TW444022B - Variants of the P53 protein and therapeutic uses - Google Patents

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Rhone Poulenc Rorer Sa
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Description

444 02 2 A7 _______B7_ 五、發明説明（！） 本發明係關於具有改良治療用途之衍生自腫瘤抑制基因 P 5 3產物之蛋白質·較佳係關於具有腫瘤抑制功能及計畫性 細胞死亡誘生功能’且優於野生型p53蛋白質之功能，特別 用於野生型P53蛋白質失活化的增生病理情況具有改良功能 之蛋白質。亦係關於編碼此等分子之核酸，含有此等核酸之 載體及其治療用途’特別用於基因治療用途。本發明產物特 別適用於’特別例如癌症等病理情況恢復p 5 3功能。 野生型p53蛋白質涉及細胞周期的調節與細胞基因組完整 性的維持。此種蛋白質的主要功能為若干基因的轉錄活化 劑’可利用一種尚未明確界定的過程於發生突變時，於基因 組複製期間妨礙細胞周期G1期的細胞，及觸發多種DNA修 復功能的過程。此外，若修復過程的功能異常或發生的過多 難以矯正的突變情況，則此種蛋白質可誘生計畫性細胞死亡 現象，稱為apoptosis。 藉此方式，p 5 3蛋白質經由消除基因组已經受損的異常分 化細胞而做為腫瘤抑制劑。 p 5 3的主要功能係依靠其作為轉錄因子的功能，換言之， 係基於其具有雙重能力可於基因組DN A層面辨認特定序列 以及恢復一般性轉錄機轉。 經濟部中央橾準局貞工消费合作杜印裝 I HI 1^1 n^n -- {請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) p53蛋白質包括393個胺基酸界定5個功能領域（參見第1 圖）*_ -轉錄活化領域有胺基酸1至73组成可結合一般性轉錄機 轉的若干因子，例如TBP蛋白質。此種領域亦屬多種轉譯後 修改的位置。亦屬p53蛋白質與多種其它蛋白質進行多種交 本紙張尺度適用中国困家橾率（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐} 經濟部中央樣準局貝工消费合作社印袈 ^ 444 02 2 Α7 _____ Β7 五'發明説明（2) 互作用的位置，特別與細胞蛋白質mdm2或EB (Epstein-Barr)病毒（EBV)之蛋白質EBNA5交互作用，後述二者可 妨礙野生型蛋白質功能。此外’此種領域含有定名為PEST 負贵蛋白質敏感性的胺基酸序列； -DNA結合領域位在胺基酸73與315間。此種P53中心領 域的組態可調節p 5 3蛋白質特異性DN A序列辨認。此種領域 為可影響野生型蛋白質功能的兩型變化位置： (i) 與妨礙ρ53功能蛋白質之交互作用，例如SV40病毒之 “大T”抗原或HPV16及HPV18病毒之E6病毒蛋白質，其可 經由泛素（ubiquitin)系統引起其分解。後述交互作用僅出 現於細胞蛋白質E6ap(泛素化串級之酶E3)存在下； (ii) 影牢p53功能之點突變，特別全部位在此區的點突 變； -核侷限化信號主要由胺基酸315至325组成且主要負责蛋 白質於發揮主要功能的小室内的正確取向； -寡聚合領域係由胺基酸325至355組成。325至355區形 成下述類型結構：（3薄片（326-334)-肘（3 3 5 -3 3 6)-cx螺旋 (337-355)。此區的功能改變主要由於野生型蛋白質與多種 突變株交互作用可能對野生型蛋白質功能產生可變的影響； -調節領域係由胺基酸365至393組成，此乃多種可以陽性 或陰性方式調控p53蛋白質功能的轉譯後修改（糖化作用，磷 酸化作用，搭接DNA等）之位置。此種領域於野生型蛋白質 活性的調控上扮演極重要角色》 p53蛋白質的功能可以多種方式破壞： -5 - 本紙張尺度逍用中國國家揉率（CNS ) A4規格（210X297公釐} (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕
444 022 A7 £7_ 五、發明説明（3 ) -由多種因子妨礙其功能例如SV40病毒的“大T，’抗原， EB病毒的EBNA5蛋白質或細胞蛋白質的mdm2 ; -經由提高對蛋白質分解的敏感度，特別經由與人類乳頭 瘤病毒HPV16及HPV18之E6蛋白質（促進p53進入泛素化周 期）交互作用使蛋白質失穩化。此種情況下，兩種蛋白質間 之交互作用僅經由先前搭接細胞蛋白質出現，細胞蛋白質為 E6ap蛋白質其搭接位置所知無多； -於p53基因層面的點突變； -刪失1或2個p53對偶基因。 後述二型修改出現於約50%各型癌症。就此方面而言，記 錄於癌細胞的p_5 3基因突變影響極大部份編碼此種蛋白質的 基因且導致蛋白質功能的不等修改。但需注意，大半突變位 在p53蛋白質中部，已知中部為與p 53蛋白質特異性基因组 序列接觸區· 如此解釋為何p53蛋白質之大半突變株具有主要特徵為無 法再搭接至野生型蛋白質辨認的DNA序列，因此無法再發 揮作為轉錄因子的角色。此外，若干突變株獲得新功能例如 於轉錄層面活化某些基因。 此等修改範園目前歸成三大類： -所謂弱突變株，其產物為無功能蛋白質，於僅在兩個對 偶基因之一突變例中，若突變株不會影蜜由另一對偶基因編 碼的野生型蛋白質功能β此大類主要代表有H273及W248 突變株，後者對癌症病情過敏的一般人熟悉的Li-Fraumeni 症候群有特異性。 -6 - 本紙》•尺度適用中國国家橾準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐> _ (锖先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央橾率局貝工消费合作社印装 經濟部中央樣準扃負工消费合作社印装 » 444022 A7 ____B7_ 五、發明说明（4 ) -支配陰性突變株’其產物為無功能蛋白質，於僅有兩個 對偶基因之一突變且經由與野生型蛋白質交互作用之例中， 可經由形成無活性混合寡聚物而阻斷後者功能，寡聚物無法 再搭接至野生型蛋白質的特異性D N A序列。此大類的主要 代表為G281突變株。 -支配腫瘤生成突變株，其產物為一種蛋白質，該蛋白質 一方面可類似前述類別突變株阻斷野生型蛋白質功能，它方 面可經由所知無多的機轉促進腫瘤發育，因此獲得功能增 加。此大類的主要代表為Η175突變株。 考慮野生型ρ 5 3基因之抗腫瘤及計畫性細胞死亡性質以及 涉及高度增生類型的無數病理，野生型ρ53基因曾經用於基 因及細胞治療。特別提議經由活體内投予野生型ρ53基因及 經由恢復ρ 5 3基因功能治療某些高度增生病理，特別癌症。 投藥較佳藉病毒性特別腺病毒性（WO 94/24297)或反錄病 毒性（WO 94/06910)載體進行。 如此顯示引進編碼野生型ρ53蛋白質之核酸可部份恢復細 胞生長的正常條件。雖然此等結果令人精神鼓舞，但此等治 療效果受限於ρ53蛋白質於活體内於高度增生細胞内轉移及 表現後的療效。確實，高度增生病理情況例如癌症係來自於 細胞生長的陰性控制與陽性控制網路中靜力的平衡受破壞。 野生型ρ53蛋白質經由從兩個對偶基因之一出現支配陰性 ρ53突變株，ρ53失活化細胞夥伴例如mdm2過度表現或甚 至於感染後存在有病毒失活化劑而使野生型p53蛋白質發揮 的負面控制失活化，構成基於重新引進野生型p53蛋白質治 本紙張尺度逋用中國B家梯率（CNS >八4規格（2丨0X297公釐） (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央樣準局貝工消費合作社印装 444 02 2 A7 _B7_ 五、發明説明（5 ) 療的不利之處，此種蛋白質也有被失活化的高度風險》 因此特別要緊地係有治療性質增強的p 5 3型蛋白質。特 別，特佳有活性組成且對支配陰性突變株及支配腫瘤生成突 變株或對腫瘤細胞所見其它細胞或病毒蛋白質如得自 HPV18 及 HPV16 之 E6，得自 EBV 之 MDM2 及 EBNA5 的失 活化作用不敏感。 先前技術曾經敘述若干p53蛋白質的修改。WO 95/06661申請案敍述ρ53蛋白質同源區，亦即343-351， 3 72-3 80及3 8 1-3 93區若干殘基的修改《但此等修改極危 險無法使所得產物逃脫活體内ρ53蛋白質失活化的機轉。此 外，此等蛋白質顯然不具有比較野生型Ρ53蛋白質改良的活 性。
Hupp et al.(Cell Vol 71 (1992) 875)描述包括删失 30 C端末殘基的p53衍生物（p53AC-ter30)。雖然此種蛋白 質保有結合DN A之能力，但未曾驗證其計畫性死亡性質。 此外，對於被支配陰性突變株的失活化作用不具抗性。
Pietenpoi et al. (PNAS 9 1 ( 1 9 9 4 ) 1 9 9 8 )敘述衍生自 p53蛋白質之嵌合體因子，特別蛋白質VP16-p53(80-343)-GCN4。然而，此種功能比較野生型p53蛋白質之 DNA結合與轉移活化能力大體降低（40%)。此外，具有非 選擇性寡聚合區，可能與其它細胞成份交互作用因此誘發非 特異性細胞反應的風險。此外，未指示其對失活化機轉的抗 性· 本發明描述具有改良治療性質的新穎p53蛋白質變體》特 -8 - 本紙▲尺度適用中國Η家搞率< CNS > Α4規格（210X297公釐) ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 *1Τ 經濟部中央標準局員工消费合作社印装 444 02 2 A7 B7 五、發明说明（6 ) 別描述適用於基因治療，特別抗癌治療的變體β本發明之變 體係衍生自ρ53蛋白質的結構修改，保有ρ53型活性且可於 高度增生細胞内表現，比較ρ53蛋白質至少具有較強的活 性。特別抗增生及/或計畫性細胞死亡活性。本發明之變體 具有增強的抗增生及/或計畫性細胞死亡活性，或對高度增 生細胞更具特異性，或對野生型Ρ53接受的多種改變的敏感 性較低β 本發明之第一目的特別係有關ρ53蛋白質變體，其中全部 或部份寡聚合領域被刪失且被人工白胺酸拉鏈領域替代。如 前述’ ρ53蛋白質被若干突變株失活化，特別被腫瘤細胞所 見的支配陰性突變株及支配腫瘤發生突變株失活化。此種失 活化係由於形成野生型ρ 5 3蛋白質與突變株間之無活性混合 寡聚物的結果，該寡聚物無法再搭接至野生型ρ53蛋白質辨 認的特定序列》現在本發明描述對若干突變株的支配陰性效 果有抗性的ρ53蛋白質變體，亦即於具有個突變對偶基 因之細胞内具有活性，該種細胞幾乎佔p53相關人類癌症的 90%。 根據本發明之變體内，全部或部份天然蛋白質寡聚合領域 (無法區別野生型與突變型）被具有特定寡聚合能力的相當領 域替代。此種修改係使用最佳人工白胺酸拉鏈進行俾形成二 聚物。本發明分子，包括此種人工白胺酸拉鏈為特佳，原因 為其僅與帶有相同白胺酸拉鏈的其它分子形成寡聚物。因此 無法與p53蛋白質之支配陰性突變株或支配腫瘤生成突變株 (此等突變株會使本發明分子失活化）形成寡聚物。也無法與 -9- 本紙張尺度適用中困國家標準（CNS ) Α4规格（21〇><297公釐） ------------ (諳先M讀背面之注意事項再填寫本頁)
,1T 經濟部中央橾準局負工消费合作社印製 444 0 2 2 A7 B7___ 五、發明説明（7 ) 摘帶寡聚合領域（也具有失活化或誘生非期望作用的能力）之 其它細胞蛋白質形成寡聚物。僅能形成均寡聚物因此具有高 度選擇性可確保於高度增生病理發揮更佳活性。 根據本發明’人工白胺酸拉鏈領域較佳為天然狀態不存在 可確保寡聚合選擇性的領域。最佳，寡聚合領域可由序列序 列識別編號1表示。 本發明之較佳具體例中，變體包括刪失全部或部份寡聚合 領域及刪失全部或部份調節領域。如前述，寡聚合領域位在 殘基325-3 55(含）而調節領域位在殘基365_393(含）。此型 變禮缺乏全部或若干經由C端末部份（aa 365-393)產生的負 面調節性效果。·此等變體可能組成具有無法調控且可能具有 增強活性的活性蛋白質。整個調節區較佳被删除*根據本發 明之較佳變體包括從殘基326或337(含）刪失p53蛋白質之C 端部份0 用於構成此等變體之中間物範例特別為： •pEC107(75-325-lz)包括從殘基326刪失p53蛋白質之 C端部份以序列序列識別編號1之人工寡聚合領域取代； •pEC1 10(75-336-lz)包括從殘基337刪失p53蛋白質之 C端部份以序列序列識別編號1之人工寡聚合領域取代。 根據較佳具體例，本發明之變體中，p53蛋白質182位置 的半胱胺酸殘基被组胺酸替代。此種突變可增加變體對特異 性結合核甚跋序列的親和力。因此引進此種額外修改另可獲 得較高轉移活化能力的分子。 結合多種修改製備本發明變禮之中間物構成體的精確範例 10- 本紙張尺度逋用中H«家搞率（CNS > A4規格（210X297公鍰) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _ - 、1Τ 444 022 a? B7 五、發明说明（8 ) 特別有： • pEC139(75-325(H182)-lz)包括從殘基 326 刪失 p53 蛋白質之C端部，以序列序列識別編號1之人工寡聚合領域 取代，及組胺酸位在182位置》 .pEC140(75-336(H182)-lz)包括從殘基 337 刪失 p53 蛋白質之C端部，以序列序列識別編號1之人工寡聚合領域 取代，及組胺酸位在182位置》 經濟部中央樣準局員工消费合作社印装 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 泉 較佳，本發明之變體中，全部或部份轉移活化領域也被刪 失且被非同源轉移法化領域替代。如前指示p 5 3之轉移活化 功能為其作為腫瘤抑制劑及作為計畫性細胞死亡誘生劑活性 的必要功能。欲提高本發明變雜的治療能力，特佳以強力異 源轉移活化領域取代天然轉移活化領域。因此此等變體具無 數優點。當然具有高度轉移活化活性。但也對由Ν-端部份 (a a 1 - 7 3 )產生的負面調節效果不敏感。確實此區含有可負 责蛋白質分解的PEST序列》以缺乏PEST序列之異源轉移 活化領域取代此區會降低負面調節作用。此等變體之另一特 徵為與得自人類乳頭瘤病毒（HPV)E6蛋白質（其可誘生變體 分解）之交互作用降低或甚至抑制。也對其它會影響野生型 ρ53蛋白質活性的細胞蛋白質例如MDM2或EBNA的交互作 用較不敏感。刪除負面調節（調節領域及轉移活化領域）敏感 性領域以特佳方式導致該等分子不再鎖定會誘生蛋白質分解 或失活化作用的蛋白質目標* 較佳’本發明之變體中，轉移活化領域係藉刪失殘基i至 74去除》用來產生此等分子之中間物構成體特別為 -11 - 本紙張尺度適用中國Η家榡率< CNS } Α4洗格（210X297公釐) 444 022 A7 B7_ 五、發明説明（9 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) pEC 1 07(75-325-lz)，pEC 1 1 0 ( 7 5 - 3 3 6 -1 z) , pEC139 (75-325(H182)-lz)及 pEC 140(75-336(H182)-lz)。 根據第一具體例，異源轉移活化領域為VP 1 6之轉移活化 領域。較佳由VP 1 6之殘基4 1 1至4 9 0組成（其序列示於序列 識別編號2)。根據本發明之變體之精確實例，1結合此等修 改者特別有： •pEC114(VP16-75-325-lz)包括刪失p53蛋白質N端部 份包括殘基1-74，以序列序列識別編號2之VP16的轉移活 化領域取代，及刪失p53蛋白質從殘基326之C端部份而以 序列序列識別編號1之人工寡聚合領域取代。變體PEC114 之完整序列示於序列識別編號25 ; •pEC116(VP16-75-336-lz)包括刪失p53蛋白質N端部 份包括殘基1 - 74，以序列序列識別編號2之VP 1 6的轉移活 化領域取代，及刪失p 5 3蛋白質從殘基3 3 7之C端部份而以 序列序列識別編號1之人工寡聚合領域取代。變體pEc 1 1 4 之完整序列示於序列識別編號26 ; .pEC147(VP16-75-325(Hl82)-U)包括刪失 P53 蛋白 經濟部中央樣準局負工消费合作社印製 質N端部份包括殘基1-74，以序列序列識別編號2之VP 16的 轉移活化領域取代，及刪失P53蛋白質從殘基326之C端部 份而以序列序列識別編號1之人工寡聚合領域取代，及組胺 酸位在1 82位置》 ..pEC149(VP16-75-336(H182)-lz)包括刪失 p53 蛋 白質N端部份包括殘基1_74，以序列序列識別編號2之VP1 6 的轉移活化領域取代*及刪失P53蛋白質從殘基337之C端 -12- 本紙張尺度遑用中國國家榡率（CNS) Α4规格（2Ι0Χ297公釐 經濟部中央橾率局員工消費合作社印装 444 022 A7 _B7__ 五、發明説明（10) 部份而以序列序列識別編號1之人工募聚合領域取代，及組 胺酸位在1 82位置； 由於前述修改，本發明之變體也具有強力增強的“殺手’’性 質可中斷細胞周期及計畫性細胞死亡》前述修改組合包括存 在有選擇性寡聚合領域及經由取代原先轉移活化領域，以及 經由於1 8 2位置存在的組胺酸改良轉移活化化能力確使對本 發明之變體提供顯著改良的治療能力。此外，根據本發明之 變體可避免出現若干（支配腫瘤生成性）突變株。若干ρ53突 變株獲得某些功能於機轉層面以及相關ρ 5 3蛋白質領域層面 的界定仍不足。高度可能若干新功能係依靠與若干執行者細 胞夥伴組合。— ' 涉及此等交互作用的領域刪除，以及其轉形性質於本案所 述分子内驗證可防·止出現腫瘤生成功能增益《如此，於製備 編碼所述多肽之臨床質體批次期間或於編碼相同多肽的病毒 或化學載體之臨床批次生產期間無規出現的突變不會產生腫 瘤生成分子小群。 此外’由於刪除若干ρ53領域（此乃若干抑制功能分子搭 接所必要的領域）’本發明之變體也具有更高更安定的治療 活性。最後’於多種本發明之構成體（例如鼠N e t或A S蛋白 質之人工寡聚合領域）存在有外來單位可於轉移感染細胞死 亡過程中觸發免疫反應，且將多種片段釋放入胞外介質，因 而增強免疫系統對抗腫瘤細胞的能力。 根據另一具體例’異源轉移活化領域較佳為一種於轉形細 胞有活性而於鄰近健康細胞無活性的轉移活化領域。本發明 -13- 本紙張尺度適用中ΗΒ家標率（CNS ) Α4ΛΜ4· ( 210X297公釐） ' ~ (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) >4. 訂 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 444 02 2 A7 _B7_ 五、發明说明（U ) 確實也描述其功能主要包括於轉形細胞而非於鄭近健康細胞 的分子。雖然似乎於包括内生性野生型P 5 3之分化細胞内外 生表現野生型p 5 3對存活能力的影響極少或無，但較佳蛋白 質僅於鎖定目標細胞有功能《此種對腫瘤細胞相對於正常細 胞的特異性目前已經在鎖定病毒載體的目標特異性或設計特 異性表現系統層面大量研究。本發明敘述p 5 3衍生物，其中 功能領域之一於主要存在於轉形細胞的細胞活化劑的不存在 之下被關掉。 如此，本發明之另一主題係有關較佳於轉形細胞具有活性 的p 5 3蛋白質變嫌，其中p 5 3之功能領域之至少一個領域完 全或部份刪失且由較佳於轉形細胞具有活性的異源領域取 代。較佳’感興趣的p 5 3功能領域為轉移活化領域》如此， 本發明之特佳主題係有關P53蛋白質變體其較佳於轉形細胞 具有活性，其中天然轉移活化領域完全或部份刪失且由較佳 於轉形細胞具有活性的轉移活化領域取代。較佳，天然轉移 活化領域係經由從p53去除殘基1-74(含）刪失。 本發明特別係關於於腫瘤生成Ras蛋白質或p53突變株存 在下具有功能的p 5 3變體。此等分子可經由使用可特異性結 合轉移活化劑或轉形細胞内存在的轉移活化複合體之蛋白質 領域替代野生型p53蛋白質的轉移活化領域獲得。 可特異性結合轉錄轉移活化劑或本發明分子内存在的轉錄 轉移活化複合體之蛋白質領域可屬於多種類型。特別為鎖定 目標的轉移活化劑或轉移活化複合體，包括此種領域之寡聚 合領域。也可為已知可與轉移活化劑或轉移活化複合體交互 -14- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS )八4^格（2丨〇 χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填駕本頁) 订 經濟部中央標準局員工消费合作社印策 444 022 A7 _B7 五、發明説明（12) 作用的合成或天然領域。亦可為針對轉移活化劑或轉移活化 複合體之抗體或抗體片段或衍生物。 較佳，異源領域係由抗體或抗體片段或衍生物組成，抗體 片段或衍生物例如為抗體片段Fab或F(ab)，2，抗體區VH或 VL或另外包括vh區藉一臂結合至vl區的單鏈抗體 (S c F v)。根據本發明修改此等抗體之核酸序列的構成例如 描述於美國專利4,946,778及申請案w〇 94/02610，WO 94/29446 ° 根據本發明之較佳構成體包括針對p53蛋白質突變株之 ScFv。此等突變株出現於轉形細胞且具有轉移活化領域。 其被根據本發明之變禮恢復產生一種於轉形細胞具有選擇性 活性的嵌合分子。 根據另一較佳模式’ S c F v係針對轉移活化複合體，換言 之，選擇性存在於轉形細胞的目標分子複合體但缺乏轉錄轉 移活化劑活性（例如腫瘤生成ras)，及攜帶轉移活化領域的 分子。後者較佳包括一個轉移活化領域及一個選擇性結合至 細胞分子的領域（例如anti-ras ScFv)。此等分子搭接可形 成轉錄轉移活化二元複合體，隨後該複合體被本發明之變體 招募。 任何其它類型可獲得此種特異活性的修改當然也可用於本 發明之架構，例如特別細胞型特異性轉移活化領域· 選擇性變體較佳包括前述C端部的額外修改因此進一步改 良性質。如此，較佳包括刪失全部或部份寡聚合領域，可由 任何異源寡聚合領域替代。如前定義，更佳為人工寡聚合領 -15- 本紙》:尺度適用中困困家揉率（CNS ) M说格（21〇><297公羞） (諳先M讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中夹橾準局貝工消费合作社印裝 444 02 2 A7 ΒΊ_ 五、發明説明（13) 域〇 根據本發明之變體且較佳於轉形細胞具有活性之變體之特 例為： .ScFv.antip 5 3 *- 7 5 -3 2 5-lz，包括刪失包括殘基卜74 的p53蛋白質N端部，以可與轉形細胞内存在的p53蛋白質 突變株特異性結合的蛋白質領域取代，及刪除p53蛋白質從 殘基3 2 6之C端部’以序列序列識別編號1之人工寡聚合領域 取代； ♦ ScFv.antip53 *-75-3 25 (H182)-l2：，此外，包括 His 182突變； • ScFv.antip53 *-75-3 3 6-lz，包括刪失包括殘基 ^74 的ρ53蛋白質N端部’以可與轉形細胞内存在的p53蛋白質 突變株特異性結合的蛋白質領域取代，及刪除ρ53蛋白質從 殘基3 37之C端部，以序列序列識別編號1之人工寡聚合領域 取代； 、 .ScFv.antip5 3 *-75 -3 3 6(Hi82)-lz，此外，包括 His 1 8 2 突變； • ScFv.antip53 *-75-393，包括刪失包括殘基1-74的 p53蛋白質N端部，以可與轉形細胞内存在的P53蛋白質突 變株特異性結合的蛋白質領域取代； * ScFv.antip53*-75-393(H182)，此外，包括於位置 1 8 2的組胺酸； .ScFv.antip53 *-75_367，包括刪失包括殘基1-74的 p53蛋白質N端部，以可與轉形細胞内存在的p53蛋白質突 -16- 本紙張尺度遢用中國國家樣率（CNS > 格（2丨0X297公羡} (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _^· 444022 A7 B7 經濟部中央樣準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（14 ) 變株特異性結合的蛋白質領域取代；及從殘基3 6 8刪失c端 部； .ScFv.antip5 3 *-75-3 67(H182) ’ 此外，包括於位置 1 8 2的組胺酸； • ScFv.antip53*-75-AS，包括刪失包括殘基1-74的 p53蛋白質N端部，以可與轉形細胞内存在的p53蛋白質突 變株特異性結合的蛋白質領域取代；及從殘基3 6 7刪失C端 部；以序列序列識別編號3之19個胺基酸補充； • SeFv_antip5 3 *-75-AS(Hl82)，此外，包括於位置 1 8 2的組胺酸： 此外，較佳活性一詞表示此等變禮於轉形細胞表現時可發 揮其主要活性*但殘餘活性存在於非轉形細胞，但比較轉形 細胞少見。 本發明之另一主題係有關一種p53蛋白質變體包括從殘基 367刪失C端部，且與序列序列識別編號3(AS)融合。此種 序列對應於鼠p53蛋白質另一剪接產物的最末19胺基酸。因 此此種變體具有基於小鼠蛋白質之寡聚合領域的修改作為野 生型蛋白質之替代剪接變體，其中27個C端胺基酸被19個不 同胺基酸替代* 此種變體對結合DNA的特異性序列具有親和力，此種序 列可被增強》 此種變體較佳包括前述N端部的修改因而進一步改良其性 質。如此，較佳包括刪失全部或部份轉移活化領域，該領域 可由任何異源轉移活化領域替代•更佳衍生自蛋白質VP16 -17- 本紙張尺度適用中國困家揉率（CNS > A4洗格（2丨0X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁}
^44 02 2 A7 B7 五、發明説明（15) 之轉移活化領域或可特異性結合轉移活化劑或轉移活化複合 體的蛋白質領域存在於轉形細胞。此外，p53蛋白質之殘基 1 8 2較佳由組胺酸替代。 根據本發明之此型變體之特例有： • ScFv.antip5 3 *-7 5 -AS，如前述， • pEC143(VP16-75-AS)，包括刪失包括殘基1-74的 p53蛋白質N端部，以序列序列識別編號2之VP16之轉移活 化領域取代；及從殘基367刪失C端部補充序列序列識別編 號3之19個胺基酸。變體PEC143之完整序列示於序列識別 編號2 8 ; • ScFv.antip5 3 *-75-AS(H182)，如前述； • pEC153(VP16-75-AS(H182))，對應於 182 位置有組 胺酸的pEC 143。* 概略言之，本發明係關於包括一個轉移活化領域，一個 DN A結合領域’ 一個針對核領域及一個寡聚合領域的任一 種嵌合體蛋白質，其中DNA結合領域及針對核領域包括人 類野生型p53蛋白質之胺基酸75至325(序列識別編號4)。申 請人確實顯示p53蛋白質之此區偶合適當轉移活化領域及寡 聚合領域，可產生就安定性，對p53突變株負面效果的抗性 及對若干細胞因子的失活化敏感性具有增強性質的P 5 3型分 子β 根據一種變體，結合DN Α及導入細胞核的領域係由人類 野生型p53蛋白質之胺基酸75至336組成（序列織別編號5)。 根據本發明之嵌合體蛋白質包括各型轉移活化領域《可為 -18- 〔锖先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) —. 訂 經濟部中央樣準局負工消费合作社印製 本紙張尺度適用中面國家#準（CNS ) 格（2丨〇><297公* > 經濟部中央橾準局負工消费合作社印簟 444 022 A7 B7 _ _ 五、發明説明（16) p 5 3蛋白質之轉移活化領域。較佳為異源轉移活化領域’例 如選自VP 1 6之轉移活化領域或可特異性結合轉形細胞内存 在的轉移活化劑或轉移活化複合體之蛋白質領域。 至於寡聚合領域，較佳為人工領域，因此為特定領域例如 人工白胺酸拉鏈，特別序列識別編號1之人工白胺酸拉鏈。 此外，本發明之嵌合體蛋白質可於位置182包括組胺酸殘 基。 本發明所述嵌合體蛋白質之特例有pEC114，pEC116， pEC147及pEC149 ° 本發明之主題也包括編碼如前定義之變體或嵌合蛋白質之 任何核駿。 本發明之核酸可為核糖核酸（RNA)或去氧核糖核酸 (DNA)。此外，可為包括一或多個P53基因之插入序列的互 補DNA(cDNA)。可來自人類，動物，病毒，合成或半合 成。可以多種方式獲得，特別使用申請案中提供的序列及例 如核酸合成儀化學合成。也可利用特定探針，特別本案所述 者篩檢存庫獲得。也可經由多種技術的组合獲得，包含化學 修改（例如延長，刪失及取代）由存庫篩檢的序列。一般而 言，本發明之核酸可根據業界人士已知技術製備。 較佳’本發明之核酸為cDNA或RNA。 本發明之核酸較佳選自： ⑻全部或部份序列序列識別編號2 5，2 6，2 7，2 8及2 9或 其互補股。 - (b)任何與⑻序列雜交及編碼本發明衍生物之序列， -19- 本紙張AjtiiflJ + SSI家料（c叫从祕^ 2丨Gx297公竣. ~ ----------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 444022 經濟部中央橾準扃員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（17) (C)由遗傳密碼簡併性所得⑻及(b)之變體。 如前指示'發明人今日構成具有較強抗增生及計畫性細胞 死亡性質的編碼p53變體多肽之新穎核酸序列*此等核酸可 用作治療劑於細胞生產可破壞或矯正細胞功能異常的衍生 物。欲達此目的’本發明亦係關於一種表現卡匣包括如前定 義之核酸，可表現之啟動基因及轉錄終結信號。啟動基因較 佳選自於哺乳類，較佳人類細胞有功能的啟動基因。特佳， 可於高度增生細胞例如癌細胞及血管再度縮窄細胞（表現核 酸的啟動基因）。就此方面而言，可使用多種啟動基因。可 為例如ρ 5 3基因本身的啟動基因。也可為不同來源的啟動基 因（負貴表現其它蛋白質*甚至合成）β如此可為以特定方式 或可誘生或強或弱，刺激與抑制基因轉錄的任何啟動基因或 衍生序列。值得一提者特別為真核基因或病毒基因之啟動基 因序列。例如，可為衍生自目標細胞基因組的啟動基因序 列。真核啟動基因中，可使用者特別為泛昆丁啟動基因 (ubiquitous promoters)(例如 HPRT，PGK，α-actin 及 tubulin之啟動基因），中間物長纖維之啟動基因（例如 GFAP，desmin，vimentin，神經長纖維及角質之長基因 之啟動基因），治療基因之敌動基因（例如，MDR，CFTR， 因子VIII及ΑροΑΙ之啟動基因），組織特異性啟動基因（例如 焦丙酮酸激酶，νίΐΐΐη，脂肪酸結合長蛋白質及平滑肌α_ actin基因之啟動基因）或另外，可回應刺激的啟動基因（例 如類固醉激素受體及維生素A酸啟動基因）。同理，衍生自病 毒基因组之啟動基因序列例如腺病毒E1A及MLP基因之啟 -20- 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐+) {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 經濟部中央樣準局員工消费合作杜印装 444 02 2 A7 __B7__ 五、發明说明（18) 動基因，CMV早期啟動基因，或另外RSV LTR啟動基因。 此外，啟動基因區可藉加入活化序列或調節序列或可進行組 織特異性或泛昆丁表現的序列修改。 今曰’本發明提供新穎治療劑其經由抗増生及/或計畫性 細胞死亡性質可干擾無數細胞功能失常。欲達成此目的，本 發明之核酸或卡匣可就此注入治療部位層面或直接與有待破 壞或治療的細胞培育。確實描述某核酸可無任何特殊載體渗 透入細胞。雖言如此，但較佳於本發明之架構内使用載體投 藥其可改良（i)細胞滲透效率，（ii)鎖定目標，及（iii)細胞外 與内之安定性》 本發明之特佳具體例中，'核酸或卡匣併入載體内。所用載 體可為化學來源（例如脂小體，塵粒，肽複合體，脂質或陽 離子聚合物）’或病毒來源（例如反錄病毒，腺病毒，⑴疹病 毒’ AAV及牛痘病毒）或質體來源。使用病毒載體係依靠病 毒的天然轉移感染性質。如此，可使用例如腺病毒，⑴疹病 毒’反錄病毒及腺相關病毒。此種載醴由轉移感染觀點看來 特別有效*就此方面而言，本發明之較佳主題為缺陷重組反 錄病毒，其基因组包括如前定義之核酸。本發明之另一主題 包括缺陷重組腺病毒，其基因組包括如前定義之核酸。 本發明之載體亦可為可於真核細胞促進核酸轉移及表現的 非病毒劑。化學或生物化學，合成或天然載體表示天然病毒 的較佳替代之道，特別由於方便安全且就轉移感染的DNA 大小不存在有理論限制等因素。此等合成載體有兩大功能， 可壓密有待轉移感染的核酸及促進其細胞搭接以及通過漿 -21 · 本紙張尺度適用中困國家揉率（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐} (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印製 厶在4 Ο 2 2 Α7 _______Β7___ 五 '發明説明（19) 膜’若屬適宜，為兩張細胞膜。欲克服核酸的多陰離子性 質’非病毒載體皆含有多陽離子價數。 本發明使用之核酸或載體可與醫藥可接受性載劑或稀釋劑 配方供局部，口服，腸外，鼻内，靜脈，肌肉，皮下，眼内 及經皮投藥。較佳，核酸或載體以注射劑型使用β因此可混 合任何載劑’注射性配方之醫藥可接受性載劑，特別直接注 射在有待治療部位者。特別為無菌或等張溶液，或乾燥，較 佳凍乾組成物，其視情沉需要添加無菌水或生理鹽水，可準 備注射液。核酸直接注入病人腫瘤為較佳，原因為可使療效 集中在患病组織。所用核酸劑量可根據多種參數調整，特別 根據基因，載體，所用投藥模式，病理或另外治療期望持續 時間而定β 本發明亦係關於· 一種包括至少一種如前定義之核酸與醫藥 可接受性載劑或稀釋劑之醫藥組成物。 本發明亦係關於包括至少一種如前定義之載體與醫藥可接 受性載劑或稀釋劑之醫藥組成物。 本發明亦係闞於包括至少一種如前定義之ρ53變體與醫藥 可接受性載劑或稀释劑之醫藥组成物。 由於具有抗增生性，故本發明之醫藥组成物特別適合治療 高度增生病症，例如癌症及血管再度縮窄。如此本發明提供 一種破壞細胞，特別高度增生細胞的有效方法《可於活體内 或外使用。於活體外使用包括於一種或多種核酸（或載體或 卡匣或直接為衍生物）存在下培育細胞。於活體内使用包括 對有機體投予活性量之本發明載體（或卡匣），較佳直接投予 -22- 本紙張尺度逍用中國Η家揉準（CNS > Α4规格（210Χ297公釐) (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) " 訂 444 022 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 五、發明説明（20) 有待冶療部位（特別為腫瘤）。就此方面而言，本發明之主題 亦屬種摧毁高度增生細胞之方法包括將該細胞或若干細胞 與如前定義之核酸接觸β 2發明亦較佳於活體内用於摧毀高度增生細胞（亦即進行 異吊增生之細胞）。如此，可應用於摧教:腫瘤細胞或血管壁 的平滑肌細抱（血管再度縮窄）。最佳治療觀察到Ρ53突變株 的腫瘤β舉例言之，值得一提者有：結腸腺癌，甲狀腺癌， 肺癌’骨髓白血病’結腸直腸癌，乳癌，肺癌，胃癌，食道 癌’ Β淋巴瘤’卵巢癌’膀胱癌，神經膠母細胞瘤肝癌， 骨癌’皮膚癌’胰臟癌，或另外腎臟癌或前列腺癌，食道 癌’喉癌，頭類癌，HPV-陽性陰部肛門癌，鼻咽之EBV陽 性癌及細胞蛋白質mdm2過度表現的癌症。 本發明之變體特-別可用於治療其中MDM2蛋白質，除了過 度表現外，也有HPV病毒相關癌症例如HPV陽性陰部肛門 癌的癌症》 本發明將參照下列實例詳細說明，此等實例僅供舉例說明 之用，絕非限制性。 圖說 囷:野生型p53蛋白質的功能領域。TA :轉錄活化領 域；DNB : DNA結合領域；NLS :核侷限化信號：0L :寡 聚合領域；REG :調節領域。 第2圈：編碼p53 AS型cDNA之構成。 第 3 圖：編碼構成體 pEC104 ’ pEC106，pEC13 1， pEC132及pEC133及其變體H182之cDNA之選值。 -23- 本紙張尺度適用中困Η家樣率（CNS > A4*t格（210X297公釐） n n ^^1 ^^1 ^i> ^· 1^1 I (请先聞#背面之注$項再填寫本育) 訂 經濟部中央橾準局I工消费合作社印製 I ΛΔ4022 A7 B7 五、發明説明（21) 差4圖:經由與人工寡聚合領域炼合之變體pEC107， pECllO，pEC139 及 pEC140 之構成。 I 5 圖.變體 PEC114 ’ pEC116，pEC141 ’ pEC143， pEC145 ’ pEC147 ， pEC149 - pECl51 ， pEC153 及 pEC155之構成》 差6圖-:P 5 3蛋白質及本發明之變體之轉移活化活性》 差7圖:Ε6蛋白質對Ρ53蛋白質及本發明之變體於SA〇s_2 細胞之轉移活化功能的影響》 圖：E6蛋白質對P53蛋白質及本發明之變體於HeLa細胞 之轉移活化功能的影窨* 多9圖:P53 H175之支配陰性突變株對本發明之變體之轉 移活化功能的影響。 實例 兔例A .製備編碼p53蛋白質變體基因所需多種核站酸片段 之構成 A1.編碼人類野生型p53之cDNA之構成》 人類p53基因係經由使用寡核甞酸5，-1及3'-393對得自人 類胎盤存庫（Clontech)之DNA進行聚合酶連鎖反應（pcr) 選殖。 寡核芬酸5、1(序列識別編號6):
ATGGAGGAGCCGCAG 寡核玷酸3^393(序列識別編號7):
GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC 然後於PCR後產物直接選殖入載體pCRil -24 - 本紙张尺度逋用肀國B家標準（CNS> A4規格（210X297公* ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ^ 訂 經濟部中央橾準局貝工消费合作杜印褽 444022 A7 _B7_ 五、發明説明（22 ) (Invitrogene) 0 A2-編碼p53 AS型之cDNA之構成 p53之AS型包括編碼人類p53蛋白質之胺基酸1至366補 充屬p53蛋白質之替代剪接產物的最末19個胺基酸之片段。 p 5 3之A S型係以兩個階段獲得： -使用寡核苷酸5、1(參見實例A1)及3'-367將編碼p53蛋白 質之胺基酸1至367之片段進行PCR放大。
寡核甞酸3'-367(序列識別編號8): GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGCTCGAGTGAGC 然後如此所得PCR片段選殖入載體pCRII (Invitrogene)—。如此選殖的片段具有限剪酶Xhol之辨認位 置（片段1 -367)。 -寡核苷酸5，-ASl，5，-AS2，3'-ASl及3，-AS2經磷酸化 作用然後雜交俾組成編碼屬p53蛋白質之替代剪接產物的最 末19個胺基酸片段。 5'-AS 1(序列識別編號9):
TCGAGCCTGCAGCCTAGAGCCTTCCAAGCCCTCATGAAGGAGG 5 ' - A S 2 (序列識別編號1 0 ):
AAAGCCCAAACTGCTGATGAATCGATATCGC 3'-ASl(序列識別編號1 1):
TGAGGGCTTGGAAGGCTCTAGGCTGCAGGC 3、AS2(序列識別編號12): GGCCGCGATATCGATTCATCAGCAGTTTGGGCTTTCCTCCTTCA 然後此片段插入片段1-367之Xhol位置層面（參見第2 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4itfr U10X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
364 367 I I P53:- AHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKT as：-ahsslqPRakqalmkeespnczz 367:- A H S S 2 Z
386 I 444022 A7 _______B7____ 五、發明説明（23 ) 圖）。如此構成的基因編碼屬P53蛋白質之替代剪接產物之人 類變體（AS)。 如此修改的蛋白質如下：
393 I 5 D 2 A3-編碼p53蛋白質帶有DNA結合領域之各片段之cDNA之 構成 本例描述編碼人類p53蛋白質之帶有全部或部份P53之 DNA結合領域之各片段之各種cdNA之構成。然後此等片段 用於構成p53變體。此等片段係利用多種寡核甞酸於實例A1 及A2所述的模版上經由聚合酶連鎖反應獲得。放大反應係 於實例A4.1所述條件下進行》 A3.1-編碼p53 75-325區及其衍生物H182之cDNA之構 成 本例描述編碼野生型人類p53蛋白質之胺基酸75至 3 25 (7 5 -3 25 )之 cDNA 之構成。 本cDNA係經由使用如下寡核甞酸V-75及V-325對p53 DNA(述於實例A1)進行聚合酶連鎖反應（PCR)獲得： 5、75(序列識別編號13):
GGGAAGCTTGGGCCGGGTCGACCTGCACCAGCAGCTCCT •26- 本纸張尺度適用中國國家樣率（CNS > A4規格（2丨0X297公釐> '' (錆先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ir^ -
,1T 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 444 022 A7 B7 五、發明说明（24)
3 ^ 3 2 5 (序列識別編號1 4 ): GGCGGCCGCGGATCCCCATCCAGTGGTTTCTT 於人類p53蛋白質之胺基酸182帶有點突變（半胱胺酸變成 組胺酸）之此種片段衍生物，係使用寡核誓酸H1 82序列利用 安木山（Amersh am)套件组經由位置指導突變發生作用獲 得： 寡核苷酸H182 3'(序列識別編號15):
ATCTGAATGGCGCTC 此片段定名為75-325(H182)。 A3.2-編碼p53之75-336 區及其衍生物H182之cDNA之 構成 本例描述編碼野生型人類p53蛋白質之胺基酸75至 3 3 6(7 5 -3 3 6)之cDNA之構成 〇 此種c D N A係經由使用寡核苷酸5 ' - 7 5 (序列識別編號1 3 ) 及如下Y-336對p53 DNA(述於實例A1)進行聚合酶連鎖反 應（PCR)獲得：
3'-336(序列識別編號16): GGCGGCCGCGGATCCTCACGCCCACGGATCTG 於人類p53蛋白質之胺基酸182帶有點突變（半胱胺酸變成 組胺酸）之此種片段衍生物’係使用寡核苷酸H182(序列識 別編號1 5 )序列利用安木山（A m e r s h a m)套件組經由位置指 導突變發生作用獲得。此片段定名為75-336 (H182)。 A3.3-編碼ρ53之75-367區及其衍生物H182之cDNA之 構成 -27- 本紙張尺度適用中a困家#率（CNS } A4规格（210X297公« ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) *ΤΓ 444 Ο 2 2 經濟部中央樣準局員工消费合作社印裝 Α7 Β7 五、發明説明（25) 本例描述編碼野生型人類ρ53蛋白質之胺基酸75至367 (7 5-3 67)之 cDNA 之構成。 此種cDNA係經由使用寡核苷酸5〜75(序列識別編號13) 及如下3，- 3 6 7 (序列識別編號8 )對p 5 3 D N A (述於實例A 1) 進行聚合酶連鎖反應（PCR)獲得。 如此所得片段包含核酸内切酶X h ο I (7 5 - 3 6 7)的一個辨認 位置。 於人類p53蛋白質之胺基酸182帶有點突變（半胱胺酸變成 組胺酸）之此種片段衍生物，係使用寡核甞酸H182(序列識 別編號1 5 )序列利用安木山（A m e r s h a m )套件組經由位置指 導突變發生作用獲得》此片段定名為75-367 (H182) » A3.4-編碼p53之75-AS片段及其衍生物H182之cDNA之 構成 - 本例描述編碼野生型人類p53蛋白質之胺基酸75至366 (75-366)補充屬P53蛋白質之替代剪接產物最末19個胺基 酸之cDNA之構成。 此片段係經由使用寡核：y：酸5 ' - 7 5 (序列識別編號1 3 )及如 下3、AS2(序列識別編號12)對實例A2所述AS片段之DNA 進行聚合酶連鎖反應（PC R)獲得。 於人類p53蛋白質之胺基酸182帶有點突變（半胱胺酸變成 組胺酸）之此種片段衍生物，係使用寡核苷酸Η 1 8 2 (序列識 別編號1 5 )序列利用安木山（A m e r s h a m)套件組經由位置指 導突變發生作用獲得。此片段定名為75-AS (H182)。
A3.5-编碼]>53之75-393片段及其衍生物H182之cDNA -28- 本紙ft尺度遍用中國B家《準（CNS Μ4规格< 2丨0X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央樣準局舅工消费合作社印製 44 02 2 A7 _ B7___ 五、發明说明（26) 之構成 本例描述編碼野生型人類p53蛋白質之胺基酸75至 393(75-393)之cDNA之構成。此片段係經由使用寡核甞酸 5 ' - 7 5 (序列識別編號1 3 )及如下3 ' - 3 9 3 (序列識別編號7)對 實例A2所述AS片段之DNA進行聚合酶連鎖反應（PCR)獲 得β 於人類ρ53蛋白質之胺基酸182帶有點突變（半胱胺酸變成 組胺酸）之此種片段衍生物，係使用寡核苷酸Η 1 8 2 (序列識 別編號1 5 )序列利用安木山（A m e r s h a m )套件組經由位置指 導突變發生作用獲得。此片段定名為75-393 (H182)。 A4 -編碼帶有轉錄活化領域（轉移活化領域）之各種片段之 cDNA之構成 本例描述編碼帶有轉移活化領域之各種片段之各cDNA之 構成。然後此等片段用於構成p53變體。 A4.1-PCR 反應 各種片段係利用多種寡核甞酸對各種模版進行聚合酶連鎖 反應獲得。放大反應係於如下條件下進行：Amplitaq DNA聚合酶（Perkin-Elmer)於供應商提供的緩衝液具有 dNTP濃度0.2 mM，100 ng模版及各500 ng兩種寡核：y： 酸。 1 -周期： 於9 1 °C 2分鐘 30-周期：於91°C 1分鐘 於55°C 1分鐘 於7 2 °C 2分鐘 -29- 本紙張尺度適用中囲國家樣率（CNS ) A4说格（210X297公釐) ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -
、1T 經濟部中央揉率局員工消费合作社印製 Η Ο 2 2 Α7 Β7 五、發明説明（27 ) 1-周期： 於72°C5分鐘 Α4‘2·編碼病毒蛋白質VP16之411-490區（VP16 TA)之 cDNA之構成 本例描述編碼病毒蛋白質VP16之胺基酸41 1-490 (VP16 TA)之cDNA之構成。此區攜帶此種蛋白質的轉移活化領 域· 衍生自單純⑴疹病毒之病毒蛋白質VP16之轉移活化片段 (4 1 1 - 4 9 0)係經由使用如上定義的條件（參見A 4 · 1)及下列寡 核茹酸 5'-VP16 及 3、VP16 : 5 ' - V P 1 6 (序列識別編號1 7 ): AAGCTTGAATTCGTTAACATGTCCACGGCCCCCCCGACC 3'-VP16(序列識別編號18):
GGTCGACCACCGTACTCGTCAAT 及 100 11呂質禮卩1111015_1(0〇83611&811』3【(1，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992) 5547)經由聚合酶連鎖反應 (PCR)獲得》 如此所得片段包括3 3 4鹼基對其序列表示序列識別編號 2 »於N端部包括一個於PCR選殖步驟添加的蛋胺酸殘基提 供轉錄引發位置（ATG)。 A5-編碼攜帶寡聚合領域之各片段之cDNA之構成 本例描述編碼攜帶寡聚合領域之各種cDNA之構成。然後 此等片段用於構成p53變體。此等片段係利用各種寡核苷酸 經由於各種模版（同源領域之p53及異源，特別人工寡聚合領 域之各種來源的模版）進行聚合酶連鎖反應獲得。放大反應 -30- 本紙張尺度通用中國B家橾率（CNS > A4规格（210X297公釐> (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
4 4 4 Ο 2 2 a? ' _ _Β7__ 五、發明説明（28) 係於如上A 4.1所述條件下進行。 A5.1-包括人工寡聚合領域之cDNA之構成。 本例描述包括由人工白胺酸拉鏈組成的人工寡聚合領域之 cDNA之構成。然後此種cDNA用於由人類p53蛋白質及其 於半胱胺酸1 8 2層面修改的衍生物之片段7 5 - 3 2 5 (實例A 3 . 1) 及7 5 -3 3 6(實例A3.2)構成變體。 此種cDNA係由下列6種寡核甞酸構成： 1 z 1 - 5、序列識別編號1 9): GATCTGAAGGCCCTCAAGGAGAAGCTGAAGGCC 1ζ2-5彳序列識別編號20): CTGGAGGAGAAGCTGAAGGCCCTGGAGGAGAAGCTG 1ζ3-5'(序列識別編號21): AAGGCACTAGTGGGt3GAGCGATGATGAATCGATATCGC lzl-3'(序列識別編號22):
CTCCTCCAGGGCCTTCAGCTTCTCCTTGAGGGCCTTCA 1 z 2 - 3 f (序列識別編號2 3 ): TAGTGCCTTCAGCTTCTCCTCCAGGGCCTTCAGCTT 1ζ3-3 乂序列識別編號24): GGCCGCGATATCGATTCATCATCGCTCCCCCAC 經濟部中央橾準局員工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此等寡核苷酸係使用脒代亞磷酸鹽化學，利用自動D N A 合成儀合成。6種寡核甞酸具有成對互補（lzl-5'/lz-l-3'， 1ζ2-5，/1ζ2-3，，1ζ3-5，/1ζ3-3，）及重疊互補（lzl-3，/lz2-5'，lz2-3f/lz3-5J，可單純經由雜交及接合獲得寡核甞酸 領域"所得L Z序列示於序列識別編號1。 -31 - ___；_ 本紙張尺度適用中國國家棋準（CNS > A4現格（2IOX297公釐） 經濟部中央橾準局員工消費合作社印装 444 022 A7 B7____ 五、發明说明（29) A5.2-包括人類p53天然寡聚合領域之cDNA之構成。 本例描述包括人類p53之天然寡聚合領域之cDNA之構 成。此種cDNA表示編碼p53之胺基酸325至3 56片段含於構 成體 75-3 67(實例 A3.3)，75-AS(實例 A3.4)，75-393(實 例A 3.5 )及其於半胱胺酸層面修改的衍生物1 8 2之片段》 f例B -編碼p 5 3蛋白質之各變體之基因之構成 Bl-p53各片段之選殖 經由實例A PCR所得各片段使用限剪酶Hindlll及 Notl(第3圖）之辨認位置於PCR後選殖入載體pBC SK_ + (Stratagene)。 此等構成產物帶有下列編號： 7 5 -3 2 5 ->pEC 104 7 5 -3 3 6 ' -^pEC 106 7 5 -3 67 ->pEC 13 1 75-AS -^pEC 132 75 -3 93 —pEC 133 由此等產物及經由使用寡核苷酸指導試管試驗突變發生系 統（安木山）及寡核钴酸H1 82進行位置指導突變發生，獲得 位置182帶有組胺酸之對應構成想。此等構成體具有下列編 號： 75-325(Hl 82) -»pEC 134 75-336(Η182) -ί-pEC 135 75-367(H 1 82) —pEC 136 75-AS(H 182) -^-pEC 137 -32- 本紙張尺度適用中困國家標率（CNS > A4规格（21 OX297公釐---- (讀先W讀背面之注意事項再填寫本頁) . . 經濟部中央標率扃員工消费合作社印¾ 444 022 A7 _B7____ 五、發明説明（3〇) 75-393(Η1 82) —pEC 138 B2 -白胺酸拉鏈融合至片段75-325及75-336及其變體Η 182 構成白胺酸拉鏈之寡核苷酸（lzl-5…lzl-3^ 1ζ2-5… 1ζ2-3…1ζ3-5'及1ζ3-3 〇藉助於Τ4激酶磷酸化全部雜交並 插入事先使用限剪酶BamHI及Notl(第4圖）消化的載體 PEC104，106，134 及 135)。 構成產物帶有下列編號： 75-325-lz -^pEC 107 75-336-lz ->pEC 110 7 5-3 2 5(H 1 82)-lz -^pEC 139 7 5 -3 3 6(H 1 82)-lz ->pEC 140 B3-轉錄活化領域融合至整個p53片段 經由以下述方式（第5圖）進行三夥伴式接合反應獲得終產 物： 實例A3所述衍生自VP 1 6之轉錄活化領域係經由使用限剪 酶Hindlll及Sail對PCR產物進行酶催消化製備。 如上所得各種 p53 片段（75-325-12，75-336-12，75_ AS，75-367，75-393及其H182變體）於使用限剪酶Sail 及Notl酶催消化含有該等變體之質體後分離。 構成可能的組合（活化領域/p53)及同時插入事先使用限剪 酶 Hindlll 及 Notl 消化的載體 pBC SK+ (Stratagene) » 構成產物帶有下列編號： VP16-75-325-1Z V-325 —pEC 114 (序列識別編號 2 5 ) VP16-75-336-lz V-336 —pEC 116 (序列識別編號 2 6) -33- I________ 本紙張尺度通用中國國家梯筚（CNS ) A4规格（210X297公釐） {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 444 022 A7 B7 五、發明说明（31 ) VP16-75-367 V-367 —pEC 141 (序列識別編號27) VP16-75-AS V-AS —pEC 143 (序列識別編號28) VP16-75-393 V-393 ^pEC 145 (序列識別編號29) W16-75-325(H182)-lz V-325H -^pEC 147 VP16-75-336(H182)-lz V-336H ->pEC 149 VP16-75-367(H182) V-367H ^-pEC 151 VP16-75-3AS(H182) V-ASH ->pEC 153 VP16-75-393(H182) V-393H -»pEC 155 帶有特異性結合轉移活化劑或轉移活化複合體替代VP 1 6 領域之領域的對應產物係以相同方式構成。此等構成體定名 如下： —
ScFv-75 -32 5 -lz S-325 ScFv-75 -3 3 6-lz S-336 ScFv-75-337 S-367 ScF v-75-AS S-AS ScFv-75-393 S-393 ScFv-75-325(Hl 82)-lz S-325H ScFv-75-336(Hl 82)-lz S-336H ScFv-75-337(H182) S-3 67H ScFv-75-AS(Hl 82) S-ASH ScFv-75-393(Hl82) S-3 93 H 經濟部中央揉準局男工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ：^l!L£_-p53變體之表現載體之構成 本例描述於試管試驗或活體試驗轉移本發明核酸用之載體 之構成。 -34- 本紙張尺度逍用中國國家樣準（CNS > A4規格（210X297公羞、 444 022 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 A7 B7五、發明説明（32) C1-質體載體之構成 欲構成質體載體用之兩型載體。 _ 載體 pVS2 ，述於 DNA Cloning，A practical apporach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford，Washington DC，1 9 8 5 »此種載體為真核表現載 體。編碼變體之核酸以Hpal-EcoRV片段形式插入此等載 體。如此處於SV40病毒之促進基因的啟動基因控制之下。 -載體pCDNA3(Invitrogen)β亦屬真核表現載體。如此 編碼本發明之變體之核酸於此種載體内處於早期CMV啟動 基因的控制之下。實例B3所述構成體皆呈Hindlll/Notl片 段形式引進此等載體.因此可於活體試驗之各種評估系統試 驗》 C2·病毒載體之構成 根據特定模式，本發明包括病毒載體之構成及使用其可於 活體内轉移及表現如前定義之核酸。 更特別有關腺病毒，已經確認多種血清型，其構造與性質 略有差異》此等血清型中，使用2型或5型人類腺病毒（Ad 2 或Ad 5)或動物來源的腺病毒（參見申請案w〇94/26914)屬 於本發明架構之較佳者。可用於本發明之架構之動物來源的 腺病毒中，值得一提者有犬，牛’鼠（例如，MAV1，Beard et al·，Virology 75 ( 1 990) 8 1 )，羊，豬，鳥或另外，猿 (例如，S A V)來源的腺病毒。較佳，動物來源的腺病毒為犬 腺病毒’更佳CAV2腺病毒[例如曼哈頓種株或A26/61 (ATCC VR-8 0 0)] »較佳，人類或犬或混合來源之腺病毒 -35- 本紙張尺度適用巾困國家橾毕（CNS )从狀（21〇><297公羞*) I I - ϋ I I - -— {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -1/ —^1* 經濟部中央標半局貝工消费合作社印製 4 44 02 2 A7 ____ B7 五、發明説明（33 ) 用於本發明之架構。 較佳本發明之缺陷腺病毒包括ITR，可包囊序列及本發明 之核酸。又更佳，本發明之腺病毒之基因组内，至少E1區 為無功能。考慮病毒基因可藉業界人士已知技術變成無功 能，特別利用全面抑制，取代或部份刪失，或於考慮的基因 添加一或多個鹼基。此種修改可於試管試驗（於分離的DNa) 或就地獲得，例如利用基因工程技術或另外經由使用突變發 生劑處理獲得。其它區域也可修改，特別區域E3 (WO95/02697) * E2 (W094/28938) ， E4 (W094/28152，W094/12649，WO95/02697)及 L5 (WO95/02697)。根據較佳具體例，本發明之腺病毒於E1 及E4區包括刪失。根據另一較佳具體例，於區於插入E4 區及本發明之核酸包括刪失（參見FR94/ 1 3 3 5 5 ) »本發明之 病毒中，E1區的刪失較佳由Ad5腺病毒序列之核苷酸455延 長至3 329。 本發明之缺陷重組腺病毒可藉業界人士已知之任一種技術 製備（Levrero et al.，Gene 101 (1991) 195’ EP 185 5 73 ； Graham, EMBO J. 3 ( 1 9 8 4) 2 9 1 7)。特別，可經 由攜帶感興趣的DNA序列之腺病毒與質體進行同源重組製 備β腺病毒及質體同時轉移感染適當細胞株後進行同源重 組。所用細胞株較佳（i)可由該等元體轉形，及（ii)含有可互 補缺陷腺病毒基因組部份，較佳呈整全形式以避免重組風險 的序列。至於細胞株範例，值得一提者有人類胚胎腎細胞株 293 (Gragam et al.，J. Gen. Virol. 3 6 ( 1 977) 5 9)其特 -36 - - p - .. , _MM_____ JL· _________ 本紙it尺度適用中國國家橾率（CNS > A4«l格（2丨OX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消费合作社印製 Α7 _Β7 五、發明説明（35 ) 備。可使用的細胞株範例為細胞株2 9 3。然後生成的重组 AAV藉習知技術純化》 至於疹病毒及反錄病毒，重组載體之構成廣泛描述於參考 文獻.特別參見Breakfield et al.，New Biologist 3 ( 1 99 1 ) 203 ； EP 453242 * EP 1 78220 > Bernstein et al. Genet. Eng. 7 ( 1985) 235 ； McCormick,
BioTechnology 3 (1985) 689等。特別，反錄病毒為可 選擇性感染分裂中的細胞的整合病毒。因此構成癌症治療用 的感興趣載ft。反錄病毒基因組包括兩個LTR，一個包囊序 列和三個編碼區（gag，pol及env)。衍生自反錄病毒之重組 載體中，gag，pol及env基因通常被完全或部份刪失，且由 感興趣的異源核酸序列替代。此等載體可由各型反錄病毒製 備例如特別MoMuLV(鼠莫洛尼白血病病毒，亦稱 MoMuLV) ’ MSV(鼠莫洛尼白肉瘤病毒），HaSV(哈維肉 瘤病毒）* SNA(脾臟壞死病毒），RSV(勞斯肉瘤病毒）或另 外符氏病毒。 欲構成含本發明之核酸之本發明之重組反錄病毒，構成含 有特別LTR包囊序列及核酸之質體，然後用來轉移感染所謂 的包囊細胞株’其可提供轉移質體所缺乏的反錄病毒功能。 一般而言’包囊細胞株可表現gag，pol及env基因。此等包 囊細胞株述於先前技術，特別PA317株（US 4,861,719)， PsiCRIP 株（WO 90/02806)及 GP + envAm-12 株（WO 8 9/0 7150)。此外，重组反錄病毒可於LTR含有修改因此抑 制轉錄活性，以及延長含有部份gag基因之包囊序列 -38 - 本紙張尺度逋用中國國家揉率（CNS ) A4規格（21〇><297公釐') {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央橾準局员工消费合作社印装 444 022 A7 B7 五、發明説明（34 ) 別含有Ad5腺病毒基因組之左手部份（12%)整合於其基因組 或如前述特別於申請案WO 94/26914及WO95/02697所述 可互補E 1及E 4功能之細胞株。 其次，已經繁殖的腺病毒如實例所述根據習知分子生物學 技術回收及純化。 至於腺相關病毒（AAV) *為相當小DNA病毒其以穩定的 位置特異性方式整合入病毒感染的細胞基因组。病毒可感染 廣泛細胞，而未對細胞生長形態或分化造成任何影響。此 外’似乎不會對人類致病。A A V基因組經選殖，決定專列 及特徵化。包括約4700鹼基，於各端含有約145鹼基之反向 重複區（ITR)其作為病毒的複製起點。其餘基因組分成帶有 包囊功能的兩大區：基因組左手部份含有牵涉病毒複製及病 毒基因表現的rep基因；基因組右手部份含有編碼病毒莢膜 蛋白質之cap基因。 於試管試驗及活體試驗使用衍生自AAV之載體來轉移基 因於參考文獻已有說明（特別參見WO 9 1 / 1 808 8 ; WO 93/0923 9 ； US 4,7 97,3 6 8 > US 5,1 39,94 1 - EP 488 528)。此等申請案描述多種衍生自AAV之構成體，由其中 己經刪失rep及/或cap基因且由感興趣的基因替代。其用於 試管試驗（對培養中的細胞）或活體試驗（直接用於有機體）轉 移感興趣的基因。本發明之缺陷重組AAV可經由將含有感 興趣的本發明核酸序列且邊緣有兩個AAV反向重複區之質 體（ITR)，及攜帶AAV包囊基因之質體（rep及cap基因）共 同轉移感染由人類助手病毒（例如腺病毒）感染的細胞株而製 -37- 本纸張/^1適用中《國家標率（〇狨）八4規并（2丨0父297公釐） {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 444022 A7 ____ B7__ 五、發明说明（36) (Bender et al.，J. Virol. 61 (1987) 1639)。然後生成 的重組反錄病毒藉習知技術純化。 供實施本發明，最特佳使用缺陷反錄病毒或腺病毒。此等 載體確實具有將基因轉移入腫瘤細胞的特佳性質。 C3-化學載體 開發的合成載體中，較佳於本發明架構使用聚離胺酸型 (LKLK)n ’（LKKL)n，聚伸乙基亞胺型及DEAE葡萄聚糖 型陽離子聚合物或另外陽離子脂質或lipofectants。其具有 縮合D N A及促進其與細胞膜結合性質。後述性質中，值得 一提者為脂多胺（例如lipofectamine及transfectam)，多 種陽離子或中性脂質（.例如D Ο T M A , D Ο G S及D Ο P E)以及 細胞核來源之肽"此外，開發鎖定轉移感染的構想，利用受 體媒介’可利用陽離子聚合物縮合DNA的原理同時指導利 用陽離子聚合物與細胞膜受體（存在於希望接枝類型細胞表 面）之配合基間之化學鍵聯將複合體搭接至細胞膜。 丈^1^^!^11或胰島素受體之鎖定目標或肝細胞之3^&1〇糖 蛋白受體之鎖定目標曾有說明*使用此種化學載體製備本發 明之組成物可根據業界人士已知之任何技術進行，通常係單 純使各種成分接觸。 3變體之功能評估 本發明之p 5 3變體係於細胞試驗評估下列標準： -轉移活化功能 -抗増生活性 -計畫性細胞死亡活性 -39- 本紙張尺度適用中明國家《率（CNS } A4規格（210X297公* ) ------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,11 經濟部中央棟芈局貝工消費合作社印策 444 022 A7 _B7_____ 五、發明说明（37 ) -與若干p53突變相關的腫瘤生成能力 特別供此評估使用之構成體為實例B所述之構成體V · 325，V-336 及 AS。 D1-轉移活化功能之評估 構成體之轉移活化功能係於轉移活化系統内於活體試驗於 缺乏兩個p53蛋白質對偶基因之SAOS-2(人類骨肉瘤）細胞 (ATCC 編號 HTB85)及腫瘤細胞株 H358 (Maxwell&Roth， Oncogene 8 ( 1 9 9 3 )，3 4 2 1)及 H e L a (AT C C CCL 2)評 估。此種系統係基於使用報告之基因其可以酶催方式評估而 其表現係處於含野生型p 5 3特異性辨認核甞酸單位的啟動基 因控制之上（參見實驗過程）。 試驗中’報告子基因為CAT(氣擻素乙醯基轉移酶）基因而 ρ53 辨認序列為 Funk 等（Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 2 866)定義的等位序列（p5 3 RE)。 此功能之評估係與野生型蛋白質就三種不同標準進行比 較。 D 1 . 1 -回應於劑量之轉移活化活性 細胞（3_5 X 105)接種於直徑6〇11含3毫升〇1^1£1^培養基 (Gibco BRL)補充10%熱失活化胎牛血清之培養皿，於二 氧化碳（5 %)培育器内於37。(：培育隔夜。然後各種構成體使 用lipofectAMINE(Gibco BRL)作為轉移感染劑以下述方 式轉移感染：共3微克質雖（其中〇.5微克報告子質體）及1〇 微升 lipofectAMINE 與 3 毫升 〇pti-MEM 培養基（Gibco BRL)未含血清（轉移感染混合物）共同培育3〇分鐘β於此期 -40 - 本紙張逋用巾困Β家樣率( CNS ) ( 210X297公釐) ~ ^^—^1 ^^^^1 n^i flu 4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 • uf 1 · 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 444022 A7 B7 五、發明说明（38 ) 間，細胞以P B S洗兩次然後於3 7 °C與轉移感染混合物共同培 育4小時，隨後抽取後者並以3毫升補充10%熱失活化胎牛血 清的DMEM培養基替代。細胞再度於37 °C生長48小時。 C A T活性之檢定分析程序 轉移感染後4 8小時’細胞以P B S洗一次然後刮下並回收於 100微升0_25M Tris緩衝液pH 8且利用三次冷凍-解凍周期 溶解於乙醇/固體二氧化碳浴》如此所得全細胞萃取物於 10,000 rpm離心15分鐘及回收上清液進行檢定分析。檢定 分析係經由添加2 0微升細胞萃取物及1 3 0微升反應混合物進 行，最終組成如下： —乙酿基輔梅A 0.4 mΜ -氣徽素， D -蘇-(二氯乙’碰基-1，2-14C) 23μΜ(200 nCi) -Tris 0.18 M pH 8 於3 7 °C培育1小時後’反應產物以2 5 0微升乙酸乙酯萃 取，其中20微升放置於矽膠平板上（薄層層析）於含95%氣仿 及5 %甲酵的混合物内跑動。如此所得層析平板最終使用即 刻顯像劑（Packard儀器公司）顯像，可求出各種乙酿化產物 之比，該比例反應出酶氣擻素乙醯基轉移酶活性因此反應出 各種構成體之轉移感染活性。 使用處於CMV啟動基因（pCDNA3)控制之下且示於第6圖 之構成體於SAOS-2細胞株所得結果顯示各種構成體具有下 列性質： _ -P 5 3蛋白質具有劑量相關活性容易朝向高劑量飽和（由 41 - 本紙張尺度逋用中a國家搮準（CNS > A4规格（2丨0X297公嫠)~~ f—— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丁 . • / y I . 444 022 A7 B7 五、發明説明（39 ) 100塵克質體）。此等飽和反應需要可於此等條件下具限制作 用的辅因子。 -AS蛋白質保有野生型蛋白質之轉錄活化能力。 -恰似p53蛋白質，V-325及V-336蛋白質具有轉移感染 活性其於高劑量顯然不會飽和。因此此種明顯缺乏飽和可使 整體活性增高。此外，顯然構成體V-3 2 5比同系物V-3 3 6更 具活性，提示帶有75-325區之嵌合體蛋白質特別優異。 欲證實此等性質，於腫瘤細胞株Η3 5 8進行類似實驗，該 株恰似SAOS-2細胞株缺乏兩個ρ53基因之對偶基因。實驗 中’各次轉移感染係使用各5 0塵克於C Μ V啟動基因控制下 的構成體進行―。表1所示結果明白顯示兩種變體V · 3 2 5及V -3 3 6比較野生型ρ 5 3蛋白質顯示改良的轉移感染活性，再度 變體V-325之活性-較佳。 表1 :於腫劣 1細胞株Η 3 5 8細胞之轉移感染活性 pCDNA 3 野生型p53 V-325 V-336 相對CAT活性 1 6 25 16 兩種試驗證實本發明之變體具有至少一種改良Ρ53之性 質。 D 1 _ 2 - Ε 6蛋白質（Η Ρ V 1 δ)對轉移活化功能的影響 所用程序與實例D1.1所述相同。此種轉移感染實驗中， 於CMV啟動基因控制下之構成體（pCDNA3)與漸增濃度且 於SV40啟動基因控制下之表現Ε6質體（pSV2)共同轉移感 染。SAOS-2細胞株所得結果示於第7囷對各構成體顯示下 列性質： -42- 本纸張尺度家樣iMCNS ) A规格（21GX297公麈) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 經濟部中央橾準局員工消费合作社印製 444 022 A7 B7 經濟部中央搮準局負工消費合作杜印«. 五、發明説明（4〇) -隨著E6濃度增高p53活性降低，此種降低相當可能反應 E6誘生p53的分解； -蛋白質V-336對E6缺乏敏感性； _蛋白質V-325顯然可略為藉E6活化。蛋白質V-325經常 且於觀察的情況中皆比較P53更具活性。欲證實對蛋白質E6 之此種表現差異，試驗構成體V-3?5及V-3 3 6於HPV-18陽 性細胞（HeLa)之轉移感染活性因而表現蛋白質E6，且該活 性與野生型p53比較。 根據前述程序進行的轉移感染實驗中，各種構成體係於 CMV啟動基因控制之下（pCDNA3)。 表8結果明白顯示兩種構成體V-325及V-336的轉錄活 性，野生型p53蛋白質活性不夠高，再度提示此二構成體對 E6不敏感，與野生-型蛋白質相反。 此種表現指示此二構成體為超野生型，特別適合治療 HPV16或HPV18感染之相關病情* D 1 · 3 -支配陰性p 5 3突變株對轉移活化功能的影響 實驗中’使用就野生型p53蛋白質描述為支配腫瘤生成及 支配陰性的突變株Η 1 7 5。根據前述程序進行的轉移感染實 驗中’各種構成體及Η175突變株置於CMV啟動基因 (pCDNA3)控制之下。各構成體與漸增濃度的可表現突變株 H175之質體共同轉移感染。 第9囷所示結果顯示各種構成趙具有下列性質： -當p53蛋白質於過量突變型H175存在下時，p53蛋白質 之轉移感染活性降低，確實對應於生理情況，原因為已知此 -43- 本紙張尺度適用中國國家樣车（CNS)A«UM 210X297公釐) (锖先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ΗΤΓ 經濟部中央樣準局負工消费合作社印裝 444 022 A7 ____B7 五、發明説明（41 ) 型突變型比較野生型p53遠更安定，因此經常過量。此種突 變株之支配陰性效果確實於此處測量。 -AS蛋白質對突變株H175之支配陰性作用敏感度增高， 原因為對較低濃度之突變株Η 1 7 5敏感。 -相反地，蛋白質V-3 2 5及V-3 3 6不僅對支配陰性作用更 敏感’同時於突變型Η 1 7 5存在下其活性以劑量相關方式增 高°再度’本試驗中，蛋白質V-325具有比較蛋白質V-336 更高的效果，證實其作為超野生型之可能狀態較高β 三種試驗結果明白顯示本發明之變體忑別含75_325-lz或 7 5 - 3 3 6 -1 ζ區之變禮’具有1)較高轉移活化活性，2)對得自 HPV18之Εό蛋白質作用敏感度較低，甚至可能相當安定， 及3)對若干ρ53突變株之支配陰性作用不存在有敏感性或甚 至活性增高。此等-性質乃出乎意外且未預期者可對本發明之 變體提供顯著治療優點。 D 2 -對細胞生長的影響 構成體V-325及V-336對細胞生長的影響係於實驗中對各 型細胞株與ρ53平行試驗，該試驗係使用可表現此三種蛋白 質質體轉移感染後形成新擻素（neomycin)抗性菌落。 根據前述程序進行的轉移感染實驗中，各種構成體係於 CMV啟動基因（pCDNA3)之控制之下。 形成新擻素抗性菌落程序 轉移感染後4 8小時，刮下細胞並移到直徑1 0 cm之培養基 且再度生長，使用10毫升DMEM培養基補充10 %熱失活化 胎牛血清且含400微克/毫升geneticin(G418)。於G418存 -44- 本紙張尺度逋用中國B家橾率（CNS > A4规格{ 210X297公釐) (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) · 444 022 細胞株 p 5 3 Ras ATCC編號 SAOS-2 -/- ? HTB 85 HCT 1 1 6 野生型 突變Ki-Ras CCL 247 Η 322 L 348 ? (” Η 460 野生型 突變Ki-Ras HTB 177 HeLa 野生型 ? CCL 2 (* )Putnam et al., Surg. Oncol.，1 ( 1 9 9 3), 49 A7 _____ B7 ____ _ 五、發明说明（42) 在下選擇15日後，使用fuchsin染色計算Neo菌落數目。 此實驗係對各型細胞進行，其中p53及Ras蛋白質狀態示 於表2。 表2 : Neo菌落形成試驗中使用的細胞株狀態 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本萸) J. 訂 實驗結果示於表3。 轰3 : Neo 菌落之生成 細胞株 載體 p 5 3 V-325 V-336 SAOS-2 253 17 12 13 HCT116 1 12 62 58 6 1 H 322 93 5 2 3 H 460 153 1 10 87 92 HeLa 172 15 1 3 1 47 經濟部中央橾準局負工消费合作社印装 結果顯示構成體V-325及V336具有可妨礙細胞生長的能 力，該種功能至少如同野生型p53蛋白質於可發揮正常功能 之細胞條件下同等有效（野生型p53或雙重刪失株），但特別 於野生型p 5 3蛋白質活性極低之細胞條件下（表現得自 HPV18之E6蛋白質的HeLa細胞）仍可保有此種活性。此種 -45- 本紙張尺度適用中國國家揉率（CNS ) A4規格（2丨0X297公羞;) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 444 02 2 a? B7 五 '發明説明（43) 性質可對本發明之變體提供顯著治療優點。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) --- •π -46 - 本紙張尺度適用中國國家搮準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公釐’） 經濟部中央樣準局員工消費合作社印装 444 022 A7 B7 五、發明説明（44) 序列表 LZ(序列識別编號1)
AGATCTC-AAGGCCCTCAAGGAGAAGCTGAAGGCCCTGGAGGAGAAGCTGAAGGCCCT
GC-AGGAGAAGCTGAAGGCACTAGTGGGGGAGCGATGATGAATCGATATCGCGGCC V P 1 6 (序列識別编號2)
AAGCTTGAATTCGTTAACATGTCCACGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGAC
GAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGAT
TTCGATCTGC-ACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCAC GACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTT1, ACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGTCGACC * · «! — AS(序列識別编號3)
TCGAGCCTGCAGCCTAGAGCCTTCCAAGCCCTCATGAAGGAGGAAAGCCCAAACTGC
TAGTGAGGATCCGCGGCCG p5 3 75-3 25 (序列識別编號4)
GGGAAGCTTGGGCCGGGTCGACCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCA CCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGC AGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGC ACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTG CAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATC TACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGC TGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAAT TTGCGTGTGGACTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCC * TATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGT AACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTG gaagactccagtggtaatctactgggacggaacagctttgaggtgcgtgtttgtgcc
TGTCCTGC-GAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCT
CACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCC
TCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGGGATCCGCGGCCGCC p 5 3 7 5 - 3 3 6 (序列識別编號5 ) -47- 本紙張尺度適用中國明家標隼（CNS)A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 444 022 A7 B7 五、發明说明（45)
GGGAAGCTTGGGCCGGGTCGACCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCA
CCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGC
AGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGC
ACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTG
CAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATC
TACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGC
TGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAAT
TTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCC
TATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGT
AACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCAGACTG
GAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCC
TGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCT
CACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCC
TCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGT
GGGCGTGAGGATCCGCGGCCGCC 序列識別编號2 5 : V - 3 2 5 、 (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) . 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印家 t/1 ATG 7CC S 61721 CAC GTG V C-GG GAT « D A7C GCC Μ A 241/61 GGT CGA G B 301/10* C7G TCA t S 了TC TTC F L ATC ΤΤΓ Μ Γ ^ei/161 Η
D
C ACC CCC CCC CCC ACC CAT T A ? ? τ 0 OCG ATG vCC· CAT CCC GAC A « A ：-： A 2 ••产严♦ 一一 ^ ψ ——·*» • wvr wM · j 4 S r ' v ? C* ? GAC TTC CAG TT? OAC CAG D F Ξ Γ r 0 CCT CCA CCA GCA GCT CCT r λ ? ·· A A ? tct tct ctc ccr tcc cac Ξ S V ? Ξ 0 CAT TCT 2GC ACA C-CC r： S : A ：< TGC CAA C7* C<C KKZ ACC \ v — f·' * «
C7C AGC v s GCC- CTA ACC CCC ΑΤί 77T K r ACA CCC 7 ?
ACC 7C7 CTG s v 7GC CCT c ? 31/ΐϊ CTG GCC I. G GAC CAT D D 151/51 CAC GAC r: D 2ΐ*·/·?1 ACC GAT T - D 271/91 GCG GCC A A 33··/川 TAC CAC '1 0 J9W.31 ACT TCC 了 c CTC- CAG v C 51 ··厂
GAC GAG CTC CAC TTA GAC GCC GAG DSLHLDGE Tt’C-CAT CTG CAC A了G TTG GGG CAC
D
D
L TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT SAPYGAL2 CCC C7T GGA λΤΤ CAC GAG TAC C-GT ALCIDEYG CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC PA?A?SW? GGC AGC TAC CGT TTC CCT CTC CGC GSYGrRLC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG TYSPALNK CTG 7GC CTT GAT 了CC ACA CCC CCG L W V C* S 了 P ? -48 本紙張尺度逋用中國國家揉率（CNS ) A4it格（210X297公釐） 4 44 0 2 2 a7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明说明（46) CCC CGC P G GTC AGC V R 6C'/5〇l CAT CTT H L 66W221 CGA CA7 Η H 72U2At CAC 7AC h y 781/261 ACC ATC €<·"2Βΐ CGT G了了 R V 9〇i/3Cl vG^> GAG C ε AGC TCC s s 1C2W3<*. ΛΑ5 CTG K L ：：cW?c·^
SAG ACC CGC C7C CGC 丁 R V R CGC TGC CCC CAC R C P H ATC CCA 07C CAA I R V £ ACT CTG G?G CTG s V V v MC TAG A7G TGTL N Y M C ATC ACA CTG GKA ： T 1 I TGT CCC 7Z-7 CCT CAC? CCT CAC CAC C-AG P π H £ TCT CCC CAG CCA s p c ? ccc ere ca5 λ ： Ξ
•，-· A CCC ATC CCC ATC 7f<c CAG A M A I y K c 571/191 CAT GAC CGC TCC TCA CAT ACC K E R C S D S 631/2*.1 GGA AA了 TTG CGT G7G GAG TAT G N L K V £ γ 691/231 CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT P Y £ p P E V 751/251 AAC AGT TCC 了GC ATG CCC GCC N S S C M G G 811/271 GAC TCC ACT CGT-AAT-CTA CTG D S S C K L L 6Ίl729^ CSS ASA GAC CSC CSC ACA GAC G S D a 只 T E 931/311 CTC CCC CCA GGG ACC ACT AAG L P ? G S T K 991/331 AAC- AAC AAA CCA CTG GAT GGG JC K K P L D G 1051/351 ^AG kAG CTC KAG GCC CTG GAG ε κ i x a t ξ
TCA CAG CXC ATG ACC GAC CTT S Q Η M 7 E V GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG D C L A P ? 〇 TTC GA丁 GAC AGA AAC ACT 777 ； L D D R N T F I CGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC G S D C T T I ATG AAC CGG AGG CCC ATC C7C Μ N R R ? I X GGA CGG AAC AGC TTT GAG G7C* G R N S Γ E V CAA GAG AAT CTC CGC AAG ΑλΑ E E ϊ〇 L S K K CCA GCA CTG CCC AAC AAC ACC R A I, P N1 N T GAT CTG AAC GCC CTC AAG GAG D L K λ L K E GAG AAG CTG AAG" C-CA C7A GTG E K L K A L V {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ^4. 序列識別编號2 6 V-336
A：G 7CC S 6：/2} GAC C7Z V CGG CAT G D ；ew6i ATG GCC M A
K
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/S' CCA
3 I /1 1 Ad?·:：： CK GAT G了C ASC CTC GGG GAC GAG CTC CAC 了TA GAC CGC GAC* "^rrTDVSLGDELHLDCI / 91/3¾ CCS ATC CCS CA了 GCC GAC GCG CTA GAC -GAT 丁丁C GAT CTG GAC A7G TTG GGG GAC A>iAHADALDDFDLD HLGD 151/5T' 7CC CCG GC-C CCS GGA TTT ACC CCC CAC <；XC TCC GCC CCC 7AC CCC C-CT CTG GXT S^^PGrTPHOSAPYGALD 211/71 CA亡了7C GAG ΓΓ了 GAG CAG ATG ΓΓΓ ACC GAT CCC C7T GCA A7T GAC GAG TAC GC?7 〇Frr^C：MrTDALGID£YC 27W91 CCT Gj;a rCA CCA GCT CCT ACA CCG GCO GCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC TCC CCC •49- 本紙張尺度通用中國B家樣芈（CNS > A4规格（210X297公釐} 444 022 A7 B7 五、發明説明（47) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製
C R P 301/101 CTG TCA TCT L S S 361/12Ί TTC TTC CAT Γ L K ATG TTT TGC MFC <81/161 CCC GGC ACC P G T GTG AGG CGC V R R 60W201 CAT CTT ATC H L ： 661/22Ϊ CGA CAT ACT R K s 721/241 CAC TAC AAC Η Y N 781/261 ACC ATC ATC T I Ϊ Θ^Ι/281 CCT STT TCT R V C 901/301 GGG GAG CCT C E ? ^61/321 AGC 了CC TCT S S 5 1021/3-il CGT GGC CCT R C R 1031/361 AAG GCC CTG K A L
A P TCT CTCs v TCT GGCs c CAA CTC 0 L CGC GTC R V TGC CCC C P CGA G?G S V GTG CTG V V TAC A7G 1 M ACA CTG
CCT TCC P s ACA CCC GCC TCI A· C CAC CAC Η K CCC CAG P 0 gag c-at E Ό
GCC AAG A K CGC GCC K A CAC CAT Η H GAA GCA Z G GTG CCC V ? TCT AAC C K GAA -GAC t 。 CCT ? 0 GAS CTC CCA AAC ? ：< CTC* KKO 1 X
CAC ΑΑΛ ACC 0 ：< T AAC TCT GTG K S V ACC TGC CCT TCP ATG CCC ATC Η λ I GAC CGC TGC ESC AAT T7G CGT N 1 S TAT G^G CCC V E P ACT TCC TGC 5 S C 7CC AC了 GGTs s c AGA GAC R D 3 CCC CCA C-CC ? ? G AAC ΑΛΛ CCA K K ? GCC CTC AAC A L X A A P 331/T n TAC CAG GGC Ϊ 〇 G 391/131 ACT TGC ACC TCT ^Sl/Ί si GTG CAG CTC V 0 L 511/171 TAC KAG CAG Ϊ K 〇 571/191 TCA CAT AGC s』 s 631/211 CTC CAG TAT V E Y 691/231 CCT GAC GTT P E V 7&V251 ATG <；GC GGC M G G 611/27^ AAT CTA CTG N L L 871/291 CGC ACA GAG S T E 931/3”·· _ AGC ACT AAG S T K 991/231 CTG GAT CGA LOG T051/351 CAC AAG CTG E K L U11/371 A P A AGC TAC CCT S Y G TAC TCC CCTy s p TGG GTT GAT W V D TCA CAG CAC 5 Q H CAT CGT CTG t> G L T7G CAT GAC L D D GCC TCT GAC C S D ATC AAC CGG K N R GGA CGG AAC G R M GAA CAG AAT E E N CCA GCA CTG R A L C^A TAT TTC E Y T AAG CCC CTC K Λ 1,
P s w ? TTC CGT CTC CCC Γ B L G GCC CTC AAC AAC A L N K TCC ACA CCC CCG S T P P ATG ACC GAG CTT Μ T E V .·> GCC CCT CCT CAG A P P 0 AGA AC了了了了 R N T Γ TGT ACC ACC A?C C T T I AGG CCC ATC CTC R P I L y AGC TTT GAG GTC S F E V
CTC CGC L R
AAG AAA X K
CCC AAC AAC ACC ? N N · T ACC CTT CAC ATC T L Q I GAG GAG AAG CTC E E K L
GAC CA E E
GGC GAG CGA TGA TGA K · * 序歹d識另编號27 : V-367
\/Λ 3V” ATC TCC ACv vCC CCC CCC ACC CAT CTC A3C C7C CGG GAC GAC CTC CAC ΤΤΛ GAC GGC CAG MSTAPr - DVSLCDtLH LUCE •50 本紙張尺度適用中國國家搮率（CNS > A4規格（210X297公漦） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
444 022 A7 B7 五、發明説明（48 ) 6'·/2* ”/31 iAC Q~Q A7G CCG CAT GCC 〇AC GCG C7A iAC GAT 7TC GAT CTG CAC ATG TTG GGG GAC D V A y A ：H A D A L D D r D L D K L G D 12 W· ••51/51 GGG GA7 rcc CCG GCG CCC GGA TTT ACC CCC CAC CAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT 0 D Ξ ? C P G T 7 p :-: D s A P Y C A L D Ί81/6Ί 2*0/71 ATG GCC GAC TTC GAC T7T GAC CAG ATG TT7 ACC 0A了 CCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT Μ A n r E Γ E 0 K Γ T D A L C I D E Y G 2A^/^y 27Ί/91 GGT QZk CCT CCA CCA GO GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC 了 GG CCC G R p A P A A p 了 p A A P A P A P s W P 30W*rC： * 331/ni CTG TCA rcr rcr GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG CGC L S 5 s V p 5 0 K T V 0 G S Y C F L G 36^/12： *79ΤΛΤ3Ί TTC TTC CAT TCT CGC ACA GCC AAG TCT CTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC ΛΑ0 F L •r: s C 了 A K s V -·* — T c T Y 5 P λ L W K AbU^S^ ATG T77 TCC CAA C7C CCC AAC ACC TGC CCT G7C CAC CTC 7GC GTT GAT TCC ACA CCC CCC M F c c A · K T c P V Q L W V D s T P ? <ew*.6i -ΊΪ/Ί71 CCC GCC ACC CGC CTC CCC GCC ATG CCC ATC 7AC AAG CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAC GTT ? G r V s A H A Ϊ Y K 0 S 0 K H T E V 57；/191 G7G AGC CvC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GCT CTC GCC CCT CCT CAG V R Λ c ? H K t R c 5 D S D G L A P P 0 601/201 ' 631/211 M CAT CT? ATC CCA CTC CAA GGA AAT TTG CCT G7G GAG TAT TTC ACC CTT CAG ATC CCT GGC H L 二 V Ξ . G M L 祆 V E Y Γ T L 0 I R Q 661/22^ cr^/231 CGT GAC- cc-c GAG ATG TTC CCA GAC CTG AAT GAC CCC TTG CAA CTC AAC GAT CCC CAC a E = F z K F R r L K E Λ - L £ L ：< D λ G 751/251 GCT GGC- ΛΛ*: GA2 CCA GOZ GGG AGC XGG C-CT CAC 7CG AGC TGA TGA A G Y z p C G 3 R A H S S - • (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) —. 訂_ 經濟部中央棣準局負工消费合作社印製
序列識別编號28 : V-AS
A7S TCC ACG :-C：C CCC CCS ACC SVT GTC AGC CTG CAC CAG CTC CAC TTA GAC GCC GAG
HS.7A??TDVSt_CDELKLDGE 61/21 91/31 CAC C7C CCG ATC CCC CAT CCC CAC CCG CTA CAC CAT TTC GAT C7C GAC ATG TTG GCG CAC DVA>：AKADALDDrDLDMLC〇 121/41 ； £1 /51
GGi； CAT 7CC CC：： GSG CCG CM 了7了 ACC CCX CAC GAC TCC CCC CCC TAC GGC CCT C7G GAT GDS?Gr-crT?H〇SAPYGALD -51 -本纸乐尺度逍用中國H家樣率（CNS > A4規格（210X297公釐） 經濟部中央樣準局貝工消费合作社印裝 F. 444 02 2 A7 B7 五、發明説明（49) Ί8、/61 ATG GCC CAC TTC GAG TTT CAC CAG ATC TTT ACC CAT CCC CTT QQS ATT CAC CAC TAC GGT MADFEFEQMFTDALG I D Z Y G 241/81 271/91 ; GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCC GCC CCT OCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC j
GRPA?AAPT?AAPA?APSWP I
301/1G1 331/n 1 J CTG TCA 7CT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG CGC AGC TAC CCT TTC CGT CTC GGC 1 X，SSSV?SQKTYQCSVGFRLG 361/12'. 39V131 TTC TTG CTA丁丁CT CGG ACA CCC AAG TC7 GTG ACT TCC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAC FLHSCTAKSVTCTYSPALNK 42T/U1 <51/151 ATC TTT TGC CAA CTC CCC AAG ACC TCC CCT CTG CAC CTG TGG G7T GAT TCC ACA CCC- CCG KFCGLAKTCPVOLWVDSTPi
CCC CGC ACC CGC GTC CGC CCC ATG CCC ATC TAC AAC CAC TCA CAG CAC ATG ACC GAG CTT «：* — PCTHVSAHATYKOSOHMTEV 50/161 571/191 GTG AC‘G CSC TC-C CCC CAC CAT GAG CGC TG<r^CA CAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG VRftCPHHERC SDSDGLAPPO 601/201 631/211 CAT CTT ；CC CGA STG G；Jk CGA AAT TTG CGT CTG GAC TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG HL：av£GNLRVEyrTL〇IRC 661/221 693/231 CGT GAG CCC TTC CAG ATC TTC CGA GAC CTG AAT CAG GCC TTG GAA CTC AAG CAT GCC CAG PE RriK_FS£LNEALELKPAQ 721/2^1 75Ί/25Ϊ
GCT GCG AAG GAS CCA GC.G GGG ACC AGS GCT CAC 7CG AGC CTG CAG CCT AGA GCC TTC CAA AGKI?〇 GSRAHSSLC-P^AF〇 761/2c ·. 6Ί Ί /271
GCC C了C ATG XA:· SAG SAA ASC CCA AAC 了GC 7GA TGA A L H ?： r Ξ c ? K C · . 序列識別编號2 9 : V - 3 9 3 31/Π A7G TCC ACG ZZC CCC CCC- ACC GAT GTC ACC C7C C-GC GAC GAG C7C CAC TTA GAC GGC GAC MSTA??-^V3LGD£L nLDCI 61/21 91/31 CAC GTG CCC ATG GCi；' CAT CCC CAC GCG CTA CAC CAT TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC dva^akadalddfdldmlcd 121/41 1S；/S1 GCG CAT TCC CCC C-GG CZZ CCA 7TT ACC CCC CAC £AC TCC CCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ^^SPC^CTTPHOSAPYGALD 1 SI/61 211/71 ATG GCC GAC TTC GA<； T了了 GAG CAG ATC TTT ACC CAT GCC CTT CGA ATT GAC GAC TAC GGT MADTrrrQ Mp-TOALG I DEYG 241/&Ί
GGT CGA CC: GCA CCA SCA GCT CCT ACA CCS GCG CCC CC7 CCA CCA CCC CCC 7CC 7GG CCC CR?AfAArT?AAPA?APS«'P -52- 本紙張尺度適用中困國家樣準（CNS > A4SL格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,π 444 0 2 2 A7B7 五、發明说明（50) 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印装 301/101 331/m CTG TCA ，TC7 1 TCT GTC ：CCT TCC CAC ；AAA ACC TAC CAG CCC ACC TAC GGT TTC CCT CTG GGC L S 5 s V P s 0 Y 0 Q s y G F R L Q 361/121 391/131 TTC 丁丁G CAT TCT GGQ ACA .GCC ；AAG i TCI 'GTC ACT TGC ：ACC TAC TCC CCT CCC CTC AAC AAC F L V £ G T A K 5 V T c T Y s P A L K ^21/141 451/151 ATG ΤΓΓ TGC CAA CTG CCC AAC ACC TGC CCT 1 GTG CAC CTG :TGC ；GTT CAl TCC :ACA ‘ CCC CCC Κ Γ C Q L λ K T c P v 〇 L w V P s T P P 401/161 51V171 CCC GGC ACC CGC GTC CGC CCC ATG GCC ATC TAC AAG CAC TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT P G T R V R A M A I y K 0 S 0 H M T E V 541/1S1 571/191 GTG AGG CGC rcc CCC CAC CAT CAG CGC τοε-^τβΑ,.σΑΤ AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG V R a P K H £ R c S V S D ΰ L A P P 0 601/301 «17211 CAT CTT A7C CG^ CTG CAA GCA MT TTC CGT GTG GAG TAT TTC GAT CAC aga AAC ACT TTT H L T S V I c s- L R V E Y L D D 只 N T F 661/221 691/231 CGA CAT AGT G7G G 了G G了G CCC TAT CAG CCG CCT GAG CTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC R H 3 V v - V P Y £ P P E V C s D C T T I 721/J41 751/2S1 CAC TAC AAC 7AC ATG 了GT AAC ACT TCC TGC ATG CGC CGC ATG AAC CGG ACG CCC ATC CTC Η Y re V H ζ K 3 s c M ' G C M K n R P I L 761/361 • βΠ/271 ACC ATC ATC ACA CTC GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA CTG GQA CGC XAC AGC ITT GAG GTG T I I T L Σ D 5 s c N L L G 只 S F t V 641/2S1 871/291 CG7 G7T 7«T CCC TGT CCT GGG ACA GAC CCG CCC ACA CAC CAA CAG AAT CTC CCC AAC AAA R V C A C P 〇 R 0 R R T t E r N L· R X K 90W301 931/311. .- GGG CAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA CCG AGC ACT AAG CCA GCA CTG CCC AAC AAC ACC G t ta K £ L P P c S T K H A L •P N N T 961/321 991/331 A*GC TCC » w _ CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GCA CAA 7A 了 77C ACC C1T CAG AIC s s s & 0 ? V K ：< P L D G E V T T L Q I l〇5'i/351 CC7 CGG C：T CAG CCC TTC GAG ATG TTC CGA GAC CTG ΑλΤ GAC GCC TTG GAA CTC AAC GAT a c A t R r r M r R E L N E A L L K D 1061/361 1Ί11/371 SCC CAG w%, i GGC AAG GAC CCA CCC GGG AGC AGC CCT CAC TCC ACC CAC CTG AAC TCC ΑΛΛ A Q A G ' X Ϊ C S R _ A H s s · H L K s K n<1/361 1171/391 AAC CCT CAG tCT ACC TCC CGC CAT ΛΑΑ AAA CTC ATG TTC AAG ACA GXA GGG CCT GAC 丁 CA K G s T s R H K K L K Γ K 7 £ C P D S •2〇\/4〇l CAC TGA TC-Λ (锖先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -53- __心 本紙法尺度逍用中國H家棣率（CNS } A4规格（210X297公釐）

Claims (1)

  1. 444 022 AS 第8510邱31號專利申請案 B8 中文申請專利範圍修正本（卯年1月）益 六、申請專利範圍
    y ,- 告本 1. 一種p53蛋白質變體，其中 (a) 全部或部份寡聚合領域經刪失且由具有序列識別編 號1之人工白胺酸拉鏈領域置換’ 序列識別編號（1) agatctgaaggccctcaaggagaagctgaaggccctggaggagaagctgaaggccCt ggaggagaagctgaaggcactagtgggggagcgatgatgaatcgatatcgcggcc 且其特徵在於自殘基326或殘基337之刪失C端部 份；及 (b) 轉移活性領域被刪失且由包括序列識別編號2之轉 移活化領域置換 序列識別编號（2) iiAGCTTGAATTCGTTAACATGTCCACGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGAC G AGCTCC ACTT AG ACGG C G AGG ACGTGGCG ATGGC GCATGCCGACGCGCTAGAC GAT TTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCAC gactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgttt ACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGTCGACC 2. 根據申請專利範圍第1項之變體，其特徵為p53蛋白質 182位置之半胱胺酸殘基被組胺酸殘基置換。 經濟部中央標準局工消费合作社印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -a 3. —種序列識別編號25之多肽（V-325)及其變體V-325H包括一個组胺酸位在p53之182位置 序列識別編號（25) 31 - ATG TCC XCC CCC CCC CCG ACC GAT GTC ACC CTC GGG GAC GAG CTC CAC TTA GAC GGC GAG 61/21. 91/3' CAC CTC SCO ΛΤΟ ：CC CA; OCC GAC GCC C7A GAC GAT TTC CAT CTC CAC ATG T7G GCC CAC DVAMA：-；A3ALDDrDLDMT-G5 121/^1 1 51 /ST- . GGC CAT TCC CCC ZZZ ZZZ OCA TTT ACC CCC CAC GAC TCC CCC CCC TAG GGC CCT CTG CAT GD5?0?C-?*?HDSAPYGALD 本纸银尺度逍用中«Β家樣丰（CNS ) ( 210XM7公釐） 六、申請專利範園 經 濟 部 中 央 揉 车局 工消 费 合 作 社 Α8 BS C8 D8 1β1/6> · 211/71 XTG GCC CAC TTC CAG ΓΤΤ GA5 CAC ΚΣΖ ΤΤΓ ACC ΟΑΓ GCC CTT OGA ATT GAC GAG TAG GCT MADrr?EQMFTDALGlDEYG .241/81 271/91 GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCC GCG GCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC GR?A?AA?tPAA?A?A?SW? 301/101 33V”1 CTG TCA TCT TCT CtC CCT tCC CAC ΛΑΑ ACC *TAC CAG CCC ACC TAC GCT TTC CGT CTG GGC ^SSSVrSOKTYOGSYGFRLG 361/121 t 39"··31 TTC rrc CAT tct ccg aca sec AAG tct gtc tgc xcg tAC TCC CCT gcc ere AAC aac rLK5^*A：<SVTCT-S?ALNK 421/H atg rrr tcc caa ctc* ccc aao acc toc cct otg cag ctg tcc gtt gat tcc aca ccc cw μ ? c G 二 A X 了 C ? V ς L w v d s t p ?-4β'/，6， 511/171 CCC GGC ACC CGC G"C CCC GCC ATC CCC ATC TAC AAC CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAC GTT· PGXRVRAMAIYKQSQ HMTE^V 541/101 57’"，9、 CTG AGO CCC TCC CCC CAC CAT GAG C〇C TGC TCA CAT ACC GAT CCT CTG GCC CCT CCT CAG VRftCPHK£RCSDSDGLAP?Q 601/201 β3τ/211 CAT'CTT ATC CGA GTC GAA GCA AAT TTC CGT CTC GAG TAT TTC CAT GAC AGA AAC ACT TT? HLXRVECMLRVEyLDDRNTF 661/221 691/23^ CCk ,CAT AC7 CTG CTC GTC CCC TAT GAC CCC CCT GAC GTT GGC TCT GAC TGT ^ACC ACC λτς RHSVVVPYEppsvCSDCTTI *m/2V‘ 751/251 CAC TAC AAC TAC ATC TGT AAC AGT TCC TCC ATC GGC GCC ATC AAC CGG AGG CCC ATC CTC HYNV KCNSSCMGGMNRR?IL 76V261 81 ACC ATC ATC ACA CTC CAA GAC TCC ACT CCT KAT CTA CTiS GGA CGO ^AC ACC ΤΤΓ GAG GTC- *I*TIS DSSGMLL GRNSFEV β<1/281 871/291 fCCt CTT TCT GCC TCT CCT CCG ACA GAC CGG CCC ACA GAC GAA GAG ΛΑΤ CTC CCC AAG AAA R V C A c ? S'· 5 a R T * E E E f N L R K K 931/31. GGC GAG CCT CAC CKZ CAC CTC CCC CCX GCC AGC ACT AAC CCA CCA+^TTG CCC AAC AAC ACC C » P*K f· Γ τ a ^ y· ^ i» n x · 961/32； P ? C R A ? N 請先 聞背 之 注 再 訂 s τ K 991/331 AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCX CT。GAT GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAC S S s P Q ? 1021/34* K K K P D L K Λ L N T L D C _ 10SW351 XAC CTy ΛΑΟ CCC rrc CAG 5AC MC CTC AAG CCC CTG CAC CAC AAG CTG AAG GCA CTX CTG KL?：A-t£XLXAl，£EKl.XALV TOSV361 CAC CGX -tga *：-a 225-.. K ε -2 本紙》尺度遑用中两«家標卒（CNS ) A4規糌（210X297公兼） 六 、申請專利範圍 4. AS B8 C8 D8 一種序列識別編號26之多肽（v_336)及其變體v_336H 包括一個組胺酸位在P53之182位置 序列識別編號（26) i/i 3"” AtC TCC ACO aCC CCC CCG ACC CAT GTC ACC CT<5 CGC CAC CAG CTC MSTA?rT-JV5x-GDE 6Ϊ/2-- . 9”3ΐ GAC CCo ATC· GCO CAT GCC GAC CCG CTA CAC GAT TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC dvahakadalddfdldmlgd U1/41 151/51 - GGC GAT TtC CCG CG5 CCC GGA ΤΓΤ ACC CCC CAC GAC TCC CCC CCC TAC GGC CCT CTG CAT GOSPGPGFTP.KDSKPvgalD 161/.61 2Π/71 AJG CCC GAC TTC C-AC- ΓΓΓ GAG CAC ATG TTT ACC GAT CCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT MA〇"I~iQMrTDALC5X〇EYG 24Ϊ/ΒΪ 271/91 CCT CCA CCT CCA CCA CCA CCT CCT ACA CCG GCC CCC CCT GCA CCA CCC CCC TCC TGG CCC CAC T H L ΤΓΑ GAC GCC GAG D G £ 請 先 W 面之注 I 貪 經濟部中央標準Α夷工消费合作社印*- G R 301/101 CTG TCA L S 361 TTC TTG F L ATG ΤΠ Μ Γ Ηβι/ΐβΐ CCC GGC P c 5^1/181 GTC ACC V R 60V2CM CAT CTT H L 661/221 CGA CAT R H 721/241 CAC TAC Η Ϊ 781 /26T acc vre T I ?A?AA?T?AA?A?APSWP 33T/m 、 TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAC GGC AGC TAC GOT TTC CGT CTG GGC s SVPSQ：<7YQ 'G S V C T ft LG 391/131 CAT TCT CGG ACA GCC AAG TCT G7C ACT TGC ACC TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG KSiS TAKSVTCTYSPALNK TCC CAA CTC CCC AAG ACC TGC CCT GTG CAC CTG TGG CT*T CAT TCC ACA CCC CCG CQLA'KTCPV W V D S T P P sn mi ACC CGC GTC CGC GCC ATC CCC ATC TAC AAC CAG TCA CAG CAC XTG ACG GAG CTT TRVRXMAirKQSQHMTEV 571/191 CGC TGC CCC CAC CAT GAG-CGC TCC TCA CAT AGC CAT dGT CTG GCC CCT CCT CAG RCPH'：^£RCSDSDGLAPP〇 631/211 ATC CGA CTC CAA CCA AAT TTC CCT GTG CAG TAT TTG GA^ GAC AGA AAC ACT TTT - rl V Ξ 〇 m V . £ Y L D D R Ν' T r " 691/231 AGT ^TG GTG GTG CCC TXT GAC CCG CCT GAC CTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC SVvv?vt?phvCSPCTTI 7S1/-251 AAC TAC ATC TGT AAC ACT TCC TCC ATG CGC GGC ATG AAC CCG AGG CCC ATC CTC NYMCn-SSCMCGMNRSPIL dtl/271 KTC ACA CTG SAA CAC TCC ACT AAT CTA CTG GGA CCG XAC AGC TTT GA<3 CTC !TlHisSCNLLGRNS.FEV 本紙張/Ut逍用中钃》家橾率（CNS > A4A#· ( 210X297公釐
    訂 I 444 022 A8B8 C8D8 六、申請專利範圍 841/281 cct err τστ R V C 901/301 GCG GAG CC7 G E P 961/321 AGC TCC TCT S S S 1021/341 CGT GGG COT ROB 1031/36¾ SXZ GCC CTC K A L 671/291 CCC TGT CCT C-CG AGA GAC CGG CCC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CCC AAG ΛΑΑ AC?3a〇5ST£EHNLRKK 931/311 CAC CAC CAC CTG CCC CCA AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC HHI1??0STKRAL?NNT 991/331 … CCC CAG CCA XAC AAG AAA CCA CTG GAT GGA CAA. TAT TTC ACC CTT CAG ATC PQ?'iKK?LDGEYFTLQI ， /351 CAG GAT C-C AAC· CCC CTC AAG GAG AAG C7C XAG GCC CTG GAG CAG AAG CTG EDlX^^ KtKLKALEEKL Τ1Π/37Τ GAG SAG λΧ〇 CTG XAC OCA CTA CTG GGG CAC CGA TGA TGA ESXLXAtVGER* 〇 5. —種核酸，其編碼如申請專利範圍第1至4項中任一項之 變體或編碼序列識別編號25·或26之蛋白質序列 序列識別編號（25) 經濟部中央梯隼局Λ工消费合作社印«. 1/1 . ATC TCC M S 61/2Γ CAC GTC-D V UWV GGG GA: G D 181/61 ATG GCC K A .241/81 CGT CGA G R 301/10Ί C7C TCA L S 361/12^ TTC TIG F L atc rrr k r 481/161 ACG GCC CCC τ a CCG ATG CCC-A M A TCC CCG C*G〇 3 ? 〇 GAC TTC CAC D F r CCT GCA CCA ? A ? rcT tct ere S 3 V CAT Ter GCC 卜：5 :· :GC CAA CT:-C 1 CCG ACC CAT CTC ACC r 7 D V 3 CAT GCC GAC OCC CTA ：-： A D Λ L CCC CCA ΤΊΤ ACC CCC ? 0 ? 7 ? TTT CAC CAG hZZ TTT r £ C K F CCA GC7 CCT ACA CCC A A：；., ? 7 ? CC? TCC CAC AAA ACC ? £ 〇 X 7 ACA GCC AAC -C7 CTG T A ：< Ξ V GCZ AAv ACC TCC CCT λ X T C r 31/11 CTG GGG I. G 91/3： GAC GAT D D 1S1/S^ CAC CAC K D 2U/71 ACC GAT T D 271/91 GCG GCC A A 33W· n TAC CAG V Z 39；/：31 ACT COC *r* 〔 CTG CAG v " ς -/^7: CAC CAC CTC CAC TTA GAC GGC GAG dslhldce TTC CAT CTG GAC AJG TTG GGC GAC fDLD'MLGD I· If TCC CCC CCC TAC GCC CCT CTG GAT SAPY-ALri CCC CTT GGA ATT GAC CAG TAC GCT ALGIDEYG CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC PA(?A?SW? GGC AGC TA守'GGT TTC CGT CTG GGC GSY GFRLG ACC TAC TCC CCT CCC CTC AAC AAG TYS?ALNK CTG 7C-C CTT CAT TCC ACA CCC CCC L ·«. V D S T P ? ---------------、tT------^ (請先H讀背面之注意事項再填寫本頁) .4 · 本紙at尺度逋Λ中國家標率（CNS ) Α4规格（210Χ297公嫠） 444 022 A8 C8 D8 六、申請專利範園 CCC CGC ACC CGC GTC CCC CCC ATG CCC ATC TAC AAG CAC TCA CAC CAC ATG ACC GAC CTT p C T R VR AM A ϊ Y K Q S Q Η Μ T E χ V S4W161 57T/191 GTG AGG CGC TCC CCC CAC CAT GAG CCC TGC TCA GAT ACC GAT CGT CTG CCC CCT CCT CAG VRKC?KKERCSDSDCLAP? 0 6CV2Q; 63 V21 1 CAT CTT ATC CGA GTC GAA GCA AAT TTG CCT CTG GAC TAT TTG CAT GAC ACA AAC ACT TTT HLIRV£CNLRV£YLDDRNTF 661/221 691/231 CGA CAT ACT GTG GTG CTG CCC TAT GaC CCG CCT GAG CTT GGC TCT CAC TGT ^CC kCZ AiC aHSVVVPYEPPEVGSDCTTl 721/3<* . 751/251 CAC TAC AAC TAC ATC TGT AAC ACT TCC TGC ATC CCC CGC ATG AAC CGC AGG CCC ATC CTC hynymcnsscmggmnrrpil 7S1/261 811/271 · 一 ACC ATC ATC ACA. CTG GAA CAC TCC AOT GG7 AAT CTA CTG GCA CGC AAC AGC TTT GAG GTG T I ：TLlD3SGNtLGRNS?EV a〇/2ai 871/29^ , CCT CTT TCT CCC TCT CCT CGC ACA CAJ£ CGC CGC ACA GAG CAA CAG AAT CTC CGC AAC AAA RVCACPCHDSRTEEENL^KK 901/301 931/311 CGG GAC CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA CGG ACC ACT XAG CGA CCA CTG CCC AAC AAC ACC G£?-'HH£!,P?CS*rKRALPNNT /32*' 991 /331 AGC-TCC TCT CCC CXC- CCA AAC AAC AAA CCA CTG GAT GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAC SSSPQPKXKPLDGDLKALKE 1021/341 10SU3S1 AAC CTG AAG GCC CTC； GA5 GAG AAC CTG AAG GCC CTG GAG GAG ^AG CTG AA< GCA CTA GTG KLKAlTE；<rxALT£KLKAI-V 1〇dW361 CCC GAG CGA 7GA tCA G E .¾ - - (诗先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 訂 1 經濟部中央標率局員工消费合作社印裝 序列識別編號（26) 3W1 ATC TCC XCG CCC CCC CC5 ACC ΟΛΤ CTC AGC CTG GGC GAC GAG CTC CAC TTA GAC GCC GAG KSTfc^?T^VSICDELHLDG=： mi 91/3； CAC G7G CCG ATC* CCG CAT GCC CAC GCG CTA GAC GAT TTC CAT CTG CAC ATG TTC GGC GAC DVaMa-"-ADALDDFDL〇MLG 121/41 Ι5Τ/5Ί D GC5 GAT TtC CCC GCC CCC GGA TTT ACC CCC CAC CAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTC GAT ΰΕ>5?2?〇ΓΤ P H .D S A P Y G A 181/61 211/71 L D A*：G GCC GAC T7C Z-\0 TTT CAC CAC ATG TT7 ACC GAT CCC CTT CGA ΛΤΤ GAC GAG TAC GGT M A D ? t ? 241/81 C· T D wwi C«A CC7 GCA CCA 5CA GCT CCT ACA CCC CCG GCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC TCC CCC M Λ G D y G -5- 本紙張尺度逍用中國_家輮率（CNS > A4«U*· ( 210X297公釐） 444 022 A8 Bi C8 D8 六、申請專利範園 經濟部t央橾率局身工消费合作社印装 C 致 ? A P A A P τ ? A A P A P A P s W P 30T/101 33Ί/111 CTG TCA TCT TCT CTC CCT TCC CAC Χλλ ACC TAC CAG CGC AGC TAC GCT TTC CGT CTG GCC L S Ξ Ξ V P Ξ Q κ * V Q G S y C γ R t G 36W^ 2 1 391/131 TTC TTC CAT TCT GGG ACA GCC AAG TCT G*：C ACT TGC ACC TAC tcc CCT GCC CTC AAC AAC t L H Ξ C T A K s V 丁 c T V s P A L N K 421 1 ^51/1 ATC TTT TGC CAA CTC CCC AAG ACC TGC CCT GTC CAG CTG TGG CTT GAT TCC ACA CCC CCG Μ Γ C Q L A K T c P V Q L H V D $ T ? P 48Τ/Τ61 511/171 CCC GCC ACC CCC OTC CGC CCC ATC CCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC ATC ACG GAG GTT P C T 裒 V R A M A I Ύ K Q 3 Q H M T r V^- 541/Ί61 571/m CTC AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAC CCC TGC TCA GAT AGC CAT GCT CTC GCC CCT CCT CAG V R R c p H u E 3 C S D $ 0 G L Λ ? P 0 601./201 631/2Π • CAT CTT ATC CG* CTC gaa CwA AAT TTG CGT CTC GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT H L .: ? V I C N · - R V. E Y L D . R N T c 661/221 691/231 CGA CAT ACT -CTC GTC GTw CCC TAT GAG CCG CCT CAC CTT GCC TCT GAC TCT ACC ACC ATC A H s V V V ? V E P P E V G S D c T T I 721/2ΛΊ . 751/251 CAC TAC AAC TAC ATG ζζτ AAC ACT TCC TGC ATC GGC GCC ATS AAC CGG AGC CCC ATC CTC Η Y N V M s S s CMC G K N R R P I L 781/26T 611/271 _ -V* ACC ATC ATC ACA CTC ZkA GAC TCC ACT CGT AAT CTA CTC GuA CGG AAC AGC TTT CAG GTG T I Ύ T I T 2 £ a G N L L G R N S F V 641/281 S7W291 CGT CTT TCT GCC TGT CC: GCC ACA GAC CGC* CCC ACA GAG OAA CAC ΛΑΤ CTC CGC AAG AAA R V c Λ C p C R D a ? T .. r Ξ N L R K X 901/301 93V311 ggg Gag CC" CAC CAC GAG CTG CCC CCA GCG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ：ACC c ε P n K I 1 ? ? GST K R A L P N N T '961/321 991/331 … KCC TCC TCT CCC QKQ CCA XAC ί AAC ‘ CCA CTG G乂Ί .GG> ,CA> ,TAT TTC :acc cn 'CAG ATC s s s P C F ：< K ? L D C r Y F T L Q 二 1021/341 - 1051/3ST CGt GGG CGT GAC 0ΑΊ 1 C7C AAC GCC CTC AAG GAG AAG'CTG fij\0 CCC/CTG GAC CAG AAC CTC- R C τ 1 L V A L X E K K A L z K L /36Ί ί m /371 AAC CCC CTG GAG CAG AAG CTC ΛΑΟ GCA CTA G7G GGG GAG CGA TGA TG^ X λ t E I K K Λ L V C ε - • 6.根據申請專利範圍第5項之核酸，其特徵為其為〇1：>1^八’ RNA，合成或半合成酸。 -6 · 本紙張尺度逋用中《國家樣车< CNS > A4规格（210X297公釐} (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 订 444 02 2 A8 B8 C8 D8 經濟部中央標準局貝工消费合作社印策 、申請專利範圍 7.根據申請專利範圍第5項之核酸，其特徵為其係選自序列 序列識別編號2 5及2 6之核酸 序列識別編號（25) 1/1 31/11 ATC TCC ACG GCC CCC CCC- ACC CAT GTC AGC CTG CGG CAC GAG CTC CAC TTA GAC CGC HSTA??-：：>V3LGDtLHLDGt 9W CAC GTC- GCC ATC CCC- CAT CCC GAC GCC* CTA CAC GAT TTC GAT CTG CAC ATG TTG GGG GAC DVAMAHA^^LDDcDLOMLCD 121 151/51 ，*' GCC GAT TCC CCC- ZZ^ CZZ CCA ΤΓΤ ^CC CCC CAC GAC TCC GCC CCC *IAC GGC GCT CXCT'CAi CD. SPCs^i'rPHDSAPVGAL^ 1β\/6·! . 2V)/?l ATC GCC GAC TTC CAC- T7T GAG CAG ATS TTT ACC GAT CCC CTT GCA ATT GAC GAG TAC GGT KADFiriQMrTUALC.I P E Y C .· 24US*! 271/91 GGT CGA CCT GCA CCA DCA ZCZ CCT ACA CCG GCG CCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC GRFAP AAPTPAAPA P a p s w ? 301/,0, 331/ill ctc tca rcr re? arc ccr tcc cac aaa acc tac cac ggc ac-c tac ggt ttc cgt ctg ggc LSS3v?5〇KTVQGSYGFRLG 36wm t 391 /' 31 TTC 了：G CAT TCt CCG ACA GC: AA<3 TC: GTG ACT :5C ACS :AC TCC CCT GCC CTC AAC AAG FLKSGtAKSVTCTYSP ^LNK 421/VA 451 /*i ^ 1 ATC TTT TCC CAA cr·：· GCC AAC- ACC TdC CCT GTC CAG CTG TGC- CTT GAT TCC ACA CCC CCG MiCC^A：<?CPVC L V D S T P ? 4&V16、 5*1 1 / W, • k ^ CCC GGC ACC CGC CTC CCC GCC ATC GCC ATC TAC WC CAC TCA CAC CAC ATC ACC GAG GTT ?G^RVRxmAIvXqsQHM7E^V nei 571/:91 CTC XCC CCC TGC CCC CAC CAT GAG CCC TCC TCA GAT ACC GAT GGT CTC GCC CCT CCT CAG VRRC?KK£RCS DSDfCLAP?〇 fiCl/2〇l 631/3^ C\T CTT ATC CGA CTC GAA GGA AAT TTC CGT GTG CAC TAT TTG Ca/ GAC AGA AAC ACT T7T HLrRVSGNLRVEYLDDRKTF 661/221 691/231 CCA CAT ACT CTG GTC GTG CCC TAT CAC CCG CCT GAC CTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC Rr：SVVv?yrpp?VG SDCTTI 72T/2<' 751/2S1 CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC ACT TCC TGC ATC GGC CCC ATC AAC CCG AGC CCC ATC CTC HYNYKCNSSCM-GGMNRRPII. 781/261 βη/271 ACC ATC ATC ACA CTC GAA GAC TCC AGT CGT AA7 CTA CTG GGA CGG AAC AGC TTT CAG GTG TIITIIdsSGNLLGRNS FEV 1/261 8*71/291 CGT CTT' TCT GCC TGT CCT CGG AGA GAC CCC CSC A.CA CAC GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA aVCAC?CKDRRTEEENLRKK 本纸張尺度逋用中國國家揉率（CNS )八4优格（210X297公釐） ---------------il------u (锖先聞讀背面之注+^項再填寫本頁) 444 022 A8 B8C8 D8 六 申請專利範圍 931/3U GGG GA。CCT CAC〔AC 2Αΰ CT：： COC CCA GGG AGd ACT AAG C6A GCA CTG CCC AAC ACC q T p · ' Η K Ξ 乙 P ? 0 5 T K R A L PN N T 96^/321 991/331 AGC TCC TCT CCC CAC· CCA AAG XAG AAA CCA C7G GAT GGG GAT CTG AAG CCC CTC AAG GAG SSSPC?KXKpL〇GDLKALKE 102Ί/34: 1051/351 AAC CTG AAw GCC C*C· C*AG SAC AAC CTG AAG CCC CTG GAG GAG AAG CTC AAG GCA CTA GTG KLKALi£KLKALit.KX< 1031/361 GGG GAO CGA TGA7GA g ε s τ · κ 序列識別编號（26) 1/1 3W” ATC TCC ACC- QZZ CCC CCC fcCC GAT GTC AGC CTC GSG CAC GAG CTC CAC TTA GAC GpC GAG KSTA??'7DV5LGDELHLD'gs 61/21 9V3^ GAC CTG CCG ATG CCS CAT CCC CAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC D -V A Μ H A D A L D D Γ D L D M L G' D 121/41 151/51 GGG GAT TtC CCC CCG CCG CCA ΤΤΓ ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT g〇SPi?GFTPHDSAPVGALD TBW61 211/71 ATG CCC CAC TTC C-AG ΓΤΤ GAC CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GCT MXO；i?iC-MFTDALGID£YC 241/81 271/91 CC? CGA CCT CCA CCA 2CA GCT CCT ACA CCG CCC GCC CCT GCA CCA CCC CCC TCC TGG CCC 經濟部中央揉準局負工消费合作社印— C R 301/101 CTG TCA L S 361/13Ί TTC TTG Γ L 421/141 ATC TTT M F 461/161 CCC GGC P C S4T/18T GTC ACC V R 601/2ΟΪ cat err H L 661/321 CGA CXT R H ? λ TCT TCT-S 5 CAT TCT H S TCC CAA c Q ACC CCC T R CCC TGC R c «re CGA : 5 wt -zrz S V CTC CCT V P CCG ACA C I ere ccc L A CTC ccc V 31 CCC CAC ? H CTG GWk V I GTC GTC： V V A TCC s GCC A AAG X GCC A P T CAC ΛΛΛ 0 x AAC TCT X s ACC TCC T C ATC GCC H A CAT v GCA G CCC p 2 a AAT TTC N L TAT CAG V £ ? A A 331/m ACC TAC CAC *r Ϊ q 39WT31 GTC 估 TGC V T c CCT CTG CAC P .V Q 5Π/Ί71 ATC TAC AAG i y κ 571/191 TGC TCX GAT C S - D 03W2V4 CCT CTG GAC 哭 V E ¢91/231 CCG CCT GAC P P E P A P Ά P GGC ACC TAC GGT TTC G S Y 0 F ACC TAC TCC CCT GCC τ y s . p a t CTC TGG GTT ΟΛΤ TCC L W V D S » CAG TCA CAG CAC ATC Q S Q Η H AGC CAT CGT CTG CCC S D G t. A TAT TTG GAT GAC AGA Y L _ D ΐ： R GTT GCC TCT GXC TGT V C S D C S w p CGT CTC CCC a l g CTC AAC AAG L N K ACA CCC CCG T P ^ P ACC GAG GTT T ε V CCT CCT CAC P ? Q AAC ACT TTT N T F ACC ACC ATC T T I Γ___ϋ 1 ---- HI ---------^------ir---- ^ (請先背*之注意事項再填寫_I____ 本紙乐尺皮逍用中鼷·家橾率（CNS ) A4就格《210X297公釐） 經濟部中央棣牟局貞工消費合作社印装 4 44 02 2 as C8 D8 六、申請專利範圍 721/241 …· *751/251 CAC TAC MC TAC A7G TST AAC ACT TCC TCC ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGC CCC ATC CTC Η Υ N V M c N 3 s c M C C K N R R ϊ> I L 701/261 611/271 ACC ATC ATC ACA CTG GAA CAC TCC AGT GOT AAT CTA CTC CGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG T I T I I 二 s s G K L L G R S T E V 841/231 ¢71/291 CCT GT7 TGT GCC TCT CCT ACA GAC CC-5 CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC coc AAG AAA R V C Λ c ? z S D S a τ ε z Ξ N L a K K 90V301 931/311 GGC GAG CCT CAC CAC GAG crc CCC CCA CGC AGC ACT AAC CGA GCA CTG ccc AAC AAC ACC g ε P fi H Ξ . L ? ? z S T R k L ? N N T 961/321 99Ί/33： * t， r ACC TCC TCT ccc CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGA GAA TAT TTC ACC CTT CAC ATC S -_s s P 0 ? X ：< p L D' G V F T L Q . 4 , 1021/341 1051/351 CCT GGG CGT CAC SAT crc- AAC- GCC CTC AAC GAC AAG CTG AAC GCC CTC GAG GAG AAG CTG R G R E :- i :X X 二 K r κ L K A L s £ K L -103V361 1 Ή ΛΑΟ GCC C7G gag GAG AAG crc AAG GCA CTA GTG SGG GAC CGA TGA TGA K .A L z ε ：< K A T V G Z R - 黌 8. —種用於治療高度增生病症之醫藥組成物’包括如申請 專利範圍第5至7項中任一項之核酸及/或載體與醫藥可接 受性載劑或稀釋劑》 9. 一種用於治療高度增生病症之醫藥組成物，包括如申請 專利範園第1至4項中任一項之變體與醫藥可接受性載劑 或稀釋劑· 10. 根據申請專利範圍第8或9項之酱藥組成物’其係供治療 高度增生病症。 -9- 本紙張尺度埴用中BI·家接準（CNS ) A4规格（210X297公爱） --1------------iT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _
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