SK286955B6 - Varianty proteínu p53 a ich terapeutické použitie - Google Patents

Varianty proteínu p53 a ich terapeutické použitie Download PDF

Info

Publication number
SK286955B6
SK286955B6 SK63-98A SK6398A SK286955B6 SK 286955 B6 SK286955 B6 SK 286955B6 SK 6398 A SK6398 A SK 6398A SK 286955 B6 SK286955 B6 SK 286955B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
protein
leu
lys
glu
seq
Prior art date
Application number
SK63-98A
Other languages
English (en)
Other versions
SK6398A3 (en
Inventor
Emmanuel Conseiller
Laurent Bracco
Original Assignee
Aventis Pharma S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma S. A. filed Critical Aventis Pharma S. A.
Publication of SK6398A3 publication Critical patent/SK6398A3/sk
Publication of SK286955B6 publication Critical patent/SK286955B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Opisujú sa proteíny odvodené od produktu supresorového nádorového génu p53, ktorý má vylepšené funkcie z pohľadu terapeutického použitia. Výhodne sa opisujú proteíny, ktoré majú supresorové nádorové funkcie a inhibítor programovanej bunkovej smrti vylepšenej predovšetkým v patologických súvislostiach proliferácie, v ktorých proteín p53 divého typu je inaktívny. Opisujú sa predovšetkým nukleové kyseliny kódujúce tieto molekuly, vektory ich obsahujúce a ich terapeutické použitie, predovšetkým v génovej terapii.

Description

Predložený vynález sa týka proteínov odvodených od produktu nádorového supresorového génu p53, ktoré majú zlepšené funkcie vzhľadom na terapeutické použitie. Výhodne sa tiež týka proteínov, ktoré majú nádorové supresorové funkcie a funkcie induktora programovanej bunkovej smrti, ktoré vynikajú nad funkciami proteínu p53 divého typu, predovšetkým v patologických súvislostiach proliferácie, v ktorých proteín p53 divého typu je neaktívny. Týka sa predovšetkým nukleových kyselín kódujúcich tieto molekuly, vektorov ktoré ich obsahujú a ich terapeutického použitia, predovšetkým v génovej terapii. Produkty podľa vynálezu sú prispôsobené obzvlášť oprave funkcie p53 v patologických súvislostiach, predovšetkým rakovinových.
Doterajší stav techniky
Divý proteín p53 zasahuje do regulácie bunkového cyklu a do udržovania celistvosti genómu bunky. Tento proteín, ktorého základná funkcia je byť aktivátorom transkripcie určitých génov, je schopný procesmi, ktoré nie sú ešte dobre definované, blokovať bunku vo fáze G1 bunkového cyklu, teda nájsť mutácie v priebehu replikácie genómu a spustiť určitý počet opráv DNA. V prípade zlého fungovania procesov opráv alebo v prípade nájdenia veľkého množstva mutačných dejov je tento proteín schopný indukovať fenomén programovanej bunkovej smrti, nazvanej apoptóza.
Takýmto spôsobom proteín p53 pôsobí ako nádorový supresor pri vylúčení nepravidelne rozdelených buniek alebo buniek, ktorých genóm bol poškodený.
Táto hlavná funkcia proteínu p53 závisí od funkcie faktora transkripcie, inými slovami závisí od dvoch schopností rozpoznávať špecifické sekvencie na úrovni genomickej DNA a získavať všeobecné vybavenie transkripcie.
Proteín p53 obsahuje 393 aminokyselín, ktoré definujú päť funkčných domén (pozri obrázok 1):
- Aktivačná doména transkripcie, tvorená aminokyselinami 1 až 73, schopná viazať určité faktory všeobecného vybavenia transkripcie ako proteín TBP. Táto doména je tiež sídlom určitého počtu posttranslačných modifikácií. Je tiež miestom množstva interakcií proteínu p53 s množstvom iných proteínov, predovšetkým s bunkovým proteínom mdm2 alebo proteínom EBNA5 vírusu Epstein-Barr (EBV), schopných blokovať funkciu divého proteínu. Táto doména má sekvenciu aminokyselín nazvanú PEST citlivú k proteolytickej degradácii.
- DNA väzbová doména, umiestnená medzi aminokyselinami 73 až 315. Konformácia tejto centrálnej domény proteínu p53 riadi rozpoznanie špecifických sekvencii DNA proteínom p53. Táto doména je sídlom dvoch typov zmien určujúcich funkciu divého proteínu:
(i) Interakcie s proteínmi blokujúcimi funkciu proteínu p53 ako antigén „veľké T“ vírusu SV40 alebo vírusovými proteínmi E6 vírusov HPV16 a HPV18 schopných vyvolať svoju degradáciu ubikvitinovým systémom. Táto posledne zmienená interakcia môže byť uskutočnená len za prítomnosti bunkového proteínu EPap (enzým E3 ubikvitinovej kaskády).
(ii) Bodové mutácie, ktoré určujú funkciu proteínu p53 a ako akýsi celok sú umiestnené v tejto oblasti.
- Signál nukleárnej lokalizácie, tvorený aminokyselinami 315 až 325, nepostrádateľný na správne rozpoznanie proteínu v mieste, kde bude vykonávať svoju základnú funkciu.
- Oblasť oligomerizácie, tvorená aminokyselinami 325 až 355. Táto oblasť 325 až 355 tvorí štruktúru typu: skladaného listu (326 až 334) - zlom (335 až 336) - hélix (337 až 355). Zmeny funkcií umiestnených v tejto oblasti sú predovšetkým spôsobené interakciami divého proteínu s rôznymi mutovanými formami, ktoré môžu viesť k rôznym vplyvom na funkciu divého proteínu.
- Doména regulácie, tvorená aminokyselinami 356 až 393 je miestom určitého počtu posttranslačných modifikácií (glykozylácia, fosforylácia, fixácia RNA ...), ktoré modulujú funkciu proteínu p53 pozitívnym alebo negatívnym spôsobom. Táto doména hrá veľmi dôležitú úlohu v modulácii aktivity divého proteínu.
Funkcia proteínu p53 môže byť narušená rôznymi spôsobmi.
- Blokácia jeho funkcie určitým počtom faktorov, napríklad antigénom „veľké T“ vírusu SV40, proteínom EBNA5 vírusu Epstein-Barr alebo bunkovým proteínom mdm2.
destabilizácia proteínu zväčšením jeho citlivosti k proteolýze, predovšetkým interakciou s proteínom E6 vírusu ľudského papilómu HPV16 a HPV18, ktorý podporuje vstup proteínu p53 do ubikvitinového cyklu. V prípade interakcie medzi týmito dvoma proteínmi sa môže previesť destabilizácia len predbežnou fixáciou bunkového proteínu, proteínu E6ap, ktorého miesto fixácie je málo známe.
- Bodové mutácie na úrovni génu proteínu p53.
- Delécie jednej alebo dvoch aliel proteínu p53.
Posledné dva typy modifikácií boli nájdené asi v 50 % rôznych typov rakoviny. Po tejto stránke mutácie génu proteínu p53 opísané v rakovinových bunkách zasahujú veľkú časť génu kódujúceho tento proteín a majú za následok rôzne mutácie funkcií tohto proteínu. Môže sa uviesť, že tieto mutácie sú z veľkej časti umiestnené v centrálnej časti proteínu p53, pri ktorej sa vie, že to je oblasť kontaktu proteínu p53 so špecifickou genomickou sekvenciou.
To vysvetľuje, prečo väčšina mutácií proteínu p53 nemá ako základnú charakteristiku možnosť fixovať sa na sekvencie DNA-kyseliny, ktorá rozpozná divý proteín a tiež možnosť vyvolať svoju úlohu transkripčného faktora. Inak sa zdá, že určité mutácie majú skúsenosti takých nových funkcií, ako je aktivácia určitých génov na úrovni transkripcie.
Súbor týchto modifikácií sa delí v súčasnej dobe do troch kategórií:
- Mutácie nazývané slabé, ktorých produkt je nefunkčný proteín, ktorý v prípade mutácie na jednej z dvoch aliel, neudeľuje funkciu divého proteínu kódovaného druhou alelou. Zástupcovia uvedení v tejto kategórii sú mutanty H273 a W248, tento posledný uvedený mutant je špecifický rodinnému syndrómu Li-Fraumeni hypersenzibility k rakovinovým chorobám.
- Dominantné negatívne mutácie, ktorých produktom je nefunkčný proteín, ktorý v prípade mutácie na jednej z dvoch aliel interakciou s divým proteínom je schopný blokovať funkciu tohto proteínu tvorbou zmesi neaktívnych oligomérov, ktoré sa už nemôžu fixovať na špecifickú sekvenciu DNA divého proteínu. Zástupca predstavujúci túto kategóriu je mutant G281.
- Dominantné onkogénne mutácie, ktorých produktom je proteín, ktorý je schopný jednak blokovať funkciu divého proteínu, ako je mutácia predchádzajúcej kategórie, a jednak podporovať málo známymi mechanizmami nádorový vývoj predstavujúci tak zosilnenie funkcie. Zástupca predstavujúci túto kategóriu je mutant H175.
Divoký gén p53 bol použitý v terapeutických génových a bunkových prístupoch vzhľadom na jeho antinádorové a apoptické vlastnosti a na jeho implikáciu v množstve patológií hyperproliferatívneho typu. Bolo tiež navrhnuté liečiť určité hyperproliferatívne patológie, predovšetkým rakoviny, podávaním in vivo divého génu p53, obnovou funkcií proteínu p53. Podávanie môže byť uskutočnené predovšetkým prostredníctvom vírusových vektorov, predovšetkým adenovírusov (WO94/24297) alebo retrovírusov (W094/06910).
Bolo tiež dokázané, že vloženie nukleovej kyseliny kódujúcej divý proteín p53 umožňuje opraviť čiastočne normálnu reguláciu bunkového rastu. Ak tieto výsledky budú povzbudivé, účinnosť takéhoto prístupu bude obmedzená terapeutickou účinnosťou proteínu p53 po prenose a expresii in vivo v hyper-proliferatívnych bunkách. Patologické hyperproliferatívne stavy sú také, ako sú rakoviny pochádzajúce z porúch rovnováhy, ktorá sa dostaví pri negatívnych alebo pozitívnych regulátoroch bunkového rastu. Inaktivácia negatívneho regulátora uskutočnená divým proteínom p53, objavením dominantného negatívneho mutantu p53 jednej z dvoch aliel a zvýšená supresia bunkového proteínu inaktivujúceho p53, ako napríklad mdm2, pozri prítomnosť vírusového inaktivátora nasledovaného infekciou, tvorí nepriaznivú spojitosť s terapiou založenou na reintrodukcii divého proteínu p53, ktorý je silne ohrozený, že bude tiež inaktivovaný.
teda obzvlášť dôležité upraviť proteíny typu p53, ktoré majú rozšírené terapeutické vlasnosti. Predovšetkým bude obzvlášť podstatne výhodné upraviť aktívne molekuly p53, aby boli necitlivé na vplyv inaktivátorov dominantných negatívnych mutantov a onkogénnych mutantov, iných bunkových proteínov alebo vírusových proteínov, napríklad E6 HPV18 a HPV16, MDM2, EBNA5 EBV atď. vyskytujúcich sa v nádorových bunkách.
Isté modifikácie proteínu p53 boli opísané vo vedľajších odboroch. Tiež prihláška vynálezu WO95/06661 opisuje modifikácie určitých rezíduí homologickej oblasti proteínu p53, predovšetkým v oblastiach 343-351, 372-380 a 381-393. Tieto modifikácie sú druhoradé a nedovoľujú výsledným produktom, aby unikli mechanizmu inaktivácie proteínu p53 in vivo. Tieto proteíny majú zvýšenú aktivitu vzhľadom na divý proteín p53.
Hupp at al. (Celí Vol 71 (1992)875) opísali derivát proteínu p53 obsahujúci deléciu 30 rezíduí C-konca (p53 C-ter30). Tentokrát, ak tento proteín si zachováva schopnosť viazať DNA, jeho apoptické vlastnosti nie sú dokázané. Nie je rezistentný na inaktiváciu dominantnými negatívnymi mutantmi.
Pietenpol et al. (PNAS 91 (1994)1998) opísali chiméme molekuly odvodené od proteínu p53, predovšetkým proteínu VP16-p53 (80-343)-GCN4. Táto molekula má schopnosť viazať DNA a schopnosť transfekcie jasne zníženú vzhľadom na divý proteín p53 (40 %). Inak obsahuje oblasť neselektívnej oligomerizácie, ohrozujúcu interakciu s inými bunkovými zlúčeninami, a tak ohrozuje indukciu nešpecifickej bunkovej odpovede. Vlastnosti rezistencie k inaktivačnému mechanizmu nie sú indikované.
Podstata vynálezu
Predložený vynález opisuje nové varianty proteínu p53, ktoré majú zlepšené terapeutické vlastnosti. Opisuje predovšetkým varianty prispôsobené terapeutickému génovému použitiu, predovšetkým protirakovinovému. Varianty podľa vynálezu odvodené od proteínu p53 štruktúrnou modifikáciou alebo štruktúrnymi modifikáciami si zachovávajú aktivitu typu p53 a exprimované v hyperproliferatívnych bunkách predkladajú aspoň jednu vlastnosť zlepšenú vzhľadom na proteín p53. Môže ísť predovšetkým o antiproliferatívnu aktivitu a/alebo apoptickú aktivitu. Varianty podľa vynálezu majú výhodne antiproliferatívnu vlastnosť a/alebo apop
SK 286955 Β6 tickú vlastnosť, buď špecifickejšiu hyperproliferativnym bunkám, alebo menej citlivú k rôznym zmenám, ktorým je podrobený divý proteín p53.
Prvý predmet vynálezu sa týka predovšetkým variantu proteínu p53, v ktorej celok alebo časť oblasti oligomerizácie je deletovaná a nahradená umelou oblasťou leucínového zipsu. Ako je už naznačené, proteín p53 je inaktivovaný istými mutantmi, predovšetkým dominantnými negatívnymi mutantmi a onkogénnymi mutantmi, ktoré sa vyskytujú v nádorovej bunke. Táto inaktivácia je výsledkom tvorby zmesi neaktívnych oligomérov interakciou medzi divým proteínom p53 a mutantom, ktorý sa už nemôže fixovať na špecifickú sekvenciu rozpoznanú divým proteínom p53. Predložený vynález opisuje teraz varianty proteínu p53 odolné proti dominantnému negatívnemu vplyvu určitých mutácií, takže opisuje aktívne varianty v bunkovej súvislosti predstavujúcej jednu alebo dve mutované alely, to je prípad viac ako 90 % ľudských rakovín závislých od p53.
Vo variantoch podľa vynálezu celok alebo časť prírodnej domény oligomerizácie proteínu, ktorý nerobí rozdielnosť medzi divými formami a mutantmi, je nahradený ekvivalentnou doménou majúcou schopnosť špecifickej oligomerizácie. Táto modifikácia je uskutočnená s použitím umelého leucínového zipsu optimalizovaného na tvorbu dimérov. Molekuly podľa vynálezu obsahujúce taký umelý leucínový zips sú predovšetkým výhodné, pretože tvoria oligoméry jedine s ďalšími molekulami nesúcimi rovnaký leucínový zips. Netvoria tak oligoméry s dominantnými negatívnymi mutantmi alebo onkogénnymi mutantmi proteínu p53 schopnými ich inaktivovať. Netvoria ani oligoméry s ďalšími bunkovými proteínmi nesúcimi doménu oligomerizácie, schopné ich tak inaktivovať alebo indukovať nežiaduce vplyvy. Môžu tvoriť len homooligoméry, majú tak dôležitú selektivitu zaisťujúcu lepšiu aktivitu v súvislosti s hyperproliferatívnymi patológiami.
Podľa predloženého vynálezu umelá doména leucínového zipsu je tak výhodne doménou neprítomnou v prírodnom stave zaisťujúcou oligomerizačnú selektivitu. Doména oligomerizácie ie reprezentovaná sekvenciou SEQ ID NO: 1.
V uprednostnenom spôsobe uskutočnenia vynálezu varianty zahŕňajú deléciu celku alebo časti domény oligomerizácie a celku alebo časti regulačnej domény. Ako je už skôr naznačené, doména oligomerizácie je umiestnená medzi rezíduami 325-393 vrátane. Tento typ variantu je celkom výhodný, pretože je úplne alebo čiastočne bez účinkov negatívnej regulácie uskutočnenej prostredníctvom časti C-konca (aa 365-393). Tieto varianty tvoria proteíny potenciálne podstatne aktívne, predstavujúce aktivitu nemodulovateľnú a prípadne zväčšenú. Oblasť regulácie je výhodne úplne zrušená. Uprednostnené varianty podľa vynálezu zahŕňajú deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 326 alebo 337.
Príklady sprostredkovateľov použitých na konštrukciu týchto variantov sú predovšetkým:
- pEC107 (75-325-Iz) majúci deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 326 nahradenú umelou doménou oligomerizácie sekvencie SEQ ID NO: 1,
- pECl 10 (75-336-Iz) majúci deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 337 nahradenú umelou doménou oligomerizácie sekvencie SEQ ID NO: 1.
Podľa spôsobu uskutočnenia je výhodne vo variantoch podľa vynálezu cysteín v pozícii 182 proteínu p53 nahradený histidínom. Táto mutácia dovoľuje výhodne zvýšiť afinitu väzby variantu na špecifické nukleotidové sekvencie. Vloženie tejto doplnkovej modifikácie dovoľuje teda získať molekulu majúcu väčší transaktivačný potenciál.
Presné príklady konštrukcií tvorených na prípravu variantov podľa vynálezu kombinujúcich tieto rôzne modifikácie sú predovšetkým:
- pEC139 (75-325(H182)-Iz) majúci deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 336 nahradenú umelou doménou oligomerizácie sekvencie SEQ ID NO: 1 a histidínom v polohe 182,
- pEC140 (75-336(H182)-Iz) majúci deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 337 nahradenú umelou doménou oligomerizácie sekvencie SEQ ID NO: 1 a histidínom v polohe 182.
Výhodne je vo variantoch podľa vynálezu celok alebo časť transaktivačnej domény deletovaný a nahradený heterológnou transaktivačnou doménou. Už skôr bolo naznačené, že transaktivačné funkcie proteínu p53 sú podstatné na svoju nádorovú supresorovú aktivitu alebo indukciu apoptózy. Aby sa zvýšil terapeutický potenciál variantov podľa vynálezu, je predovšetkým výhodné nahradiť prírodnú transaktivačnú doménu heterológnou transaktivačnou doménou. Tieto varianty majú tiež množstvo nevýhod. Majú, ako sa dalo očakávať, vysokú transaktivačnú aktivitu. Sú ale tiež bez citlivosti na vplyvy negatívnej regulácie vykonávané prostredníctvom časti N-konca (aa 1-73). V skutočnosti táto oblasť obsahuje sekvenciu PEST zodpovednú za svoju proteolytickú degradáciu. Substitúcia tejto oblasti heterologickou transaktivačnou doménou bez sekvencií PEST dovoľuje znížiť túto negatívnu reguláciu. Tieto varianty sú tiež charakterizované znížením, dokonca aj supresiou, každej interakcie s proteínom E6 vírusu ľudského palindrómu (HPV), ktorý je schopný indukovať ich degradáciu. Sú tiež menej citlivé na interakcie s ďalšími bunkovými proteínmi takými, ako sú MDM2 a EBNA, ktoré určujú aktivitu divého proteínu p53. Varianty takto získané majú tak zvýšenú stabilitu. Supresia citlivých oblastí k negatívnej regulácii (regulačná a transaktivačná doména) predovšetkým spôsobuje to, že molekuly už nie sú cieľom proteínov indukujúcich ich proteolýzu alebo ich inaktiváciu.
Výhodne je vo variantoch podľa vynálezu transaktivačná doména odstránená deléciou rezíduí 1 až 74. Prechodné konštrukcie použité na realizáciu takýchto molekúl sú predovšetkým pEC107 (75-325-Iz), pECHO (75-336-Iz), pEC139 (75-325(H182)-Iz) a pEC140 (75-336(H182)-Iz).
Podľa prvého spôsobu realizácie heterológna transaktivačná doména je transaktivačná doména VPI6. Je výhodne zložená z rezíduí 411 až 490 V916, ktorých sekvencia je daná SEQ ID NO: 2. Presné príklady variantov podľa vynálezu kombinujúce tieto rôzne modifikácie sú predovšetkým:
- pECl 14 (VP16-75-325-IZ) majúci deléciu časti N-konca proteínu p53 obsahujúcej rezíduá 1 až 74, nahradenú transaktivačnou doménou VPI6 sekvencie SEQ ID NO: 2 a deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 326 nahradenú umelou doménou oligomerizácie sekvencie SEQ ID NO: 1. Úplná sekvencia variantu pEC114 je reprezentovaná SEQ ID NO: 25.
- pECllô (VP16-75-336-Iz) majúci deléciu časti N-konca proteínu p53 obsahujúcej rezíduá 1 až 74, nahradenú transaktivačnou doménou VPI6 sekvencie SEQ ID NO: 2 a deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 337 nahradenú umelou doménou oligomerizácie sekvencie SEQ ID NO: 1. Úplná sekvencia variantu pECl 16 je reprezentovaná SEQ ID NO: 26.
- pEC147 (VP16-75-325(H182)-Iz) majúci deléciu časti N-konca proteínu p53 obsahujúcej rezíduá 1 až 74, nahradenú transaktivačnou doménou VP16 sekvencie SEQ ID NO: 2 a deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 326 nahradenú umelou doménou oligomerizácie sekvencie SEQ ID NO: 1, a histidín v polohe 182.
- pEC149 (VP16-75-336(H182)-Iz) majúci deléciu časti N-konca proteínu p53 obsahujúcej rezíduá 1 až 74, nahradenú transaktivačnou doménou VPI6 sekvencie SEQ ID NO: 2 a deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 337 nahradenú umelou doménou oligomerizácie sekvencie SEQ ID NO: 1, a histidín v polohe 182.
Vzhľadom na skôr spomenuté modifikácie variantov podľa vynálezu majú tiež vlastnosti „vražedné“, ktoré vedú k zastaveniu bunkového cyklu a potenciálne zvýšenej apoptóze. Kombinácie spomenutých modifikácií, zahŕňajúce prítomnosť selektívnej domény oligomerizácie a transaktivačná schopnosť zvýšenou substitúciou pôvodnej domény a prítomnosťou histidínu v polohe 182 udeľujú naozaj variantom podľa vynálezu terapeutické potenciály jasne zlepšené. Okrem toho varianty podľa vynálezu umožňujú vyhnúť sa určitým mutáciám (dominantným onkogénnym). Zosilnené funkcie určitých mutácii proteínu p53 sú ešte málo definované na úrovni ich mechanizmov na úrovni domén proteínu p53. Je teda silne pravdepodobné, že tieto nové funkcie budú závisieť od kombinovania s určitými partnerskými molekulovými efektormi. Eliminácie implikovaných domén z týchto interakcii, ktorých transformačné vlastnosti boli dokázané v zmysle opísaných molekúl v predloženej prihláške vynálezu, sú takej povahy, že zabraňujú zvýšeniu onkogénnych funkcií. Tiež mutácie, ktoré sa objavujú náhodným spôsobom v priebehu prípravy klinických častí plazmidov kódujúcich opísané polypeptidy alebo v priebehu produkcie klinických častí vírusových alebo chemických vektorov kódujúcich tie isté polypeptidy, nevytvárajú podpopuláciu onkogénnych molekúl.
Vzhľadom na supresiu určitých domén proteínu p53 nevyhnutných na fixáciu určitých inhibičných molekúl svojej funkcie varianty podľa vynálezu majú tiež terapeuticky vyššiu a stabilnejšiu aktivitu. Existencia cudzích motívov v rôznych konštrukciách podľa vynálezu (napr. myší proteín AS, umelá doména oligomerizácie atď.) je schopná začať imunitnú reakciu v priebehu smrti transfekovaných buniek v extracelulámom prostredí týchto rôznych fragmentov, zvyšujúcich tak schopnosť imunitného systému k boju proti nádorovým bunkám
Podľa iného spôsobu uskutočnenia heterológna transaktivačná doména je transaktivačná doména aktívna prednostne v transformovaných bunkách a tlie v zdravých príbuzných bunkách. Predložený vynález skutočne opisuje tiež molekuly, ktorých funkcia sa vyskytuje predovšetkým v transformovaných bunkách a nie v zdravých príbuzných bunkách. Zdá sa, že expresia exogénu divého proteínu p53 uprostred bunkového delenia zahŕňajúca endogén divého proteínu p53 má malý alebo žiadny vplyv na životaschopnosť, ale je výhodná možnosť upraviť proteín, ktorý bude nefunkčný uprostred cieľovej bunky. Táto špecifickosť nádorových buniek oproti normálnym bunkám je v súčasnej dobe pokročilo spracovaná na úrovni špecifickosti cieľového vírusového vektora alebo na úrovni koncepcie špecifického expresného systému. Predložený vynález teraz opisuje deriváty proteínu p53, ktorého jedna z funkčných domén je v neprítomnosti bunkového aktivátora prítomná, predovšetkým v transformovaných bunkách.
Iný predmet predloženého vynálezu sa týka variantu proteínu p53 aktívneho prednostne v transformovaných bunkách, v ktorých aspoň jedna z funkčných domén proteínu p53 je deletovaná celá alebo čiastočne a je nahradená heterológnou doménou aktívnou predovšetkým v transformovaných bunkách. Funkčná doména proteínu p53 je doména transaktivačná. Predmet uprednostňovaný predovšetkým podľa vynálezu sa týka variantu proteínu p53 aktívneho prednostne v transformovaných bunkách, v ktorých prírodná transaktivačná doména je deletovaná celá alebo sčasti a je nahradená transaktivačnou doménou aktívnou predovšetkým v transformovaných bunkách. Prírodná transaktivačná doména je deletovaná supresiou rezíduí 1 až 74 vrátane proteínu p53.
Predložený vynález sa týka predovšetkým variantov proteínu p53, ktoré sú špecificky funkčné v prítomnosti onkogénneho proteínu Ras alebo mutantu proteínu p53. Tieto molekuly sú získané predovšetkým na hradením transaktivačnej domény divého proteínu p53 proteínovou doménou schopnou špecificky viazať transaktivátor alebo transaktivačný komplex prítomný v transformovanej bunke.
Proteínová doména schopná špecificky viazať transkripčný transaktivátor alebo transkripčný transaktivátorový komplex prítomný v molekulách vynálezu môže byť rôzneho typu. Môže ísť predovšetkým o doménu oligomerizácie v prípade, kde transaktivátor alebo transaktivačný komplex zahŕňa predovšetkým jednu takú doménu. Môže tiež ísť o syntetickú doménu alebo známu prírodnú doménu, ktorá by interagovala s uvedeným transaktivátorom alebo transaktivačným komplexom. Môže tiež ísť o protilátky, buď fragment, alebo derivát protilátky, nasmerované proti transaktivátoru alebo transaktivačnému komplexu.
Heterologická doména je tvorená protilátkou, buď fragmentom, alebo derivátom protilátky. Fragmenty alebo deriváty protilátok sú napríklad fragmenty Fab alebo f(ab)'2, oblasti VH alebo VL protilátky, alebo tiež protilátky jednoduchého reťazca (ScFv) obsahujúce oblasť VH naviazanú na oblasť VL ramenom. Konštrukcia sekvencii nukleových kyselín kódujúcich takéto protilátky modifikované podľa vynálezu boli opísané napríklad v US 4 946 778 alebo v prihláškach vynálezu W094/02610, WO94/29446.
Uprednostňovaná konštrukcia podľa vynálezu zahŕňa protilátku ScFv nasmerovanú proti mutantu proteínu p53. Tieto mutanty sa objavujú v transformovaných bunkách a majú transaktivačnú doménu. Ich získavanie variantom podľa vynálezu tvorí chimému molekulu aktívnu predovšetkým v transformovaných bunkách.
Podľa iného uprednostňovaného spôsobu, protilátka ScFv je nasmerovaná proti transaktivačnému komplexu, taktiež komplexu medzi cieľovou molekulou prítomnou obzvlášť v transformovaných bunkách, ale bez transkripčnej aktivity transaktivátora (napríklad onkogénny ras) a molekulou nesúcou transaktivačnú doménu. Táto molekula výhodne zahŕňa transaktivačnú doménu a doménu selektívne viazanú k uvedenej bunkovej molekule (napríldad ScFv anti-ras). Fixácia tejto molekuly dovoľuje tvorbu binárneho transkripčného komplexu transaktivátora, ktorý vyvoláva komplex, ktorý je teda získaný variantom podľa vynálezu.
Všetky ďalšie typy modifikácií vedúce k týmto špecifickým aktivitám môžu byť použité v rámci predloženého vynálezu rovnako ako každá transaktivačná doména špecifická pre určitý typ bunky.
Tieto selektívne varianty obsahujú výhodne doplnkové modifikácie v časti C-konca, ako je už naznačené, na zlepšenie ich vlastností. Obsahujú tiež výhodne deléciu celku alebo časti domény oligomerizácie, ktorá môže byť nahradená celou heterologickou doménou oligomerizácie. Ide predovšetkým o umelú doménu oligomerizácie takú, aká je už definovaná.
Presné príklady variantov podľa vynálezu aktívnych predovšetkým v transformovaných bunkách sú predovšetkým:
- ScFv.antip53*-75-325-Iz majúci deléciu časti N-konca proteínu p53 obsahujúceho rezíduá 1 až 74, substituovanú proteínovou doménou schopnou špecificky viazať mutant proteínu p53 prítomný v transformovanej bunke a deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 326, substituovanú umelou doménou oligomerizácie sekvencie SEQID NO: 1.
- ScFv.antip53*-75-325(H182)-Iz obsahujúci navyše mutáciu His 182.
- ScFv.antip53*-75-336-Iz majúci deléciu časti N-konca proteínu p53 obsahujúceho rezíduá 1 až 74, substituovanú proteínovou doménou schopnou špecificky viazať mutant proteínu p53 prítomný v transformovanej bunke a deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 337, substituovanú umelou doménou oligomerizácie sekvencie SEQ ID NO: 1.
- ScFv.antip53*-75-336(H182)-Iz obsahujúci navyše mutáciu His 182.
- ScFv.antip53 *-75-393 majúci deléciu časti N-konca proteínu p53 obsahujúceho rezíduá 1 až 74, substituovanú proteínovou doménou schopnou špecificky viazať mutant proteínu p53 prítomný v transformovanej bunke.
ScFv.antip53*-75-393(H182)-Iz obsahujúci navyše histidín v polohe 182.
- ScFv.antip53*-75-367 majúci deléciu časti N-konca proteínu p53 obsahujúceho rezíduá 1 až 74, substituovanú proteínovou doménou schopnou špecificky viazať mutant proteínu p53 prítomný v transformovanej bunke a deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 368.
- ScFv.antip53*-75-367(H182) obsahujúci navyše histidín v polohe 182.
- ScFv.antip53*-75-AS majúci deléciu časti N-konca proteínu p53 obsahujúceho rezíduá 1 až 74, substituovanú proteínovou doménou schopnou špecificky viazať mutant proteínu p53 prítomný v transformovanej bunke a deléciu časti C-konca proteínu p53 od rezídua 367, pridanú k 19 aminokyselinám sekvencie SEQ ID NO: 3.
- ScFv.antip53*-75-AS(H182) obsahujúci navyše histidín v polohe 182.
Termín aktívny naznačuje, že tieto varianty skúšajú svoju aktivitu predovšetkým až keď sú exprimované v transformovaných bunkách. Zvyšková aktivita predsa len môže byť v bunkách netransformovaných, ale je nižšia ako v bunkách transformovaných.
Iný predmet predloženého vynálezu sa týka variantu proteínu p53 zahŕňajúceho deléciu na C-konci od rezídua 367, zlúčenú so sekvenciou SEQ ID NO: 3 (AS). Táto sekvencia zodpovedá 19 posledným aminokyselinám produktu alternatívneho myšieho proteínu p53. Tento variant predstavuje teda modifikáciu domény oligomerizácie založenú na proteíne opísanom pri krysách ako alternatívny variant divého proteínu, v ktorom aminokyselín C-konca je nahradených 19 rôznymi aminokyselinami. Tento variant má afinitu k špecifickým sekvenciám väzby k DNA potenciálne zvýšenú.
Tento variant výhodne zahŕňa modifikácie v časti N-konca, ako je už naznačené, na zlepšenie ich vlastností. Výhodne obsahuje deléciu celej alebo časti transaktivačnej domény, ktorá môže byť nahradená heterológnou transaktívačnou doménou. Ide predovšetkým o transaktivačnú doménu odvodenú od proteínu VPI6 alebo proteínovú doménu schopnú špecificky viazať transaktivátor alebo transaktivačný komplex prítomný v transformovanej bunke. Okrem toho rezíduum 182 proteínu p53 je výhodne nahradené histidínom.
Presné príklady typu variantov podľa vynálezu sú predovšetkým:
- ScFv.antip53*-75-AS už skôr opísaný,
- pEC143(VP16-75-AS) majúci deléciu časti N-konca proteínu p53 obsahujúceho rezíduá 1 až 74, substituovanú proteínovou transaktívačnou doménou VPI6 sekvencie SEQ ID NO: 2 a deléciu časti C-konca od rezídua 367, pridanú k 19 aminokyselinám sekvencie SEQ ID NO: 3. Kompletná sekvencia variantu pEC143 je predstavená SEQ ID NO: 28.
- ScFv.antip53*-75-AS(H 182) už skôr opísaný,
- pEC153(VP16-75-AS(H182)) zodpovedá pEC143 s histidínom v polohe 182.
Podľa všeobecnejšieho spôsobu sa vynález týka všetkých chimémych proteínov zahŕňajúcich transaktivačnú doménu, doménu DNA väzbovú, jadrovú rozpoznávajúcu doménu a doménu oligomerizácie, v ktorých DNA väzbové domény a jadrové rozpoznávacie domény sú tvorené aminokyselinami 75 až 325 ľudského divého proteínu p53 (SEQ ID NO: 4). Predkladáte! skutočne ukázal, že táto oblasť proteínu p53 spojená s transaktivačnými doménami prispôsobenými doménam oligomerizácie umožňuje tvorbu molekúl typu p53 majúce výhodné vlastnosti predovšetkým v oblasti stability, odolnosti k negatívnym vplyvom mutantov proteínu p53 a citlivosti k inaktivácii rôznymi bunkovými faktormi.
Podľa variantu DNA väzbová doména a jadrová rozpoznávajúca doména sú tvorené aminokyselinami 75 až 336 divého ľudského proteínu p53 (SEQ ID NO: 5).
Chiméme proteíny podľa predloženého vynálezu môžu zahŕňať rôzne typy transaktivačných domén. Môže ísť o transaktivačnú doménu proteínu p53. Môže predovšetkým ísť o heterológnu transaktivačnú doménu vybranú napríklad medzi transaktívačnou doménou VPI6 alebo proteínovou doménou schopnou špecificky viazať transaktivátor alebo transaktivačný komplex prítomný v transformovanej bunke.
Čo sa týka domény oligomerizácie, môže predovšetkým ísť o umelú doménu, teda špecifickú, napríklad umelý leucínový zips, predovšetkým sekvencia SEQ ID NO: 1.
Chiméme proteíny podľa predloženého vynálezu môžu okrem toho obsahovať histidín v polohe 182.
Presné príklady chimémych proteínov takých, aké sú opísané v predloženej prihláške vynálezu, sú predovšetkým pECl 14, pECl 16, pEC147 a pEC149.
Predložený vynález sa týka tiež každej nukleovej kyseliny kódujúcej variant alebo chimémy proteín takých, aké sú už definované.
Nukleová kyselina podľa vynálezu môže byť kyselina ribonukleová (RNA) alebo deoxyribonukleová (DNA). Okrem toho môže ísť o komplementárnu cDNA prípadne obsahujúcu jeden alebo viac intrónov génu p53. Môže byť ľudského pôvodu, zvieracieho, vírusového, syntetického alebo semisyntetického. Môže byť získaná rôznymi spôsobmi, predovšetkým chemickou syntézou s použitím sekvencii uvedených v prihláške vynálezu a napríklad syntetizátorom nukleových kyselín. Môže byť získaná triedením bánk pomocou špecifických sond, predovšetkým takých, aké sú opísané v prihláške vynálezu. Môže byť tiež získaná zmiešanými technikami zahŕňajúcimi chemické modifikácie (elongácia, delécia, substitúcia atď.) triedených sekvencii z bánk. Všeobecným spôsobom môžu byť nukleové kyseliny podľa predloženého vynálezu pripravené podľa všetkých odborníkom známych techník.
Nukleová kyselina podľa predloženého vynálezu je cDNA alebo RNA.
Nukleová kyselina podľa predloženého vynálezu je výhodne vybraná medzi:
(a) celá alebo časť sekvencii SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33 a 34 alebo ich komplementárne vlákno, (b) každá sekvencia hybridizujúca so sekvenciami (a) kódujúca derivát podľa vynálezu, (c) varianty (a) a (b) vyplývajúce z degenerácie genetického kódu.
Ako je už naznačené, predkladáte! teraz vytvoril nové sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce rôzne polypeptidy proteínu p53 majúce celkom významné antiproliferatívne a apoptické vlastnosti. Tieto nukleové kyseliny môžu byť použité ako terapeutické agens, s cieľom vyvolať v derivovaných bunkách podľa vynálezu schopnosť zničiť alebo opraviť bunkové disfiinkcie. V tomto ohľade predložený vynález sa týka predovšetkým kaziet expresie obsahujúcich nukleovú kyselinu takú, aká je už definovaná, promótor umožňujúci jej expresiu a terminačný signál transkripcie. Promótor je výhodne vybraný medzi funkčnými promótormi v cicavčích bunkách, predovšetkým ľudských. Ide predovšetkým o promótor umožňujúci expresiu nukleovej kyseliny v hyperproliferatívnej bunke (napr. karcinogénna). V tomto ohľade môžu byť použité rôzne promótory. Môže ísť napríklad o vlastný promótor génu p53. Môže ísť predovšetkým o oblasti rôzneho pôvodu (zodpovedné za expresiu ďalších proteínov alebo syntetických proteínov). Môže ísť o každý promótor alebo od
SK 286955 Β6 vodenú sekvenciu stimulujúcu alebo potlačujúcu transkripciu génu špecificky alebo nešpecifický, indukovateľne alebo neindukovateľne, silno alebo slabo. Môžu sa uviesť predovšetkým sekvencie promótorov eukaryotických génov alebo génov vírusových. Napríklad môže ísť o sekvencie promótorov pochádzajúcich z genómu cieľovej bunky. Medzi eukaryotickými promótormi sa môžu použiť predovšetkým ubikvitné promótory (promótor génov HPRT, PGK, a-aktín, tubulín atď.), vláknité promótory (promótor génov GFAP, dezmín, vimentín, keratín atď.), promótory terapeutických génov (napríklad promótor génov MDR, CFTR, Faktor Vili, ApoAI atď.), špecifické promótory tkanív (promótor génu pyruvát-kinázy, vilínu, proteínu črevnej väzby mastných kyselín, a-aktín hladkého svalstva atď.) alebo tiež promótory zodpovedajúce podnetu (receptor steroidných hormónov, receptor kyseliny retínovej atď.). Môže isť o sekvencie promótorov génov E1A a MLP adenovírusu, raný promótor CMV alebo tiež promótor LTR RSV atď. Okrem toho tieto oblasti promótorov môžu byť modifikované prídavkom aktivačných sekvencií, sekvencií regulačných alebo sekvencií umožňujúcich tkanivovo špecifickú alebo majoritnú expresiu.
Predložený vynález teraz ponúka nové terapeutické agens umožňujúce svojimi antiproliferatívnymi vlastnosťami a/alebo apoptickými vlastnosťami interferovať s počtom disfunkčných buniek. S týmto cieľom nukleové kyseliny alebo kazety podľa vynálezu môžu byť injikované na úrovni miesta ošetrenia alebo inkubované priamo s bunkami určenými na zničenie alebo ošetrenie. Bolo opísané, že nukleové kyseliny nus môžu penetrovať do buniek bez zvláštneho vektora. Ale v rámci predloženého vynálezu sa uprednostňuje použitie vektorov, podávanie ktorých umožňuje zvýšiť (i) účinnosť bunkovej penetrácie, (ii) cielenie (iii) stabilitu extra a intracelulámu. Podľa uskutočnenia nukleová kyselina alebo kazeta uprednostnená predovšetkým predloženým vynálezom je zahrnutá do vektora. Použitý vektor môže byť chemického pôvodu (lipozóm, peptidový komplex, lipidy alebo katiónové polyméry atď.), vírusového pôvodu (retrovírus, adenovírus, herpes vírus, AAV, vírus ovčích kiahní atď.) alebo plazmatického pôvodu.
Použitie vírusových vektorov spočíva na prirodzených'vlastnostiach transfekcie vírusov. Je možné použiť napríklad adenovírusy, herpesové vírusy, retrovírusy a vírusy AAV. Tieto vektory sa javia predovšetkým výkonné z hľadiska transfekcie. Po tejto stránke uprednostnený predmet podľa vynálezu spočíva v defektných rekombinantných retrovírusoch, ktorých genóm obsahuje nukleovú kyselinu takú, ktorá bola už skôr definovaná. Iný predmet predloženého vynálezu spočíva predovšetkým v defektných rekombinantných adenovírusoch, ktorých genóm obsahuje nukleovú kyselinu takú, ktorá bola už skôr definovaná.
Vektor podľa predloženého vynálezu môže byť predovšetkým nevírusový agens schopný podporovať prenos a expresiu nukleových kyselín v eukaryotických bunkách. Vektory chemické alebo biochemické, syntetické alebo prírodné, predstavujú zaujímavú alternatívu prírodným vírusom, predovšetkým z dôvodov pohodlia, bezpečnosti a predovšetkým neprítomnosti teoretického limitu, ktorý sa týka veľkosti DNA použitej na transfekciu. Tieto syntetické vektory majú dve základné fiinkcie, skompaktovať nukleovú kyselinu na transfekciu a podporovať svoju bunkovú fixáciu, ako taktiež podporovať svoj prechod cez plazmatickú membránu a prípadne dve nukleárne membrány. Na potlačenie polyaniónovej povahy nukleových kyselín majú nevírusové vektory všetky náboje polykatiónové.
Nukleová kyselina alebo vektor použitý v predloženom vynáleze môžu byť formulované vzhľadom na podávame, a to spôsobom topikálnym, orálnym, parenterálnym, intranazálnym, vnútrožilovo, intramuskulárne, podkožné, intraokuláme, transdermatologicky atď. Nukleová kyselina alebo vektor sú výhodne použité v injikovateľnej forme. Môžu to byť zmesi vehikula farmaceutický prijateľného pre injikovateľnú formu, predovšetkým na priamu injikáciu na úrovni miesta ošetrenia. Môže ísť predovšetkým o strerilné roztoky, izotonické alebo suché látky, predovšetkým lyofilizované, ktoré po pridaní sterilnej vody alebo fyziologického séra podľa okolnosti umožňujú injikovateľnú formu. Priame injikovanie nukleovej kyseliny do nádora pacienta je zaujímavé, pretože to dovoľuje sústrediť terapeuticky vplyv na úrovni postihnutého tkaniva. Dávky nukleovej kyseliny môžu byť prispôsobené vzhľadom na rôzne parametre, predovšetkým vzhľadom na gén, vektor, spôsob použitého podávania, patológiu alebo tiež vzhľadom na dĺžku liečenia.
Vynález sa týka predovšetkým všetkých farmaceutických kompozícií, ktoré obsahujú aspoň jednu nukleovú kyselinu takú, ktorá bola už opísaná.
Týka sa najmä všetkých farmaceutických kompozícií, ktoré obsahujú aspoň jeden vektor taký, ktorý bol už opísaný.
Týka sa tiež všetkých farmaceutických kompozícií, ktoré obsahujú aspoň jeden variant proteínu p53 taký, ktorý bol už opísaný.
Vzhľadom na antiproliferatívne vlastnosti farmaceutických kompozícii podľa vynálezu, tieto kompozície sú prispôsobené predovšetkým na liečenie hyperproliferativnych chorôb, predovšetkým rakovín a restenózy. Predložený vynález predkladá tiež metódu účinnú predovšetkým na deštrukciu buniek, predovšetkým hyperproliferatívnych. Táto metóda môže byť použitá in vitro alebo ex vivo. Ex vivo spočíva predovšetkým v inkubácii buniek v prítomnosti jednej alebo viacerých nukleových kyselín (alebo vektora, kazety alebo priamo derivátu). Metóda použitá in vivo spočíva v podávaní organizmu aktívneho množstva vektora (alebo kazety) podľa vynálezu priamo na úrovni miesta ošetrenia (predovšetkým ošetrenie nádoru). Po tejto stránke sa vyná
SK 286955 Β6 lez týka predovšetkým metódy deštrukcie hyperproliferatívnych buniek skontaktovaním týchto buniek alebo časti z nich s nukleovou kyselinou, už skôr definovanou.
Predložený vynález je výhodné použiť in vivo na deštrukciu hyperproliferatívnych buniek (t. j. v nenormálnej proliferácii). Je tak aplikovateľný na deštrukciu nádorových buniek alebo buniek hladkého svalstva vaskulámej steny (restenóza). Je prispôsobený predovšetkým na liečenie rakovín, v ktorých je prítomný mutant p53. Napríklad sa môžu citovať adenokarcinómy hrubého čreva, rakoviny štítnej žľazy, karcinómu pľúc, leukémie miechy, rakoviny konečníka, rakoviny pŕs, rakoviny pľúc, rakoviny žalúdka, rakoviny pažeráka, lymfómy B, rakoviny vaječníkov, rakoviny močového mechúra, glioblastómy, hepatokarcinómy, rakoviny kostí, kože, pankreasu, rakoviny ľadvín a prostaty, rakoviny pažeráka, rakoviny hrtana, rakoviny hlavy a krku, rakoviny genitálií HPV pozitívne, rakoviny nosohltana EBV pozitívne, rakoviny, v ktorých bunkový proteín mdm2 je silne exprimovaný atď..
Varianty podľa vynálezu sú predovšetkým účinné na liečenie rakovín, v ktorých proteín MDM2 je okrem toho silne exprimovaný, rovnako ako na liečenie rakovín spojených s vírusom HPV, napríklad rakovín genitálií HPV pozitívnych.
Nasledujúce obrázky a príklady bližšie ilustrujú vynález, ale bez toho, aby v akomkoľvek smere obmedzovali jeho rozsah.
Prehľad obrázkov na výkresoch:
Obrázok 1: Funkčné domény divého proteínup53. TA: Aktivačná doména transkripcie, DNB: DNA väzbová doména, NLS: signál nukleárnej lokalizácie, OL: doména oligomerizácie, REG: doména regulácie.
Obrázok 2: Konštrukcia cDNA kódujúca formu AS proteínu p53.
Obrázok 3: Klonovanie cDNA kódujúcej konštrukcie pEC104, pEC106, pEC131, pEC132 a pEC133 a kódujúca ich variant H182.
Obrázok 4: Konštrukcia fúzie variantov pEC107, pECHO, pEC139 a pEC140 s umelou doménou oligomerizácie.
Obrázok 5: Konštrukcia variantov pECl 14, pECl 16, pEC141, pEC143, pEC145, pEC147, pEC151, pEC153 apEC155.
Obrázok 6: Rozpoznanie sekvencií špecifickej dvoj vlákno vej DNA hybridnými molekulami vynálezu.
Pokus oneskorenia na géli: porovnanie medzi HisV325 a divým p53, stĺpec 1: inkubácia v neprítomnosti HisV325 a divého p53, stĺpec 2: 30 ng divého p53, stĺpec 3: detto 2 + pAb421, stĺpec 4: 30 ng HisV325, stĺpec 5: detto 4 + pAb421, stĺpec 6: 30 ng HisV325 + 30 ng divého p53, stĺpec 7: detto 6 + pAb421, stĺpec 8: 30 ng HisV325 + 15 ng divého p53, stĺpec 9: detto 8 + pA±>421, stĺpec 10: 30 ng HisV325 + 7,5 ng divého p53, stĺpec 11: detto 10 + pAb421, stĺpec 12: 30 ng HisV325 +4,5 ng divokého p53, stĺpec 13: detto 12 + pAb421, stĺpec 14: 30 ng HisV325 + 3 ng divého p53, stĺpec 15: detto 14 + pAb421. Obrázok 7: Transaktivačná aktivita divého proteínu p53 a variantu AS, V-325 a V-336. Obrázok 8: Transaktivačná aktivita divého proteínup53 a variantov V-325, V-336 a V343. Obrázok 9: Expresia variantov vynálezu v bunkách SAOS-2.
Obrázok 10: Indukcia génov hdm2 a WAF1 v bunkách EB, EB-1 a EB-V325.
Obrázok 11: Vplyv proteínu E6 na transaktivačnú funkciu proteínu p53 a variant vynálezu v bunkách SAOS-2. Množstvo vektorov CMV-konštrukcie = 100 ng.
Obrázok 12: Vplyv proteínu E6 na transaktivačnú funkciu proteínu p53 a variant vynálezu v bunkách HeLa. Obrázok 13: Citlivosť divého proteínu p53 a variant vynálezu na degradáciu indukovanú proteínom E6. Obrázok 14: Vplyv dominantného negatívneho mutantu proteínu p53 H175 na transaktivačnú funkciu variantov vynálezu. Množstvo vektorov CMV-konštrukcie =100 ng.
Obrázok 15: Vplyv proteínu hdm2 na transaktivačnú funkciu proteínu p53 a variantov vynálezu v bunkách SAOS-2. Množstvo vektorov CMV-konštrukcie = 100 ng.
Obrázok 16: Vplyv divých proteínov p53 a V-325 na rast buniek silne exprimujúcich proteín hdm2. Obrázok 17: Indukcia apoptózy divými proteínmi p53 a V-325.
Obrázok 18: Kinetická indukcia apoptózy v bunkách EB, EB-1 a EB-V325.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad A. Konštrukcia rôznych nukleotidových fragmentov nevyhnutných na realizáciu génov kódujúcich varianty proteínu p53.
Al. Konštrukcia cDNA kódujúca divý ľudský proteínu p53.
Gén ľudského proteínu p53 bol klonovaný reťazovou amplifikačnou reakciou (PCR) na DNA banke ľudskej placenty (Clontech) s použitím oligonukleotidov 5'-1 a 3 '-393.
Oligonukleotid 5'-l (SEQ ID NO: 6): ATGGAGGAGCCGCAG
Oligonukleotid 3’-393 (SEQ ID NO: 7):
GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC
Produkt bol potom klonovaný priamo po PCR do vektora pCRII (Invitrogén).
A2. Konštrukcia cDNA kódujúca formu AS proteínu p53
Forma AS proteínu p53 obsahuje fragment kódujúci aminokyseliny 1 až 366 ľudského proteínu p53 pripoj ený k 19 posledným aminokyselinám produktu alternatívneho zostrihu myšieho proteínu p5 3.
Forma AS proteínu p53 bola získaná v dvoch etapách:
- amplifikácia PCR fragmentu kódujúceho aminokyseliny 1 až 367 proteínu p53 s použitím oligonukleotidov 5-1 (pozri príklad Al) a 3-367,
Oligonukleotid 3'-367 (SEQ ID NO: 8): GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGCTCGAGTGAGC
Fragment PCR takto získaný bol potom klonovaný do vektora pCRII (Invitrogén). Takto získaný fragment má rozpoznávajúce miesto pre reštrikčný enzým Xhol (fragment 1-367).
-Oligonukleotidy 5'-ASI, 5-AS2, 3'-ASI a 3'AS2 boli fosforylované, potom spoločne hybridizované s cieľom tvorby fragmentu kódujúceho posledných 19 aminokyselín produktu alternatívneho zostrihu myšieho proteínu p53.
5-AS1 (SEQIDNO: 9):
TCGAGCCTGCAGCCTAGAGCCTTCCAAGCCCTCATGAAGGAGG
5'-AS2 (SEQ ID NO: 10): AAAGCCCAAACTGCTGATGAATCGATATCGC
3'-ASI (SEQ ID NO: 11): TGAGGGCTTGGAAGGCTCTAGGCTGCAGGC
3'-AS2 (SEQIDNO: 12):
GGCCGCGATATCGATTCATCAGCAGTTTGGGCTTTCCTCCTTCA
Tento fragment bol potom vložený na úrovni miesta Xhol fragmentu 1-367 (pozri obrázok 2). Takto vytvorený gén kóduje variant ľudského produktu alternatívneho zostrihu myšieho proteínu p53 (AS).
Takto modifikovaná sekvencia je nasledujúca:
364 367 386
393
I I I
I
p53: - AHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSDZ
AS: -AHSSLQPRAFQALMKEESPNCZZ
367: -AHSSZZ
A3. Konštrukcia cDNA kódujúca rôzne fragmenty proteínu p53 nesúca DNA väzbovú doménu.
Tento príklad opisuje konštrukciu rôznych cDNA kódujúcich rôzne fragmenty ľudského proteínu p53 nesúcich celok alebo časť DNA väzbovej domény proteínu p53. Tieto fragmenty sú potom použité v konštrukcii variantov proteínu p53. Boli získané amplifikačnou polymerázovou reakciou na matriciach opísaných v príklade Al a A2 prostredníctvom rôznych oligonukleotidov. Amplifikačné reakcie boli uskutočnené za podmienok opísaných v príklade A4.1.
A3.1. Konštrukcia cDNA kódujúca oblasť 75-325 proteínu p53 a jeho derivát H182
SK 286955 Β6
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA kódujúcu aminokyseliny 75 až 325 divého ľudského proteínu p53 (75-325).
Táto cDNA bola získaná reťazovou amplifikačnou reakciou (PCR) na DNA proteínu p53 (opísané v príklade Al) s nasledujúcimi oligonukleotidmi 5'-75 a 3'-325:
5'-75 (SEQIDNO: 13):
GGGAAGCTTGGGCCGGGTCGACCTGCACCAGCAGCTCCT
3'-325 (SEQ ID NO: 14): GGCGGCCGCGGATCCCCATCCAGTGGTTTCTT
Derivát tohto fragmentu nesúci bodovú mutáciu na aminokyseline 182 ľudského proteínu p53 (cysteín - histidín) bol získaný mutagenézou riadenou prostredníctvom súpravy Amersham s použitím oligonukleotidu Hl 82:
Oligonukleotid H182 3' (SEQ ID NO: 15): ATCTGAATGGCGCTC
Tento fragment bol označený 75-325(H182).
A3.2. Konštrukcia cDNA kódujúca oblasť 75-336 proteínu p53 a jeho derivátH182
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA kódujúcu aminokyseliny 75 až 336 divého ľudského proteínu p53 (75-336).
Táto cDNA bola získaná reťazovou amplifikačnou reakciou (PCR) na DNA proteínu p53 (opísané v príklade Al) s nasledujúcimi oligonukleotidmi 5'-75 (SEQ ID NO: 13) a 3'-336:
3'-336 (SEQ ID NO: 16): GGCGGCCGCGGATCCTCACGCCCACGGATCTG
Derivát tohto fragmentu nesúci bodovú mutáciu na aminokyseline 182 ľudského proteínu p53 (cysteín -
- histidín) bol získaný mutagenézou riadenou prostredníctvom súpravy Amersham s použitím oligonukleotidu H182 (SEQ ID NO: 15). Tento fragment bol označený 75-336(Hl 82).
A3.3. Konštrukcia cDNA kódujúca oblasť 75-343 proteínu p53
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA kódujúcu aminokyseliny 75 až 343 divého ľudského proteínu p53 (75-343).
Táto cDNA bola získaná reťazovou amplifikačnou reakciou (PCR) na DNA proteínu p53 (opísané v príklade Al) s nasledujúcimi oligonukleotidmi 5'-75 (SEQ ID NO: 13) a 3'-343:
3'-343 (SEQ ID NO: 35): CGGATCCTCTCGGAACATCTCGAA
A3.4. Konštrukcia cDNA kódujúca oblasť 75- 367 proteínu p53 a jeho derivát H182
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA kódujúcu aminokyseliny 75 až 367 divého ľudského proteínu p53 (75-367).
Tento fragment bol získaný reťazovou amplifikačnou reakciou (PCR) na DNA proteínu p53 (opísané v príklade Al) s nasledujúcimi oligonukleotidmi 5'-75 (SEQ ID NO: 13) a 3'-367 (SEQ ID NO: 8).
Takto získaný fragment obsahuje rozpoznávacie miesto endonukleázou Xhol (75-367).
Derivát tohto fragmentu nesúci bodovú mutáciu na aminokyseline 182 ľudského proteínu p53 (cysteín -
- histidín) bol získaný mutagenézou riadenou prostredníctvom súpravy Amersham s použitím oligonukleotiduH182 (SEQ ID NO: 15). Tento fragment bol označený 75-367 (Hl 82).
A3.5. Konštrukcia cDNA kódujúca fragment 75-AS a jeho derivát H182
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA kódujúcu aminokyseliny 75 až 366 divého ľudského proteínu p53 (75-366) pridanej k 19 posledným aminokyselinám produktu alternatívneho zostrihu myšieho proteínu p53.
Tento fragment bol získaný reťazovou amplifikačnou reakciou (PCR) na DNA fragmentu AS (opísané v príklade 2) s nasledujúcimioligonukleotidmi 5'-75 (SEQ ID NO: 13) a 3-AS2 (SEQ IDNO: 12).
Derivát tohto fragmentu nesúci bodovú mutáciu na aminokyseline 182 ľudského proteínu p53 (cysteín -
- histidín) bol získaný mutagenézou riadenou prostredníctvom súpravy Amersham s použitím oligonukleotidu H182 (SEQ ID NO: 15). Tento fragment bol označený 75-AS(H182).
A3.6. Konštrukcia cDNA kódujúca fragment 75-393 proteínu p53 a jeho derivát H182
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA kódujúcu aminokyseliny 75 až 393 ľudského proteínu p53 (75-393). Tento fragment bol získaný reťazovou amplifikačnou reakciou (PCR) na DNA proteínu p53 (opísané v príklade Al) s nasledujúcimi oligonukleotidmi 5-75 (SEQID NO: 13) a 3'-393 (SEQID NO: 7).
Derivát tohto fragmentu nesúci bodovú mutáciu na aminokyseline 182 ľudského proteínu p53 (cysteín - histidín) bol získaný mutagenézou riadenou prostredníctvom súpravy Amersham s použitím oligonukleotidu Hl 82 (SEQ ID NO: 15). Tento fragment bol označený 75-393(H182).
A4. Konštrukcia cDNA kódujúca rôzne fragmenty nesúce aktivačnú doménu transkripcie (transaktivačná doména).
Tento príklad opisuje konštrukciu rôznych cDNA kódujúcich rôzne fragmenty nesúce transaktívačnú doménu. Tieto fragmenty sú potom použité v konštrukcii variantov proteínu p53.
A4.1. PCR reakcia
Amplifikačnou polymerizačnou reakciou boli získané rôzne fragmenty na rôznych matriciach prostredníctvom rôznych oligonukleotidov. Tieto amplifikačné reakcie boli uskutočnené za nasledujúcich podmienok: Enzým Amplitaq-DNA-polymeráza (Perkin-Elmer) v pufri dodanom dodávateľom s koncentráciou 0,2 mM dNTP, 100 ng matrice a 500 ng každého z dvoch oligonukleotidov.
- cyklus: 2 minúty pri 91 °C
- cykly: 1 minúta pri 91 °C 1 minúta pri 55 °C 1 minúta pri 72 °C
- cyklus: 1 minúta pri 72 °C
A4.2. Konštrukcia cDNA kódujúca oblasť 411-490 vírusového vektora VPI6 (VP16TA)
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA kódujúcu aminokyseliny 411-490 vírusového proteínu VP16 (VP16 TA). Táto oblasť nesie transaktívačnú doménu tohto proteínu.
Transaktivačný fragment transaktivátora odvodený od vírusového proteínu VPI6 (411-490) herpesového vírusu bol získaný reťazovou amplifikačnou reakciou (PCR) s použitím podmienok už skôr definovaných (pozri A4.1) a nasledujúcich oligonukleotidov 5'-VP16 a 3'-VP16:
5'-VP16 (SEQ ID NO: 17): AAGCTTGAATTCGTTAACATGTCCACGGCCCCCCCGACC
3'-VP16 (SEQ ID NO: 18): GGTCGACCACCGTACTCGTCAAT a 100 ng plazmidu pUHD15-l (Gossen a Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5547).
Fragment takto získaný obsahuje 334 bázových párov, ktorých sekvencia je daná SEQ ID NO: 2. Obsahuje vo svojej častí N-konca metionín nesený iniciačným miestom transkripcie (ATG), pridaný tak do etapy klonovania metódou PCR.
A4.2. Konštrukcia cDNA kódujúca rôzne fragmenty schopné získavať aktivačnú doménu transkripcie (transaktívačná doména) proteínu p53 endogénu.
A4.2.1. Konštrukcia cDNA kódujúca protilátku jednoduchého reťazca schopnú viazať proteín p53 (ScFv 42)
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA kódujúcu protilátku jednoduchého reťazca schopnú viazať proteín p53 (ScFv 421). Táto konštrukcia vyjadrená na intracelulámej úrovni musí byť schopná fixovať proteín p53 divého endogénu alebo mutant s cieľom získania svojej transaktívačnej domény.
cDNA kódujúca ScFv 421 (prihláška vynálezu PCT/FR96/00477) môže byť extrakt vo forme fragmentu Ncol/NotI, ktorý zahŕňa iniciačné miesto translácie (ATG) a žiadnu terminačnú sekvenciu translácie.
Takto získaný fragment obsahuje 766 bázových párov, ktorých sekvencia je daná SEQ ID NO: 36.
A4.2.2. Konštrukcia cDNA kódujúca oblasť 325-360 divého proteínu p53 (325-360)
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA kódujúcu aminokyseliny 325-360 divého proteínu p53 (325-360). Táto oblasť nesie doménu oligomerizácie tohto proteínu. Táto konštrukcia na intracelulámej úrovni musí byť schopná fixovať divý proteín p53 endogénny alebo mutant s cieľom získania svojej transaktívačnej domény.
Odvodená oligomerizačná doména divého ľudského proteínu p53 (325-360) bola získaná reťazovou amplifikačnou reakciou (PCR) s použitím podmienok skôr definovaných (pozri A4.1.) a nasledujúcich oligonukleotidov 5'-325 a 3'-360:
SK 286955 Β6
5'-325 (SEQ ID NO: 37): AAGCTTGAATTCGTTAACGCCACCATGGGAGAATATTTCACCCTT
3'-360 (SEQ IDNO-.38): GGGTCGACCTGGCTCCTTCCCAGC na 100 ng DNA proteínu p53 (opísané v príklade Al).
Takto získaný fragment obsahuje 14 bázových párov, ktorých sekvencia je daná SEQ ID NO: 39. Obsahuje na N-konci metionín nesený iniciačným miestom translácie (ATG), pridaný v etape klonovania PCR a neobsahuje žiadnu sekvenciu terminácie translácie.
A4.2.3. Konštrukcia cDNA kódujúca oblasť 325-393 divého proteínu p53 (325-393)
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA kódujúcu aminokyseliny 325-393 divého proteínu p53 (325-393). Táto oblasť nesie doménu oligomerizácie tohto proteínu. Táto konštrukcia na intracelulámej úrovni musí byť schopná fixovať divý proteínu p53 endogénny alebo mutant s cieľom získania svojej transaktivačnej domény.
Táto odvodená oligomerizačná doména divého ľudského proteínu p53 (325-360) bola získaná reťazovou amplifikačnou reakciou (PCR) s použitím podmienok skôr definovaných (pozri A4.1) a nasledujúcich oligonukleotidov 5-325 (SEQ IDNO: 37) a3’-393.2:
3’-393.2 (SEQ ID NO: 40): GGGTCGACCGTCTGAGTCAGGCCCTTC na 100 ng DNA proteínu p53 (opísané v príklade Al).
Takto získaný fragment obsahuje 243 bázových párov, ktorých sekvencia je daná SEQ ID NO: 41. Obsahuje na N-konci metionín nesený iniciačným miestom translácie (ATG), pridaný tak v etape klonovania PCR a neobsahuje žiadnu sekvenciu terminácie translácie.
A5. Konštrukcia cDNA kódujúca rôzne fragmenty nesúce doménu oligomerizácie
Tento príklad opisuje konštrukciu rôznych cDNA kódujúcich rôzne fragmenty nesúce doménu oligomerizácie. Tieto fragmenty sú potom použité v konštrukcii variantov proteínu p53. Tieto fragmenty boli získané amplifikačnou polymerázovou reakciou na rôznych matriciach (p53 pre homologickú oblasť a matrice rôzneho pôvodu pre heterológnu oblasť oligomerizácie, predovšetkým umelú) prostredníctvom rôznych oligonukleotidov. Amplifikačné reakcie boli uskutočnené za podmienok opísaných v príklade A4.1.
A5.1. Konštrukcia cDNA obsahujúca umelú oblasť oligomerizácie
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA obsahujúcu umelú doménu oligomerizácie, tvorenú umelým leucínovým zipsom. Táto cDNA je potom použitá na konštrukciu variantov od fragmentov 75-325 (príklad A3.1) a 75-336 (príklad A3.2) ľudského proteínu p53 a ich modifikovaných proteínov na úrovni cysteínu 182.
Táto cDNA bola konštruovaná od 6-tich nasledujúcich oligonukleotidov.
Izl-5' (SEQ ID NO: 19): GATCTGAAGGCCCTCAAGGAGAAGCTGAAGGCC
Iz2-5' (SEQ ID NO: 20): CTGGAGGAGAAGCTGAAGGCCCTGGAGGAGAAGCTG
IZ3-5' (SEQ ID NO: 21): AAGGCACTAGTGGGGGAGCGATGATGAATCGATATCGC
Izl-3' (SEQIDNO: 22): CTCCTCCAGGGCCTTCAGCTTCTCCTTGAGGGCCTTCA
Iz2-3' (SEQ IDNO: 23): TAGTGCCTTCAGCTTCTCCTCCAGGGCCTTCAGCTT
Iz3-3' (SEQ ID NO: 24): GGCCGCGATATCGATTCATCATCGCTCCCCCAC
Tieto oligonukleotidy boli syntetizované prostredníctvom automatického syntetizátora DNA s použitím chémie fosfoamidov. Týchto šesť oligonukleotidov predstavuje komplementámosť v pároch (Izl-5'/Izl-3', Iz2-57Iz2-3', Iz3-5'/Iz3-3') a komplementaritu reťazcovú (Izl-3'/Iz2-5', Iz2-3'/Iz3-5') dovoľujúcu získať doménu oligomerizácie jednoduchou hybridizáciou a ligáciou. Výsledná sekvencia LZ je daná SEQ ĽD NO: 1.
SK 286955 Β6
A5.2. Konštrukcia cDNA obsahujúca prirodzenú doménu oligomerizácie ľudského proteínu p53
Tento príklad opisuje konštrukciu cDNA obsahujúcu prirodzenú doménu oligomerizácie ľudského proteínu p53. Táto cDNA je reprezentovaná fragmentom kódujúcim aminokyseliny 325 až 356 proteínu p53 získaného v konštrukcii 75-367 (príklad A3.4), 75-AS (príklad A3.5), 75-393 (príklad A3.6) a ich derivátov na úrovni modifikovaných cysteínov 182.
Príklad B. Konštrukcia génov kódujúcich rôzne varianty proteínu p53
BI. Klonovanie rôznych fragmentov proteínu p53
Každý z rôznych fragmentov získaných PCR opísaný v príklade A bol klonovaný po PCR do vektora pBC SK+ (Stratagen) s použitím rozpoznávajúcich miest reštrikčnými enzýmami HindlII a Not I (obrázok 3).
Produkty týchto konštrukcií nesú nasledujúce čísla:
75-325 ->pEC 104
75-336 -> pEC 106
75-343->pEC 171
75-367 ->pEC 131
75-AS—>pEC 132
75-393 -> pEC 133
Z týchto produktov riadenou mutagenézou s použitím mutagenézy in vitro riadenej oligonukleotidovým mutagenézovým systémom (Amersham) a oligonukleotidu H182 boli získané zodpovedajúce konštrukcie nesúce histidín v pozícii 182. Tieto konštrukcie nesú nasledujúce čísla:
75-325(H182) -> pEC 134
75-336(H182) -> pEC 135
75-367(H182) -> pEC 136 75-AS(H182) -> pEC 137 75-393(H182) pEC 138
B2. Fúzie leucínového zipsu s fragmentom 75-325, 75-336 a 75-343 a s ich variantom H182
Oligonukleotidy obsahujúce leucínový zips (Izl-5', Izl-3', Iz2-5', Iz2-3', Iz3-5' a Iz3-3') boli fosforylované pomocou T4 kinázy, potom hybridizované všetky spoločne a vložené do vektorov pEC 104, 106, 134 a 135 a 171, predbežne štiepené reštrikčnými enzýmami BamHI a Nôti (obrázok 4).
Produkty týchto konštrukcií nesú nasledujúce čísla:
75-325-Iz-> pEC 107
75-336-Iz -> pEC 110
75-343-Iz -> pEC 174
75-325(H182)-Iz-> pEC 139
75-336(H182)-Iz -> pEC 140
B3. Fúzie aktivačnej domény transkripcie so súborom fragmentov p53
Konečné produkty boli získané ligáciou k trom spoločníkom nasledujúcim spôsobom (obrázok 5):
Aktivačná doména transkripcie odvodená od VPI6, opísaná v príklade A3, bola pripravená enzýmovým štiepením reštrikčnými enzýmami HindlII a Sali produktov PCR.
Boli izolované rôzne fragmenty proteínu p53 (75-325-Iz, 75-336-Iz, 75-343-Iz, 75-AS, 75-367, 75-393 a ich varianty H182) po enzýmovom štiepení reštrikčnými enzýmami Sali a Nôti plazmidov ich obsahujúcich.
Možné kombinácie (aktivačná doména/p53) boli vytvorené a súčasne vložené do vektora pBC SK+ (Stratagen) a prednostne štiepené reštrikčnými enzýmami HindlII a Nôti.
Produkty konštrukcie nesú nasledujúce čísla:
VP16-75-325-IZ VP16-75-336-IZ VP16-75-367
VP16-75-AS
VPI 6-75-393
V-325 pEC 114 (SEQID NO: 25)
V-336 -> pEC 116 (SEQ ID NO: 26)
V-367 -+ pEC 141 (SEQ ID NO: 27)
V-AS -> pEC 143 (SEQ ID NO: 28)
V-393 -> pEC 145 (SEQ ID NO: 29)
VP16-75-343-ÍZ
VP16-75-325(H182)-Iz
VP16-75-336(H182)-Iz
V-343 -> pEC 175 (SEQ ID NO: 30)
VP16-75-367(H182)
VP16-75-AS(H182)
VP-16-75-393(H182)
V-325H pEC 147
V-336H -> pEC 149
V-367H -» pEC 151
V-ASH pEC 153
V-393H pEC 155
Zodpovedajúce produkty nesúce oblasť viažucu špecificky transaktivátor alebo transaktivačný komplex k miestu domény VPI6 sú konštruované rovnakým spôsobom. Tieto konštrukcie sú opísané nasledovne:
ScFv-75-325-Iz
SCFV-75-336-Iz
ScFv-75-367 ScFv-75-AS ScFv-75-393 ScFv-75-325(H182)-Iz ScFv-75-336(H182)-Iz ScFv-75-367(H182) ScFv-75-AS(H182)
ScFv-75-393(H182) (325-393)-75-325-Iz (325-393)-75-336-Iz (325-393)-75-367 (325-393)-75-AS (325-393)-75-393 (325-393)-75(H182)-Iz (325-393)-75-336(H182)-Iz (325-393)-75-367(H182) (325-393)-75-AS(Hl 82) (325-393)-75-393(H182) (325-360)-75-325-Iz (325-360)-75-336-Iz (325-360)-75-367 (325-360)-75-AS (325-360)-75-393 (325-360)-75-325(H182)-Iz (325-360)-75-336(H182)-Iz (325-360)-75-337(H182) (325-360)-75-AS(H182) (325-360)-75-393(H182)
S-325 -> pEC 176 (SEQ ID NO: 31)
S-336
S-367
S-AS
S-393
S-325H
S-336H
S-367H
S-ASH
S-393H
393-325 -> pEC 177 (SEQ ID NO: 32)
393-336
393-367
393-AS
393-393
393-325H
393-336H
393-367H
393-ASH
393-393H
360-325 -> pEC 178 (SEQ ID NO: 33)
360-336
360-367
360-AS
360-393
360-325H
360-336H
360-367H
360-ASH
360-393H
Produkty obsahujúce doménu 325-360 proteínu p53 a transaktivačnú doménu (1-74) môžu byť posúdené zmiešaním syntetického separátora (Hinge) získaného inzerciou do miesta
Sali s fragmentom DNA získaným hybridizáciou syntetického oligonukleotidového páru komplementárneho k Hinge-down a Hinge-up.
Hinge-up (SEQ ID NO: 42): TCGAGGAGGTGGTGGCTCTGGAGGCGGAGGATCCGGCGGTGGAGGTTC
Hinge-down (SEQ ID NO: 43): TCGAGAACCCCTACCGCCGGATCCTCCGCCTCCAGAGCCACCACCTCC
Sekvencia výslednej dvoj vláknovej DNA Hinge je nasledujúca:
TCGAGGAGGTGGTGGCTCGGAGGCGGAGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCCTCCACC ACCGAGACCTCCGCCTCCTAGGCCGCCATCCCCAAGAGCT a zodpovedajúca proteínová sekvencia je (SEQ ID NO: 44):
Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser
Zodpovedajúce produkty sú opísané nasledovne:
(325-360)-Hmge-75-325-Iz 36011-325 -> pEC 179 (SEQID NO: 44)
(325-360)-Hinge-75-336-Iz (325-360)-Hinge-75-367 (325-360)-Hinge-75-AS (325-360)-Hinge-75-393 (325-360)-Hinge-75-325(H182)-Iz (325-360)-Hinge-75-336(H182)-Iz (325-360)-Hinge-75-367(H 182) (325-360)-Hinge-75-AS(H182) (325-360)-Hinge-75-393(Hl 82) 360h-336 360h-367 360h-AS 36011-393 360h-325H 360h-336H 360h-367H 360h-ASH 360h-393H
Príklad C. Konštrukcia expresných vektorov variantov proteínu p53
Tento príklad opisuje konštrukciu vektorov použiteľných na prenos nukleových kyselín podľa vynálezu in vitro alebo in vivo.
Cl. Konštrukcia plazmidových vektorov
Na konštrukciu plazmidových vektorov boli použité dva typy vektorov.
- Vektor pSV2, opísaný v DNA Cloning, A practical approarch Vol. 2, D. M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington D.C, 1985. Tento vektor je eukaryotický expresný vektor. Nukleové kyseliny kódujúce varianty boli vložené do vektora vo forme fragmentov Hpal-EcoRV. Sú tak umiestnené pod kontrolou promótora zosilovača transkripcie vírusu SV40.
- Vektor pCDNA3 (Invitrogen). Ide predovšetkým o eukaryotický expresný vektor. Nukleové kyseliny kódujúce varianty podľa vynálezu sú tak umiestnené do vektora pod kontrolou raného promótora CMV. Všetky konštrukcie opísané v príklade B3 boli vložené do vektora vo fonne fragmentu HindUI/Notl s cieľom testovania v rôznych systémoch in vivo.
C2. Konštrukcia vírusových vektorov
Vynález spočíva v konštrukcii a použití vírusových vektorov umožňujúcich prenos a expresiu in vivo nukleových kyselín, ktoré boli skôr definované.
Pokiaľ predovšetkým ide o adenovírusy, boli charakterizované rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa tak trocha menia. Medzi sérotypy sa výhodne používajú v rámci predloženého vynálezu ľudské adenovírusy typu 1 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovírusy zvieracieho pôvodu (pozri prihláška vynálezu WO94/26914). Medzi adenovírusy zvieracieho pôvodu používaných v rámci predloženého vynálezu sa môžu uviesť adenovírusy psieho, hovädzieho a myšacieho pôvodu (napríklad: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo opičieho (napríklad: SAV). Preferované adenovírusy zvieracieho pôvodu sú psie adenovírusy, predovšetkým adenovírus CAV2 (napríklad souche manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800)). V rámci predloženého vynálezu sa výhodne používajú adenovírusy ľudského pôvodu alebo psieho, alebo ich zmes.
Defektné adenovírusy predloženého vynálezu obsahujú ITR, sekvenciu umožňujúcu predovšetkým enkapsidáciu a nukleovú kyselinu podľa vynálezu. V genóme adenovírusu vynálezu aspoň oblasť El je nefunkčná. Pozorovaný vírusový gén môže byť zbavený funkcie všetkými technikami odborníkom známymi, predovšetkým úplnou supresiou, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo viac báz v požadovanom géne alebo požadovaných génoch. Tieto modifikácie môžu byť uskutočnené in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ, napríklad prostredníctvom techník génového odboru alebo tiež pôsobením mutagénnych činidiel. Môžu byť modifikované rôzne oblasti, predovšetkým oblasť E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia adenovírusy podľa vynálezu obsahujú deléciu v oblasti El a E4. Podľa iného uprednostňovaného spôsobu realizácie zahŕňa deléciu v oblasti El, kde je vložená oblasť E4 a nukleová kyselina podľa vynálezu (pozri FR9413355). Vo vírusoch podľa vynálezu sa delécia prednostne nachádza v oblasti El nukleotidov 455 až 3329 v sekvencii adenovírusu Ad5.
Defektné rekombinantné adenovírusy podľa vynálezu môžu byť pripravené technikami všetkým odborníkom známymi (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Môžu byť pripravené všeobecnou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom nesúcim medzi iným sekvenciu DNA záujmu. Všeobecná rekombinácia nastane po kotransfekcii zmieneného adenovírusu do línie prispôsobených buniek. Línia použitých buniek musí predovšetkým (i) byť transformovateľná uvedenými elementmi a (ii) obsahovať sekvencie schopné doplniť časť genómu defektného adenovírusu, predovšetkým v integrovanej forme s cieľom vyhnutia sa nebezpečiu rekombinácie. Napríklad môže ísť o líniu ľudských obličkových embryonálnych buniek 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje predovšetkým začlenenú vo svojom genóme, ľavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12 %) alebo môže ísť o línie schopné doplniť funkcie El a E4 tak, ako je to opísané predovšetkým v prihláškach vynálezov WO94/26914 a WO95/02697.
Adenovírusy, ktoré sú rozmnožené, sú získané a purifikované podľa klasických techník molekulárnej biológie tak, ako je opísané v príkladoch.
Pokiaľ ide o vírusy AAV, ide o vírusy DNA relatívne malej veľkosti, ktoré sa začleňujú do genómu buniek, ktoré infikujú, stabilným spôsobom a na špecifické miesto. Sú schopné infikovať široké spektrum buniek, bez vyvolania vplyvu na rast, morfológiu alebo delenie buniek. Nezdá sa, že by boli zahrnuté do patológií u ľudí. Genóm AAV bol klonovaný, sekvenovaný a charakterizovaný. Obsahuje okolo 4700 báz a na každom konci obsahuje oblasť obrátenej repetície (ITR) so 145 bázami, ktoré sú replikačného pôvodu pre vírus. Zvyšok genómu je rozdelený na dve oblasti nesúce funkcie enkapsidácie: ľavú časť genómu, ktorá obsahuje gén rap implikovaný pri vírusovej replikách a expresii vírusových génov a pravú časť genómu, ktorá obsahuje gén cap kódujúci kapsidové proteíny vírusu.
Použitie vektorov odvodených od AAV na prenos génov in vitro a in vivo bolo opísané v literatúre (pozri predovšetkým WO91/18088, WO93/09239, US 4797368, US 5139941, EP 488 528). Tieto prihlášky vynálezov opisujú rôzne konštrukcie odvodené od AAV, v ktorých gény rap a/alebo cap sú deletované a nahradené génom záujmu a opisujú ich použitie na prenos in vitro (na bunky v kultúre) alebo in vivo (priamo do organizmu) uvedeného génu záujmu. Rekombinantné defektne AAV podľa vynálezu môžu byť pripravené kotransfekciou, v línii infikovaných buniek pomocným ľudským vírusom (napríklad adenovírusom), plazmidu obsahujúceho nukleovú sekvenciu vynálezu ohraničenú dvoma oblasťami obrátenej repetície (ITR) AAV a plazmidu nesúceho gén enkapsidácie (gén rap a cap) AAV. Použiteľná línia buniek je napríklad línia 293. Rekombinantné produkty AAV sú potom purifikované klasickými technikami.
Pokiaľ ide o vírusy herpesu a retrovírusy, konštrukcie rekombinantných vektorov boli široko opísané v literatúre: pozri predovšetkjn Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP 178220 Bemstein et al. Genet. Eng. Ί (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 atď. Retrovírusy sú integrativne vírusy, selektívne infikujúce bunky vo fáze delenia. Tvoria tak vektory záujmu na rakovinové aplikácie. Genóm retrovírusov obsahuje predovšetkým dve LTR, jednu sekvenciu enkapsidácie a tri kódovacie oblasti (gag, pol a env). V rekombinantných vektoroch odvodených od retrovírusov, gény gag, pol a env sú všeobecne deletované sčasti alebo úplne a nahradené sekvenciou heterológnej nukleovej kyseliny záujmu. Tieto vektory môžu byť realizované od rôznych typov retrovírusov, predovšetkým MoMuLV (murine moloney leukémia vírus, tiež označený MoMLV), MSV (murine moloney sarcoma vírus), HaSV (harvey sarcoma vírus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (rous sarcoma vírus) alebo tiež od Friendovho vírusu.
Na konštrukciu rekombinantných retrovírusov podľa predloženého vynálezu obsahujúcich nukleovú kyselinu podľa predloženého vynálezu je konštruovaný plazmid, obsahujúci predovšetkým LTR, sekvenciu enkapsidácie a uvedenú nukleovú kyselinu, ktorý je potom použitý na transfekciu línie buniek spomínanej enkapsidácie, schopnej priniesť plazmid so zníženou schopnosťou v transretrovírusových funkciách. Všeobecne sú línie enkapsidácií tak schopné exprimovať gény gag, pol a env. Tieto línie enkapsidácie boli opísané v skorších odboroch, predovšetkým línia PA317 (US4861719), línia PsiCRIP (W090/02806) a línia GP+envAm-12 (W089/07150). Inak rekombinantné retrovírusy môžu pripustiť modifikácie na úrovni LTR na potlačenie transkripčnej aktivity, rovnako ako sekvencie enkapsidácie, obsahujúce časť génu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Rekombinantné retrovírusy sú potom purifikované klasickými technikami.
Na uskutočnenie predloženého vynálezu je predovšetkým výhodné použitie rekombinantného defektného adenovírusu alebo retrovírusu. Tieto vektory majú naozaj vlastnosti zaujímavé predovšetkým na prenos génov do nádorových buniek.
C3. Chemické vektory
Medzi synteticky vyvinutými vektormi sa výhodne používajú v rámci predloženého vynálezu katiónové polyméry polylyzínového typu, (LKLK)n, (LKKL)n, polyetylénimin a DEAE dextrán alebo tiež lipidy katiónové alebo lipofektanty. Majú schopnosť kondenzovať DNA a podporovať jej spojenie s bunkovou membránou. Medzi týmito naposledy menovanými sa môžu uviesť lipopolyaminy (lipofektamín, transfektám atď.), rôzne katiónové lipidy alebo neutrálne lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE atď.), tak ako peptidy nukleárneho pôvodu. Bol vyvinutý koncept cieľovej transfekcie prostredníctvom receptora, ktorý využíva princíp kondenzovania DNA vďaka katiónovému polyméru riadiacemu fixáciu komplexu k membráne vďaka chemickej väzbe medzi katiónovým polymérom a ligandom membránového receptora, ktorý je prítomný na povrchu bunkového typu, ktorý má byť zakotvený. Cieľový receptor transferinu, inzulínu alebo receptor azialoglykoproteínov hepatocytov bol tiež opísaný. Príprava kompozície podľa vynálezu používajúca takýto chemický vektor je realizovaná podľa techník známych odborníkom, všeobecne jednoduchým uvedením do kontaktu rôznych zlúčenín.
SK 286955 Β6
Príklad D. Posúdenie funkcií variantov proteínu p53
Varianty proteínu p53 podľa predloženého vynálezu boli ocenené v bunkovom teste pre nasledujúce kritériá:
- väzba k sekvencii špecifickej dvojvláknovej DNA,
- transaktivačná funkcia,
- antiproliferatívna aktivita,
- apoptická aktivita,
- onkogénne potenciálne spojenie s určitými mutáciami proteínu p53.
Na toto posúdenie sú použité konštrukcie V-325, V-336, V-343 a AS, ktoré sú opísané v príklade B.
Dl. Rozpoznanie sekvencie špecifickej dvojvláknovej DNA hybridnými molekulami podľa predloženého vynálezu
D1.1 Tvorba hybridných molekúl cDNA divého proteínu p53 bola klonovaná do vektora pBlue-Bacin (Invitrogen) v mieste BamHI. Inzerciou do plazmidu pAcHLT-A (Pharmingen) fragmentu obsahujúceho cDNA V325 získaného štiepením plazmidu pECl 14 enzýmami EcoRI a Nôti bol vytvorený vektor umožňujúci získať rekombinantný baculovírus majúci za cieľ expresiu proteínu V3 25 označeného na N-konci peptidovou sekvenciou, obsahujúcou medzi iným spojenie šiestich zvyškov histidínu. Od týchto rekombinantných vektorov boli vytvorené baculovírusy a purifikované podľa návodov uvedených výrobcom (Invitrogen, Pharmingen). Tieto dva proteíny boli homogénne purifikované od nukleárnych extraktov hmyzích infikovaných buniek SF9 ich baculovírusmi, nukleárne extrakty boli získané postupom opísaným Delphinem et al. (C. Delphin, Eur. J. Biochem., 223, 683-692, 1994).
Divý proteín p53 bol purifikovaný imunoafinitou na monoklonálnych protilátkach pAb421 (Oncogene Sciences, Ab-1) podľa nasledujúceho protokolu: infikovaný nukleárny extrakt bunky sa inkubuje počas troch hodín pri teplote 4 °C s proteínovým gélom A-agarózy, na ktorom bola kovalentne viazaná protilátka pAb421. Po extenzívnom vymytí gélu pufŕom 50 mM TrisHCl s pH 7,8 obsahujúcom 1 M KC1 a inhibítory proteáz, proteín p53 sa eluuje peptidom zodpovedajúcim epitopu, rozpoznaného touto protilátkou na proteín p53 (KKGQSTSRHK), tento peptid bol použitý v koncentrácii 5 mg/ml v roztoku použitom na vymývanie. Po koncentrácii na Centrikon-30 (Amicon Grace), eluovaný proteín p53 sa separuje a purifikuje k homogenite permeáciou na géli na kolóne Superóza 6 HR10/30 ekvilibrovanej 50 mM TrisHCl pH 7,5, 0,2 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM ZnCl2, 10 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 0,1 % NP-40, 5 % glycerolu. Frakcie obsahujúce proteín p53 sú alikvotné a sú bezprostredne zmrazené na - 80 0 C až do použitia.
Proteín V325 označený na N-konci peptidovou sekvenciou obsahujúcou medzi iným spojenie šiestich zvyškov histidínu nazvaný odteraz HisV325, bol purifikovaný postupom, ktorý bol upravený Hochuliem et al. (Bio/Technology Vol 6 (1988) 1321). Skôr ako bol aplikovaný na gél (Niskel-NTA agarosa) nukleárny extrakt infikovaných buniek, bol zbavený solí na kolóne PD10 (Pharmacia) ekvilibrovanej 50 mM fosfátovým pufŕom pH 8, ktorý obsahoval 5 mM 6-merkaptoetanol, 0,1 % NP-40 a zmes inhibítorov proteáz. Inkubácia nukleárneho extraktu s gélom (Nickel-NTA agarosa) bola uskutočnená v tomto pufri počas jednej hodiny pri teplote 4 °C za súčasného miešania. Gél bol potom vymytý rovnakým pufrom s pH 6. Proteín HisV325 je eluovaný 0,3 M imidazolom v naposledy menovanom pufri na premytie gélu 0,1 M imidazolom. Frakcie obsahujúce HisV325 sú alikvotné a sú okamžite zmrazené na - 80 °C až do ich použitia.
D 1.2. Konštrukcia sekvencie špecifickej dvojvláknovej DNA
Sekvencia špecifickej dvojvláknovej DNA použitá v tomto pokuse je zložená z dvoch syntetizovaných oligonukleotidov, ktorých sekvencia je nasledujúca:
Oligo 5568 (SEQID NO: 45): GATCCGAACATGTCCCAACATGTTGA
Oligo 5569 (SEQ ID NO: 46): AGCTTCAACATGTTGGGACATGGTCG
Tieto dva syntetické oligonukleotidy boli značené fosforom 33 tridsať minútovou inkubáciou pri teplote 37 °C 5 pmolov každého oligonukleotidu v 20 μΐ nasledujúceho reakčného prostredia:
Tris-HCl pH 7,6 50mM
MgCl2 10mM ditiotreitol 5mM
Spermidín 100 μΜ
EDTA 100 μΜ
ATP-T-33P (Amersham) 50pCi (1000-3000 Ci/mmol)
SK2869S5 Β6
Τ4 kináza (Boehringer) 10 U
Tieto dva oligonukleotidy takto označené boli hybridizované za prítomnosti 100 mM NaCl na obnovenie dvojvláknovej sekvencie WAF-RE obsahujúcej špecifickú sekvenciu rozpoznanú proteínom p53 v oblasti promótora génu WAF-1 (W. S, EI-Deiry, Celí Vol 75 (1993) 817):
GATCCGAACATGTCCCAACATGTTGA GCTTGTACAGGGTTGTACAACTTCGA
D 1.3 Rozpoznanie dvojvláknovej sekvencie WAF-RE hybridnými molekulami podľa vynálezu
Na preukázanie špecifického rozpoznania dvojvláknovej sekvencie WAF-RE hybridnými molekulami podľa vynálezu boli uskutočnené oneskorené pokusy na géli na základe princípu ďalej opísaného. Reakcia väzby DNA je uskutočnená v 25 μΐ reakčnom prostredí (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,05 mM ZnCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mg/ml BSA, 10 % glycerol, 1 % Nonidet P-40, 0,1 M NaCl, 2 μg/ml aprotinín, 2 pg/ml E-64, 2 pg/ml leupeptín, 2 pq/ml pepstatín) pridaním sekvencie WAF-RE (2,4 ,10’9M) pripravenej podľa predchádzajúceho pokusu, 1,2.10'6 M súťažného studeného oligonukleotidu AP2 (Promega) použitého na nešpecifickú fixáciu a 30 ng hybridných molekúl na testovanie prítomnosti alebo neprítomnosti divého proteínu p53 (medzi 3 a 30 ng), divý proteín p53 môže byť aktivovaný pre svoju aktivitu špecifickej fixácie na DNA prostredníctvom 300 ng protilátky pAb 421 (T. R. Hupp, Celí Vol 71 (1992) 875). Reakčná zmes sa inkubuje počas 30 minút na ľade a výsledná zmes sa podrobí natívnej elektroferéze na 4 % polyakrylamidovom géli s pohybom pri 200 V a pri teplote 16 °C. Gél sa potom suší a autorádiografuje.
Výsledok ukážkového pokusu súťaže medzi divým proteínom p53 a HisV325 v oneskorení na géli je zobrazený na obrázku 6. Tento výsledok ukazuje, že HisV325 rozpozná dvojvláknovú sekvenciu WAF-RE afinitou porovnateľnou s afinitou divého proteínu p53. Môže sa poznamenať, že HisV325 dáva na oneskorenom géli majoritný pruh, ktorý sa pohybuje rýchlejšie ako pruh získaný s divým proteínom p53. Toto by mohlo naznačovať, že HisV325 sa fixuje vo forme dimérov. Je teda možné predpokladať, že tento pruh nie je ani posunutý, ani amplifikovaný prítomnosťou pAb421. V neprítomnosti pAb421 divý p53 sa fixuje omnoho menej na RE-WAF ako V325.
D2. Posúdenie transaktivačnej funkcie
Transaktivačná funkcia konštrukcií bola posúdená v systéme transaktivácie in vivo v bunkách SAOS-2 (ľudský osteosarkóm), nedostatočne vyvinutých pre dve alely proteínu p53 (bunky prístupné ATCC pod číslom HTB85) a v nádorovej línii H358 (Maxwell a Roth, Oncogene 8 (1993), 3421) a HeLa (ATCC CCL 2). Tento systém spočíva v použití reportérového génu dávkovateľného enzymaticky a umiestneného v závislosti od promótora obsahujúceho nukleotidový motív špecifického rozpoznania divou formou p53 (pozri experimentálne protokoly).
V týchto testoch je nosným génom gén CAT (chloramfenikolacetyl-transferáza) a sekvencia rozpoznania proteínomp53, ktorá je zhodná so sekvenciou (p53RE) definovanou Funkem a spolupracovníkmi (Mol. Celí. Biol. 12(1992) 2866).
Posúdenie tejto funkcie bolo uskutočnené v porovnaní s funkciami divého proteínu pre tri typy rôznych kritérií.
D 2.1. Transaktivačná aktivita v zodpovedajúcich dávkach
Bunky (3,5 . 105) boli naočkované na Petriho misku s priemerom 6 cm, ktorá obsahovala 3 ml kultivačnej pôdy DMEM (Gibco BRL) s prídavkom 10 % teľacieho plodového séra inaktivovaného teplom a kultivované cez noc pod 5 % CO2 pri teplote 37 °C. Takto boli transfekované rôzne konštrukcie s použitím lopofectAMINu (Gibco BRL) ako agentov transfekcie nasledujúcim spôsobom: 3 pg plazmidu boli inkubované (medzi nimi 0,5 pg plazmidového reportéra) s 10 μΐ lipofectAMINu počas 30 minút s 3 ml kultivačnej pôdy Opti-MEM (Gibco BRL) bez séra (transfekčná zmes). V priebehu tohto času sa bunky dvakrát prepláchli PBS a potom boli inkubované 4 hodiny pri teplote 37 °C s transfekčnou zmesou, ktorá bola potom odsatá a nahradená 3 ml kultivačnej pôdy DMEM (Gibco BRL) s prídavkom 10 % teľacieho plodového séra inaktivovaného teplom a bunky boli ponechané ešte 48 hodín pri teplote 37 °C.
Protokol dávkovania aktivity CAT hodín po transfekcii buniek boli jedenkrát premyté PBS, potom zoškrabnuté a znova zaradené do 100 μΐ 0,25 M pufra Tris pH 8 a lyzované troma cyklami zmrazovania - rozmrazovanie prebieha v kúpeli etanol/ľad. Takto získaný bunkový extrakt bol odstredený pri 10 000 rpm počas 15 minút a získaný supematant bol použitý na dávkovanie aktivity. Táto je uskutočnená prídavkom 20 μΐ bunkového extraktu k 130 μΐ reakčnej zmesi, ktorej konečné zloženie je nasledujúce:
- Acetylkoenzým A 0,4 mM
- Chloramfenikol, D-threo-(dichloracetyl-l,2-14C) μΜ (200 nCi)
- Tris 0,18 M pH 8
Po jednej hodine inkubácie pri teplote 37 °C reakčné produkty boli extrahované 250 μΐ etylacetátu, z tohto extraktu 20 μΐ bolo umiestnených na kremennej doske (chromatografia na tenkej vrstve) s elučnou zmesou obsahujúcou 95 % chloroformu a 5 % metanolu. Takto získaná chromatografická doštička je nakoniec vyvolaná pomocou detekčného prístroja (Pacckard instruments), ktorý umožňuje vypočítať pomer rôznych produktov acetylácie, pomer ukazuje aktivity enzýmu Chloramfenikol-acetyl-transferáza, a teda transaktivačnú aktivitu rôznych konštrukcií.
Získané výsledky v línii SAOS-2 s konštrukciami umiestnenými pod riadením promótora CMV (pCDNA3) sú uvedené na obrázku 7 a 8 a ukazujú nasledujúce vlastnosti pre každú konštrukciu:
- Proteín p53 predstavuje dávku aktivity závislú, ktorá smeruje k nasýteniu pre zvýšené dávky (od 100 ng plazmidu). Táto saturácia môže vyjadriť nevyhnutnosť kofaktorov, ktoré by boli za týchto podmienok limitujúce.
- Proteín AS zachováva schopnosť transaktivačnej aktivity divého proteínu.
- Proteíny V-325, V-336 a V-343 dokazujú, rovnako ako proteín p53, transaktivačnú aktivitu, nezdajú sa, že sú schopné nasýtenia v silných dávkach. Je teda možné, že táto zjavná neprítomnosť saturácie potom vedie k celkovému zvýšeniu aktivity. Okrem iného je možné tiež pozorovať, že konštrukcia V-325 je aktívnejšia ako jej homológy V-336 a V-343, táto konštrukcia navrhuje, aby chiméme proteíny obsahovali oblasť 75-325 a boli tak predovšetkým výhodné.
S cieľom potvrdiť tieto vlastnosti boli uskutočnené podobné pokusy v nádorovej línii H 358, ktorá je rovnako ako línia SAOS-2 chybná na oboch alelách génu p53. V týchto pokusoch bola každá transfekcia uskutočnená s 50 ng každej konštrukcie umiestnenej pod kontrolou promótora CMV. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1, ktorá jasne ukazuje, že dva varianty V-325 a V-336 preukazujú zlepšenú transaktivačnú aktivitu vzhľadom na transaktivačnú aktivitu divého proteínu p53 s tým, že má opäť lepšiu aktivitu variant V-325.
Tabuľka 1: Transaktivačná aktivita v bunkách nádorovej línie H358
pCDNA 3 divý p53 V-325 V-336
relatívna aktivita 1 6 25 16
Tieto dva pokusy potvrdzujú, že varianty podľa vynálezu majú aspoň jednu vlastnosť vylepšeného proteinu p53.
S cieľom overiť, že tento rozdiel aktivít nie je spôsobený rozdielom expresie, ale prírastkom aktivity variantov podľa vynálezu, úroveň expresie divého proteínu p53 a variantov V-325, V-336 a V-343 bola analyzovaná v bunkách SAOS-2. S týmto cieľom boli bunky transfekované 3 pg každého plazmidu použitého v predchádzajúcom pokuse a znova získané 24 hodín a 48 hodín po transfekcii. Po dvoch premytiach v pufri PBS (Gibco BRL) boli bunky lyzované počas 15 minút pri teplote 4 °C v 50 μΐ pufra RIPA (10 mM Tris-HC1, pH 8,0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 % Nonidet-P40,1 % deoxycholátu sodného, 0,1 % dodecylsulfátu sodného) s prídavkom 2 mM PMSF, 20 pg/ml aprotínu, 2 pg/ml E64, 2 pg/ml leupeptínu a 2 pg/ml pepstatínu. Po 15 minútach odstreďovania pri 15 000 rpm supematanty boli odobrané, pridané k elučnému pufru (Laemmli U. K., Náture, 227, 680-685,1970) a podrobené elektroforéze na 10 % polyakrylamidovom géli v denaturujúcom prostredí 200 V podľa už opísaného protokolu (Laemmli U.K., Náture, 227, 680-685, 1970). Proteíny boli potom prenesené na membránu PVDF (NEN Research Products) s použitím prenosného systému semi-sec NOVEX za dodržania odporúčam výrobcu a detegované pomocou monoklonálnych protilátok pAb 240 (Oncogene Sciences, Ab-3) a sekundárnych protilátok (králik, anti-myš) spriahnutých s peroxidázou (Nordic Immunology) s použitím súpravy ECL (Amersham).
Výsledky tohto pokusu zobrazené na obrázku 9 dokazujú, že varianty B-325 a V-336 sú exprimované pri porovnateľnej úrovni s variantmi divého proteínu p53, a že variant V-343 sa zdá do určitej miery lepšie exprimovaný ako predchádzajúce varianty. Z väčšieho porovnania úrovne expresie v 24. a 48. hodine možno indikovať, že relatívna stabilita každej konštrukcie je podobná. Tento výsledok ukazuje, že aktivita variantov podľa vynálezu V-325 a V-336 nie je spôsobená lepšou expresiou, ale pravdepodobne potenciálom aktivátora prírastku transkripcie, čo je v rozpore s variantom V-343.
Neskoršie s cieľom potvrdiť schopnosť variantov podľa vynálezu aktivovať umiestnený gén v závislosti od elementu rozpoznania divého proteínu p53 bola uskutočnená štúdia aktivity endogénnych génov s ohľadom na expresiu génov hdm2 a WAF1 bežne indukovaných proteínomp53.
Tento pokus bol uskutočnený v línii buniek EB (rakovina hrubého čreva) chybných na oboch alelách kódujúcich proteín p53 (Shaw et al., PNAS 89 (1992) 4495). Stabilný kloň exprimujúci proteín p53 pod kontrolou promótora indukovateľného metationínom z tejto línie bol konštruovaný (kloň EB-1 (Shaw et al., PNAS 89 (1992) 4495)). Rovnakým spôsobom bol konštruovaný ďalší stabilný kloň exprimujúci proteín V-325 pod kontrolou promótora indukovateľného metalotioneínom s použitím plazmidu odvodeného od vektora pmIM -Tli (získaný podľa P. Shawa) inzerciou cDNA kódujúcou proteín V-325 z miest EcoRI - Nôti (pmlMTliV325). S tým cieľom boli transfekované bunky EB (3,5 105 buniek) 1,3 nq plazmidu pmIMTli-V-325 a 200 ng plazmdu pcDNA3 podľa protokolu už skôr opísaného, stabilné klony boli šľachtené po transfekcii rastom v kultivačnom médiu obsahujúcom 800 pg/ml geneticínu. Bol vybraný kloň exprimujúci V-325 indukovateľný na porovnateľnej úrovni expresie proteínu p53 v klone EB-1 (kloň EB-V325).
Klony EB-1 a EB-V325 rovnako ako rodičovské bunky EB (106 buniek) boli podrobené pôsobeniu ZnCl2 (200 μΜ) a bunkový extrakt bol podrobený v rôznych časoch elektroforéze a prenesený na membránu, ako je skôr opísané. Prenesené bunky boli detegované troma rôznymi protilátkami, monoklonálnou protilátkou pAb240 nasmerovanou proti proteínu p53 a dvoma protilátkami polyklonálnymi, jednou nasmerovanou proti proteínu hdm2 a druhou proti proteínu WAF1. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obrázku 9, ktorý ukazuje, že: (1) proteín p53, chýba v bunkách EB, EB-V325 a EB-1, za neprítomnosti indukcie je exprimovaný v klone EB-1 4 hodiny po začiatku pôsobenia zinku a variant V-325 je exprimovaný rovnakým spôsobom v klone EB-V325, (2) proteín WAF1, ktorého expresia sa zdá, že indukuje v bunkách EB pôsobením zinku štyri hodiny po začiatku svoju expresiu predĺženú až na 16 hodín v klonoch EB-1 a EB-V325 a (3) indukcia proteínu hdm2 nebola pozorovateľná, ako v klonoch EB-1 a EB-V325 so zvýšenou expresiou v klone EB-V325.
Tieto výsledky ukazujú, že aktivita tranksripcie variantu V-3 25 sa vyjadruje indukciou expresie génov normálne indukovaných divým proteínom p53 a že tento variant predstavuje prírastok aktivity vo fyziologickom kontexte vzhľadom na divý proteín p53.
D2.2 Vplyv proteínu E6 (HPV18) na transaktivačnú funkciu
Použité protokoly sú zhodné s tými, ktoré sú opísané v príklade Dl .1. V tomto pokuse konštrukcie umiestnené pod kontrolou promótora CMV (pCDNA3) boli kotransfekované s rastúcou koncentráciou plazmidu exprimujúceho E6 pod kontrolou promótora SV40 (pSV2). Získané výsledky v línii SAOS-2 sú uvedené na obrázku 11a ukazujú nasledujúce vlastnosti pre každú konštrukciu:
- aktivita proteínu p53 sa znižuje so zvyšovaním koncentrácie E6, tento úbytok aktivity p53 je veľmi pravdepodobne obrazom degradácie proteínu p53, ktorý je vyvolaný E6,
- proteín V-336 ukazuje absenciu citlivosti na E6,
- pri proteíne V-325 sa zdá, že môže byť ľahko aktivovaný E6. Proteín V-325 je vždy a za všetkých situácií viac aktívny ako proteín p53. S cieľom potvrdiť rozdiel tohto chovania oproti proteín E6, bola testovaná transaktivačná aktivita konštrukcií V-325 a V-336 v pozitívnych bunkách HPV18 (HeLa) exprimujúcich proteín E6 a porovnávaná s transaktivačnou aktivitou divého proteínu p53.
V tomto príklade transfekcie uskutočnenej podľa protokolu už skôr opísaného boli umiestnené rôzne konštrukcie pod kontrolu promótora CMV (pCDNA3).
Výsledky uvedené na obrázku 12 ukazujú veľmi čistú transkripčnú aktivitu dvoch konštrukcií V-325 a V-336 a veľmi nízku aktivitu divého proteínu p53, to vychádza z predpokladu, že tieto dve konštrukcie nie sú citlivé na E6 na rozdiel od divého proteínu.
Na testovanie, či je táto neprítomnosť citlivosti k proteínu E6 odrazom lepšej stability k degradácii indukovanej týmito proteínmi, boli uskutočnené pokusy degradácie in vitro.
Boli získané rôzne molekuly použité v tomto pokuse transláciou in vitro pri lýze retikulocytov, molekúl opísaných v príklade Cl (vektor pcDNA3) s použitím súpravy TNT Coupled Reticulo.cyte lysate Systems (Promega) podľa experimentálneho protokolu, ktorý opisuje dodávateľ pre reakčný objem 50 μΐ.
Pre tento pokus hybridné molekuly podľa vynálezu V-325aV-336 rovnako ako divý proteín p53 sú produkty translácie in vitro za prítomnosti 44 pCi 35S-metionínu (Amersham) (1175 Ci/mmol), aby sa vytvorili tieto hybridné molekuly rádioaktívne značené. Proteín E6 (HPV18) je produkt vytvorený za rovnakých podmienok, ale za neprítomnosti 35S-metionínu.
μΐ každého produktu rádioaktívne označeného (p53, V-325 a V-336) boli inkubované pri teplote 30 °C s 2 μΐ proteínu E6 rádioaktívne neznačeným a s 10 μΐ lyzovaného retikulocytu v konečnom objeme 40 μΐ pufta 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 3 mM DTT. Reakcia bola zastavená v rôznych časových úsekoch a vždy bolo odobrané z reakčnej zmesi 7,5 μΐ a tento objem bol opäť nahradený prídavkom 7,5 μΐ elučného pufra (Laemmli U. K., Náture, 227, 680-685, 1970), takto pripravené vzorky boli podrobené elektroforéze na 10 % polyakrylamidovom géli v denaturujúcom prostredí pri 200 V podľa vopred opísaného protokolu (Laemmli U. K., Náture, 227, 680-685, 1970). Gél bol potom sušený a detegovaný pomocou zariadenia na
SK 286955 Β6 detekciu (Packard instruments), ktoré umožňuje určiť množstvo variantov podľa vynálezu, ktoré neboli degradované v priebehu reakcie.
Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obrázku 14, ktorý jasne ukazuje, že varianty V-325 a V-336 sú rezistentnejšie ako divý proteínu p53 na denaturáciu indukovanú E6, variant V-325 má opäť lepšie vlastnosti v termíne rezistencie na degradáciu. Tieto výsledky odrážajú rozdiely citlivosti divokého proteínu p53 a variantov V-325 a V-336 k proteínu E6 pozorovanej na úrovni transkripčnej aktivity v predchádzajúcich pokusoch (obrázok 11 a 12).
Toto chovanie robí tieto dve konštrukcie výhodné predovšetkým pri liečení patológií spojených s infekciami spôsobenými HPV16 alebo HPV18.
D2.3. Vplyv dominantného negatívneho mutanta proteínu p53 na transaktivačnú funkciu
V tomto príklade bol použitý mutant H175 opísaný ako dominantný onkogénny a dominantný negatívny oproti divému proteínu p53. V tomto príklade transfekcie uskutočneného podľa protokolu už skôr opísaného boh umiestnené rôzne konštrukcie rovnako ako mutant H175 pod kontrolu promótora CMV (pCDNA3). Každá konštrukcia bola kotransfekovaná s rastúcou koncentráciou plazmidu exprimujúceho mutant H175.
Výsledky uvedené na obrázku 14 ukazujú nasledujúce vlastnosti pre každú konštrukciu:
- Protein p53 znižuje svoju transaktivačnú aktivitu za prítomnosti nadbytku mutovanej formy H175, to zodpovedá fyziologickej situácii, je známe, že tento typ v mutovanej forme je stabilnejší ako divý protein p53, a je teda vždy v nadbytku. Meria sa teda dominantný negatívny vplyv tohto mutanta.
- Protein AS má prírastok citlivosti k dominantnému negatívnemu vplyvu mutanta H175, pretože je citlivý k slabším koncentráciám tohto mutanta.
- Naopak proteíny V-325 a V-336 nie sú len citlivejšie na dominantný negatívny vplyv, ale ich zvýšená aktivita je závislá od veľkosti dávky prítomnej mutovanej formy H175. Opäť v tomto pokuse má protein V-325 tento vplyv zvýšený vzhľadom na protein V-336 potvrdzujúci to trochu viac vo svojom možnom superdivom štatúte.
D2.4. Vplyv proteínu hdm2 na transaktivačnú funkciu
Použité protokoly sú identické už k skôr opísaným v príklade D 1.1. V tomto príklade transfekcie boli konštrukcie umiestnené pod kontrolu promótora CMV (pcDNA3), boli kontransfekované s rastúcou koncentráciou plazmidu exprimujúceho hdm2 (fragment 1-134) pod riadením promótora CMV (pcDNA3). Výsledky získané v línii SAOS-2, uvedené na obrázku 15, ukazujú nasledujúce vlastnosti pre každú konštrukciu:
- aktivita proteínu p53 sa znižuje so zvyšovaním koncentrácie hdm2, čo zodpovedá fyziologickej situácii,
- protein V-325 sa zdá byť necitlivý k tejto inhibícii hdm2.
Toto chovanie robí protein V-325 superdivým kandidátom výhodným predovšetkým na liečenie patológií spojených so superexpresiou hdm2 a tiež pri liečení patológií spojených so silnou expresiou bunkových proteínov interagujúcich s N-koncom proteínu p53.
Výsledky týchto štyroch pokusov jasne ukazujú, že varianty podľa vynálezu, predovšetkým varianty obsahujúce oblasti 75-325-Iz alebo 75-336-Iz, predstavujú (1) zvýšenú transaktivačnú aktivitu, (2) menšiu citlivosť na vplyv proteínu E6 HPV18 (3) neprítomnosť citlivosti k dominantnému negatívnemu vplyvu istých mutantov proteínu p53 a vzrast aktivity v takomto kontexte a (4) neprítomnosť citlivosti k proteínu hdm2. Tieto rôzne vlastnosti sú celkom pozoruhodné a nečakané a udeľujú variantom podľa vynálezu terapeutické význačné prednosti.
D3. Vplyv na bunkový rast
Vplyv konštrukcií V-325 a V-336 na bunkový rast bol testovaný súčasne s proteínom p53 na rôznych typoch bunkových línií v pokuse o tvorbu rezistentných kolónií na neomycín, nasledujúcej transfekcie plazmidov exprimujúcich tieto tri proteíny.
V tomto pokuse transfekcie uskutočnenej podľa protokolu už skôr opísaného boli umiestnené rôzne konštrukcie pod kontrolu promótora CMV (pcDNA3).
Protokol tvorby kolónií rezistentných na neomycín hodín po transfekcii boli bunky odobrané a umiestnené na Petriho misky s priemerom 10 cm a podrobené rastu s 10 ml kultivačného média DMEM s prídavkom 10 % plodového hovädzieho séra inaktivovaného teplom, ktoré obsahuje 400 pg/ml geneticínu (G418). Po 15 dňoch kultivácie v prítomnosti G418 bol počet kolónií NeoR určený počítaním po farbení fuchsínom.
Tieto pokusy boli uskutočnené na rôznych typoch buniek, ktorých štatút proteínov p53 a Ras je uvedený v tabuľke 2.
SK 286955 Β6
Tabuľka 2: Štatút bunkových línií použitých v teste tvorby kolónií NéoR
línia p53 Ras superexpresia hdm2 č. ATCC
SAOS-2 -/- 2 - HTB 85
HCT116 7 mutovaný Ki-Ras - CCL 247
H322 L 248 7 - (*)
H460 divý mutovaný Ki-Ras - HTB 177
HeLa divý 7 - CCL 2
OsA-CL 7 7 + (**)
(*) Putnam et al., Surg. Oncol., 1 (1993), 49 (**) Oliner et al., Náture, 358, (1992), 80
Výsledky pokusov sú uvedené v tabuľke 3 a na obrázku 16.
Tabuľka 3: Tvorba kolónií NéoR
línia vektor divý p53 V-325 V-336
SAOS-2 253 17 12 13
HCT116 112 62 58 61
H322 93 5 2 3
H460 153 110 07 92
ΗθΐΛ 172 151 31 47
Tieto výsledky ukazujú, že konštrukcie V-325 a V-336 majú schopnosť blokovať bunkový rast spôsobom aspoň tak účinným ako divý proteín p53 v bunkových kontextoch, kde tento proteín môže normálne fungovať (divý p53 alebo dvojnásobne deletovaný), ale predovšetkým, že tieto konštrukcie zachovávajú tieto aktivity dokonca i v bunkách, kde je divý proteín p53 veľmi málo aktívny (bunky HeLa exprimujúce proteín E6 HPV18 a bunky OsA-CL prezentujúci zvýšenú expresiu proteínu hdm2). Tieto vlastnosti udeľujú variantom podľa vynálezu významné terapeutické výhody.
D4. Apoptická aktivita variantov podľa vynálezu
Apoptická aktivita podľa vynálezu bola študovaná s použitím buniek EB, EB-1 a EB-V325 a podmienok indukcie už skôr opísaných (príklad Dl).
Bunky takto indukované (106 buniek) boli fixované a permeabilizované inkubáciou počas 40 minút v 1 ml Permeafixu (Ortho Diagnostic Systems Inc.), potom dvakrát premyté pufrom A (PBS (Gibco BRL) s prídavkom 0,5 % Tweenu 20), potom boli resuspendované a inkubované počas jednej hodiny pri izbovej teplote v 100 μΐ pufra A s prídavkom 2 % BSA (PBS-BSA) a 1 pg monoklonálnej protilátky pAb240. Po dvoch nových premytiach pufrom PBS-BSA boli bunky inkubované počas jednej hodiny pri izbovej teplote v 100 μΐ rovnakého pufra s prídavkom 1 ng polyklonálnej protilátky sekundárne viazanej k fluoresceínu (GAM-FITC (Immunotech)). Potom boli bunky dvakrát premyté pufrom A, resuspendované v 1 ml rovnakého pufra obsahujúceho 5 mg propídium jodidu a 1 mg RNázy (DNáza-free) a inkubované počas 30 minút pri izbovej teplote, potom boli analyzované cytometricky.
Výsledky pokusu 24- a 48-hodinovej indukcie uskutočnenej na bunkách EB-1 a EB-V325 sú uvedené na obrázku 17. Za týchto podmienok bunky exprimujúce divý proteín p53 alebo jeho variant V-325 (detegovaný protilátkami pAb240) sú majoritne rozdelené na fáze Gl a sub-Gl (apoptóza) po 24 hodinách indukcie a po 48 hodinách hlavne na sub-Gl. Tento výsledok jasne ukazuje, že proteín V-325 je schopný, rovnako ako divý proteín p53, indukovať apoptózu.
Výsledky kinetického pokusu indukcie uskutočneného na bunkách EB a klonoch EB-1 a EB-V325 uvedené na obrázku 18 ukazujú, že variant V-325 indukuje rýchlejšie a mohutnejšie apoptózu ako divý proteín p53. S ohľadom na fakt, že tieto dva proteíny sa zdajú byť exprimované za porovnateľných úrovniach v klonoch (pozri Dl), výsledok pripúšťa myšlienku zlepšenia aktivity variantu V-325 vzhľadom na aktivitu divého proteínu p53.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:
(1) podávateľ:
(A) Meno: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) Ulica: 20, Raymond ARON (C) Mesto: ANTONY (D) Krajina: Francúzsko (E) Smerovacie číslo: 92165 (G) Telefón: (1) 40.91.69.22 (H) Fax: (1) 40.91.72.91 (ii) názov vynálezu: Varianty proteínu p53 a ich terapeutické použitie (iii) počet sekvencií: 46 (iv) počítačová forma:
(A) typ nosiča: Floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilný (C) systém využitia: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Relase 1.0, Version 1.30 (OEB) (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 112 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:
AGATCTGAAG GCCTCAAGG AGAAGCTGAA GGCCCTC-GAG GAC-AAGCTGA 50
AGGCCCTGGA GGAGAAGCTG AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC 100
GATATCGCGG CC 112 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 266 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO-. 2:
AAGCTTGAAT
TCGTTAACAT
GTCCACGGCC
CCCCCGACCG
ATGTCAGCCT
GGGGGACGAG
CTCCACTTAG
ACGGCGAGGA
CGTGGCGATG
GCGCATGCCG
100
ACGCFCTAGA
CGATTTCGAT
CTGGACATGT
TGGGGGACGG
GGATTCCCCG
150
GGGCCGGGAT
TTACCCCCCA
CGACTCCGCC
CCCTACGGCG
CTCTGGATAT
200
GGCCGACTTC
GAGTTTGAGC
AGATGTTTAC
CGATGCCCTT
GGAATTGACG
250
AGTACGGTGG
TCGACC
266
SK 286955 Β6 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 3:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 7 6 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:
TCGAGCCTGC AGCCTAGAGC CTTCCAAC-CC CTCATGAAGG AGGAAAGCCC
AAACTGCTAG TGAGGATCCG CGGCCG (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 788 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:
GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG CCCTGCACCA GCCCCCTCCT AAACCTACCA GGGCAGCTAC ACAGCCAAGT CTGTGACTTG TTGCCAACTG GCCAAGACCT CCCCGCCCGG CACCCGCGTC CACATGACGG AGGTTGTGAG TAGCGATGGT CTGGCCCCTC TGCGTGTGGA GTATTTGGAT GTGCCCTATG AGCCGCCTGA CAACTACATG TGTAACAGTT TCCTCACCAT CATCACACTG AACAGCTTTG AGGTGCGTGT AGAGGAAC-AG AATCTCCGCA CAGGGAGCAC TAAGCGAGCA CCAAAGAAGA AACCACTGGA
ACCTGCACCA GCAGCTCCTA GGCCCCTGTC ATCTTCTGTC GGTTTCCGTC TGGGCTTCTT CACGTACTCC CCTGCCCTCA GCCCTGTGCA GCTGTGGGTT CGCGCCATGG CCATCTACAA GCGCTGCCCC CACCATGAGC CTCAGCATCT TATCCGAGTG GACAGAAACA CTTTTCGACA GGTTGGCTCT GACTGTACCA CCTGCATGGG CGGCATGAAC GAAGACTCCA GTGGTAATCT TTGTGCCTGT CCTGGGAGAG AGAAAGGGGA GCCTCACCAC CTGCCCAACA ACACCAGCTC TGGGGATCCG CGGCCGCC
CACCGGCGGC 50
CCTTCCCAGA 100
GCATTCTGGG 150
ACAAGATGTT 200
GATTCCACAC 250
GCAGTCACAG 300
GCTGCTCAGA 350
GAAGGAAATT 400
TAGTGTGGTG 450
CCATCCACTA 500
CGGAGGCCCA 550
ACTGGGACGG 600
ACCGGCGCAC 650
GAGCTGCCCC 700
CTCTCCCCAG 750
788
(2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 821 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie
SK 286955 Β6 (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:
GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG CCCTGCACCA GCCCCCTCCT AAACCTACCA GGGCAGCTAC ACAGCCAAGT CTGTGACTTG TTGCCAACTG GCCAAGACCT CCCCGCCCGG CACCCGCGTC CACATGACGG AGGTTGTGAG TAGCGATGGT CTGGCCCCTC TGCGTGTGGA GTATTTGGAT GTGCCCTATG AGCCGCCTGA CAACTACATG TGTAACAGTT TCCTCACCAT CATCACACTG AACAGCTTTG AGGTGCGTGT AGAGGAAGAG AATCTCCGCA CAGGGAGCAC TAAGCGAGCA CCAAAGAAGA AACCACTGGA GCGTGAGGAT CCGCGGCCGC
ACCTGCACCA GCAGCTCCTA GGCCCCTGTC ATCTTCTGTC GGTTTCCGTC TGGGCTTCTT CACGTACTCC CCTGCCCTCA GCCCTGTGCA GCTGTGGGTT CGCGCCATGG CCATCTACAA GCGCTGCCCC CACCATGAGC CTCAGCATCT TATCCGAGTG GACAGAAACA CTTTTCGACA GGTTGGCTCT GACTGTACCA CCTGCATGGG CGGCATGAAC GAAGACTCCA GTGGTAATCT TTGTGCCTGT CCTGGGAGAG AGAAAGGGGA GCCTCACCAC CTGCCCAACA ACACCAGCTC TGGAGAATAT TTCACCCTTC C
CACCGGCGGC 50
CCTTCCCAGA 100
GCATTCTGGG 150
ACAAGATGTT 200
GATTCCACAC 250
GCAGTCACAG300
GCTGCTCAGA350
GAAGGAAATT400
TAGTGTGGTG450
CCATCCACTA500
CGGAGGCCCA550
ACTGGGACGG600
ACCGGCGCAC650
GAGCTGCCCC700
CTCTCCCCAG750
AGATCCGTGG800
821 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 6:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 15 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:
ATGGAGGAGC CGCAG 15 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 7:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 42 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 7:
GGCGGCCGCG ATATCGATTC ATCAGTCTGA GTCAGGCCCT TC 42 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 8:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 36 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:
GGCGGCCGCG ATATCGATTC ATCAGCTCGA GTGAGC 36 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 9:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 43 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iii) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:
TCGAGCCTGC AGCCTAGAGC CTTCCAAGCC CTCATGAAGG AGG 43 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 10:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 31 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:
AAAGCCCAAA CTGCTGATGA ATCGATATCG C 31 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 11:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 30 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 11:
TGAGGGCTTGGAAGGCTCTAGGCTGCAGGC 30 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 12:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 44 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:
GGCCGCGATA TCGATTCATC AGCAGTTTGG GCTTTCCTCC TTCA 44 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 13:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 39 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 13:
GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG ACCTGCACCA GCAGCTCCT (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 14:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 32 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 14:
GGCGGCCGCG GATCCCCATC CAGTGGTTTC TT 32 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 15:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 15 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 15:
ATCTGAATGG CGCTC 15 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 16:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 32 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 16:
GGCGGCCGCG GATCCTCACG CCCACGGATC TG 32 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 17:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 39 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 17:
AAGCTTGAAT TCGTTAACAT GTCCACGGCC CCCCCGACC 39 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 18:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 23 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 18:
GGTCGACCAC CGTACTCGTC AAT 23 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 19:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 33 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 19:
GAT C TGAAGG CCCTCAAGGA GAAGCTGAAG GCC 33 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 20:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 36 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO. 20:
CTGGAGGAGA AGCTGAAGGC CCTGGAGGAG AAGCTG 36 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 21:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 38 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 21:
AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC GATATCGC 38 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 22:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 42 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna
SK 286955 Β6 (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO:22:
AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC GATATCGC 38 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 23:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 42 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 23 :
TAGTGCCTTC AGCTTCTCCT CCAGGGCCTT CAGCTT 36 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 24:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 33 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 24:
GGCCGCGATA TCGATTCATC ATCGCTCCCC CAG 33 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 25:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 1095 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...1095 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 25:
ATG TCC ACG GCC CCC CCS ACC «ΛΤ STC AGC CTG SSG GAC GAG CK CAC
Met 1 Ser Thr Ala Pro 5 Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu 15 His
10
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT
Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Mat Ala His 20 25 Ala Asp AK Leu 30 Asp Asp
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT
Phe Asp LtU Asp 35 Met Leu Gly Asp Gly Asp 40 Ser Pro Gly Pro 45 Gly Phe
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC
Thr Pro His Asp 50 ser Ala Pro Tyr Gly AK 55 Leu Asp 60 Mat AK ASP Phe
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CIT GGA ATT GAC GAG TAC GGT
Glu 55 Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu 70 Gly 75 Zle Asp Glu Tyr Gly 80
GCT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC
Gly Arg Pro ak Pro 85 AK AK Pro Thr Pro 90 AK AK pro Ala pro 95 AK
ccc TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG
Pro Ser Trp Pro 100 Leu Ser Ser Ser val Pro 105 Ser Gin Lys Thr 110 Tyr Gin
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG
Gly Ser Tyr Gly 115 Phe Arg Leu Gly Phe Leu 120 HÍS Ser Gly Thr 125 Ala Lys
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA
Ser Val Thr Cys 130 Thr Tyr Ser Pro AK Leu 135 Asn Lys 140 Met Phe Cys Gin
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG IGG GIT GAT TCC ACA CCC CCG
Leu 145 AK Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp 150 Val 155 Asp ser Thr Pro Pro 150
CCC GGC ACC CGC CTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC
Pro Gly Thr Arg Val 155 Arg Ala Met AK Zle 170 Tyr Lys Gin Sex Gin 175 His
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT
Met thr Glu Val 180 Val Arg Arg Cys Pro His 185 His Glu Arg Cys 190 Ser Asp
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT
Ser Asp Gly Leu 195 Alt Pro Pro Gin His Leu 200 íle Arg Val Glu 205 Gly Asn
TTG CCT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAG ACT ’ TTT 1 CGA CAT AGT GTG
Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Mg Asa . Thr Phe Arg His Ser val
210 215 220
GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TCT ACC ACC ATC
Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr íle
225 230 235 240
CAC TAC AAC TAC ATG TCT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG
His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg
245 250 25S
AGG CCC ATC CTC ACC ATC íle TTT Phe ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA íle Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu
Arg Pro íle Leu Thr AGC Ser
CTG Leu GGA Gly 260 CGG AAC 265 270 TGT CCT GGG AGA
GAG Glu STS CGT GTT TGT GCC
Arg 275 Asn Val 280 Arg Val cys AU cys 285 ΡΓΟ Gly Arg
GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC
Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly G1U Pro His
290 295 300
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG ccc AAC AAC ACC
His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr
305 310 315 320
AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGG GAT CTG AAG
Sex Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Asp Leu Lys
325 330 335
GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG
Ala Leu Lys Glu Lys Leu Lys AU Leu Glu Glu Lys Leu Lys Ala Leu
340 345 350
GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA TGA
G1U G1U Lys Leu Lys Ala Leu Val Gly Glu Arg « •
355 360 365
9«
144
192
240
288
336
384
432
480
528
57«
524
572
720
768
816
864
912
960 1008 1056
1095 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 26: 5 (i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 1128 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...1128 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 26:
ATG TCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48
Met Ser Thr Ala Pro 370 Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His
375 380
MA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96
Leu Asp Gly Glu 385 Asp Val Ala Met Ala 390 His Ala Asp Ala Leu 395 Asp Asp
MC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
Phe Asp Lau 400 Asp Mat Leu Gly Asp 405 Gly Asp Ser Pro Gly 410 Pro Gly Phe
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro 415 HiS Asp Ser Ala Pro 420 Tyr Gly Ala Leu Asp 425 Met Ala Asp Phe
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
G1U 430 Phe G1U Gin Mat Phe 435 Thr Asp Ale Leu Gly 440 Zle Asp G1U Tyr Gly 445
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala Pro 450 Ala Ala Pro Thr Pro 455 Ala Ala Pro Ala Pro 460 Ala
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro 465 Leu Ser Ser Ser Val 470 Pro Ser Gin Lys Thr 475 Tyr Gin
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser Tyr 430 Gly Phe Arg Leu Gly 485 Phe Leu His Ser Gly 490 Thr Ala Lys
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser val 495 Thr Cys Thr Tyr Ser 500 Pro Ala Leu Asn Lys 505 Mat Phe Cys Gin
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu 510 Ala Lys Thr cys Pro 515 Val Gin Leu Trp Val 520 ASp Ser Thr Pro Pro 525
CCC GGC Pro Gly ACC CGC Thr Arg GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
val. 530 Arg Ala Het Ala íle S35 Tyr Lys Gin Ser Gin His 540
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro Kis His Glu Arg Cys Ser ASp
545 550 555
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Zle Arg Val Glu Gly Asn
560 565 570
TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG 672
Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg HiS Ser Val
575 580 535
GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC 720
val v<i Pro Tyr Glu Pro Pro G1U val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Zle
590 595 600 605
CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG 768
HIS Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg
610 615 620
AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA 816
Arg Pro íle Leu Thr 11. íle Thr Leu G1U Asp Ser Ser Gly Asn Leu
625 630 635
CTG GGA CGG MC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 854
Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg
640 €45 650
GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC 912
Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His
655 660 665
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC 960
Mis Glu Leu fxo Pro Gly Sex Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr
670 67S 680 685
AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGA GAA TAT TTC 1008
Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys tys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe
690 695 700
ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG 1056
Thr Leu Gin íle Ar? Gly Arg Glu Asp Leu Lys Al. Leu Lys Glu Lys
705 710 715
CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG 1104
Leu ty. Ala Leu Glu Glu Lys Leu Lys Ala Leu G1U Glu Lys Leu Lys
720 725 730
GCA CTA GTG GGG GAG GGA TGA TGA 1128
Ala Leu Val Gly Glu Are t «
735 740
SK 286955 Β6 (2) Informácia pre sekvenciu SEQID NO: 27:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 765 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...765 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 27:
ATG TCC ACG GCC CCC CCG Pro ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48
Met Ser Thr Ala 380 Pro Thr Asp Val Ser 385 Leu Gly Asp Glu 390 Leu H1S
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96
Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp
395 400 405
TTC GAT CTG GAC ATG TTG ggg GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp ser Pro Gly Pro Gly Phe
410 415 420
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr 425 Pro His Asp Ser Ala 430 Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Mat Ala Asp Phe
43S 440
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met 445 Phe Thr Asp Ala Leu 450 Gly Zle Asp Glu Tyr 455 Gly
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala 460 Pro Ala Ala Pro Thr 465 Pro Ala Ala Pro Ala 470 Pro Ala
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp 475 Pro Leu Ser Ser Ser 480 Val Pro Ser Gin Lys 485 Thr Tyr Gin
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser 490 Tyr Gly Phe Arg Leu 495 Gly Phe Leu His Ser 500 Gly Thr Ala Lys
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser 505 Val Thr Cys Thr Tyr 510 Ser Pro Ala Leu Asn 515 Lys Het Phe Cys Gin 520
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr Cys 525 Pro Val Gin Leu Trp 530 Val Asp Ser Thr Pro 535 Pro
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
Pro Gly Thr Arg 540 Val Arg Ala Met Ala 545 Zle Tyr Lys Gin Ser 550 Gin His
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Met Thr Glu 555 Val Val Arg Arg Cys 560 Pro His His Glu Arg 565 Cys Ser Asp
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp 570 Gly Leu Ala Pro Pro 575 Gin His Leu íle Arg Val 580 Glu Gly Asn
TTG CGT GTG GAG TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC 672
Leu 585 Arg Val Glu Tyr Phe 590 Thr Leu Gin Zle Arg 595 Gly Arg Glu Arg Phe 600
GAG ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG 720
Glu Met Phe Arg Glu 605 Leu Asn Glu Ala Leu 610 Glu Leu Lys Asp Ala 615 Gin
GCT Ala GGG Gly AAG Lys GAG Glu 620 CCA Pro GGG Gly GGG Gly AGC Ser AGG Arg 625 GCT Ala CAC His TCG Ser AGC Ser TGA ♦ 630 TGA * 765
(2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 28:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 816 bázových párov (B) typ: nukleotid
(C) počet vlákien: jedno
(D) konfigurácia: lineárna
(ii) typ molekuly: cDNA
(iii) hypotetický: nie
5 (iv) anti-sense: nie
(ix) charakteristika:
(Ά) meno/CLE: CD S (B) umiestnenie: 1...816 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 28: 10
ATG Met TCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48
Ser Thr Ala Pro 260 Pro Thr Asp Val Ser 265 Leu Gly Asp Glu Leu 270 His
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96
Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp
275 2S0 285
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe
290 295 300
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe
305 310 315
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly íle Asp Glu Tyr Gly
320 325 330 335
GGT CGA CCT GCA CCA Gly Ara Pro Ala Pro GCA Ala GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Ala Pro Thr Pro 345 Ala Ala Pro Ala Pro Ala 350
340
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin
355 360 365
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys
370 375 380
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met phe Cys Gin
3Θ5 390 395
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro
400 405 410 415
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala íle Tyr Lys Gin Ser Gin His
420 425 430
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp
435 440 445
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu íle Arg Val Glu Gly Asn
450 455 460
TTG CGT GTG GAG TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC 672
Leu Arg Val Glu Tyr Phe Thr Leu Gin íle Arg Gly Arg Glu Arg Phe
465 470 475
GAG ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG 720
Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin
480 485 490 495
GCT GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT CAC TCG AGC CTG CAG CCT 768
Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser Leu Gin Pro
500 505 510
AGA GCC TTC CAA GCC CTC ATG AAG GAG GAA AGC CCA AAC TGC TGA TGA 816
Arg Ala Phe Gin Ala Leu Met Lys Glu Glu Ser Pro Asn Cys * »
515 520 525
SK 286955 Β6 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 29:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 1209 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...1209 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 29:
ATG Met TCC ACG GCC Ser Thr Ala 275 CCC CCG ACC Pro Pro Thr GAT Asp 280 GTC AGC CtG GGG GAC GAG CIC CAC- 48
Val Ser Leu Gly Asp 285 Glu Leu Hls
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96
Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala Hls Ala Asp Ala Leu Asp Asp
290 295 300
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe
305 310 315 320
15
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATS GCC GAC TTC 192
Thr Pro Hla Asp Ser 325 Ala Pro Tyr Gly Ala 330 Leu Asp 'Met Ala Asp Phe 335
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CIT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly íle Asp Glu Tyr Gly
340 345 350
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
355 360 365
CCC TCC TGG ccc CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin
370 375 380
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu H1S Ser Gly Thr Ala Lys
385 390 395 400
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Mat Phe Cys Gin
405 410 415
CTG GCC AAG ACC TCC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr cys Pro Val Gin Leu Trp val ASp ser Thr pro Pro
420 425 430
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATC GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC S28
Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala íle Tyr Lys Gin Ser Gin Hls
435 440 445
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Met Thr G1U Val val Arg Arg Cya Pro HiS H13 G1U Arg Cys Ser Asp
450 455 460
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin HiS Leu íle Arg Val Glu Gly Asn
465 470 475 480
TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG 672
Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg Hls Ser Val
485 490 495
GTG GTG ccc TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC 720
Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Sex Asp Cys Thr Thr Zle
500 505 510
CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG 768
Hls ryr Asn Tyr Met Cys Asn Sex Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg
515 520 525
AGG ; ccc : atc CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT 1 CTA 816
Arg Pre i íle Leu Thr íle íle Thr Leu G1U Asp Ser Ser Gly Asn . Leu
530 535 540
CTG GGA CCG AAC ACC HT GAG GCG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 864
Leu 545 Gly Arg Asn Sex Phe 550 Glu Val Arg Val Cys 555 Ala Cys Pro Gly Arg 560
GAC CGG CGC ÄCA GAG GAA gag AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC 912
Asp Arg Arg Thr Glu 565 Glu clu Asn Leu Arg 570 Lys Lys Gly Glu Pro 575 His
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC 960
His Gin Leu Pro 580 Pro Gly S«r Thr Lys Arg 585 Ala Leu Pro Asn 590 Asn Thr
AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAÍ AAG AAA CCA CTG GAT GGA GAA TAT TTC 1008
Ser Ser Ser 595 Pro Gin Pro Lyä Lys 500 Lys Pro Leu Asp Gly 605 Glu Tyr Phe
ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG ATG TTC CGA GAG CTG 1056
Thr Leu 610 Gin Tie Arg Gly Ara 615 Glu Arg Phe Glu Met 620 Phe Arg Glu Leu
AAT GAG GCC TTC GAA CTC AA'J GAT GCC CAG GCT GGG AAG GAG CCA GGG 1104
Asn 625 Glu Ala Leu Glu Leu 630 Ly* Asp Ala Gin Ala 635 Gly Lys Glu Pro Gly 640
GGG AGC AGG GCT CAC TCC CAC CTG AAG TCC AAA AAG GGT CAG TCT 1152
Gly Ser Arg Ala His 645 Ser His Leu Lys 650 Ser Lys Lys Gly Gin 655 Ser
ACC TCC CGC CAT AAA AAA CTC ATG TTC AAG ACA GAA GGG CCT GAC TCA 1200
Thr Ser Arg His 660 Lys Lys Met Phe 665 Lys Thr Glu Gly Pro 670 Asp Sex
GAC TGA TGA 1209
Asp 675
(2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 30:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 1149 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...1149 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO:30:
ATC GCC ACG GCC CCC CCG ACC1 GAT CTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48
Met Ale Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu KU
1 5 10 15
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCC CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96
Leu Asp Gly Glu Asp Val AU Mat AU His Ala Asp AU Leu Asp Asp
20 25 30
TTC GAT CTG GAC ATG TTC GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT U4
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe
35 40 45
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro His ASp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met AU Asp Phe
50 5S 40
GAG TTT GAG CAG ATC TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp AU Leu Gly íle Asp Glu Tyr Gly
45 70 75 80
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT cer ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala Pro Ala AU Pro Thr Pro Ala Ala Pro AU Pro Ala
85 90 95
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser v*i Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin
100 105 110
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTC CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Lou Gly Phe Leu H1S Ser Gly Thr Ala Lys
115 120 125
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro AU Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin
130 135 140
CTG GCC AAG ACC TGC CCT CTC CAG CTG TGC GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro
145 150 155 160
SK 286955 Β6
ccc Pro ese ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TÄC AAG QMJ TCÄ CAG CAC Xl· Tyr Xye Cla Ser Gla Xi· 528
Gly Bir Arg Val 185 Arg Ala Mst Ala
170 T75
ATG ACG GAG GIT CTG AGG CGC TBC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GäT 576
Met Thr Glu val val Arg Arg cys Pro H1S Hls Glu Arg Cys Ser Asp
180 185 190
MC GAT GCT CTG GCC ccr cer aw cat CTT ATC CGA CTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro 51a Bis Leu Zle Arg Val Glu Gly Asn
195 200 205
TTG CGT CTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT ACT GTG 672
Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg ASn Thr Phe Arg Hl* Ser V»1
210 215 220
GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TCT ACC ACC ATC 720
val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu val Gly Ser Asp Cys Thr Thr íle
225 230 235 240
CAC TAC AAC tac ATG TCT AAC ACT TCC TGC ATG GCC GGC ATG AAC CGG 768
Hl· Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Mat Gly Gly Met Asn Arg
245 250 255
AGG ccc ATC CTC ACC ATC MC ACA CTG GAA GAC ICC AGT GGT AAT CTA 816
fag Pro Zla Leu Thr Zle Zla Thr Leu Glu Asp Ser Sex Gly Aau Leu
160 265 270
CTG GGA CGG AAC ACC TTT GAG CTG CCT CTT TCT GCC TCT CCT GCG AGA 864
Leu Gly Ara Asn Ser She Glu Val Arg V*1 Cys Ala Cys Pro Gly Arg
275 280 285
GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC 912
Asp Ara Arg Tta Glu Glu Glu Asn Leu Acg Lys Lys Gly Glu Pro Hl*
290 295 300
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CSA GCA CTG CCC AAC AAC ACC 960
tUs Glu Letí Fro Pro Gly Ser Tbr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr
305 310 315 320
AGC TCC TCT CCC CAS CCA AAG AAG AAA CCA CTG CAT GGA GAA TAT TTC 1008
Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe
325 330 335
ACC CTT OS ATC CGT GGG CCT GAG CGC TTC GAG ATG TTC CGA GAG GAT 1056
Bw Leu Gin ne Arg Gly Arg Glu Arg pne Glu Met PtM ktg Glu Asp
340 34$ 350
CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG 1104
Leu Lys AL* Leu Lys Glu Lys Leu Lys Ala Leu Glu Glu Lys Leu Lys
355 380 385
GCC CTG GAG GAG AAC CTG AAG GCA CSA CTG GGG GAG CGA TGA TGA 1149
Al* Leu G1U Glu Lya Leu Lys Ala Leu Val Gly Glu Axg · *
370 375 380 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 31:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 1611 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) antí-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...1611 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO:31:
SK 286955 Β6
ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCA GGG GCA GAG CTT GTG GGG TCA 46
MET ALA GLN VAL GLN LEU GLN GLU SER GLY ALA GLU LEU VAL GLY 15 SER
1 5 10
GGG GCC TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA 96
GLY ALA SER VAL LYS LEU SER CYS THR ALA SER GLY PHE ASN ZLE LYS
20 25 30
GAC TAC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG GAG 144
ASP TYR TYR MET HIS TRP VAL LYS GLN ARG PRO GLU GLN GLY LEU GLU
35 40 45
TGG ATT GGA TGG ATT GAT CCT GAG AAT GGT GAT ACT GAA TAT GCC CCG 192
TRP ÍLE GLY TRP ILE ASP PRO GLU ASN GLY ASP THR GLU TYR ALA PRO
50 55 60
AAG TTC LYS PHE 65 CAG GLN GCC AAG GCC ACT ATG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AAT ACA 240
GLY LYS ALA 70 THR MET TKR ALA ASP THR SER SER ASN THR
75 80
GCC TAC CTG CAG CTC AGC AGC CTG GCA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT 288
ALA TYR LEU GLN LEU SER SER LEU ALA SER GLU ASP THR ALA VAL TYR
85 90 95
TAT TGT AAT TTT TAC GGG GAT GCT TTG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC 336
TYR CYS ASN PHE TYR GLY ASP ALA LEU ASP TYR TRP GLY GLN GLY THR
100 105 110
ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT 384
THR VAL THR VAL SER SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER
115 120 125
GGC GGT GGC GGA TCG GAT GTT TTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC ACT TTG 432
GLY GLY GLY GLY SER ASP VAL LEU MET THR GLN THR PRO LEU THR LEU
130 135 140
TCG GTT ACC ATT GGA CAA CCA GCC TCC ATC TCT TGC AAG TCA AGT CAG 480
SER VAL THR XLE GLY GLN PRO ALA SER ILE SER CYS LYS SER SER GLN
145 150 155 160
AGC CTC TTG GAT AGT GAT GGA AAC ACA TAT TTG AAT TGG TTG TTA CAG 528
SER LEU LEU ASP SER ASP GLY LYS THR TYR LEU ASN TRP LEU LEU GLN
165 170 175
AGG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CGC CTA ATC TAT CTG GTG TCT AAA CTG 576
ARG PRO GLY GLN SER PRO LYS ARG LEU ILE TYR LEU VAL SER LYS LEU
180 185 190
GAC TCT GGA GTC CCT GAC AGG TTC ACT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT 624
ASP SER GLY VAL PRO ASP ARG PHE THR GLY SER GLY SER GLY THR ASP
195 200 205
TTC ACA CTG AAA ATC AAC AGA GTG Gag GCT GAG GAT TTG GGA GTT TAT 672
PHE THR ΙΣΟ LYS ILE ASN ARG VAL GLU ALA GLU ASP LEU GLY VAL TYR
210 215 220
TAT TGC TGG CAA GGT ACA CAT TCT CCG CTC ACG TTC GCT GCT GGG ACC 720
TYR CYS TRP GLN GLY THR HIS SER PRO LEU THR PHE GLY ALA GLY THR
225 230 235 240
AAG CTG GAG CTG AAA CGG CCG GCC GCA TTG CAG ACG CCT CGA CCT GCA 768
LYS LEU OtĽO LEU LYS ARG ALA ALA ALA LEU GLU m ARG ARG PRO ALA
245 250 255
CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC 816
PRO ALA ALA PRO THR PRO ALA ALA PRO ALA PRO ALA PRO SER TRP PRO
260 265 270
CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT 864
LEU SER SER SER VAL PRO SSR GLN LYS THR TYR GLN GLY SER TYR GLY
275 280 285
ttc cct CTC LEU GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA CCC AAG TCT GTG ACT TGC 912
PHE ARG 290 GLY PRE LEU KIS 295 SER GLY THR ALA LYS 300 SER VAL THR CYS
ACG TAC TCC CCT GCC CIC AAC AAG ATS TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC 960
THR TYR SER PRO ALA LEU ASN LYS MET PHE CYS GLH LEU ALA LYS THR
305 310 315 320
TCC CCT CTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC 1008
CYS 980 VAL GLH LEU TRP VAL ASP SER THR PRO PRO PRO GLY THR ARG
325 330 335
CIC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT 1056
VAL ARG ALA MET ALA ILE TYR LYS GLH SER GLH HIS MET THR GLU VAL
340 345 350
CTG AGG CGC TGC CCC CAC CM GAC CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG 1104
VAL ARG ARG CYS PRO HIS KIS GLU ARG CYS SER ASP SER ASP GLY LEU
355 360 365
GCC CCT CCT CAG CAT CIT ATC CGA GTG GAA GGA AAT TTC CCT GTG GAG 1152
ALA PRO PRO GLH HIS LEU ILE ARG VAL GLU GLY ASH LEU ARG VAL GLU
370 375 380
ΤΛΤ TTG GAT GAC AGA AAC ACT MT CGA CAT ACT CTG GTG GTG CCC TAT 1200
rot LEU ASP ASP ARG ASH THR PHE ARG HIS SER VAL VAL VAL PRO TYR
335 390 395 400
GAG CCG CCT GAG GIT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC 1248
GLU PRO PRO GLU VAL GLY SER ASP CYS THR TKR ILE HIS TYR ASH TYR
405 410 415
ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC 1296
MET CYS ASH SER SER CYS MET GLY GLY MET ASH ARG ARG PRO ILE LEU
420 425 430
ACC ATC ATC ACA CIC GAA GAC TCC ACT GCT AAT CTA CTG GGA CGG AAC 1344
THR ILE UJE XSSt LEU CLU ASP SER SER GLY ASH LEU LEU GLY ARG ASN
435 440 445
AGC TM GAG GTG CCT GTT TCT GCC TCT (XT GGG AGA GAC CGG CGC ACA 1392
SER PHE GLU VAL ARG VAL CYS ALA CYS PRO GLY ARG A$P ARG ARG THR
450 455 460
GAG GAA GAG AAT CIC CGC AAG AAA GGC GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC 1440
GLU GLU GLU ASH LEU ARG LYS LYS GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO
465 470 475 480
CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC 1488
PRO &X SEK THR 1XS OSMA LEU PRO ASH ASH IHR SER SER SER PRO
485 490 495
CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAS GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG 1536
GLU PRO LYS LYS LTS PRO LEU ASP GLY ASP LEU LYS ALA LEU LYS GLU
SOO 50S 510
AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG 1584
LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU
515 520 525
AAG GCA OTA GTG GGG GAG CGA TCA TGA 1611
LYS ALA LEU VAL GLY GLU ARG t *
530 535
(2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 32:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 1065 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1,..1065 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 32:
SK 286955 Β6
ATG MET 1 GGA GAA TAT TTC ACC CTT GAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG 48
GLY GLU TYR PHE 5 THR LEU GLN ILE ARG 10 GLY ARG GLU ARG PHE GLU 15
ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT 96
MET PHE ARG GLU LEU ASN GLU ALA LEU GLU LEU LYS ASP ALA GLN ALA
20 25 30
GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT CAC TCC AGC CAC CTG AAG TCC 144
GLY LYS GLU PRO GLY GLY SER ARG ALA HIS SER SER HIS LEU LYS SER
35 40 45
AAA AAG GGT CAG TCT ACC TCC CGC CA? AAA AAA CTC ATG TTC AAG ACA 192
LYS LYS GLY GLN SER THR SER ARG HIS LYS LYS LEU MET PHE LYS THR
50 55 60
GAA GGG CCT GAC TCA GAC GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG 240
GLU GLY PRO ASP SER ASP GLY ARG PRO ALA PRO ALA ala PRO THR PRO
65 70 75 80
GCG GCC ALA ALA CCT GCA PRO ALA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT 288
PRO ALA 85 PRO SER TRP PRO 90 LEU SER SER SER VAL 95 PRO
TCC CAG AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC &SS CTC CGT CTG GGC CTC TTG 336
ser GLN LYS THR 100 TYR GLN GLY SER TYR 105 GLY PHE ARG LP» GLY 110 PHE LEU
CAT GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC tcc CCT GCC CTC 384
HIS SER GLY 115 THR ALA LYS SSR VAL 120 THR CYS THR TYR SER 125 PRO ALA LEU
AAC AAG ATG CTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG 432
ASN LYS 130 MET PHE CYS GLN LEU 135 ALA LYS THR CYS PRO 140 VAL GLN LEU TRP
GCT GAT TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC 480
VAL 14S ASP SER THR PRO PRO 150 PRO GLY THR ARG VAL 155 ARG ALA MET ALA ILE 160
TAC AAG CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GIT GTG AGG CGC TGC CCC CAC 528
TYR LYS GLN SER GLN 165 HIS MET THR GLU VAL 170 VAL ARG ARG CYS PRO 175 HIS
CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CCT 576
HIS GLU ARG CYS 180 SER ASP SER ASP GLY 185 LEU ALA PRO PRO GLN 190 HIS LEU
ATC CGA GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC 624
ILE ARG VAL 195 GLU GLY ASN LEU ARG 200 VAL GLU TYR W ASP 205 ASP ARG ASN
ACT TCT CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GIT GGC 672
THR PHE 210 ARG HIS SER VAL VAL 215 VAL PRO TYR GLU PRO 220 PRO GLU VAL GLY
TCT GAC TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC ACT TCC TGC 720
SER 225 ASP CYS THR THR ILE 230 HIS TYR ASN TYR MET 235 CYS ASN SER SER číre 240
ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA 768
MET GLY GLY MET ASN 245 ARG ARG PRO ILE LEU 250 THR ILE HE THR LEU 255 GLU
GAC TCC AGT GGT AAT CIA CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GCT 816
ASP SER SER GLY 260 ASN LEU LEU GLY ARG 265 ASN SER PHE GLU VAL 270 ARG VAL
TGT GCC TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC 864
CYS ALA CYS 275 PRO GLY ARG ASP ARG 280 ARG THR GLU GLU GLU 285 ASN LEU ARG
AAG AAA GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA . GGG AGC ACT AAG CGA 912
LYS LYS GLY GLU PRO HIS HIS GLU iSt PRO PRO i GLY SER THR . LYS : ARG
290 295 300
SK 286955 Β6
GCA CTG ccc AAC AAC ACC AGC TCC TCT
ALA LEU PRO ASN ASN THR SER SER SER
305 310
CTG GAT GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG
LEU ASP GLY ASP LEU LYS ALA LEU LYS
325
GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG
GLU LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS
340 345
CGA TGA TGA
ARG * *
355
CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA 960
PRO GLN PRO LYS LYS LYS PRO 320
315
GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG 1008
GLU 330 LYS LEU LYS ALA LEU 335 GLU
CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG 1056
LEU LYS ALA LEU VAL 350 GLY GLU
1065 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 33:
(i) charakteristika sekvencie:
(A)dížka: 963 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CD S (B) umiestnenie: 1...963 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 33 :
ATG GGA MET GLY 1 GAA TAT GLU TYR TTC ACC CIT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG 48
PHE THR 5 LEU GLN ILE ARG 10 GLY ARG GLU ARG PHE 15 GLU
ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT 96
MET PHE ARG GLU 20 LEU ASN GLU ALA LEU 25 GLU LEU LYS ASP ALA 30 GLN ALA
GGG AAG GAG CCA CGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC 144
GLY LYS GLU 35 PRO GLY ARG PRO ALA 40 PRO ALA ALA PRO THR 45 PRO ALA ALA
CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG 192
PRO ALA 50 PRO ALA PRO SER TRP 55 PRO LEU SER SER SER 60 VAL PRO SER GLN
AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT 240
LYS 65 THR TYR GLN GLY SER 70 TYR GLY PHE ARG LEU 75 GLY PHE LEU HIS SER 60
GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG 288
GLY THR ALA LYS SER 85 VAL THR CYS THR TYR 90 SER PRO ALA LEU ASN 95 LYS
ATG TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT 336
MET PHE CYS GLN too LEU ALA LYS THR CYS 105 PRO VAL GLN LEU TRP 110 VAL ASP
TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG 384
SER THR PRO 115 PRO PRO GLY THR ARG 120 VAL ARG ALA MET ALA 125 ILE TYR LYS
CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG 432
GLN SER 130 GLN HXS MET THR GLU 135 VAL VAL ARG ARG CYS 140 PRO KIS HIS GLU
CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG CCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA 430
ARG 145 CYS SER ASP SER ASP 150 GLY LEU ALA PRO PRO 155 GLN HIS LEU ILE ARG 160
GTG GAA GGA AKT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT 523
VAL GLU GLY ASN LEU 165 ARG VAL GLU TYR LEU 170 ASP ASP ARG ASN THR 175 PHE
CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC 576
ARG HIS SER VAL 180 VAL VAL PRO TYR GLU 185 PRO PRO GLU VAL GLY 190 SER ASP
TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC 624
CYS THR THR 195 ILE KX5 TYR ASN TYR 200 MET CYS ASN SER SER 20S CYS MET GLY
GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC 672
GLY MET ASN ARG ARG PRO ILE LEU THR XLE ILE THR LEU GLU ASP SER
210 21S 220
AGT GGT SER GLY 225 AAT ASN CTA LEU CTG GGA LEU GLY 230 CGG AAC AGC ΓΤΤ GAG GTG CGT GTT TGT GCC 720
ARG ASN SER PHE GLU 235 VAL ARG VAL CYS ALA 240
TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA 768
CYS PRO GLY ARG ASP 245 ARG ARG THR GLU GLU 250 GLU ASN LEU ARG LYS 255 LYS
GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG 816
GLY GLU PRO HIS 260 HIS GLU LEU PRO PRO 265 GLY SER THR LYS ARG 270 ALA LEU
ccc AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT 864
PRO ASN ASN 275 THR SER SER SER PRO 280 GLN PRO LYS LYS LYS 285 PRO LEU ASP
GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG 912
GLY ASP 290 LEU LYS ALA LEU LYS 295 GLU LYS LEU LYS ALA 300 LEU GLU GLU LYS
CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA 960
LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU LYS ALA LEU VAL GLY GLU ARG *
305 310 315 320
TGA * 963
(2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 34:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 1011 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...1011 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 34:
ATG GGA GAA TÄT MET GLY GLU TYR 1 TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG 46
PHE 5 THR LEU GLN ILE ARG io GLY ARG GLU ARG PHE 15 GLU
ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT 96
MET PHE ARG GLU LEU ASN GLU AXA LEU GLU LEU LYS ASP ALA GLN ALA
20 25 30
GGG AAG GAG CCA GGT CGA GGA GGT GGT GGC TCT GGA GGC GGA GGA TCC 144
GLY LYS GLU PRO GLY ARG GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER
35 40 45
GGC GGT GGA GGT TCT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC 192
GLY GLY GLY GLY SER ARG PRO ALA PRO ALA AIA PRO THR PRO ALA ALA
50 55 60
CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG 240
PRO ALA PRO ALA PRO SER TRP PRO LEU SER SER SER VAL PRO SER GLN
65 70 75 80
AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT 288
LYS THR TYR GLN GĽT SER TYR GLY PHE ARG LEU GLY PHE LEU KIS SER
85 90 95
GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG 336
GLY THR ALA LYS SER VAL THR CYS THR TYR SER PRO ALA LEU ASN LYS
100 105 no
ATG TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT 384
MET PHE CYS GLN LEU ALA LYS THR CYS PRO VAL GLN LEU TRP VAL ASP
115 120 125
TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG 432
SER THR PRO PRO PRO GLY THR ARG VAL ARG ALA MET ALA ILE TYR LYS
130 135 140
CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG 480
GLN SER GLN HIS MET THR GLU VAL VAL ARG ARG CYS PRO HIS HIS GLU
145 150 155 160
CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA 528
ARG CYS SEB ASP SER ASF GLY LEU ALA PRO PRO GLN HIS LEU ILE ARG
165 170 175
GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT 57«
VAL GLU GLY ASN ixu ARG VAL GLU TYR LEU ASP ASP ARG ASN THR PHE
180 185 190
SK 286955 Β6
CGA ARG CAP AGT GTG GTG GTG VAL CCC IM GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC 624
HIS SER 195 VAL VAL PRO TYR 200 GLU PRO PRO GLU VAL 205 GLY SER ASP
TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC 672
CYS THR 210 THR ILE HIS TYR ASN 215 TYR MET CYS ASN SER 220 SER CYS MET GLY
GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC 720
GLY 225 MET ASN ARG ARG PRO 230 ZLE LEU THR ZLE ZLE 235 THR LEU GLU ASP SER 240
AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC 768
SER GLY ASN LEU LEU 245 GLY ARG ASN SER PHE 250 GLU VAL ARG VAL CYS 255 ALA
TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA 816
CYS PRO GLY ARG 260 ASP ARG ARG THR GLU 265 GLU GLU ASN LEU ARG 270 LYS LYS
GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG 864
GLY GLU PRO 275 HIS HIS GLU LEU PRO 280 PRO GLY SER THR LYS 285 ARG ALA LEU
CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT 912
PRO ASN 290 ASN THR SER SER SER 295 PRO GLN PRO LYS LYS 300 LYS PRO LEU ASP
GGG GAT CTG AAG CCC CTC AAC CAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG 960
GLY 305 ASP LEU LYS ALA LEU 310 LYS GLU LYS LEU LYS 315 ALA LEU GLU GLU LYS 320
CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA 1008
LEU LYS ALA LEU GLU 325 GLU LYS LEU LYS AZA 330 LEU VAL GLY GLU ARG 335 *
TCA
1011 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 35:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 24 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...1095 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO:35:
CGGATCCTCT CGGAACATCT CGAA 24 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 36:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 749 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (Ľ) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...749 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 36:
GCCATGGCCC AGGTGCAGCT GCAGGAGTCA GGGGCAGAGC TTGTGGGGTC AGGGGCCTCA 60
GTCAAGTTGT CCTGCACAGC TTCTGGCTTC AACATTAAAG ACTACTATAT GCACTGGGTG 120
AAGCAGAGGC CTGAACAGGG CCTGGAGTGG ATTGGATGGA TTGATCCTGA GAATGGTGAT 180
ACTGAATATG CCCCGAAGTT CCAGGGCAAG GCCACTATGA CTGCAGACAC ATCCTCCAAT 240
ACAGCCTACC TGCAGCTCAG CAGCCTGGCA TCTGAGGACA CTGCCGTCTA TTATTGTAAT 300
TTTTACGGGG ATGCTTTGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCA CGGTCACCGT CTCCTCAGGT 360
GGAGGCGGTT CAGGCGGAGG TGGCTCTGGC GGTGGCGGAT CGGATGTTTT GATGACCCAA 420
ACTCCACTCA eTSTGTCGGT TACCATTGGA CAACCAGCCT CCA1CTCTTG CAAGTCAAGT 480
CAGAGCCTCT TGGASAGTGA TGGAAAGACA TATTTGAATT GGTIGTTACA GAGGCCAGGC 540
CAGTCTCCAA AGCGCCTAAT CTATCTGGTG TCTAAACTGG ACTCTGGAGT CCCTGACAGG 600
TTCACTGGCA GTGGATCAGG GACAGATTTC ACACTGAAAA TCAACAGAGT GGAGGCTGAG 660
GATTTGGGAG TTTATTATTG CTGGCAAGGT ACACATTCTC CGCTCACGTT CGGTGCTGGG 720
ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCGGCCGC 749
(2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 37:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 45 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 37:
AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTT 45 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 38:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 24 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 38:
GGGTCGACCT GGCTCCTTCC CAGG 24 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 39:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 749 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 39:
AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTTCAGAT CCGTGGGCGT 60
GAGCGCTTCG AGATGTTCCG AGAGCTGAAT GAGGCCTTGG AACTCAAGGA TGCCCAGGCT 120
GGGAAGGAGC CAGCTCGACC C 141 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 40:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 27 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna '(ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 40:
GGGTCGACCG TCTGAGTCAG GCCCTTC 27 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 41:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 749 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 41:
AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTTCAGAT CCGTGGGCGT 60
GAGCGCTTCG AGATGTTCCG AGAGCTGAAT GAGGCCTTGG AACTCAAGGA TGCCCAGGCT 120
GGGAAGGAGC CAGGGGGGAG CAGGGCTCAC TCCÄGCCACC TGAAGTCCAA AAAGGGTCAG 180
TCTACCTCCC GCCATAAAAA ACTCATGTTC AAGACAGAAG GGCCTGACTC AGACGGTCGA 240
CCC 243
(2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 42:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 48 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 42 :
TCGAGGAGGT GGTGGCTCTG GAGGCGGAGG
ATCCGGCGGT GGAGGTTC 48 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 43:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 48 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQID NO:43:
TCGAGAACCC CTACCGCCGG ATCCTCCGCC
TCCAGAGCCA CCACCTCC 4S (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 44:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 16 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetický: nie (v) typ fragmentu: interný (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 44:
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
10
Gly Ser (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 45:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 26 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 45:
GATCCGAACA TGTCCCAACA TGTTGA 26 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID NO: 46:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 26 bázových párov (B) typ: nukleotid (C} počet vlákien: j edno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iv) anti-sense: nie (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 46:
AGCTTCAACA TGTTGGGACA TGGTCG 26

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Variant proteínu p53 majúci antiproliferatívnu alebo apoptickú aktivitu, v ktorom časť oligomerizačnej domény a taktiež regulátorovej domény sú deletované a nahradené umelou doménou leucinového zipsu, pri5 čom delécia C-koncovej časti sa uskutoční vo zvyšku 326 alebo 337 a celá transaktivačná doména alebo jej časť je deletovaná a nahradená heterológnou transaktivačnou doménou VPI6 a za predpokladu, že C-koncová časť je deletovaná vo zvyšku 326, umelá doména leucinového zipsu má sekvenciu: Asp-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Glu-Lys-Leu-Lys-Ala-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Lys-Ala-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Lys-Ale-Leu-Val-Gly-Glu-Arg.
    10
  2. 2. Variant podľa nároku 1, kde umelá doména leucinového zipsu je doména zaisťujúca selektívnu oligomerizáciu, ktorá sa nevyskytuje v prírodnom stave.
  3. 3. Variant podľa nároku 2, kde doména leucinového zipsu má sekvenciu: Asp-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Glu-Lys-Leu-Lys-Ala-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Lys-Ala-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Lys-Ála-Leu-Val-Gly-Glu-Arg.
  4. 4. Variant podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde arginínový zvyšok v polohe 182 proteínu p53 je 15 nahradený histidínom.
  5. 5. Variant podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, ktorý obsahuje deléciu zvyškov 1 až 74.
  6. 6. Variant podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde transaktivačná doména obsahuje sekvenciu kódovanú sekvenciou SEQ ID NO: 2.
  7. 7. Zlúčenina V-325 sekvencie SEQ ID NO: 25 a jej variant V-325H obsahujúce histidín v polohe 182 20 proteínu p5 3.
  8. 8. Zlúčenina V-336 sekvencie SEQ ID NO: 26 a jej variant V-336H obsahujúce histidín v polohe 182 proteínu p5 3.
  9. 9. Nukleová kyselina kódujúca variant proteínu p53 podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.
  10. 10. Nukleová kyselina podľa nároku 9, ktorou je cDNA, RNA, syntetická alebo semisyntetická kyselina.
    25
  11. 11. Nukleová kyselina podľa nároku 9, ktorá kóduje aminokyselinu majúcu sekvenciu SEQ ID no: 25 alebo 26.
  12. 12. Expresná kazeta obsahujúca nukleovú kyselinu podľa nároku 9,10 alebo 11, promótor umožňujúci jej expresiu a signál na termináciu transkripcie.
  13. 13. Vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa nárokov 9,10 alebo 11 alebo kazetu podľa nároku 12.
    30
  14. 14. Vektor podľa nároku 13, ktorýje vírusový vektor.
  15. 15. Vektor podľa nároku 14, ktorý j e defektný rekombinantný adenovírus.
  16. 16. Vektor podľa nároku 14, ktorý je defektný rekombinantný retrovírus.
  17. 17. Vektor podľa nároku 14, ktorý je defektný rekombinantný AAV.
  18. 18. Vektor podľa nároku 14, ktorýje defektný rekombinantný HSV.
    35
  19. 19. Vektor podľa nároku 13, ktorý j e chemický alebo biochemický vektor.
  20. 20. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 9, 10 alebo 11, expresnú kazetu podľa nároku 12 alebo vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 19 a farmaceutický prijateľné vehikulum.
  21. 21. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje variant proteínu p53 pod40 ľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 a farmaceutický prijateľné vehikulum.
  22. 22. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 20 alebo 21,vyznačujúca sa tým, že je určená na použitie pri liečení hyperproliferatívnej poruchy.
  23. 23. Použitie nukleovej kyseliny podľa nároku 9, 10 alebo 11, expresnej kazety podľa nároku 12 alebo vektora podľa nároku 13 na prípravu liečiva na liečenie hyperproliferatívnej poruchy.
    45 24. Použitie variantu proteínu p53 podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 na prípravu liečiva na liečenie hyperproliferatívnej poruchy.
SK63-98A 1995-07-19 1996-07-17 Varianty proteínu p53 a ich terapeutické použitie SK286955B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9508729A FR2736915B1 (fr) 1995-07-19 1995-07-19 Variants de la proteine p53 et utilisations therapeutiques
PCT/FR1996/001111 WO1997004092A1 (fr) 1995-07-19 1996-07-17 Variants de la proteine p53 et utilisations therapeutiques

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK6398A3 SK6398A3 (en) 1998-09-09
SK286955B6 true SK286955B6 (sk) 2009-08-06

Family

ID=9481133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK63-98A SK286955B6 (sk) 1995-07-19 1996-07-17 Varianty proteínu p53 a ich terapeutické použitie

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6326464B1 (sk)
EP (1) EP0839194B1 (sk)
JP (1) JPH11510378A (sk)
KR (1) KR100501881B1 (sk)
AT (1) ATE324442T1 (sk)
AU (1) AU725841B2 (sk)
BR (1) BR9611087A (sk)
CA (1) CA2224468C (sk)
CZ (1) CZ296185B6 (sk)
DE (1) DE69636072T2 (sk)
DK (1) DK0839194T3 (sk)
ES (1) ES2263161T3 (sk)
FR (1) FR2736915B1 (sk)
HU (1) HU225937B1 (sk)
IL (1) IL122991A (sk)
MX (1) MX9800555A (sk)
NO (1) NO322477B1 (sk)
PT (1) PT839194E (sk)
SK (1) SK286955B6 (sk)
TW (1) TW444022B (sk)
WO (1) WO1997004092A1 (sk)
ZA (1) ZA966127B (sk)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1208438A (zh) 1995-07-28 1999-02-17 玛丽·柯里癌症治疗中心 转运蛋白及其应用
US6881571B1 (en) 1998-03-11 2005-04-19 Exonhit Therapeutics S.A. Qualitative differential screening
FR2775984B1 (fr) * 1998-03-11 2006-09-15 Bioscreen Therapeutics Sa Criblage differentiel qualitatif
FR2755144B1 (fr) * 1996-10-29 1998-11-27 Rhone Poulenc Rorer Sa Fragments d'anticorps a chaine unique anti-p53 et utilisation
US6017735A (en) * 1997-01-23 2000-01-25 Marie Curie Cancer Care Materials and methods for intracellular transport and their uses
US5943914A (en) * 1997-03-27 1999-08-31 Sandia Corporation Master-slave micromanipulator apparatus
EP0979290A2 (en) 1997-04-28 2000-02-16 Aventis Pharma S.A. Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors
IL121041A0 (en) 1997-06-09 1997-11-20 Yeda Res & Dev Immunogenic compositions for induction of anti-tumor immunity
DE19751587A1 (de) 1997-11-21 1999-07-29 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Onkogen- oder virusgesteuerte Expressionssysteme
EP1150688A4 (en) * 1998-10-19 2004-06-16 Yeda Res & Dev TREATING SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATODES BY REGULATING THE AUTOIMMUNE RESPONSE TO AUTOANTIGENS
US6831155B2 (en) * 1999-12-08 2004-12-14 President And Fellows Of Harvard College Inhibition of p53 degradation
US7196242B2 (en) * 2000-05-16 2007-03-27 The Regents Of The University Of California Methods for identifying novel therapeutics and diagnostics in the p53 pathway
US7534861B2 (en) * 2003-01-10 2009-05-19 Ambergen, Inc. Compositions and methods for immunoaffinity purification
US7772367B2 (en) * 2004-01-30 2010-08-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York C-terminal p53 palindromic peptide that induces apoptosis of cells with aberrant p53 and uses thereof
US20060246143A1 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Hilmi Ege Targeted therapy via targeted delivery of energy susceptible nanoscale magnetic particles
KR100749858B1 (ko) * 2005-08-12 2007-08-16 연세대학교 산학협력단 ｐ53 변이체 및 그의 용도
US9186317B2 (en) * 2007-11-26 2015-11-17 Stc.Unm Active nanoparticles and method of using
EP2224961A1 (en) * 2007-11-26 2010-09-08 The Research Foundation of the State University of New York Small molecule cancer treatments that cause necrosis in cancer cells but do not affect normal cells
KR102092345B1 (ko) 2013-09-30 2020-03-24 삼성전자주식회사 류신 지퍼 변이체 및 이의 용도

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5559223A (en) * 1991-08-09 1996-09-24 E. I. Dupont De Nemours And Company Synthetic storage proteins with defined structure containing programmable levels of essential amino acids for improvement of the nutritional value of plants
GB9224784D0 (en) * 1992-11-26 1993-01-13 Univ Dundee Cellular protein
FR2710846B1 (fr) * 1993-10-04 1995-12-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions pharmaceutiques et leur utilisation, notamment dans le traitement des maladies neurogénératives.
US5700657A (en) * 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby
AU1440695A (en) * 1993-12-21 1995-07-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research P53-based polypeptide fragments, nucleic acid molecules encoding same, and uses thereof
US5573925A (en) * 1994-11-28 1996-11-12 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology P53 proteins with altered tetramerization domains
WO1996016989A1 (en) 1994-11-28 1996-06-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology p53 PROTEINS WITH ALTERED TETRAMERIZATION DOMAINS

Also Published As

Publication number Publication date
US6933373B2 (en) 2005-08-23
HU225937B1 (en) 2008-01-28
PT839194E (pt) 2006-08-31
ES2263161T3 (es) 2006-12-01
EP0839194B1 (fr) 2006-04-26
TW444022B (en) 2001-07-01
IL122991A (en) 2007-07-24
CZ296185B6 (cs) 2006-01-11
ATE324442T1 (de) 2006-05-15
NO980203L (no) 1998-03-10
SK6398A3 (en) 1998-09-09
NO322477B1 (no) 2006-10-09
CA2224468C (fr) 2012-01-03
DE69636072T2 (de) 2006-11-30
WO1997004092A1 (fr) 1997-02-06
KR100501881B1 (ko) 2005-11-14
DK0839194T3 (da) 2006-08-28
FR2736915B1 (fr) 1997-08-22
HUP9901343A2 (hu) 1999-08-30
HUP9901343A3 (en) 2000-10-30
FR2736915A1 (fr) 1997-01-24
US6326464B1 (en) 2001-12-04
MX9800555A (es) 1998-04-30
BR9611087A (pt) 1999-07-13
JPH11510378A (ja) 1999-09-14
AU725841B2 (en) 2000-10-19
CA2224468A1 (fr) 1997-02-06
IL122991A0 (en) 1998-08-16
US20020193561A1 (en) 2002-12-19
AU6618696A (en) 1997-02-18
KR19990029088A (ko) 1999-04-15
ZA966127B (en) 1997-02-10
CZ14498A3 (cs) 1998-04-15
EP0839194A1 (fr) 1998-05-06
DE69636072D1 (de) 2006-06-01
NO980203D0 (no) 1998-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK286955B6 (sk) Varianty proteínu p53 a ich terapeutické použitie
SK28098A3 (en) Antagonists of the oncogenic activity of the protein mdm2, and use thereof in the treatment of cancers
EP0938553B1 (en) Dna encoding dp-75 and a process for its use
WO1996014877A1 (en) Novel tumor suppressor gene, hic-1
SK131197A3 (en) Conditional expression system
SK55899A3 (en) Method for restoring p53-dependent trans-activating activity in cells, anti-p53 single-chain antibody fragments and dna encoding them, their use and means containing them
US6544948B1 (en) ΔP62, variants thereof, amino acid sequences coding therefor and their uses in gene therapy for cancer
BG63548B1 (bg) Полипептиди, съдържащи протеинови домени на gax, включени в транскрипцията и/или взаимнодействащи сдруги протеини, съответни нуклеинови киселини и тяхното използване
MXPA97008877A (en) P62, its variants, the nucleic acid sequences that code them, and its use in anti-cancer gene therapy
NZ501892A (en) Use of a reagent that modulates HIC-1 expression for treating cell proliferation
MXPA99003470A (en) Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20130717