CZ296185B6 - Varianty proteinu p53 a jejich terapeutické pouzití - Google Patents

Varianty proteinu p53 a jejich terapeutické pouzití Download PDF

Info

Publication number
CZ296185B6
CZ296185B6 CZ0014498A CZ14498A CZ296185B6 CZ 296185 B6 CZ296185 B6 CZ 296185B6 CZ 0014498 A CZ0014498 A CZ 0014498A CZ 14498 A CZ14498 A CZ 14498A CZ 296185 B6 CZ296185 B6 CZ 296185B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
leu
lys
seq
domain
Prior art date
Application number
CZ0014498A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ14498A3 (cs
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of CZ14498A3 publication Critical patent/CZ14498A3/cs
Publication of CZ296185B6 publication Critical patent/CZ296185B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Resení poskytuje varianty proteinu p53, mající antiproliferativní nebo apoptotickou aktivitu, kde cást oligomerizacní domény a také regulátorové domény jsou deletovány a nahrazeny umelou doménou leucinového zipu, celá transaktivacní doména nebo jejícást je deletována a nahrazena heterologní transaktivacní doménou VP16. Dále se týká nukleových kyselin, které kódují varianty p53, a farmaceutickýchprípravku, které obsahují varianty p53 nebo odpovídající nukleovou kyselinu. Farmaceutické prípravky jsou urceny k lécení nemocí spojených s hyperproliferací, zejména genovou terapií.

Description

Varianty proteinu p53 a jejich terapeutické použití
Oblast techniky
Předložený vynález se týká proteinů odvozených od produktu supresorového genu nádorů p53, které mají zlepšené funkce vzhledem k terapeutickému použití. Výhodně se také týká proteinů, které mají supresorové funkce nádorů a funkce induktoru programované buněčné smrti, které vynikají nad funkcemi proteinu p53 divokého typu, zejména v patologických souvislostech proliferace, ve kterých protein p53 divokého typu je neaktivní. Týká se zejména nukleových kyselin kódujících tyto molekuly, vektorů je obsahující a jejich terapeutického použití, zejména v genové terapii. Produkty podle vynálezu jsou přizpůsobeny zvláště opravě funkcí p53 v patologických souvislostech zejména rakovinových.
Dosavadní stav techniky
Divoký protein p53 zasahuje do regulace buněčného cyklu a do udržování celistvosti genomu buňky. Tento protein, jehož základní funkce je být aktivátorem transkripce určitých genů, je schopný procesy ne ještě dobře definovanými blokovat buňku ve fázi G1 buněčného cyklu, tedy objevit mutace v průběhu replikace genomu a spustit určitý počet oprav DNA. V případě špatného fungování procesů oprav nebo v případě objevení velkého počtu mutačních dějů je tento protein schopen indukovat fenomén programované buněčné smrti, nazvané apoptóza.
Takovýmto způsobem protein p53 jedná jako nádorový supresor při vyloučení nepravidelně rozdělených buněk nebo buněk, jejichž genom byl poškozen.
Tato hlavní funkce proteinu p53 závisí na funkci faktoru transkripce, jinými slovy závisí na dvou schopnostech rozpoznávat specifické sekvence na úrovni genomické DNA a získávat všeobecné vybavení transkripce.
Protein p53 obsahuje 393 aminokyselin, které definují pět funkčních domén (viz Obrázek 1):
- aktivační doména transkripce, tvořená aminokyselinami 1 až 73, schopná vázat určité faktory všeobecné vybavení transkripce jako protein TBP. Tato doména je také sídlem určitého počtu posttranslačních modifikací. Je také místem počtu interakcí proteinu p53 s počtem jiných proteinů, zejména s buněčným proteinem mdm2 nebo proteinem EBNA5 viru Epstem-Barr (EBV), schopných blokovat funkci divokého proteinu. Tato doména má sekvenci aminokyselin nazvaných PĚST citlivých k proteolytické degradaci.
- DNA vazebná doména, umístěná mezi aminokyselinami 73 až 315. Konformace této centrální domény proteinu p53 řídí rozpoznání specifických sekvencí DNA proteinu p53. Tato doména je sídlem dvou typů změn určujících funkci divokého proteinu:
(i) interakce s proteiny blokujícími funkci proteinu p53 jako antigen velké Τ' viru SV40 nebo virovými proteiny E6 virů HPVI6 a HPVIB schopných vyvolat svou degradaci ubikvitinovým systémem. Tato posledně zmíněná interakce může být provedena jenom v přítomnosti buněčného proteinu EPap (enzym E3 ubikvidinové kaskády).
(ii) bodové mutace, které určují funkci proteinu p53 a jako jakýsi celek jsou umístěny v této oblasti.
- signál nukleární lokalizace, tvořený aminokyselinami 315 až 325, nepostradatelný ke správnému rozpoznání proteinu v místě, kde bude vykonávat svou základní funkci.
- oblast oligomerizace, tvořená aminokyselinami 325 až 355. Tato oblast 325 až 355 tvoří strukturu typu: β skládaného listu (326 až 334) - zlom (335 až 336) - a helix a (337 až 355).
-1 CZ 296185 B6
Změny funkcí umístěných v této oblasti jsou zejména způsobeny interakcí divokého proteinu s různými mutovanými formami, které mihou vést k různým vlivům na funkci divokého proteinu.
- doména regulace, tvořená aminokyselinami 356 až 393 je místem určitého počtu modifikací posttranslačních (glykolizace, fosforylace, fixace RNA...), které modulují funkci proteinu p53 pozitivním nebo negativním způsobem. Tato doména hraje velmi důležitou roli v modulaci aktivity divokého proteinu.
Funkce proteinu p53 může být narušena různými způsoby.
- blokace jeho funkce určitým počtem faktorů například antigenem velké Τ' viru SV40, proteinem EBNA5 viru Epstein-Barr nebo buněčným proteinem mdm2.
- destabilizace proteinu zvětšením jeho citlivosti k proteolýze, zejména interakcí s proteinem E6 viru lidského papílomu HPV16 a HPV18, který podporuje vstup proteinu p53 do ubikvidinového cyklu. V případě interakce mezi těmito dvěma proteiny může se provést destabilizace jen předběžnou fixací buněčného proteinu, proteinu E6ap, jehož místo fixace je špatně známé.
- bodové mutace na úrovni genu proteinu p53
- delece jedné nebo dvou alel proteinu p53
Poslední dva typy modifikací jsou nalezeny asi v 50 % různých typů rakoviny. Po této stránce mutace genu proteinu p53 zapsané v rakovinných buňkách zasahují velkou část genu kódujícího tento protein a mají za následek různé mutace funkcí tohoto proteinu. Může se uvést, že tyto mutace jsou z velké části umístěny v centrální části proteinu p53, u něhož se ví, že to je oblast kontaktu se specifickou genomickou sekvencí proteinu p53.
To vysvětluje, proč většina mutací proteinu p53 nemá jako základní charakteristiku možnost se fixovat k sekvencím kyseliny DNA, která rozpozná divoký protein a také možnost vyvolat svou roli transkripčního faktoru. Jinak se zdá, že určité mutace mají zkušenosti nových funkcí takových, jako je aktivace určitých genů na úrovni transkripce.
Soubor těchto modifikací se dělí v současné době do třech kategorií.
- mutace řečené slabé, jejichž produkt je nefunkční protein, který v případě mutace na jedné ze dvou alel, neuděluje funkci divokého proteinu kódovaného druhou alelou. Zástupci uvedené v této kategorii jsou mutanty H273 a W248, tento posledně uvedený mutant je specifický rodinnému syndromu Li-Fraumeni hypersenzibility k rakovinným chorobám
- dominantní negativní mutace, jejichž produktem je nefunkční protein, který v případě mutace na jedné ze dvou alel interakcí s divokým proteinem je schopný blokovat funkci tohoto proteinu tvorbou směsí neaktivních oligomerů, které se již nemohou fixovat k sekvenci specifické DNA divokého proteinu. Zástupce představující tuto kategorii je mutant G281.
- dominantní onkogenní mutace, jejichž produktem je protein, který je schopný jednak blokovat funkci divokého proteinu jako je mutace předchozí kategorie, a jednak podporovat špatně známými mechanizmy nádorový vývoj, představující tak zesílení funkce. Zástupce představující tuto kategorii je mutant H175.
Divoký gen p53 byl použit v terapeutických genových a buněčných přístupech vzhledem k jeho antinádorovým a apoptickým vlastnostem a k jeho implikaci do počtu patologií hyperproliferativního typu. Bylo také navrženo léčit určité hyperproliferativní patologie, zejména rakoviny, podáváním in vivo divokého genu p53, obnovou funkcí proteinu p53. Podávání může být provedeno především prostřednictvím virových vektorů, zejména adenovirů (WO94/24297) nebo adenovirů (W094/06910).
Bylo také prokázáno, že vložení nukleové kyseliny kódující divoký protein p53 umožňuje opravit částečně normální regulaci buněčného růstu. Jestli tyto výsledky budou povzbudivé, účinnost takovéhoto přístupu bude omezena terapeutickou účinností proteinu p53 po přenosu a expresi in
-2 CZ 296185 B6 vivo v hyperproliterativních buňkách. Patologické hyperproliferativní stavy takové, jako jsou rakoviny pocházejí z poruch rovnováhy, která se ustaví v negativních nebo pozitivních regulátorech buněčného růstu. Inaktivace negativního regulátoru provedená divokým proteinem p53, objevením dominantního negativního mutantu p53 od jedné ze dvou alel a zvýšená suprese buněčného proteinu inaktivujícího p53 jako například mdm2, viz přítomnost virového inaktivátoru následovaného infekcí, tvoří nepříznivou spojitost pro terapii založenou na reintrodukci divokého proteinu p53, který silně riskuje, že bude také inaktivován.
Je tedy obzvláště důležité upravit proteiny typu p53, které mají rozšířené terapeutické vlastnosti. Zejména bude obzvláště podstatně výhodné upravit aktivní molekuly p53, aby byly necitlivé k vlivu inaktivátorů dominantních negativních mutantů a onkogenních mutantů, jiných buněčných proteinů nebo virových proteinů například E6 HPV18 a HPV16, MDM2, EBNA5 EBV atd. vyskytujících se v nádorových buňkách.
Jisté modifikace proteinu p53 byly popsány ve vedlejších oborech. Také přihláška vynálezu WO95/06661 popisuje modifikace určitých reziduí homologové oblasti proteinu p53, zejména v oblastech 343-351, 372-380 a 381-393. Tyto modifikace jsou druhořadé a nedovolují výsledným produktům, aby unikly mechanizmu inaktivace proteinu p53 in vivo. Tyto proteiny vykazují zvýšenou aktivitu vzhledem k divokému proteinu p53.
Hupp at al. (Cell Vol 71 (1992) 875) popsali derivát proteinu p53 obsahující deleci 30 rezidui Ckonce (p53AC-ter30). Tentokrát, jestliže tento protein zachovává schopnost vázat DNA, jeho apoptické vlastnosti nejsou prokázány. Není rezistentní k inaktivaci dominantními negativními mutanty.
Pietenpol et al. (PNAS 91 (1994) 1998) popsali chimémí molekuly odvozené od proteinu p53, zejména proteinu VP16-p53 (80-343) -GCN4. Tato molekula má schopnost vázat DNA a schopnost transfekce jasně sníženou vzhledem k divokému proteinu p53 (40 %). Jinak má oblast neselektivní oligomerizace, riskující interakci s jinými buněčnými sloučeninami, a tak riskuje indukci nespecifické buněčné odpovědi. Vlastnosti rezistence k inaktivačnímu mechanizmu nejsou indikovány.
Podstata vynálezu
Předložený vynález popisuje nové varianty proteinu p53, které mají zlepšené terapeutické vlastnosti. Popisuje zejména varianty přizpůsobené terapeutickému genovému použití, zejména protirakovinovému. Varianty podle vynálezu odvozené od proteinu p53 strukturní modifikací nebo strukturními modifikacemi zachovávají aktivitu typu p53 a exprimované v hyperproliferativních buňkách předkládají alespoň jednu vlastnost zlepšenou vzhledem k proteinu p53. Může se jednat zejména o antiproliferativní aktivitu nebo/a apoptickou aktivitu. Varianty podle vynálezu mají výhodně antiproliferativní vlastnost nebo/a apoptickou vlastnost, buď specifičtější hyperproliferativním buňkám nebo méně citlivé k různým změnám, kterým je podrobený divoký proten p53.
První předmět vynálezu se týká zejména varianty proteinu p53, ve které celek nebo část oblasti oligomerizace je deletována a nahrazena umělou oblastí leucinového zipu. Jak je již naznačeno, protein p53 je inaktivován jistými mutanty, zejména dominantními negativními mutanty a onkogenními mutanty, které se vyskytují v nádorové buňce. Tato inaktivace je výsledkem tvorby směsi neaktivních oligomerů interakcí mezi divokým proteinem p53 a mutantem, který se už nemůže fixovat na specifickou sekvenci rozpoznanou divokým proteinem p53. Předložený vynález popisuje nyní varianty proteinu p53 odolné vůči dominantnímu negativnímu vlivu určitých mutací, tudíž popisuje aktivní varianty v buněčné souvislosti představující jednu nebo dvě mutované alely, to je případ více než 90 % lidských rakovin p53.
-3 CZ 296185 B6
Ve variantách podle vynálezu celek nebo část přírodní domény oligomerizace proteinu, který nedělá rozdílnost mezi divokými formami a mutanty, je nahrazen ekvivalentní doménou mající schopnost specifické oligomerizace. Tato modifikace je provedena za použití umělého leucinového zipu optimalizovaného pro tvorbu dimerů. Molekuly podle vynálezu obsahující takový umělý leucinový zip jsou zejména výhodné, protože tvoří oligomery jedině s dalšími molekulami nesoucími stejný leucinový zip. Netvoří tak oligomery s dominantními negativními mutanty nebo onkogenními mutanty proteinu p53 schopnými je inaktivovat. Netvoří ani oligomery s dalšími buněčnými proteiny nesoucími doménu oligomerizace, schopné je tak inaktivovat nebo indukovat nežádoucí vlivy. Mohou tvořit jen homooligomery, mají tak důležitou selektivitu zajišťující lepší aktivitu v souvislosti s hyperproliferativními patologiemi.
Podle předloženého vynálezu umělá doména leucinového zipu je tak výhodně doménou nepřítomnou v přírodním stavu zajišťující oligomerizační selektivitu. Doména oligomerizace je reprezentovaná sekvencí SEQ ID n°l.
V upřednostněném způsobu provedení vynálezu varianty zahrnují deleci celku nebo části domény oligomerizace a celku nebo části regulační domény. Jak je již dříve naznačeno, doména oligomerizace je umístěna mezi rezidui 325-355 včetně a regulační doména mezi rezidui 365-393 včetně. Tento typ varianty je docela výhodný, protože je úplně nebo částečně bez účinků negativní regulace provedené prostřednictvím části C-konce (aa 365-393). Tyto varianty tvoří proteiny potencionálně podstatně aktivní, představující aktivitu nemodulovatelnou a případně zvětšenou. Oblast regulace je úplně výhodně zrušena. Upřednostněné varianty podle vynálezu zahrnují deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 326 nebo 337.
Příklady zprostředkovatelů použitých pro konstrukci těchto variant jsou zejména:
- pEC10+7 (75—325—Iz) mající deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 326 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l.
- pECllO (75—336—Iz) mající deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 337 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n° 1.
Podle způsobu provedení je výhodně ve variantách podle vynálezu cystein v pozici 182 proteinu p53 nahrazen histidinem. Tato mutace dovoluje výhodně zvýšit afinitu varianty pro specifické nukleotidové sekvence vázání. Vložení této doplňkové modifikace dovoluje tedy získat molekulu mající větší transaktivační potenciál.
Přesné příklady konstrukcí tvořených pro přípravu variant podle vynálezu kombinující tyto různé modifikace jsou zejména:
- pEC139 (75-325 (H182) -Iz) mající deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 336 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l a histidinem v poloze 182.
- pEC140 (75-336 (H182) -Iz) mající deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 337 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l a histidinem v poloze 182.
Výhodně je ve variantách podle vynálezu celek nebo část transaktivační domény deletován a nahrazen heterologní transaktivační doménou. Již dříve bylo naznačeno, že transaktivační funkce proteinu p53 jsou podstatné pro svou supresorovou aktivitu nádoru nebo induktoru apoptozy. Aby se zvýšil terapeutický potenciál variant podle vynálezu je zejména výhodné nahradit přírodní transaktivační doménu heterologní transaktivační doménou. Tyto varianty mají také počet nevýhod. Mají, jak se dalo očekávat, vysokou transaktivační aktivitu. Ale jsou také bez citlivosti k vlivům negativní regulace vykonanou prostředníkem části N-konce (aa 1-73). Vskutku tato oblast obsahuje sekvenci PĚST odpovědnou za svou proteolytickou degradaci. Substituce této oblasti heterologní transaktivační doménou bez sekvencí PĚST dovoluje snížit tuto negativní regulaci. Tyto varianty jsou také charakterizovány snížením, dokonce i suprese, každé interakce s
-4CZ 296185 B6 proteinem E6 viru lidského palindromu (HPV), který je schopný indukovat jejich degradaci. Jsou také méně citlivé k interakcím s dalšími buněčnými proteiny takovými, jako jsou MDM2 a EBNA, které určují aktivitu divokého proteinu p53. Varianty takto získané mají tak zvýšenou stabilitu. Suprese citlivých oblastí k negativní regulaci (regulační a transaktivační doména) zejména způsobuje to, že molekuly, které už nejsou cílem proteinů indukujících jejich proteolýzu nebo jejich inaktivaci.
Výhodně je ve variantách podle vynálezu transaktivační doména odstraněna delecí reziduí 1 až 74. Přechodné konstrukce použité pro realizaci takových molekul jsou zejména pEC107 (75325-Iz), pECl 10 (75-336-Iz), pEC139 (75-325 (H182)-Iz) a pECI40 (75-336 (H182)-Iz).
Podle prvního způsobu realizace heterologní transaktivační doména je transaktivační doména VP16. Je výhodně složená z reziduí 411 až 490 V916, jejichž sekvence je dána SEQ ID n°2. Přesné příklady variant podle vynálezu kombinující tyto různé modifikace jsou zejména:
- pEC114 (VP16-75-325-Iz) mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74, nahrazenou transaktivační doménou VP16 sekvence SEQ ID n°2 a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 326 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l. Úplná sekvence varianty pECl 14 je reprezentována SEQ ID n°25.
- pEC116 (VPI6-75-336-Iz) mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74, nahrazenou transaktivační doménou VPI6 sekvence SEQ ID n°2 a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 337 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l. Úplná sekvence varianty pECl 14 je reprezentována SEQ ID n°26.
- pEC147 (VPI6-75-325 (H182) -Iz) mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74, nahrazenou transaktivační doménou VPI6 sekvence SEQ ID n°2 a deleci části Ckonce proteinu p53 od rezidua 326 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l, a histidin v poloze 182.
- pEC149 (VPI6-75-336 (H182) -Iz) mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74, nahrazenou transaktivační doménou VPI6 sekvence SEQ ID n°2 a deleci části Ckonce proteinu p53 od rezidua 337 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l, a histidin v poloze 182.
Vzhledem k dříve zmíněným modifikacím varianty podle vynálezu mají také vlastnosti vražedné, které vedou k zastavení buněčného cyklu a apoptózy potencionelně zvýšené. Kombinace zmíněných modifikací, zahrnující přítomnost selektivní domény oligomerizace a transaktivační schopnost zvýšenou substitucí původní domény a přítomností histidinu v poloze 182 udělují vskutku variantám podle vynálezu terapeutické potenciály jasně zlepšené. Mimoto varianty podle vynálezu umožňují vyhnout se určitým mutacím (dominantním onkogenním). Zesílení funkce určitých mutací proteinu p53 jsou ještě špatně definovány na úrovni jejích mechanizmů, na úrovni domén proteinu p53. Je tedy silně pravděpodobné, že tyto nové funkce budou záviset na kombinování s určitým partnerskými molekulovými efektory. Eliminace implikovaných domén z těchto interakcí, jejichž transformační vlastnosti byly prokázány ve smyslu popsaných molekul v předložené přihlášce vynálezu, jsou takové povahy, že zabraňují zvýšení onkogenních funkcí. Také mutace, které se objevují náhodným způsobem během přípravy klinických částí plazmidů kódujících popsané polypeptidy nebo během produkce klinických částí virových nebo chemických vektorů kódujících tyto stejné polypeptidy nevytvářejí podpopulaci onkogenních molekul.
Vzhledem k supresi určitých domén proteinu p53 nezbytných pro fixaci určitých inhibičních molekul své funkce, varianty podle vynálezu mají také terapeutickou vyšší a stabilnější aktivitu.
Existence cizích motivů v různých konstrukcích podle vynálezu (např. myší protein AS, umělá doména oligomerizace atd.) je schopná zahájit imunitní reakci během smrti transfektovaných buněk v extracelulárním prostředí těchto různých fragmentů, zvyšujících tak schopnost imunitního systému k boji proti nádorovým buňkám.
-5 CZ 296185 B6
Podle jiného způsobu provedení heterologní transaktivační doména je transaktivační doména aktivní přednostně v transformovaných buňkách a ne ve zdravých příbuzných buňkách. Předložený vynález popisuje vskutku také molekuly jejichž funkce se vyskytuje zejména v transformovaných buňkách a ne ve zdravých příbuzných buňkách. Zdá se, že exprese exogenu divokého proteinu p53 uprostřed buněčného dělení zahrnující endogen divokého proteinu p53 má malý nebo žádný vliv na životaschopnost, je nicméně výhodná možnost upravit protein, který bude nefunkční uprostřed cílové buňky. Tato specifičnost nádorových buněk oproti normálním buňkám je v současné době hodně zpracovaná na úrovni specifičnosti cílového virového vektoru nebo na úrovni koncepce specifického expresního systému. Předložený vynález nyní popisuje deriváty proteinu p53, jehož jedna z funkčních domén je v nepřítomnosti buněčného aktivátoru přítomná, zejména v transformovaných buňkách.
Jiný předmět předloženého vynálezu se týká varianty proteinu p53 aktivní přednostně v transformovaných buněk, ve kterých alespoň jedna z funkčních domén proteinu p53 je deletována celá nebo z části a je nahrazena heterologní doménou aktivní především v transformovaných buňkách. Funkční doména proteinu p53 je doména transaktivační. Předmět zejména upřednostňovaný podle vynálezu se týká varianty proteinu p53 aktivní přednostně v transformovaných buňkách, ve kterých přírodní transaktivační doména je deletována celá nebo z části a je nahrazena transaktivační doménou aktivní především v transformovaných buňkách. Přírodní transaktivační doména je deletována supresí reziduí 1 až 74 včetně proteinu p53.
Předložený vynález se týká zejména variant proteinu p53, které jsou specificky funkční v přítomnosti onkogenního proteinu Ras nebo mutantu proteinu p53. Tyto molekuly jsou získány zejména nahrazením transaktivační domény divokého proteinu p53 proteinovou doménou schopnou specificky vázat transaktivátor nebo transaktivační komplex přítomný v transformované buňce.
Proteinová doména schopná specificky vázat transkripční transaktivátor nebo transkripční transaktivátorový komplex přítomný v molekulách vynálezu může být různého typu. Může se jednat zejména o doménu oligomarizace v případě, kde transaktivátor nebo transaktivační komplex zahrnuje zejména jednu takovou doménu. Může se také jednat o syntetickou doménu nebo známou přírodní doménu, která by interagovala s výše uvedeným transaktivátorem nebo transaaktivačním komplexem. Může se také jednat o protilátky, buď fragment nebo derivát protilátky řízený proti transaktivátoru nebo transaktivačnímu komplexu.
Heterologní doména je tvořena protilátkou, buď fragmentem nebo derivátem protilátky. Fragmenty nebo deriváty protilátek jsou například fragmenty Fab nebo F(ab)'2, oblasti VH nebo VL protilátky nebo také protilátky jednoduchého řetězce (ScFv) obsahující oblast VH vázanou k oblasti VL ramenem. Konstrukce sekvencí nukleových kyselin kódujících takovéto protilátky modifikované podle vynálezu byly popsány například v US 4 946 778 nebo v přihláškách vynálezu W094/02610, WO94/29446.
Upřednostňovaná konstrukce podle vynálezu zahrnuje protilátku ScFv řízenou proti mutantu proteinu p53. Tyto mutanty se objevují v transformovaných buňkách a mají transaktivační doménu. Jejich získávání variantou podle vynálezu tvoří chimémí molekulu aktivní zejména v transformovaných buňkách.
Podle jiného upřednostňovaného způsobu, protilátka ScFV je řízená proti transaktivačnímu komplexu, tudíž komplexu mezi cílovou molekulou přítomnou zvláště v transformovaných buňkách, ale bez transkripční aktivity transaktivátoru (například onkogenní ras) a molekulou nesoucí transaktivační doménu. Tato molekula výhodně zahrnuje transaktivační doménu a doménu selektivně vázanou k výše uvedené buněčné molekule (například ScFv anti-ras). Fixace této molekuly
-6CZ 296185 B6 dovoluje tvorbu binárního transkripčního komplexu transaktivátoru, který vyvolává komplex, který je tedy získán variantou podle vynálezu.
Všechny další typy modifikací vedoucí k těmto specifickým aktivitám mohou být použity v rámci předloženého vynálezu stejně jako každá transaktivační doména specifická pro určitý typ buňky.
Tyto selektivní varianty obsahují výhodně doplňkové modifikace v části C-konce, jak je již naznačeno, pro zlepšení jejich vlastností. Obsahují také výhodně deleci celku nebo části domény oligomerizace, která může být nahrazena celou heterologní doménou oligomerizace. Jedná se především o umělou doménu oligomerizace takovou, jaká je již definována.
Přesné příklady variant podle vynálezu aktivních především v transformovaných buňkách jsou zejména:
- ScFv.antip53*-75-325-Iz mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou doménou schopnou specificky vázat mutant proteinu p53 přítomný v transformované buňce a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 326, substituovanou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l.
- ScFv.antip53 *-75-325 (H182) -Iz obsahující zvláště mutaci His 182.
- ScFv.antip53*-75-336-Iz mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou doménou schopnou specificky vázat mutant proteinu p53 přítomný v transformované buňce a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 337, substituovanou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l.
- ScFv.antip53*-75-336 (H182) -Iz obsahující zvláště mutaci His 182.
- ScFv.antip53*-75-393 mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou doménou schopnou specificky vázat mutant proteinu p53 přítomný v transformované buňce.
- ScFv.antip53*-75-393 (H182) -Iz obsahující zvláště histidin v poloze 182.
ScFv.antip53*-75-367 mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou doménou schopnou specificky vázat mutant proteinu p53 přítomný v transformované buňce a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 368.
- ScFv.antip53*-75-367 (H182) obsahující zvláště histidin v poloze 182.
- ScFv.antip53*-75-AS mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou doménou schopnou specificky vázat mutant proteinu p53 přítomný v transformované buňce a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 367, přidanou k 19 aminokyselin sekvence SEQ ID n°3.
- ScFv.antip53*-75-AS (H182) obsahující zvláště histidin v poloze 182.
Termín aktivní naznačuje, že tyto varianty zkoušejí svou aktivitu zejména až když jsou exprimovány v transformovaných buňkách. Zbytková aktivita může přece jen být v buňkách netransformovaných, ale nižší než v buňkách transformovaných.
Jiný předmět předloženého vynálezu se týká varianty proteinu p53 zahrnující deleci na C-konci od rezidua 367, sloučenou se sekvencí SEQ ID n°3 (AS). Tato sekvence odpovídá 19 posledním aminokyselin produktu alternativnímu myšímu proteinu p53. Tato varianta představuje tedy modifikaci domény oligomerizace založenou na proteinu popsaném u krys jako varianta alternativní divokému proteinu, ve kterém 27 aminokyselin C-konce je nahrazeno 19 různými aminokyselinami. Tato varianta má afinitu pro specifické sekvence vazby k DNA potenciálně zvýšenou.
-7CZ 296185 B6
Tato varianta zahrnuje výhodně modifikace v části N-konce, jak je již naznačeno, pro zlepšení jejích vlastností. Obsahuje výhodně deleci celé nebo části transaktivační domény, která může být nahrazena heterologní transaktivační doménou. Jedná se zejména o transaktivační doménu odvozenou od proteinu VP16 nebo proteinovou doménou schopnou specificky vázat transaktivátor nebo transaktivační komplex přítomný v transformované buňce. Mimoto reziduum 182 proteinu p53 je výhodně nahrazeno histidinem.
Přesné příklady typu variant podle vynálezu jsou zejména:
- ScFv. antip53*-75-AS již dříve popsaná,
- pECI43 (VP16-75-AS) mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou transaktivační doménou VP16 sekvence SEQ ID n°2 a deleci části C-konce od rezidua 367 přidanou k 19 aminokyselinám sekvence SEQ ID n°3. Kompletní sekvence varianty pECI43 je představena SEQ ID n°28.
- ScFv.antip53*-75-AS (H182) již dříve popsaná,
- pEC153 (VP16-75-AS (H182)) odpovídá pECI43 s histidinem v poloze 182.
Podle všeobecnějšího způsobu se vynález týká všech chimérních proteinů zahrnujících transaktivační doménu, doménu DNA vazebnou, jadernou rozpoznávací doménu a doménu oligomerizace, ve kterých DNA vazebné domény a jaderné rozpoznávací domény jsou tvořeny aminokyselinami 75 až 325 lidského divokého proteinu p53 (SEQ ID n°4). Předkladatel vskutku ukázal, že tato oblast proteinu p53 spojená s transaktivační doménami přizpůsobenými doménám oligomerizace umožňuje tvorbu molekul typu p53 mající vlastnosti zejména výhodné v oblasti stability, odolnosti k negativním vlivům mutantů proteinu p53 a citlivosti k inaktivaci různými buněčnými faktory.
Podle varianty DNA vazebná doména a jaderná rozpoznávací doména jsou tvořeny aminokyselinami 75 až 336 divokého lidského proteinu p53 (SEQ ID n°5).
Chimérní proteiny podle předloženého vynálezu mohou zahrnovat různé typy transaktivačních domén. Může se jednat o transaktivační doménu proteinu p53. Může se jednat zejména o heterologní transaktivační doménu vybranou například mezi transaktivační doménou VP16 nebo proteinovou doménou schopnou specificky vázat transaktivátor nebo transaktivační komplex přítomný v transformované buňce.
Co se týče domény oligomerizace, může se jednat především o umělou doménu, tedy specifickou, například umělý leucinový zip, zejména sekvence SEQ ID n°l.
Chimérní proteiny podle předloženého vynálezu mohou mimoto obsahovat histidin v poloze 182.
Přesné příklady chimérních proteinů takových, jaké jsou popsány v předložené přihlášce vynálezu jsou zejména pECl 14, pECl 16, pECI47 a pECI49.
Předložený vynález se týká také každé nukleové kyseliny kódující variantu nebo chimérní protein takových, jaké jsou již definovány.
Nukleová kyselina podle vynálezu může být kyselina ribonukleová (RNA) nebo deoxyribonukleová (DNA). Mimoto se může jednat o komplementární cDNA případně obsahující jeden nebo více intronů genu p53. Může být lidského původu, zvířecího, virového, syntetického nebo semisyntetického. Může být získána různými způsoby, zejména chemickou syntézou za použití sekvencí uvedených v přihlášce vynálezu a například syntetizátorem nukleových kyselin. Může být získána tříděním bank pomocí specifických sond, zejména takových, jaké jsou popsány v přihlášce vynálezu. Může být také získána smíšenými technikami zahrnujícími chemické modifikace (elongace, delece, substituce atd.) tříděných sekvencí z bank. Všeobecným způsobem
-8CZ 296185 B6 mohou být nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu připraveny podle všech odborníky známých technik.
Nukleová kyselina podle předloženého vynálezu je cDNA nebo RNA.
Nukleová kyselina podle předloženého vynálezu je výhodně vybrána mezi:
(a) celá nebo část sekvencí SEQ ID n°25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33 a 34 nebo jejich komplementární vlákno, (b) každá sekvence hybridující se sekvencemi (a) kódující derivát podle vynálezu, (c) varianty (a) a (b) vyplývající z degenerace genetického kódu.
Jak je již naznačeno, předkladatel nyní vytvořil nové sekvence nukleové kyseliny kódující různé polypeptidy proteinu p53 mající antiproliferativní vlastnosti a apoptické docela význačné. Tyto nukleové kyseliny mohou být použity jako terapeutické agens, za účelem vyvolat v derivovaných buňkách podle vynálezu schopnost zničit nebo opravit buněčné disfunkce. V tomto ohledu se předložený vynález týká zejména kazet exprese obsahujících nukleovou kyselinu takovou jaká je již definována, promotor umožňující její expresi a terminační signál transkripce. Promotor je výhodně vybrán mezi funkčními promotory v savčích buňkách především lidských. Jedná se zejména o promotor umožňující expresi nukleové kyseliny v hyperproliferativní buňce (např. karcinogenní) V tomto ohledu mohou být použity různé promotory. Může se jednat například o vlastní promotor genu p53. Může se jednat zejména o oblasti různého původu (odpovědné za expresi dalších proteinů nebo syntetických proteinů). Může se jednat o každý promotor nebo odvozenou sekvenci stimulující nebo potlačující transkripci genu specificky nebo nespecificky, indukovatelně nebo neindukovatelně, silně nebo slabě. Mohou se uvést zejména sekvence promotory eukariontních genů nebo genů virových. Například se může jednat o sekvence promotorů pocházejících z genomu cílové buňky. Mezi eukariontními promotory se mohou použít zejména ubikvitinové promotory (promotor genů HPRT, PGK, a-aktin, tubulin atd.), vláknité promotory (promotor genů GFAP, desmin, vimentin, keratin atd.), promotory terapeutických genů (například promotor genů MDR, CFTR, Taktor VIII, ApoAI atd.), specifické promotory tkání (promotor genu pyruvát-kinázy, vilinu, proteinu střevní vazby mastných kyselin, a-aktin hladkého svalstva atd.) nebo také promotory odpovídající podnětu (receptor seroidních hormonů, receptor kyseliny retinové atd.). Může se jednat o sekvence promotorů genů EIA a MLP adenoviru, ranný promotor CMV nebo také promotor LTR RSV atd. Mimoto tyto oblasti promotorů mohou být modifikovány přídavkem aktivačních sekvencí, sekvencí regulačních nebo sekvencí umožňujících tkáňově specifickou expresi nebo sekvencí majoritní.
Předložený vynález nabízí nyní nové terapeutické agens umožňující svými antiproliferativními vlastnostmi nebo/a apoptickými vlastnostmi interferovat s počtem disfunkčních buněk. Za tímto cílem nukleové kyseliny nebo kazety podle vynálezu mohou být injektovány na úrovni místa ošetření nebo inkubovány přímo s buňkami určenými ke zničení nebo ošetření. Bylo popsáno, že nukleové kyseliny nus mohou penetrovat do buněk bez zvláštního vektoru. Nicméně v rámci předloženého vynálezu se upřednostňuje použití vektoru podávání umožňující zvýšit (i) účinnost buněčné penetrace, (ii) cílení (iii) stabilitu extra a intracelulární.
Podle provedení nukleová kyselina nebo kazeta zejména upřednostněná předloženým vynálezem je zahrnuta do vektoru. Použitý vektor může být chemického původu (lipozom, peptidový komplex, lipidy nebo kationické polymery atd.), virového původu (retrovirus, adenovirus, oparový virus. AAV, virus neštovic atd.) nebo plazmatického původu.
Použití virových vektorů spočívá na přirozených vlastnostech transfekce virů. Je možné použít například adenoviry, oparové viry, retroviry a viry AAV. Tyto vektory se jeví zejména výkonné z hlediska transfekce. Po této stránce upřednostněný předmět podle vynálezu spočívá v defektních rekombinantních retrovirech, jejichž genom obsahuje nukleovou kyselinu takovou, jaká je již
-9CZ 296185 B6 drive definovaná. Jiný předmět předloženého vynálezu spočívá zejména v defektních rekombinantních adenovirech, jejichž genom obsahuje nukleovou kyselinu takovou, jaká je již dříve definovaná.
Vektor podle předloženého vynálezu může zejména být nevirový agens schopný podporovat přenos a expresi nukleových kyselin v eukaryontních buňkách. Vektory chemické nebo biochemické, syntetické nebo přírodní, představují zajímavou alternativu přírodním virům, zejména z příjemných důvodů, bezpečnosti a zejména nepřítomnosti teoretické limity, která se týká velikosti DNA použité k transfekci. Tyto syntetické vektory mají dvě základní funkce, zkompaktnit nukleovou kyselinu pro transfekci a podporovat svou buněčnou fixaci, rovněž jako podporovat svůj přechod skrz plazmovou membránu a popřípadě dvě nukleární membrány. Pro potlačení polyanionické povahy nukleových kyselin mají nevirové vektory všechny náboje polykationické.
Nukleová kyselina nebo vektor použitý v předloženém vynálezu mohou být formulovány vzhledem k podávání, a to způsobem topikálním, orálním, parenterálním, intranasálním, nitrožilně, intramuskulárně, podkožně, intraokulárně, transdermatologicky atd. Nukleová kyselina nebo vektor jsou výhodně použity v injektovatelné formě. Mohou to být směsi vehikula farmaceuticky přijatelného pro injektovatelnou formu, zejména pro přímou injektaci na úrovni místa ošetření. Může se jednat zejména o sterilní roztoky, izotonické nebo suché látky, především lyofilizované, které po přidání sterilní vody nebo fyziologického séra podle okolnosti, umožňují injektovatelnou formu. Přímé injektování nukleové kyseliny do nádoru pacienta je zajímavé, protože to dovoluje soustředit terapeutický vliv na úrovni postižené tkáně. Dávky nukleové kyseliny mohou být uzpůsobeny vzhledem k různým parametrům, zejména vzhledem ke genu, vektoru, způsobu použitého podávání, patologii nebo také vzhledem k délce léčení.
Vynález se týká zejména všech farmaceutických kompozic, které obsahují alespoň jednu nukleovou kyselinu takovou, jaká je již popsána.
Týká se zejména všech farmaceutických kompozic, které obsahují alespoň jeden vektor takový, jaký je již popsán.
Týká se také všech farmaceutických kompozic, které obsahují alespoň jednu variantu proteinu p53 takovou, jaká je již popsána.
Vzhledem k antiproliferativním vlastnostem farmaceutických kompozic podle vynálezu, jsou tyto kompozice přizpůsobeny zejména pro léčení hyperproliferativních chorob především rakovin a restenózy. Předložený vynález předkládá také metodu účinnou především pro destrukci buněk, zejména hyperproliferativních. Tato metoda může být použita in vitro nebo ex vivo. Ex vivo spočívá zejména v inkubaci buněk v přítomnosti jedné nebo více nukleových kyselin (nebo vektoru, kazety nebo přímo derivátu). Metoda použitá in vivo spočívá v podávání organizmu aktivního množství vektoru (nebo kazety) podle vynálezu přímo na úrovni místa ošetření (zejména ošetření nádoru). Po této stránce se vynález týká zejména metody destrukce hyperproliferativních buněk zkontaktováním těchto buněk nebo části z nich s nukleovou kyselinou, již dříve definovanou.
Předložený vynález je výhodně použit in vivo pro destrukci hyperproliferativních buněk (tj. v nenormální proliferaci). Je tak aplikovatelný pro destrukci nádorových buněk nebo buněk hladkého svalstva vaskulární stěny (resténóza). Je přizpůsobený zejména léčení rakovin, ve kterých je přítomný mutant p53. Kupříkladu se mohou citovat adenokarcinomy tračníku, rakoviny štítné žlázy, karcinom plic, leukémie míchy, rakoviny konečníku, rakoviny prsu, rakoviny plic, rakoviny žaludku, rakoviny jícnu, lymfomy B, rakoviny vaječníků, rakoviny močového měchýře, glioblastomy, hepatokarcinomy, rakoviny kostí, kůže, pankreasu, rakoviny ledvin a prostaty, rakoviny jícnu, rakoviny hrtanu, rakoviny hlavy a krku, rakoviny genitálií HP V pozitivní, rakoviny nosohltanu EBV pozitivní, rakoviny, ve kterých buněčný protein mdm2 je silně exprimován atd.
-10CZ 296185 B6
Varianty podle vynálezu jsou zejména účinné pro léčení rakovin, ve kterých protein MDM2 je kromě toho silně exprimován, stejně jako pro léčení rakovin spojených s virem HPV například rakovin genitálií HPV pozitivních.
Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.
Seznam obrázků
Obrázek 1: Funkční domény divokého proteinu p53. TA: Aktivační doména transkripce. DNB: DNA vazebná doména. NLS: signál nukleární lokalizace. OL: doména oligomerizace. REG: doména regulace.
Obrázek 2: Konstrukce cDNA kóduj ící formu AS proteinu p5 3.
Obrázek 3: Klonování cDNA kódující konstrukce pEC104, pEC106, pECI31, pECI32 a pECI33 a kódující jejich variantu H182.
Obrázek 4: Konstrukce variant pEC107, pECllO, pEC239 a pEC140 fúzí s umělou doménou oligomerizace.
Obrázek 5: Konstrukce variant pEC114, pEClló, pEC141, pEC143, pEC145, pEC147, pEC149, pEC151,pEC153 apEC155.
Obrázek 6: Rozpoznání sekvencí specifické dvouvláknové DNA hybridními molekulami vynálezu.
Pokus zpoždění na gelu: soutěž mezi HisV325 a divokým p53. sloupec 1: inkubace v nepřítomnosti HisV325 a divokého p53, sloupec 2:30 ng divokého p53, sloupec 3: detto 2 + pAb421, sloupec 4:30 ng HisV325, sloupec 5: detto 4 + pAb421, sloupec 6:30 ng HisV325 + 30 ng divokého p53, sloupec 7: detto 6 + pAb421, sloupec 8:30 ng HisV325 + 15 ng divokého p53, sloupec 9: detto 8 + pAb421, sloupec 10:30 ng HisV325 + 7,5 ng divokého p53, sloupec 11: detto 10 + pAb421, sloupec 12:30 ng HisV325 + 4,5 ng divokého p53, sloupec 13: detto 12 + pAb421, sloupec 14:30 ng HisV325 + 3 ng divokého p53, sloupec 15: detto 14 + pAAb421.
Obrázek 7: Transaktivační aktivita divokého proteinu p53 a varianty AS, V-325 a V-336.
Obrázek 8: Transaktivační aktivita divokého proteinu p53 a varianty V-325, V-336 a V-343.
Obrázek 9: Exprese variant vynálezu v buňkách SAOS-2.
Obrázek 10: Indukce genů hdm2 a WAFI v buňkách EB, EB-1 a EB-V325.
Obrázek 11 :Vliv proteinu E6 na transaktivační funkci proteinu p53 a variant vynálezu v buňkách SAOS-2. Množství vektorů CMV-konstrukce -100 ng.
Obrázek 12: Vliv proteinu E6 na transaktivační funkci proteinu p53 a variant vynálezu v buňkách HeLa.
Obrázek 13: Citlivost divokého proteinu p53 a variant vynálezu k degradaci indukované proteinem E6.
Obrázek 14: Vliv dominantního negativního mutantu proteinu p53 H175 na transaktivační funkci variant vynálezu. Množství vektorů CMV-konstrukce -100 ng.
Obrázek 15: Vliv proteinu hdm2 na transaktivační funkci proteinu p53 a variant vynálezu v buňkách SAOS-2. Množství vektorů CMV-konstrukce = 100 ng.
Obrázek 16: Vliv divokých proteinů p53 a V-325 na růst buněk silně exprimující protein hdm2.
Obrázek 17: Indukce apoptózy divokými proteiny p53 a V-325.
Obrázek 18: Kinetická indukce apoptózy v buňkách EB, EB-1 a EB-V325.
-11 CZ 296185 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad A. Konstrukce různých nukleotidových fragmentů nezbytných pro realizaci genů kódujících varianty proteinu p53
Al. Konstrukce cDNA kódující divoký lidský protein p53
Gen lidského proteinu p53 byl klonován řetězovou amplifikační reakcí (PCR) na DNA banky lidské placenty (Clontech) za použití oligonukleotidů 5-1 a 3-393.
Oligonukleotid 5'-l (SEQ ID n°6):
ATGGAGGAGCCGCAG
Oligonukleotid 3'-393 (SEQ ID n°7):
GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC
Produkt byl potom klonován přímo po PCR do vektoru pCRII (Invitrogen).
A2. Konstrukce cDNA kódující formu AS proteinu p53
Forma AS proteinu p53 obsahuje fragment kódující aminokyseliny 1 až 366 lidského proteinu p53 připojený k 19 posledním aminokyselinám produktu alternativního sestřihu myšího proteinu p53.
Forma AS proteinu p53 byla získána ve dvou etapách:
- amplifíkace PCR fragmentu kódující aminokyseliny 1 až 367 proteinu p53 za použití oligonukletidů 5'-l (viz příklad Al) a 3'-367,
Oligonukleotid 3'-3 67 (SEQ ID n°8):
GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGCTCGAGTGAGC
Fragment PCR takto získaný byl pak klonován do vektoru pCRII (Invitrogen). Takto získaný fragment má rozpoznávací míSto pro reStrikční enzym Xho 1 (fragment 1-367).
- oligonukleotidy 5-AS1, 5-AS2, 3-AS1 a 3'AS2 byly fosforylovány potom Společně hybridovány za účelem tvorby fragmentu kódujícího poSledních 19 aminokySelin produktu alternativního SeStřihu myšího proteinu p53.
5'-ASl (SEQIDn09).
TCGAGCCTGCAGCCTAGAGCCTTCCAAGCCCTCATGAAGGAGG
5'-AS2 (SEQ ID n° 10):
AAAGCCCAAACTGCTGATGAATCGATATCGC
3-AS1 (SEQIDn°ll):
TGAGGGCTTGGAAGGCTCTAGGCTGCAGGC
3-AS2 (SEQIDn°12):
GGCCGCGATATCGATTCATCAGCAGTTTGGGCTTTCCTCCTTCA
Tento fragment byl pak vložen na úrovni místa Xho 1 fragmentu 1-367 (viz Obrázek 2). Takto vytvořený gen kóduje variantu lidského produktu alternativního sestřihu myšího proteinu p53 (AS).
- 12CZ 296185 B6
Takto modifikovaná sekvence je následující:
364 367 386
393
I I I
I p53:-AHSSHLKSKKGOSTSRHKKLMFKTEGPDSDZ
AS: -AHSSLOPRAFOALMKEESPNCZZ
367:-AHSSZZ
A3. Konstrukce cDNA kódující různé fragmenty proteinu p53 nesoucí DNA vazebnou doménu.
Tento příklad popisuje konstrukci různých cDNA kódující různé fragmenty lidského proteinu p53 nesoucí celek nebo část DNA vazebné domény proteinu p53. Tyto fragmenty jsou pak použity v konstrukci variant proteinu p53. Byly získány amplifikační reakcí polymerázou na matricích popsaných v příkladu Al a A2 prostřednictvím různých oligonukleotidů. Amplifikační reakce byly provedeny za podmínek popsaných v příkladu A4.1.
A3.1. Konstrukce cDNA kódující oblast 75-325 proteinu p53 a jeho derivát H182
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 325 divokého lidského proteinu p53 (75-325).
Tato cDNA byla získána řetězovou amplifikační reakcí (PCR) na DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al) s následujícími oligonukleotidy 5-75 a 3' -325:
5-75 (SEQIDno13):
GGGAAGCTTGGGCCGGGTCGACCTGCACCAGCAGCTCCT
3'-325 (SEQ ID n° 14):
GGCGGCCGCGGATCCCCATCCAGTGGTTTCTT
Derivát tohoto fragmentu nesoucí bodovou mutaci na aminokyselině 182 lidského proteinu p53 (cystein -> histidin) byl získán mutagenezi řízenou prostřednictvím soupravy Amersham za použití oligonukleotidu H182:
Oligonukleotid H182 3' (SEQ ID n°15):
ATCTGAATGGCGCTC
Tento fragment byl označen 75-325 (H182).
A3.2. Konstrukce cDNA kódující oblast 75-336 proteinu p53 a jeho derivát H182
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 336 divokého lidského proteinu p53 (75-336).
Tato cDNA byla získána řetězovou amplifikační reakcí (PCR) na DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al) s následujícími oligonukleotidy 5'-75 (SEQ ID n°13) a 3,-336:
3-336 (SEQIDn°16):
GGCGGCCGCGGATCCTCACGCCCACGGATCTG
Derivát tohoto fragmentu nesoucí bodovou mutaci na aminokyselině 182 lidského proteinu p53 (cystein -> histidin) byl získán mutagenezi řízenou prostřednictvím soupravy Amersham za pou-13 CZ 296185 B6 žití oligonukleotidů H182 (SEQ ID n°15). Tento fragment byl označen 75-336 (H182).
A3.3. Konstrukce cDNA kódující oblast 75-343 proteinu p53
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 343 divokého lidského proteinu p53 (75-343).
Tato cDNA byla získána řetězovou amplifíkační reakcí (PCR) na DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al) s následujícími oligonukleotidy 5-75 (SEQ IDn°13) a 3-343:
3'-343 (SEQ ID n°35):
CGGATCCTCTCGGAACATCTCGAA
A3.4. Konstrukce cDNA kódující oblast 75-367 proteinu p53 a jeho derivát H182
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 367 divokého lidského proteinu p53 (75-367).
Tento fragment byl získán řetězovou amplifíkační reakcí (PCR) na DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al) s následujícími oligonukleotidy 5-75 (SEQ ID n°13) a 3'-367 (SEQ ID n°8).
Takto získaný fragment obsahuje rozpoznávací místo endonukleázou Xho 1 (75-367).
Derivát tohoto fragmentu nesoucí bodovou mutaci na aminokyselině 182 lidského proteinu p53 (cystein -> histidin) byl získán mutagenezí řízenou prostřednictvím soupravy Amersham za použití oligonukleotidů H182 (SEQ ID n°15). Tento fragment byl označen 75-367 (H182).
A3.5. Konstrukce cDNA kódující fragment 75-AS a jeho derivát H182
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 366 divokého lidského proteinu p53 (75-366) přidané k 19 posledním aminokyselinám produktu alternativního sestřihu myšího proteinu p53.
Tento fragment byl získán řetězovou amplifíkační reakcí (PCR) na DNA fragmentu AS (popsáno v příkladu A2) s následujícími oligonukleotidy 5-75 (SEQIDn°13)a 3-AS2 (SEQIDn°12).
Derivát tohoto fragmentu nesoucí bodovou mutaci na aminokyselině 182 lidského proteinu p53 (cystein -> histidin) byl získán mutagenezí řízenou prostřednictvím soupravy Amersham za použití oligonukleotidů H182 (SEQ ID n°15). Tento fragment byl označen 75-AS (H182).
A3.6. Konstrukce cDNA kódující fragment 75-393 proteinu p53 a jeho derivát H182
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 393 lidského proteinu p53 (75-393). Tento fragment byl získán řetězovou amplifíkační reakcí (PCR) na DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al) s následujícími oligonukleotidy 5' -75 (SEQ ID n°13) a 3'-393 (SEQ IDn°7).
Derivát tohoto fragmentu nesoucí bodovou mutaci na aminokyselině 182 lidského proteinu p53 (cystein -> histidin) byl získán mutagenezí řízenou prostřednictvím soupravy Amersham za použití oligonukleotidů H182 (SEQ ID n°15). Tento fragment byl označen 75-393 (H182).
A4. Konstrukce cDNA kódující různé fragmenty nesoucí aktivační doménu transkripce (transaktivační doména).
-14CZ 296185 B6
Tento příklad popisuje konstrukci různých cDNA kódujících různé fragmenty nesoucí transaktivační doménu. Tyto fragmenty jsou pak použity v konstrukci variant proteinu p53.
A4.1. PCR reakce
Amplifíkační reakcí polymerázou byly získány různé fragmenty na různých matricích prostřednictvím různých oligonukleotidů. Tyto amplifíkační reakce byly provedeny za následujících podmínek: Enzym Amplitaq-DNA-polymeráza (Perkin-Elmer) v pufru dodaném dodavatelem s koncentrací 0,2 mM dNTP, 100 ng matrice a 500 ng každého ze dvou oligopeptidů.
-cyklus: 2 minuty při 91 °C
-cykly: 1 minuta při 91 °C minuta při 55 °C minuta při 72 °C
-cyklus: 1 minuta při 72 °C
A4.2. Konstrukce cDNA kódující oblast 411-490 virálního vektoru VP16 (VP16TA)
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 411-490 virálního proteinu VP16 (VP16 TA). Tato oblast nese transaktivační doménu tohoto proteinu.
Transaktivační fragment transaktivátoru odvozený od virálního proteinu VP16 (411-490) viru oparu byl získán řetězovou amplifíkační reakcí (PCR) za použití podmínek již dříve definovaných (viz A4, 1) a následujících oligonukleotidů 5'-VP16 a 3'-VP16:
5ΎΡ16 (SEQ ID n°17):
AAGCTTGAATTCGTTAACATGTCCACGGCCCCCCCGACC
3'-VP16 (SEQ ID n°18):
GGTCGACCACCGTACTCGTCAAT a 100 ng plazmidu pUHD15-l (Gossen a Bujard. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5547).
Fragment takto získaný obsahuje 334 párů bází, jejichž sekvence je daná SEQ ID n°2. Obsahuje ve své části N-konce methionin nesený iniciačním místem transkripce (ATG), přidaný tak do etapy klonování metodou PCR.
A4.2. Konstrukce cDNA kódující různé fragmenty schopné získávat aktivační doménu transkripce (transaktivační doména) proteinu p53 endogenu.
A4.2.1 Konstrukce cDNA kódující protilátku jednoduchého řetězce schopnou vázat protein p53 (ScFv 42)
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující protilátku jednoduchého řetězce schopnou vázat protein p53 (ScFv 421). Tato konstrukce vyjádřena na intracelulární úrovni musí být schopna fixovat protein p53 divokého endogenu nebo mutant za účelem získání své transaktivační domény.
cDNA kódující ScFv 421 (přihláška vynálezu PCT/FR96/00477) může být extrakt ve formě fragmentu Nco I/Not 1, který zahrnuje iniciační místo translace (ATG) a žádnou terminační sekvenci translace.
Takto získaný fragment obsahuje 766 párů bází, jejichž sekvence je daná SEQ ID n°36.
-15 CZ 296185 B6
A4.2.2. Konstrukce cDNA kódující oblast 325-360 divokého proteinu p53 (325-360)
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 325-360 divokého proteinu p53 (325-360). Tato oblast nese doménu oligomerizace tohoto proteinu. Tato konstrukce na intracelulární úrovni, musí být schopna fixovat divoký protein p53 endogenní nebo mutant za účelem získání své transaktivační domény.
Odvozená oligomerizační doména divokého lidského proteinu p53 (325-360) byla získána řetězovou amplifikační reakcí (PCR) za použití podmínek dříve definovaných (viz A4, 1) a následujících oligonukleotidů 5-325 a 3-360.
5-325 (SEQ ID n°37):
AAGCTTGAATTCGTTAACGCCACCATGGGAGAATATTTCACCCTT
3-360 (SEQ ID n°38):
GGGTCGACCTGGCTCCTTCCCAGC na 100 ng DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al).
Takto získaný fragment obsahuje 141 párů bází, jejichž sekvence je daná SEQ ID n°39. Obsahuje na N-konci methionin nesený iniciačním místem translace (ATG), přidaný v etapě klonovaní PCR a neobsahuje žádnou sekvenci terminace translace.
A4.2.3. Konstrukce cDNA kódující oblast 325-393 divokého proteinu p53 (325-393)
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 325-393 divokého proteinu p53 (325-393). Tato oblast nese doménu oligomerizace tohoto proteinu. Tato konstrukce na intracelulární úrovni musí být schopna fixovat divoký protein p53 endogenní nebo mutant za účelem získání své transaktivační domény.
Tato odvozená oligomerizační doména divokého lidského proteinu p53 (325-360) byla získána řetězovou amplifikační reakcí (PCR) za použití podmínek dříve definovaných (viz A4, 1) a následujících oligonukleotidů 5-325 (SEQ IDn°37) a 3’-393.2:
3-393 (SEQ ID n°40):
GGGTCGACCGTCTGAGTCAGGCCCTTC na 100 ng DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al)
Takto získaný fragment obsahuje 243 párů bází, jejichž sekvence je daná SEQ ID n°41. Obsahuje na N-konci methionin nesený iniciačním místem translace (ATG), přidaný tak v etapě klonovaní PCR a neobsahuje žádnou sekvenci terminace translace.
A5. Konstrukce cDNA kódující různé fragmenty nesoucí doménu oligomerizace
Tento příklad popisuje konstrukci různých cDNA kódujících různé fragmenty nesoucí doménu oligomerizace. Tyto fragmenty jsou pak použity v konstrukci variant proteinu p53. Tyto fragmenty byly získány amplifikační reakcí polymerázou na různých matricích (p53 pro homologní oblast a matrice různého původu pro heterologní oblast oligomerizace, zejména umělou) prostřednictvím různých oligonukleotidů. Amplifikační reakce byly provedeny za podmínek popsaných v příkladu A4.1.
A5.1. Konstrukce cDNA obsahující umělou oblast oligomerizace
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA obsahující umělou doménu oligomerizace, tvořenou umělým leucinovým zipem. Tato cDNA je pak použita pro konstrukci variant od fragmentů 75-16CZ 296185 B6
325 (příklad A3.1) a 75-336 (příklad A3.2) lidského proteinu p53 a jejich modifikovaných derivátů na úrovni cysteinu 182.
Tato cDNA byla konstruována od 6 následujících nukleotidů.
Izl-5'(SEQ ID n°19):
GATCTGAAGGCCCTCAAGGAGAAGCTGAAGGCC
Iz2-5' (SEQ ID n°20):
CTGGAGGAGAAGCTGAAGGCCCTGGAGGAGAAGCTG
Iz3-5'(SEQ ID n°21):
AAGGCACTAGTGGGGGAGCGATGATGAATCGATATCGC
Izl-3' (SEQEDn°22):
CTCCTCCAGGGCCTTCAGCTTCTCCTTGAGGGCCTTCA
Iz2-3' (SEQ ID n°23):
TAGTGCCTTCAGCTTCTCCTCCAGGGCCTTCAGCTT
Iz3-3' (SEQ ID n°24):
GGCCGCGATATCGATTCATCATCGCTCCCCCAC
Tyto oligonukleotidy byly syntetizovány prostřednictvím automatického syntetizátoru DNA za použití chemie fosfoamidů. Těchto šest oligonukleotidů představuje komplementárnost v párech (Izl-51 /Izl-3', Iz2-5' /Iz2-3', Iz3-5' /Iz3-3') a komplementárnost řetězcovou (Izl-3' /Iz2-5', Iz2-3' /Iz3-5') dovolující získat doménu oligomerizace jednoduchou hybridizací a ligací. Výsledná sekvence LZ je daná SEQ ID n°l.
A5.2. Konstrukce cDNA obsahující přirozenou doménu oligomerizace lidského proteinu p53
Tento příklad popisuje konstrukci cDNA obsahující přirozenou doménu oligomerizace lidského proteinu p53. Tato cDNA je reprezentována fragmentem kódujícím aminokyseliny 325 až 356 proteinu p53 získaného v konstrukci 75-367 (příklad A3.4), 75-AS (příklad A3.5), 75-393 (příklad A3.6) a jejich derivátů na úrovni modifikovaných cysteinu 182.
Příklad B. Konstrukce genů kódujících různé varianty proteinu p53
Bl. Klonování různých fragmentů proteinu p53
Každý z různých fragmentů získaných PCR popsaný v příkladu A byl klonován po PCR do vektoru pBC SK+ (Stratagen) za použití rozpoznávacích míst enzymy restrikce Hind III a Not I (Obrázek 3).
Produkty těchto konstrukcí nesou následující Čísla: 75-325 ->pEC 104
75-336->pEC 106
75-343 ->pEC 171
75-367->pEC 131
75-AS ->pEC 132
75-393 ->pEC 133
Od těchto produktů mutagenezí řízenou za použití mutageneze in vitro řízenou oligonukleotidovým mutagenním systémem (Amersham) a oligonukleotidů H182 byly získány odpovídající konstrukce nesoucí histidin v pozici 182. Tyto konstrukce nesou následující čísla:
- 17CZ 296185 B6
75-325 (Η 182)->pEC 134
75-336 (H182) ->pEC 135
75-367 (H182)->pEC 136
75-AS (H182) ->pEC 137
75-393 (H182)->pEC 138
B2. Fúze leucinového zipu s fragmentem 75-325, 75-336 a 75-343 a s jejich variantou H182
Oligonukleotidy obsahující leucinový zip (Izl-5', Izl-3, Iz2-5', Iz2-3', Iz3-5'a Iz3-3') byly fosforylovány pomocí T4 kinázy potom hybridovány všechny společně a vloženy do vektorů pEC 104, 106, 134 a 135 a 171, předběžně tráveny restrikčními enzymy BamHI a Notl (Obrázek4).
Produkty těchto konstrukcí nesou následující čísla:
75-325-Iz ->pEC 107
75-336-Iz ->pEC 110
75-343-Iz ->pEC 174
75-325 (H182) -Iz ->pEC 139
75-336 (H182) -Iz ->pEC 140
B3. Fúze aktivační domény traskripce se souborem fragmentů p53
Konečné produkty byly získány ligací ke třem společníkům následujícím způsobem (Obrázek5):
Aktivační doména transkripce odvozená od VP16, popsaná v příkladu A3 byla připravena enzymovou digescí restrikčními enzymy Hind III a Sal I produktů PCR.
Byly izolovány různé fragmenty proteinu p53 (75-325-Iz, 75-336-Iz, 75-343-Iz, 75-AS, 75367, 75-393 a jejich varianty H182) po enzymové digesci restrikčními enzymy Sall a Notl plazmidů je obsahující.
Možné kombinace (aktivační doména/p53) byly vytvořeny a současně vloženy do vektoru pBC SK+ (Stratagen) a přednostně tráveny restrikčními enzymy Hind 11 a Not 1.
Produkty konstrukce nesou následující čísla:
VP16-75-325-Iz V-325 ->pEC 114 (SEQ ID n°25)
VP16-75-3 3 6-Iz V-336 ->pEC 116 (SEQ ID n°26)
VP16-75-367 V-367 ->pEC 141 (SEQ ID n°27)
VP16-75-AS V-AS ->pEC 143 (SEQ ID n°28)
VP16-75-393 V-393 ->pEC 145 (SEQ ID n°29)
VP16-75-343-Iz V-343 ->pEC 175 (SEQ ID n°30)
VP16-75-325 (H182) -Iz V-325 H ->pEC 147
VP16-75-336 (H182) -Iz V-336 H ->pEC 149
VP16-75-367 (H182) V-367 H ->pEC 151
VP16-75-AS (H182) V-ASH ~>pEC 153
VP16-75-393 (H182) V-393 H ->pEC 155
Odpovídající produkty nesoucí oblast vázající specificky transaktivátor nebo transaktivační komplex k místu domény VP16 jsou konstruovány stejným způsobem. Tyto konstrukce jsou popsány následovně:
-18CZ 296185 B6
ScFv-75-325-Iz S-325 ->pEC 176 (SEQ ID n°31)
ScFv-75-336-Iz S-336
ScFv-75-367 S-367
ScFv-75-AS S-AS
ScFv-75-393 S-393
ScFv-75-325 (H182) -Iz S-325 H
ScFv-75-336 (H182) -Iz S-336 H
ScFv-75-367 (H182) S-367 H
ScFv-75-AS (H182) S-ASH to ScFv-75-393 (H182) S-393 H (325-393) -75-325-Iz 393-325 ->pEC 177 (SEQ ID n°32) (325-393) -75-336-Iz 393-336 (325-393) -75-367 393-367 (325-393) -75-AS 393-AS (325-393) -75-393 393-393 (325-393) -75-325 (H182) -Iz 393-325 H (325-393) -75-336 (H182) -Iz 393-336 H (325-393) -75-367 (H182) 393-367 H (325-393) -75-AS (H182) 393-ASH (325-393) -75-393 (H182) 393-393 H (325-360) -75-325-Iz 360-325 ->pEC 178 (SEQ ID n°33) (325-360) -75-336-Iz 360-336 (325-360) -75-367 360-367 (325-360) -75-AS 360-AS (325-360) -75-393 360-393 (325-360) -75-325 (H182) -Iz 360-325 H (325-360) -75-336 (H182) -Iz 360-336 H (325-360) -75-337 (H182) 360-367 H (325-360) -75-AS (H182) 360-ASH (325-3 60) -75-393 (H182) 360-393 H
Produkty obsahující doménu 325-360 proteinu p53 a transaktivační doménu (1-74) mohou být posouzeny smícháním syntetického separátoru (Hinge) získaného inzercí v místě Sal 1 s fragmentem DNA získaným hybridací syntetického oligonukleotidového páru komplementárního k 35 Hinge-up a Hinge-down.
Hinge-up (SEQ ID n°42):
TCGAGGAGGTGGTGGCTCTGGAGGCGGAGGATCCGGCGGTGGAGGTTC
Hinge-down (SEQ ID n°43):
TCGAGAACCCCTACCGCCGGATCCTCCGCCTCCAGAGCCACCACCTCC
Sekvence výsledné dvouvláknové DNA Hinge je následující
TCGAGGAGGTGGTGGCTCGGAGGCGGAGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCCTCCACC
ACCGAGACCTCCGCCTCCTAGGCCGCCATCCCCAAGAGCT a odpovídající proteinová sekvence je (SEQ ID n°44):
Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly -Gly-Ser
-19CZ 296185 B6
Odpovídající produkty jsou popsány následovně:
(325-360) -Hinge-75-325-Iz 360h-325 ->pEC 179 (SEQ ID n°34) (325-360) -Hinge-75-336-Iz 360h-336 (325-360) -Hinge-75-367 360h-367 (325-360) -Hinge-75-AS 360h-AS (325-360) -Hinge-75-393 360h-393 (325-360) -Hinge-75-325 (H182) -Iz 360h-325 H (325-360) -Hinge-75-336 (H182) -Iz 360h-336 H (325-360) -Hinge-75-367 (H182) 360h-367 H (325-360) -Hinge-75-AS (H182) 360h-ASH (325-360) -Hinge-75-393 (H182) 360h-393 H
Příklad C. Konstrukce expresních vektorů variant proteinu p53
Tento příklad popisuje konstrukci vektorů použitelných pro přenos nukleových kyselin podle vynálezu in vitro nebo in vivo.
Cl. Konstrukce plazmidových vektorů
Pro konstrukci plazmidových vektorů byly použity dva typy vektorů.
- Vektor pSV2, popsán v DNA Cloning. A practical approarch Vol.2, D. M. Glover (Ed) IRL Press. Oxford. Washington DC, 1985. Tento vektor je eukariontní vektor exprese. Nukleové kyseliny kódující varianty byly vloženy do vektoru ve formě fragmentů Hpal-EcORV. Jsou tak umístěny pod řízením promotoru zesilovače transkripce viru SV40.
- Vektor pCDNA3 (Invitrogen). Jedná se zejména o eukariontní expresní vektor. Nukleové kyseliny kódující varianty podle vynálezu jsou tak umístěny do vektoru pod řízením ranného promotoru CMV. Všechny konstrukce popsané v příkladu 83 byly vloženy do vektoru ve formě fragmentu Hind 111/Not 1 za účelem testování v různých systémech in vivo.
C2. Konstrukce virových vektorů
Vynález spočívá v konstrukci a použití virových vektorů umožňujících přenos a expresi in vivo nukleových kyselin, které jsou dříve definované.
Pokud se jedná zejména o adenoviry, byly charakterizovány různé serotypy, jejichž struktura a vlastnosti se tak trochu mění. Mezi serotypy se s výhodou používají v rámci předloženého vynálezu lidské adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenoviry zvířecího původu (viz přihláška vynálezu WO94/26914). Mezi adenoviry zvířecího původu používaných v rámci předloženého vynálezu se mohou uvést adenoviry psího, hovězího a myšího původu (na příklad: Mávl. Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího (na příklad: SAV). Adenoviry zvířecího původu jsou adenoviry psí, zejména adenovirus CAV2 [například souche manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800) ]. V rámci předloženého vynálezu se s výhodou používají adenoviry původu lidského nebo psího nebo jejich směs.
Defektní adenoviry předloženého vynálezu obsahují ITR, sekvenci umožňující zejména enkapsidaci a nukleovou kyselinu podle vynálezu. V genomu adenoviru vynálezu alespoň oblast El je nefunkční. Pozorovaný virový gen může být zbaven funkce všemi odborníky známými technikami, zejména úplnou supresí, substitucí, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo více bází v požadovaném genu nebo požadovaných genech. Tyto modifikace mohou být provedeny in vitro
-20CZ 296185 B6 (na izolované DNA) nebo in šitu, na příklad prostřednictvím technik genového oboru nebo také působením mutageních činidel. Mohou být modifikovány různé oblasti, zejména oblast E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152), WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Podle upřednostňovaného způsobu provedení adenoviry podle vynálezu obsahují deleci v oblasti El a E4. Podle jiného upřednostňovaného způsobu realizace zahrnuje deleci v oblasti El, kde je vložena oblast E4 a nukleová kyselina vynálezu (viz FR94 13355). Ve virech podle vynálezu delece se přednostně rozprostírá v oblasti El nukleotidů 455 až 3329 v sekvenci adenovirů Ad5.
Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny všemi odborníky známými technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham. EMBO J. 3 (1984) 2917). Mohou být připraveny obecnou rekombinací mezi adenovirem a plazmidem nesoucím mezi jiným sekvenci DNA zájmu. Obecná rekombinace nastane po kotransfekci zmáněného adenovirů do linie přizpůsobených buněk. Linie použitých buněk musí zejména (i) být transformovatelná uvedenými elementy a (ii) obsahovat sekvence schopné doplnit část genomu defektního adenovirů, zejména v integrované formě za účelem vyhnutí se nebezpečí rekombinace. Například se může jednat o linii lidských ledvinových embrionárních buněk 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje zejména, začleněnou ve svém genomu, levou část genomu adenovirů Ad5 (12 %) nebo se může jednat o linie schopné doplnit funkce El a E4 tak, jak je popsáno zejména v přihláškách vynálezů WO 94/26914 a WO 95/02697.
Adenoviry, které jsou rozmnoženy jsou získány a purifíkovány podle klasických technik molekulární biologie tak, jak je popsáno v příkladech.
Pokud jde o viry AAV, jedná se o viry DNA relativně malé velikosti, které se začleňují do genomu buněk, které infikují, stabilním způsobem a regiospecifícky. Jsou schopné infikovat široké spektrum buněk, bez vyvolání vlivu na růst, morfologii nebo dělení buněk. Nezdá se, že by byly zahrnuty do patologií u lidí. Genom AAV byl klonován, sekvenován a charakterizován. Obsahuje okolo 4700 bází a na každém konci obsahuje oblast obrácené repetice (1TR) se 145 bázemi, které jsou replikačního původu pro virus. Zbytek genomu je rozdělen na dvě oblasti nesoucí funkce enkapsidace: levou část genomu, která obsahuje gen rap implikovaný do virální replikace a exprese virových genů a pravou část genomu, která obsahuje gen cap kódující kapsidové proteiny viru.
Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz zejména WO 91/18088; WO 93/09239; US 4 797 368; US5 139 941; EP 488 528). Tyto přihlášky vynálezů popisují různé konstrukce odvozené od AAV, ve kterých geny rap nebo/a cap jsou deletovány a nahrazeny genem zájmu a popisují jejich použití pro přenos in vitro (na buňky v kultuře) nebo in vivo (přímo do organizmu) výše uvedeného genu zájmu. Rekombinantní defektní AAV podle vynálezu mohou být připraveny kotransfekci, v linii infikovaných buněk pomocným lidským virem (například adenovirem), plazmidu obsahujícího nukleovou sekvenci vynálezu lemovanou dvěmi oblastmi obrácené repetice (ITR) AAV a plazmidu nesoucího gen enkapsidace (gen rap a cap) AAV. Použitelná linie buněk je na příklad linie 293. Rekombinantní produkty AAV jsou pak purifíkovány klasickými technikami.
Pokud jde o viry oparu a retroviry, konstrukce rekombinantních vektorů byly široce popsány v literatuře: viz zejména Breakfíeld et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EPI78220 Bemstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick. BiOTechnology 3 (1985) 689, atd. Retroviry jsou integrativní viry, selektivně infikující buňky ve fázi dělení. Tvoří tak vektory zájmu pro rakovinové aplikace. Genom retrovirů obsahuje zejména dvě LTR, jednu sekvenci enkapsidace a tři kódovací oblasti (gag, pol a env). V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů, geny gag, pol a env jsou všeobecně deletovány zčásti nebo úplně a nahrazeny sekvencí heterologní nukleoné kyseliny zájmu. Tyto vektory mohou být realizovány od různých typů retrovirů, zejména MOMuLV (murine moloney leukemia virus, také označen MOMLV), MSV
-21 CZ 296185 B6 (murine moloney sarcoma virus), HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (rouš sarcoma virus) nebo také od Friendova viru.
Pro konstrukci rekombinantních retrovirů podle předloženého vynálezu obsahující nukleovou kyselinu podle předloženého vynálezu, plazmid obsahující zejména LTR, sekvenci enkapsidace a výše uvedenou nukleovou kyselinu je konstruován, pak použit pro transfekci linie buněk řečené enkapsidace, schopné přinést ve transretrovirálních funkcích se sníženou schopností do plazmidu. Všeobecně jsou linie enkapsidací tak schopné exprimovat geny gag, pol a env. Tyto linie enkapsidace byly popsány v dřívějších oborech, zejména linie PA317 (US 4 861 719), linie PsiCRIP (WO 90/02806) a linie GP+envAm-12 (WO 89/07150). Jinak rekombinantní retroviry mohou připustit modifikace na úrovni LTR pro potlačení transkripční aktivity, stejně jako sekvence enkapsidace, obsahující část genu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Rekombinantní retroviry jsou pak purifíkovány klasickými technikami.
Pro provedení předloženého vynálezu je především výhodné použití rekombinantního defektního adenovirů nebo retroviru. Tyto vektory mají vskutku vlastnosti zajímavé zejména pro přenos genů do nádorových buněk.
C3. Chemické vektory
Mezí syntetickými vyvinutými vektory se s výhodou používají v rámci předloženého vynálezu kationické polymery polylyzinového typu, (LKLK) n, (LKKL) n, polyethylenimin a DEAE dextran nebo také lipidy kationické nebo lipofektanty. Mají schopnost kondenzovat DNA a podporovat její spojení s buněčnou membránou. Mezi těmito posledně jmenovanými se mohou uvést lipopolyaminy (lipofektamin, transfektam atd.) různé kationické lipidy nebo neutrální lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE atd.), tak jako peptidy nukleárního původu. Byl vyvinut koncept cílové transfekce prostřednictvím receptoru, který využívá principu kondenzování DNA díky kationickému polymeru řídícímu fixaci komplexu k membráně díky chemické vazbě mezi kationickým polymerem a ligandem membránového receptoru, který je přítomný na povrchu buněčného typu, který má být roubován. Cílový receptor transferinu, inzulínu nebo receptor asialoglykoproteinů hepatocytů byl také popsán. Příprava kompozice podle vynálezu používající takovýto chemický vektor je realizována podle všech odborníky známých technik, všeobecně jednoduchým uvedením do kontaktu různých sloučenin.
Příklad D. Posouzení funkcí variant proteinu p53
Varianty proteinu p53 podle předloženého vynálezu byly oceněny v buněčném testu pro následující kritéria:
- vazba k sekvenci specifické dvouvláknové DNA
- transaktivační funkce
- antiproliferativní aktivita
- apoptická aktivita
- onkogenní potenciální spojení s určitými mutacemi proteinu p53
Pro toto posouzení jsou použité konstrukce V-325, V-336, V-343 a AS, které jsou popsány v příkladu B.
Dl. Rozpoznání sekvence specifické dvouvláknové DNA hybridními molekulami podle předloženého vynálezu
Dl.l Tvorba hybridních molekul
-22 CZ 296185 B6 cDNA divokého proteinu p53 byla klonována do vektoru pBlueBaclll (Invitrogen) v místě BamHI. Inzercí do plazmidu pAcHLT-A (Pharmingen) fragmentu obsahujícího cDNA V325 získaného digescí plazmidu pECII4 enzymy EcOR I a Nit I byl vytvořen vektor umožňující získat rekombinantní bakulovirus mající za cíl expresi proteinu V325 označeného na N-konci peptidovou sekvencí, obsahující mezi jiným spojení šesti zbytků histidinu. Od těchto vektorů rekombinantních byly vytvořeny bakuloviry a purifíkovány podle výrobcem uvedených návodů (Invitrogen. Pharmingen). Tyto dva proteiny byly homogenně purifíkovány od nukleárních extraktů hmyzích infikovaných buněk SF9 jejich bakuloviry, nukleární extrakty byly získány postupem popsaným Delphinem et al. (C. Delphin. Eur. J. Biochem., 223, 683-692, 1994).
Divoký protein p53 byl purifíkován imunoafínitou na monoklonálních protilátkách pAb421 (Oncogene Sciences. Ab-1) podle následujícího protokolu: infikovaný nukleární extrakt buňky se inkubuje po dobu třech hodin při teplotě 4 °C s proteinovým gelem A-agarózy, na kterém byla kovalentně vázána protilátka pAb421. Po extenzivním vymytí gelu pufrem 50 mM TrisHCI o pH 7,8 obsahující 1 M KCI a inhibitory proteáz, protein p53 se eluuje peptidem odpovídajícím epitopu, rozpoznaného touto protilátkou na protein p53 (KKGQSTSRHK), tento peptid byl použit v koncentraci 5 mg / ml v roztoku použitém pro vymývání. Po koncentraci na Centrikon-30 (Amicon Grace), eluovaný protein p53 se separuje a purifíkuje k homogenitě permeací na gelu na koloně Superosa 6 HR10/30 ekvilibrované 50 mM TrisHCI pH 7,5, 0,2 M NaCl, 0, 1 mM EGTA, 0, 1 mM ZnCl2,10 mM DTT, 0, 1 mM PMSF, 0,1 % NP-40,5 % glycerolu. Frakce obsahující protein p53 jsou alikvotní a jsou bezprostředně zmrazený na -80 °C až do použití.
Protein V325 označený na N-konci peptidovou sekvencí obsahující mezi jiným spojení šesti zbyktů histidinu nazvaný od nynějška HisV325 byl purifíkován postupem, který byl upraven Hochuliem et al. (Bio/Technology Vol 6 (1988) 1321). Dříve než byl aplikován na gel (NiskelNTA agaróza) nukleární extrakt infikovaných buněk, byl zbaven solí na koloně PD10 (Pharmacia) ekvilibrované 50 mM fosfátovým pufrem pH 8, který obsahoval 5 mM β-merkaptoethanolu, 0,1 % NP-40 a směs inhibitorů proteáz. Inkubace nukleárního extraktu s gelem (Nickel-NTA agaróza) byla provedena v tomto pufru po dobu jedné hodiny při teplotě 4 °C za současného míchání. Gel byl potom vymyt stejným pufrem o pH 6. Protein HisV325 je eluován 0,3 M imidazolem v posledně jmenovaném pufru po promytí gelu 0,1 M imidazolem. Frakce obsahující HisV325 jsou alikvotní ajsou okamžitě zmrazený na-80 °C až do jejich použití.
Dl. 2. Konstrukce sekvence specifické dvouvláknové DNA
Sekvence specifické dvouvláknové DNA použité v tomto pokusuje složena ze dvou syntetizovaných oligonukleotidů, jejichž sekvence je následující:
Oligo 5568 (SEQ ID n°45):
GATCCGAACATGTCCCAACATGTTGA
Oligo 5569 (SEQ ID n°46):
AGCTTCAACATGTTGGGACATGGTCG
Tyto dva syntetické oligonukleotidy byly značeny fosforem 33 třicetiminutovou inkubací při teplotě 37 °C 5 pmolů každého oligonukleotidů ve 20 μΐ následujícího reakčního prostředí:
Tris-HCI pH 7,650 mM
MgCl2lOmM dithiotreitol5 mM
Spermidin 100 μΜ
EDTA 100 μΜ
ΑΤΡ-γ-33Ρ (Amersham) 50 μ Ci (1000-3000 Ci/mmol)
-23CZ 296185 B6
T4 kináza (Boehringer) 10 U
Tyto dva oligonukleotidy takto značené byly hybridovány v přítomnosti 100 mM NaCl pro obnovení dvouvláknové sekvence WAF-RE obsahující specifickou sekvenci rozpoznanou proteinem p53 v oblasti promotoru genu WAF-1 (W. S. EI-Deiry. Cell Vol 75 (1993) 817):
GATCCGAACATGTCCCAACATGTTGA GCTTGTACAGGGTTGTACAACTTCGA
Dl.3 Rozpoznání dvouvláknové sekvence WAF-RE hybridními molekulami podle vynálezu
Pro prokázání specifického rozpoznání dvouvláknové sekvence WAF-RE hybridními molekulami podle vynálezu byly provedeny opožděné pokusy na gelu na základě principu popsaného dále. Reakce vazby DNA je provedena v 25 μΐ reakčním prostředí (20 mM Tris-HCI pH 7, 5, 5 mM MgCl2, 0, 05 mM ZnCl2, 5mM dithiotreitol, 0,1 mg/ml BSA, 10 % glycerol, 1 % Nonidet P-40, 0. IM NaCl, 2 pg/ml aprotinin, 2 pg/ml E-64,2 pg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin) přidáním sekvence WAF-RE (2, 4 10-9M) připravené podle předcházejícího pokusu, 1, 2 10’6M soutěžního chladného oligonukleotidu AP2 (Promega) použitého pro nespecifickou fixaci a 30 ng hybridních molekul pro testování přítomnosti nebo nepřítomnosti divokého proteinu p53 (mezi 3 a 30 ng), divoký protein p53 může být aktivován pro svou aktivitu specifické fixace k DNA prostřednictvím 300 ng protilátky pAb421 (T. R. Hupp. Cell Vol 71 (1992) 875). Reakční směs se inkubuje po dobu 30 minut na ledu a konečná směs se podrobí nativní elektroforéze na 4 % polyakrylamidovém gelu s pohybem při 200 V a při teplotě 16 °C. Gel se pak suší a autoradiografuje.
Výsledek ukázkového pokusu soutěže mezi divokým proteinem p53 a HisV325 ve zpoždění na gelu je ukázán na Obrázku 6. Tento výsledek ukazuje, že His-V325 rozpozná dvouvláknovou sekvenci WAF-RE afinitou srovnatelnou s afinitou divokého proteinu p53. Může se poznamenat, že HisV325 dává na opožděném gelu majoritní pruh, který se pohybuje rychleji než pruh získaný s divokým proteinem p53. Toto by mohlo naznačovat, že HisV325 se fixuje ve formě dimerů. Je tedy možné předpokládat, že tento pruh není ani posunut ani amplifikován přítomností pAb421.
V nepřítomnosti pAb421 divoký p53 se fixuje mnohem méně RErWAf než V325.
D2. Posouzení transaktivační funkce
Transaktivační funkce konstrukcí byla posouzena v systému transaktivace in vivo v buňkách SAOS-2 (lidský osteosarkom), nedostatečně vyvinutých pro dvě alely proteinu p53 (buňky přístupné ATCC pod číslem HTB85) a v nádorové linii H358 (Maxwell a Roth. Oncogene 8 (1993), 3421) a HeLa (ATCC CCL 2). Tento systém spočívá v použití donašečského genu dávkovatelného enzymaticky a umístěného v závislosti na promotoru obsahující nukleotidový motiv specifického rozpoznání divokou formou proteinu p53 (viz experimentální protokoly).
V těchto testech, nosný gen je gen CAT (chloramfenikolacetyl-transferáza) a sekvence rozpoznání proteinem p53 je shodná sekvence (p53RE) definovaná Funkem a spolupracovníky (Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 2866).
Posouzení této funkce bylo provedeno ve srovnání s funkcemi divokého proteinu pro tři typy různých kritérií.
D2.1. Transaktivační aktivita v odpovídajících dávkách
Buňky (3, 5 105) byly naočkovány na Petriho misku o průměru 6 cm, která obsahovala 3 ml kultivační půdy DMEM (Gibco BRL) s přídavkem 10% telecího plodového séra inaktivovaného teplem a kultivovány přes noc pod 5 % CO2 při teplotě 37 °C. Takto byly transfektované různé
-24CZ 296185 B6 konstrukce za použití lopofectAMINu (Gibco BRL) jako agentu transfekce následujícím způsobem: 3 pg plazmidu bylo inkubováno (mezi nimi 0,5 pg plazmidového reportéru) s 10 pl lipofectAMINu po dobu 30 minut se 3 ml kultivační půdy Opti-MEM (gibco BRL) bez séra (transfekční směs). Během tohoto času se buňky dvakrát propláchly PBS a potom byly inkubovány 4 hodiny při teplotě 37 °C s transfekční směsí, která byla pak odsáta a nahrazena 3 ml kultivační půdy DMEM (Gibco BRL) s přídavkem 10% telecího plodového séra inaktivovaného teplem a buňky byly ponechány ještě 48 hodin při teplotě 37 °C.
Protokol dávkování aktivity CAT hodin po transfekci buňky byly jednou promyty PBS potom seškrábnuty a znovu zařazeny do 100 pl 0,25 M pufru Tris pH 8 a lyžovány třemi cykly zmrazování - rozmrazování probíhá v lázni ethanol / led. Buněčný extrakt takto získaný byl odstředěn při 10 000 rpm po dobu 15 minut a získaný supernatant byl použit pro dávkování aktivity. Tato je provedena přídavkem 20 pl buněčného extraktu ke 130 pl reakční směsi, jejíž konečné složení je následující:
- Acetylkoenzym A 0, 4 mM
- Chloramfenikol. D-threo(dichloracetyl-l, 2-,4C 23mM (200nCi)
- Tris 0,18 MpH 8
Po jedné hodině inkubace při teplotě 37 °C reakční produkty byly extrahovány 250 pl ethylacetátu, z tohoto extraktu 20 pl bylo umístěno na křemenné desce (chromatografie na tenké vrstvě) s eluční směsí obsahující 95 % chloroformu a 5 % methanolu. Chromatografícká destička takto získaná je nakonec vyvolána pomocí detekčního přístroje (Pacckard instruments), který umožňuje vypočítat poměr různých produktů acetylace, poměr ukazuje aktivity enzymu Chloramfenikol-acetyl-transferáza a tedy transaktivační aktivitu různých konstrukcí.
Získané výsledky v linii SAOS-2 s konstrukcemi umístěnými pod řízením promotoru CMV (pCDNA3) jsou uvedeny na Obrázku 7 a 8 a ukazují následující vlastnosti pro každou konstrukci:
- protein p53 představuje dávku aktivity závislou, která směřuje k nasycení pro zvýšené dávky (od 100 ng plazmidu). Tato saturace může vyjádřit nezbytnost kofaktorů, které by byly limitující za těchto podmínek.
- protein AS zachovává schopnost transaktivační aktivity divokého proteinu
- proteiny V-325, V-336 a V-343 prokazují, stejně jako protein p53, transaktivační aktivitu, nezdají se, že jsou schopné nasycení v silných dávkách. Je tedy možné, že tato zjevná nepřítomnost saturace potom vede k celkovému zvýšení aktivity. Je možné také pozorovat mimo jiné, že konstrukce V-325 je aktivnější než její homology V-336 a V-343, tato konstrukce navrhuje, aby chimémí proteiny obsahovaly oblast 75-325, a byly tak zejména výhodné.
S cílem potvrdit tyto vlastnosti byly provedeny podobné pokusy v nádorové linii H 358, která je stejně jako linie SAOS-2 vadná na obou alelách genu p53. V těchto pokusech, každá transfekce byla provedena s 50 ng každé konstrukce umístěné v závislosti promotoru CMV. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1, která jasně ukazuje, že dvě varianty V-325 a V-336 prokazují zlepšenou transaktivační aktivitu vzhledem k transaktivační aktivitě divokého proteinu p53 s tím, že opět opět lepší aktivitu vykazuje varianta V-325.
Tabulka 1: Transaktivační aktivita v buňkách nádorové linie H358.
pCDNA 3 divoký p53 V-325 V-336
relativní aktivita CAT 1 6 25 16
-25 CZ 296185 B6
Tyto dva pokusy potvrzují, že varianty podle vynálezu mají alespoň jednu vlastnost vylepšeného proteinu p53.
Za účelem ověření, že tento rozdíl aktivit není způsoben rozdílem exprese, ale přírůstkem aktivity variant podle vynálezu, úroveň exprese divokého proteinu p53 a variant V-325, V-336 a V343 byla analyzována v buňkách SAOS-2. Za tímto účelem buňky byly transfektovány 3 pg každého plazmidu použitého v předchozím pokusu a znovu získány 24 hodin a 48 hodin po transfekci. Po dvou promytí v pufru PBS (Gibco BRL), buňky byly lyžovány po dobu 15 minut při teplotě 4 °C v 50 μΐ pufru RIPA (10 mM Tris-HCI, pH 8, 0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Nonidet-P40,l % deoxycholátu sodného, 0,1 % dodekylsulfátu sodného) s přídavkem 2 mM PMSF, 20 pg/ml aprotinu, 2 pg/ml E64,2 pg/ml leupeptinu a 2 pg/ml pepstatinu. Po 15 minutách odstřeďování při 15 000 rpm, supernatanty byly odebrány, přidány k elučnímu pufru (Laemmli U. K., Nátuře, 227, 680-685, 1970) a podrobeny elektroforéze na 10% polyakrilovém gelu v denaturujícím prostředí 200 V podle již popsaného protokolu (Laemmli U. K., Nátuře, 227, 680685, 1970). Proteiny byly potom přeneseny na membránu PVDF (NEN Resaerch Products) za použití přenosného systému semi-sec NOVEX za dodržení doporučení výrobce a detekovány pomocí monoklonálních protilátek pAb 240 (Oncogene Sciences. Ab-3) a sekundárních protilátek (králík, anti-myš) spřažených s peroxidázou (Nordic Immunology) za použití soupravy ECL (Amersham).
Výsledky tohoto pokusu ukázány na Obrázku 9 dokazují, že varianty V-325 a V-336 jsou exprimovány na srovnatelné úrovni s variantami divokého proteinu p53, a že varianta V-343 se zdá poněkud lépe exprimována než předchozí varianty. Z většího srovnání úrovně exprese ve 24. a 48. hodině lze indikovat, že relativní stabilita každé konstrukce je podobná. Tento výsledek ukazuje, že aktivita variant podle vynálezu V-325 a V-336 není způsobena lepší expresí, ale pravděpodobně potenciálem aktivátoru přírůstku transkripce, což je v rozporu s variantou V-343.
Později s cílem potvrdit schopnost variant podle vynálezu aktivovat umístěný gen v závislosti na elementu rozpoznání divokého proteinu p53 byla provedena studie aktivity endogenních genů s ohledem na expresi genů hdm2 a WAF1 běžně indukovaných proteinem p53.
Tento pokus byl proveden v linii buněk EB (rakovina tračníku) vadných na obou alelách kódujících protein p53 (Shaw et al., PNAS 89 (1992) 4495). Stabilní klon exprimující protein p53 pod řízením promotoru indukovatelného methationinem z této linie byl konstruován (klon EB-1 (Shaw et al., PNAS 89 (1992) 4495)). Stejným způsobem byl konstruován další stabilní klon exprimující protein V-325 pod řízením promotoru indukovatelného methallotioneinem za použití plazmidu odvozeného od vektoru pmlMTli (získaný podle P. Shawa) inzercí cDNA kódující protein V-325 z míst EcOR 1 - Not 1 (pmlMTli-V325). Za tím účelem byly transfektovány buňky EB (3, 5 105 buněk) 1,3 pg plazmidu pmlMTli-V325 a 200 ng plazmidu pcDNA3 podle protokolu již dříve popsaného, stabilní klony byly šlechtěny po transfekci růstem v kultivačním médiu obsahujícím 800 pg/ml geneticinu. Byl vybrán klon exprimující V-325 indukovatelný na srovnatelné úrovni exprese proteinu p53 v klonu EB-1 (klon EB-V325).
Klony EB-1 a EB-V325 stejně jako rodičovské buňky EB (106 buněk) byly podrobeny působení ZnCl2 (200μΜ) a buněčný extrakt byl podroben v různých časech elektroforéze a přenesen na membránu, jak je dříve popsáno. Přenesené buňky byly detekovány třemi různými protilátkami, monoklonální protilátkou pAb240 řízenou proti proteinu p53 a dvěmi protilátkami polyklonálními, jednou řízenou proti proteinu hdm2 a druhou proti proteinu WAF1. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na Obrázku 9, který ukazuje, že: 1) protein p53, chybí v buňkách EB, EBV325 a EB-1, v nepřítomnosti indukce je exprimován v klonu EB-14 hodiny po začátku působení zinku a varianta V-325 je exprimovaná stejným způsobem v klonu EB-V325, 2) protein WAF1, jehož exprese se zdá, že indukuje v buňkách EB působením zinku čtyři hodiny po začátku svou
-26CZ 296185 B6 expresi prodlouženou až na 16 hodin v klonech EB-1 a EB-V325 a 3) indukce proteinu hdm2 nebyla pozorovatelná, než v klonech EB-1 a EB-V325 se zvýšenou expresí v klonu EB-V325.
Tyto výsledky ukazují, že aktivita transkripce variantou V-325 se vyjadřuje indukcí exprese genů normálně indukovaných divokým proteinem p53 a že tato varianta představuje přírůstek aktivity ve fyziologickém kontextu vzhledem k divokému proteinu p53.
D2.2-Vliv proteinu E6 (HPV18) na transaktivační funkci
Použité protokoly jsou shodné s těmi, které jsou popsané v příkladu Dl, 1. V tomto pokusu konstrukce umístěné pod řízením promotoru CM V (pCDNA3) byly kotransfektovány s růstovou koncentrací plazmidů exprimujícího E6 pod řízením promotoru SV40 (pSV2). Získané výsledky v linii SAOS-2 jsou uvedeny na Obrázku 11 a ukazují následující vlastnosti pro každou konstrukci:
- aktivita proteinu p53 se snižuje se zvyšováním koncentrace E6, tento úbytek aktivity p53 je velmi pravděpodobně obrazem degradace proteinu p53, který je vyvolán E6.
- protein V-336 ukazuje absenci citlivosti na E6
- protein V-325 se zdá, že může být lehce aktivován E6. Protein V-325 je vždy a za všech situacích více aktivní než protein p53. Za účelem potvrzení rozdílu tohoto chování oproti proteinu E6, byla testována transaktivační aktivita konstrukcí V-325 a V-336 v pozitivních buňkách HPV18 (HeLa) exprimující protein E6 a porovnávána s transaktivační aktivitou divokého proteinu p53.
V tomto příkladu transfekce provedené podle protokolu již dříve popsaného byly umístěny různé konstrukce pod řízením promotoru CMV (pCDNA3).
Výsledky uvedené na Obrázku 12 ukazují velmi čistou transkripční aktivitu dvou konstrukcí V325 a V-336 a velmi nízkou aktivitu divokého proteinu p53, to vychází z předpokladu, že tyto dvě konstrukce nejsou citlivé na E6 na rozdíl od divokého proteinu.
Pro testování, je-li tato nepřítomnost citlivosti k proteinu E6 odrazem lepší stability k degradaci indukované těmito proteiny, byly provedeny pokusy degradace in vitro.
Byly získány různé molekuly použité v tomto pokusu translací in vitro při lýze retikulocytů, molekul popsaných v příkladu Cl (vektor pcDNA3) za použití soupravy TNT Coupled Reticulocyte lysáte Systems (Promega) podle experimentálního protokolu, který popisuje dodavatel pro reakční objem 50 μΐ.
Pro tento pokus hybridní molekuly podle vynálezu V-325 a V-336 stejně jako divoký protein p53 jsou produkty translace in vitro v přítomnosti 44 pCi 35S-methioninu (Amersham) (1175 Ci/mmol), aby se vytvořily tyto hybridní molekuly radioaktivně značené. Protein E6 (HPV18) je produkt vytvořený za stejných podmínek, ale v nepřítomnosti35S-methioninu.
μΐ každého produktu radioaktivně značeného (p53, V-325 a V-336) byly inkubovány při teplotě 30 °C s 2 μΐ proteinu E6 radioaktivně neznačeným as 10 μΐ lisovaného retikulocytu v konečném objemu 40 μΐ pufru 25 mM Tris-HCI pH 7, 5, 100 mM NaCl, 3 mM DTT. Reakce byla zastavena v různých časových úsecích a vždy bylo odebráno z reakční směsi 7,5 μΐ a tento objem byl opět nahrazen přídavkem 7,5 μΐ elučního pufru (Laemmli U. K., Nátuře, 227, 680-685, 1970), takto připravené vzorky byly podrobeny elektroforéze na 10 % polyakrilovém gelu v denaturujícím prostředí při 200 V podle předem popsaného protokolu (Laemmli U. K., Nátuře, 227, 680-685, 1970). Gel byl potom sušen a detekován pomocí zařízení pro detekci (Packard instruments),
-27CZ 296185 B6 které umožňuje určit množství variant podle vynálezu, které nebyly degradovány v průběhu reakce.
Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na Obrázku 14, který jasně ukazuje, že varianty V-325 a V-336 jsou rezistentnější než divoký protein p53 k denaturaci indukované E6, varianta V-325 vykazuje opět lepší vlastnosti v termínu rezistence k degradaci. Tyto výsledky odrážejí rozdíly citlivosti divokéko proteinu p53 a variant V-325 a V-336 k proteinu E6 pozorované na úrovni transkripční aktivity v předchozích pokusech (Obrázek 11 a 12).
Toto chování činí tyto dvě konstrukce výhodné zejména při léčení patologií spojených s infekcemi způsobenými HPV16 nebo HPV18.
D2.3. Vliv dominantního negativního mutantu proteinu p53 na transaktivační funkci
V tomto příkladu byl použit mutant H175 popsaný jako dominantní onkogenní a dominantní negativní oproti divokému proteinu p53. V tomto příkladu transfekce provedeného podle protokolu již dříve popsaného byly umístěny různé konstrukce stejně jako mutant H175 pod řízením promotoru CMV (pCDNA3). Každá konstrukce byla kotransfektovaná s růstovou koncentrací plazmidu exprimujícího mutant H175.
Výsledky uvedené na Obrázku 14 ukazují následující vlastnosti pro každou konstrukci:
- protein p53 snižuje svou transaktivační aktivitu v přítomnosti nadbytku mutované formy H175, to odpovídá fyziologické situaci, je známo, že tento typ v mutované formě je stabilnější než divoký protein p53, a je tedy vždy v nadbytku. Měří se tedy dominantní negativní vliv tohoto mutantu.
- protein AS vykazuje přírůstek citlivosti k dominantnímu negativnímu vlivu mutantu H175, protože je citlivý ke slabším koncentracím tohoto mutantu.
- naopak proteiny V-325 a V-336 nejsou jenom citlivější k vlivu dominantnímu negativnímu, ale jejich zvýšená aktivita je závislá na velikosti dávky přítomné mutované formy H175. Opět v tomto pokusu protein V-325 vykazuje tento zvýšený vliv vzhledem k proteinu V-336 potvrzující to trochu více ve svém možném statutu superdivokém.
D2.4. Vliv proteinu hdm2 na transaktivační funkci
Použité protokoly jsou identické k již dříve popsaným v příkladu Dl, I.V tomto příkladu transfekce byly konstrukce umístěny pod řízením promotoru CMV (pcDNA3), byly kotransfektovány s růstovou koncentrací plazmidu exprimujícího hdm2 (fragment 1-134) pod řízením promotoru CMV (pcDNA3). Výsledky získané v linii SAOS-2, uvedené na Obrázku 15, ukazují následující vlastnosti pro každou konstrukci:
- aktivita proteinu p53 se snižuje se zvyšováním koncentrace hdm2, což odpovídá fyziologické situaci
- protein V-325 se zdá být necitlivý k této inhibici hdm2.
Toto chování činí protein V-325 superdivokým kandidátem výhodným zejména pro léčení patologií spojených se superexpresí hdm2 a také při léčení patologií spojených se silnou expresí buněčných proteinů interagujících s N-koncem proteinu p53.
Výsledky těchto čtyř pokusů jasně ukazují, že varianty podle vynálezu, zejména varianty obsahující oblast 75-325-Iz nebo 75-336-Iz, představují 1) zvýšenou transaktivační aktivitu, 2) menší citlivost k vlivu proteinu E6 HPV18, 3) nepřítomnost citlivosti k dominantnímu negativnímu vlivu jistých mutantů proteinu p53 a vzrůst aktivity v takovém kontextu a 4) nepřítomnost
-28CZ 296185 B6 citlivosti k proteinu hdm2. Tyto různé vlastnosti jsou docela pozoruhodné a nečekané a udělují variantám podle vynálezu terapeutické význačné přednosti.
D3. Vliv na buněčný růst
Vliv konstrukcí V-325 a V-336 na buněčný růst byl testován současně s proteinem p53 na různých typech buněčných linií v pokusu o tvorbu rezistentních kolonií k neomycinu následující transfekci plazmidů exprimující tyto tři proteiny.
V tomto pokusu transfekce provedené podle protokolu již dříve popsaného byly umístěny různé konstrukce pod řízením promotoru CMV (pCDNA3).
Protokol tvorby kolonií rezistentních k neomycinu hodin po transfekci buňky byly odebrány a umístěny na Petriho misky o průměru 10 cm a podrobeny růstu s 10 ml kultivačního média DMEM s přídavkem 10 % plodového hovězího séra inaktivovaného teplem, které obsahuje 400 pg/ml geneticinu (G418). Po 15 dnech kultivace v přítomnosti G418 byl počet kolonií NeoR určen počítáním po barvení fuchsinem.
Tyto pokusy byly provedeny na různých typech buněk, jejichž statut proteinů p53 a Ras je uveden v Tabulce 2.
Tabulka 2: Statut buněčných linií použitých v testu tvorby kolonií NéoR
linie p53 Ras superexpres e hdm2 n00ATCC
SAOS-2 -/- ? - HTB85
HCT116 ? mutovaný Ki-Ras - CCL 247
H322 L248 ? - (*)
H460 divoký mutovaný Ki-Ras - HTB 177
HeLa divoký ? - CCL 2
OsA-CL ? ? +
(*) Putnám et al., Surg. Oncol., 1 (1993), 49 (**) Oliner et al., Nátuře, 358, (1992), 80
Výsledky pokusů jsou uvedeny v Tabulce 3 a na Obrázku 16.
Tabulka 3: Tvorba kolonií NéoR
linie vektor divoký p53 V-325 V-336
SAOS-2 253 17 12 13
HCT116 112 62 58 61
H322 93 5 2 3
H460 153 110 87 92
HeLa 172 151 31 47
Tyto výsledky ukazují, že konstrukce V-325 a V-336 mají schopnost blokovat buněčný růst způsobem alespoň tak účinným jako divoký protein p53 v buněčných kontextech, kde tento protein může normálně fungovat (divoký p53 nebo dvojnásobně deletovaný), ale především, že tyto kon-29 CZ 296185 B6 strukce zachovávají tyto aktivity dokonce i v buňkách, kde je divoký protein p53 velmi málo aktivní (buňky HeLa exprimující protein E6 HpV18 a buňky OsA-CL prezentující zvýšenou expresi proteinu hdm2). Tyto vlastnosti udělují variantám podle vynálezu významné terapeutické výhody.
D4. Apoptická aktivita variant podle vynálezu
Apoptická aktivita podle vynálezu byla studována za použití buněk EB, EB-1 a EB-V325 a podmínek indukce již dříve popsaných (příklad Dl).
Buňky takto indukované (106 buněk) byly fixovány a permeabilizovány inkubací po dobu 40 minut v 1 ml Permeafixu (Ortho Diagnostic Systems lne.), potom dvakrát promyty pufrem A (PBS (Gidco BRL) s přídavkem 0,5 % Tweenu 20), pak byly resuspendovány a inkubovány po dobu jedné hodiny a při okolní teplotě ve 100 μΐ pufru A s přídavkem 2 % BSA (PBS-BSA) a 1 pg monoklonální protilátky pAb240. Po dvou nových promytí pufrem PBS-BSA, buňky byly inkubovány po dobu jedné hodiny a při okolní teplotě v 100 μΐ stejného pufru s přídavkem 1 pg polyklonální protilátky sekundárně vázané k fluoresceinu (GAM-FITC (Immunotech)). Potom byly buňky dvakrát promyty pufrem A, resuspendovány v 1 ml stejného pufru obsahujícího, 5 mg propidium jodidu a 1 mg RNasy (DNasa-free) a inkubovány po dobu 30 minut při okolní teplotě, potom byly analyzovány cytomericky.
Výsledky pokusu 24 a 48 hodinové indukce provedené na buňkách EB-1 a EB-V325 jsou uvedeny na Obrázku 17. Za těchto podmínek buňky exprimující divoký protein p53 nebo jeho variantu V-325 (detekovaný protilátkami pAb240) jsou majoritně rozděleny na fázi G1 a sub-Gl (apoptóza) po 24 hodinách indukce a po 48 hodinách hlavně na sub-Gl. Tento výsledek jasně ukazuje, že protein V-325 je schopný, stejně jako divoký protein p53, indukovat apoptózu.
Výsledky kinetického pokusu indukce provedeného na buňkách EB a klonech EB-1 a EB-V325 uvedené na Obrázku 18 ukazují, že varianta V-325 indukuje rychleji a mohutněji apoptózu než divoký protein p53. S ohledem na fakt, že tyto dva proteiny se zdají být exprimovány na srovnatelných úrovních v klonech (viz Dl) výsledek připouští myšlenku zlepšení aktivity varianty V325 vzhledem k aktivitě divokého proteinu p53.
Seznam sekvencí (1) Všeobecné informace:
(i) podavatel:
(A) Jméno: RHONE-POULENC RORER S. A.
(B) Ulice: 20, Raymond ARON (C) Město: ANTONY (D) Země: Francie (E) Směrovací číslo: 92165 (G) Telefon: (1)40,91,69, 22 (H) Fax: (1)40,91,72,91 (ii) název vynálezu: Varianty proteinu p53 a jejich terapeutické použití (iii) počet sekvencí: 46 (iv) způsob luštění počítačem:
(A) Typ nosiče: Floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) systém využití: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Relase #1.0, Version #1.30 (OEB)
-30CZ 296185 B6 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 112 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 1:
AGATCTGAAG GCCTCAAGG AGAAGCTGAA GGCCCTGGAG GAGAAGCTGA50
AGGCCCTGGA GGAGAAGCTG AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC10
GATATCGCGGCC112 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 266 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 2:
AAGCTTGAAT TCGTTAACAT GTCCACGGCC CCCCCGACCG ATGTCAGCCT50
GGGGGACGAG CTCCACTTAG ACGGCGAGGA CGTGGCGATG GCGCATGCCG100
ACGCFCTAGA CGATTTCGAT CTGGACATGT TGGGGGACGG GGATTCCCCG150
GGGCCGGGAT TTACCCCCCA CGACTCCGCC CCCTACGGCG CTCTGGATAT200
GGCCGACTTC GAGTTTGAGC AGATGTTTAC CGATGCCCTT GGAATTGACG250
AGTACGGTGG TCGACC266 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 76 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 3:
TCGAGCCTGC AGCCTAGAGC CTTCCAAGCC CTCATGAAGG AGGAAAGCCC 50
AAACTGCTAG TGAGGATCCG CGGCCG 76 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 788 párů bází
-31 CZ 296185 B6 (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 4:
GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG ACCTGCACCA GCAGCTCCTA CACCGGCGGC 50 CCCTGCACCA GCCCCCTCCT GGCCCCTGTC ATCTTCTGTC CCTTCCCAGA 100 AAACCTACCA GGGCAGCTAC GGTTTCCGTC TGGGCTTCTT GCATTCTGGG 150 ACAGCCAAGT CTGTGACTTG CACGTACTCC CCTGCCCTCA ACAAGATGTT 200 TTGCCAACTG GCCAAGACCT GCCCTGTGCA GCTGTGGGTT GATTCCACAC 250 CCCCGCCCGG CACCCGCGTC CGCGCCATGG CCATCTACAA GCAGTCACAG 300 CACATGACGG AGGTTGTGAG GCGCTGCCCC CACCATGAGC GCTGCTCAGA 350 TAGCGATGGT CTGGCCCCTC CTCAGCATCT TATCCGAGTG GAAGGAAATT 400 TGCGTGTGGA GTATTTGGAT GACAGAAACA CTTTTCGACA TAGTGTGGTG 450 GTGCCCTATG AGCCGCCTGA GGTTGGCTCT GACTGTACC A CC ATCCACTA 500 CAACTACATG TGTAACAGTT CCTGCATGGG CGGCATGAAC CGGAGGCCCA 550 TCCTCACCAT CATCACACTG GAAGACTCCA GTGGTAATCT ACTGGGACGG 600 AACAGCTTTG AGGTGCGTGT TTGTGCCTGT CCTGGGAGAG ACCGGCGCAC 650 AGAGGAAGAG AATCTCCGCA AGAAAGGGGA GCCTCACCAC GAGCTGCCCC 700 CAGGGAGCAC TAAGCGAGCA CTGCCCAACA ACACCAGCTC CTCTCCCCAG 750 CCAAAGAAGA AACCACTGGA TGGGGATCCG CGGCCGCC 788 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 821 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken:jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 5:
GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG ACCTGCACCA GCAGCTCCTA CACCGGCGGC 50 CCCTGCACCA GCCCCCTCCT GGCCCCTGTC ATCTTCTGTC CCTTCCCAGA 100 AAACCTACCA GGGCAGCTAC GGTTTCCGTC TGGGCTTCTT GCATTCTGGG 150 ACAGCCAAGT CTGTGACTTG CACGTACTCC CCTGCCCTCA ACAAGATGTT 200 TTGCCAACTG GCCAAGACCT GCCCTGTGCA GCTGTGGGTT GATTCCACAC 250 CCCCGCCCGG CACCCGCGTC CGCGCCATGG CCATCTACAA GCAGTCACAG 300 CACATGACGG AGGTTGTGAG GCGCTGCCCC CACCATGAGC GCTGCTCAGA 350 TAGCGATGGT CTGGCCCCTC CTCAGCATCT TATCCGAGTG GAAGGAAATT 400 TGCGTGTGGA GTATTTGGAT GACAGAAACA CTTTTCGACA TAGTGTGGTG 450 GTGCCCTATG AGCCGCCTGA GGTTGGCTCT GACTGTACCA CCATCCACTA 500 CAACTACATG TGTAACAGTT CCTGCATGGG CGGCATGAAC CGGAGGCCCA 550 TCCTCACCAT CATCACACTG GAAGACTCCA GTGGTAATCT ACTGGGACGG 600 AACAGCTTTG AGGTGCGTGT TTGTGCCTGT CCTGGGAGAG ACCGGCGCAC 650 AGAGGAAGAG AATCTCCGCA AGAAAGGGGA GCCTCACCAC GAGCTGCCCC 700 CAGGGAGCAC TAAGCGAGCA CTGCCCAACA ACACCAGCTC CTCTCCCCAG 750 CCAAAGAGA AACCACTGGA TGGAGAATAT TTCACCCTTC AGATCCGTGG 800 GCGTGAGGAT CCGCGGCCGC C 821
-32CZ 296185 B6 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 15 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 6:
ATGGAGGAGCCGCAG 15 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 42 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 7:
GGCGGCCGCG ATATCGATTC ATCAGTCTGA GTCAGGCCCT TC 42 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 36 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 8:
GGCGGCCGCG ATATCGATTC ATCAGCTCGA GTGAGC 3 6 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 9:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 43 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 9:
-33CZ 296185 B6
TCGAGCCTGC AGCCTAGAGC CTTCCAAGCC CTCATGAAGG AGG 43 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 10:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 10:
AAAGCCCAAA CTGCTGATGA ATCGATATCG C 31 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 11:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 30 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 11:
TGAGGGCTTG GAAGGCTCTA GGCTGCAGGC 30 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 12:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 44 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 12:
GGCCGCGATA TCGATTCATC AGCAGTTTGG GCTTTCCTCC TTCA 44 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 13:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 13:
-34CZ 296185 B6
GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG ACCTGCACCA GCAGCTCCT 39 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 14:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 32 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 14:
GGCGGCCGCG GATCCCCATC CAGTGGTTTC TT 32 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 15:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 32 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 15:
ATCTGAATGG CGCTC 15 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 16:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 32 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 16:
GGCGGCCGCG GATCCTCACG CCCACGGATC TG 32 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 17:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 17:
-35 CZ 296185 B6
AAGCTTGAAT TCGTTAACAT GTCCACGGCC CCCCCGACC 39 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 18:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 23 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 18:
GGTCGACCAC CGTACTCGTC AAT 23 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 19:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 19:
GATCTGAAGG CCCTCAAGGA GAAGCTGAAG GCC 33 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 20:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 36 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken:jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 20:
CTGGAGGAGA AGCTGAAGGC CCTGGAGGAG AAGCTG 36 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 21:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 38 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 21:
-36CZ 296185 B6
AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC GATATCGC 38 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 22:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 42 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 22:
AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC GATATCGC 38 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 23:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 42 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 23:
TAGTGCCTTC AGCTTCTCCT CCAGGGCCTT CAGCTT 3 6 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 24:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 24:
GGCCGCGATA TCGATTCATC ATCGCTCCCC CAG 33 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 25:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 1095 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken:jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
-37CZ 296185 B6 (A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1... 1095 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 25:
ATG ACG GCC CCC CCG ACC GAT GAC AGC CTG GGG GAC GAG 42
Met Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu
1 5 10
CTC CAC TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC 84
Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp
15 20 25
GCG CTA GAC GAT TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT 126
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp
30 35 40
TCC CCG GGG CCG GGA TTT ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC 168
Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr
45 50 55
GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC GAG TTT GAG CAG ATG TTT 210
-38 CZ 296185 B6
Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu 65 Phe Glu Gin Met Phe 70
60
ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT GGT CGA CCT GCA 252
Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Arg Pro Ala
75 80
CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT ACA CCA GCC CCC TCC 294
Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser
85 90 95
TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin
100 105 110
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA 378
Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr
115 120 125
GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG 420
Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys
130 135 140
ATG TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG 462
Met Phe Cys Gin Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp
145 150
GTT GAT TCC ACA CCC TCG CCC GGC ACC CGC GTC CC-C GCC ATG 504
Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met
155 160 165
GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC ATG TCG GAG GTT GTG AGG 546
Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His Met Thr Glu Val Val Arg
170 175 180
CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG 588
Arg Cys Pro His His Glu Arg cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu
185 190 195
GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT TTG CGT 630
Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg val Glu Gly Asn Leu Arg
200 205 210
GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG 672
Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val
215 220
-39 CZ 296185 B6
GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC 714
Vál Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Giy Ser Asp Cys Thr
225 230 235
ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATG TOT* AAC AGT TCC TGC ATG GGC 756
Thr lle His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly
240 245 250
GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA 798
Gly Met Asn Arg Arg Pro lle Leu Thr lle lle Thr Leu Glu
255 260 265
GAC TCC AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG 840
Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
270 275 280
CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA 882
Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu
285 290
GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC 924
Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro
295 300 305
CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC AGC TCC 966
Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser
310 315 320
TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGG GAT CTG AAG 1008
Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Asp Leu Lys /
325 330 335
GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG 1050
Ala Leu Lys Glu Lys Leu Lys Ala Leu Glu Glu Lys Leu Lys
340 345 350
GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA 1092
Ala Leu Glu G1U Lys Leu Lys Ala Leu Val Gly Glu Arg *
355 360
TGA ir
365 1095
-40CZ 296185 B6 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 26:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 1128 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1. . .1128 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 26:
ATG TCC ACG GCC CCC Met Ser Thr Ala Pro CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC Asp Glu Leu His 380 48
Pro Thr Asp Val Ser Leu 375 Gly
370
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96
Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala Mis Ala Asp Ala Leu Asp Asp
385 390 395
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe
400 405 410
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe
415 420 425
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp G1U Tyr Gly
430 435 440 445
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
450 455 460
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT tct GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin. Lys Thr Tyr Gin
465 470 475
-41 CZ 296185 B6
GGC AGC TAC Gly Ser Tyr GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Phe Arg Leu Gly 485 Phe Leu His Ser Gly 490 Thr Ala Lys
480
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe cys Gin
495 500 505
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA ccc CCG 480
Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro
510 515 520 525
ccc GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His
530 535 540
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp
545 550 555
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu cly Asn
560 565 570
TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG 672
Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val
575 580 585
GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC 720
Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile
590 595 600 605
CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG 768
His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg
610 615 620
AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA 816
Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu
625 630 635
CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 864
Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg
640 645 650
GAC CGG ČGC ÁČA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC 912
Asp Arg Arg Thr G1U Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys cly Glu Pro His
655 660 665
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC 960
His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr
670 675 680 685
AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGA GAA TAT TTC 1008
Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe
690 695 700
ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG 1056
Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg Glu Asp Leu Lys Ala Leu Lys G1U Lys
705 710 715
CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG 1104
Leu Lys Ala Leu Glu Glu Lys Leu Lys Ala Leu Glu Glu Lys Leu Lys
720 725 730
GCA CTA GTG GGG GAG CGA . TGA TGA 11 28
Ala Leu Val Gly Glu Arg ♦ *
735 740
-42 CZ 296185 B6 (2) Informace pro sekvenCi SEQ ID NO: 27:
(i) charakteristika sekvenCe:
(A) délka: 765 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE to (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1.. .765 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 27:
ATC Met TCC ACG GCC CCC Pro CCG ACC GAT Pro Thr Asp GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48
Ser Thr Ala 330 Val 385 Ser Leu Gly Asp Glu Leu His 390
TTA GAC GCC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96
Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp
395 400 405
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
.Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Cly Asp Ser Pro cly Pro Gly Phe
410 415 420
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro H1S Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe
425 430 435 440
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly
445 450 455
-43 CZ 296185 B6
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT Ala CCT Pro ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala Pro 460 Ala Thr 465 Pro Ala Ala Pro Ala 470 Pro Ala
CCC TCC ,TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin
475 480 485
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser cly Thr Ala Lys
490 495 500
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin
505 510 515 520
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro
525 530 535
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
Pro Gly Thr Arg val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His
540 545 550
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp
555 560 565
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn
570 575 580
TTG CGT GTG GAG TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC 672
Leu Arg Val Glu Tyr Phe Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe
585 590 595 600
GAG ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG 720
Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin
605 610 615
GCT GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT CAC TCG AGC TGA TGA 765
Ala cly Lys Glu Pro ciy ciy Ser Arg Ala His Ser Ser ♦ ♦
620 625 630 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 28:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 816 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární ío (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1. . .816 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 28
-44CZ 296185 B6
ATG Met TCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC His 48
Ser Thr Ala Pro Pro Thr 260 Asp Val Ser 265 Leu Gly Asp Glu Leu 270
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96
Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp
275 280 285
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe
290 295 300
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe
305 310 315
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly
320 325 330 335
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
340 34.5 350
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin
355 360 365
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys
370 375 380
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin
385 390 395
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro
400 405 410 415
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His
420 425 430
-45 CZ 296185 B6
ATG ACG Met Thr GAG GTT Glu Val 435 GTG AGG CGC Arg TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Val Arg Cys Pro 440 His HiS Glu Arg Cys Ser Asp 445
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn
450 455 460
TTG CGT GTG GAG TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC 672
Leu Arg Val Glu Tyr Phe Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe
465 470 475
GAG ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG 720
Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin
480 485 490 495
GCT GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT CAC TCG AGC CTG CAG CCT 768
Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala HiS Ser Ser Leu Gin Pro
500 505 510
AGA GCC TTC CAA GCC CTC ATG AAG GAG GAA AGC CCA AAC TGC TGA TGA 816
Arg Ala Phe Gin Ala Leu Met Lys G1U Glu Ser Pro Asn Cys ♦ *
515 520 525
(2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 29:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 1209 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1.. .1209 (xi) popis sekvenCe: SEQ Π) NO 29:
-46CZ 296185 B6
ATC TCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC
Met Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His 275 280 285
TTA Leu GAC Asp 290 GGC GAG GAC GTG GCG ATG Ala Met 295 GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT Asp 96
Gly Glu Asp Val Ala His Ala Asp 300 Ala Leu Asp
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 1 44
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe
305 310 315 320
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe
325 330 335
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly
340 345 350
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
355 360 365
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin
370 375 380
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys
385 390 395 400
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe cys Gin
405 410 415
CTG GcC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro
420 425 430
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His
435 440 445
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp
450 455 460
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn
465 470 475 480
TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG 672
Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val
485 490 495
GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC 720
Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile
500 505 510
CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATC GGC GGC ATG AAC CGG 768
His Tyr Asn Tyr Met cys Asn. Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg
515 520 525
-47CZ 296185 B6
AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA 816
Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile 535 Thr Leu Glu Asp Ser 540 Ser Gly Asn Leu
530
CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 864
Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg
545 550 555 560
GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC 912
Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His
565 570 575
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC 960
His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr
580 585 590
AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGA GAA TAT TTC 1008
Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe
595 600 605
ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG ATG TTC CGA GAG CTG 1056
Thr Leu Gin ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu
610 615 620
AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT GGG AAG GAG CCA GGG 1104
Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin Ala Gly Lys Glu Pro Gly
625 630 635 640
GGG AGC AGG GCT CAC TCC AGC CAC CTG AAG TCC AAA AAG GGT CAG TCT 1152
Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gin Ser
645 650 655
ACC TCC CGC CAT AAA AAA CTC ATG TTC AAG ACA GAA GGG CCT GAC TCA 1200
Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser
660 665 670
GAC TGA TGA
Asp * *
675
1209 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 30:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 1149 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: CDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1.. .1149 (xi) popis sekvenCe: SEQ ID NO 30:
-48 CZ 296185 B6
ATG GCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT Thr Asp GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48
Met 1 Ala Thr Ala Pro 5 Pro Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His
10 15
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96
Leu Asp Gly Glu 20 Asp Val Ala Met Ala 25 His Ala Asp Ala Leu 30 ASP Asp
TTC GAT CTG GAC ATG TTC GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
Phe Asp Leu 35 Asp Met Leu Gly Asp 40 Gly Asp Ser Pro Gly 45 Pro Gly Phe
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro 50 HiS Asp Ser Ala Pro 55 Tyr Gly Ala Leu Asp 60 Met Ala Asp Phe
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu 65 Phe Glu Gin Met Phe 70 Thr Asp Ala Leu Gly 75 lle Asp Glu Tyr Gly 80
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala Pro 85 Ala Ala Pro Thr Pro 90 Ala Ala Pro Ala Pro 95 Ala
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro 100 Leu Ser Ser Ser Val 105 Pro Ser Gin Lys Thr 110 Tyr Gin
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser Tyr 115 Gly Phe Arg Leu Gly 120 Phe Leu His Ser Gly 125 Thr Ala Lys
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val 130 Thr Cys Thr Tyr Ser 135 Pro Ala Leu Asn Lys 140 Met Phe Cys Gin
CTG GCC AAG ACC TCC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu 145 Ala Lys Thr Cys Pro 150 Val Gin Leu Trp Val 155 Asp Ser Thr Pro Pro 160
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
Pro Gly Thr Arg Val 165 Arg Ala Met Ala lle 170 Tyr Lys Gin Ser Gin 175 His
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp
180 185 190
49CZ 296185 B6
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn 624
195 200 205
TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT ‘ AGT GTG 672
Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val
210 215 220
GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC 720
val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile
225 230 235 240
CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATC GGC GGC ATC AAC CGG 768
His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg
245 250 255
AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA 816
Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu
260 265 270
CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTC CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 864
Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala cys Pro Gly Arg
275 280 285
GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC 912
Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His
290 295 300
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC 960
His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr
305 310 315 320
AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGA GAA TAT TTC 1008
Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe
325 330 335
ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG ATC TTC CGA GAG GAT 1056
Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg G1U Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Asp
340 345 350
CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG i GAG AAG CTG AAG 1104
Leu Lys Ala Leu Lys Glu Lys Leu Lys . Ala Leu i Glu < Glu Lys Leu Lys
355 360 365
GCC CTG GAG GAG . AAG CTC . AAG ’ GCA · CTA < GTG ' GGG GAG CGA TGA TGA 1 1 49
Ala Leu Glu ' Glu : tys Leu : Lys . Ala : Leu ' Val ' Gly Glu Arg *
370 375 380 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 31: 5 (i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 1611 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární ío (ii) typ molekuly: CDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1... 1611 (xi) popis sekvenCe: SEQ ID NO 31:
-50CZ 296185 B6
ATC GCC CAG GTC CAG CTC CAG GAG TCA GGG GCA GAG CTT GTC GGG TCA 48
MET 1 ALA GLN VAL GLN 5 LEU GLN GLU SER GLY 10 ALA GLU LEU VAL GLY SER 15
GGG GCC TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA 96
GLY ALA SER VAL 20 LYS LEU SER CYS THR 25 ALA SER GLY PHE ASN 30 ILE LYS
GAC TAC TAT ATC CAC TGG GTC AAG CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG GAG 144
ASP TYR TYR 35 MET HIS TRP VAL LYS 40 GLN ARG PRO GLU GLN 45 GLY LEU GLU
TGG ATT GGA TCG ATT GAT CCT GAG AAT GGT GAT ACT GAA TAT GCC CCG 192
TRP ILE 50 GLY TRP ILE ASP PRO 55 GLU ASN GLY ASP THR 60 GLU TYR ALA PRO
AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AAT ACA 240
LYS 65 PHE GLN GLY LYS ALA 70 THR MET THR ALA ASP 75 THR SER SER ASN THR 80
GCC TAC CTC CAG CTC AGC ACC CTC GCA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT 288
ALA TYR LEU GLN LEU 85 SER SER LEU ALA SER 90 GLU ASP THR ALA VAL 95 TYR
TAT TGT AAT TTT TAC GGG GAT GCT TTG GAC TAC TCG GGC CAA GGG ACC 336
TYR CYS ASN PHE 100 TYR GLY ASP ALA LEU 105 ASP TYR TRP GLY GLN 110 GLY THR
ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT 384
THR VAL THR 115 VAL SER SER GLY GLY 120 GLY GLY SER GLY GLY 125 GLY GLY SER
GGC GGT GGC GGA TCG GAT GTT TTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC ACT TTC 432
GLY GLY 130 GLY GLY SER ASP VAL 135 LEU MET THR GLN THR 140 PRO LEU THR LEU
TCG GTT ACC ATT GGA CAA CCA GCC TCC ATC TCT TCC AAG TCA AGT CAG 480
SER 145 VAL THR ILE GLY GLN 150 PRO ALA SER ILE SER 155 CYS LYS SER SER GLN 160
-51 CZ 296185 B6
AGC CTC TTG GAT AGT GAT GGa AAG ACA TAT TTG AAT TGG TTG TTA CAG528
SER LEU LEU ASP SER ASP GLY LYS THR TYR LEU ASN TRP LEU LEUGLN
165 170175
AGG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CGC CTA ATC TAT CTG GTG TCT AAA CTG576
ARG PRO GLY GLN SER PRO LYS ARG LEU ILE TYR LEU VAL SER LYSLEU
180 185190
GAC TCT GGA GTC CCT GAC AGG TTC ACT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT624
ASP SER GLY VAL PRO ASP ARG PHE THR GLY SER GLY SER GLY THRASP
195 200205
TTC ACA CTG AAA ATC AAC AGA GTG GAG GCT GAG GAT TTG GGA GTT TAT672
PHE THR LEU LYS ILE ASN ARG VAL GLU ALA GLU ASP LEU GLY VALTYR
210 215220
TAT TGC TGG CAA GGT ACA CAT TCT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC720
TYR CYS TRP GLN GLY THR HIS SER PRO LEU THR PHE GLY ALA GLYTHR
775 230 235240
AAG CTG GAG CTG AAA CGG GCG GCC GCA TTG CAG ACG CGT CGA CCT GCA768
LYS LEU GLU LEU LYS ARG ALA ALA ALA LEU GLN THR ARG ARG PRO ALA
245 250255
CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC816
PRO ALA ALA PRO THR PRO ALA ALA PRO ALA PRO ALA PRO SER TRPPRO
260 265270
CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT864
LEU SER SER SER VAL PRO SER GLN LYS THR TYR GLN GLY SER TYRGLY
275 280285
TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC912
PHE ARG LEU GLY PHE LEU HIS SER GLY THR ALA LYS SER VAL THRCYS
290 295300
ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC960
THR TYR SER PRO ALA LEU ASN LYS MET PHE CYS GLN LEU ALA LYSTHR
305 310 315320
TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC1008
CYS PRO VAL GLN LEU TRP VAL ASP SER THR PRO PRO PRO GLY THRARG
325 330335
GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG CTT1056
VAL ARG ALA MET ALA ILE TYR LYS GLN SER GLN HIS MET THR GLUVAL
340 345350
GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG1104
VAL ARG ARG CYS PRO HIS HIS GLU ARG CYS SER ASP SER ASP GLY LEU
355 360365
GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG1152
ALA PRO PRO GLN HIS LEU ILE ARG VAL GLU GLY ASN LEU ARG VAL GLU
370 375380
TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT1200
TYR LEU ASP ASP ARG ASN THR PHE ARG HIS SER VAL VAL VAL PRO TYR
385 390 395400
-52 CZ 296185 B6
GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC 1248
GLU PRO PRO GLU VAL GLY 405 SER ASP CYS THR 410 THR ILE HXS TYR ASN 415 TYR
ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC 1296
MET CYS ASN SER SER CYS MET GLY GLY MET ASN ARG ARG PRO ILE LEU
420 425 430
ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC 1344
THR ILE ILE THR LEU GLU ASP SER SER GLY ASN LEU LEU GLY ARG ASN
435 440 445
AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA 1392
SER PHE GLU VAL ARG VAL CYS ALA CYS PRO GLY ARG ASP ARG ARG THR
450 455 460
GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC 1440
GLU GLU GLU ASN LEU ARG LYS LYS GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO
465 470 475 480
CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC 1488
PRO GLY SER THR LYS ARG ALA LEU PRO ASN ASN THR SER SER SER PRO
485 490 495
CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG 1536
GLN PRO LYS LYS LYS PRO LEU ASP GLY ASP LEU LYS ALA LEU LYS GLU
500 505 510
AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG 1584
LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU
515 520 525
AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA TGA 1611
LYS ALA LEU VAL GLY GLU ARG * *
530 535 (2) Informace pro Sekvenci SEQ ID NO: 32:
(i) charakteristika sekvenCe:
(A) dolka: 1065 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1. . .1065 (xi) popis sekvenCe: SEQ ID NO 32:
-53 CZ 296185 B6
ATG GGA GAA TAT TTC PHE 5 ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC PHE 15 GAG GLU 48
MET 1 GLY GLU TYR THR LEU GLN ILE ARG GLY 10 ARG GLU ARG
ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT 96
MET PHE ARG GLU 20 LEU ASN GLU ALA LEU 25 GLU LEU LYS ASP ALA 30 GLN ALA
GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT CAC TCC AGC CAC CTG AAG TCC 144
GLY LYS GLU 35 PRO GLY GLY SER ARG 40 ALA HIS SER SER HIS 45 LEU LYS SER
AAA AAG GGT CAG TCT AC<~ TCC CGC CAT AAA AAA CTC ATG TTC AAG ACA 192
LYS LYS 50 GLY GLN SER THR SER 55 ARG HIS LYS LYS LEU 60 MET PHE LYS THR
GAA GGG CCT GAC TCA GAC GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG 240
GLU 65 GLY PRO ASP SER ASP 70 GLY ARG PRO ALA PRO 75 ALA ALA. .PRO THR PRO 80
GCG GCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT 288
ALA ALA PRO ALA PRO 85 ALA PRO SER TRP PRO 90 LEU SER SER SER VAL 95 PRO
TCC CAG AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG 336
SER GLN LYS THR 100 TYR GLN GLY SER TYR 105 GLY PHE ARG LEU GLY 110 PHE LEU
CAT TCT GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC 384
HIS SER GLY 115 THR ALA LYS SER VAL 120 THR CYS THR TYR SER 125 PRO ALA LEU
AAC AAG ATG TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG 432
ASN LYS 130 MET PHE CYS GLN LEU 135 ALA LYS THR CYS PRO 140 VAL GLN LEU TRP
GTT GAT TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC 480
VAL 145 ASP SER THR PRO PRO 150 PRO GLY THR ARG VAL 155 ARG ALA MET ALA ILE 160
TAC AAG CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC 528
TYR LYS GLN SER GLN 165 HIS MET THR GLU VAL 1 70 VAL ARG ARG CYS PRO 175 HIS
CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT 576
HIS GLU ARG CYS 180 SER ASP SER ASP GLY 185 LEU ALA PRO PRO GLN 190 HIS LEU
ATC CGA GTG GAA. GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC 624
ILE ARG VAL 195 GW GLY ASN LEU ARG 200 VAL GLU TYR LEU ASP 205 ASP ARG ASN
-54CZ 296185 B6
ACT TTT THR PHE CGA CAT AGT SER GTG GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC 672
ARG HIS VAL VAL VAL 215 PRO TYR GLU PRO 220 PRO GLU VAL GLY
210
TCT GAC TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC 720
SER 225 ASP CYS THR THR ILE 230 HIS TYR ASN TYR MET 235 CYS ASN SER SER CYS 240
ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA 768
MET GLY GLY MET ASN 245 ARG ARG PRO ILE LEU 250 THR ILE ILE THR LEU 255 GLU
GAC TCC AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT 816
ASP SER SER GLY 260 ASN LEU LEU GLY ARG 265 ASN SER PHE GLU VAL 270 ARG VAL
TGT GCC TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC 864
CYS ALA CYS 275 PRO GLY ARG ASP ARG 280 ARG THR GLU GLU GLU 285 ASN LEU ARG
AAG AAA GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA 912
LYS LYS 290 GLY GLU PRO HIS HIS 295 GLU LEU PRO PRO GLY 300 SER THR LYS ARG
„SCA..CTG CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA 960
ALA 305 LEU PRO ASN ASN THR 310 SER SER SER PRO GLN 315 PRO LYS LYS LYS PRO 320
CTG GAT GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG 1008
LEU ASP GLY ASP LEU 325 LYS ALA LEU LYS GLU 330 LYS LEU LYS ALA LEU 335 GLU
GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG 1056
GLU LYS LEU LYS 340 ALA LEU GLU GLU LYS 345 LEU LYS ALA LEU VAL 350 GLY GLU
CGA TGA TGA 1065
ARG * ilr 355
(2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 33:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 963 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA io (iii) hypotetický: NE v(iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1.. .963 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 33:
-55 CZ 296185 B6
ATG GGA GAA TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC GLU ARG TTC PHE 15 GAG GLU 48
MET 1 GLY GLU TYR PHE 5 THR LEU GLN ILE ARG 10 GLY ARG
ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT 96
MET PHE ARG GLU 20 LEU ASN GLU ALA LEU 25 GLU LEU LYS ASP ALA 30 GLN ALA
GGG AAG GAG CCA GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC 144
GLY LYS GLU 35 PRO GLY ARG PRO ALA 40 PRO ALA ALA PRO THR 45 PRO ALA ALA
CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG 192
PRO ALA 50 PRO ALA PRO SER TRP 55 PRO LEU SER SER SER 60 VAL PRO SER GLN
AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT 240
LYS 65 THR TYR GLN GLY SER 70 TYR GLY PHE ARG LEU 75 GLY PHE LEU HIS SER 80
GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG 288
GLY THR ALA LYS SER 85 VAL THR CYS THR TYR 90 SER PRO ALA LEU ASN 95 LYS
ATC TTT TGC CAA CTC GCC AAG ACC TCC CCT GTC CAG CTC TCG GTT GAT 336
MET PHE CYS GLN 100 LEU ALA LYS THR CYS 105 PRO VAL GLN LEU TRP 110 VAL ASP
TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATC GCC ATC TAC AAG 384
SER THR PRO 115 PRO PRO GLY THR ARG 120 VAL ARG ALA MET ALA 125 ILE TYR LYS
CAG TCA CAG CAC ATC ACG GAG GTT GTG AGG CGC TCC CCC CAC CAT GAG 432
GLN SER 130 GLN HIS MET THR GLU 135 VAL VAL ARG ARG CYS 140 PRO HIS HIS GLU
CGC TCC TCA GAT AGC GAT GGT CTC GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA 480
ARG 145 CYS SER ASP SER ASP 150 GLY LEU ALA PRO PRO 155 GLN HIS LEU ILE ARG 160
GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG CAT GAC AGA AAC ACT TTT 528
VAL GLU GLY ASN LEU 165 ARG VAL GLU TYR LEU 170 ASP ASP ARG ASN THR 175 PHE
CGA CAT AGT GTG GTC GTG CCC TAT CAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC 576
ARG HIS SER VAL 180 VAL VAL PRO TYR GLU 185 PRO PRO GLU VAL GLY 190 SER ASP
-56CZ 296185 B6
TGT CYS ACC ACC ATC CAC TAC AAC TYR ASN TAC ATC TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GLY 624
THR THR ILE 195 HIS TYR 200 MET CYS ASN SER SER 205 CYS MET
GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC 672
GLY MET ASN ARG ARG PRO ILE LEU THR ILE ILE THR LEU GLU ASP SER
210 215 220
AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC 720
SER GLY ASN LEU LEU GLY ARG ASN SER PHE GLU VAL ARG VAL CYS ALA
225 230 235 240
TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA 768
CYS PRO GLY ARG ASP ARG ARG THR GLU GLU GLU ASN LEU ARG LYS LYS
245 250 255
GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG 816
GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO PRO GLY SER THR LYS ARG ALA LEU
260 265 270
CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT 864
PRO ASN ASN THR SER SER SER PRO GLN PRO LYS LYS LYS PRO LEU ASP
275 280 285
GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG 912
GLY ASP LEU LYS ALA LEU LYS GLU LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS
290 295 300
CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA 960
LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU LYS ALA LEU VAL GLY GLU ARG *
305 lín 315 320
TGA 963 ★
(2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 34:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 1011 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA io (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1. . .1011
-57CZ 296185 B6
ATC MET 1 GGA GLY (xi) popis sekvence: SEO ID NO 34 CGC ARG TTC PHE 15 GAG GLU 48
GAA TAT GLU TYR TTC ACC CTT CAG ATC PHE THR LEU GLN ILE 5 CGT GGG CGT GAG ARG GLY ARG GLU 10
ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT 96
MET PHE ARG GLU 20 LEU ASN GLU ALA LEU 25 GLU LEU LYS ASP ALA 30 GLN ALA
GGG AAG GAG CCA GGT CGA GGA GGT GGT GGC TCT GGA GGC GGA GGA TCC 144
GLY LYS GLU 35 PRO GLY ARG GLY GLY 40 GLY GLY SER GLY GLY 45 GLY GLY SER
GGC GGT GGA GGT TCT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCC GCC 192
GLY GLY 50 GLY GLY SER ARG PRO 55 ALA PRO ALA ALA PRO 60 THR PRO ALA ALA
CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG 240
PRO 65 ALA PRO ALA PRO SER 70 TRP PRO LEU SER SER 75 SER VAL PRO SER GLN 80
AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTC GGC TTC TTG CAT TCT 238
LYS THR TYR GLU GLY 85 SER TYR GLY PHE ARG 90 LEU GLY PHE LEU HIS 95 SER
GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG 336
GLY THR ALA LYS 100 SER VAL THR CYS THR 105 TYR SER PRO ALA LEU 110 ASN LYS
ATG TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTC CAG CTG TGG GTT GAT 384
MET PHE CYS 1 1 5 GLN LEU ALA LYS THR 120 CYS PRO VAL GLN LEU 125 TRP VAL ASP
TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG 432
SER THR 130 PRO PRO PRO GLY THR 135 ARG VAL ARG ALA MET 140 ALA ILE TYR LYS
CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG 480
GLN 145 SER GLN HIS MET THR 150 GLU VAL VAL ARG ARG 155 CYS PRO HIS HIS GLU 160
CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA 528
ARG CYS SER ASP SER 165 ASP GLY LEU ALA PRO 170 PRO GLN HIS LEU ILE 175 ARG
GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT 576
VAL GLU GLY ASN 180 LEU ARG VAL GLU TYR 185 LEU ASP ASP ARG ASN 190 THR PHE
CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC 624
ARG HIS SER 195 VAL VAL VAL PRO TYR 200 GLU PRO PRO GLU VAL 205 GLY SER ASP
TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC 672
CYS THR THR ILE HIS TYR ASN TYR MET CYS ASN SER SER CYS MET GLY
2)0 215 220
58CZ 296185 B6
GGC ATG AAC CGG AGG ARG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ILE 235 ACA CTG GAA GAC TCC SER 240 720
GLY 225 MET ASN ARG PRO 230 ILE LEU THR ILE THR LEU GLU ASP
AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC 768
SER GLY ASN LEU LEU GLY ARG ASN SER PHE GLU VAL ARG VAL CYS ALA
245 250 255
TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA 816
CYS PRO GLY ARG ASP ARG ARG THR GLU GLU GLU ASN LEU ARG LYS LYS
260 265 270
GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG 864
GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO PRO GLY SER THR LYS ARG ALA LEU
275 280 285
CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT 912
PRO ASN ASN THR SER SER SER PRO GLN PRO LYS LYS LYS PRO LEU ASP
290 295 300
GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG 960
GLY ASP LEU LYS ALA LEU LYS GLU LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS
305 310 315 320
CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA 1008
LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU LYS ALA LEU VAL GLY GLU ARG *
325 330 335
TGA
101 1 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 35:
(i) charakteristika sekvenCe:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: CDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1. . .1095 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 35:
CGGATCCTCT CGGAACATCT CGAA (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 36:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 749 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: CDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS
-59CZ 296185 B6 (B) umístění: 1.. .749 (xi) popis sekvence:- SEQ ID NO 36:
GCCATGGCCC AGGTGCAGCT GCAGGAGTCA GGGGCAGAGC TTGTGGGGTC AGGGGCCTCA 60
GTCAAGTTGT CCTGCACAGC TTCTGGCTTC AACATTAAAG ACTACTATAT GCACTGGGTG 120
AAGCAGAGGC CTGAACAGGG CCTGGAGTGG ATTGGATGGA TTGATCCTGA GAATGGTGAT 180
ACTGAATATG CCCCGAAGTT CCAGGGCAAG GCCACTATGA CTGCAGACAC ATCCTCCAAT 240
ACAGCCTACC TGCAGCTCAG CAGCCTGGCA TCTGAGGACA CTGCCGTCTA TTATTGTAAT 300
TTTTACGGGG ATGCTTTGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCA CGGTCACCGT CTCCTCAGGT 360
GGAGGCGGTT CAGGCGGAGG TGGCTCTGGC GGTGGCGGAT CGGATGTTTT GATGACCCAA 420
ACTCCACTCA CTTTGTCGGT TACCATTGGA CAACCAGCCT CCATCTCTTG CAAGTCAAGT 480
CAGAGCCTCT TGGATAGTGA TGGAAAGACA TATTTGAATT GGTTGTTACA GAGGCCAGGC 540
CAGTCTCCAA AGCGCCTAAT CTATCTGGTG TCTAAACTGG ACTCTGGAGT CCCTGACAGG 600
TTCACTGGCA GTGGATCAGG GACAGATTTC ACACTGAAAA TCAACAGAGT GGAGGCTGAG 660
GATTTGGGAG TTTATTATTG CTGGCAAGGT ACACATTCTC CGCTCACGTT CGGTGCTGGG 720
ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCGGCCGC (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 37:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 45 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 37:
AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTT 45 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 38:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 38:
GGGTCGACCT GGCTCCTTCC CAGG 24
-60CZ 296185 B6 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 39:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 749 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 39:
AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTTCAGAT CCGTGGGCGT 60
GAGCGCTTCG AGATGTTCCG AGAGCTGAAT GAGGCCTTGG AACTCAAGGA TGCCCAGGCT 120
GGGAAGGAGC CAGGTCGACC C 141 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 40.
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: CDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 40:
GGGTCGACCG TCTGAGTCAG GCCCTTC 27 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 41:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 749 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: CDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvenCe: SEQ ID NO 41:
AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTTCAGAT CCGTGGGCGT60
GAGCGCTTCG AGATGTTCCG AGAGCTGAAT GAGGCCTTGG AACTCAAGGA TGCCCAGGCT120
GGGAAGGAGC CAGGGGGGAG CAGGGCTCAC TCCAGCCACC TGAAGTCCAA AAAGGGTCAG180
TCTACCTCCC GCCATAAAAA ACTCATGTTC AAGACAGAAG GGCCTGACTC AGACGGTCGA 240 ccc 243 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 42:
(i) charakteristika sekvence:
-61 CZ 296185 B6 (A) délka: 48 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken:jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvenCe: SEQ ID NO 42:
TCGAGGAGGT GGTGGCTCTG GAGGCGGAGG ATCCGGCGGT GGAGGTTC 48 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 43:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 48 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 43:
TCGAGAACCC CTACCGCCGG ATCCTCCGCC TCCAGAGCCA CCACCTCC 48 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 44:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 16 nukleových kyselin (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetický: NE (v) typ fragmentu: interní (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 44:
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10
Gly Ser (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 45:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 26 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: CDNA (iii) hypotetický: NE
-62CZ 296185 B6 (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 45:
GATCCGAACA TGTCCCAACA TGTTGA 26 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 46:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 26 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: CDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 46:

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Varianta proteinu p53 mající antiproliferativní nebo apoptotickou aktivitu, ve které část oligomerizační domény a také regulátorové domény jsou deletovány a nahrazeny umělou doménou leucinového zipu, přičemž delece C-koncové části je provedena ve zbytku 326 nebo 337 a celá transaktivační doména nebo její část je deletována a nahrazena heterologní transaktivační doménou VP16 a za předpokladu, že C-koncová část je deletovaná ve zbytku 326, umělá doména leucinového zipu má sekvenci: Asp-Leu-LysAla-Leu-Lys-Glu-Lys-Leu-Lys-Ala-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Lys-AlaLeu-Glu-Glu-Lys-Leu-Lys-Ala-Leu-Val-Gly-Glu-Arg.
  2. 2. Varianta podle nároku 1, kde umělá doména leucinového zipu je doména zajišťující selektivitu oligomerizace, která se nevyskytuje v přírodním stavu.
  3. 3. Varianta podle nároku 2, kde doména leucinového zipu má sekvenci: Asp-Leu-Lys-AlaLeu-Lys-Glu-Lys-Leu-Lys-Ala-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Lys-Ala-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Lys-AlaLeu-Val-Gly-Glu-Arg.
  4. 4. Varianta podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde argininový zbytek v poloze 182 proteinu p53 j e nahrazen histidinem.
  5. 5. Varianta podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, ve které byly zbytky 1 až 74 deletovány.
  6. 6. Varianta podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde transaktivační doména obsahuje sekvenci kódovanou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEQ ID No.2.
  7. 7. Sloučenina V-325 sekvence uvedené v seznamu sekvencí jako SEQ ID No. 25 a její varianta V-325H obsahující histidin v poloze 182 proteinu p53.
    -63 CZ 296185 B6
  8. 8. Sloučenina V-336 sekvence uvedené v seznamu sekvencí jako SEQ ID No. 26 a její varianta V-336H obsahující histidin v poloze 182 proteinu p53.
  9. 9. Nukleová kyselina kódující variantu proteinu p53 podle kteréhokoliv z předchozích nároků.
  10. 10. Nukleová kyselina podle nároku 9, která je cDNA, RNA, nebo syntetická nebo semisyntetická nukleová kyselina.
  11. 11. Nukleová kyselina podle nároku 9, která kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEQ ID No. 25 nebo SEQ ID No. 26.
  12. 12. Expresní kazeta obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 9, 10 nebo 11, promotor umožňující její expresi a signál pro terminaci transkripce.
  13. 13. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 9, 10 nebo 11 nebo kazetu podle nároku 12.
  14. 14. Vektor podle nároku 13, který je virový vektor.
  15. 15. Vektor podle nároku 14, který je defektní rekombinantní adenovirus.
  16. 16. Vektor podle nároku 14, který je defektní rekombinantní retrovirus.
  17. 17. Vektor podle nároku 14, který je defektní rekombinantní AAV.
  18. 18. Vektor podle nároku 14, který j e defektní rekombinantní HSV.
  19. 19. Vektor podle nároku 13, který j e chemický nebo biochemický vektor.
  20. 20. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 9, 10 nebo 11, expresní kazetu podle nároku 12 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 13 až 19 a farmaceuticky přijatelné vehikulum.
  21. 21. Farmaceutický přípravek, v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje variantu proteinu p5 3 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 a farmaceuticky přijatelné vehikulum.
  22. 22. Farmaceutický přípravek podle nároku 20, v y z n a č u j í c í se tím, že je určen pro použití při léčení hyperproliferativních poruch.
  23. 23. Farmaceutický přípravek podle nároku 21, v y z n a č uj í c í se t í m, že je určen pro použití při léčení hyperproliferativních poruch.
  24. 24. Použití nukleové kyseliny podle nároku 9, 10 nebo 11, expresní kazety podle nároku 12 nebo vektoru podle nároku 13 pro výrobu léku pro použití při léčení hyperproliferativních poruch.
  25. 25. Použití varianty proteinu p53 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro výrobu léku pro použití při léčení hyperproliferativních poruch.
CZ0014498A 1995-07-19 1996-07-17 Varianty proteinu p53 a jejich terapeutické pouzití CZ296185B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9508729A FR2736915B1 (fr) 1995-07-19 1995-07-19 Variants de la proteine p53 et utilisations therapeutiques

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ14498A3 CZ14498A3 (cs) 1998-04-15
CZ296185B6 true CZ296185B6 (cs) 2006-01-11

Family

ID=9481133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0014498A CZ296185B6 (cs) 1995-07-19 1996-07-17 Varianty proteinu p53 a jejich terapeutické pouzití

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6326464B1 (cs)
EP (1) EP0839194B1 (cs)
JP (1) JPH11510378A (cs)
KR (1) KR100501881B1 (cs)
AT (1) ATE324442T1 (cs)
AU (1) AU725841B2 (cs)
BR (1) BR9611087A (cs)
CA (1) CA2224468C (cs)
CZ (1) CZ296185B6 (cs)
DE (1) DE69636072T2 (cs)
DK (1) DK0839194T3 (cs)
ES (1) ES2263161T3 (cs)
FR (1) FR2736915B1 (cs)
HU (1) HU225937B1 (cs)
IL (1) IL122991A (cs)
MX (1) MX9800555A (cs)
NO (1) NO322477B1 (cs)
PT (1) PT839194E (cs)
SK (1) SK286955B6 (cs)
TW (1) TW444022B (cs)
WO (1) WO1997004092A1 (cs)
ZA (1) ZA966127B (cs)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9610058A (pt) 1995-07-28 1999-07-27 Marie Curie Cancer Care Uso de vp22 ou uma porção ativa fragmento ou homólogo do mesmo proteína de transporte ácido nucleíco vetor de expressão célula hospedeira de mamíferos ou microbiana e processos para transportar uma proteína ou peptídeo desejado para uma população de marcaç o de células e para transportar uma molécula desejada em uma população de células
US6881571B1 (en) 1998-03-11 2005-04-19 Exonhit Therapeutics S.A. Qualitative differential screening
FR2775984B1 (fr) 1998-03-11 2006-09-15 Bioscreen Therapeutics Sa Criblage differentiel qualitatif
FR2755144B1 (fr) 1996-10-29 1998-11-27 Rhone Poulenc Rorer Sa Fragments d'anticorps a chaine unique anti-p53 et utilisation
US6017735A (en) * 1997-01-23 2000-01-25 Marie Curie Cancer Care Materials and methods for intracellular transport and their uses
US5943914A (en) * 1997-03-27 1999-08-31 Sandia Corporation Master-slave micromanipulator apparatus
BR9808697A (pt) 1997-04-28 2000-07-11 Rhone Poulenc Rorer Sa Processo para inibir o crescimento de um tumor, vetor de adenovìrus defeituoso, vetor de vìrus, uso do mesmo, e, composição farmacêutica
IL121041A0 (en) 1997-06-09 1997-11-20 Yeda Res & Dev Immunogenic compositions for induction of anti-tumor immunity
DE19751587A1 (de) 1997-11-21 1999-07-29 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Onkogen- oder virusgesteuerte Expressionssysteme
EP1150688A4 (en) * 1998-10-19 2004-06-16 Yeda Res & Dev TREATING SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATODES BY REGULATING THE AUTOIMMUNE RESPONSE TO AUTOANTIGENS
US6831155B2 (en) * 1999-12-08 2004-12-14 President And Fellows Of Harvard College Inhibition of p53 degradation
WO2001087918A1 (en) * 2000-05-16 2001-11-22 The Regents Of The University Of California Methods for identifying novel therapeutics and diagnostics in the p53 pathway
US7534861B2 (en) * 2003-01-10 2009-05-19 Ambergen, Inc. Compositions and methods for immunoaffinity purification
WO2005074521A2 (en) * 2004-01-30 2005-08-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York C-TERMINAL p53 PALINDROMIC PEPTIDE THAT INDUCES APOPTOSIS OF CELLS WITH ABERRANT p53 AND USES THEREOF
US20060246143A1 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Hilmi Ege Targeted therapy via targeted delivery of energy susceptible nanoscale magnetic particles
KR100749858B1 (ko) 2005-08-12 2007-08-16 연세대학교 산학협력단 ｐ53 변이체 및 그의 용도
WO2009070650A1 (en) * 2007-11-26 2009-06-04 The Research Foundation Of State University Of New York Small molecule cancer treatments that cause necrosis in cancer cells but do not affect normal cells
US9186317B2 (en) * 2007-11-26 2015-11-17 Stc.Unm Active nanoparticles and method of using
KR102092345B1 (ko) * 2013-09-30 2020-03-24 삼성전자주식회사 류신 지퍼 변이체 및 이의 용도

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5559223A (en) * 1991-08-09 1996-09-24 E. I. Dupont De Nemours And Company Synthetic storage proteins with defined structure containing programmable levels of essential amino acids for improvement of the nutritional value of plants
GB9224784D0 (en) * 1992-11-26 1993-01-13 Univ Dundee Cellular protein
FR2710846B1 (fr) * 1993-10-04 1995-12-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions pharmaceutiques et leur utilisation, notamment dans le traitement des maladies neurogénératives.
US5700657A (en) * 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby
WO1995017213A1 (en) * 1993-12-21 1995-06-29 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research P53-based polypeptide fragments, nucleic acid molecules encoding same, and uses thereof
US5573925A (en) * 1994-11-28 1996-11-12 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology P53 proteins with altered tetramerization domains
AU4288496A (en) 1994-11-28 1996-06-19 Wistar Institute Of Anatomy And Biology, The P53 proteins with altered tetramerization domains

Also Published As

Publication number Publication date
SK286955B6 (sk) 2009-08-06
MX9800555A (es) 1998-04-30
EP0839194A1 (fr) 1998-05-06
DE69636072T2 (de) 2006-11-30
AU6618696A (en) 1997-02-18
NO980203L (no) 1998-03-10
JPH11510378A (ja) 1999-09-14
NO980203D0 (no) 1998-01-16
PT839194E (pt) 2006-08-31
DE69636072D1 (de) 2006-06-01
US20020193561A1 (en) 2002-12-19
TW444022B (en) 2001-07-01
NO322477B1 (no) 2006-10-09
DK0839194T3 (da) 2006-08-28
ES2263161T3 (es) 2006-12-01
HU225937B1 (en) 2008-01-28
IL122991A (en) 2007-07-24
ZA966127B (en) 1997-02-10
US6326464B1 (en) 2001-12-04
KR100501881B1 (ko) 2005-11-14
US6933373B2 (en) 2005-08-23
ATE324442T1 (de) 2006-05-15
CA2224468A1 (fr) 1997-02-06
KR19990029088A (ko) 1999-04-15
BR9611087A (pt) 1999-07-13
CZ14498A3 (cs) 1998-04-15
IL122991A0 (en) 1998-08-16
SK6398A3 (en) 1998-09-09
WO1997004092A1 (fr) 1997-02-06
HUP9901343A2 (hu) 1999-08-30
HUP9901343A3 (en) 2000-10-30
FR2736915A1 (fr) 1997-01-24
CA2224468C (fr) 2012-01-03
FR2736915B1 (fr) 1997-08-22
AU725841B2 (en) 2000-10-19
EP0839194B1 (fr) 2006-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ296185B6 (cs) Varianty proteinu p53 a jejich terapeutické pouzití
EP0918867B1 (en) Substrate trapping protein tyrosine phosphatases
CZ63098A3 (cs) Antagonisti onkogenní aktivity proteinu Mdm2 a jejich použití v léčení rakovin
EP0938553A1 (en) Dna encoding dp. 75 and a process for its use
SK131197A3 (en) Conditional expression system
CZ145599A3 (cs) Způsob obnovení translační aktivity závislé na p53 v buňkách, jednořetězcové protilátky proti p53 a DNA, které je kódují, jejich použití a prostředky, které je obsahují
AU718889B2 (en) deltaP62, its variants, nucleic acid sequences and their uses
BG63548B1 (bg) Полипептиди, съдържащи протеинови домени на gax, включени в транскрипцията и/или взаимнодействащи сдруги протеини, съответни нуклеинови киселини и тяхното използване
AU2007276793A1 (en) Composition and method for treatment of tumors
MXPA97008877A (en) P62, its variants, the nucleic acid sequences that code them, and its use in anti-cancer gene therapy
MXPA97006928A (es) Sistema de expresion condicional

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20130717