JPH11510378A

JPH11510378A - 蛋白質ｐ５３の変異体及び治療への使用

Info

Publication number: JPH11510378A
Application number: JP9506356A
Authority: JP
Inventors: コンセイエ，エマニユエル; ブラツコ，ローラン
Original assignee: ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 1999-09-14
Also published as: DE69636072D1; IL122991A; NO322477B1; HUP9901343A3; SK6398A3; MX9800555A; ATE324442T1; EP0839194B1; CZ296185B6; ES2263161T3; AU725841B2; HU225937B1; IL122991A0; ZA966127B; WO1997004092A1; SK286955B6; PT839194E; FR2736915B1; AU6618696A; CA2224468C

Abstract

(57)【要約】この発明は、治療用として用いるための機能が向上された、腫瘍抑制遺伝子産物ｐ５３から誘導された蛋白質に関する。この発明は有利には、向上した腫瘍抑制機能及びプログラムされた細胞死を誘発する機能を備えた蛋白質、特に野生型ｐ５３蛋白質が不活性化されている増殖性の病理学的症状において向上した機能をもつ蛋白質に関する。この発明はまた、これらの分子をコードする核酸、これらを含むベクター、及び特に遺伝子治療におけるこれらの治療のための使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白質Ｐ５３の変異体及び治療への使用本発明は、腫瘍抑制遺伝子産物ｐ５３から誘導された蛋白質であって、治療への使用のために改良された機能を有する蛋白質に関する。本発明は、有利には腫瘍抑制機能を有し、かつ野生型の蛋白質ｐ５３よりもプログラムされた細胞死の誘発機能が優れている蛋白質、より詳しくは、野生型の蛋白質ｐ５３が不活性化される増殖病理学的状態において、より優れた機能を有する蛋白質に関する。本発明はまた、これらの分子をコードする核酸、これらを含むベクター、及び特に遺伝子治療における治療へのこれらの使用に関する。本発明の物質は、例えば特にがんのような病理学的状態における、ｐ５３の機能の回復に適している。野生型蛋白質ｐ５３は、細胞周期の調節、及び細胞のゲノムの完全性の維持に関わっている。この蛋白質の主要な機能はいくつかの遺伝子の転写活性剤としての機能であるが、この蛋白質は、いまだに十分には解明されていないプロセスによって、ゲノムの複製中に突然変異が現われた時に細胞周期のＧ１期の細胞を阻害し、またＤＮＡのいくつかの修復過程を開始させることができる。さらにはこれらの修復過程がうまく機能しない場合、あるいは突然変異事象の出現が多すぎて修正できない場合、この蛋白質は、プログラムされた細胞死現象（アポトーシスと呼ばれる）を誘発することができる。このようにして蛋白質ｐ５３は、異常分化した細胞、又はゲノムが破損した細胞を除去することにより、腫瘍抑制剤として作用する。ｐ５３のこの主要な機能は、その転写因子機能によるものである。換言すれば、ゲノムＤＮＡレベルの特定配列を認識する能力、及び通常の転写機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅ）を回復させる（ｒｅｃｒｕｔｅｒ）能力という二重の能力によるものである。蛋白質ｐ５３は、３９３アミノ酸を含んでいる。これらのアミノ酸は、５つの機能領域を画定する（図１参照）： − 例えばアミノ酸１〜７３から成る転写活性化領域。これは、蛋白質ＴＢＰのような一般的な転写機構のいくつかの因子を結合することができる。この領域はまた、いくつかの翻訳後修飾の位置でもある。これはまた、蛋白質ｐ５３と、その他の多数の蛋白質、特に細胞蛋白質ｍｄｍ２又はＥｐｓｔｅｉｎ− Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）の蛋白質ＥＢＮＡ５との数多くの相互作用の位置でもある。これらは、野生型蛋白質の機能を阻害することができる。さらにこの領域は、蛋白質分解を受け易いＰＥＳＴと呼ばれるアミノ酸配列を有している。 − アミノ酸７３とアミノ酸３１５との間に配置されたＤＮＡへの結合領域。ｐ５３のこの中央領域のコンフォメーションが、蛋白質ｐ５３に特異的なＤＮＡ配列の認識を調節する。この領域は、野生型蛋白質の機能に影響を与える次の２種類の変化の位置である：（ｉ）ウイルスＳＶ４０の「大Ｔ」抗原のようなｐ５３の機能を阻害する蛋白質、又はユビキチン系によってその分解を引起こすことができるウイルスＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のウイルス蛋白質Ｅ６との相互作用。この後者の相互作用は、細胞蛋白質Ｅ６ａｐ（ユビキチン化カスケード酵素Ｅ３）の存在下においてしか生じない。（ｉｉ）ｐ５３の機能に影響を与える点突然変異であり、これのほとんど全部がこの区域に限定される。 − アミノ酸３１５〜３２５から成る、核局在シグナルであって、蛋白質がその主要な機能を行使する区画における、蛋白質の正しい指向に不可欠なシグナル。 − アミノ酸３２５〜３５５から成るオリゴマー化領域。この区域３２５〜３５５は、次の型の構造：βシート（３２６−３３４）−エルボー（３３５−３３６）−αらせん（３３７−３５５）を形成する。この区域に局在する機能の変化は、本質的に、野生型蛋白質と種々の突然変異型との相互作用によるものである。これらの突然変異型は、野生型蛋白質の機能に対して種々の作用を生じさせることがある。 − アミノ酸３６５〜３９３から成る調節領域。この領域は、いくつかの翻訳後修飾（グリコシル化、燐酸化、ＲＮＡ結合、等）の位置であり、これらの修飾は、蛋白質ｐ５３の機能をプラスに、あるいはマイナスに調節する。この領域は、野生型蛋白質の活性の調節において非常に重要な役割を果たしている。蛋白質ｐ５３の機能は、様々な方法で妨害されることがある。 − いくつかの因子によるその機能の阻害。因子は例えば、ウイルスＳＶ４０の「大Ｔ」抗原、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスの蛋白質ＥＢＮＡ５、又は細胞蛋白質ｍｄｍ２である。 − 蛋白質分解に対する感受性を増すことによる、特にヒト乳頭腫ウイルスＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の蛋白質Ｅ６との相互作用による、蛋白質の不安定化。このことにより、ユビキチニン化サイクル中にｐ５３が入るのが促進される。この場合、これら２つの蛋白質間の相互作用は、細胞蛋白質、すなわち結合位置がよく知られていない蛋白質Ｅ６ａｐを予め結合させることによってしか行なわれない。 − ｐ５３の遺伝子のレベルにおける点突然変異。 − １つ又は２つのｐ５３対立遺伝子の欠失。最後の２つの型の改変は、様々な型のがんの約５０％に見出される。この点に関して、がん細胞に記録されるｐ５３遺伝子の突然変異は、この蛋白質をコードする遺伝子の非常に大きな部分に影響し、その結果この蛋白質の機能の様々な改変が生じる。しかしながらこれらの突然変異は、大部分、蛋白質ｐ５３の中央部分に局在する。この中央部分は、蛋白質ｐ５３に特異的なゲノム配列と接触する区域であることが知られている。このことから、なぜ蛋白質ｐ５３の突然変異体の大部分は、野生型蛋白質によって認識されるＤＮＡ配列にもはや結合されず、従ってその転写因子としての役割をもはや果たすことができないという主要な特徴を有するのか、その理由が明らかにされる。そのほかに、いくつかの突然変異体は、転写レベルにおいて、例えばいくつかの遺伝子の活性化のような新規機能を獲得するようである。現在、これらの改変全体は次の３つのカテゴリーに再分類されている： − いわゆる弱突然変異体。これの物質は、非機能的蛋白質であり、これは、２つの対立遺伝子のうちの１つだけの突然変異の場合に、もう１つの対立遺伝子によってコードされた野生型蛋白質の機能に影響を与えない。このカテゴリーの主な代表には、突然変異体Ｈ２７３及びＷ２４８がある。この後者の突然変異体は、がんの症状に対して過敏なＬｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ家族性症候群に特有なものである。 − 負の優性突然変異体。この物質は、非機能性蛋白質であり、これは、２つの対立遺伝子のうちの１つだけの突然変異の場合、野生型蛋白質との相互作用によって、不活性混合オリゴマーの形成により野生型蛋白質の機能を阻害することができる。これらのオリゴマーは、野生型蛋白質に特異的なＤＮＡ配列に結合することはもはやありえない。このカテゴリーの主な代表には突然変異体Ｇ２８１がある。 − がん形成性優性突然変異体。この物質は、一方で前のカテゴリーの突然変異体のように、野生型蛋白質の機能を阻害することができ、他方で、よく知られていないメカニズムによって腫瘍の進行を促進することができる蛋白質である。従って機能の増加を示す。このカテゴリーの主な代表には突然変異体Ｈ１７５がある。野生型遺伝子ｐ５３は、その抗腫瘍形成性及びアポトーシス性（ａｐｏｐｔｏｔｉｑｕｅ）及び過増殖型の多くの病理学に関わっていることから、遺伝子・細胞療法の方法に用いられてきた。特に、ｐ５３の機能の回復による野生型ｐ５３遺伝子の生体内投与によって、いくつかの過増殖性の病理学、特にがんを治療することが提案された。投与は、ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクター（ＷＯ９４／２４２９７号）又はレトロウイルスベクター（ＷＯ９４／０６９１０号）によって有利に実施することができる。従って野生型蛋白質ｐ５３をコードする核酸の導入によって、細胞成長の正常な調節を一部回復することができることが証明された。しかしながらこれらの結果は希望がもてるものではあるが、これらの方法の有効性は、生体内での過増殖細胞内への移入及び発現後の蛋白質ｐ５３の治療効率によって制限されている。実際、例えばがんのような過増殖性病理状態は、細胞成長の負及び正の制御網に確立される平衡の乱れによって生じる。２つの対立遺伝子のうちの１つから、負の優性ｐ５３突然変異体の出現により、野生型蛋白質ｐ５３によって行使される負の制御の不活性化、例えばｍｄｍ２のようなｐ５３を不活性化させる細胞パートナーの過剰発現、さらには感染後のウイルス性不活性化物質の存在は、野生型蛋白質ｐ５３の再導入に基づいた治療に対して不利な状況を作る。この蛋白質も同様に不活性化される危険が高い。従って治療特性が向上したｐ５３型蛋白質を入手しうることが特に重要である。がん形成性の負の優性突然変異体、又は腫瘍細胞中に見られる、例えばＨＰＶ１８及びＨＰＶ１６のＥ６、ＭＤＭ２、ＥＢＶのＥＢＮＡ５等のようなその他の細胞蛋白質又はウイルス蛋白質の不活性化作用に対して敏感でなく、かつ構成的に活性なｐ５３分子を入手することが特に有利であろう。蛋白質ｐ５３のいくつかの改変については、先行技術に記載されている。従って特許出願ＷＯ９５／０６６６１号は、蛋白質ｐ５３の相同領域、すなわち３４３−３５１、３７２−３８０、及び３８１−３９３領域のいくつかの残基についての改変について記載している。しかしながらこれらの改変は非常にマイナーであり、生じた物質が生体内の蛋白質ｐ５３の不活性化メカニズムから免れることはできない。さらにこれらの蛋白質は、野生型蛋白質ｐ５３と比べて改良された活性を示すようには見えない。フップ（Ｈｕｐｐ）ら（“Ｃｅｌｌ”、第７１巻、（１９９２年）、８７５頁）は、３０個のＣ−末端残基の欠失を含むｐ５３誘導体（ｐ５３△−ｔｅｒ３０）について記載している。しかしながらこの蛋白質が、ＤＮＡに結合する能力を保存しているとしても、これのアポトーシス性は証明されていない。さらに、これは負の優性突然変異体による不活性化に対して耐性がない。ピーテンポル（Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ）ら（“ＰＮＡＳ”、第９１巻、（１９９４年）、１９９８頁）は、蛋白質ｐ５３、特に蛋白質ＶＰ１６−ｐ５３（８０− ３４３）−ＧＣＮ４から誘導されたキメラ分子について記載している。しかしながらこの分子は、野生型蛋白質ｐ５３と比べて、ＤＮＡに結合する能力も、トランス活性化能力も実質的に減少している（４０％）。さらにはこの分子は、非選択性オリゴマー化領域を有しており、その他の細胞成分と相互作用する危険があり、従って非特異的細胞応答を誘発する危険がある。さらに、不活性化メカニズムに対するその抵抗特性は示されていない。本発明は、改良された治療特性を有する蛋白質ｐ５３の新規変異体について記載する。本発明は、特に抗がん遺伝子治療への使用に適した変異体について特に記載する。本発明の変異体は、構造改変によって蛋白質ｐ５３から誘導されたものであり、ｐ５３型の活性を保持しており、過増殖細胞中に発現すると、蛋白質ｐ５３と比較して少なくとも向上した特性を有する。特に抗増殖活性及び／又はアポトーシス活性に関わっている。本発明の変異体は有利には、抗増殖活性及び／又はアポトーシス活性が増加している。あるいは過増殖細胞に対してより特異的な抗増殖活性及び／又はアポトーシス活性を有し、この活性は野生型ｐ５３が受ける種々の変化に対してあまり感受的でない。本発明の第一の目的は、より詳しくは、オリゴマー化領域の全部又は一部が欠失し、かつこの領域が人工ロイシンジッパー領域と代えられているような蛋白質ｐ５３の変異体に関する。前記のように、蛋白質ｐ５３はいくつかの突然変異体、特に、腫瘍細胞中に見られるがん形成性の負の優性突然変異体によって不活性化される。この不活性化は、野生型蛋白質ｐ５３と突然変異体との不活性混合オリゴマーの形成の結果である。これらはもはや、野生型蛋白質ｐ５３によって認識される特定配列に結合することは不可能である。本発明は、ここにおいて、いくつかの突然変異体の負の優性作用に抵抗する蛋白質ｐ５３の変異体、すなわち突然変異された１つ又は２つの対立遺伝子を有する細胞状況において活性な変異体について記載する。これは、ｐ５３依存性ヒトがんの９０％近くのケースに当てはまる。本発明による変異体において、蛋白質の自然のオリゴマー化領域の全部又は一部は、野生型と突然変異型との間で区別を行なわず、従ってこの領域は特定のオリゴマー化能力を有する同等の領域によって置き換えられる。この改変は、最適化された人工ロイシンジッパーを用いて実施され、ダイマーを形成する。このような人工ロイシンジッパーを含む本発明の分子は、特に有利である。その理由は、同じロイシンジッパーを有するその他の分子とのみ、オリゴマーを形成するからである。これらの分子は従って、これらを不活性化し得る蛋白質ｐ５３の負の又はがん形成性の優性突然変異体とはオリゴマーを形成しない。これらの分子はまた、これらを不活性化し得るか又は望ましくない作用を誘発し得るオリゴマー化領域を有するその他の細胞蛋白質ともオリゴマーを形成しない。本発明の分子は、ホモオリゴマーしか形成することはできず、従って選択性が大きく、過増殖性病理学的状況において、より良好な活性を保証する。従って本発明によれば、人工ロイシンジッパー領域は、有利には自然の状態では存在しない領域であり、オリゴマー化の選択性を保証する。特に好ましくは、オリゴマー化領域は、配列番号１として表わされる。本発明の好ましい実施態様において、変異体は、オリゴマー化領域の全部又は一部、及び調節領域の全部又は一部の欠失を含んでいる。前記のようにオリゴマー化領域は、残基３２５−３５５の間に位置し、調節領域は残基３６５−３９３（これら末端残基も含む）の間に位置している。この型の変異体は非常に有利である。その理由は、この型の変異体にはＣ−末端部分（ａａ３６５−３９３）を介して行使される負の調節作用の全部又は一部がないからである。これらの変異体は、潜在的にかつ構成的に活性な蛋白質を構成する。これは、調節できない、場合によっては増加した活性を有する。調節領域は有利には全部が除去される。本発明による好ましい変異体は、残基３２６又は３３７からの、蛋白質ｐ５３のＣ−末端部分の欠失を含んでいる。これらの変異体の構築に用いられる中間体の例には、特に次のものがある：・ｐＥＣ１０７（７５−３２５−ｌｚ）であり、これは、配列番号１の人工オリゴマー化領域によって置換された、残基３２６からの蛋白質ｐ５３のＣ−末端部分の欠失を含んでいる；・ｐＥＣ１１０（７５−３３６−ｌｚ）であり、これは、配列番号１の人工オリゴマー化領域によって置換された、残基３３７からの蛋白質ｐ５３のＣ−末端部分の欠失を含んでいる。本発明の変異体において有利な実施態様によれば、蛋白質ｐ５３の１８２位のシステイン残基はヒスチジンに置換されている。この突然変異によって、有利には特異的結合ヌクレオチド配列に対する変異体の親和性を増すことができる。従ってこの追加の改変の導入により、トランス活性化（Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅｕｒ）能力がさらに増した分子を得ることができる。これらの種々の改変を組合わせた、本発明の変異体の調製のための中間構築物の適切な例には、特に次のものがある：・ｐＥＣ１３９（７５−３２５（Ｈ１８２）−Ｉｚ）であり、これは、配列番号１の人工オリゴマー化領域によって置換された、残基３２６からの蛋白質ｐ５３のＣ−末端部分の欠失、及び１８２位のヒスチジンを含んでいる；・ｐＥＣ１４０（７５−３３６（Ｈ１８２）−ｌｚ）であり、これは、配列番号１の人工オリゴマー化領域によって置換された、残基３３７からの蛋白質ｐ５３のＣ−末端部分の欠失、及び１８２位のヒスチジンを含んでいる。有利には、本発明による変異体において、トランス活性化領域の全部又は一部も欠失し、この領域は異種トランス活性化領域に代えられている。前記において、ｐ５３のトランス活性化機能は、腫瘍のサプレッサーの活性又はアポトーシス誘導物質の活性にも不可欠であることが指摘された。本発明による変異体の治療ポテンシャルを増すためには、自然のトランス活性化領域を、強力な異種トランス活性化領域と置換するのが特に有利である。従ってこれらの変異体は、数多くの利点を有する。これらの変異体は、当然ながら高いトランス活性化活性を有する。しかしながらこれらはまた、Ｎ−末端部分（ａａ１−７３）を介して行使された負の調節作用に対して感受性のないものにされる。実際、この領域は、その蛋白質分解に関係する配列ＰＥＳＴを含んでいる。この領域を、配列ＰＥＳＴを含まない異種トランス活性化領域と置換することによって、この負の調節を減少させることができる。これらの変異体はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の蛋白質Ｅ６とのあらゆる相互作用の減少、さらにはサプレッションを特徴としている。このウイルスは、これらの分解を誘発しやすい。これらの変異体はまた、その他の細胞蛋白質、例えば野生型蛋白質ｐ５３の活性に影響を与えるＭＤＭ２及びＥＢＮＡとの相互作用にも感受性がより低い。従ってこのようにして得られた変異体は、安定性が増している。負の調節に対して感受性がある領域（調節領域及びトランス活性化領域）の除去により、特に有利には、これらの蛋白質分解又はこれらの不活性化を誘発する蛋白質の標的ではもはやない分子を生じる。有利には本発明の変異体において、トランス活性化領域は、残基１〜７４の欠失によって除去される。このような分子を作るために用いられる中間体は、特に、ｐＥＣ１０７（７５−３２５―ｌｚ）、ｐＥＣ１１０（７５−３３６―ｌｚ）、ｐＥＣ１３９（７５−３２５（Ｈ１８２）―ｌｚ）、及びｐＥＣ１４０（７５ −３３６（Ｈ１８２）―ｌｚ）である。第一の実施態様によれば、異種トランス活性化領域は、ＶＰ１６のトランス活性化領域である。これは有利にはＶＰ１６の残基４１１〜４９０から成る。この配列は、配列番号２に示されている。これらの種々の改変を組合わせた、本発明の適切な例には特に次のものがある：・ｐＥＣ１１４（ＶＰ１６−７５−３２５−ｌｚ）であり、これは、配列番号２のＶＰ１６のトランス活性化領域によって置換された、残基１−７４を含む蛋白質ｐ５３のＮ−末端部分の欠失、及び配列番号１の人工オリゴマー化領域によって置換された、残基３２６からの蛋白質ｐ５３のＣ−末端部分の欠失を含んでいる。変異体ｐＥＣ１１４の完全配列は、配列番号２５に示される。・ｐＥＣ１１６（ＶＰ１６−７５−３３６−ｌｚ）であり、これは、配列番号２のＶＰ１６のトランス活性化領域によって置換された、残基１−７４を含む蛋白質ｐ５３のＮ−末端部分の欠失、及び配列番号１の人工オリゴマー化領域によって置換された、残基３３７からの蛋白質ｐ５３のＣ−末端部分の欠失を含んでいる。変異体ｐＥＣ１１６の完全配列は、配列番号２６に示される。・ｐＥＣ１４７（ＶＰ１６−７５−３２５（Ｈ１８２）−ｌｚ）であり、これは、配列番号２のＶＰ１６のトランス活性化領域によって置換された、残基１− ７４を含む蛋白質ｐ５３のＮ−末端部分の欠失、配列番号１の人工オリゴマー化領域によって置換された、残基３２６からの蛋白質ｐ５３のＣ−末端部分の欠失、及び１８２位にヒスチジンを有している。・ｐＥＣ１４９（ＶＰ１６−７５−３３６（Ｈ１８２）−ｌｚ）であり、これは、配列番号２のＶＰ１６のトランス活性化領域によって置換された、残基１− ７４を含む蛋白質ｐ５３のＮ−末端部分の欠失、配列番号１の人工オリゴマー化領域によって置換された、残基３３７からの蛋白質ｐ５３のＣ−末端部分の欠失、及び１８２位にヒスチジンを有している。前記改変によって、本発明の変異体はまた、細胞周期の停止及びアポトーシスである潜在的に高められた「殺」特性をも有している。前記改変の組合わせは、選択的オリゴマー化領域の存在、及び起源領域の置換によって、及び１８２位のヒスチジンの存在によって改良されたトランス活性化力の存在をも含むが、この組合わせは実際に、本発明の変異体に、明らかに改良された治療能力を与える。さらには本発明の変異体によって、いくつかの突然変異体（発がん性優性）の出現を回避することができる。ｐ５３のいくつかの突然変異体の機能の獲得については、これらのメカニズムのレベルにおいても、関連のあるｐ５３の領域のレベルにおいても、いまだにあまり解明されていない。これらの新規機能のいくつかは、いくつかのエフェクター細胞パートナーとの組合わせによることになる可能性が非常に高い。これらの相互作用に関わる領域の除去、そのうちでも本出願に記載された分子中における、トランスフォーミング特性が証明されている相互作用に関わる領域の除去は、これらの発がん機能の獲得が出現するのを妨げる性質がある。従って、記載されているポリペプチドをコードするプラスミドの臨床ロットの製造の際、又はこれらの同じポリペプチドをコードするウイルス又は化学ベクターの臨床ロットの生産の際、無作為に現われる突然変異からは、発がん分子の二次的集団（ｓｏｕｓ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を生じなかった。さらに、その機能を阻害するいくつかの分子の結合に不可欠ないくつかのｐ５３領域の除去によって、本発明の変異体はまた、より高くかつより安定な治療活性を有する。最後に、本発明の種々の構築物における外来性ユニットの存在（例えば、マウス蛋白質ＡＳ、人工オリゴマー化領域等）は、トランスフェクションされた細胞が死ぬ時、及びこれらの種々の断片が細胞外媒体中へ放出される時に、免疫反応を引起こしやすい。従って、がん細胞に対して闘うことができる免疫系能力が高められる。別の実施態様によれば、異種トランス活性化領域は、トランスフォームされた細胞において優先的に活性であって、近隣の健康な細胞において活性ではないトランス活性化領域である。本発明はまた実際には、トランスフォームされた細胞中において本質的に機能が行使されるのであって、近隣の健康な細胞において行使されるのではない分子についても記載する。内因性の野生型ｐ５３を有する分化細胞中での野生型ｐ５３の外因性発現は、生存能力に対してほとんど、又はまったく影響を与えないようであるが、それにもかかわらず、標的細胞の中でしか機能的ではない蛋白質を入手できるのは有利である。正常細胞に対するがん細胞のこの特異性は、現在、ウイルスベクターの標的化特異性のレベル、又は特異的発現系の設計のレベルにおいて多く研究がなされている。本発明はここで、トランスフォームされた細胞中に本質的に存在する細胞活性化物質の不在下において、機能領域の１つが消えているようなｐ５３の誘導体について記載する。従って本発明のもう１つの目的は、トランスフォームされた細胞中において優先的に活性な蛋白質ｐ５３の変異体であって、ｐ５３の機能領域の少なくとも１つが、全部又は一部欠失しており、かつトランスフォームされた細胞中において優先的に活性な異種領域によって置換されている変異体に関する。ｐ５３の該機能領域は、トランス活性化領域であるのが好ましい。従って本発明の特に好ましい目的は、トランスフォームされた細胞中において優先的に活性な蛋白質ｐ５３の変異体であって、天然のトランス活性化領域が全部又は一部欠失しており、かつトランスフォームされた細胞中において優先的に活性なトランス活性化領域によって置換されている変異体に関する。有利には、天然のトランス活性化領域は、ｐ５３の残基１−７４の除去を介して欠失している。本発明はより詳しくは、発がん性蛋白質Ｒａｓ又はｐ５３の突然変異体の存在下において特異的に機能的なｐ５３の変異体に関する。これらの分子は特に、トランスフォームされた細胞中に存在するトランス活性化物質又はトランス活性化複合体と特異的に結合することができる蛋白質領域によって、野生型蛋白質ｐ５３のトランス活性化領域を置換することによって得られる。本発明の分子中に存在する転写トランス活性化物質又は転写トランス活性化複合体を特異的に結合することができる蛋白質領域は、種々の型のものであり得る。標的トランス活性化物質又はトランス活性化複合体も同様にこのような領域を含んでいる場合、特にこれはオリゴマー化領域であってもよい。同様に、前記トランス活性化物質又はトランス活性化複合体と相互作用するものとして知られた、合成又は天然のあらゆる領域であってもよい。さらには、トランス活性化物質又はトランス活性化複合体に対する抗体、又は該抗体の断片又は誘導体であってもよい。有利には異種領域は、抗体、又は抗体の断片もしくは誘導体から成っている。抗体の断片又は誘導体は、例えば断片Ｆａｂ又はＦ（ａｂ）’₂、抗体のＶＨ又はＶＬ領域、あるいはアームによってＶＬ領域に結合したＶＨ領域を含む一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）である。本発明によって改変されたこのような抗体をコードする核酸配列の構築に関しては、例えば米国特許第４，９４６，７７８号又は特許出願ＷＯ９４／０２６１０号、ＷＯ９４／２９４４６号に記載されている。本発明による好ましい構築物は、蛋白質ｐ５３の突然変異体に対するＳｃＦｖを含んでいる。これらの突然変異体は、トランスフォームされた細胞中に現われ、かつトランス活性化領域を有している。本発明による変異体によるこれらの補充により、トランスフォームされた細胞中において選択的に活性なキメラ分子を生じる。別の好ましい態様によれば、ＳｃＦｖはトランス活性化複合体に対して向けられている。すなわちこれは、トランスフォームされた細胞中に選択的に存在するが、転写トランス活性化物質活性（例えば発がん性ｒａｓ）を含まない標的分子と、トランス活性化領域を有する分子との間の複合体である。この後者の分子は、有利にはトランス活性化領域、及び前記細胞分子への選択的結合領域（例えば抗ｒａｓＳｃＦｖ）を含んでいる。この分子の結合によって、転写トランス活性化二元複合体が形成される。従ってこの複合体は、本発明の変異体によって補充される。この活性の特異性を生じるその他のあらゆる改変は、当然ながら本発明の枠内において用いることができる。例えば特にある種の細胞に特異的なあらゆるトランス活性化領域である。これらの選択的変異体は有利には、前記のように、これらの特性をさらに改善するために、前記のようなＣ−末端部分における追加の改変を含んでいる。従ってこれらは有利には、オリゴマー化領域の全部又は一部の欠失を含んでいる。この領域は、いずれかの異種オリゴマー化領域によって置換されていてもよい。より好ましくは前記のような人工オリゴマー化領域である。トランスフォームされた細胞において優先的に活性な本発明による変異体の適切な例は、特に下記のものである：ＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３^*−７５−３２５−ｌｚ：これはトランスフォームされた細胞中に存在する蛋白質ｐ５３の突然変異体を特異的に結合することができる蛋白質領域によって置換された、残基１−７４を含む、蛋白質ｐ５３のＮ− 末端部分の欠失、及び配列番号１の人工オリゴマー化領域によって置換された、残基３２６からの蛋白質５３のＣ−末端部分の欠失を有している；ＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３^*−７５−３２５（Ｈ１８２）− ｌｚ：これはさらに突然変異体Ｈｉｓ１８２を含んでいる；ＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３＊−７５−３３６−ｌｚ：これはトランスフォームされた細胞中に存在する蛋白質ｐ５３の突然変異体を特異的に結合することができる蛋白質領域によって置換された、残基１−７４を含む、蛋白質ｐ５３のＮ− 末端部分の欠失、及び配列番号１の人工オリゴマー化領域によって置換された、残基３３７からの蛋白質ｐ５３のＣ−末端部分の欠失を有している；ＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３^*−７５−３３６（Ｈ１８２）−ｌｚ：これはさらに突然変異体Ｈｉｓ１８２を含んでいる； − ＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３^*−７５−３９３：これはトランスフォームされた細胞中に存在する蛋白質ｐ５３の突然変異体を特異的に結合することができる蛋白質領域によって置換された、残基１−７４を含む、蛋白質ｐ５３のＮ−末端部分の欠失を有している； − ＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３^*−７５−３９３(Ｈ１８２)：これはさらに１８２位にヒスチジンを含んでいる； − ＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３＊−７５−３６７：これはトランスフォームされた細胞中に存在する蛋白質ｐ５３の突然変異体を特異的に結合することができる蛋白質領域によって置換された、残基１− ７４を含む、蛋白質ｐ５３のＮ−末端部分の欠失、及び残基３６８からのＣ−末端部分の欠失を有している； − ＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３^*−７５−３６７(Ｈ１８２)：これはさらに１８２位にヒスチジンを含んでいる； − ＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３^*−７５−ＡＳ：これはトランスフォームされた細胞中に存在する蛋白質ｐ５３の突然変異体を特異的に結合することができる蛋白質領域によって置換された、残基１−７４を含む、蛋白質ｐ５３のＮ−末端部分の欠失、及び配列番号３の１９のアミノ酸が加えられた、残基３６７からのＣ−末端部分の欠失を有している； − ＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３^*−７５−ＡＳ(Ｈ１８２)：これはさらに１８２位にヒスチジンを含んでいる。そのほかに、優先的に活性という用語は、これらの変異体が、トランスフォームされた細胞中において発現される時に本質的にこれらの活性を行使するということを示す。しかしながら残留活性は、トランスフォームされていない細胞中に存在しても良いが、トランスフォームされた細胞中において見られる活性よりも低い。本発明のもう１つの目的は、配列番号３（ＡＳ）に融合した、残基３６７からのＣ−末端部分の欠失を有している蛋白質ｐ５３の変異体に関する。この配列は、マウス蛋白質ｐ５３の代替スプライシング産物の最後の１９アミノ酸に対応する。従ってこの変異体は、マウスの場合に野生型蛋白質の代替スプライシング変異体として記載されている蛋白質をベースとするオリゴマー化領域の改変を示す。ここでは、Ｃ−末端の２７アミノ酸が、異なる１９アミノ酸によって置換されている。この変異体は、潜在的に増加したＤＮＡへの結合に特異的な配列に対して親和性を有している。この変異体は有利には、さらにその特性を改善するために前記のようにＮ−末端部分において改変を有している。従ってこの変異体は有利には、トランス活性化領域の全部又は一部の欠失を含んでいる。この領域は、いずれの異種トランス活性化領域によって置換されていてもよい。より好ましくは、蛋白質ＶＰ１６から誘導されたトランス活性化領域、又はトランスフォームされた細胞中に存在するトランス活性化物質又はトランス活性化複合体を特異的に結合することができる蛋白質領域である。そのほかに、蛋白質ｐ５３の残基１８２は、有利にはヒスチジンによって置換されている。本発明によるこの型の変異体の適切な例は、特に次のものである：・前記のＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３^*−７５−ＡＳ；・ｐＥＣ１４３（ＶＰ１６−７５−ＡＳ）：これは、配列番号２のＶ１６トランス活性化領域によって置換された、残基１−７４を含む蛋白質ｐ５３のＮ−末端部分の欠失、及び配列番号３の１９アミノ酸が加えられた、残基３６７からのＣ−末端部分の欠失を有している。変異体ｐＥＣ１４３の完全な配列は、配列番号２８として表わされている；・前記のＳｃＦｖ．ａｎｔｉｐ５３^*−７５−ＡＳ（Ｈ１８２）；・ｐＥＣ１５３（ＶＰ１６−７５−ＡＳ（Ｈ１８２））：これは１８２位にヒスチジンを有するｐＥＣ１４３に対応する。より一般的には本発明は、トランス活性化領域、ＤＮＡ結合領域、核中に指向するための領域、及びオリゴマー化領域を含むあらゆるキメラ蛋白質であって、ＤＮＡへの結合領域、及び核に指向するための領域が、ヒト野生型蛋白質ｐ５３のアミノ酸７５〜３２５から成るキメラ蛋白質に関する（配列番号４）。実際、本出願人は、適切なトランス活性化領域及びオリゴマー化領域と組合わされた蛋白質ｐ５３のこの領域によって、安定性、ｐ５３の突然変異体の負の作用への耐性、及びいくつかの細胞因子による不活性化への感受性に関して、特に有利な特性を有するｐ５３型の分子を作ることができることを見出した。１つの変異体によれば、ＤＮＡへの結合領域及び核に指向するための領域は、ヒト野生型蛋白質ｐ５３のアミノ酸７５〜３３６から成る（配列番号５）。本発明によるキメラ蛋白質は、種々の型のトランス活性化領域を含んでいてもよい。蛋白質ｐ５３のトランス活性化領域であってもよい。好ましくは、異種トランス活性化領域であってもよく、これは、例えばＶＰ１６のトランス活性化領域、又は特にトランスフォームされた細胞中に存在するトランス活性化物質又はトランス活性化複合体を特異的に結合することができる蛋白質領域から選ばれる領域である。オリゴマー化領域に関するならば、好ましくは人工的な領域、従って特定の領域である。例えば特に配列番号１の人工ロイシンジッパーである。本発明によるキメラ蛋白質はそのほかに、１８２位にヒスチジン残基を含んでいてもよい。本出願に記載されているキメラ蛋白質の適切な例は特に、ｐＥＣ１１４、ｐＥＣ１１６、ｐＥＣ１４７、及びｐＥＣ１４９である。本発明はまた、例えば前記のような変異体又はキメラ蛋白質をコードするあらゆる核酸をも目的としている。本発明による核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。さらには、場合によってはｐ５３遺伝子の１つ又は複数のイントロンを含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってもよい。これはヒト、動物、ウイルス起源であっても、合成又は半合成であってもよい。これは様々な方法によって、特に化学合成によって得られる。この際、本出願において示されている配列、例えば核酸のシンセサイザーが用いられる。これはまた、例えば特にこの出願において記載されているような、特異的プローブを用いたライブラリーの選別によって得ることもできる。これはさらに、ライブラリーから選別された配列の化学的改変（伸長、欠失、置換等）を含む技術の組合わせによって得ることもできる。一般的に本発明の核酸は、当業者に知られたあらゆる技術に従って製造することができる。好ましくは本発明による核酸は、ｃＤＮＡ又はＲＮＡである。本発明による核酸は、有利には次のものから選ばれる：（ａ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３１、３２、３３、及び３４又はこれらの相補鎖の全部または一部；（ｂ）配列（ａ）とハイブリダイズし、かつ本発明の誘導体をコードするあらゆる配列；（ｃ）遺伝暗号の縮重から生じる（a）及び（b）の変異体。前記のように、本出願人は今回、ｐ５３のポリペプチド変異体をコードし、かつまったく驚くべき抗増殖性及びアポトーシス性を有する新規核酸配列を構築した。これらの核酸は、細胞の機能不全を破壊又は修正することができる、本発明の誘導体を細胞内に生じるための治療剤として用いることができる。この目的のために、本発明はまた、前記のような核酸、発現を可能にするプロモーター、及び転写終結シグナルを含むあらゆる発現カセットにも関する。プロモーターは有利には、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞中で機能的なプロモーターから選ばれる。より好ましくは、過増殖細胞（がん細胞、再発狭窄症（ｒｅｓｔｅｎｏｓｅ）細胞等）における核酸の発現を可能にするプロモーターである。このためには、種々のプロモーターを用いることができる。例えばｐ５３遺伝子のプロモーターであってもよい。また、異なる起源の領域（他の蛋白質の発現に関わるもの、又は合成されたもの）であってもよい。従って、特異的又は非特異的に、誘導的又は非誘導的に、強力に又は弱く遺伝子の転写を刺激するか又は抑制する、いずれのプロモーター又は誘導された配列であってもよい。特に真核遺伝子又はウイルス遺伝子のプロモーター配列を挙げることができる。例えば標的細胞のゲノム由来のプロモーター配列であってもよい。真核プロモーターのうち、特に偏在（ｕｂｉｑｕｉｔａｉｒｅ）プロモーター（ＨＰＲＴ、ＰＧＫ、ａ−アクチン、チューブリン等の遺伝子のプロモーター）、中間フィラメントプロモーター（ＧＦＡＰ、デスミン、ビメンチン、ニューロフィラメント、ケラチン等の遺伝子のプロモーター）、治療遺伝子のプロモーター（例えばＭＤＲ、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子、ＡｐｏＡｌ等の遺伝子のプロモーター）、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合腸蛋白質、平滑筋のａ−アクチン等の遺伝子のプロモーター）、あるいは刺激応性プロモーター（ステロイドホルモンのレセプター、レチノイン酸のレセプター等）を用いることができる。同様に、ウイルスのゲノム由来のプロモーター配列であってもよい。例えばアデノウイルスの遺伝子Ｅ１Ａ及びＭＬＰのプロモーター、ＣＭＶの初期プロモーター、あるいは、ＲＳＶのＬＴＲプロモーター等であってもよい。さらには、これらのプロモーター領域は、活性化配列、調節配列、又は組織特異的もしくは優先発現を可能にする配列を加えることによって、改変することができる。本発明は、抗増殖性及び／又はアポトーシス性によって、数多くの細胞機能不全に干渉しうる新規治療剤を提供する。この目的のために、本発明の核酸又はカセットは、処理される部位のレベルにそのまま注入してもよく、あるいは破壊又は処理される細胞と共に直接インキュベーションしてもよい。実際、裸の核酸は特定のベクターを伴わずに細胞内に侵入できると記載されているが、それにもかかわらず、本発明の枠内では、投与用ベクターを用いるのが好ましい。これにより、（ｉ）細胞浸透効率、（ｉｉ）ターゲッティング、（ｉｉｉ）細胞外及び細胞内安定性を改良することができる。本発明の特に好ましい実施態様において、核酸又はカセットはベクターに組込まれる。用いられるベクターは、化学起源(リポソーム、ナノ粒子、ペプチド複合体、脂質、又はカチオン性ポリマー等)、ウイルス起源（レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＡＶ、ワクシニアウイルス等）、又はプラスミド起源のものであり得る。ウイルスベクターの使用は、ウイルスの天然のトランスフェクション性に左右される。従って例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、及びアデノ随伴ウイルスを用いることができる。これらのベクターは、トランスフェクションの面で特に有効である。この点に関して、本発明の好ましい対象は、ゲノムが前記定義の核酸を含んでいる欠陥組換えレトロウイルスである。本発明のもう１つの特別な対象は、ゲノムが前記のような核酸を含んでいる欠陥組換えアデノウイルスである。本発明によるベクターはまた、真核細胞における核酸の移入と発現を促進しうる非ウイルス剤であってもよい。合成又は天然の化学的ベクター又は生化学的ベクターは、特に便利さや安全性のために、またトランスフェクションされるＤＮＡの大きさに関して、理論的制限がないことによって、天然のウイルスと有利に代えることができる。これらの合成ベクターは、次の２つの主要な機能を有する。すなわちトランスフェクションされるべき核酸を導入すること、およびその細胞固定を促進すること、並びに形質膜、場合によっては２つの核膜の通過である。核酸のポリアニオン性を緩和するために、非ウイルスベクターはすべてポリカチオン電荷を有する。本発明において用いられる核酸又はベクターは、局所的、経口的、非経口的、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮的等による投与のために配合することが出来る。好ましくは核酸又はベクターは、注射しうる形態で用いられる。従ってこれを、注射しうる組成物用に、特に治療を受ける部位のレベルへの直接注射のために、医薬的に許容しうるあらゆる賦形剤と混合してもよい。特に無菌溶液、等張液、あるいは乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であってもよい。これらは、場合によっては無菌水か生理食塩水を添加して、注射薬を形成することが出来る。患者の腫瘍への核酸の直接注入が有利であるが、その理由は、この注射によって、患部組織のレベルに治療効果を集中させることができるからである。用いられる核酸の用量は、様々なパラメータに従って調整することができる。パラメータとは、特に、遺伝子、ベクター、用いられる投与方法、関係する病理、さらには予定される治療期間などである。本発明はまた、前記定義の少なくとも１つの核酸を含むあらゆる医薬組成物にも関する。本発明はまた、前記定義の少なくとも１つのベクターを含むあらゆる医薬組成物にも関する。本発明はまた、前記定義の少なくとも１つのｐ５３変異体を含むあらゆる医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、その抗増殖性によって、なかでも特に過増殖性障害、例えば特にがん及び再発狭窄症の治療に適している。従って本発明は、細胞、特に過増殖性細胞の破壊に対して特に有効な方法を提供する。本発明はｉｎｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏで用いることができる。本発明は、ｅｘｖｉｖｏでは、本質的に、１つ又は複数の核酸の存在下（あるいはベクター、カセット又は誘導体の直接の存在下）に細胞をインキュベーションすることから成る。本発明は、ｉｎｖｉｖｏでは、本発明のベクター（又はカセット）の活性量を、好ましくは直接、治療される部位（特に腫瘍）のレベルにおいて、生物に投与することから成る。この点に関して、本発明はまた、前記細胞又はこれらの細胞のうちの一部と、前記定義の核酸とを接触させることを含む、過増殖性細胞の破壊方法をも目的とする。本発明は有利には、過増殖（すなわち異常増殖）細胞の破壊のために、ｉｎｖｉｖｏで用いられる。従って本発明は、腫瘍細胞、又は脈管系の壁の平滑筋細胞（再発狭窄症）の破壊に適用しうる。本発明はなかでも特に、ｐ５３突然変異体が見られるがんの治療に適している。例えば、結腸腺がん、甲状腺がん、肺上皮腫、骨髄性白血病、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、胃がん、食道がん、Ｂリンパ腫、卵巣がん、膀胱がん、神経芽細胞腫、肝臓上皮腫、骨がん、皮膚がん、膵臓がん、さらには腎臓がん、前立腺がん、食道がん、咽頭がん、頭及び首のがん、ＨＰＶ陽性肛門生殖器がん、ＥＢＶ陽性上咽頭がん、細胞蛋白質ｍｄｍ２が過剰発現しているがんなどを挙げることができる。本発明の変異体は特に、蛋白質ＭＤＭ２がさらに過剰発現しているがん、並びにＨＰＶウイルスに関連したがん、例えばＨＰＶ陽性肛門生殖器がんの治療に効果がある。本発明は、以下の実施例においてより詳細に説明されるが、これらの実施例は例示として考慮されるべきものであり、本発明を限定するものではない。図面の説明図１は、野生型蛋白質ｐ５３の機能領域を表わしている。ＴＡは、転写活性化領域であり、ＤＮＢはＤＮＡ結合領域であり、ＮＬＳは、核局在シグナルであり、ＯＬはオリゴマー化領域、ＲＥＧは調節領域である。図２は、ｐ５３のＡＳ形をコードするｃＤＮＡの構築を表わしている。図３は、ｐＥＣ１０４、ｐＥＣ１０６、ｐＥＣ１３１、ｐＥＣ１３２、及びｐＥＣ１３３の構築物並びにこれらの変異体Ｈ１８２をコードするｃＤＮＡのクローニングを表わしている。図４は、人工オリゴマー化領域との融合による、変異体ｐＥＣ１０７、ｐＥＣ１１０、ｐＥＣ１３９及びｐＥＣ１４０の構築を表わしている。図５は、変異体ｐＥＣ１１４、ｐＥＣ１１６、ｐＥＣ１４１、ｐＥＣ１４３、ｐＥＣ１４５、ｐＥＣ１４７、ｐＥＣ１４９、ｐＥＣ１５１、ｐＥＣ１５３、及びｐＥＣ１５５の構築を表わしている。図６は、本発明のハイブリッド分子による、特異的二本鎖ＤＮＡ配列の認識を表わしている。ゲル上での遅延試験：ＨｉｓＶ３２５と野生型ｐ５３との競合。列１：ＨｉｓＶ３２５と野生型ｐ５３の不存在下におけるインキュベーション、列２：３０ｎｇの野生型ｐ５３、列３：２と同じもの＋ｐＡｂ４２１、列４：３０ｎｇのＨｉｓＶ３２５、列５：４と同じもの＋ｐＡｂ４２１、列６：３０ｎｇのＨｉｓＶ３２５＋３０ｎｇの野生型ｐ５３、列７：６と同じもの＋ｐＡｂ４２１、列８：３０ｎｇのＨｉｓＶ３２５＋１５ｎｇの野生型ｐ５３、列９：８と同じもの＋ｐＡｂ４２１、列１０：３０ｎｇのＨｉｓＶ３２５＋７．５ｎｇの野生型ｐ５３、列１１：１０と同じもの＋ｐＡｂ４２１、列１２：３０ｎｇのＨｉｓＶ３２５＋４．５ｎｇの野生型ｐ５３、列１３：１２と同じもの＋ｐＡｂ４２１、列１４：３０ｎｇのＨｉｓＶ３２５＋３ｎｇの野生型ｐ５３、列１５：１４と同じもの＋ｐＡｂ４２１。図７は、野生型蛋白質ｐ５３、並びに変異体ＡＳ、Ｖ−３２５及びＶ−３３６のトランス活性化活性を表わしている。図８は、野生型蛋白質ｐ５３、並びに変異体Ｖ−３２５、Ｖ−３３６、及びＶ −３４３のトランス活性化活性を表わしている。図９は、ＳＡＯＳ−２細胞における本発明の変異体の発現を表わしている。図１０は、ＥＢ、ＥＢ−１及びＥＢ−Ｖ３２５細胞における遺伝子ｈｄｍ２及びＷＡＦ１の誘発を表わしている。図１１は、ＳＡＯＳ−２細胞における蛋白質ｐ５３、及び本発明の変異体のトランス活性化機能に対する蛋白質Ｅ６の作用を表わしている。ベクターＣＭＶ構築物の量＝１００ｎｇである。図１２は、ＨｅＬａ細胞における蛋白質ｐ５３、及び本発明の変異体のトランス活性化機能に対する蛋白質Ｅ６の作用を表わしている。図１３は、蛋白質Ｅ６によって誘発された分解に対する、野生型蛋白質ｐ５３及び本発明の変異体の感受性を表わしている。図１４は、本発明の変異体のトランス活性化機能に対するｐ５３Ｈ１７５の負の優性突然変異体の作用を表わしている。ベクターＣＭＶ構築物の量＝１００ｎｇである。図１５は、ＳＡＯＳ−２細胞における蛋白質ｐ５３及び本発明の変異体のトランス活性化機能に対する蛋白質ｈｄｍ２の作用を表わしている。ベクターＣＭＶ構築物の量＝１００ｎｇである。図１６は、蛋白質ｈｄｍ２を過剰発現する細胞の増殖に対する、野生型蛋白質ｐ５３及びＶ−３２５蛋白質の作用を表わしている。図１７は、野生型蛋白質ｐ５３及びＶ−３２５蛋白質によるアポトーシスの誘発を表わしている。図１８は、ＥＢ、ＥＢ−１及びＥＢ−Ｖ３２５細胞におけるアポトーシス誘発の動力学を表わしている。実施例実施例Ａ：蛋白質ｐ５３の変異体をコードする遺伝子を作るために必要な種々のヌクレオチド断片の構築Ａ１：ヒト野生型ｐ５３をコードするｃＤＮＡの構築オリゴヌクレオチド５’−１及び３’−３９３を用いて、ヒト胎盤ライブラリー（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社）のＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ヒトｐ５３遺伝子をクローンニングした。オリゴヌクレオチド５’−１（配列番号６）：ＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧオリゴヌクレオチド３’−３９３（配列番号７）：ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＴＣＧＡＴＴＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＴＴＣついでこの生成物を、ＲＣＲ後にベクターｐＣＲＩＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）社）中に直接クローニングした。Ａ２：ｐ５３のＡＳ形をコードするｃＤＮＡの構築ｐ５３のＡＳ形は、マウス蛋白質ｐ５３の代替スプライシング産物の最後の１９アミノ酸が加えられたヒト蛋白質ｐ５３のアミノ酸１〜３６６をコードする断片を含んでいる。ｐ５３のＡＳ形は、２工程で得られた： − オリゴヌクレオチド５’−１（実施例Ａ１参照）及び３’−３６７を用いて、蛋白質ｐ５３のアミノ酸１〜３６７をコードする断片のＰＣＲによる増幅。オリゴヌクレオチド３’−３６７（配列番号８）：ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＴＣＧＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣついでこのようにして得られたＰＣＲ断片を、ベクターｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社）中にクローニングした。このようにしてクローニングされた断片は、制限酵素ＸｈｏＩ用の認識部位を有している（断片１−３６７）。 − オリゴヌクレオチド５’−ＡＳ１、５’−ＡＳ２、３’ −ＡＳ１、及び３’−ＡＳ２を燐酸化し、ついで共にハイブリダイズし、マウス蛋白質ｐ５３の代替スプライシング産物の最後の１９アミノ酸をコードする断片を構築した。５’−ＡＳ１（配列番号９）：ＴＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＧＡＧＧ５’−ＡＳ２（配列番号１０）：ＡＡＡＧＣＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣ３’−ＡＳ１（配列番号１１）：ＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＣＴＣＴＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣ３’−ＡＳ２（配列番号１２）：ＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＴＣＧＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡついでこの断片は、断片１−３６７のＸｈｏＩ部位のレベルに挿入された（図２参照）。このようにして構築された遺伝子は、マウス蛋白質ｐ５３の代替スプライシング産物のヒト変異体（ＡＳ）をコードする。このように改変された蛋白質配列は次のとおりである：Ａ３：ＤＮＡ結合領域を有する蛋白質ｐ５３の種々の断片にをコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、ｐ５３のＤＮＡ結合領域の全部又は一部を有する、ヒト蛋白質ｐ５３の種々の断片をコードする種々のｃＤＮＡの構築について記載する。ついでこれらの断片は、ｐ５３の変異体の構築に用いられる。これらの断片は、種々のオリゴヌクレオチドを用いて、実施例Ａ１及びＡ２に記載された鋳型におけるポリメラーゼ連鎖反応によって得られたものである。増幅反応は、実施例Ａ４．１に記載された条件下に実施された。Ａ３．１：ｐ５３及びその誘導体Ｈ１８２の７５−３２５領域をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、ヒト野生型蛋白質ｐ５３のアミノ酸７５〜３２５（７５−３２５）をコードするｃＤＮＡの構築について記載する。このｃＤＮＡは、次のオリゴヌクレオチド５’−７５及び３’−３２５を用いるｐ５３のＤＮＡ上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（実施例Ａ１に記載されているもの）によって得られた：５’−７５（配列番号１３）：ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＣＧＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴ３’−３２５（配列番号１４）：ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＴＴＴＣＴＴヒト蛋白質ｐ５３のアミノ酸１８２に点突然変異（システイン→ヒスチジン）を有するこの断片の誘導体は、下記配列のオリゴヌクレオチドＨ１８２を用いて、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）キットを使用して実施された部位特異的突然変異誘発によって得られた。オリゴヌクレオチドＨ１８２３’（配列番号１５）：ＡＴＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＣＴＣこの断片は、７５−３２５（Ｈ１８２）と称する。Ａ３．２：ｐ５３の７５−３３６領域及びその誘導体Ｈ１８２をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、ヒト野生型蛋白質ｐ５３のアミノ酸７５〜３３６（７５−３３６）をコードするｃＤＮＡの構築について記載する。このｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチド５’−７５（配列番号１３）及び下記オリゴヌクレオチド３’−３３６を用いるｐ５３ＤＮＡ上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（実施例Ａ１に記載されているもの）によって得られた：３’−３３６（配列番号１６）：ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＧＡＴＣＴＧヒト蛋白質ｐ５３のアミノ酸１８２に点突然変異（システイン→ヒスチジン）を有するこの断片の誘導体は、オリゴヌクレオチドＨ１８２（配列番号１５）を用いて、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）キットを使用して実施された部位特異的突然変異誘発によって得られた。この断片は、７５−３３６(Ｈ１８２)と称する。Ａ３．３：ｐ５３の７５−３４３領域をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、ヒト野生型蛋白質ｐ５３のアミノ酸７５〜３４３（７５−３４３）をコードするｃＤＮＡの構築について記載する。このｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチド５’−７５（配列番号１３）及び下記オリゴヌクレオチド３’−３４３を用いるｐ５３のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（実施例Ａ１に記載されているもの）によって得られた：３’−３４３（配列番号３５）：ＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＧＧＡＡＣＡＴＣＴＣＧＡＡＡ３．４：ｐ５３及びその誘導体Ｈ１８２の７５−３６７領域をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、ヒト野生型蛋白質ｐ５３のアミノ酸７５〜３６７（７５−３６７）をコードするｃＤＮＡの構築について記載する。この断片は、オリゴヌクレオチド５’−７５（配列番号１３）及び３’−３６７（配列番号８）を用いる実施例Ａ１に記載されたｐ５３ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られた：このようにして得られた断片は、エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ（７５−３６７）の認識部位を含んでいる。ヒト蛋白質ｐ５３のアミノ酸１８２に点突然変異（システイン→ヒスチジン）を有するこの断片の誘導体は、オリゴヌクレオチドＨ１８２（配列番号１５）を用いて、アマーシャムキットにより実施された部位特異的突然変異誘発によって得られた。この断片は、７５−３６７（Ｈ１８２）と指称された。Ａ３．５：ｐ５３及びその誘導体Ｈ１８２の７５−ＡＳ断片をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、ヒト野生型蛋白質ｐ５３のアミノ酸７５〜３６６（７５−３６６）をコードするｃＤＮＡの構築について記載する。これは、マウス蛋白質ｐ５３の代替スプライシング産物の最後の１９アミノ酸が付加されているものである。この断片は、オリゴヌクレオチド５’−７５（配列番号１３）及び３’−ＡＳ２（配列番号１２）を用いる実施例Ａ２に記載されているＡＳ断片のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られた。ヒト蛋白質ｐ５３のアミノ酸１８２に点突然変異（システイン→ヒスチジン）を有するこの断片の誘導体は、オリゴヌクレオチドＨ１８２（配列番号１５）を用いて、アマーシャムキットを使用して実施された部位特異的突然変異誘発によって得られた。この断片は、７５−ＡＳ（Ｈ１８２）と指称された。Ａ３．６：ｐ５３及びその誘導体Ｈ１８２の７５−３９３断片をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、ヒト野生型蛋白質ｐ５３のアミノ酸７５〜３９３（７５−３９３）をコードするｃＤＮＡの構築について記載する。この断片は、オリゴヌクレオチド５’−７５（配列番号１３）及び３’−３９３（配列番号７）を用いる実施例Ａ１に記載されているｐ５３ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られた。ヒト蛋白質ｐ５３のアミノ酸１８２に点突然変異（システイン→ヒスチジン）を有するこの断片の誘導体は、オリゴヌクレオチドＨ１８２（配列番号１５）を用いて、アマーシャムキットを使用して実施された部位特異的然変異誘発によって得られた。この断片は、７５−３９３（Ｈ１８２）と指称された。Ａ４：転写活性化領域（トランス活性化領域）を有する種々の断片をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、トランス活性化領域を有する種々の断片をコードする種々のｃＤＮＡの構築について記載する。ついでこれらの断片は、ｐ５３の変異体の形成において用いられる。Ａ４．１：ＰＣＲ反応種々の断片が、種々のオリゴヌクレオチドを用いて、種々の鋳型におけるポリメラーゼ連鎖反応によって得られた。増幅反応は、下記条件下に実施された：供給業者によって供給された緩衝液中の酵素ＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社）、ｄＮＴＰ濃度０．２ｍＭ、鋳型１００ｎｇ、及び２つのオリゴヌクレオチドの各々５００ｎｇ。 − サイクル：９１℃で２分 − 複数のサイクル：９１℃で１分５５℃で１分７２℃で１分 − サイクル：７２℃で５分Ａ４．２：ウイルス蛋白質ＶＰ１６（ＶＰ１６ＴＡ）の４１１−４９０領域をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、ウイルス蛋白質ＶＰ１６（ＶＰ１６ＴＡ）のアミノ酸４１１−４９０をコードするｃＤＮＡの構築について記載する。この領域は、この蛋白質のトランス活性化領域を有している。単純ヘルペスウイルスのウイルス蛋白質ＶＰ１６（４１１−４９０）由来のトランス活性化断片が、前記条件（Ａ４．１参照）及び下記オリゴヌクレオチド５ ’−ＶＰ１６及び３’−ＶＰ１６を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られた：５’−ＶＰ１６（配列番号１７）：ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＧＧＣＣＣＣＣＣＣＧＡＣＣ３’−ＶＰ１６（配列番号１８）：ＧＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧＴＣＡＡＴこの時さらに、プラスミドｐＵＨＤ１５−１（Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８９巻、（１９９２年）、５５４７頁）１００ｎｇをも用いた。このようにして得られた断片は、配列が配列番号２として示されている３３４塩基対を含んでいる。この断片は、そのＮ− 末端部分に、ＰＣＲクローニング工程の際に付加された、転写開始部位（ＡＴＧ）によってもたらされたメチオニン残基を含んでいる。Ａ４．２：内因性蛋白質ｐ５３の転写活性化領域（トランス活性化領域）を補充することができる種々の断片をコードするｃＤＮＡの構築Ａ４．２．１：蛋白質ｐ５３を結合することができる一本鎖抗体（ＳｃＦｖ４２１）をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、蛋白質ｐ５３を結合することができる一本鎖抗体（ＳｃＦｖ４２１）をコードするｃＤＮＡの構築について記載する。細胞内のレベルにおいて発現されるこの構築物は、そのトランス活性化領域を補充するために、野生型又は突然変異型の内因性蛋白質ｐ５３を結合することができるものでなければならない。ＳｃＦｖ４２１をコードするｃＤＮＡ（特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９６／００４７７号）を、断片ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの形態で抽出することができる。これは翻訳開始部位（ＡＴＧ）を含むが、翻訳停止配列はまったく含んでいない。このようにして得られた断片は、配列が配列番号３６とされている７６６塩基対を含んでいる。Ａ４．２．２：野生型蛋白質ｐ５３の３２５−３６０領域（３２５−３６０）をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、野生型蛋白質ｐ５３のアミノ酸３２５−３６０（３２５−３６０）をコードするｃＤＮＡの形成について記載する。この領域は、この蛋白質のオリゴマー化領域を有している。細胞内のレベルで発現されたこの構築物は、そのトランス活性化領域を補充するために、野生型又は突然変異型の内因性蛋白質ｐ５３を結合することができるものでなければならない。ヒト野生型蛋白質ｐ５３（３２５−３６０）由来のこのオリゴマー化領域は、前記条件（Ａ４．１参照）及び下記オリゴヌクレオチド５’−３２５及び３’− ３６０を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られた：５’−３２５（配列番号３７）：ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＴ３’−３６０（配列番号３８）：ＧＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣこの反応は、ｐ５３ＤＮＡ１００ｎｇに対して実施された（実施例Ａ１に記載されているもの）。このようにして得られた断片は、配列が配列番号３９とされている１４１塩基対を含んでいる。これは、そのＮ−末端部分に、ＰＣＲクローニング工程の際に加えられた、翻訳開始部位（ＡＴＧ）によってもたらされたメチオニン残基を含んでおり、これは翻訳停止配列をまったく含んでいない。Ａ４．２．３：野生型蛋白質ｐ５３の３２５−３９３（３２５−３９３）領域をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、野生型蛋白質ｐ５３のアミノ酸３２５−３９３（３２５−３９３）をコードするｃＤＮＡの構築について記載する。この領域は、この蛋白質のオリゴマー化領域を有している。細胞内のレベルで発現されたこの構築物は、そのトランス活性化領域を補充するために、野生型又は突然変異型の内因性蛋白質ｐ５３を結合することができるものでなければならない。ヒト野生型蛋白質ｐ５３（３２５−３６０）から誘導されたこのオリゴマー化領域は、前記条件（Ａ４．１参照）及びオリゴヌクレオチド５’−３２５（配列番号３７）及び下記オリゴヌクレオチド３’−３９３．２を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られた：３’−３９３．２（配列番号４０）：ＧＧＧＴＣＧＡＣＣＧＴＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＴＴＣこの反応は、ｐ５３のＤＮＡ１００ｎｇに対して実施された（実施例Ａ１に記載されているもの）。このようにして得られた断片は、配列が配列番号４１とされている２４３塩基対を含んでいる。この断片は、そのＮ−末端部に、ＰＣＲクローニング工程の際に付加された、翻訳開始部位（ＡＴＧ）によってもたらされたメチオニン残基を含んでおり、これは翻訳停止配列はまったく含んでいない。Ａ５：オリゴマー化領域を有する種々の断片をコードするｃＤＮＡの構築この実施例では、オリゴマー化領域を有する種々の断片をコードする種々のｃＤＮＡの形成について記載する。ついでこれらの断片は、ｐ５３の変異体の構築において用いられる。種々のオリゴヌクレオチドを用いた種々の鋳型（相同領域に関してはｐ５３、及び異種、特に人工オリゴマー化領域に関しては種々の起源の鋳型）におけるポリメラーゼ連鎖反応によって得られた。増幅反応は、前記Ａ４．１に記載された条件下において実施された。Ａ５．１：人工オリゴマー化領域を含むｃＤＮＡの構築この実施例では、人工ロイシンジッパーから成る、人工オリゴマー化領域を含むｃＤＮＡの形成について記載する。ついでこのｃＤＮＡは、ヒト蛋白質ｐ５３、及びシステイン１８２のレベルにおいて改変されたこれらの誘導体、の断片７５−３２５（実施例Ａ３．１）及び７５−３３６（実施例Ａ３．２）からの変異体の構築に用いられる。このｃＤＮＡは、次の６つのオリゴヌクレオチドから形成されたものである。ｌｚ１−５’（配列番号１９）：ＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＣｌｚ２−５’（配列番号２０）：ＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧｌｚ３−５’（配列番号２１）：ＡＡＧＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣｌｚ１−３’（配列番号２２）：ＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＡ１ｚ２−３’（配列番号２３）：ＴＡＧＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴｌｚ３−３’（配列番号２４）：ＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＴＣＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣこれらのオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）化学を利用し、ＤＮＡの自動合成器を用いて合成された。これらの６つのオリゴヌクレオチドは、相補対（ｌｚ１−５’／ｌｚ１−３’、ｌｚ２− ５’／ｌｚ２−３’、ｌｚ３−５’／ｌｚ３−３’）及び重なり合い相補体（ｌｚ１−３’／ｌｚ２−５’、ｌｚ２−３’／ｌｚ３−５’）を有する。このため、ハイブリダイゼーション及び連結によってオリゴマー化領域を簡単に得ることができる。生じた配列ＬＺは、配列番号１に示される。Ａ５．２：ヒトｐ５３の天然オリゴマー化領域を含むｃＤＮＡの構築この実施例では、ヒトｐ５３の天然オリゴマー化領域を含むｃＤＮＡの形成について記載する。このｃＤＮＡは、構築物７５−３６７（実施例Ａ３．４）、７５−ＡＳ（実施例Ａ３．５）、７５−３９３（実施例Ａ３．６）中に含まれたｐ５３のアミノ酸３２５〜３５６、及びシステイン１８２のレベルにおいて改変されたこれらの誘導体をコードする断片によって表される。実施例Ｂ：蛋白質ｐ５３の種々の変異体をコードする遺伝子の構築Ｂ１：ｐ５３の種々の断片のクローニング実施例Ａに記載されているＰＣＲによって得られた種々の断片の各々は、ＰＣＲ後に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩによる認識部位を用いてベクターｐＢＣＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングされた（図３）。これらの生成物は、次の番号を有する：７５−３２５ −−＞ｐＥＣ１０４７５−３３６ −−＞ｐＥＣ１０６７５−３４３ −−＞ｐＥＣ１７１７５−３６７ −−＞ｐＥＣ１３１７５−ＡＳ −−＞ｐＥＣ１３２７５−３９３ −−＞ｐＥＣ１３３これらの物質から、オリゴヌクレオチド特異的インビトロ突然変異誘発システム（アマーシャム社）、及びオリゴヌクレオチドＨ１８２を用いて実施された部位特異的突然変異誘発によって、１８２位にヒスチジンを有する対応の構築物が得られた。これらの構築物は下記番号を有する：７５−３２５（Ｈ１８２） −−＞ｐＥＣ１３４７５−３３６（Ｈ１８２） −−＞ｐＥＣ１３５７５−３６７（Ｈ１８２） −−＞ｐＥＣ１３６７５−ＡＳ（Ｈ１８２） −−＞ｐＥＣ１３７７５−３９３（Ｈ１８２） −−＞ｐＥＣ１３８Ｂ２：断片７５−３２５、７５−３３６、及び７５−３４３、及びこれらの変異体Ｈ１８２へのロイシンジッパーの融合ロイシンジッパーを構成するオリゴヌクレオチド（ｌｚ１− ５’、ｌｚ１−３’、ｌｚ２−５’、ｌｚ２−３’、ｌｚ３−５’、及びｌｚ３ −３’）は、Ｔ４キナーゼによって燐酸化され、ついですべてが一緒にハイブリダイズされ、予め制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩによって消化されたベクターｐＥＣ１０４、１０６、１３４、及び１３５及び１７１中に挿入された（図４）。これらの生成物は、下記番号を有する：７５−３２５−ｌｚ −−＞ｐＥＣ１０７７５−３３６−ｌｚ −−＞ｐＥＣ１１０７５−３４３−ｌｚ −−＞ｐＥＣ１７４７５−３２５（Ｈ１８２）−ｌｚ −−＞ｐＥＣ１３９７５−３３６（Ｈ１８２）−ｌｚ −−＞ｐＥＣ１４０Ｂ３：完全ｐ５３断片への転写活性化領域の融合最終生成物は、下記のように実施された３つのパートナーの連結によって得られた（図５）。実施例Ａ３に記載されたＶＰ１６由来の転写活性化領域は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩによるＰＣＲ生成物の酵素消化によって調製された。既に得られている種々の断片ｐ５３（７５−３２５−ｌｚ、７５−３３６−ｌｚ、７５−３４３−ｌｚ、７５−ＡＳ、７５ −３６７、７５−３９３、及びこれらの変異体Ｈ１８２）は、制限酵素ＳａＩＩ及びＮｏｔＩによる前記断片を含むプラスミドの酵素消化後に単離された。可能性のある組合わせ（活性化領域／ｐ５３）が形成され、同時に、これは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩにより予め消化されたベクターｐＢＣＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に挿入された。これらの構築物は、下記番号を有する： VP16-75-325-lz V-325 −−＞ pEC114(配列番号25) VP16-75-336-lz V-336 −−＞ pEC116(配列番号26) VP16-75-367 V-367 −−＞ pEC141(配列番号27) VP16-75-AS V-AS −−＞ pEC143(配列番号28) VP16-75-393 V-393 −−＞ pEC145(配列番号29) VP16-75-343-lz V-343 −−＞ pEC175(配列番号30) VP16-75-325(H182)-lz V-325H −−＞ pEC147 VP16-75-336(H182)-lz V-336H −−＞ pEC149 VP16-75-367(H182) V-367H −−＞ pEC151 VP16-75-AS(H182) V-ASH −−＞ pEC153 VP16-75-393(H182) V-393H −−＞ pEC155 ＶＰ１６領域の代わりにトランス活性化物質又はトランス活性化複合体を特異的に結合する領域を有する対応物質は、同じ方法で形成される。これらの構築物は、下記のように示される：トランス活性化領域（１−７４）の代わりにｐ５３の領域３２５−３６０を含む物質は、下記ヒンジアップ（Ｈｉｎｇｅ−ｕｐ）及びヒンジダウン（Ｈｉｎｇｅ−ｄｏｗｎ）相補的合成オリゴヌクレオチド対のハイブリダイゼーションによって得られたＤＮＡ断片のＳａｌＩ部位における挿入によって得られた、（Ｈｉｎｇｅ）合成分離体が付加されていてもよい：ヒンジアップ（配列番号４２）：ＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣヒンジダウン（配列番号４３）：ＴＣＧＡＧＡＡＣＣＣＣＴＡＣＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣ生じたヒンジ二本鎖ＤＮＡの配列は下記のとおりである：ＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＡＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴ対応蛋白質配列は次のとおりである（配列番号４４）：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ対応する物質は下記のように示される： (325-360)-Hinge-75-325-lz 360h−325−−> pEC179 (配列番号34) (325-360)-Hinge-75-336-lz 360h-336 (325-360)-Hinge-75-367 360h-367 (325-360)-Hinge-75-AS 360h-AS (325-360)-Hinge-75-393 360h-393 (325-360)-Hinge-75-325(H182)-lz 360h-325H (325-360)-Hinge-75-336(H182)-lz 360h-336H (325-360)-Hinge-75-367(H182) 360h-367H (325-360)-Hinge-75-AS(H182) 360h-ASH (325-360)-Hinge-75-393(H182) 360h-393H 実施例Ｃ：ｐ５３の変異体の発現ベクターの構築この実施例では、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏでの本発明の核酸の移入に用いうるベクターの構築について記載する。Ｃ１：プラスミドベクターの構築プラスミドベクターの構築のために、２種類のベクターが用いられた。 − ＤＮＡクローニング（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ）に記載されたベクターｐＳＶ２： “ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ”、第２巻、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ（編）ＩＲＬ出版、ワシントンＤＣ、オックスフォード、１９８５年。このベクターは、真核生物発現ベクターである。変異体をコードする核酸は、断片Ｈｐａｌ−ＥｃｏＲＶの形態で、このベクター中に挿入された。従ってこれらは、ウイルスＳＶ４０エンハンサーのプロモーターの調節下に置かれる。 − ベクターｐＣＤＮＡ３（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）社）。同様に、真核生物発現ベクターである。従って本発明の変異体をコードする核酸は、このベクターにおいて、ＣＭＶ初期プロモーターの調節下に置かれる。実施例Ｂ３に記載されたあらゆる構築物は、ｉｎｖｉｖｏで種々の評価システムにおいてテストするために、断片ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩの形態でこのベクター中に導入された。Ｃ２：ウイルスベクターの構築特別な態様によれば、本発明は、前記のような核酸の生体内移入及び発現を可能にするウイルスベクターの構築及び使用に関する。より詳しくは、アデノウイルスに関しており、構造及び特性が少しずつ異なる種々の血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）の特徴が示された。これらの血清型のうち、本発明の枠内においては、２型又は５型のヒトアデノウイルス（Ａｄ２又はＡｄ５）、又は動物起源のアデノウイルス（特許出願ＷＯ９４／２６９１４号参照）を用いるのが好ましい。本発明の枠内において用いうる動物起源のアデノウイルスとして、イヌ、ウシ、マウス起源のアデノウイルス（例えばＭａｖｌ、ベアード（Ｂｅａｒｄ）ら、“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”、第７５巻、（１９９０年）、８１頁）、ヒツジ、ブタ、トリ、あるいはサル起源のアデノウイルス（例：ＳＡＶ）を挙げることができる。好ましくは動物起源のアデノウイルスは、イヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２[例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣＶＲ−８００）]である。好ましくは本発明の枠内において、ヒト又はイヌ又は混合起源のアデノウイルスを用いる。好ましくは本発明の欠陥アデノウイルスは、ＩＴＲ、キャプシド化を可能にする配列、及び本発明による核酸を含んでいる。さらに好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、少なくともＥ１領域は機能的ではない。該ウイルス遺伝子は、当業者に知られたあらゆる技術、特に完全サプレッション、置換、一部欠失、又は１つ又は複数の該遺伝子中への１つ又は複数の塩基の付加によって、非機能的にすることができる。このような改変は、インビトロ（単離されたＤＮＡに対して）で、又はその場で、例えば遺伝子工学の技術を用いて、あるいは突然変異剤による処理によって得ることができる。その他の領域もまた、改変することができる。特に領域Ｅ３（ＷＯ９５／０２６９７号）、Ｅ２（ＷＯ９４／２８９３８号）、Ｅ４（ＷＯ９４／２８１５２号、ＷＯ９４／１２６４９号、ＷＯ９５／０２６９７号）、及びＬ５（ＷＯ９５／０２６９７号）である。好ましい実施態様によれば、本発明によるアデノウイルスは、領域Ｅ１及びＥ４に欠失を含んでいる。もう１つの好ましい実施態様によれば、これは、領域Ｅ１に欠失を含んでいる。この領域のレベルに、領域Ｅ４及び本発明の核酸が挿入されている（ＦＲ９４１３３５５号参照）。本発明のウイルスにおいて、領域Ｅ１における欠失は、好ましくは、アデノウイルスＡｄ５配列上のヌクレオチド４５５から３３２９まで及んでいる。本発明の欠陥組み換えアデノウイルスは、当業者に知られたあらゆる技術によって調製することができる（レブレロ（Ｌｅｖｒｅｒｏ）ら、“Ｇｅｎｅ”、第１０１巻、（１９９１年）、１９５頁、ＥＰ１８５５７３号；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）、“ＥＭＢＯＪ．”、第３巻、（１９８４年）、２９１７頁）。特にこれらは、アデノウイルスと、中でも特に問題のＤＮＡ配列を有するプラスミドとの間の相同組み換えによって調製することができる。相同組み換えは、適切な細胞系中への前記アデノウイルスとプラスミドの同時トラスフェクション後に生じる。用いられる細胞系は、好ましくは（ｉ）前記要素によってトランスフォームしうるものでなければならず、（ｉｉ）組み換えのリスタを避けるために好ましくは組み込み形態で、欠陥アデノウイルスのゲノム部分を相補することができる配列を含んでいなければならない。細胞系の例として、ヒト胎児腎細胞株２９３（グラハムら、“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．”、第３６巻、（１９７７年）、５９頁）であって、特にアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左部分（１２％）がゲノム中に組み込まれて含むもの、又は特に例えば特許出願ＷＯ９４／２６９１４号、及びＷＯ９５／０２６９７号に記載されているような、Ｅ１及びＥ４機能を相補することができる細胞株を挙げることができる。ついで、増殖されたアデノウイルスを回収し、実施例において示されているように、分子生物学の従来技術に従って精製する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に関しては、比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスである。これは感染される細胞のゲノム中に安定かつ部位特異的に組込まれる。これらウイルスは、広いスペクトルの細胞に感染することができ、細胞の成長、形態又は分化に影響を誘発しない。さらには、これらはヒトの場合の病理に関わっていないようである。ＡＡＶのゲノムは、クローニングされ、配列決定され、特徴付けられている。このゲノムは約４７００塩基を含み、各末端部に、約１４５塩基の逆反復領域（ＩＴＲ）を含んでおり、これはウイルスの複製起源として用いられる。ゲノムの残りは、キャプシド化機能を有する次の２つの不可欠領域に分けられる。すなわち、ウイルスの複製及びウイルス遺伝子の発現に関わる遺伝子ｒｅｐを含むゲノムの左部分と、ウイルスのキャプシド蛋白質をコードする遺伝子ｃａｐを含むゲノムの右側部分である。ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏでの遺伝子の移入へのＡＡＶから誘導されたベクターの使用は、文献に記載されている（特に、ＷＯ９１／１８０８８号；ＷＯ９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号、欧州特許第４８８５２８号）。これらの特許出願には、遺伝子ｒｅｐ及び／又はｃａｐが欠失し、目的の遺伝子によって置換されている、ＡＡＶから誘導された種々の構築物について、及び前記目的の遺伝子をｉｎｖｉｔｒｏ（培養細胞上へ）又はｉｎｖｉｖｏ（生物に直接）へ移入するためのこれらの使用について記載されている。本発明の欠陥組み換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆反復領域（ＩＴＲ）が両端に隣接された本発明の目的の核酸配列を含むプラスミド、及びＡＡＶキャプシド化遺伝子（遺伝子ｒｅｐ及びｃａｐ）を有するプラスミドをヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）によって感染された細胞系に同時トランスフェクトすることによって調製することができる。使用しうる細胞系は、例えば細胞株２９３である。生じたＡＡＶ組み換え体は、ついで従来技術によって精製される。ヘルペスウイルス及びレトロウイルスに関して、組み換えベクターの構築は、文献に広く記載されている：特にブレイクフィールド（Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ）ら、“ＮｅｗＢｉｏｌｏｇｉｓｔ”、第３巻、（１９９１年）、２０３頁；欧州特許第４５３２４２号、欧州特許第１７８２２０号、バーンスタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）ら、“Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．”、第７巻、（１９８５年）、２３５頁；マコーミック（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ）、“ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、第３巻、（１９８５年）、６８９頁等参照。特にレトロウイルスは、組み込み可能なウイルスであり、分裂細胞に選択的に感染する。従ってレトロウイルスは、がんへの適用に対する目的のベクターになる。レトロウイルスのゲノムは、本質的に２つのＬＴＲ、キャプシド化配列、及び３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含んでいる。レトロウイルスから誘導された組み換えベクターにおいて、遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖは、一般に完全に又は部分的に欠失され、目的の異種核酸配列によって置換されている。これらのベクターは、種々の型のレトロウイルス、例えば特にＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」；ＭｏＭＬＶとも称される）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（ハーベー肉腫ウイルス））、ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）、あるいはフレンド・ウイルスから作ることができる。本発明の核酸を含む本発明の組み換えレトロウイルスを形成するために、特にＬＴＲ、キャプシド化配列、及び前記核酸を含むプラスミドが構築され、ついでいわゆるキャプシド化細胞系をトランスフェクションするために用いられる。この細胞系はプラスミド中に欠けているレトロウイルス機能をトランスにおいてもたらすことができるものである。従って一般に、キャプシド化系は、遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを発現することができる。このようなキャプシド化系は、先行技術に記載されている。特にＰＡ３１７系（米国特許第４，８６１，７１９号）；ＰｓｉＣＲＩＰ系（ＷＯ９０／０２８０６号）、及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍ− １２系（ＷＯ８９／０７１５０号）である。さらに、組み換えレトロウイルスは、転写活性を抑制するためにＬＴＲレベルに改変を含んでいてもよく、遺伝子ｇａｇの一部を含む、伸長されたキャプシド化配列を含んでいてもよい（ベンダー（Ｂｅｎｄｅｒ）ら、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、第６１巻、（１９８７年）、１６３９頁）。生じた組み換えレトロウイルスは、ついで従来技術によって精製される。本発明の実施のために、欠陥組み換えアデノウイルス又はレトロウイルスを用いるのが特に有利である。これらのベクターは実際、腫瘍細胞への遺伝子の移入のために特に有利な特性を有している。Ｃ３：化学ベクター開発された合成ベクターのうち、本発明の枠内において、ポリリシン型（ＬＫＬＫ）ｎ、（ＬＫＫＬ）ｎ、ポリエチレンインミン型、及びＤＥＡＥデキストラン型のカチオン性ポリマー、あるいはカチオン性脂質又はリポフェクタントを用いるのが好ましい。これらは、ＤＮＡを縮合する特性、及び細胞膜との会合を促進する特性を有している。これらの後者のもののうち、リポポリアミン（リポフェクタミン、トランスフェクタム等）、種々のカチオン性又は中性脂質（ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ等）、並びに核起源のペプチドを挙げることができる。そのほかに、標的化トランスフェクションの概念も開発された。このトランスフェクションはレセプターによって媒介されるものであり、これは、組込みたい種類の細胞の表面に存在する、カチオン性ポリマーと、膜レセプターのリガンドとの間の化学結合によって、膜への複合体の結合を実施しつつ、カチオン性ポリマーによってＤＮＡを縮合するという原理を利用している。従って、トランスフェリンやインシュリンのレセプター、又は肝細胞のアシアロ糖蛋白質（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｅ）のレセプターのターゲッティングについても記載されている。このような化学ベクターを用いる本発明の組成物の製造は、一般に種々の成分を単純に接触させることにより、当業者に知られたあらゆる技術に従って実施される。実施例Ｄ：ｐ５３変異体の機能評価本発明のｐ５３変異体を、下記基準についての細胞テストにおいて評価を行なった： − 特異的二本鎖ＤＮＡ配列への結合 − トランス活性化機能 − 抗増殖活性 − アポトーシス活性 − ｐ５３のいくつかの突然変異と関連する発がん能より詳しくはこの評価のために用いられる構築物は、実施例Ｂに記載された構築物Ｖ−３２５、Ｖ−３３６、Ｖ−３４３及びＡＳである。Ｄ１：本発明のハイブリッド分子による、特異的二本鎖ＤＮＡ配列の認識Ｄ１．１：ハイブリッド分子の産生野生型ｐ５３のｃＤＮＡは、ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インビトロゲン社）中に、ＢａｍＨＩ部位においてクローニングされた。酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによるプラスミドｐＥＣ１１４の消化によって得られたＶ３２５ｃＤＮＡを含む断片のプラスミドｐＡｃＨＬＴ−Ａ（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社）中への挿入によって、ベクターを得、このベクターによって、組み換えバキュロウイルスを得ることができた。これは、特に６つのヒスチジン残基の鎖を含むペプチド配列によってＮ−末端部分に標識された蛋白質Ｖ３２５の発現を目的としているものである。これらのベクターから、組み換えバキュロウイルスは、製造業者（インビトロゲン社、ファーミンゲン社）の指示に従って産生され、かつ精製された。２つの蛋白質は、これらの各バキュロウイルスによって感染させられた昆虫細胞ＳＦ９の核抽出物から、均質に精製された。デルフィン（Ｄｅｌｐｈｉｎ）らによって記載された手順に従って、核抽出物が得られた（Ｃ．Ｄｅｌｐｈｉｎ“Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．”、第２２３巻、６８３〜６９２頁、１９９４年）。野生型ｐ５３は、下記プロトコルに従って、モノクローン抗体ｐＡｂ４２１（ “ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅｓ”、Ａｂ−１）上の免疫親和性により精製される。すなわち感染された細胞の核抽出物を、４℃で３時間、プロテインＡ −アガロースゲルでインキュベーションする。但し、このゲル上には、抗体ｐＡｂ４２１が共有結合されている。１ＭＫＣｌ及びプロテアーゼの阻害剤を含む緩衝液５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．８によるゲルの十分な洗浄後、蛋白質ｐ５３は、この抗体によって認識されるｐ５３上のエピトープ（ＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫ）に対応するペプチドによって溶離される。このペプチドは、洗浄のために用いられる溶液中濃度５ｍｇ／ｍｌで用いられる。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（アミコン・グレース(ＡｍｉｃｏｎＧｒａｃｅ)社）での濃縮後、溶離されたｐ５３は、ペプチドから分離され、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ１０／３０カラム上ゲル浸透によって均質精製される。このカラムは、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５、０．２ＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＧＴＡ、０．１ｍＭＺｎＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＰＭＳＦ、０．１％ＮＰ−４０、５％グリセロールによって平衡化させられたものである。ｐ５３を含む画分をアリコートに分け、使用まですぐに−８０℃に凍結しておく。特に６つのヒスチジン残基の鎖を含むペプチド配列によってＮ−末端部分に標識された蛋白質Ｖ３２５であって、以下ＨｉｓＶ３２５と呼ばれるものを、ホチューリ（Ｈｏｃｈｕｌｉ）らの適合手順によって精製した（“Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、第６巻、（１９８８年）、１３２１頁）。ニッケル−ＮＴＡアガロースゲル上にアプライする前に、感染させられた細胞の核抽出物を、カラムＰＤ１０（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）で脱塩する。このカラムは、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．１％ＮＰ−４０、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８で平衡化させられているものである。ニッケル−ＮＴＡアガロースゲルでの核抽出物のインキュベーションを、この緩衝液中で４℃で１時間撹拌下に実施する。ついでゲルを同じ緩衝液ｐＨ６で十分に洗浄する。蛋白質ＨｉｓＶ３２５を、０．１Ｍイミダゾールゲル中でのゲルの洗浄後、この後者の緩衝液中において０．３Ｍイミダゾールによって溶離する。ＨｉｓＶ３２５を含む画分をアリコートに分け、使用まですぐに−８０℃で凍結しておく。Ｄ１．２：特異的二本鎖ＤＮＡ配列の構築この実験で用いられた特異的二本鎖ＤＮＡ配列は、２つの合成オリゴヌクレオチドから成る。この配列は次のとおりである：オリゴ５５６８（配列番号４５）：ＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＡオリゴ５５６９（配列番号４６）：ＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＧこれらの２つの合成オリゴヌクレオチドは、下記反応媒体２０μｌ中の各オリゴヌタレオチド５ｐモルの３７℃での３０分のインキュベーションによって、燐 −３３標識された：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６５０ｍＭＭｇＣｌ₂ １０ｍＭジチオトレイトール５ｍＭスペルミジン１００μＭＥＤＴＡ１００μＭＡＴＰ−γ−³³Ｐ（アマーシャム社）５０μＣｉ（１０００−３０００Ｃｉ／ミリモル）Ｔ４キナーゼ（ベーリンガー社）１０Ｕついでこのように標識された２つのオリゴヌクレオチドは、下記ＷＡＦ−ＲＥ二本鎖配列を再構成するために、１００ｍＭＮａＣｌの存在下にハイブリダイズされた。この配列は、遺伝子ＷＡＦ−１のプロモーター領域において、ｐ５３によって認識される特異的配列を含んでいる（Ｗ．Ｓ．Ｅ１−Ｄｅｉｒｙ、“Ｃｅｌｌ”、第７５巻、（１９９３年）、８１７頁）：ＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＴＴＧＴＡＣＡＡＣＴＴＣＧＡＤ１．３：本発明のハイブリッド分子によるＷＡＦ−ＲＥ二本鎖配列の認識本発明のハイブリッド分子によるＷＡＦ−ＲＥ二本鎖配列の特異的認識を証明するために、ゲル上での遅延実験を、下記原理に基づいて実施した。ＤＮＡ結合反応は、前の実施例に従って調製されたＷＡＦ−ＲＥ配列（２．４×１０^-9Ｍ）、非特異的結合を排除するために用いられる冷競合体オリゴヌクレオチドＡＰ２（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）１．２×１０^-6Ｍ、及び野生型ｐ５３の存在下又は不存在下に試験されるハイブリッド分子３０ｎｇの添加によって、反応媒体（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２０ｍＭｐＨ７．５、５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０５ｍＭＺｎＣｌ₂、５ｍＭジチオトレイトール、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、１０％グリセロール、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．１ＭＮａＣｌ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μ ｇ／ｍｌＥ−６４、２μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌペプスタチン）２５μｌ中で実施される。この野生型ｐ５３は、３００ｎｇの抗体ｐＡｂ４２１によるＤＮＡへの特異的結合活性を得るために、活性化されてもよい（Ｔ．Ｒ．Ｈｕｐｐ、“Ｃｅｌｌ”、第７１巻、（１９９２年）、８７５頁）。反応混合物を、氷上で３０分インキュベーションする。最終混合物は、２００Ｖ、１６℃での移動で、４％ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動に付される。ついでこのゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーに付す。野生型ｐ５３と、ＨｉｓＶ３２５との競合を表わすゲル上での遅延試験の結果を図６に示す。この結果は、Ｈｉｓ−Ｖ３２５が、野生型ｐ５３の親和性に匹敵しうる親和性を有するＷＡＦ−ＲＥ二本鎖配列を認識することを示している。ＨｉｓＶ３２５は、野生型ｐ５３を用いて得られたものより速く移動する遅延ゲル中での主要バンドを与えることが分る。これによって、ＨｉｓＶ３２５はダイマー形態で結合することが示される。さらには予期されたとおり、このバンドは、ｐＡｂ４２１の存在によって移動もせず、増幅もしない。最後に、ｐＡｂ４２１の不存在下では、野生型ｐ５３は、Ｖ３２５と比べて少ないＲＥ−ＷＡＦにほとんど結合しない。Ｄ２：トランス活性化機能の評価蛋白質ｐ５３の２つの対立遺伝子に欠陥のあるＳＡＯＳ−２（ヒト骨肉腫）細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ８５）中、及び腫瘍細胞株Ｈ３５８（Ｍａｘｗｅｌｌ＆Ｒｏｔｈ、“Ｏｎｃｏｇｅｎｅ”、第８巻、（１９９３年）、３４２１頁）及びＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）中のｉｎｖｉｖｏでのトランス活性化系において、上記構築物のトランス活性化機能を評価した。この系は、レポーター遺伝子の使用に基づくものであり、この遺伝子は酵素的にアッセイ可能であり、ｐ５３の野生型による特異的認識のためのヌクレオチドユニットを含むプロモーターの支配下に置かれているものである（実験手順参照）。このテストにおいて、レポーター遺伝子は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子であり、ｐ５３による認識配列は、フンク（Ｆｕｎｋ）らによって定義されたコンセンサス配列（ｐ５３ＲＥ）である（“Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．”、第１２巻、（1992年）、２８６６頁）。この機能評価は、３つの異なる型の基準についての野生型蛋白質の機能との比較によって実施された。Ｄ２．１：応答用量におけるトランス活性化活性細胞（３．５×１０⁵）を、熱不活性化牛胎仔血清１０％が加えられた媒体ＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ社）３ｍｌが入っている直径６ｃｍのペトリ皿に植え付け、３７℃でＣＯ₂（５％）を含むインキュベーターで一晩培養する。ついで、下記のようにトランスフェクション剤としてｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ギブコＢＲＬ社）を用いて、種々の構築物をトランスフェクションする：全プラスミド３μｇ（このうちレポータープラスミドは０．５μｇ）を、１０ μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥと共に、３０分間、血清を含まない媒体Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ギブコＢＲＬ社）３ｍｌ（トランスフェクション混合物）を用いてインキュベーションを行なう。この間、細胞をＰＢＳで２回濯ぎ、ついでトランスフェクション混合物と共に、３７℃で４時間インキュベーションする。この後、この混合物は液を吸引され、熱不活性化牛胎仔血清１０％が添加された３ｍｌの媒体ＤＭＥＭと代えられる。ついで細胞を３７℃で４８時間再び成長させる。ＣＡＴ活性のアッセイ手順：トランスフェクションの４８時間後、細胞を一回ＰＢＳで洗浄し、ついでこすって、１００μｌの０．２５ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８中に回収し、３サイクルのエタノール／固体二酸化炭素浴中凍結−融解によって溶解する。このようにして得られた細胞抽出物全体を、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、回収された上澄み液を活性のアッセイに用いる。アッセイは、次の最終組成を有する反応混合物１３０μｌに細胞抽出物２０μｌを加えて実施される： − アセチル−補酵素Ａ０．４ｍＭ − クロラムフェニコール、Ｄ−トレオ− （ジクロロアセチル−１，２−¹⁴Ｃ）２３μＭ(２００ｎＣｉ) − Ｔｒｉｓ０．１８ＭｐＨ８３７℃で１時間のインキュベーション後、反応生成物は、酢酸エチル２５０μ ｌによって抽出される。このうち２０μｌを、シリカプレート上に置き（薄層クロマトグラフィー）、クロロフォルム９５％と、メタノール５％とを含む混合物中で展開する。最後に、このようにして得られたクロマトグラフィープレートは、インスタントイメージャー（ｉｎｓｔａｎｔｉｍａｇｅｒ）（パッカード・インストルメンツ（ＰａｃｋａｒｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社）によって発色される。これによって、種々のアセチル化生成物の割合を計算することができる。この割合は、酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの活性を反映しており、従って種々の構築物のトランス活性化活性を表わしている。図７及び図８に示されている、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＤＮＡ３）の調節下におかれた構築物を有するＳＡＯＳ−２系において得られた結果は、構築物の各々に関して次の特性を示している： − 蛋白質ｐ５３は、用量依存活性を示す。これは、用量が高くなると飽和に向かう（プラスミド１００ｎｇから）。この飽和は、これらの条件下において制限的になるような補因子（ｃｏｆａｃｔｅｕｒ）の必要性を反映しているかもしれない。 − 蛋白質ＡＳは、野生型蛋白質の転写を活性化する能力を保持している。 − 蛋白質Ｖ−３２５、Ｖ−３３６、及びＶ−３４３は、すべて蛋白質ｐ５３のように、トランス活性化活性を有する。この活性については、高い用量でも飽和可能ではないようである。従ってこのような飽和が外見上存在しないので、全体的な活性増加を生じることが可能である。そのほかに、構築物Ｖ−３２５は、この同族体Ｖ−３３６及びＶ−３４３より活性が高いようである。このことは、領域７５−３２５を有するキメラ蛋白質が特に有利であることを示している。これらの特性を確認する目的で、同様の実験を、腫瘍細胞株Ｈ３５８において実施した。この細胞株は、ｐ５３遺伝子の２つの対立遺伝子に欠陥のあるＳＡＯＳ−細胞株２とまったく同様である。この実験においては、各トランスフェクションは、ＣＭＶプロモーターの支配下に置かれた構築物の各々を５０ｎｇ用いて実施された。表１に示された結果は、２つの変異体Ｖ−３２５及びＶ−３３６が、野生型蛋白質ｐ５３の活性と比較して改善されたトランス活性化活性を有することを明白に示している。さらには変異体Ｖ−３２５の活性はより優れている。これらの２つの試験から、本発明の変異体は、改良されたｐ５３特性の少なくとも１つを有することが確認される。この活性差が、発現の差によるものではなく、本発明の変異体の活性の増加によるものであることを証明するために、野生型蛋白質ｐ５３及び変異体Ｖ−３２５、Ｖ−３３６及びＶ−３４３の発現レベルを、ＳＡＯＳ−２細胞において分析した。これを実施するために、先行実験において用いられたプラスミドの各々３ μｇによって細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションの２４時間後と４８時間後に回収する。緩衝液ＰＢＳ（ギブコＢＲＬ社）での２回の洗浄後、ＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）５０μｌ中４℃で１５分間細胞を溶解する。但し、この緩衝液には、２ｍＭＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌＥ６４、２μｇ／ｍｌロイペプチン、及び２μｇ／ｍｌペプスタチンが添加されている。１５０００ｒｐｍでの１５分の遠心分離後、上澄み液を採取し、移動用緩衝液（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）Ｕ．Ｋ、“Ｎａｔｕｒｅ”、第２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年）を添加し、先に記載の手順（レムリＵ．Ｋ、“Ｎａｔｕｒｅ”、第２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年）に従って、２００Ｖで変性用媒体中１０％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に付す。ついで蛋白質を、ＰＶＤＦ膜（ネン・リサーチ・プロダクツ（ＮＥＮＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ）社）上に転写する。この際、製造業者の薦めに従って、半乾燥ＮＯＶＥＸトランスファー装置を用いる。蛋白質は、モノクローン抗体ｐＡｂ２４０（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂ−３）、及びペルオキシダーゼ（ノルディック・イミュノロジー（ＮｏｒｄｉｃＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）社）結合の二次抗体によって、ＥＣＬキット（アマースハム社）を用いて明らかにされる。図９に示されたこの実験の結果は、変異体Ｖ−３２５及びＶ−３３６が、野生型蛋白質ｐ５３のレベルに匹敵しうるレベルで発現したこと、及び変異体Ｖ−３４３が、前記のものよりわすかによく発現しているようであることを示している。さらには２４時間及び４８時間の発現レベルの比較は、各構築物の各々の相対的安定性が類似していることを示しているように見える。従ってこの結果は、本発明の変異体Ｖ−３２５及びＶ−３３６の活性の増加は、発現がよりよくなったからではなく、おそらく変異体Ｖ−３４３とは逆に、増加した転写活性化能によるものであることを示している。次に、本発明の変異体が、野生型ｐ５３の認識要素の調節下に置かれた遺伝子を活性化する能力を確認する目的で、通常は蛋白質ｐ５３によって誘発される遺伝子ｈｄｍ２及びＷＡＦ１の発現を見ることによって、内因性遺伝子の活性化の研究を実施した。この実験は、蛋白質ｐ５３をコードする２つの対立遺伝子に欠陥のある細胞株ＥＢ（結腸がん）において実施された（ショー（Ｓｈａｗ）ら、“ＰＮＡＳ”、第８９巻、（１９９２年）、４４９５頁）。メタロチオネインの誘発性プロモーターの調節下にある蛋白質ｐ５３を発現する安定クローンは、この細胞株（クローンＥＢ−１（ショーら、“ＰＮＡＳ”、第８９巻、（１９９２年）、４４９５頁））から形成された。同様に、メタロチオネインの誘発性プロモーターの調節下にある蛋白質Ｖ−３２５を発現するもう１つの安定クローンは、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位への蛋白質Ｖ−３２５をコードするｃＤＮＡの挿入によって、ベクターｐｍＩＭＴ１ｉ（Ｐ．Ｓｈａｗから得られたもの）から誘導されたプラスミド（ｐｍＩＭＴ１ｉ−Ｖ３２５）を用いて形成された。これを行なうために、ＥＢ細胞（３．５×１０⁵細胞）を、前記手順に従って、１．３μｇのプラスミドｐｍＩＭＴ１ｉ−Ｖ３２５及び２００ｎｇのプラスミドｐｃＤＮＡ３によってトランスフェクションした。ゲネティシン８００μ ｇ／ｍｌを含む媒体中での成長によるトランスフェクション後に、安定クローンを選択した。クローンＥＢ−１における蛋白質ｐ５３の発現と同等のレベルで誘発しうるようにＶ−３２５を発現するクローンが選択された（クローンＥＢ−Ｖ３２５）。クローンＥＢ−１及びクローンＥＢ−Ｖ３２５、並びに親細胞ＥＢ（１０⁶細胞）を、ＺｎＣｌ₂（２００μＭ）処理に付し、異なる時点で細胞抽出を実施し、これらの細胞抽出物を電気泳動に付し、前記のように膜へ転写した。転写された蛋白質は次の３つの異なる抗体によって顕在化された。すなわち用いた抗体は、蛋白質ｐ５３に対するモノクローン抗体ｐＡｂ２４０、及び１つが蛋白質ｈｄｍ２に対する抗体であり、またもう１つが蛋白質ＷＡＦ１に対する抗体である２つのポリクローン抗体である。図１０に示されたこの実験の結果は次のことを示す。すなわち、１）誘発が存在しない場合に細胞ＥＢ、ＥＢ−Ｖ３２５及びＥＢ−１には存在しない蛋白質ｐ５３は、亜鉛処理開始の４時間後からクローンＥＢ−１において発現し、変異体Ｖ−３２５は、同様にクローンＥＢ−Ｖ３２５において発現すること、２）亜鉛処理開始の４時間後、細胞ＥＢにおいて発現が誘発されたように見える蛋白質ＷＡＦ１は、クローンＥＢ−１及びＥＢ−Ｖ３２５においては１６時間まで発現が延長されること、及び３）蛋白質ｈｄｍ２の誘発は、クローンＥＢ−１及びＥＢ−Ｖ３２５においてしか見られず、クローンＥＢ−Ｖ３２５において発現が増加することである。これらの結果から、変異体Ｖ−３２５による転写活性は、通常は野生型蛋白質ｐ５３によって誘発される遺伝子の発現の誘発として現われること、及びこの変異体は、野生型蛋白質ｐ５３に対して生理学的状況において活性が確かに増すことが分る。Ｄ２．２：トランス活性化機能に対する蛋白質Ｅ６（ＨＰＶ１８）の作用用いられる手順は、実施例Ｄ１．１に記載されている手順と同じである。このトランスフェクション実験において、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＤＮＡ３）の調節下に置かれた構築物は、ＳＶ４０プロモーター（ｐＳＶ２）の調節下にＥ６を発現する増加濃度のプラスミドと共に同時トランスフェクションされた。図１１に示されている、ＳＡＯＳ−２細胞株において得られた結果は、構築物の各々に関して次の特性を示す： − ｐ５３の活性は、Ｅ６の濃度の増加につれて減少し、この減少はＥ６によって誘発されたｐ５３の分解を反映している可能性が高い。 − 蛋白質Ｖ−３３６は、Ｅ６への感受性がないことを示す。 − 蛋白質Ｖ−３２５は、Ｅ６によってわずかに活性化されうるようである。蛋白質Ｖ−３２５は、観察されたあらゆる状況において、常にｐ５３より活性が高い。蛋白質Ｅ６に対する挙動のこの差を確認するために、ＨＰＶ１８陽性細胞（ＨeＬa）中にあり、従って蛋白質Ｅ６を発現する構築物Ｖ−３２５及びＶ−３３６のトランス活性化活性をテストし、野生型ｐ５３のこの活性と比較した。前記手順に従って実施されたこのトランスフェクション実験において、種々の構築物をＣＭＶプロモーター（ｐＣＤＮＡ３）の調節下に置いた。図１２に示されている結果は、ある状況下における２つの構築物Ｖ−３２５及びＶ−３３６の非常に明確な転写活性を示している。また、野生型蛋白質ｐ５３はあまり活性が高くない。これらの２つの構築物は、野生型蛋白質とは逆に、Ｅ６に対して感受性がないことを再び示している。蛋白質Ｅ６への感受性がないことが、この蛋白質によって誘発された分解の結果安定性が改善されたことを表わすのかどうかをテストするために、インビトロで分解実験を実施した。この実験において用いた種々の分子は、実施例Ｃ１に記載された分子（ベクターｐｃＤＮＡ３）の、網赤血球の細胞溶解物におけるインビトロ翻訳によって得られた。この際、全体の反応容積５０μｌに対して、供給業者によって記載された実験手順に従って、ＴＮＴＣｏｕｐｌｅｄＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅＳｙｓｔｅｍｓキット（プロメガ社）を用いる。この実験に関して、本発明のハイブリット分子Ｖ−３２５及びＶ−３３６、並びに野生型蛋白質ｐ５３は、³⁵Ｓ−メチオニン（アマーシャム社）４４μＣｉ（１１７５Ｃｉ／ミリモル）の存在下にインビトロ翻訳によって産生されて、放射性標識されたハイブリット分子を生成させる。蛋白質Ｅ６（ＨＰＶ１８）の方は、同じ条件下ではあるが、³⁵Ｓ−メチオニンの不存在下に産生される。ついで放射性標識物質の各々（ｐ５３、Ｖ−３２５、及びＶ−３３６）２μｌを、２μｌの非放射性標識蛋白質Ｅ６及び１０μｌの網赤血球溶解物と共に、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＤＴＴ４０μｌの最終容積中において３０℃でインキュベートする。ついで反応媒体から７．５μｌを採取し、かつ移動用緩衝液（レムリＵ．Ｋ．、“Ｎａｔｕｒｅ”、第２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年）７．５μｌを添加することによって、種々の時点で反応を停止する。このように調製された試料を、前記手順レムリＵ．Ｋ．、“Ｎａｔｕｒｅ”、第２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年）に従って（２００Ｖで変性用媒体中１０％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動に付す。ついでゲルを乾燥し、インスタントイメージャー（ｉｎｓｔａｎｔｉｍａｇｅｒ）（パッカード・インストルメンツ社）によって顕在化する。これによって、反応中に分解されなかった本発明の変異体の量を評価することができる。図１３に示されたこの実験の結果は、変異体Ｖ−３２５及びＶ−３３６が、Ｅ６によって誘発された分解に対して、野生型蛋白質ｐ５３よりはるかに耐性があり、これは分解への耐性の点でも、ここで再び変異体Ｖ−３２５に関してはさらに良好な特性を有することを明白に示している。これらの結果は、先述の実験において（図１１及び１２）転写活性のレベルで観察された、蛋白質Ｅ６への野生型蛋白質ｐ５３と、変異体Ｖ−３２５及びＶ−３３６との感受性の差を確かに反映している。この挙動によって、これら２つの構築物は、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８による感染に関連した病気の治療に対して特に有利な、野生型を超える候補物質となる。Ｄ２．３：トランス活性化機能に対する負の優性ｐ５３突然変異体の作用この実験において、野生型蛋白質ｐ５３に関して発がん優性及び負の優性として記載されている突然変異体Ｈ１７５を用いた。前記手順に従って実施されたこのトランスフェクション実験において、種々の構築物並びに突然変異体Ｈ１７５が、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＤＮＡ３）の調節下に置かれた。これらの構築物の各々は、突然変異体Ｈ１７５を発現する増加濃度のプラスミドで同時トランスフェクションされた。図１４に示された結果は、構築物の各々に関して下記特性を示している： − 蛋白質ｐ５３は、過剰の突然変異型Ｈ１７５の存在下では、そのトランス活性化活性が減少する。このことは確かに生理学的状況に合致している。その理由は、この型の突然変異型は、野生型ｐ５３よりはるかに安定で、従って常に過剰であることが知られているからである。従ってここで、この突然変異体の負の優性作用が測定される。 − 蛋白質ＡＳは、突然変異体Ｈ１７５の負の優性作用に対して増加した感受性を示す。その理由は、ＡＳ蛋白質は該突然変異体のより低い濃度に対し感受性であるからである。 − これに対して、蛋白質Ｖ−３２５及びＶ−３３６は負の優性作用に対してより感受性であるだけでなく、突然変異型Ｈ１７５の存在下に用量依存的にこれらの活性が増しさえする。さらにはこの試験において、蛋白質Ｖ−３２５は、蛋白質Ｖ−３３６に比して効果が増しており、これによって、この蛋白質の方が、野生型を超える可能性がわずかに高いことが確認される。Ｄ２．４：トランス活性化機能に対する蛋白質ｈｄｍ２の作用用いられる手順は、実施例Ｄ１．１に記載されたものと同じである。このトランスフェクション実験において、ＣＭＶプロモーター（ｐｃＤＮＡ３）の調節下に置かれる構築物は、ＣＭＶプロモーター（ｐｃＤＮＡ３）の調節下にｈｄｍ２を発現する増加濃度のプラスミド（断片１−１３４）で同時トランスフェクションされる。図１５に示されたＳＡＯＳ−２細胞株において得られた結果は、構築物の各々について下記特性を示している： − 蛋白質ｐ５３の活性は、ｈｄｍ２の濃度の増加につれて減少するが、このことは確かに生理学的状況に合致している。 − 蛋白質Ｖ−３２５は、ｈｄｍ２によるこの阻害に対して感受性がないようである。この挙動によって、蛋白質Ｖ−３２５は、ｈｄｍ２の過剰発現に関係した病気の治療、より詳しくは蛋白質ｐ５３のＮ−末端領域と相互作用を行なう細胞蛋白質の過剰発現に関連した病気の治療に対して特に有利な野生型を超える候補物質となる。これら４つの実験の結果は、本発明による変異体、特に領域７５−３２５−ｌｚ又は７５−３３６−ｌｚを含む変異体が、次のものを有することを明白に示している。すなわち、１）トランス活性化活性の増加、２）ＨＰＶ１８の蛋白質Ｅ６の作用に対して感受性が小さいこと、３）ｐ５３のいくつかの突然変異体の負の優性作用に対する感受性がないこと、及びこのような状況におけるこの活性の増加、及び４）蛋白質ｈｄｍ２に対する感受性がないことである。これらの種々の特性は、まったく顕著なものであり、意外であり、本発明の変異体に、かなり大きな治療上の利点を与える。Ｄ３：細胞増殖に対する作用細胞増殖への構築物Ｖ−３２５及びＶ−３３６の作用について、ｐ５３と平行してテストを行なった。このテストは、これら３つの蛋白質を発現するプラスミドによるトランスフェクションに続く、ネオマイシン耐性があるコロニーの形成実験において、種々の型の細胞系に対して実施した。前記手順に従って実施されたこのトランスフェクション実験において、種々の構築物がＣＭＶプロモーター（ｐＣＤＮＡ３）の調節下に置かれた。ネオマイシンに耐性があるコロニーの形成手順：トランスフェクションの４８時間後、細胞をこすり取って、直径１０ｃｍのペトリ皿に移し、媒体ＤＭＥＭ１０ｍｌで再び増殖させる。但し、この媒体には、熱不活性化牛胎仔血清１０％が添加されており、これはジェネティシン（Ｇ４１８）４００μｇ／ｍｌを含んでいる。Ｇ４１８の存在下、１５日目を選んで、Ｎｅｏ^Rコロニーの数を、フクシンでの染色後、計数によって測定する。この実験は、種々の細胞型に対して実施された。これらの蛋白質ｐ５３及びＲａｓの状態（ｓｔａｔｕｔ）について表２に示す。（^*）プトナム（Ｐｕｔｎａｍ）ら、“Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．” 第１巻、（１９９３年）、４９頁（^**）オリナー（Ｏｌｉｎｅｒ）ら、“Ｎａｔｕｒｅ”、第３５８巻、（１９９２年）、８０頁これらの実験の結果を表３及び図１６に示す。これらの結果から、構築物Ｖ−３２５及びＶ−３３６は、野生型蛋白質ｐ５３が正常に機能することができる細胞状況（野生型ｐ５３又は二重欠失体）において、野生型蛋白質ｐ５３と少なくとも同程度に細胞増殖を阻止する能力を有するが、特にこれらの構築物は、野生型蛋白質ｐ５３の活性が非常に低い細胞状況（ＨＰＶ１８の蛋白質Ｅ６を発現するＨｅＬａ細胞、及び蛋白質ｈｄｍ２の過剰発現を示すＯｓＡ−ＣＬ細胞）においてでさえこの活性を保持することが分る。この特性は、本発明の変異体にかなり大きい治療上の利点を与える。Ｄ４：本発明の変異体のアポトーシス活性細胞ＥＢ、ＥＢ−１、及びＥＢ−Ｖ３２５、及び前記誘発条件（実施例Ｄ１）を用いて、本発明の変異体のアポトーシス活性を調べた。このようにして誘発された細胞（１０⁶細胞）を、Ｐｅｒｍｅａｆｉｘ（オーソ・ダイアグノスティック・システムズ社（ＯｒｔｈｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．））１ｍｌ中で４０分間のインキュベーションによって、固定し、透過性のあるものにする。ついでこれを２回、緩衝液Ａ（０．５％のツイーン２０が添加されたＰＢＳ（ギブコＢＲＬ社））で洗浄し、その後再懸濁し、室温で１時間、２％ＢＳＡ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）及び１μｇのモノクローン抗体ｐＡｂ２４０が添加された１００μｌの緩衝液Ａ中でインキュベーションする。ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液であらたに２回洗浄した後、細胞を、室温で１時間、同じ緩衝液１００μｌではあるが、フルオレセイン（ＧＡＭ−ＦＩＴＣ（イミュノテック社））結合の第二ポリクローン抗体１μｇが添加された緩衝液の中でインキュベーションする。ついで細胞を２回緩衝液Ａ中で洗浄し、ヨウ化プロピジウム５μｇと、ＲＮａｓｅ（ＤＮａｓｅを含んでいない）１ｍｇを含む同じ緩衝液１ｍｌ中に再懸濁し、室温で３０分間インキュベーションし、その後フローサイトメトリー（ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｅｄｅｆｌｕｘ）で分析した。ＥＢ−１及びＥＢ−Ｖ３２５細胞に対して実施された２４時間及び４８時間の誘発実験の結果を図１７に示す。これらの条件下、野生型蛋白質ｐ５３又はその変異体Ｖ−３２５（抗体ｐＡｂ２４０によって検出されたもの）を発現する細胞は、２４時間の誘発後、大部分がＧ１及びサブＧ１期（アポトーシス）に分布し、ついで４８時間後は主としてサブＧ１期に分布している。これらの結果は、蛋白質Ｖ−３２５が、野生型蛋白質ｐ５３とまったく同様にアポトーシスを誘発しうることを明白に示している。図１８に示されているＥＢ細胞並びにＥＢ−１及びＥＢ−Ｖ３２５クローンに対して実施された動力学的誘発実験の結果から、変異体Ｖ−３２５は、野生型蛋白質ｐ５３より迅速かつ大量にアポトーシスを誘発するらしいことが分る。これら２つの蛋白質は、これらのクローンで同等のレベルで発現するらしいという事実を考慮すると（§Ｄ１参照）、この結果は、野生型蛋白質ｐ５３の活性に比べて変異体Ｖ−３２５の活性の方が改良されているという考え方を強固なものにする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１０月２９日【補正内容】請求の範囲１．オリゴマー化領域の一部及び調節領域の全部が欠失し、人工ロイシンジッパー領域によって置換されているｐ５３蛋白質変異体であって、Ｃ−末端部分の欠失が、残基３２６又は残基３３７から行なわれていることを特徴とする前記変異体。２．人工ロイシンジッパー領域が、オリゴマー化の選択性を保証する天然状態では存在しない領域であることを特徴とする、請求項１に記載の変異体。３．ロイシンジッパー領域が、配列番号１の配列を有することを特徴とする、請求項２に記載の変異体。４．ｐ５３蛋白質の１８２位のアルギニン残基が、ヒスチジンによって置換されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の変異体。５．トランス活性化領域の全部又は一部が欠失し且つ異種トランス活性化領域によって置換されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の変異体。６．残基１〜７４の欠失を含むことを特徴とする、請求項５に記載の変異体。７．異種トランス活性化領域が、ＶＰ１６のトランス活性化領域であることを特徴とする、請求項５又は６に記載の変異体。８．トランス活性化領域が、配列番号２の配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載の変異体。９．異種トランス活性化領域が、トランスフォームされた細胞に特異的なトランス活性化領域であることを特徴とする、請求項５又は６に記載の変異体。１０．トランス活性化領域が、トランスフォームされた細胞中に存在するトランス活性化物質又はトランス活性化複合体を選択的に結合しうる蛋白質領域から成ることを特徴とする、請求項９に記載の変異体。１１．トランスフォームされた細胞中において優先的に活性なｐ５３蛋白質変異体であって、ｐ５３の機能領域の少なくとも１つが、完全に又は部分的に欠失し且つトランスフォームされた細胞中において優先的に活性な異種領域によって置換されている、前記変異体。１２．欠失かつ置換されたｐ５３の機能領域が、トランス活性化領域であることを特徴とする、請求項１１に記載の変異体。１３．発がん性ｒａｓ蛋白質又はｐ５３突然変異体を含む細胞中において優先的に活性なトランス活性化領域を含む、請求項１２に記載の変異体。１４．トランス活性化領域が、トランスフォームされた細胞中に存在するトランス活性化物質又はトランス活性化複合体を選択的に結合しうる蛋白質領域であることを特徴とする、請求項１３に記載の変異体。１５．蛋白質領域が、抗体の断片又は誘導体、好ましくはＦａｂ又はＳｃＦｖを含んでいることを特徴とする、請求項１４に記載の変異体。１６．蛋白質領域が、ｐ５３蛋白質の突然変異体に対するＳｃＦｖを含んでいることを特徴とする、請求項１５に記載の変異体。１７．天然トランス活性化領域が、残基１〜７４の除去によって欠失していることを特徴とする、請求項１２〜１６のいずれかに記載の変異体。１８．配列番号３（ＡＳ）に融合された、残基３６６からのＣ−末端部分の欠失を含むｐ５３蛋白質変異体。１９．トランス活性化領域の全部又は一部が欠失し且つ異種トランス活性化領域によって置換されていることを特徴とする、請求項１８に記載の変異体。２０．ｐ５３蛋白質の１８２位のアルギニン残基が、ヒスチジンによって置換されていることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の変異体。２１．トランス活性化領域、ＤＮＡ結合領域、核中に指向するための領域、及びオリゴマー化領域を含むキメラ蛋白質であって、前記ＤＮＡ結合領域及び核中に指向するための領域が、ヒト野生型ｐ５３蛋白質のアミノ酸７５〜３２５（配列番号４）から成ることを特徴とする前記キメラ蛋白質。２２．トランス活性化領域、ＤＮＡ結合領域、核中に指向するための領域、及びオリゴマー化領域を含むキメラ蛋白質であって、前記ＤＮＡ結合領域及び核中に指向するための領域が、ヒト野生型ｐ５３蛋白質のアミノ酸７５〜３３６（配列番号５）から成ることを特徴とする前記キメラ蛋白質。２３．ｐ５３蛋白質の１８２位のアルギニン残基が、ヒスチジンによって置換されていることを特徴とする、請求項２１又は２２に記載のキメラ蛋白質。２４．トランス活性化領域が、ＶＰ１６のトランス活性化領域から成ることを特徴とする、請求項２１〜２３のいずれかに記載のキメラ蛋白質。２５．トランス活性化領域が、トランスフォームされた細胞中に存在するトランス活性化物質又はトランス活性化複合体を選択的に結合しうる蛋白質領域から成ることを特徴とする、請求項２１〜２４のいずれかに記載のキメラ蛋白質。２６．オリゴマー化領域は、人工ロイシンジッパーから成ることを特徴とする、請求項２１〜２５のいずれかに記載のキメラ蛋白質。２７．配列番号２５の配列の化合物Ｖ−３２５、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−３２５Ｈ。２８．配列番号２６の配列の化合物Ｖ−３３６、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−３３６Ｈ。２９．配列番号２７の配列の化合物Ｖ−３６７、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−３６７Ｈ。３０．配列番号２８の配列の化合物Ｖ−ＡＳ、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−ＡＳＨ。３１．配列番号２９の配列の化合物Ｖ−３９３、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−３９３Ｈ。３２．配列番号３０の配列の化合物Ｖ−３４３、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−３４３Ｈ。３３．配列番号３１の配列の化合物Ｓ−３２５、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｓ−３２５Ｈ。３４．配列番号３２の配列の化合物３９３−３２５、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体３９３−３２５Ｈ。３５．配列番号３３の配列の化合物３６０−３２５、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体３６０−３２５Ｈ。３６．配列番号３４の配列の化合物３６０ｈ−３２５、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体３６０ｈ−３２５Ｈ。３７．請求項１〜３６のいずれかに記載の変異体又はキメラ蛋白質をコードする核酸。３８．ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又は合成もしくは半合成の核酸であることを特徴とする、請求項３７に記載の核酸。３９．配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３及び３４の配列の核酸のうちから選ばれることを特徴とする、請求項３７に記載の核酸。４０．請求項３７に記載の核酸、その発現を可能にするプロモーター、及び転写終結シグナルを含む発現カセット。４１．請求項３７に記載の核酸又は請求項４０に記載のカセットを含むベクター。４２．ウイルスベクターであることを特徴とする、請求項４１に記載のベクター。４３．欠陥組み換えアデノウイルスであることを特徴とする、請求項４２に記載のベクター。４４．欠陥組み換えレトロウイルスであることを特徴とする、請求項４２に記載のベクター。４５．欠陥組み換えＡＡＶであることを特徴とする、請求項４２に記載のベクター。４６．欠陥組み換えＨＳＶであることを特徴とする、請求項４２に記載のベクター。４７．化学又は生化学ベクターであることを特徴とする、請求項４１に記載のベクター。４８．請求項３２〜４７のいずれかに記載の核酸及び／又はベクターを含む医薬組成物。４９．請求項１〜３６のいずれかに記載の変異体又はキメラ蛋白質を含む医薬組成物。５０．過増殖性障害の治療のための、請求項４８又は４９に記載の医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．オリゴマー化領域の全部又は一部が欠失し且つ人工ロイシンジッパー領域によって置換されている、ｐ５３蛋白質の変異体。２．前記欠失には、調節領域の全部又は一部も含まれることを特徴とする、請求項１に記載の変異体。３．残基３２６からのＣ−末端部分の欠失を含んでいることを特徴とする、請求項２に記載の変異体。４．残基３３７からのＣ−末端部分の欠失を含んでいることを特徴とする、請求項２に記載の変異体。５．人工ロイシンジッパー領域が、オリゴマー化の選択性を保証する天然状態では存在しない領域であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の変異体。６．ロイシンジッパー領域が、配列番号１の配列を有することを特徴とする、請求項５に記載の変異体。７．ｐ５３蛋白質の１８２位のアルギニン残基が、ヒスチジンによって置換されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の変異体。８．トランス活性化領域の全部又は一部が欠失し且つ異種トランス活性化領域によって置換されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の変異体。９．残基１〜７４の欠失を含むことを特徴とする、請求項８に記載の変異体。１０．異種トランス活性化領域が、ＶＰ１６のトランス活性化領域であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の変異体。１１．トランス活性化領域が、配列番号２の配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の変異体。１２．異種トランス活性化領域が、トランスフォームされた細胞に特異的なトランス活性化領域であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の変異体。１３．トランス活性化領域が、トランスフォームされた細胞中に存在するトランス活性化物質又はトランス活性化複合体を選択的に結合しうる蛋白質領域から成ることを特徴とする、請求項１２に記載の変異体。１４．トランスフォームされた細胞中において優先的に活性なｐ５３蛋白質変異体であって、ｐ５３の機能領域の少なくとも１つが、完全に又は部分的に欠失し且つトランスフォームされた細胞中において優先的に活性な異種領域によって置換されている、前記変異体。１５．欠失かつ置換されたｐ５３の機能領域が、トランス活性化領域であることを特徴とする、請求項１４に記載の変異体。１６．発がん性ｒａｓ蛋白質又はｐ５３突然変異体を含む細胞中において優先的に活性なトランス活性化領域を含む、請求項１５に記載の変異体。１７．トランス活性化領域が、トランスフォームされた細胞中に存在するトランス活性化物質又はトランス活性化複合体を選択的に結合しうる蛋白質領域であることを特徴とする、請求項１６に記載の変異体。１８．蛋白質領域が、抗体の断片又は誘導体、好ましくはＦａｂ又はＳｃＦｖを含んでいることを特徴とする、請求項１７に記載の変異体。１９．領域が、ｐ５３蛋白質の突然変異体に対するＳｃＦｖを含んでいることを特徴とする、請求項１８に記載の変異体。２０．天然トランス活性化領域が、残基１〜７４の除去によって欠失されていることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれかに記載の変異体。２１．配列番号３（ＡＳ）に融合された、残基３６６からのＣ−末端部分の欠失を含むｐ５３蛋白質変異体。２２．トランス活性化領域の全部又は一部が欠失し且つ異種トランス活性化領域によって置換されていることを特徴とする、請求項２１に記載の変異体。２３．ｐ５３蛋白質の１８２位のアルギニン残基が、ヒスチジンによって置換されていることを特徴とする、請求項２１又は２２に記載の変異体。２４．トランス活性化領域、ＤＮＡ結合領域、核中に指向するための領域、及びオリゴマー化領域を含むキメラ蛋白質であって、前記ＤＮＡ結合領域及び核中に指向するための領域が、ヒト野生型ｐ５３蛋白質のアミノ酸７５〜３２５（配列番号４）から成ることを特徴とする前記キメラ蛋白質。２５．トランス活性化領域、ＤＮＡ結合領域、核中に指向するための領域、及びオリゴマー化領域を含むキメラ蛋白質であって、前記ＤＮＡ結合領域及び核中に指向するための領域が、ヒト野生型ｐ５３蛋白質のアミノ酸７５〜３３６（配列番号５）から成ることを特徴とする前記キメラ蛋白質。２６．ｐ５３蛋白質の１８２位のアルギニン残基が、ヒスチジンによって置換されていることを特徴とする、請求項２４又は２５に記載のキメラ蛋白質。２７．トランス活性化領域が、ＶＰ１６のトランス活性化領域から成ることを特徴とする、請求項２４〜２６のいずれかに記載のキメラ蛋白質。２８．トランス活性化領域が、トランスフォームされた細胞中に存在するトランス活性化物質又はトランス活性化複合体を選択的に結合しうる蛋白質領域から成ることを特徴とする、請求項２４〜２７のいずれかに記載のキメラ蛋白質。２９．オリゴマー化領域は、人工ロイシンジッパーから成ることを特徴とする、請求項２４〜２８のいずれかに記載のキメラ蛋白質。３０．配列番号２５の配列の化合物Ｖ−３２５、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−３２５Ｈ。３１．配列番号２６の配列の化合物Ｖ−３３６、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−３３６Ｈ。３２．配列番号２７の配列の化合物Ｖ−３６７、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−３６７Ｈ。３３．配列番号２８の配列の化合物Ｖ−ＡＳ、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−ＡＳＨ。３４．配列番号２９の配列の化合物Ｖ−３９３、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−３９３Ｈ。３５．配列番号３０の配列の化合物Ｖ−３４３、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｖ−３４３Ｈ。３６．配列番号３１の配列の化合物Ｓ−３２５、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体Ｓ−３２５Ｈ。３７．配列番号３２の配列の化合物３９３−３２５、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体３９３−３２５Ｈ。３８．配列番号３３の配列の化合物３６０−３２５、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体３６０−３２５Ｈ。３９．配列番号３４の配列の化合物３６０ｈ−３２５、又はｐ５３の１８２位にヒスチジンを含むその変異体３６０ｈ−３２５Ｈ。４０．請求項１〜３９のいずれかに記載の変異体又はキメラ蛋白質をコードする核酸。４１．ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又は合成もしくは半合成の核酸であることを特徴とする、請求項４０に記載の核酸。４２．配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３及び３４の配列の核酸のうちから選ばれることを特徴とする、請求項４０に記載の核酸。４３．請求項４０に記載の核酸、その発現を可能にするプロモーター、及び転写終結シグナルを含む発現カセット。４４．請求項４０に記載の核酸又は請求項４３に記載のカセットを含むベクター。４５．ウイルスベクターであることを特徴とする、請求項４４に記載のベクター。４６．欠陥組み換えアデノウイルスであることを特徴とする、請求項４５に記載のベクター。４７．欠陥組み換えレトロウイルスであることを特徴とする、請求項４５に記載のベクター。４８．欠陥組み換えＡＡＶであることを特徴とする、請求項４５に記載のベクター。４９．欠陥組み換えＨＳＶであることを特徴とする、請求項４５に記載のベクター。５０．化学又は生化学ベクターであることを特徴とする、請求項４４に記載のベクター。５１．請求項３５〜５０のいずれかに記載の核酸及び／又はベクターを含む医薬組成物。５２．請求項１〜３９のいずれかに記載の変異体又はキメラ蛋白質を含む医薬組成物。５３．過増殖性障害の治療のための、請求項５１又は５２に記載の医薬組成物。