovírusové funkcie, ktoré sú v plazmide deficientné. Všeobecne povedané sú enkapsidačné línie schopné exprimovať gény gag, pol a env. Takéto enkapsidačné línie boli opísané v skorších prácach, najmä potom línie PA317 (US 4, 861, 719), línie PsiCRIP (WO 90/02806) a línie GP + envAm-12 (WO 89/07150). Rekombinantné vírusy môžu zahŕňať modifikácie na úrovni LTR na potlačenie transkripčnej aktivity, ako i enkapsidačné sekvencie zahŕňajúce časť génu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Produkované rekombinantné retrovírusy sú potom purifikované klasickými technikami.
Na využitie predkladaného vynálezu je vhodné použiť adenovírus alebo defektný rekombinantný retrovírus. Tieto vektory majú skutočne mimoriadne zaujímavé vlastnosti na prenos génov do tumorálnych buniek.
2.3 Chemický vektor
Z vyvinutých syntetických vektorov sa prednostne v rámci predkladaného vynálezu využívajú katiónové polyméry typu polylyzínu, (LKLK)n, (LKKL)n, polyetylénimínu a DEAE dextrán alebo katiónových, alebo lipofektantných lipidov. Majú tú vlastnosť, že kondenzujú DNA a podporujú jej spojenie s bunkovou membránou. Z nich môžeme uviesť lipopolyamíny (lipofektamín, transfektam atď.), rôzne katiónové alebo neutrálne lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE atď.) ako aj peptidy nukleárneho pôvodu. Okrem toho bol vyvinutý koncept cieľovej transfekcie sprostredkovanej receptorom, ktorý využíva princíp kondenzácie DNA vďaka katiónovému polyméru pri orientácii fixácie komplexu na membránu vďaka chemickej väzbe medzi katiónovým polymérom a väzivom membránového receptora prítomného na povrchu bunkového typu, ktorý’ chceme transplantovať. Zacielenie receptora na transferín, inzulín alebo receptor asialoglykoproteinov bolo už skôr podrobne opísané. Príprava zlúčeniny s použitím chemického vektora je realizovaná bežnou, odborníkom známou technikou, predovšetkým potom jednoduchým uvedením jednotlivých zložiek do vzájomného kontaktu.
Príklad 3
Inhibícia transaktivácic R.R.E. (ras responsive elements) podmienená onkogenetickými formami Ras (obr. 2).
Fibroblasty NIH 3T3 boli transfekované nosným génom, génom chloramfenikol acetyltransferázy, riadeným prvkami reagujúcimi na Ras derivovanými zo zosilňovača transkripcie vírusu polyómu. Tieto prvky sú stimulované 15 - 20-krát ak sú bunky kotransfekované expresným vektorom nesúcim cDNA onkogénu Middle T (MT) SV40. Táto stimulácia je len nepatrne ovplyvnená, ak kotransfekcia
SK 283071 Β6 prináša expresné vektory proteínu p62-C a polypeptidu Δρ62 (porovnaj príklad 2). Ak je kotransfekcia realizovaná nielen s MT, ale aj s aktivovanou formou onkogénu Ha-ras (Val 12), aktivita CAT je stimulovaná 30 - 40-krát nad základnú úroveň. Expresia polypeptidu p62 ovplyvňuje túto stimuláciu len nepatrne, zatiaľ čo proteín p62-C a polypeptid Ap62 inhibuje takmer bezo zvyšku celkovú aktivitu podmienenú onkogénnym Ras. Rovnakým spôsobom je potom stimulácia dosiahnutá kotransfekciou s onkogénom v-src výrazne inhibovaná proteínmi p62-C a polypeptidom Ap62, nie však proteínom p 62.
Tieto pokusy boli uskutočnené s 0,5 pg vektora umožňujúceho expresiu MT alebo Ras VAL 12 alebo v-src et s 4 pg expresného vektora nesúceho cDNA proteínu p62-C alebo polypeptidu Ap62. Jasne dokazujú schopnosť proteínov podľa predkladaného vynálezu pôsobiť proti onkogénnym signálom ras.
Príklad 4
Dôkaz smrti bunky indukovanej polypeptidom Ap62 vo fibroblastoch NIH3T3 (obr. 3).
Fibroblasty NIH3T3 boli transfekované s účinnosťou 60 % množstvom 5 pg expresného vektora polypeptidu Δρ62 (príklad 2).
hodín po transfekcii majú bunky výrazné zhoršenie ich životaschopnosti vzhľadom na kontrolné subjekty. Analýza ich DNA ukazuje po migrácii na agarózovom géli charakteristické degradačné štádia apoptóznych javov. Rovnaké javy možno pozorovať v prípade, kedy je p62-C transfekovaný za rovnakých podmienok ako je Δρ62.
Príklad 5
Dôkaz expresie polypeptidu Δρ62 v embryonálnych fibroblastoch ovplyvnených rôznymi cytotoxickými činidlami a sérovou depriváciou (obr. 4).
Myšie embryonálne fibroblasty boli vnesené do kultúry (1), ovplyvnené 0,5 pg kyseliny okadovej (2), ovplyvnené 10 ng/ml PMA a 2 pg ionomycínu (3), 1 pM staurosporínu (4) alebo 2 pg/ml kamtotecínu (5) a potom zbavené séra.
Expresia mediátorových RNA proteínu p62 a polypeptidu Δρ62 v týchto fibroblastoch a počas rôznych ovplyvnení bola podrobená dôkladnej analýze. Pri každom ovplyvnení boli analyzované tri body. Tie zodpovedajú trom časovým intervalom ovplyvnenia: 6, 12 a 24 hodín.
Sonda 5' špecifická pre polypeptid Δρ62 (SEQID č. 7): CTGTCAAGCAGTATCCCAAGGAGG
Sonda 5' špecifická pre proteín p62 (SEQ ID č. 8): AAGGGCTCAATGAGAGACAAAGCC
Sonda 3 spoločná pre p62 a Δρ62 (SEQ ID č. 9): GTATGTATCATCATATCCTATTTC
Vo fibroblastoch vnesených do kultúry za prítomnosti 10 % fetálneho teľacieho séra (SVF) bola mRNA proteínu p62 potvrdená, zatiaľ čo mRNA polypeptidu Δρ62 nebola detekovaná ani po 24 hodinách po vnesení do kultúry. Rovnaká situácia je pri ošetrení kyselinou okadovou. Na rozdiel od toho, je možno porovnať výraznú indukciu polypeptidu Δρ62 po 6 až 12 hodinách ovplyvňovania pomocou PMA a ionomycínom. mRNA sa dá rovnako dokázať pridaním staurosporínu a je výrazne indukovaná po 12 hodinách ovplyvňovania kaptotecínom. Hneď ako sú embryonálne fibroblasty odobraté zo séra, je možné pozorovať vý raznú indukciu polypeptidu Δρ62 súčasne so zmiznutím informácie pre proteín p62.
Tieto výsledky dokazujú, že expresia mRNA polypeptidu Δρ62 je indukovaná počas niektorých apoptických situácií vo fibroblastoch.
Príklad 6
Inhibícia tvorby ložísk indukovaných ras polypeptidom Δρ62
Tento príklad opisuje inú štúdiu, dokazujúcu, že polypeptid Δρ62 interferuje s transformačným procesom, indukovaným onkogénmi. Najmä tento príklad dokresľuje, že polypeptid Δρ62 dokáže inhibovať tvorbu ložísk indukovanú rôznymi onkogénmi (ras onkogénny, v-src) v bunkách NIH3T3, zatiaľ čo proteín p62 na tento fenomén vôbec nepôsobí.
Fibroblasty NIH3T3 boli kotransfekované pomocou 0,1 pg vektora expresie v-Src alebo Ha-Ras Vall2 a 4 mg vektora expresie proteínu p62, polypeptidu Δρ62 alebo prázdneho vektora (príklad 2). Bunky boli udržované v prostredí obsahujúcom 10 % fetálne teľacie sérum a počet ložísk bol určený po fixácii a zafarbení buniek za prítomnosti fenolfuksínu. Pokusy boli uskutočnené v troch opakovaniach.
Dosiahnuté výsledky sú uvedené na obr. 5. Potvrdzujú, že polypeptid Δρ62 znižuje počet ložísk indukovaných prostredníctvom v-src a Ha-Ras Val 12 asi o 50 %. Tento účinok potvrdzuje špecifickú antagonistickú schopnosť transformácie prostredníctvom v-src a Ha-Ras onkogénneho, pretože polypeptid Δρ62 nepôsobí na tvorbu ložísk indukovaných prostredníctvom v-Raf. Okrem toho, sledovaný účinok nie je viazaný na toxicitu produktu, pretože počet kolónií rezistentných proti neomycínu po transfekcii prostredníctvom proteínu p62, polypeptidu Δρ62 alebo prázdneho vektora je porovnateľný. Tieto výsledky teda potvrdzujú inhibičnú úlohu molekúl podľa vynálezu v procese transformácie indukovanom onkogénmi. Rovnako potvrdzujú vhodnosť týchto produktov na korekciu procesov bunkovej proliferácie indukovaných onkogénmi, ako aj nástroje na identifikáciu ďalších molekúl buď aktívnych, a/alebo podieľajúcich sa na signalizácii týchto onkogénov.
Príklad 7
Dôkaz interakcie s src in vivo
Tento príklad názorne opisuje štúdiu interakcie polypeptidu Δρ62 s ďalšími molekulami. Dokazuje celkom jasne, že proteín p62 a polypeptid Δρ62 dokážu vstúpiť do interakcie in vivo so src.
Fibroblasty NIH3T3 boli transfekované vektorom expresie proteínu p62 alebo polypeptidu Δρ62 obsahujúcom marker myc („myc teg“) (príklad 2). Transfekované bunky boli udržiavané v asynchrónnom raste alebo blokované v mitotickej fáze nocodazolom. Bunky boli potom kotransfekované expresným vektorom v-Src alebo prázdnym. Po 48 hodinách boli bunky lyzované a utvorené komplexy boli imunodetekované pomocou protilátok anti-myc (protilátka 9E10) a anti-Src (protilátka N16).
Dosiahnuté výsledky dokazujú, že proteín p62 a polypeptid Δρ62 dokážu vstúpiť do interakcie in vivo so src. Okrem toho, zatiaľ čo interakcie medzi p62 a src prebiehajú, ako sa zdá, výlučne v mitotických bunkách, polypeptid Δρ62 viaže src dokázateľne dokonca i v bunkách asynchrónnych. Táto interakcia je zintenzívnená v bunkách mitotických.
ZOZNAM SEKVENCIÍ GGT GTT 960 GGA CCA CCT CGG GGG CCT TTG CTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG
Gly val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu val Arg Gly Thr Pro Val Arg
INFORMÁCIE 0 SEQ ID č. 1 305 310 315 320
Charakteristika sekvencie: GGA GCC 1008 ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA
(A) DÍžka : 1332 párov báz Gly Ala íle Thr Arg 325 Gly Ala Thr Val Thr 330 Arg Gly Val Pro Pro 335 Pro
(B) Typ : nukleotid CCT ACT GTG AGG CCA GCA CCA GCA CGG ACA GCG GGC ATC
(C) Počet vlákien : jedno 1056 AGA
(D) Konfigurácia : lineárna Pro Thr Val Arg 340 Gly Ala Pro Ala Pro 345 Arg Ala Arg Thr Ala 35C Gly íle
Typ molekuly: cDNA CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA
Hypotetická : nie 1104 Gin Arg íle Pro Leu Pro Pro Pro Pre Ala Pro Glu Thr Tyr Glu Glu
Antimediátorová: nie 355 360 365
Popis sekvencie : SEQ ID č. 1 TAT GGA 1152 TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA AGT TAC GAA GGC TAC GAA
ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC GCG CGC ATG AGC CGG TCT TCG GGC Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr Ala Glu Gin Ser Tvr Glu Gly Tyr Glu
48 Met Gin Arg Arq Asp Asp Pro Ala Ala Arg Met Ser Arg Ser Ser Gly 370 375 380
1 5 10 15 GGC TAT 1200 TAC AGC CAG AGT CAA GGG GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA
CGT AGC GGC TCC ATG GAC CCC TCC GGT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG Gly Tyr Tyr Ser Gin Ser Gin Gly Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly
96 Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Sex Gly Ala H1S Pro Ser val Arg Gin 385 390 395 400
20 25 30 CAT GGG GAG GTT CAA GAT rcr TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG
ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG CCT 144 CAC CGG TCC CGG GGA GGC GGA 1248 His Gly Glu Val Gin Asp Ser Tyr Glu Ala Tyr Gly Gin Asp Asp Trp
405 410 415
Thr pro ser Arg Gin Pro Pro Leu Pro 3S 40 Hla Arg Ser Arg 45 Gly Gly Gly AAT GGG 1296 ACC AGG CCG TCG CTG AAG GCC CCT CCT GCT AGG CCA GTG AAG
GGC GGA TCC CGC GGG GGC GCC CGG GCC 192 TCG CCC GCC ACG CAG CCG CCA Aan Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala Pro Pro Ala Arg Pro Val Lys
Gly Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ala Thr Gin Pro Pro 420 425 430
50 55 60 GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT GGA CGT TAT TAA
CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT CCC GAC GCG ACA GTG GGC GGG 1332
240 Gly Ala Tyr Arg G1U HiS Pro Tyr Gly Arg Tyr *
Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly 65 70 Pro ASp 7S Ala Thr Val Gly Gly 80 435 440
CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG GTC AAG
288 Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys INF ORMACIE O SE QI Dč í. 2
85 90 95 Charak téri stik a se :kvi sne: ie:
ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC (A) Dlž ka: 12 15 párov báz
Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Het Ala Glu Lys Asp (B) Typ >: n ukl· eoti d
ioo 105 110 (C) Poč etv lák ien :je. dno
TCG 384 CTC GAC CCG TCC TTC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA GAA (D) Konfig urá cia : lineárna
Ser Leu Asp 115 Pro Ser Phe Thr H13 120 Ala Met Gin Leu Leu 125 Thr Ala Glu Typ mo dcki uly : cDNA
ATT GAG AAG ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT GAT GAG CAG AAT Hyp Otei tick á: nie
432 íle Glu Lys íle Gin Lys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Asp Glu Glu Asn Anti ime diát oro vá: : nie
130 135 1 40 Pop ÍS S( :kvi ^nci ie : SEQ ID č. 2:
TAC TTG GAT TTA TTT TCT CAT AAC AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC GCG CGC ATG AGC CGG TCT TCG GGC
480 48
Tyr Leu Asp Leu Phe Ser KiS Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val Met Gin Arg Arg ASO Asp pro Ala Ala Arg Met Ser Arg Ser Sex Gly
145 150 155 160 1 5 1 0 15
CTG ATA CCT GTC AAG CAG TAT CCC AAG TTC AAT TTT GTG GGG AAG ATT CGT AGC GGC TCC ATG GAC CCC TCC GGT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG
528 96
Leu íle Pro Val Lys Gin Tyr Pro Lys Phe Asn Phe val Gly Lys íle Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Ser Gly Ala His Pro Ser Val Arg Gin
165 170 175 20 25 30
CTT 576 GGA CCA CAA GGG AAT ACA ATC AAA AGA CTG CAG GAA GAG ACT GGT ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG CCT CAC CGG TCC CGG GGA GGC GGA
Leu Gly Pro Gin 180 Gly Asn Thr íle Lys 185 Arg Leu Gin Glu Glu 190 Thr Gly 144 Thr Pro Sar 35 Arg Gin Pro Pro Leu 40 Pro His Arg Ser Arg 45 Gly Gly Gly
GCA 624 AAG ATC TCT GTA TTG GGA AAG GGC TCA ATG AGA GAC AAA GCC AAG GGG GGA TCC CGC GGG GGC GCC CGG GCC TCG CCC GCC ACG CAG CCG CCA
Ala Lys íle 195 Ser Val Leu Gly Lys 200 Gly Ser Met Arg Asp 205 Lys Ala Lys 192 Gly Gly ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala ser Pro Ala Thr Gin Pro Pro
50 55 60
GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT GGA GAC CCC AAA TAT GCC CAC TTG AAT GCG ACA GTG GGC GGG
672 CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT CCC GAC
Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asp Pro Lys Tyr Ala His Leu Asn 240 Gly Ala Thr Val Gly Gly
210 215 220 Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Pro Asp
65 70 75 60
ATG GAT CTG CAT CTC TTC ATT GAA GTC TTT GGA CCC CCA TGT GAG GCT GTC AAG
720 CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG
288
Met Asp Leu His Val Phe íle Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys
225 230 235 240 85 90 95
TAT GCT CTT ATG GCC CAT CCC ATC CAG CAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC
768 336 Glu Asp
Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu Val Lys Lys Phe Leu val Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Lys
245 250 255 100 105 110
CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC TCG CTC GAC CCG TCC TTC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA CAA
816 384 Ala Glu
Pro Asp Met Met Asp Asp íle Cys Gin Glu Gin Phe Leu Glu Leu Ser Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gin Leu Leu Thr
260 265 270 115 120 125
TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC TCT CGT GGA CGT GGG GTG CCA GTG ATT GAG AAG ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT GAT GAG GAG AAT
864 432
Tyr Leu Asn Gly Val Pro G1U Pro Ser Arg Gly Arg Gly val Pro Val íle Glu Lys íle Gin Lys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Asp Glu Glu Asn
275 280 285 1 30 135 140
AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA CCT GTT CCC AGG GGC CGT TAC TTG GAT TTA TTT TCT CAT AAG AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG
912 480
Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro Arg Gly Arg Tyr Leu Asp Leu Phe Ser His Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val
290 295 300 145 150 155 160
CTG ΑΓΑ CCT GTC AA3 CAC TAT CCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT 520
Leu íle Pro Val Lys Gin Tyr Pro Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly
165 170 175
SK 283071 Β6
GGA GAC 576 ccc Pro AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT
Gly Asp Lys Tyr Ala His Leu Asn Met Asp Leu His Val Phe íle
180 185 190
GAA 624 GTC TTT GGA CCC CCA TGT GAG GCT TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC
Glu Val Phe 195 Gly Pro Pro Cys Glu 200 Ala Tyr Ala Leu Met 205 Ala His Ala
ATG 672 GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC
Met Glu 210 Glu Val Lys Lys Phe 215 Leu Val Pro Asp Met 220 Met Asp Asp íle
TGT 720 CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA
Cys 22S Gin Glu Gin Phe Leu 230 G1U Leu Ser Tyr Leu 235 Asn Gly Val Pro Glu 240
ccc 768 TCT CCT GGA CGT GGG GTG CCA GTG AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT
Pro Ser Arg Gly Arg 245 Gly Val Pro val Arg 250 Gly Arg Gly Ala Ala 255 Pro
cer 816 CCA CCA CCT GTT CCC AGG GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG
Pro Pro Pro Pro 260 Val Pro Arg Gly Arg 265 Gly Val Gly Pro Pro 270 Arg Gly
GCT 864 TTG GTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC
Ala Leu Val 275 Arg Gly Thr Pro Val 280 Arg Gly Ala íle Thr 285 Arg Gly Ala
ACT 912 GTG ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA
Thr Val 290 Thr Arg Gly val Pro 295 Pro Pro Pro Thr Val 300 Arg Gly Ala Pro
GCA 960 CCA AGA GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA
Ala 305 Pro Arg Ala Arg Thr 310 Ala Gly íle Gin Arg 315 íle Pro Leu Pro Pro 320
CCT CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC
1008
Pro Pro Ala Pro G1U Thr Tyr Glu Glu Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr
325 330 335
GCA GAA CAA AGT TAC GAA GGC TAC GAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA
1056
Ala Glu Gin Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Tyr Tyr Ser Gin Ser Gin
340 345 350
GGG GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT
1104
Gly Asp ser Glu ryr Tyr Asp Tyr Gly His Gly Glu val Gin Asp Ser
355 360 365
TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG
1152
Tyr Glu Ala Tyr Gly Gin Asp Asp Trp Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu
370 375 380
AAG GCC CCT CCT ' GCT AGG CCA GTG AAG GGA GCA TAC AGA GAG ; CAC CCA
1200
Lys Ala Pro Pro Ala Arg Pro Val Lys Gly Ala Tyr Arg Glu . His Pro
385 390 395 400
ATG AGA 48 GAC Asp AAA GCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT GGA GAC CCC
Lys Ala Lys 5 Glu Glu Glu Leu 10 Arg Lys Gly Cly Asp 15 Pro
Met 1 Arg
AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT
96
Lys Tyr Ala His Leu Asn Met Asp Leu KiS Val Phe íle Glu Val Phe
20 25 30
GGA CCC CCA TGT GAG GCT TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA
144
Gly Pro Pro Cys Glu Ala Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu
35 40 45
GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG
192
Val Lys Lys Phe Leu Val Pro Asp Met Met Asp Asp íle Cys Gin Glu
50 55 60
CAA TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA ccc TCT CGT
240
Gin Phe Leu Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg
65 70 75 80
GGA CGT GGG GTG CCA GTG AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA
288
Gly Arg Gly val Pro val Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro
B5 90 95
CCT GTT CCC AGG GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CCG GGG GCT TTG GTA
336
Pro Val Pro Arg Gly Arg Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val
100 105 110
CGT GGT ACA CCA GTA AGG GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT
384
Arg Gly Thr Pro Val Arg Gly Ala íle Thr Arg Gly Ala Thr val Thr
115 120 125
CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA GCA CCA AGA
432
Arg Gly val Pro Pro Pro Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro Ala Pro Arg
130 135 140
GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA
480
Ala Arg Thr Ala Gly íle Gin Arg íle Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala
145 150 155 160
CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA
528
Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr Ala Glu Gin.
165 170 175
AGT TAC GAA GGC TAC GAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA GGG GAC TCA
576
Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Tyr Tyr Ser Gin Ser Gin Gly Asp Ser
180 185 190
GAA TAT TAT GAC TAT GGA CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT TAT GAA GCT
624 Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly His Gly Glu Val Gin Asp Ser Tyr G1U Ala
195 200 205
TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG AAG GCC CCT
672
Tyr Cly Gin Asp Asp Trp Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala Pro
210 215 220
CCT GCT AGG CCA GTG AAG GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT GGA CGT
720
Pro Ala Arg Pro Val Lys Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro Tyr Gly Arg
225 230 235 240
TAT TAA
726
Tyr *
TAT GGA GGT TAT TAA 1215
Tyr Gly Arg Tyr ·
405
INFORMÁCIE O SEQ ID č. 3 :
Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 726 párov báz (B) Typ: nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA Hypotetická : nie Antimediátorová: nie
Popis sekvencie : SEQ ID č. 3 :
INFORMÁCIE O SEQ ID č. 4 : Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka ; 24 párov báz (B) Typ: nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID č. 4 : CAGCTGCTGA CGGCAGAAAT TGAG
INFORMÁCIE O SEQ ID č. 5 : Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 24 párov báz (B) Typ : nukleotid (C) Počet vlákien . jedno (D) Konfigurácia: lineárna Typ molekuly: cDNA Hypotetická: nie Antimediátorová: nie
Popis sekvencie : SEQ ID č. 5 : TTAATAACGT CCATATGGGT GCTC
INFORMÁCIE O SEQ ID č. 6 :
Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka : 24 párov báz (B) Typ : nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia: lineárna Typ molekuly : cDNA Hypotetická: nie Antimediátorová: nie
Popis sekvencie : SEQ ID č. 6 : CAGTATCCCA AGGAAGGAAGA GCTC
INFORMÁCIE O SEQ ID č. 71 :
Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka : 24 párov báz (B) Typ : nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická : nie Antimediátorová: nie
Popis sekvencie : SEQ ID č. 7 : CTGTCAAGCA GTATCCCAAG GAGG
INFORMÁCIE O SEQ ID č. 8 :
Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka : 24 párov báz (B) Typ: nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia: lineárna Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie Antimediátorová: nie
Popis sekvencie : SEQ ID č. 8 : AAGGGCTCAA TGAGAGACAA AGCC
INFORMÁCIE O SEQ ID č. 9 :
Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka : 24 párov báz (B) Typ: nukleotid (C) Počet vlákien : jedno (D) Konfigurácia : lineárna Typ molekuly : cDNA Hypotetická: nie Antimediátorová: nie
Popis sekvencie : SEQ ID č. 9 : GTATGTATCA TCATATCCAT ATTC

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Derivát proteínu p62 schopný čiastočne inhibovať interakciu medzi proteínom GAP a p62, vyznačujúci sa tým, že obsahuje deléciu aspoň 10 aminokyselín v oblasti medzi aminokyselinovými zvyškami 145-247, čím stráca schopnosť proteínu p62 vstúpiť do interakcie s RNA a že obsahuje väčšinu z oblasti aminokyselín medzi 200 až 450 proteínu p62, ktorá má fosforylované tyrozíny lokalizované medzi zvyškami 200 a 450, umožňujúcu interakciu s oblasťou SH2 proteínu GAP.
  2. 2. Derivát podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že inhibuje signály prenášané prostredníctvom ras.
  3. 3. Derivát podľa nárokov la 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje deléciu aspoň 10 aminokyselín medzi aminokyselinovými zvyškami 145 až 247 v oblasti homológie s proteínom GRP33.
  4. 4. Derivát podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ide o polypeptid obsahujúci celú sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo jej časť, alebo jej variant, ktorý kóduje polypeptid zachovávajúci si uvedené vlastnosti.
  5. 5. Polypeptid Δρ62 so sekvenciou SEQ ID NO: 2.
  6. 6. Derivát podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vo väčšine oblasť nesúcu fosforylované tyrozíny proteínu p62.
  7. 7. Derivát podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že ide o polypeptid obsahujúci celú sekvenciu SEQ ID NO: 3 alebo jej časť, ktorá kóduje polypeptid zachovávajúci si uvedené vlastnosti.
  8. 8. Polypeptid p62-C so sekvenciou SEQ ID NO: 3.
  9. 9. Nukleová kyselina kódujúca polypeptid podľa nárokov 1 až 8.
  10. 10. Nukleová kyselina podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že ide o cDNA alebo RNA.
  11. 11. Nukleová kyselina podľa nárokov 9 alebo 10, vyznačujúca sa tým, že je zvolená z množiny zahrnujúcej:
    (a) celok alebo časť sekvencie SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 3, alebo jej komplementárneho vlákna, (b) sekvenciu hybridizujúcu so sekvcnciami (a) a kódujúcu derivát podľa nároku 1 a (c) varianty (a) a (b) vyplývajúce z degenerácie genetického kódu.
  12. 12. Nukleová kyselina so sekvenciou SEQ ID NO: 2.
  13. 13. Nukleová kyselina so sekvenciou SEQ IDNO: 3.
  14. 14. Expresná kazeta obsahujúca nukleovú kyselinu podľa nárokov 9 až 13, ďalej promótor umožňujúci jej expresiu a signál ukončenia transkripcie.
  15. 15. Vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa nároku 9 až 13 alebo kazetu podľa nároku 14.
  16. 16. Vektor podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že ide o vektor plazmidový.
  17. 17. Vektor podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že ide o vektor vírusový.
  18. 18. Vektor podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že vírusový vektor je odvodený z adeno vírusu, retrovírusu, vírusu AAV alebo herpetického vírusu.
  19. 19. Defektný rekombinantný retrovirus, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 9 až 13 alebo kazetu podľa nároku 14.
  20. 20. Defektný rekombinantný adenovírus, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 9 až 13 alebo kazetu podľa nároku 14.
  21. 21. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň nukleovú kyselinu podľa nároku 9.
  22. 22. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň jeden vektor podľa nároku 15.
  23. 23. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň jeden derivát podľa nároku 1.
  24. 24. Farmaceutická kompozícia podľa nárokov 21 až 23 na použitie na liečenie rakoviny.
  25. 25. Použitie nukleovej kyseliny podľa nároku 9 alebo vektora podľa nároku 15 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na ošetrenie hyperproliferatívnych porúch.
SK1613-97A 1995-06-01 1996-05-29 Proteín Deltap62, jeho varianty, nukleotidové sekvencie a ich využitie SK283071B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9506533A FR2734826B1 (fr) 1995-06-01 1995-06-01 Deltap62, ses variants, sequences nucleiques et leurs utilisations
PCT/FR1996/000802 WO1996038556A2 (fr) 1995-06-01 1996-05-29 Deltap62, ses variants, sequences d'acides nucleiques les codant, et leurs utilisations en therapie genique anti-cancereuse

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK161397A3 SK161397A3 (en) 1998-07-08
SK283071B6 true SK283071B6 (sk) 2003-02-04

Family

ID=9479588

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1613-97A SK283071B6 (sk) 1995-06-01 1996-05-29 Proteín Deltap62, jeho varianty, nukleotidové sekvencie a ich využitie

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6544948B1 (sk)
EP (1) EP0828832A2 (sk)
JP (1) JPH11506325A (sk)
KR (1) KR19990022193A (sk)
AU (1) AU718889B2 (sk)
BR (1) BR9608632A (sk)
CA (1) CA2219861A1 (sk)
CZ (1) CZ291533B6 (sk)
FR (1) FR2734826B1 (sk)
HU (1) HUP9901346A3 (sk)
IL (1) IL118493A0 (sk)
NO (1) NO975409L (sk)
SK (1) SK283071B6 (sk)
WO (1) WO1996038556A2 (sk)
ZA (1) ZA964392B (sk)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2493300A (en) * 1999-01-06 2000-07-24 Regents Of The University Of California, The Modulation of hiv replication using sam68
PT1414960E (pt) 2001-07-30 2008-04-28 G R M O Groupe De Rech En Mala Doença óssea de paget
JP6193231B2 (ja) * 2011-08-08 2017-09-06 チュアラボ オンコロジー, インコーポレーテッドCurelab Oncology, Inc. がんの治療および予防のための、ｐ６２に関する方法および組成物
WO2021231652A1 (en) * 2020-05-14 2021-11-18 Curelab Oncology, Inc. Using the p62 plasmid to treat or reduce the severity of coronavirus infections

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5610276A (en) * 1991-05-17 1997-03-11 Chiron Corporation Polypeptides and antibodies derived from GAP associated protein, p62
KR100356615B1 (ko) * 1993-07-13 2003-04-03 아방티 파르마 소시에테 아노님 결함아데노바이러스벡터및유전자치료에서그의사용

Also Published As

Publication number Publication date
SK161397A3 (en) 1998-07-08
US6544948B1 (en) 2003-04-08
ZA964392B (en) 1996-12-09
FR2734826B1 (fr) 1997-07-04
WO1996038556A2 (fr) 1996-12-05
CA2219861A1 (fr) 1996-12-05
NO975409D0 (no) 1997-11-25
WO1996038556A3 (fr) 1997-01-09
MX9708877A (es) 1998-03-31
CZ291533B6 (cs) 2003-03-12
IL118493A0 (en) 1996-09-12
EP0828832A2 (fr) 1998-03-18
KR19990022193A (ko) 1999-03-25
HUP9901346A2 (hu) 1999-08-30
AU6129196A (en) 1996-12-18
FR2734826A1 (fr) 1996-12-06
CZ375997A3 (cs) 1998-02-18
HUP9901346A3 (en) 2000-10-30
BR9608632A (pt) 1999-05-04
JPH11506325A (ja) 1999-06-08
NO975409L (no) 1997-11-25
AU718889B2 (en) 2000-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU722782B2 (en) Antagonists of the oncogenic activity of the MDM2 protein and their use in the treatment of cancers
EP0938553B1 (en) Dna encoding dp-75 and a process for its use
US6238918B1 (en) DNA sequence encoding the tumor suppressor gene ING1
SK286955B6 (sk) Varianty proteínu p53 a ich terapeutické použitie
US7329741B2 (en) Polynucleotides that hybridize to DP-75 and their use
HU226330B1 (en) Anti-p53 single-chain antibody fragments and their uses to produce pharmaceutical compositions
SK283071B6 (sk) Proteín Deltap62, jeho varianty, nukleotidové sekvencie a ich využitie
EP0846761A1 (en) A novel transcription factor expressed in cycling cells, nucleic acid molecules encoding said transcription factor and its promoter region and uses thereof
MXPA97008877A (en) P62, its variants, the nucleic acid sequences that code them, and its use in anti-cancer gene therapy
US6747133B1 (en) Antibodies against the tumor suppressor gene ING1
CA2315275A1 (en) P53 regulatory protein called rb18a and uses thereof
MXPA98001407A (en) Antagonists of the oncogenic activity of the mdm2 protein, and its use in the treatment of the cance